Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка метода выделения и изучение характеристик антитромбина III как основы антитромботического лекарственного препарата

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка метода выделения и изучение характеристик антитромбина III как основы антитромботического лекарственного препарата"

005007024

На правах рукописи

Кряжевских Ирина Сергеевна

Разработка метода выделения и изучение характеристик антитромбина III как основы антитромботического лекарственного препарата

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 2 ЯНВ 2072

Москва 2011

005007024

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова и в ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России

Научный руководитель: академик РАМН, д.х.н.

Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук кандидат биологических наук

Баирамашвили Дмитрий Ильич Черновская Татьяна Вениаминовна

Ведущая организация: ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится «30» января 2012 г. в 15 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу: 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова

Автореферат представлен на сайте www.mon.gov.ru

Автореферат диссертации разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ *

Актуальность темы

Плазма донорской крови является уникальным источником различных белков, обладающих высокой лечебной эффективностью. Одной из важных функций плазмы крови является поддержание системы гемостаза, которая включает в себя процессы свертывания крови и фибринолиза, и обеспечивает нормальную циркуляцию крови.

В процессах свертывания и фибринолиза участвуют большое количество белков плазмы. Совокупность их превращений приводит к образованию тромба, и в дальнейшем его лизиса. Смещение равновесия между образованием тромба и его растворением в одну из сторон может привести к развитию сложных патологических состояний.

По мере развития медицины ученые нашли причины многих заболеваний крови, таких как гемофилия, болезнь Виллебранда, различные тромбозы и др. Выяснилось, что они связаны с врожденным недостатком или отсутствием определенного белка в плазме крови больного. Поэтому при лечении этих заболеваний пациенту показаны переливания плазмы донорской крови, в которой в норме содержатся все белки. Однако наряду с необходимым для выздоровления компонентом крови при таких переливаниях больной получает

* Работа выполнена при участии кандидата химических наук Берковского A.JI.

Список используемых сокращений: AT III - антитромбин III, FVIII - фактор свертывания крови VIII, FIX - фактор свертывания крови IX, ППУ - плазма после удаления факторов свертывания FVIII и FIX, СЗП - свежезамороженная плазма донорской крови, ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование, ME - международная единица активности, НМГ - низкомолекулярный гепарин, pi - изоэлектрическая точка.

весь комплекс белков плазмы крови, осложняющих процесс лечения. Крайнюю степень осложнений больной приобретает при так называемом синдроме массивных трансфузий. При трансфузии умеренных доз плазмы фаза угнетения физиологических реакций не всегда проявляется клинически, но ее всегда можно обнаружить лабораторными методами. При массивной трансфузии плазмы донорской крови неблагоприятные эффекты многократно усиливаются. Все эти проблемы привели к развитию методов разработки лекарственных препаратов из плазмы донорской крови.

В последние годы препараты антитромбина III (AT III), выделенные из плазмы донорской крови, занимают одно из ведущих мест в современной медицинской практике. Это связано с тем, что риск развития тромбозов различной этиологии возникает не только вследствие наследственных изменений, но и в процессе лечения ряда различных сложных заболеваний и постоперационной реабилитации. Образование тромба после операционного вмещательства и риск его «отрыва» является очень острой проблемой в современной медицине. Поэтому разработка и получение препарата AT III является актуальной проблемой в современной российской биофармацевтической промышленности.

Работа выполнена при финансовой поддержке и в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 14.740.11.0120).

Цель данной работы заключается в разработке метода выделения AT III из плазмы донорской крови после удаления факторов свертывания FVIII и FIX (ППУ) с высоким выходом без дополнительной переподготовки сырья. Это требуется для соблюдения непрерывности потока исходного сырья, необходимой для обеспечения стерильности процесса фракционирования плазмы донорской крови, существующего на базе производственного отдела ГУ Гематологического научного центра.

Задачи исследования заключались в следующем:

1. Разработать метод получения антитромбина III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX в рамках расширения выпускаемых препаратов из плазмы донорской крови на базе Гематологического научного центра;

2. Оценить сорбционные свойства двух аффинных сорбентов по отношению к белку антитромбину III;

3. Разработать условия колоночной хроматографии выделения AT III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX на выбранном сорбенте;

4. Подобрать условия для вирусной инактивации AT III;

5. Выбрать стабилизаторы для лиофилизации готового концентрата AT III. Научную новизну этой работы можно сформулировать следующим

образом: разрабатываемая схема выделения AT III может рассматриваться как

модуль, который можно встроить в любой процесс фракционирования плазмы

донорской крови. Создание таких модулей для различных белков плазмы

позволяет расширить количество получаемых субстанций и снизить затраты на

фракционирование плазмы и дополнительное исходное сырье. Также в работе

показано преимущество использования малоизвестного сорбента Toyopearl AF-

Heparin НС-650М по сравнению с популярным носителем Heparin-Sepharose FF.

Использование данного аффинного носителя на стадии очистки

пастеризованного концентрата AT III от продуктов деградации позволяет

очистить белок на 97 % и сохранить активность белка в процессе вирусной

инактивации на 83 %.

Практическая значимость состоит в том, что в настоящее время на

территории России не производят препараты AT III. Их недостаток

компенсируется исключительно за счет приобретения зарубежных аналогов

препарата. Потребность в препаратах на основе белка AT III возрастает с

5

каждым годом, потому что риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, трансплантация искусственных органов и сосудов и увеличение раковых больных приводят к проблемам с тромбообразованием. Разработанная нами технология применяется на базе опытно-промышленного производства препаратов плазмы в ФГБУ Гематологическом научном центре.

Апробация работы

Результаты работы докладывались на ХП международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2008» (Волгоград, Россия, 2008) и на Московской международной научно-практической конференции "Биотехнология: экология крупных городов" (Москва, Россия, 2010).

