Механизмы регуляции свертывания крови

Пантелеев, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы регуляции свертывания крови
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции свертывания крови"

На правах рукописи

ПАНТЕЛЕЕВ Михаил Александрович

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

>1 1 МАР 2010

Пущино —2010

003493346

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН и Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Фазоил Иноятович Атауллаханов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Евгений Ильич Маевский

доктор физико-математических наук, профессор Георгий Теодорович Гурия

доктор технических наук, профессор Михаил Александрович Ханин

Ведущее учреждение: Институт математических проблем биологии РАН

Защита состоится 24 марта 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность гсмы. Свертывание крови представляет собой сложную сеть ферментативных реакций, основой которой служит каскад последовательно активирующих друг друга сериновых протеиназ, охваченный многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей (Рис. 1). Его основная задача заключается в предотвращении потери крови при повреждениях сосудистой системы.

Нарушения работы системы свертывания крови являются, прямо или косвенно, лидирующей причиной смертности и инвалидности в современном мире. Их диагностика и коррекция затруднены сложностью этого процесса, в котором задействованы десятки белков, взаимодействующих в сотнях реакций друг с другом, с клетками крови и сосудистой стенкой. Кроме того, свертывание крови является пространственно неоднородным процессом, в котором большую роль играют диффузия реагентов и перенос их кровотоком.

Препятствием для создания более совершенных методов диагностики и терапии свертывания оказывается плохое понимание его регуляции. В связи с этим представляется актуальным изучение того, как устроена система свертывания крови, и каков вклад каждого из ее компонентов в общую динамику процесса.

Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Реакции активации и инактивации факторов свертывания показаны односторонними тонкими черными стрелками. При этом фигурные стрелки показывают под действием каких именно ферментов происходит эта активация или инактивация. Обратимые реакции формирования комплексов показаны двусторонними тонкими черными стрелками. Чтобы избежать перегруженности, на схеме не показаны: связывание тромбина с тромбомодулином, активация и секреция тромбоцитов, контактная активация свертывания.

Еще на самых ранних этапах исследования свертывания появлялись гипотезы о возможных причинах его каскадного устройства (Levine, Science 1966; 152: 651-653). В последние десятилетия на пути к его пониманию было сделано несколько принципиальных шагов. В основополагающих теоретических работах М.А. Ханина и сотрудников (J Theor Biol 1989; 136: 127-134) показана роль положительных обратных связей в формировании

ГЙГ] шфзкгер

порогов в ферментативных каскадах. Другая их функция, регуляция пространственного распространения свертывания, предложена в серии теоретических и экспериментальных работ Ф.И. Атауллаханова и сотрудников (Биофизика 1994; 39: 97-106; Thromb Res 1996; 84: 333-344; Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57). Третье возможное следствие наличия положительных обратных связей, пороговый ответ по скорости кровотока, предсказывалось Э. Белтрами и Дж. Джести (Math Biosci 2001; 172: 1-13).

Однако, до настоящего момента не предпринималось попыток целиком проанализировать и понять структуру каскада свертывания, систематически и с единых позиций изучить функции его частей. Кроме того, почти все перечисленные результаты предсказаны с помощью сильно упрощенных математических моделей, и предсказания разных исследователей во многом противоречат друг другу в зависимости от того, какие реакции включались в такие модели. За редким исключением (Ovanesov et al, Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57), эти гипотезы не проверены на детальных моделях или в эксперименте.

Далее, арсенал современных методов системной биологии не содержит стандартных способов анализа сетей реакций, подобных свертыванию. Существуют хорошо разработанные подходы — такие, как анализ метаболического контроля или теория биохимических систем, — для линейных, стационарных, точечных систем реакций. Однако, методология исследования пространственно-неоднородных и нестационарных систем разработана значительно хуже.

Таким образом, в настоящий момент существует актуальная проблема исследования регуляции свертывания крови, решение которой осложняется отсутствием подходящих системно-биологических подходов.

Цель работы: Выявление и анализ механизмов регуляции свертывания крови.

Задачи исследования:

1. Построение детальной математической модели свертывания крови.

2. Экспериментальное исследование кинетики отдельных реакций и блоков системы свертывания для тестирования модели.

3. Выявление в каскаде свертывания крови функциональных подсистем и их ролей.

4. Применение полученных результатов к исследованию методов диагностики нарушений свертывания и механизмов действия лекарственных препаратов.

Научная новизна. Разработана методика анализа сложных сетей биохимических реакций, основанная на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Построена математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги полнотой и корректностью описания биохимических реакций и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. С их использованием выявлен механизм и динамика порогового поведения системы свертывания крови. Экспериментально показана новая роль фактора VIII в регуляции доставки субстрата к ферменту в комплексе внутренней теназы. Впервые построена механизменная модель мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы. Обнаружена что петля положительной обратной связи, обусловленная активацией фактора V тромбином, формирует триггерный ответ в системе свертывания. Выявлен механизм, с помощью которого внутренняя теназа регулирует пространственную динамику свертывания крови. Теоретически предсказана и экспериментально обнаружена локализация пространственного роста тромба in vitro; показано, что она определяется путем протеина С.

Установлено преимущественное связывание компонентов внутренней теназы с малой субпопуляцией, формирующейся при активации тромбоцитов. С помощью математического моделирования выявлен новый режим регуляции внешнего пути ингибитором пути тканевого фактора. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с гемофилией A in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии. Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им физиологических задач, выполняемых системой.

Научио-ппактическое значение. Разработанные в работе методы и построенные математические модели могут быть использованы в качестве инструментов для теоретического исследования биохимии, биофизики, фармакологии как свертывания крови, так и других сетей ферментативных реакций, а также Для планирования и анализа экспериментов. Выявленные механизмы отдельных реакций свертывания крови и взаимодействия факторов системы свертывания с фосфолипидными везикулами и активированными тромбоцитами могут быть использованы для создания новых про- и антикоагулянтов. Полученные результаты по регуляции динамики свертывания крови могут быть использованы для создания новых методов диагностики нарушений гемостаза и фармакологического воздействия на систему свертывания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Разработанная методика анализа сложных сетей биохимических реакций, основанная на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе, позволяет выявить в каскаде свертывания крови функциональные подсистемы и их роли.

2) Построенная детальная математическая модель свертывания крови превосходит существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и согласованностью с экспериментальными данными.

3) Фактор Villa регулирует формирование комплекса внутренней теназы посредством формирования мембранного-зависимого комплекса с фактором X и доставки фактора X к ферменту.

4) Активация тромбоцитов крови тромбином ведет к формированию двух субпопуляций активированных тромбоцитов, одна из которых способна кальций-зависимым образом специфически связывать компоненты внутренней теназы.

5) Активация фактора V тромбином, внутренний путь свертывания крови и путь протеина С формируют в системе свертывания крови триггерный ответ, способность к пространственному распространению и к локализации, соответственно.

Апробация работы. Работа прошла апробации: 22 июля 2009 г. на заседании семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и Гематологического научного центра РАМН, 3 августа 2009 г. на заседании семинара "Молекулярное моделирование и разработка биологически активных соединений" Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им М.В. Ломоносова, 16 сентября 2009 г. на заседании проблемной комиссии №6 «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ Гематологического научного центра РАМН, 23 октября 2009 г. на заседании семинара Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Материалы диссертации доложены автором на следующих конференциях и съездах: конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 24-26 октября 2001 г.; VII-я национальная конференция "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза", Москва, 27-29 марта 2002 г.; 1-й Всероссийский съезд гематологов. Москва, 16-18 апреля 2002 г.; Gordon Research Conference on Proteolytic Enzymes & Their Inhibitors, New London, USA, July 7-12, 2002; Vth International Congress on Mathematical Modeling, Dubna, Moscow Region, September 30-0ctober 6, 2002; конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 11-14 ноября 2002 г.; 1-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 5-6 февраля 2003 г.; 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, USA, February 14-18, 2004; Workshop 'Mathematical models and methods in biology and medicine', Bedlewo, Poland, May 29 - June 3, 2005; 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference 'The Protein World', Budapest, Hungary, July 2-7, 2005; XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland, July 6-12, 2007; Workshop on 'Modelling of Blood Diseases', Lyon, France, 5-9 Nov 2007; Gordon Research Conference on Haemostasis, Waterville Valley, USA, June 29-July 4, 2008; 3rd Workshop on Algorithms in Bioinformatics, Moscow, October 7-9, 2008; XXIInd Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis, Boston, USA, July 11-16, 2009.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 66 работ, в том числе 26 статей в реферируемых научных изданиях и 40 работ в материалах конференций и съездов.

Личное участие автора в получении результатов. Автором разработана методика исследования сложных сетей биологических реакций; выполнены все представленные в работе экспериментальные и теоретические исследования отдельных реакций свертывания; построена математическая модель и созданы программы для ее решения; осуществлено ее тестирование, исследование, и проведены все представленные расчеты; выполнены эксперименты по влиянию препаратов фактора VIII на пространственную динамику свертывания крови.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического указателя, включающего 407 источников, приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность исследуемой темы, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи, дана общая характеристика работы.

Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит сведения о системе гемостаза (включая плазменный и тромбоцитарный гемостаз), об основных экспериментальных моделях и методах исследования свертывания крови, о математических моделях свертывания, о методах теоретического анализа сложных биологических систем реакций. Отмечена связь проанализированных работ с предметом исследования диссертации.