Публикации

По результатам диссертационной работы опубликовано 2 оригинальных статьи в журналах, входящих в список изданий, рекомендованных ВАК, а также 2 тезисов докладов на Российских и Международных конференциях.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, обсуждения и результаты, выводы и список литературы, включающий 91 источник. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 9 таблицами.

Во введении сформулированы задачи исследования, обозначена цель работы и ее практическая значимость.

Литературный обзор состоит из трех частей. В первой части

литературного обзора рассматривается физиологическая значимость и механизм

действия АТ III. Уделяется внимание структурным особенностям белка и

клиническому применению препаратов на основе АТ Ш. Вторая часть

литературного обзора посвящена существующим способам выделения белка АТ

П1 из плазмы донорской крови. Также рассматриваются методы количественной

6

и качественной оценки концентратов на основе AT III. В третьей части описываются дополнительные стадии технологического процесса, необходимые для получения готовой лекарственной формы, и способы определения лечебной эффективности концентрата AT III.

В основной части дается описание оборудования и материалов, использованных при проведении исследования и методик анализа.

В обсуждении результатов представлены этапы разработки технологии получения AT III из плазмы после удаления факторов свертывания (ППУ), проблемы и способы их устранения. Приводятся результаты количественной и качественной оценки, полученного концентрата AT III.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исходное сырье: в качестве исходного сырья использовалась плазма

донорской крови, полученная после удаления факторов свёртывания VIII и IX

(ППУ), содержание AT III в которой составляло 86,7 ± 5,8 % (п=8),

концентрация общего белка - 6,3 + 0,4 % (п=8).

Изучение сорбнионных свойств аффинных носителей

Фракционирование плазмы донорской крови человека можно представить

в виде поэтапного процесса, на каждой стадии которого выделяется белок,

обладающий лечебными свойствами. В связи с этим, стадию выделения

антитромбина III целесообразно включать после выделения факторов

свертывания FIX и FVIII, потому что потери AT III на этих стадиях

минимальны, рис. 1. Потери терапевтически значимых белков, таких как

альбумин и иммуноглобулины, в ходе хроматографического фракционирования

очень малы, поэтому их можно выделять из фракции не связанной с колонкой

после аффинной хроматографии.

При хроматографическом выделении AT III из плазмы донорской крови,

используют в основном аффинные носители, в частности, Heparin-Sepharose FF

7

и ТоуореаН АЕ-Нерапп НС-650М, содержащие в качестве лиганда гепарин. Указанные сорбенты отличаются между собой строением матриц. Однако именно строение матрицы определяет устойчивость сорбента к скоростям элюции и допустимый интервал значений рН используемых растворов. Мы решили провести сравнительное изучение сорбционных характеристик Тоуореаг1 АР-Нерапп, построенного из полимерной матрицы, состоящей из гидроксилированного полиметилметакрилата, позволяющей вести хроматографический процесс на больших скоростях и в большом интервале значений рН 2-13, а также весьма распространенного сорбента Нерапп-БерЬагозе И7, мягкая матрица которого состоит из полисахаридов.

Рис. 1. Схема поэтапного процесса фракционирования плазмы донорской крови

В качестве стартовых условий проведения сорбции белка были выбраны физико-химические характеристики исходной плазмы после удаления факторов свертывания FIX и FVIII (ППУ) с целью возможности соблюдения в разрабатываемой технологической схеме принципа непрерывности потока, рекомендуемого для стерильных производств, и исключить необходимость проведения каких-либо подготовительных стадий перед проведением хроматографического выделения AT III.

Для проведения сравнительного изучения процесса сорбции на вышеуказанных носителях был выбран batch-метод. Сорбцию проводили путем постоянного перемешивания сорбента с различными объемами ППУ при комнатной температуре в течение 1 часа. Сорбент удаляли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин. Количество сорбированного белка определяли по разности значений содержания AT III в растворах до и после сорбции.

При проведении сорбции (п=3) с использованием равных нагрузок на сорбент в размере 50 ME AT III/ г сорбента было установлено, что на Toyopearl AF-Heparin сорбировалось 42.8 ± 2.8 ME AT 1Ш г сорбента, а на Heparin-Sepharose FF 37.4 ±6.1 ME AT П1/ г сорбента. Уже при минимальных нагрузках емкость Heparin-Sepharose FF была меньше, чем емкость Toyopearl AF-Heparin. В связи с полученными результатами представлялось целесообразным построение кривых насыщения обоих аффинных сорбентов.

Кривые насыщения аффинных носителей строились последовательным увеличением нагрузки белка на носитель от 30 до 300 ME AT III на г сорбента. Кривые насыщения представлены на рис. 2.

Кол-во нанесенного AT Ш, ME AT ШУг сорб

Рис. 2. Кривые насыщения аффинных сорбентов

♦ Кривая насыщения для Toyopearl AF-Heparin в Кривая насыщения для Heparin-Sepharose FF

На рис. 2 видно, что с увеличением нагрузки белка на сорбент разница между значениями емкости аффинных носителей возрастает. Как следует из формы кривой, плато для Toyopearl AF-Heparin достигается при нагрузке 150 ME AT П1 на г сорбента, а это означает, что при этой нагрузке на сорбенте заняты все гепариновые группы, доступные для AT Ш в данных условиях сорбции. При этом максимальная емкость сорбента достигает значений 74,5 МЕ AT III/г сорбента. Для Heparin-Sepharose FF емкость достигается при нагрузке 100 ME AT III на г сорбента и равна 44,8 ME AT П1/г сорбента.

Таким образом, емкость Toyopearl AF-Heparin в 1,5 раза превышает таковую для Heparin-Sepharose FF. Полученные результаты по изучению сорбции batch-методом свидетельствуют о преимуществах дальнейшего использования Toyopearl AF-Heparin по сравнению с Heparin-Sepharose FF в качестве сорбента для разработки процесса хроматографического выделения AT

III. Кроме того, учитывая синтетическую природу матрицы, можно рассчитывать на возможность вести хроматографический процесс при высоких скоростях элюции, а также проводить регенерацию с использованием 6 М раствора мочевины, сильных растворов щелочи и других сильных детергентов. Это допущение очень важно, так как плазма донорской крови и ее фракции представляют собой биологические матрицы, состав которых не бывает постоянным, и, следовательно, регенерация сорбента является важным этапом хроматографического процесса.