В главе 2 описываются материалы и методы работы, в том числе: белки и методы их модификации, протоколы выделения плазмы крови и тромбоцитов с помощью центрифугирования и гель-фильтрации, протоколы приготовления фосфолипидных везикул, методы исследования кинетики реакций свертывания и связывания факторов свертывания с фосфолипидными везикулами или тромбоцитами, использованные в работе

экспериментальные модели свертывания in vitro — кинетика генерации фибрина в точечной системе и регистрация свертывания крови в пространственно-неоднородной системе.

Кроме того, в главе 2 приводится описание математической модели свертывания, разработанной для достижения цели настоящей работы. Она описывает процессы свертывания крови либо в точечной, либо в пространственной системе. В частности, вариант модели для свертывания в точечной системе представляет собой систему из 24 обыкновенных уравнений, выписанных на основании закона действующих масс. Переменными модели служат концентрации шести ферментов (факторы Vila, IXa, Xa, IIa, XIa, активированный протеин С) и шести их предшественников (факторы VII, IX, X, II, XI, протеин С), двух активных кофакторов (Va, Villa) и двух их предшественников (V, VIII), двух стехиометрических ингибиторов (AT-III и TFPI), трех белков других классов (TF, фибрин, фибриноген) и трех белковых комплексов (VIIa-TF, VII-TF, Xa-TFPI). Для некоторых видов расчетов в модель включались иные компоненты: тромбомодулин, комплексы и реакции с его участием, активация тромбоцитов, и др.

При построении модели сначала производилось описание отдельных реакций и простых систем из нескольких очищенных белков вплоть до достижения согласия с экспериментом. Затем моделируемые системы постепенно усложнялись, постоянно сопоставляясь с экспериментом. Диапазон параметров модели ограничивался экспериментально измеренными значениями. Юстирования констант не проводилось, лишь в некоторых случаях производился выбор между значениями, сообщавшимися разными группами. Конечная версия модели подверглась проверке путем сравнения с большим набором экспериментальных данных.

В точечном случае математическая модель интегрировалась численно с использованием солвера ode45 в MATLAB, версия R2008a (The MathWorks, Natick, MA, USA). Задача интегрирования системы уравнений в частных производных решалась вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга порядка 2(3). Численная схема реализована с помощью программы, написанной на Watcom C/C++ 10.0.

Глава 3 содержит результаты работы.

1. Фунщионально-орентированный анализ чувствительности как инструмент для выделения модулей. В начале главы разрабатывается методика исследования сложных биологических систем, которая будет использоваться в работе. Базовая гипотеза подхода заключается в том, что глобальная физиологическая задача сложной биологической системы может быть разделена на несколько функций-подзадач, каждая из которых контролируется отдельным модулем; каждая подзадача может быть охарактеризована численным параметром; анализ чувствительности может быть использован для выделения функциональных модулей. Конкретные стадии предлагаемого подхода (не обязательно в каждом случае осуществляемые в полном объеме): 1) разработка математической модели; 2) идентификация физиологических задач и выходных параметров; 3) выделение модулей и редукция в два этапа, в том числе а) удаление ненужных компонентов с использованием анализа необходимости и чувствительности и б) редукция систем на основании временной иерархии процессов; 4) анализ редуцированных моделей.

Основные функциональные задачи свертывания, которые использовались в нашем анализе в качестве первого приближения:

1) "Свернуть или не свернуть"; другими словами, распознать место повреждения и сформировать локальный ответ в зависимости от концентрации активатора, его размера и формы.

2) Распространиться от места повреждения, т.е. сформировать полноценный трехмерный сгусток, закрывающий место повреждения, а не просто тонкую фибриновую пленку поверх тканевого фактора.

3) Предотвратить неограниченное тромбообразование и локализовать тромб.

ф ш О

нет активации

¡1Ёг яр

••

» 0,

10« !0; № 10' 10' К." 10- !!)( 10' IV 10* 10' IV 10' 10* № 10' I!)' 11'

Флуоресценция белка

Рис. 2. Связывание факторов X, VIII, 1Ха с тромбоцитами, активированными увеличивающимися концентрациями тромбина: наблюдение двух субпопуляций. Тромбоциты (конечная концентрация 2-Ю8 мл"1) активировались тромбином в указанных концентрациях (колонки) и инкубировались с флуоресцеин-меченным факторами X (200 нМ) или VIII (50 нМ) или |Ха (200 нМ) в присутствии 2.5 мМ СаС12 при 37°С на протяжении 15 мин. Образцы немедленно анализировались на проточном цитометре. Двухмерные точечные гистограммы показывают распределение тромбоцитов в зависимости от светорассеяния под прямым углом и флуоресценции фактора свертывания. Тромбоциты с низким и высоким связыванием факторов свертывания наблюдались в верхних левом и правом квадрантах, соответственно (показаны как субпопуляции 1 и 2 для фактора X при концентрации тромбина 100 нМ).

2. Экспериментальные и теоретические исследования отдельных реакций свертывания. Для того, чтобы построить детальную модель свертывания крови, мы провели исследование кинетики отдельных реакций свертывания. Наиболее подробным было исследование реакции, катализируемой внутренней теназой.

Одно из направлений этого исследования связано с выявлением распределения связывания факторов свертывания между активированными тромбоцитами. Для решения этой задачи тромбоциты активировались увеличивающимися концентрациями тромбина (О-

100 нМ), и их прокоагулянтная поверхность характеризовалась по связыванию флуоресцентно меченных факторов X, VIII, 1Ха или аннексина V (маркера, связывающегося с фосфатидилсерином) с помощью проточной цитометрии. В присутствии факторов свертывания наблюдались две субпопуляции активированных тромбоцитов, которые на порядки отличались друг от друга по уровню связыванию факторов свертывания (Рис. 2). Взаимодействие с высокосвязывающей субпопуляцией являлось специфическим и кальций-зависимым. Количество тромбоцитов с высоким связыванием росло с увеличением концентрации тромбина.

Фактор VIII или Villa (нМ)

Фактор IXa-EGR (нМ)

Рис. 3. Совместное связывание компонентов внутренней теназы с фосфолипидными везикулами. Факторы свертывания в указанных концентрациях инкубировались с фосфолипидными везикулами (5 мкМ) при 37°С на протяжении 15 мин. (А) Связывание фактора VIII в отсутствие других факторов (□) или в присутствии 10 нМ фактора IXa-EGR (о), 100 нМ фактора X (Д), обоих факторов IXa-EGR и X (V), или при активации 1 нМ тромбина (ш). Сплошные линии показывают аппроксимацию экспериментальных данных стандартной гиперболической функцией связывания. (Б) Связывание фактора IXa-EGR: в отсутствие других факторов (□) или в присутствии 10 нМ фактора VIII (о), 100 нМ фактора X (Д), или же обоих факторов VIII и X (V). Вложенная панель показывает специфическое связывание IXa в присутствии других факторов. (В) Связывание фактора X: в отсутствие других факторов (□) или в присутствии 10 нМ фактора IXa-EGR (о), 10 нМ фактора VIII (Д), факторов IXa-EGR и VIII (V), 10 нМ фактора Villa (А), или факторов IXa-EGR и Villa (Y).

Далее, чтобы изучить взаимодействие компонентов внутренней теназы на фосфолипидной мембране, мы исследовали связывания меченных флуоресцеином факторов VIII, Villa, IXa-EGR и X (в различных комбинациях с немеченными факторами) с фосфолипидными везикулами, используя проточную цитометрию. Характерные кривые связывания представлены на Рис. 3. Влияние фактора Villa на связывание факторов IXa и X, а также данные кинетических исследований показывают, что фактор Villa служит "якорем" для факторов IXa и X. Затем мы продемонстрировали, что формирование комплекса VIIIa-X существенно для функционирования внутренней теназы; это было выполнено путем сравнения фактор VIIIa-зависимого связывания фактора X с фосфолипидными везикулами и активации фактора X. Наиболее вероятным механизмом такой регуляции представляется доставка фактора X к мембране. Ранее фактору Villa приписывались две функции в активации фактора X: увеличение каталитической константы и увеличение количества фермента на мембране. Наши данные показывают, что в дополнение к этим функциям фактор Villa увеличивает концентрацию фосфолипид-связанного субстрата.

В качестве заключительного шага по моделированию комплекса внутренней теназы, мы разработали математические модели активации фактора X комплексом IXa-VIIIa на фосфолипидных везикулах и на тромбоцитах, основанные на детальном учете биохимических механизмов и дающие количественное описание экспериментальных

данных. Мы получили уравнение для скорости активации фактора X внутренней теназой в "тромбоцитарной" модели:

А.Ха] _ кЫ \1Ха" 1- \У1Па" \ ¡X" ] ^

л ¡к-И-К^1 /к

где [А*"], [УШс/4], \lXci~'} даются уравнениями:

1 ] +[х]

-__(3)

(4)

"А

[ш V ] =_[!Xa]N .„""

-\1Ха\ 1

Отдельного исследования также потребовало описание системы реакций внешнего пути свертывания. Главный регулятор внешней теназы, ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) принадлежит к семейству ингибиторов типа Куница. Свободный TFPI связывает Vila медленно и слабо по сравнению с фактором Ха, но комплекс Xa-TFPI способен хорошо связывать VIIa-TF, формируя ингибиторный комплекс Xa-TFPI-VIIa-TF. Поэтому ранние работы предлагали двухшаговый механизм действия TFPI: TFPI сначала связывает Ха, а затем комплекс Xa-TFPI связывает VIIa-TF, полностью ингибируя его активность. Однако, позднее стало известно, что этот общепринятый двухшаговый механизм действия TFPI не может объяснить экспериментальные данные по кинетике ингибирования комплекса VIIa-TF. Для объяснения противоречия Баух и соавторы (J Biol Chem 1998; 273: 4378-4386) предположили, что основным путем ингибирования является ингибирование фермент-продуктного комплекса Xa-VIIa-TF при участии TFPI, но предложенная схема исследована не была.

Поэтому мы исследовали механизм ингибирования активации фактора X при участии TFPI. Были построены и проанализированы модели различных реакционных схем, и предложены гипотезы, объясняющие экспериментальные данные.

3. Исследование регуляции свертывания. Создание двух основных инструментов, методики исследования и математической модели, позволило нам перейти к основной части работы — исследованию механизмов регуляции свертывания крови. Разберем использованный подход наиболее подробно на примере регуляции начальной кинетики свертывания.

3.1. Анализ чувствительности в применении к начальной кинетике свертывания. Для того, чтобы выделить набор компонентов, которые необходимы и достаточны для регуляции начальных стадий свертывания, было произведено поочередное удаление каждой переменной или константы и оценка воздействия этого на время свертывания Ьы с помощью параметра Дtcl„,, описывающего его относительное изменение. Здесь и далее мы будем называть эту процедуру анализом необходимости. С другой стороны, чтобы оценить локальную чувствительность системы к возмущениям в значениях параметров, эти значения варьировались, и коэффициенты контроля С, = Э1пгА,/SinR рассчитывались для каждого параметра R. Это позволило судить о том, какие процессы регулируют формирование

фибрина. Таблица 1 содержит примеры значений Д1сы и С, для концентраций компонентов системы свертывания.

3.2. Удаление несущественных переменных и реакций. В качестве первого шага редукции модели мы удалили те переменные и члены, которые не оказывали существенного влияния на формирование сгустка. В качестве критерия мы использовали требование, чтобы интегральная значимость и коэффициент контроля для этих реакций должны быть меньше 0.1. Если хотя бы один из параметров превышал это значение, соответствующий реагент или реакция оставлялись в системе. Таким образом, этот шаг позволил нам убрать из нашего рассмотрения целиком весь внутренний путь (факторы IX, IXa, VIII, Villa, XI, XIa), путь протеина С (PC, АРС), активацию фактора VII и связывание фактора Ха с TFPI, оставляя только 15 дифференциальных уравнений.

Таблица 1. Сравнительное влияние компонентов системы свертывания Свертывание в плазме, активированной 5 пМ TF, моделировалось в компьютерном эксперименте. Обозначения: н.с., нет свертывания; н.п., неприменимо. Компоненты считались необходимыми, если в их отсутствие не происходило свертывания; существенными, если AtM для них превышал 0.10; контролирующими, если С,и превышал 0.10.

Компонент Atcbi Необходимый Существенный Контролирующий

VIIa-TF н.с. н.п. Да Да

VII-TF н.с. н.п. Да Да

TF н.с. -0.55 Да Да Да

Vila н.с. -0.52 Да Да Да

VII -0.68 0.49 Нет Да Да

IXa 0.00 н.п. Нет Нет

IX -0.01 0.01 Нет Нет Нет

Xa н.с. н.п. Да Да

X н.с. -0.07 Да Да Нет

На н.с. н.п. Да Да

II н.с. -0.25 Да Да Да

Фибрин н.с. н.п. Да Да

Фибриноген н.с. -0.01 Да Да Нет

Villa 0.00 н.п. Нет Нет

VIII 0.00 -0.01 Нет Нет Нет

Va н.с. н.п. Да Да

V н.с. -0.37 Да Да Да

XIa 0.00 н.п. Нет Нет

XI 0.00 0.00 Нет Нет Нет

AT-III -0.20 0.25 No Да Да

TFPI -0.41 0.44 No Да Да

Xa-TFPI 0.00 н.п. Нет Нет

АРС 0.00 н.п. Нет Нет

PC 0.00 0.00 Нет Нет Нет

3.3. Редукция модели с использованием временной иерархии процессов. Система была обезразмерена, и были произведены оценки малых параметров при производных. Сравнение их значений показывает, что большинство переменных в системе либо быстрые (е«1), либо медленные (£»1) в используемой временной шкале, если ТГ находится в пикомолярном

диапазоне. Исключениями являются концентрации пула ТР (.т3р), фактора Уа (х5) и тромбина (.т2), хотя при достаточно малом ТР (0.01 пМ и меньше) тромбин тоже становится быстрой переменной. Таким образом, наиболее общая версия редуцированной модели состояла из трех уравнений:

' _ и .

-V

(5)

Л Л,

1Г

Здесь а, и Ь, суть параметры. Для низких концентраций ТР тромбин тоже становился быстрой переменной, и система имела точное решение:

= •*>!,.<,-Vе"'1"

3.4. Динамика полной точечной модели свертывания. Проекция фазового пространства на плоскость Хзр-л2 показана на Рис. 4. Единственной точкой пересечения изоклин является ноль, устойчивое стационарное состояние. Ответом системы на добавление активатора дг3р всегда является импульс тромбина, заканчивающийся возвращением в начало координат. Амплитуда импульса является резко нелинейной функцией уровня активации, как видно из полулогарифмического графика на панели Б: при увеличении ТР с 0.03 до 0.04 пМ максимальная концентрация тромбина, достигаемая на изоклине (к2/Ж = 0, увеличивается более чем три порядка. Из-за исчерпания предшественников в системе не видно истинной бистабильности, но поведение тромбина в области этого скачка концентраций похоже на поведение в области седла, которое можно выявить при редукции.

*,р(пМ)

Рис. 4. Динамика полной модели свертывания. Показана проекция фазового пространства полной модели на плоскость х3р-х2 в линейном (А) или полулогарифмическом (Б) масштабе. Изоклины <&,/л = о и ¡¡х ¡ж - о показаны как толстые черная и серая линии, соответственно. Направления фазовых траекторий показаны короткими толстыми стрелками. Тонкие пунктирные линии показывают фазовые траектории при высокой концентрации ТР, когда начинает играть роль расход неактивных факторов-предшественников.

3.5. Механизм переключения в системе свертывания. Рассмотрим конечную плотность сгустка на больших временах. В этом случае концентрация фибрина в редуцированной модели будет:

Фибри

и:

если / » — = 110 мин

(7)

На Рис. 5А показаны результаты расчетов с использованием как полной, так и редуцированной моделей, дающие эту экспоненциальную зависимость.

S 8 * 8

1 б

а. ю s

-е- 4

»S

т 2 а>

I о

Редукция ДО ОДНОГО ур*1Н*НИЯ

^ис

s 6 о.

•9- 4

Полная иод «ль

ТФ (пМ)

10 20 30 40 50 60

ТФ (пМ)

Рис. 5. Влияние фактора V на зависимость конечного ответа системы от уровня активации. Теоретическая (А, Б) зависимость финальной плотности сгустка (спустя 5 часов) от концентрации TF, добавленного в нормальную (А) или дефицитную по фактору V (Б) плазму. Сплошные линии представляют собой расчеты с помощью полной модели, а пунктирные — расчеты, основанные на формулах редуцированной модели. Вставка на панели Б сравнивает кривые для полного (0%) и частичного (1%) дефицита фактора V.

Если мы примем во внимание, что а) концентрация фибрина лимитирована концентрацией фибриногена, б) существует пороговая концентрация фибрина, требуемая для желирования плазмы, в) прочность сгустка возрастает с увеличением концентрации фибрина, то гладкая экспонента на практике превратится в порог. При ТР<0.03 пМ свертывания не видно (менее процента фибриногена перешло в фибрин, при ТИ >0.04 рМ свертывание уже достигло максимума. Таким образом, диапазон концентраций ТР, где сгусток непрочен, становится минимальным. Редуцированная модель позволяет нам заключить, что причиной такого переключения является активация фактора V тромбином (Рис. 4Б).

3.6. Роль внутренней теназы в пространственной динамике свертывания крови. Рассмотрим регуляцию двух других физиологических функций — пространственного распространения и локализации свертывания. Формирование фибринового сгустка определяется тромбином. Лимитирующим компонентом протромбиназы является фактор Ха, который, в свою очередь, производится под действием внешней либо внутренней теназы. Мы предприняли попытку различить вклады этих реакций в пространственной фазе роста сгустка, используя модель.

Зависимости размера сгустка от времени и скорости роста сгустка от концентрации фактора VIII показывают хорошее согласование модели и эксперимента. С помощью модели был проанализирован механизм наблюдавшегося эффекта нарушения пространственного формирования сгустка. Мы построили зависимости от времени и координаты отдельно для фактора Ха, произведенного внешней теназой, или внутренней теназой, или обеими. В то время, как активированный внешней теназой фактор Ха расположен вблизи от активатора и

быстро ингибируется, активированный внутренней теназой фактор распространяется вдаль от активатора и определяет формирование сгустка.

3.7. Роль фактора XI в пространственной динамике свертывания крови. Чтобы определить относительный вклад внешней теназы и фактора Х1а в формирование фактора 1Ха, были проведены исследования в плазме, дефицитной по фактору XI. Эксперименты и расчеты производились в соответствии с экспериментами в плазме, дефицитной по фактору VIII, с тем исключением, что для активации использовались макрофаги, несущие значительно меньше TF, чем фибробласты. Не только фаза инициации, но и фаза распространения свертывания практически не отличается в норме и в отсутствие фактора XI. Только после 25-30 мин и на расстоянии -0.7 мм от активатора появляется разница (в отсутствие фактора VIII она возникает после 5-10 мин и на расстоянии -0.3 мм).