Разработка условий колоночной хроматографии на Toyopearl AF-Heparin

При переходе на колоночный процесс хроматографического выделения AT III на носителе Toyopearl AF-Heparin выбиралась нагрузка 75 ME AT III на г сорбента, установленная batch-методом. Стартовый буферный раствор оставался идентичным по составу буфера, который использовался для получения ППУ 0,01 М Tris, 0,06 М Na3Cit, pH 7,8, и ППУ наносили на колонку в неизменном виде после DEAE-Sepharos на скорости 113 см/час. Таким образом, мы исключили стадию переподготовки сырья. Три параллельных эксперимента показали, что выход по активности AT Ш составил 10 - 12 %, а основная часть целевого белка, равная 50 - 60 %, остается во фракции не связанной с колонкой. Полученные результаты показали, что в динамических условиях нагрузка на сорбент имеет меньшее значение.

Снижение нагрузки на сорбент до 35 ME AT III/г сорбента при прочих равных условиях привело к уменьшению потерь во фракции не связанной с колонкой до 20 - 30 %, но выход AT III оставался низким.

Дальнейшее уменьшение нагрузки до 25 МЕ/г сорбента при прочих

равных условиях позволило минимизировать потери во фракции не связанной с

колонкой до 0 - 10 %. При этом выход AT III оставался низким и составлял 20 -

11

30 %, а основная часть белка десорбировалась промежуточным буфером (0,01 М Tris, 0,06 М Na3Cit, 0,3 М NaCl рН 7,8) и промывом 2 М NaCl после элюции целевого белка.

Для того чтобы избежать больших потерь АТ III во фракции, полученной при промыве колонки промежуточным буфером, представлялось целесообразным снизить ионную силу буферного раствора в два раза (0,01 М Tris, 0,06 М Na3Cit, 0,15 М NaCl рН 7,8). В результате выход АТ III увеличился до 40 - 50 %, а потери целевого белка в промежуточном буфере уменьшились до 5 -10 %.

Для обеспечения высокого выхода целевого белка в элюируемой фракции было решено снизить скорость элюции с 25 см/час до 15 см/час. Это привело к увеличению выхода по активности АТ 1П до 70 - 80 % и помогло минимизировать потери во фракции промыва сорбента 2 М NaCl после элюции целевого белка.

Таким образом, сорбционная емкость аффинного носителя Toyopearl AF-Heparin в динамических условиях падает со значения 75 МЕ/г сорбента до 25 МЕ/г сорбента. Это связано с затруднениями, которые испытывают большие белковые молекулы при движении по колонке.

Материальный баланс рассчитывали как соотношение суммарной специфической активности АТ 1П во всех хроматографических фракциях по отношению к исходному содержанию АТ III в ППУ.

Для определения молекулярно-массового состава хроматографических фракций использовался SDS-электрофорез в восстановленных условиях. На рисунке 3 представлена электрофореграмма молекулярно-массовых составов фракций от исходного ППУ (трек № II) до полученного концентрата АТ III (трек № VI).

III IV V VI VII

I

97.000 66 ООО

45.000

|_14.000~

Рис. 3. Распределение молекулярно-массового состава фракций

после аффинной хроматографии

Трек I- низкомолекулярный маркер; Трек II - исходная ППУ; Трек III -фракция не связанная с колонкой; Трек IV - промыв стартовым буфером; Трек V - промыв промежуточным буфером; Трек VI - элюат АТ П1; Трек VII - промыв 2 М №С1.

По данным денситограммы чистота АТ III составляет 77 % с молекулярной массой 58,5 кДа. Дополнительные полосы свидетельствуют о наличии примесных белков в концентрате АТ III. Их содержание составляет около 23 %, а идентификация примесей не проводилась потому, что после процесса вирусной инактивации необходимо будет провести еще одну стадию хроматографической очистки.

Таким образом, концентрат АТ III, полученный после первой стадии аффинной хроматографии, обладает следующими характеристиками:

♦ молекулярная масса 58,5 кДа;

♦ специфическая активность 18 ± 3 МЕ/мл;

♦ удельная активность 7,4 ±1,6 МЕ/мг белка;

13

♦ фактор очистки 528 ± 132.

В аналогичных хроматографических условиях мы провели выделение AT III из ППУ на сорбенте Heparin-Sepharose FF. Это было сделано для того, чтобы установить, сохраняется ли закономерность между сорбционными свойствами аффинных носителей Toyopearl AF-Heparin и Heparin-Sepharose FF в условиях колоночной хроматографии.

Значения специфической активности AT III в концентратах, полученных при хроматографическом выделении на обоих аффинных сорбентах, оказались близкими по своему числовому значению и составили 18 ± 3 ME AT Ш/мл для Toyopearl AF-Heparin и 17 ± 2 ME AT III/мл для Heparin-Sepharose FF. Но выход целевого белка при использовании Toyopearl AF-Heparin на 20 % выше, чем на Heparin-Sepharose FF. Это хорошо согласуется с результатами, полученными batch-методом.

Измерение специфической активности AT III

Измерение специфической активности AT III в хроматографических фракциях проводилось амидолитическим методом с помощью хромогенного субстрата с использованием набора Berichrom Antithrombin III (А) (фирма DADE Behring, Германия).

Метод основан на взаимодействии AT Ш с избытком тромбина, что приводит к образованию эквимолярного устойчивого комплекса [ATIII-Тромбин]. Остаточный тромбин, не вступивший в реакцию с AT П1, взаимодействует с хромогенным субстратом. В результате отщепляется оптически активный пептид, количество которого определяется при 405 нм.