3.8. Остановка роста сгустка при участии протеина С. Влияние эндотелия на свертывание крови в математической модели имитировалось добавлением в систему тромбомодулина (от 100 до 3 нМ). Расчеты предсказали, что это ведет к остановке роста сгустка на расстоянии 0.2-1 мм от активатора, в зависимости от концентрации тромбомодулина. На основании этих расчетов были проведены эксперименты, результаты которых совпали с предсказаниями модели.

При средних концентрациях (10 нМ), тромбомодулин не влиял на инициацию свертывания, но останавливал его неограниченное распространение. Добавление тромбомодулина вело к производству высоких концентраций активированного протеина С комплексом тромбин-тромбомодулин. Он быстро распространялся от активатора, уничтожая все следы активного фактора V в плазме и предотвращая дальнейшее формирование и распространение тромбина.

4. Практические приложения исследований по регуляции динамики свертывания крови. Описанные выше исследования регуляции свертывания крови позволили сформулировать ряд предположений, которые могут иметь практическую значимость: о роли различных реакций свертывания в точечных и пространственно-неоднородных системах, о механизмах распространения и остановки тромбов, об управляющих реакциях в системе. Кроме того, в процессе работы разработана детальная математическая модель, которая может быть использована для анализа и предсказания результатов экспериментов. В последнем разделе работы мы использовали созданные инструменты и полученные результаты для анализа механизмов действия лекарственных препаратов.

4.1. Пространственная динамика свертывания крови при гемофилии A: Koale DVI. Для того, чтобы исследовать влияние заместительной терапии препаратом Koate DVI при гемофилии А на пространственную динамику свертывания, были проведены две серии экспериментов.

В одной из них анализировались образцы плазм от пациентов, проходивших терапию препаратом Koate DVI в Гемофилическом центре Гематологического центра РАМН. Тяжелому больному гемофилией А (активность фактора VIII<1%) вводился препарат Koate DVI (40 Ед/кг), затем на протяжении суток у больного брались пробы на активность фактора VIII (определение производилось в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН) и на исследования скорости роста сгустка. Пробы обрабатывались и исследовались, как описано в методической главе. Затем для каждого эксперимента строились профили светорассеяния и рассчитывалась скорость роста сгустка.

Далее, для того, чтобы оценить эффект Koate DVI, мы добавили этот препарат в плазм)' больного гемофилией A (VHI:C<1%). При концентрации Koate DVI меньшей, чем 1-5 мкг/мл, улучшающего эффекта на скорость роста сгустка не наблюдалось. Скорость роста сгустка росла по мере увеличения концентрации Koate DVI; при концентрации, равной 20 мкг/мл, скорость роста нормализовалась и не менялась дальше при увеличении концентрации вплоть до 625 мкг/мл. Эти сведения хорошо согласуются с клиническими представлениями о связи концентрации фактора VIII с активностью системы свертывания. Они могут быть использованы для выявления склонности к кровотечению и назначению индивидуальной терапии и дозировки препарата.

4.2. Пространственная динамика свертывания при гемофилии А: Агемфил А. Задачей данного исследования было изучить влияние Агемфила А на пространственный рост фибринового сгустка. План эксперимента был аналогичен исследованию Коэйт DVI. Были проведены две основные серии экспериментов.

В первой серии исследовалась фармакокинетика Агемфила А. Препарат переливался тяжелым больным гемофилией А в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН, и на протяжении 30 часов брались пробы крови и исследовалась динамика роста сгустка. Параллельно в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН те же пробы крови исследовались на активность фактора VIII. Всего было проведено 4 опыта по фармакокинетике Агемфила А на 4-х разных пациентах, давших согласующиеся результаты.

Во второй серии экспериментов препарат добавлялся в разных концентрациях непосредственно в плазму перед наблюдением за скоростью роста сгустка. Для того, чтобы оценить эффект Агемфила А, мы протитровали плазму больного гемофилией A (VIII:C<1%) этим препаратом.

В фармакокинетическом исследовании Агемфила А скорость роста сгустка хорошо коррелировала с активностью фактора VIII. Однако, несмотря на то, что активность фактора к концу 30-часового периода падала до -10% от нормы, скорость роста сгустка оставалась довольно высокой (-25 мкм/мин, т.е. более 50% от нормы). В эксперименте по титровке препарата, при концентрации препарата скорость роста сгустка в зависимости от концентрации препарата росла линейно в полулогарифмической шкале. Выводы из этого исследования согласуются с полученными при работе с Коэйтом DVI.

4.3. Механизм действия активированного фактора VII. Активированный фактор VII был впервые применен в клинике в начале 1980-х годов как средство для улучшения гемостаза у больных гемофилией, имевших ингибиторные антитела. В настоящий момент разными авторами были предложены две гипотезы о его предпочтительном пути действия. Одна предполагает, что действие препарата преимущественно TF-зависимо, вторая — что оно не зависит от TF и определяется взаимодействием с фосфолипидами.

Мы использовали математическую модель, чтобы проанализировать этот вопрос. Была рассчитана зависимость времени свертывания и максимума тромбина от концентрации добавленного фактора Vila, при этом в одной из серий расчетов TF-независимый механизм был отключен. Модель предсказала два принципиально разных варианта: если эти реакции не существуют, то при увеличении Vila выше 10 нМ никакого увеличения максимума тромбина не будет; а если существуют, то будет. Эксперименты, выполненные параллельно с расчетами, показали, что справедливо второе предположение, и TF-независимые реакции вносят значительный вклад в генерацию тромбина. Во втором теоретическом эксперименте мы моделировали генерацию тромбина, отключая каждый из механизмов (TF-зависимый или

TF независимый). Эффект в сильнейшей степени определялся условиями моделируемого эксперимента. При высокой концентрации TF (100 пМ) работал TF-зависимый механизм. Если же отключался TF-независимый механизм, то эффект Vila почти не падал. В то же время при низком TF (1 пМ) вклад TF-независимого механизма был преобладающим.

Наши результаты позволяют предположить, что TF-независимый механизм вносит заметный вклад в нормализацию свертывания, особенно при малой активации или вдали от активатора. Этот вывод может иметь значение при принятии решения о применении препарата и планировании дозировки.

Глава 4 посвящена обсуждению основных результатов работы, связанных с регуляцией свертывания крови; остальные результаты обсуждаются в тех разделах главы 3, где описывается их получение.

Целью данного исследования было систематически разобраться в механизмах, регулирующих сложную сеть реакций свертывания крови, выявить функции различных частей этой системы и понять ее устройство.

В качестве основного инструмента при ответе на поставленные вопросы было выбрано математическое моделирование, используемое в комбинации с экспериментами. Необходимость детального изучения отдельных реакций и подсистем свертывания при построении модели, необходимость последующей проверки модели, применение модели и полученных результатов к разным практическим задачам привели к тому, что в процессе ответа на основной вопрос нами были проведены вспомогательные исследования. Это способствовало получению полезных побочных результатов, начиная с выявления молекулярных подробностей механизма сборки мембранно-зависимого комплекса внутренней теназы и заканчивая фармакокинетикой препаратов факторов крови.

Главные новые результаты работы можно представить наглядно в виде Рис. 7. На нем показана система свертывания, разбитая на модули, отвечающие за отдельные задачи. Ниже приведен список таких модулей и их функций с указанием того, были ли данные модули о их функции очерчены в настоящей работе или же в работах других исследователей:

6: Остановка

5: Пространственное распространение /

Порог пошмертацш

Рис. 6. Выявление модулей в системе свертывания крови. Ключевые результаты настоящего исследования и их место в современных представлениях о регуляции свертывания можно наглядно представить с помощью этой схемы. Можно выделить шесть модулей, ответственных за шесть подзадач.

1) Основной каскад: роль скорее структурная, а не регуляторная (настоящая работа).

2) Полимеризация фибрина: порог (другие исследования и настоящая работа).

3) Петля положительной обратной связи, активация фактора V: переключение (настоящая работа).

4) Петля положительной обратной связи, активация фактора VII фактором Ха: регуляция потоком крови (другие исследования).

5) Петля положительной обратной связи, активация факторов VIII и XI: пространственное распространение (другие исследования и настоящая работа).

6) Петля отрицательной обратной связи, путь протеина С: пространственная локализация (настоящая работа).

В процессе этой работы нами было создано значительное количество инструментов и методологических приемов, которые могут быть полезными для специалистов по теоретической, математической, системной биологии. Некоторые из них (модель свертывания в целом) имеют более узкую область применимости, другие (модели мембранно-зависимых реакций) могут оказаться полезными за пределами свертывания. Наиболее интересным методологическим результатом этой работы является разработка и формулировка подхода к анализу биологических сетей произвольной сложности. Он базируется на гипотезе о модульной функциональной структуре этих сетей и задействует в качестве основных инструментов детальное математическое моделирование, анализ чувствительности и анализ временной иерархии процессов.

С точки зрения системной биологии, свертывание крови оказывается интересным и необычным примером регуляции. Эта сложная сеть реакций содержит пять важных обратных связей, которые используются для выполнения широкого круга регуляторных функций.

С точки зрения гемостазиологии, наш анализ предполагает значительный терапевтический потенциал специализированного фармакологического воздействия на отдельные модули этой системы. Современные терапевтические и диагностические стратегии в свертывания обычно основаны на предположении, что воздействия лекарств является просто про- или антикоагулянтным, без учета сложности ответа сети; и в результате лечение тромбоза может привести к опасности кровотечения. Если бы мы смогли специфически регулировать отдельные блоки в свертывании, отдельно управляя порогом или чувствительностью к потоку, то терапия свертывания получила бы мощное средство лечения тромбозов и кровотечений. Результаты настоящего исследования дают возможность сделать существенный шаг в этом направлении.

Выводы

1. Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Его особенностью является возможность исследовать нестационарные системы произвольной сложности, в том числе в присутствии диффузионных и конвекционных потоков. Он позволяет выделить в биологической системе функциональные модули, разделить их структурные и управляющие элементы, построить редуцированные математические модели отдельных модулей.

2. Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. Кроме того, в процессе построения модели:

2.1. Выявлен молекулярный механизм сборки комплекса, активирующего фактор X во внутреннем пути свертывания крови. Экспериментально обнаружена новая роль фактора VIII в этом комплексе, которая заключается в регуляции доставки субстрата, фактора X, к ферменту, фактору 1Ха. Впервые построена детальная модель мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы.

2.2. Экспериментально установлено неравномерное связывание компонентов внутренней теназы с активированными тромбоцитами: активация тромбином ведет к формированию малой субпопуляции, клетки которой имеют высокую поверхностную плотность фосфатидилсерина и кальций-зависимым образом связывают преобладающее большинство факторов свертывания.

2.3. Выявлен новый режим регуляции ферментативного комплекса внешней теназы при участии ингибитора пути тканевого фактора.

3. Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций. Предсказаны с помощью математической модели и подтверждены экспериментально функции трех модулей:

3.1. Путь фактора V: отвечает за триггерный ответ системы свертывания крови на активирующий сигнал.

3.2. Внутренний путь: регулирует пространственное распространение свертывания; при этом первостепенная контролирующая роль принадлежит диффузии фактора 1Ха и активации фактора VIII, а дополнительная регуляция осуществляется с помощью реакции активации фактора XI тромбином.

3.3. Путь протеина С: определяет остановку роста тромба посредством переключения активности тромбина тромбомодулином.

4. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с гемофилией A in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в реферируемых научных изданиях

1. МА Пантелеев. Регуляция начальной стадии свертывания ингибитором пути тканевого фактора. Тромбоз, гемостаз и реология 2002; (1): 94-97.

2. MA Panteleev, VI Zarnitsina, FI Ataullakhanov. Tissue factor pathway inhibitor: a possible mechanism of action. Eur J Biochem 2002; 269(8): 2016-2031.

3. КГ Копылов, ОП Плющ, ЕГ Лопатина, ТВ Северова, ФИ Атауллаханов, МА Пантелеев. Домашнее лечение концентратом фактора VIII больных гемофилией А. Проблемы гематологии и переливания крови 2003; (2): 15-27.

4. MA Panteleev, EL Saenko, NM Ananyeva, FI Ataullakhanov. Kinetics of factor X activation by the membrane-bound complex of factor IXa and factor Villa. Biochem J 2004: 381(3): 779-794.

5. MA Пантелеев, AA Токарев, AA Бутылии. Теоретические исследования гемостаза и тромбоза. Новое в трансфузиологии 2005; (11): 42-57.

6. FI Ataullakhanov, MA Panteleev. Mathematical modelling and computer simulation in blood coagulation. Pathophysiol Ilaemost Thromb 2005; 34(2-3): 60-70.

7. FI Ataullakhanov, MA Panteleev. Towards virtual coagulation. Pathophysiol Haemost Thromb 2005; 34(2-3): 58-59.

8. EA Ermakova, MA Panteleev, EE Shnol. Blood coagulation and propagation of autowaves in flow. Pathophysiol Haemost Thromb 2005; 34(2-3): 135-142.

9. MA Panteleev, NM Ananyeva, N J Greco, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. J Thromb Haemost 2005; 3(11): 2545-2553.

10. MV Ovanesov, NM Ananyeva, MA Panteleev, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3(2): 321-331.

11. MA Panteleev, NM Ananyeva, NJ Greco, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Factor Villa regulates substrate delivery to the intrinsic factor X-activating complex. FEBS J 2006; 273(2): 374-387.

12. AA Tokarev, YuV Krasotkina, MV Ovanesov, MA Panteleev, MA Azhigirova, VA Volpert, FI Ataullakhanov, AA Butilin. Spatial dynamics of contact-activated fibrin clot formation in vitro and in silico in haemophilia B: effects of severity and Ahemphil В treatment. Math Mod Nat Phenomena 2006; 1(2): 124-137.

13. MA Panteleev, MV Ovanesov, DA Kireev, AM Shibeko, EI Sinauridze, NM Ananyeva, AA Butylin, EL Saenko, FI Ataullakhanov. Spatial propagation and localization of blood coagulation are respectively regulated by intrinsic and protein С pathways. Biophys J 2006; 90(5): 1489-1500.

14. MA Panteleev, NM Ananyeva, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Mathematical models of blood coagulation and platelet adhesion: clinical applications. Curr Pharm Des 2007; 13(14): 1457-1467.

15. EI Sinauridze, DA Kireev, NY Popenko, AV Pichugin, MA Panteleev, OV Krymskaya, FI Ataullakhanov. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007; 97(3): 425-434.

16. AA Бутылин, MA Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Пространственная динамика свертывания крови. Российский химический журнал 2007; 51(1): 45-50.

17. YaN Kotova, FI Ataullakhanov, MA Panteleev. Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5'diphosphate acting via the P2Y12 receptor. J Thromb Haemost 2008; 6(9): 1603-1605.

18. MA Пантелеев, ЯН Котова, AA Токарев, ФИ Атауллаханов Механизмы регуляции свертывания крови. Терапевтический архив 2008; 80(7): 88-91.

19. МА Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 2008; 1(1): 50-62.

20. МА Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции. Клиническая онкогематология 2008; 1(2): 174-181.

21. MA Пантелеев, ЕИ Синауридзе, ФИ Атауллаханов. Свертывание крови: современные проблемы. Клиническая онкогематология 2008; 1(3): 259-265.

22. MV Ovanesov, MA Panteleev, EI Sinauridze, DA Kireev, OP Plyushch, KG Kopylov, EG Lopatina, EL Saenko, FI Ataullakhanov. Mechanisms of action of recombinant activated factor VII in the context of tissue factor concentration and distribution. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19(8): 743-755.

23. EA Ermakova, EE Shnol, MA Panteleev, AA Butylin, V Volpert, FI Ataullakhanov. On propagation of excitation waves in moving media: the FitzHugh-Nagumo model. PLoS ONE 2009; 4(2):e4454.

24. AM Шибеко, CC Карамзин, AA Бутылин, MA Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Обзор современных представлений о влиянии скорости течения на процесс плазменного свертывания крови. Биологические мембраны 2009; 26(6): 443-450.

25. ЯН Котова, ЕА Костанова, МА Розенфельд, ЕИ Синауридзе, МА Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Влияние ингибиторов цистеиновых протеиназ на тромбоцитарное и плазменное звенья системы свертывания крови. Биологические мембраны 2009; 26(6): 514-520.

26. AM Shibeko, ES Lobanova, MA Panteleev, FI Ataullakhanov. Blood flow controls coagulation onset via the positive feedback of factor VII activation by factor Xa. BMC Systems Biology 2010; 4(1): 5.

Публикации в трудах конференций и съездов

1. МА Пантелеев, ВИ Зарницына, ФИ Атауллаханов. Регуляция начальной стадии свертывания крови ингибитором пути тканевого фактора. Конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 24-26 октября 2001 г. (Труды .... стр. 87-88).

2. МА Пантелеев, ВИ Зарницына, ФИ Атауллаханов. Математическая модель для тестов активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), протромбинового времени (ПВ) и разбавленного тромбопластинового времени (РТВ). VII национальная конференция "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза", Москва, 27-29 марта 2002 г. (Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов, 2002, Приложение 1, с. 98-99).

3. МА Panteleev, VI Zarnitsina, FI Ataullakhanov. A possible mechanism of action of tissue factor pathway inhibitor. The 3rd Annual Conference on Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, Salt-Lake-City, Utah, April 6-8, 2002 (Proceedings of..., p. 98).

4. MA Пантелеев, ВИ Зарницына, ФИ Атауллаханов. Математическое моделирование пространственной динамики свертывания крови. I Всероссийский съезд гематологов, Москва, 16-18 апреля 2002 г. (Проблемы гематологии и переливания крови, 2002 г., н. 1,с. 67).

5. МА Panteleev, VI Zarnitsina, FI Ataullakhanov. Mathematical model of blood coagulation. The V International Congress on Mathematical Modeling, Dubna, Moscow Region, September 30-0ctober 6, 2002 (Proceedings of..., p. 218).

6. MA Пантелеев, ЕЛ Саенко, ФИ Атауллаханов. Кинетика активации фактора Ха мембранно-связанным комплексом факторов 1Ха и Villa. Конференция "От

современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 11-14 ноября 2002 г. (Труды ..., стр. 108-109).

7. AM Самойлов, МА Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Зависимость интенсивности светорассеяния фибринового сгустка от концентрации фибриногена в плазме крови. Конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущин о, 11-14 ноября 2002 г. (Труды стр. 124).

8. МА Пантелеев, ВИ Зарницына, ФИ Атауллаханов. Математическая модель пространственной динамики свертывания крови. 1-я Всероссийская Конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 5-6 февраля 2003 г. (Труды ..., с. 71).