Измерения проводились в пластиковых кюветах шириной 10 мм при 37° С. За величину международной единицы активности AT III (ME AT III) принимали активность, соответствующую активности 1 мл нормальной плазмы донорской крови.

Проведение сравнительных количественных определений специфической активности AT III потребовало подтверждения допустимости применения амидолитического метода с помощью хромогенного субстрата, используемого для тестирования СЗП, в случае измерения активности AT III в таком её полупродукте, как ППУ в соответствии с рекомендациями [Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation/ U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration// 2001].

В качестве калибровочного раствора использовали стандартную человеческую плазму (Standart Human Plasma, DADE Behring). Калибровочная кривая строилась в диапазоне концентраций специфической активности AT III от 0,26 ME/мл до 0,91 МЕ/мл.

Первостепенную роль при смене матрицы играет специфичность методики по отношению к AT III. Допустимость применения методики хромогенных субстратов для количественного определения AT III в образцах ППУ устанавливалась с помощью построения прямых, отражающих зависимость оптической плотности экспериментальных образцов при 405 нм от содержания в них AT III. Параллельность прямых, построенных последовательным разведением исходных образцов ППУ, относительно калибровочной кривой свидетельствует о высокой специфичности методики измерения специфической активности антитромбина III с помощью хромогенного субстрата. Уравнения прямых, представленных в виде зависимости D 405 = f(A АТ ш), для калибровочной кривой (1) и ППУ (2 и 3) представлены ниже:

у=-0.0112х +2.0183 (1) у=-0.0112х +2.0183 (2) у=-0.0112х +2.0183 (3)

В полученных уравнениях коэффициенты при «х», характеризующие

тангенс угла наклона прямой, имеют одинаковую величину, равную -0.0112.

15

Это позволяет утверждать, что прямые зависимости оптической плотности экспериментальных образцов при 405 нм от содержания в них AT Ш параллельны. Свободные члены уравнения равны между собой и характеризуют расстояние, на которое смещены прямые относительно «0» при пересечении с осью ординат.

Таким образом, эти факторы свидетельствуют о допустимости применения данного метода количественного измерения специфической активности AT III в СЗП к ее полупродукту ППУ.

В процессе хроматографического выделения получаемые концентраты AT III представляют собой растворы высокоочищенного белка с высокой активностью AT Ш. Биологическая матрица в этих растворах кардинально отличается от природы СЗП или ППУ.

В качестве контрольного образца концентрата AT III с известной специфической активностью мы использовали стандарт NIBSC Antithrombin Concentrate, Human (концентрат AT Ш человеческий), аттестованный в 25 независимых лабораториях, с содержанием 4,4 МЕ/мл.

Основной компонент свежезамороженной плазмы это альбумин, его содержание составляет 40-50 г/л СЗП. Поэтому разведения контрольного образца AT Ш решено было проводить не с помощью рабочего буфера, а раствором рабочего буфера, содержащего 5 % альбумин для инфузий. Использование таких разведений позволяет сопоставить биологические матрицы СЗП и концентрата, и измерение специфической активности AT Ш в контрольном образце можно проводить по той же калибровочной кривой, которая используется для исходного сырья.

Для подтверждения вышеизложенного сделали пять разведений контрольного образца AT Ш до активности 0,44 ME/мл и измеряли каждое разведение три раза. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты измерения специфической активности NIBSC Antithrombin Concentrate.

№ разведения А атш расчетная, МЕ/мл А дтш± А, МЕ/мл

1 0,41 ± 0,02

2 0,44 ± 0,02

3 0,44 0,42 ± 0,02

4 0,41 ± 0,02

5 0,45 ± 0,02

Из полученных результатов можно сделать вывод, что данная методика измерения специфической активности AT III в очищенных концентратах может использоваться для опытных концентратов AT III.

Вирусная инактивация

Среди современных способов инактивации вирусов наибольшее распространение приобрел метод пастеризации готового концентрата белка AT III в присутствии органических солей цитрата или аспарагината натрия с добавлением сахарозы, которые используются в качестве стабилизаторов.

Концентрат AT III элюируется буферным раствором с высокой концентрацией солей хлорида натрия. Поэтому представлялось целесообразным установить влияние высокого содержания хлорида натрия на процесс термической инактивации. Концентрат AT III разделили на две части: в первой части концентрат AT III разводили в шесть раз дистиллированной водой и подвергали термической инактивации, а вторую часть концентрата пастеризовали без изменений в течение 10 часов при 60 °С. В таблице 2 представлены результаты, полученные в ходе эксперимента.

Таблица 2. Выбор стабилизаторов для вирусной инактивации.

Образец A ATIII, исходная» МЕ/мл А АТ1П, конечная» МЕ/мл

Концентрат с высокой ионной силой

AT Ш без добавок 16,32 ±2,24 0,08 ± 0,05

AT III с 0,6 М Na3Cit 13,60 ±3,32 13,20 ±3,54

AT Ш с 0,6 М Na3Cit и 20 % сахарозы 12,84 ± 3,46 12,35 ± 3,48

Концентрат AT III в физиологических условиях

AT III без добавок 2,84 ±0,68 0,08 ±0,05

AT III с 0,6 М Na3Cit 2,84 ±0,72 2,44 ± 0,56

AT Ш с 0,6 М Na3Cit и 20 % сахарозы 2,46 ± 0,69 2,30 ± 0,62

В результате можно сделать следующие выводы. Высокое содержание солей в концентрате AT III не влияет на термическую стабильность белка. Таким образом, стадию предварительного диализа перед проведением вирусной инактивации можно не проводить.

Следующий шаг заключался в выборе оптимальной концентрации цитрата натрия. Концентрат AT Ш разделили на три группы: к первой группе добавляли цитрат натрия до концентрации 0,2 М, ко второй - 0,4 М, а к третьей - 0,6 М. В соответствии с данными литературы, дальнейшее увеличение содержания цитрата натрия может привести к стабилизации не только целевого белка, но и вирусов.