9. MV Ovanesov, EI Sinauridze, МА Panteleev, OP Plyushch, KG Kopylov, EG Lopatina, FI Ataullakhanov. Comparative study of the effect of recombinant factor Vila on clot growth and thrombin generation in normal and hemophilia A plasma in vitro. XlXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Birmingem, UK, July 12-18,

2003 (J Thromb Haemost 2003; Supplement 1: PI 109, Birmingham, UK).

10. M Panteleev, EL Saenko, FI Ataullakhanov. Kinetics of factor X activation by membrane-bound complex of factor IXa and factor Villa. XlXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Birmingham, UK, July 12-18, 2003 (J Thromb Haemost 2003; Supplement 1: PI066, Birmingham, UK).

11. MA Panteleev, MV Ovanesov, FI Ataullakhanov. The mechanism of action of high-dose factor Vila in preventing bleeding in hemophilia. Computational simulation studies. XIX Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Birmingham, UK, July 12-18, 2003 (J Thromb Haemost 2003; Supplement 1: P1618, Birmingham, UK).

12. MA Panteleev, MV Ovanesov, EI Sinauridze, EL Saenko, FI Ataullakhanonov. Spatiotemporal dynamics of blood coagulation. Computational simulation studies. The 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, MD, USA, Februry 14-18, 2004 (Biophys J 2004; 86(1 Pt 2): 1561-Pos).

13. Лобанова EC, Пантелеев MA, Атауллаханов ФИ. Пространственная динамика роста сгустка в условиях кровотока. III Съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня.

2004 (Труды..., т. I, стр. 352-353).

14. Токарев АА, Пантелеев МА, Атауллаханов ФИ. Редукция математической модели свертывания крови. III Съезд биофизиков России, Воронеж, 24-29 июня, 2004 (Труды... т. I, стр. 384-386).

15. МА Panteleev, NM Ananyeva, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Two subpopulations of activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic fX-activating complex. XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Sydney, Australia, August 6 - 12, 2005 (Proceedings..., abstract P0376).

16. MA Panteleev, NM Ananyeva, NJ Greco, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Factor Villa regulates substrate delivery to the intrinsic factor X-activating complex. XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, August 6 -12, 2005 (Proceedings..., abstract P1242).

17. ES Lobanova, AM Shibeko, MA Panteleev, FI Ataullakhanov. Computer simulation model of spatial dynamics of fibrin clot growth under conditions of blood flow. XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, August 6 -12,2005 (Proceedings..., abstract P0613).

18. MA Panteleev, NM Ananyeva, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Factor Villa regulates substrate delivery to intrinsic factor X-activating complex. 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference 'The Protein World', Budapest, Hungary, July 2-7, 2005 (FEBS J 2005, vol. 272, suppl. l,p. 405).

19. MA Panteleev, NM Ananyeva, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Factor Villa regulates substrate delivery to intrinsic factor X-activating complex. FEBS forum for young scientists, Visegrad, Hungary, June 30 - July 2, 2005 (Proceedings..., p. 97).

20. MA Panteleev, MV Ovanesov, AM Shibeko, AA Tokarev, El Sinauridze, FI Ataullakhanov. Computer simulation study of blood coagulation control. Workshop "Mathematical models and methods in biology and medicine", Bedlewo, Poland, May 29 -June 3, 2005 (Proceedings..., p. 12).

21. NM Ananyeva, MA Panteleev, NJ Greco, FI Ataullakhanov, EL Saenko. Factor Villa regulates substrate delivery to the intrinsic factor X-activating complex. 10th Congress of the European Hematology Association, June 2-5, 2005, Stockholm, Sweden (Proceedings..., abstract 0312).

22. AM Shibeko, ES Lobanova, MA Panteleev, OE Avilov, AV Gusev, EE Shnol, FI Ataullakhanov. Mathematical modeling of fibrin clot formation in the presence of blood flow. 1st Intl Conf Mathematical Biology and Bioinformatics (October 9-15, 2006, Pushchino, Russia): (Proceedings..., p. 55-56).

23. AA Tokarev, MA Panteleev, AA Butylin, FI Ataullakhanov. Different phases of spatial and homogeneous clotting are controlled by different groups of the coagulation cascade components. Workshop "Modelling of blood diseases", 5-9 Nov 2007, Lyon, France. Proceedings..., p. 16,

24. AM Shibeko, MA Panteleev, ES Lobanova, FI Ataullakhanov. Blood flow suppresses feedback activation of extrinsic tenase by factor Xa and prevents clotting(theoretical research). Workshop "Modelling of blood diseases", 5-9 Nov 2007, Lyon, France. Proceedings..., p. 18.

25. AM Shibeko, MA Panteleev, FI Ataullakhanov. Binding of fibrinogen to fibrin as a regulator of fibrin polymerization initiation. Workshop "Modelling of blood diseases", 5-9 Nov 2007, Lyon, France. Proceedings..., p. 19.

26. JC Bordet, M Panteleev, JL Plantier, YD Dargaud, F Ataullakhanov, С Negrier. Regulation of thrombin generation and clot growth by mutant factor VIII molecule. Workshop "Modelling of blood diseases", 5-9 Nov 2007, Lyon, France. Proceedings..., p. 2

27. MA Panteleev, FI Ataullakhanov. Understanding the complexity of blood coagulation: possible implications for diagnostics and therapy. Workshop "Modelling of blood diseases", 5-9 Nov 2007, Lyon, France. Proceedings..., p. 3.

28. НГ Коротина, MA Пантелеев, EJI Саенко, ФИ Атауллаханов. Исследование механизмов инактивации активированного фактора VIII системы свертывания крови in vitro. 11-я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI-го века". 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино. (Труды..., стр. 147).

29. ЯН Котова, MA Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Секреция АДФ регулирует формирование гетерогенных субпопуляций при активации тромбоцитов крови. 11-я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI-ro века". 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино. (Труды..., стр. 148)

30. АН Баландина, ДА Киреев, МА Пантелеев, ИИ Шмырев, AM Шибеко. ФИ Атауллахонов. Пороговое поведение системы свертывания крови при активации различной плотностью тканевого фактора. 11 -я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI-го века". 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино. (Труды..., стр. 69).

31. AM Шибеко, МА Пантелеев, ФИ Атауллаханов. Реакция связывания фибриногена с фибрином как регулятор начальной стадии полимеризации фибрина. 11 -я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука ХХ1-го века". 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино. (Труды..., стр. 63).

32. АН Баландина, MB Ованесов, AM Шибеко, МА Пантелеев, ВИ Сарбаш, Атауллахонов Ф.И. Пространственная динамика генерации тромбина в плазме крови. 11-я международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука ХХ1-го века". 29 октября - 2 ноября 2007, Пущино. (Труды..., стр. 231).

33. AN Balandina, DA Kireev, MA Panteleev, II Shmirev, AM Shibeko, FI Ataullakhanov. Threshold behavior of the blood clotting system activated by the tissue factor. XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Geneva 2007, July 6-12 (Proceedings.... abstract P-S-004).

34. AM Shibeko, OE Avilov, MA Panteleev, ES Lobanova, FI Ataullakhanov. Blood flow suppresses feedback activation of extrinsic tenase by factor Xa and prevents clotting. XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Geneva 2007, July 6-12 (Proceedings..., abstract P-T-009).

35. MA Panteleev, FI Ataullakhanov. Formation of subpopulations with different phosphatidylserine expression during thrombin-stimulated platelet activation is controlled by ADP secretion. XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis Geneva 2007, July 6-12 (Proceedings..., abstract P-W-289).

36. ЯН Котова, ФИ Атауллаханов, MA Пантелеев. Механизмы внутриклеточной сигнализации в формировании гетерогенных субпопуляций при активации тромбоцитов крови. Конференция "Биология — наука XXI-го века", 2008, Пущино. (Труды..., стр. 89).

37. YN Kotova, FI Ataullakhanov, МА Panteleev. Role of P2Y12 receptor at formation of heterogeneous platelet subpopulations. 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Athens, 28 June - 3 July 2008 (Proceedings of..., p. 325).

38. YN Kotova, FI Ataullakhanov, MA Panteleev. Identification of signal transduction pathways controlling formation of heterogeneous subpopulations during platelet activation. 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research, Vienna, February 04 - 07, 2009 (Proceedings of..., p. A59).

39. A Balandina, M Panteleev, A Shibeko, I Shmirev, F Ataullakhanov. Regulatory functions of positive feedbacks of factors V and VII activation in blood clotting initiation. XXIInd Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Boston, July 11-16, 2009 (Proceedings..., abstract PP-MO-235).

40. M Panteleev, A Balandina, M Ovanesov, E Lipets, F Ataullakhanov. Task-oriented modular analysis of the blood coagulation network: the role of factor V feedback activation in triggering clot formation. XXIInd Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Boston, July 11-16, 2009 (Proceedings..., abstract PP-WE-253).

Содержание диссертации, доктора физико-математических наук, Пантелеев, Михаил Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Система гемостаза.

1.2. Система свертывания крови.

1.2.1. Биохимия свертывания крови.

1.2.2. Формирование фибринового сгустка.

1.2.3. Тромбин.

1.2.4. Активация каскада свертывания.

1.2.5. Ингибиторы свертывания.

1.2.6. Кофакторы и мембранно-зависимые реакции.

1.2.7. Доменная структура фактора VIII.

1.2.8. Прочие петли положительной обратной связи.

1.2.9. Путь протеина С.

1.2.10. Контактная активация свертывания.

1.2.11. Роль тромбоцитов в свертывании.

1.2.12. Переключение активности тромбина.

1.2.13. Взаимодействие свертывания с другими системами.

1.2.14. Система свертывания — заключение.

1.3. Механизмы активации тромбоцитов.

1.3.1. Активаторы тромбоцитов и типы тромбоцитарных ответов.

1.3.2. Рецепторы.

1.3.3. Пути сигнализации в тромбоцитах.

1.3.4. "Укутанные" тромбоциты.

1.3.5. Механизмы активации тромбоцитов — заключение.

1.4. Экспериментальные модели и методы исследования свертывания крови.

1.4.1. Особенности свертывания in vivo и их исследование in vitro.

1.4.2. Экспериментальные модели свертывания in vivo.

1.4.3. Ex vivo.

1.4.4. In vitro: классические.

1.4.5. In vitro: учет пространственной неоднородности и потока.

1.4.5. Экспериментальные модели — заключение.

1.5. Математические модели свертывания крови.

1.5.1. Классификация математических моделей.

1.5.2. Упрощенные и феноменологические модели.

1.5.3. Детальные модели.

1.5.4. Модели свертывания крови - заключение.

1.6. Методы анализа сложных систем ферментативных реакций.

1.6.1. Классификация методов теоретической системной биологии.

1.6.2. Методы исследования стационарных систем.

1.6.3. Методы исследования нестационарных систем.

1.6.4. Методы анализа - заключение.

1.7. Постановка задачи.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Теоретические методы.

2.1.1. Математическая модель свертывания крови.

2.1.2. Допущения модели.

2.1.3. Построение модели.

2.1.4. Численные методы для точечной модели.

2.1.5. Численные методы для реакционно-диффузной модели.

2.2. Экспериментальные методы.

2.2.1. Анализ тромбоцитарных субпопуляций.

2.2.2. Сборка комплекса внутренней теназы.

2.2.3. Пространственная динамика свертывания крови.

2.2.4. Кинетика генерации фибрина в точечной системе.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Порог по активации в свертывании крови.

3.1.1. Выявление модулей и редукция: метод.

3.1.2. Идентификация подзадач и выходных параметров в системе свертывания.

3.1.3. Анализ чувствительности в применении к начальной кинетике свертывания.

3.1.4. Чувствительность и необходимость: возможные ошибки.

3.1.5. Сравнение полоэюительных обратных связей в системе свертывания.

3.1.6. Шаг А: удаление несущественных переменных и реакций.

3.1.7. Шаг Б: редукция модели с использованием временной иерархии процессов.

3.1.8. Исследование редуцированной системы.

3.1.9. Исследование полной модели.

3.1.10. Механизм переключения в системе свертывания.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы регуляции свертывания крови"

Актуальность темы. Свертывание крови представляет собой сложную сеть ферментативных реакций в плазме крови. Ее основой служит каскад активирующих друг друга сериновых протеиназ, охваченный многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей — реакций, в которых ферменты нижних ступеней каскада воздействуют на компоненты, находящиеся на более высоких ступенях [1,2]. Основная задача свертывания заключается в предотвращении потери крови при нарушении целостности сосудистой системы. Она реализуется посредством расщепления белка фибриногена, присутствующего в плазме крови, которое ведет к его превращению в способный к полимеризации белок фибрин. В свою очередь, формирование сети волокон фибрина приводит к локальному переходу плазмы крови из жидкого в гелеобразное состояние и остановке кровотечения. Помимо наиболее очевидной функции, остановки кровотечения при ранениях, свертывание крови участвует в защите организма от различных внутренних повреждений и кровоизлияний, микротравм, которые постоянно возникают при любой мышечной нагрузке, заживлении ран, иммунном ответе, формировании сосудистой системы при ангиогенезе.

Нормальное функционирование кровеносной системы требует постоянного поддержания деликатного баланса между жидким состоянием крови в норме и способностью быстро сформировать фибриновый сгусток. Такое положение дел приводит к тому, что система остановки кровотечения, система гемостаза оказывается не только жизненно важной, но одновременно и одной из самых уязвимых систем организма. Отклонение вышеописанного баланса создает опасность возникновения кровотечения, тромбоза или же более сложной патологии наподобие диссеминированного внутрисосудистого свертывания [3-5]. Такие отклонения нередко возникают при самых разных заболеваниях или состояниях, изначально не связанных напрямую со свертыванием: раке, сепсисе, атеросклерозе, травме, беременности и других. В связи с этим нарушения свертывания крови являются, прямо или косвенно, лидирующей причиной смертности и инвалидности в современном мире.

Борьба с нарушениями свертывания затруднена высокой сложностью этого процесса. В нем задействованы десятки белков, взаимодействующие в сотнях реакций друг с другом, с клетками крови и сосудистой стенки; и указанное взаимодействие происходит на фоне диффузии участников реакций и их переноса кровотоком. Наличие сложных и нелинейных обратных связей в каскаде свертывания приводит к тому, что его ответ на внешнее воздействие оказывается сложно предсказать на основании интуитивных соображений [6]. На практике это означает, что большинство современных лекарственных средств не могут эффективно вернуть свертывание к нормальному состоянию: применение антитромботических препаратов почти всегда связано с риском развития кровотечений, а попытки улучшить свертывание крови часто ведут к тромбозам [7]. Схожие проблемы возникают и при диагностике: например, удлинение активированного частичного тромбопластинового времени не обязательно связано с кровотечениями, а прокоагулянтные изменения в плазме этим тестом не регистрируются совершенно [8,9].

Ключевым препятствием на пути развития более совершенных методов диагностики и терапии свертывания крови оказывается недостаточное понимание его регуляции [10,11]. В этой сложной сети реакций только одна — полимеризация фибрина — непосредственно нужна для перехода плазмы крови в гелеобразное состояние. Весь остальной каскад с его сложными механизмами, десятками факторов, ингибиторов, положительных и отрицательных обратных связей выполняет чисто регуляторную роль. Выяснение того, зачем система свертывания устроена так сложно, и какую роль играет каждый из ее компонентов, может привести к качественному прогрессу в нашей способности ею управлять.

Описанные обстоятельства позволяют сделать первый вывод: о практической важности исследований регуляции свертывания крови, обусловленной значительностью вклада нарушений свертывания в смертность и инвалидность.

Что сейчас известно о регуляции системы свертывания? Еще на самых ранних этапах ее исследования появлялись гипотезы о возможных причинах каскадного устройства [12]. В последние десятилетия на пути к его пониманию были сделаны несколько принципиальных шагов. Основополагающие теоретические работы М.А. Ханина и сотрудников [6,13] выявили роль положительных обратных связей в формировании в ферментативных каскадах порога по активации — способности системы переключаться между устойчивыми стационарными состояниями в зависимости от силы активации. Другая функция обратных связей, регуляция пространственного распространения свертывания, была предложена в серии теоретических и экспериментальных работ Ф.И. Атауллаханова и сотрудников [14-18]. Третье возможное следствие наличия положительных обратных связей, пороговый ответ по скорости кровотока, было предсказано Э. Бельтрами и Дж. Джести [19]. Однако, до настоящего момента не предпринималось попыток проанализировать и понять структуру каскада свертывания в целом, систематически и с единых позиций изучить функции его различных частей. Кроме того, почти все перечисленные результаты были предсказаны с помощью сильно упрощенных математических моделей. За редким исключением [14,17], они не были проверены на детальных моделях или в эксперименте. Типичным примером существующей неопределенности в вопросе регуляции свертывания крови может служить ситуация с порогом по активации. За последние двадцать лет теоретики предлагали самые разные положительные обратные связи в качестве его регуляторов [6,20-24], в то время как сам порог, являющийся предметом столь разрозненных мнений, экспериментально не обнаружен [25,26].

Подобная скудность доказательств и отсутствие единых представлений приводит нас ко второму заключению: об актуальности детального исследования регуляции свертывания крови.

Но какая стратегия должна быть избрана для такой работы? Изучение сложных систем биохимических реакций, начавшееся в 1960-е годы, привело к созданию проработанных теорий и методов для исследования полиферментных систем, примерами которых могут быть анализ метаболического контроля и теория биохимических систем [27]. Однако, такие методы были эффективны в основном при анализе стационарных, пространственно однородных систем реакций, и потому не играли заметной роли в исследованиях свертывания.

С другой стороны, прогресс в биохимии и вычислительной математике привел к тому, что на рубеже ХХ-го и ХХ1-го века отдельные направления исследования полиферментных систем, методы биоинформатики и математической биологии слились, породив новую дисциплину — системную биологию [28]. Ее целью является детальное, количественное, не допускающее априорной редукции, всестороннее исследование сложных биологических систем. В отличие от теорий метаболического контроля, системная биология не накладывает ограничений на классы изучаемых систем: в ней создаются подходы для изучения систем, которые могут быть пространственно неоднородными, нестационарными, плохо определенными, стохастическими. В рамках системной биологии получила важное развитие идея иерархической, модульной структуры биологических систем [28,29]; в ней также нашел активное применение анализ чувствительности, универсальный метод тестирования и изучения сложных математических моделей [30]. Тем не менее, современный арсенал методов системной биологии не содержит готовых подходов для решения сформулированной выше проблемы исследования регуляции свертывания крови. Попытки применить к свертыванию традиционные варианты анализа чувствительности не выявили новых данных о его регуляции [31,32], а существующие примеры модульного анализа сложных систем не содержат единообразных алгоритмов выделения таких функциональных модулей [33].