В результате мы получили, что 0,2 М цитрата натрия позволяет сохранить активность белка на 71 %, 0,4 М цитрат натрия на 85 % и 0,6 М на 91 %. Таким образом, наилучшими стабилизирующими свойствами обладает цитрат натрия в концентрации 0,6 М.

После завершения процесса термической инактивации пастеризованные концентраты AT III повторно наносили на колонку с сорбентом Toyopearl AF-

Heparin в аналогичных условиях для очистки от частично инактивированного белка. На электрофореграмме, рис. 4, показано, как изменяется молекулярно-массовый состав концентрата AT III в процессе противовирусной обработки. Для определения молекулярно-массового состава хроматографических фракций использовался SDS-электрофорез в восстановленных условиях. Разделение и окрашивание проводили с помощью электрофоретической установки PhastSystem, фирма GE Healthcare с использованием готовых гелей PhastGel Gradient 8-25. Гели окрашивали раствором Кумасси R-250.

Рис. 4. Изменение молекулярно-массового состава концентрата AT III в процессе вирусной инактивации

Трек I - низкомолекулярный маркер;

Трек II - элюат AT III после первой аффинной хроматографии; Трек III - элюат AT III после пастеризации;

Трек IV - концентрат AT III после повторной очистки на Toyopearl AF-Heparin.

Трек № II показывает состав концентрата AT III после первой стадии

аффинной хроматографии на сорбенте Toyopearl AF-Heparin. Наличие

19

дополнительных полос после пастеризации (трек № III) свидетельствует о частичном разрушении белка в процессе термической инактивации. Трек № IV -концентрат AT III после повторной очистки на сорбенте Toyopearl AF-Heparin. В результате AT III сохранил свою активность на 83 ± 7 %, чистота концентрата AT III по данным денситограммы составила 97 % от содержания AT III в концентрате до вирусной инактивации. Вторая стадия аффинной хроматографии на Toyopearl AF-Heparin позволила очистить концентрат AT III не только от латентных и прелатентных форм белка, но избавиться и от примесных белков, оставшихся в концентрате после первой стадии аффинной хроматографии.

Лиофилизация концентрата AT III

Лиофилизация является необходимым шагом при производстве препаратов плазмы. Это связано с тем, что растворы плазменных белков, обладающих лечебными свойствами, сохраняют свою активность в течение небольшого количества времени, в то время как лиофилизированные препараты могут быть пригодны к использованию в течение длительного срока.

Весьма эффективный подход к решению проблемы стабилизации белковых препаратов состоит в использовании разного рода стабилизаторов, препятствующих межбелковому контакту, обеспечивающих молекулярное окружение, в той или иной мере имитирующее нативное, и блокирующих протекание нежелательных химических реакций.

В качестве стабилизаторов белка в процессе лиофильной сушки мы выбрали растворы, содержащие 0,5 % NaCl, 0,2 % Na3Cit, pH 7,4 с добавлением 1 % альбумина, 1 % глицина, 2 % сорбитола и смеси 1 % глицина + 2 % сорбитола. Эти стабилизаторы были выбраны в соответствии с многочисленными данными, представленными в современной литературе.

В результате мы получили, что для белка AT III наилучшими стабилизирующими свойствами обладают составы с добавлением 1 % глицина, и 1 % альбумина, которые позволяют сохранить активность AT III на 71,9 % и 69 % соответственно. Использование глицина в качестве стабилизатора предпочтительнее, так как добавление альбумина вносит дополнительный риск передачи инфекций.

Изоэлектрофокусированне

Последней необходимой характеристикой субстанции AT III является набор изоформ конечного концентрата. Соотношение а- и ß-изоформ в концентрате AT III будет влиять на его лечебную эффективность. Плазменный AT III существует, по крайней мере, в двух изоформах а и ß. В а-изоформе все четыре N-гликозилированных локуса заняты гликанами идентичной структуры. Для ß-изоформы обнаружены только три таких гликана, в то время как боковая цепь при Asp 135 полностью отсутствует. В связи с этим электрофоретическая подвижность изоформ AT III различна, что позволяет разделять их в градиенте pH в соответствии с изоэлектрическими точками, которые равны для ß-изоформы 5,1, для а-изоформы 4,9, соответственно. Количественное содержание изоформ AT III в плазме колеблется в пределах для а-изоформы -90-95 %, для ß-изоформы 5-10 %. Несмотря на преобладающее количество а-изоформы, именно ß-изоформа играет основную роль в ингибировании протеаз.

Для проведения ИЭФ использовалась электрофоретическая установка 3000 Xi, фирма-производитель Bio-Rad, США. Разделение проводилось в полиакриламидном геле с использованием амфолитов 3-7. Гели окрашивали раствором Кумасси R-250.

На электрофореграмме, рис. 5, приведено распределение составов концентрата AT III после первой аффинной хроматографии (трек № 2) и после

лиофилизации (трек № 3) на основании изоэлектрических точек белков.

21

I

I II Ш IV

Рис. 5. Изофокус концентратов AT III | Трек I, IV -маркер;Трек II - элюат AT III после первой аффинной

хроматографии;Трек III - концентрат AT III после лиофилизации.

Как видно из рис. 5, составы промежуточного и лиофилизированного концентратов значительно отличаются друг от друга. В промежуточном концентрате АТ III (трек № II) после первой аффинной хроматографии помимо целевого белка присутствуют дополнительные примеси. Наличие большого набора полос с различными р1 говорит о многокомпонентном составе данной фракции, тогда как белок АТ III характеризуется двумя изоформами с р1 4,9 и 5,1 соответственно. Этот результат хорошо согласуется с данными, полученными с использованием ЗОБ-электрофореза.

Конечная лиофилизированная субстанция АТ III содержит 91 % а-изоформы с р1 4,8, и 9 % Р-изоформы с р1 5,3 соответственно (трек № III). Отсутствие дополнительных полос в данном образце свидетельствует о высокой

чистоте готового концентрата, который практически не содержит каких-либо других белков.

В заключение можно утверждать, что конечная субстанция AT III обладает следующими характеристиками:

-молекулярная масса 58,5 кДа;

- специфическая активность 50 МЕ/мл;

- удельнаая активность 6,8 МЕ/мг белка;

- чистота концентрата 97 %;

- соотношение изоформ a:ß — 91:9.

Выводы

1. Разработан метод получения AT Ш из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX в соответствии с возможностью реализации его на базе ГНЦ.

2. Показано преимущество использования сорбента Toyopearl AF-Heparin по сравнению с Heparin-Sepharose FF в качестве сорбента для очистки AT III из плазмы донорской крови.

3. Были подобраны оптимальные условия колоночной хроматографии на сорбенте Toyopearl AF-Heparin.

4. Разработанные условия вирусной инактивации концентрата AT III, которые позволяют сохранять активность белка на 83 %.

5. Разработанные условия лиофилизации готовой субстанции AT Ш, которые позволяют сохранить активность AT III на 71,9 %.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кряжевских И.С. Оптимизация процесса вирусной инактивации концентрата антитромбина Ш / Кряжевских И.С., Коржавин Д.В., Швец В.И., Берковский A.J1. // Биофармацевтический журнал. -2011. - том 3. - № 3. - С. 23-27.

2. Ажигирова М.А. Сравнительное изучение сорбционных свойств аффинных носителей по отношению к белку антитромбину III / Ажигирова М.А., Дереза Т.Л., Кряжевских И.С., Швец В.И. // Вестник МИТХТ. - 2010. - № 2. - С. 64-68.

3. Кряжевских И.С. Оптимизация метода выделения антитромбина III из плазмы донорской крови / Кряжевских И.С., Швец В.И. // Тезисы и стендовый доклад Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». - Москва, Россия, 2010. - С. 485-486.

4. Кряжевских И.С. Особенности измерения специфической активности антитромбина 1П в процессе хроматографического фракционирования / Кряжевских И.С., Ажигирова М.А., Дереза Т.Л. // Тезисы докладов XII международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2008». -Волгоград, Россия, 2008. - С. 130-131.

Подписано в печать 15.12.11 Заказ № 42 Тираж 100 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86 www.copycentr.su (494) 434-83-55

- п С

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Кряжевских, Ирина Сергеевна, Москва

61 12-2/445

Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ)

На правах рукописи

Кряжевских Ирина Сергеевна

Разработка метода выделения и изучение характеристик антитромбина III как основы антитромботического лекарственного препарата

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель

академик РАМН, проф. Швец В.И.

Москва 2012

Оглавление

Стр

Введение................................................... 4

Литературный обзор......................................

Строение AT III и особенности его

функционирования....................................... 9

Способы выделения AT III и методы его

определения в концентрате............................. 20

Лекарственные препараты на основе

белка антитромбина III................................. 27

Основная часть............................................

Материалы и методы..................................... 35

Обсуждения и результаты...............................

Изучение сорбционных свойств аффинных

носителей................................................. 55

Разработка условий колоночной хроматографии

на Toyopearl AF-Heparin............................... 59

Измерение специфической активности AT III..... 65

Оценка степени десорбции гепарина с матрицы

сорбента................................................... 69

Вирусная инактивация.................................. 70

Диализ концентрата AT III............................. 75

Лиофилизация концентрата AT III................... 78

Изоэлектрофокусирование............................. 80

Материальный баланс.................................... 82

Выводы...................................................... 85

Список литературы........................................ 86

Список сокращений

СЗП - свежезамороженная плазма

ППУ - плазма после удаления факторов свертывания FVIII и FIX

КСН - криосупернатант

КП - криопреципитат

AT III - антитромбин III

FVIII - фактор свертывания VIII

FIX - фактор свертывания IX

PC - протеин С

PS - протеин S

APC - активированный протеин С

vWF - фактор фон Виллебранда

TF - тканевой фактор

TFPI - ингибитор пути тканевого фактора

Fg - фибриноген

Fn - фибрин

t-PA - альтеплаза

НМГ - низкомолекулярный гепарин

Введение *

Циркуляцию крови в организме человека можно сравнить с течением реки по плодородной равнине. Высыхание реки становиться причиной увядания долины. Аналогично и в нашем организме, большие потери крови опасны для жизни человека. В этом случае его может спасти только одно -переливание крови. Но переливание цельной крови часто приводит к серьезным осложнениям, поэтому ученые последнего столетия задались вопросом: а можно ли разделить кровь на различные компоненты, чтобы избежать тяжелых осложнений? Над воплощением этой идеи в реальность стали работать ученые разных направлений: химики, биологи, медики. Так появилась отрасль науки, называемая трансфузиологией. Благодаря их усилиям сейчас лечатся многие заболевания крови, связанные с изменениями ее состава, спасаются многие жизни людей с сильными кровотечениями и гематологическими заболеваниями.

Первое переливание крови человеку от человека осуществил английский профессор акушерства и гинекологии Дж. Бланделл (1819). Он произвел переливание крови роженице, умиравшей от кровопотери. В 1832 г. подобная операция была проведена в России акушером Г. С. Вольфом. Его пригласили к женщине, которая находилась на краю гибели от массивной кровопотери после «искусственных» родов. Вольф решил, что единственная надежда спасти больную - новая пионерская операция, названная трансфузией крови. Лишь два года назад в Лондоне он узнал о трансфузии от знаменитого акушера и физиолога Джеймса Бланделла. По возвращении в Россию Вольф привез с собой одно из трансфузиологических приспособлений Бланделла и небольшой желудочковый насос Рида. С этим оснащением Вольф и выполнил трансфузию крови женщине, обозначенной как «М.Гл.», которая впоследствии выздоровела [1]. Но не все переливания

* Работа выполнена при участии к.х.н. Берковского А.Л.

крови заканчивались выздоровлением, многие больные погибали по непонятным для врачей причинам. Медицина вплотную подошла к выяснению вопроса о несовместимости человеческой крови.

Второй период в истории переливания крови связан с развитием учения об иммунитете. Очень важную роль сыграло открытие групп крови, в результате чего были вскрыты причины некоторых посттрансфузионных осложнений, что дало возможность предупредить их. Оказалось, что осложнения при переливании крови животных человеку происходят потому, что сыворотка крови человека склеивает (агглютинирует) и разрушает кровяные тельца животных. Используя эти данные, венский бактериолог К. Ландштейнер (1901 г.) открыл законы взаимодействия эритроцитов одного человека с сывороткой другого и установил, что по свойствам крови всё человечество можно разделить на 4 группы: 0(1), А(П), В(III), АВ(1У). С открытием групп крови, её переливание как лечебный метод стал быстро развиваться. Первое переливание с учётом групп крови по совместимости произвёл в 1909 г. американский хирург Дж. Крайл. Это открытие резко сократило число осложнений. В 1940 г. был открыт резус-фактор (И1-фактор), положительный и отрицательный, названный так по имени обезьян, у которых было выявлено наличие определенных антигенов в эритроцитах.

В 1926 г. профессор Александр Александрович Богданов (Малиновский) создал первый в мире Институт переливания крови. Институту был выделен особняк бывшего купца Игумнова на Большой Якиманке. Первая операция переливания крови сотрудниками Института была проведена в том же году. Богданов писал, что переливание крови может быть не только полезным, но и единственным способом спасения человеческой жизни при сильном кровотечении. Еще в 1908 г. в романе «Красная звезда» Богданов описывает метод обменного переливания крови [2].

По мере развития медицины ученые нашли причины многих заболеваний крови, таких как гемофилия, болезнь Виллебранда, различные тромбозы и др. Выяснилось, что они связаны с врожденным недостатком или отсутствием определенного белка в плазме крови больного. Поэтому при лечении этих заболеваний пациенту показаны переливания плазмы донорской крови, в которой в норме содержатся все белки. Однако наряду с необходимым для выздоровления компонентом крови при таких переливаниях больной получает весь комплекс белков плазмы крови, осложняющих процесс лечения. Крайнюю степень осложнений больной приобретает при так называемом синдроме массивных трансфузий. При трансфузии умеренных доз плазмы фаза угнетения физиологических реакций не всегда проявляется клинически, но ее всегда можно обнаружить лабораторными методами. При массивной трансфузии плазмы донорской крови неблагоприятные эффекты многократно усиливаются. Все эти проблемы привели к развитию методов разработки лекарственных препаратов из плазмы донорской крови.

В настоящее время известно большое количество белков плазмы донорской крови. Но лишь немногие из них обладают лечебными свойствами.

Европейская схема получения препаратов плазмы

1. Раствор альбумина 5 %, 10 %, 20 %;

2. Внутривенные иммуноглобулины;

3. Гипериммунные иммуноглобулины;

4. Антитромбин III;

5. Активированный белок С;

6. Гаптоглобин;

7. Фактор IX;

8. Фактор VIII;

9. Фактор VIII-vWF;

10. Фактор X;

11. Фактор XI;

12. Фактор XIII;

13. а-кислый гликопротеид.

Препараты антитромбина III (AT III) занимают одно из ведущих мест в современной медицинской практике. Это связано с тем, что риск развития тромбозов различной этиологии возникает не только вследствие наследственных изменений, но и в процессе лечения ряда различных сложных заболеваний и постоперационной реабилитации. Образование тромба после операционного вмешательства и риск его «отрыва» является очень острой проблемой в современной медицине.

Цель данной работы заключается в разработке такого метода выделения AT III, который позволил бы получать целевой белок из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX (ППУ) с хорошим выходом без дополнительной переподготовки сырья. Это требуется для того, чтобы соблюдалась непрерывность потока исходного сырья, необходимая для обеспечения стерильности процесса фракционирования плазмы донорской крови, существующего на базе производственного отдела ГУ Гематологического научного центра.

Задачи исследования заключались в следующем:

1. Разработать метод получения антитромбина III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX в рамках расширения выпускаемых препаратов из плазмы донорской крови на базе Гематологического научного центра;

2. Оценить сорбционные свойства двух аффинных сорбентов по отношению к белку антитромбину III;

3. Разработать условия колоночной хроматографии выделения AT III из плазмы после удаления факторов свертывания FVIII и FIX на выбранном сорбенте;

4. Подобрать условия для вирусной инактивации AT III;

5. Выбрать стабилизаторы для лиофилизации готового концентрата AT

Научную новизну этой работы можно сформулировать следующим образом: разрабатываемая схема выделения AT III может рассматриваться как модуль, который можно встроить в любой процесс фракционирования плазмы донорской крови. Создание таких модулей для различных белков плазмы позволяет расширить количество получаемых субстанций в процессе фракционирования и снизить затраты на фракционирование плазмы и дополнительное исходное сырье. Также в работе показано преимущество использования малоизвестного сорбента Toyopearl AF-Heparin НС-650М по сравнению с популярным носителем Heparin-Sepharose FF. Использование данного аффинного носителя на стадии очистки пастеризованного концентрата AT III от продуктов деградации позволяет очистить белок на 97 % и сохранить активность белка в процессе вирусной инактивации на 83 %.

Практическая значимость состоит в том, что в настоящее время на территории России не производят препараты AT III. Их недостаток компенсируется исключительно за счет приобретения зарубежных аналогов препарата. Потребность в препаратах на основе белка AT III возрастает с каждым годом, потому что риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, трансплантация искусственных органов и сосудов и увеличение раковых больных приводят к проблемам с тромбообразованием. Разработанная нами технология применяется на базе опытно-промышленного производства препаратов плазмы в ФГБУ Гематологическом научном центре. Поэтому разработка и получение препарата AT III является актуальной проблемой в современной российской биофармацевтической промышленности.

Литературный обзор Строение AT III и особенности его функционирования

Одной из важных функций плазмы крови является поддержание системы гемостаза, которая включает в себя процессы свертывания крови и фибринолиза и обеспечивает нормальную циркуляцию крови.

Явление гемостаза, в том числе свертывание крови, представляет собой функцию организма, призванную сохранять кровь (жидкую внутреннюю среду), и обеспечивать ее циркуляцию в организме. Кровь, вытекающая из сосудов при их повреждении, в течение нескольких минут свертывается -образуется тромб, состоящий из фибриновой сетки, в петлях которой задерживаются форменные элементы и сыворотка. Все реакции, обеспечивающие образование фибринового сгустка находятся в тесной взаимосвязи.

В 1876 г. А. Шмидт опубликовал первый вариант созданной им ферментативной теории свертывания крови. Основным положением этой теории являлось признание существования фермента (фибрин-фермент), катализирующего реакцию взаимодействия фибриногена с «фибринопластическим веществом». Образование фибрина рассматривалось как следствие этой реакции. Впоследствии фибрин-фермент был переименован А. Шмидтом в тромбин. При этом было экспериментально показано, что в циркулирующей крови тромбин отсутствует, он появляется в крови, излившейся из кровеносных сосудов путем активации неактивного предшественника - протромбина, являющегося белком плазмы крови.

В зависимости от источника образования тромбопластина (кровь или ткани) предложено различать «внутреннюю» и «внешнюю» свертывающие системы. Это разделение дает возможность дифференцированного подхода к анализу процессов, совершающихся при свертывании крови, и к выяснению дефектов в этом процессе при различной патологии. В 1975 г. Б.А. Кудряшов привел следующую схему процесса свертывания крови [3]:

Внутренняя система Взаимодействие факторов V, VIII, IX, X, XI, XII,

Внешняя система Взаимодействие тканевого предшественника с факторами

V, VII, X

Протромбин

I

Тромбин + фибриноген —> фибрин

Решающей стадией, по мнению автора, является взаимодействие тромбина с фибриногеном, приводящее к образованию волокон фибрина.

Наряду с факторами, обеспечивающими свертывание крови, существенное значение имеют вещества (антикоагулянты), приводящие к инактивации тромбина или препятствующие его образованию. Эта система белков плазмы называется противосвертывающей системой. В 1957 г. Я.В. Велик [4] приводит в качестве антикоагулянтов плазмы крови гепарин, антитромбин и антитромбопластин. В совокупности антикоагулянты регулируют концентрацию активного тромбина в кровеносном русле и препятствуют образованию фибринового сгустка внутри сосудов.

Завершение процесса свертывания крови характеризуется растворением фибринового сгустка. Этот процесс называется фибринолизом. Принцип фибринолитической системы основан также на ферментативных реакциях. Белок плазминоген фибринолитической системы активируется активаторами плазминогена, образуя специфический фермент плазмин, который подобно другому ферменту системы свертывания - тромбину, катализирует превращение одной формы белка в другую [5]. Действие этих двух ферментов на один и тот же субстрат - фибриноген, изменяет его свойства в противоположных направлениях: тромбин превращает фибриноген в фибрин-мономер, а плазмин лишает фибриноген способности

свертываться ферментом. Антиплазмин, в свою очередь, взаимодействует с плазмином, нейтрализуя его.

Достижения биохимии, молекулярной и клеточной биологии последних лет привели к открытию нового семейства рецепторов, активируемых протеиназами - факторами свертывания крови, новых функций известных адгезивных белков, новых ингибиторов каскада свертывания и развитию новых знаний о функциях гемостаза. В современном представлении механизм свертывания крови определяется «триггерными» взаимодействиями [6], т.е. экспрессия тканевого фактора (TF) на поверхность эндотелия в месте повреждения сосуда запускает каскад реакций по внешнему пути свертывания крови [7]. Решающей реакцией свертывания крови по внешнему пути является активирование фактором Ха фактора II (протромбина), который приводит к образованию тромбина. Пикомолярные количества тромбина, в свою очередь, активируют факторы V и VIII, которые со-локализуются на тромбоцитах и представляют собой внутренний путь свертывания крови (рис. 1). Прикрепление тромбоцитов в месте повреждения сосуда обеспечивается с помощью мультимерной молекулы фактора фон Виллебранда (vWF), который всегда находится в комплексе с фактором VIII. Таким образом, фактор VIII закрепляется в месте повреждения и запускается внутренний путь свертывания крови.

Рис. 1. Каскад свертывания крови

В процессе свертывания крови значительную роль играют ионы кальция и фосфолипидные поверхности клеточных мембран [8]. Фактически, весь каскад осуществляется на их поверхности. Это очень важный момент, который объясняет локализацию коагуляционного каскада в зоне повреждения сосуда, то есть именно в том месте, где он необходим для остановки кровотечения. На отрицательно заряженных фосфолипидных поверхностях образуется теназный комплекс между факторами 1Ха и Villa в присутствии ионов кальция, подобным образом происходит формирование протромбиназного комплекса между факторами Ха и Va. Со-локализация этих факторов приводит к увеличению скорости превращения протромбина (фактор II) в тромбин (фактор На) почти в 300 раз [9].

С учетом данных о локализации и контроле коагуляционных реакций на различных клеточных поверхностях процесс свертывания крови в настоящее время представляется в виде трех перекрывающих друг друга фаз [10]:

1. Первая фаза - инициация свертывания крови. Развивается в тот момент, когда происходит повреждение целостности сосудистой стенки, и тканевой фактор экспрессируется на поверхности мембран. Контакт тканевого фактора с кровью приводит к образованию активного комплекса TF:VIIa, что является критическим событием для активации всего коагуляционного каскада. Малое количество тромбина, которое образуется на клетках, несущих TF, хотя и недостаточно для образования гемостатически полноценного количества фибрина, однако существенно для формирования последующих фаз свертывания крови.

2. Вторая фаза - усиление процесса свертывания, микромолярные количества тромбина, которые образуются на клетках, н