Отсюда мы можем сделать третье заключение: об актуальной проблеме развития методов системной биологии и адаптации их к анализу регуляции нелинейных, нестационарных, пространственно неоднородных систем реакций, подобных свертыванию крови.

Какой бы метод анализа сложной системы мы не выбрали или не создали, его реализация невозможна без математической модели. Такая модель должны быть детальной, потому что невозможно понять роль какой-либо реакции в системе свертывания, если такая реакция в модели отсутствует. Далее, такая модель должна быть построена предельно тщательно и должна быть проверена сравнением с экспериментальными данными на всех уровнях организации, потому что даже медленная и внешне незначительная реакция в сложной системе может сыграть контролирующую роль: ярким примером тут может быть ключевая роль медленных обратных реакций в управлении стационарным состоянием в теориях метаболического контроля. Таким образом, произвол в выборе параметров системы и механизмов реакций недопустим, если мы хотим получить модель, способную решить нашу задачу. Наш анализ литературы не выявил математических моделей, способных удовлетворить таким требованиям.

И так мы приходим к последнему заключению: об необходимости работы по созданию новой, детальной, согласованной на всех уровнях организации с экспериментом математической модели свертывания крови.

Подводя итоги нашему рассмотрению, мы можем сделать заключение о практической значимости, важности и актуальности работы по выявлению механизмов регуляции свертывания крови. Однако, такая работа осложняется отсутствием подходящих системно-биологических подходов и математических моделей. Рассмотренные принципиальные проблемы определяют структуру настоящего исследования.

Цель работы: Выявление и анализ механизмов регуляции свертывания крови.

Задачи исследования:

1. Разработка алгоритма анализа сложных, нестационарных, неточечных биологических систем.

2. Построение детальной математической модели свертывания крови; экспериментальное исследование кинетики отдельных реакций и блоков системы свертывания для тестирования модели.

3. Выявление молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию процесса свертывания.

4. Применение полученных результатов к практическим задачам — исследованию методов диагностики нарушений свертывания и механизмов действия лекарственных препаратов.

Научная новизна. Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. С их использованием выявлен механизм и динамика порогового поведения системы свертывания крови. Экспериментально показана новая роль фактора VIII в регуляции доставки субстрата к ферменту в комплексе внутренней теназы. Впервые построена детальная модель мембранно-зависимой реакции, катализируемой комплексом внутренней теназы. Выявлен механизм, с помощью которого внутренняя теназа регулирует пространственную динамику свертывания крови. Теоретически предсказана и экспериментально обнаружена локализация пространственного роста тромба in vitro; показано, что она определяется путем протеина С. Установлено преимущественное связывание компонентов внутренней теназы с малой субпопуляцией, формирующейся при активации тромбоцитов. С помощью математического моделирования выявлен новый режим регуляции внешнего пути ингибитором пути тканевого фактора. С помощью теоретических и экспериментальных исследований влияния препаратов Агемфил А, Коэйт DVI, НовоСэвен на динамику свертывания крови пациентов с гемофилией A in vitro установлены зависимости их эффективности от дозы, выявлены механизмы действия, предложены стратегии по оптимизации терапии. Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций.

Научно-практическое значение. Разработанные в работе методы и построенные математические модели могут быть использованы в качестве инструментов для теоретического исследования биохимии, биофизики, фармакологии, как свертывания крови, так и других сетей ферментативных реакций, а также для планирования и анализа экспериментов. Выявленные механизмы отдельных реакций свертывания крови и взаимодействия факторов системы свертывания с фосфолипидными везикулами и активированными тромбоцитами могут быть использованы для создания новых про- и антикоагулянтов. Полученные результаты по регуляции динамики свертывания крови позволяют пересмотреть представления . о регуляции каскада и способах фармакологического воздействия. Они открывают путь для создания новых методов диагностики и фармакологического воздействия на систему свертывания.

Основные положения, выносимые на защиту;

1) Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе.

2) Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных.

3) Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Пантелеев, Михаил Александрович

Выводы

3.1. Путь фактора V: отвечает за триггерный ответ системы свертывания крови на активирующий сигнал.

Благодарности

Эта работа в была бы невозможна без помощи и поддержки многочисленных коллег, перед которыми я нахожусь в неоплатном долгу.

В первую очередь, я выражаю благодарность замечательному коллективу, в котором я имею удовольствие работать. Хотя необходимость разумного ограничения объема не позволяет перечислить здесь всех, кто внес вклад в этот проект, я не могу не воспользоваться случаем поблагодарить непосредственных соавторов, которые своими экспериментами, теоретическими расчетами, ценными советами и критикой принимали самое прямое и непосредственное участие в моей работе. Это Анна Николаевна Баландина, Андрей Александрович Бутылин, Вероника Игоревна Зарницина, Сергей Сергеевич Карамзин, Дмитрий Александрович Киреев, Наталья Геннадиевна Коротина, Яна Николаевна Котова, Елена Николаевна Липец, Екатерина Сергеевна Лобанова, Михаил Владимирович Ованесов, Леонид Александрович Парунов, Александра Валерьевна Похилко, Василий Иванович Сарбаш, Елена Ивановна Синауридзе, Алексей Александрович Токарев, Николай Николаевич Топалов, Алексей Михайлович Шибеко.

Огромную роль в наших исследованиях сыграло сотрудничество с коллегами из других лабораторий и институтов, которым я искренне признателен:

• Американский Красный Крест — Наталья Михайловна Ананьева, Николас Греко, Джеймс Куртц, Гэри Морофф, Евгений Львович Саенко, Андрей Гарунович Сарафанов, Шалини Ситхараман;

• Гемофилический центр ГНЦ РАМН — Елена Геннадиевна Лопатина, Константин Геннадиевич Копылов, Ольга Павловна Плющ;

• Институт Иммунологии — Алексей Васильевич Пичугин, Людмила Ивановна Ульянова

• Институт математических проблем биологии РАН — Эммануил Эльевич Шноль;

• Институт химической физики РАН — Елена Андреевна Ермакова;

• Институт проблем управления РАН — Ольга Леонардовна Морозова.

На различных этапах моей работы (главным образом, связанных с защитами различных квалификационных работ) она подвергалась рецензированию, и я в неоплатном долгу перед людьми, взявшими на себя колоссальный и неблагодарный труд изучить ее и способствовать ее улучшению своими ценными замечаниями. Это Мария Алексеевна Ажигирова, Владимир Николаевич Буравцев, Сергей Александрович Васильев, Майя Александровна Волкова, Борис Наумович Гольдштейн, Елена Евгеньевна Зыбунова,

Павел Сергеевич Иванов, Геннадий Иванович Козинец, Ирина Львовна Лисовская, Алексей Иванович Лобанов, Евгений Ильич Маевский, Владимир Александрович Макаров, Борис Ефимович Мовшев, Александр Григорьевич Погорелов, Михаил Абрамович Ройтберг, Валерий Григорьевич Савченко, Всеволод Александрович Твердислов, Михаил Александрович Ханин, Дмитрий Петрович Харакоз.

Наконец, не существует слов, которые могли бы выразить мою благодарность руководителю нашей команды, Фазоилу Иноятовичу Атауллаханову. На протяжении десяти лет он был для меня учителем и примером в науке и за ее пределами; его интеллектуальный вклад в нашу работу исключителен; а его титанические усилия, призванные обеспечить научную работу в условиях неблагоприятной внешней среды, превосходят всякое воображение. Спасибо!

Библиография Диссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Пантелеев, Михаил Александрович, Пущино

1. Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова. М.: Триада-Х, 1997.

2. Colman RW. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2006.

3. Воробьев АИ, Городецкий BM, Шулутко ЕМ, Васильев С А. Острая массивная кровопотеря. М.: Гзотар-Медиа, 2001.

4. Рагимов АА, Алексеева JIA. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. М.: Практическая медицина, 2007.

5. Мачабели МС. Тромбогеморрагическая теория общей патологии. Yen физиол наук 1986; 17: 56.

6. Khanin MA, Semenov VV. A mathematical model of the kinetics of blood coagulation. J Theor Biol 1989; 136: 127-134.

7. Jesty J, Beltrami E. Positive feedbacks of coagulation: their role in threshold regulation. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005; 25: 2463-2469.

8. Hemker HC, Giesen P, AlDieri R, Regnault V, de SE, Wagenvoord R, Lecompte T, Beguin S. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32: 249-253.

9. Hemker НС, A1 Dieri R, Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr Opin Hematol 2004; 11: 170-175.

10. Hemker HC, Beguin S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost 2000; 84: 747-751.

11. Hoffman M, Monroe DM. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost 2001; 85: 958-965.

12. Levine SN. Enzyme amplifier kinetics. Science 1966; 152: 651-653.

13. Khanin MA, Leytin VL, Popov AP. A mathematical model of the kinetics of platelets and plasma hemostasis system interaction. Thromb Res 1991; 64: 659-666.

14. Ovanesov MV, Krasotkina JV, Ul'yanova LI, Abushinova KV, Plyushch OP, Domogatskii SP, Vorob'ev AI, Ataullakhanov FI. Hemophilia A and В are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 4557.

15. Zarnitsina VI, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI. A mathematical model for the spatiotemporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II. Results. Thromb Res 1996; 84: 333-344.16

Информация о работе

Пантелеев, Михаил Александрович
доктора физико-математических наук
Пущино, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Механизмы регуляции свертывания крови - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы