Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск новых азотсодержащих гетероциклических соединений, влияющих на систему гемостаза

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Поиск новых азотсодержащих гетероциклических соединений, влияющих на систему гемостаза"

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ -УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ШДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

005020010

Самородов Александр Владимирович

Поиск новых азотсодержащих гетероциклических соединений, влияющих

на систему гемостаза

03.01.04 - Биохимия 14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

5 дг;? ¿С¡2

Уфа-2012

005020010

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научпые руководители:

доктор медицинских наук, профессор Феликс Хусаинович Камилов

кандидат фармацевтических наук, доцент Галия Амировна Тимчрханова

Официальные оппоненты:

зав. кафедрой биохимии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Сергей Леонидовы ч Галян

профессор кафедры фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор медицинских наук Наталья Альбертовна Муфазалова

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится _ 2012 года в _ часов на заседании

диссертационного совета _ при Государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3).

Автореферат разослан_2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Мирсаева Г. X.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Тромбоэмболические заболевания, несмотря на значительные успехи современной медицины, по-прежнему представляют сложную медико-социальную проблему [Бокарев И.Н., 2000; Балуда В.П. и соавт., 2003.; Бышевский А.Ш., 2007]. По данным ВОЗ, тромбозы и связанные с ними осложнения являются одной из наиболее частых причин инвалидности и летальности в общей структуре причин смертности среди взрослого населения. За октябрь 2008 года в развитых странах уровень смертности в результате тромбоза в различных его проявлениях составил в среднем 21,9 % и ежегодно около 25 млн. человек являются жертвами тромбоза [Prandoni Р., 2007]. При этом, более половины тромботических эпизодов в венозном русле протекают бессимптомно и обнаруживаются впоследствии на аутопсии при развитии таких осложнений, как тромбоэмболия легочной артерии и хроническая венозная недостаточность [Planes А. et al., 1988; Gathof B.S. et al., 2004]. Венозный тромбоэмболизм имеет место у 5 000 000 людей и регистрируется вновь у 150 человек на 100 000 населения. Так же у 30% госпитализированных в многопрофильные клиники больных имеет место повышенный риск тромбообразования [Alikhan R., 2010].

Важное место расстройств гемостаза в общей патологии человека определяется высокой частотой, разнообразием и потенциально очень высокой опасностью геморрагических и тромбогеморрагических заболеваний и синдромов. Они сопутствуют травмам, осложняют хирургические вмешательства, лекарственную и трансфузионную терапию, ограничивают использование инвазивных методов исследования и лечения, являются существенным звеном патогенеза большого числа других заболеваний, часто замыкают порочный круг, усугубляющий течение и исход основного заболевания [Зубаиров Д.М., 1998].

В этой связи весьма актуален поиск новых средств, способных в лечебных и профилактических целях корректировать систему гемостаза. С одной стороны, это обусловлено ростом заболеваемости. Но многие существующие антитромботические средства не удовлетворяют требованиям медицины, так как большинство из них обладают нежелательными побочными действиям. Это ограничивает их применение в качестве специфических, эффективно и избирательно действующих средств для коррекции системы гемостаза. Например, у трети пациентов прием аспирина, самого назначаемого и широко применяемого препарата, способствует желудочной диспепсии различной степени выраженности, а у 30-40% пациентов выявляется аспиринорезистентность

[Баркаган З.С., 2004].

Одним из современных направлений в разработке новых лекарственных средств является синтез аналогов и производных применяемых препаратов. Наше внимание привлекли производные ксантина, многие из которых входят в состав лекарственных средств (например, кофеин, эуфиллин, пентоксифиллин). В настоящее время лидирующее положение в терапии гемореологических нарушений занимает пентоксифиллин [Зудин A.M. и др., 2004]. Этим определяется интерес к поиску корректоров системы гемостаза среди производных ксантина для создания на их основе избирательно действующих, высокоэффективных лекарственных препаратов, превосходящих пентоксифиллин.

-з-

Цель исследования. Поиск и изучение биохимического механизма действия наиболее активного из 15 впервые синтезированных производных ксантина на систему гемостаза в эксперименте.

Для достижения поставленной цели необходимо решение следующих задач:

1. Провести скрининг 15 впервые синтезированных производных ксантина на наличие антиагрегационной и антикоагуляционной активности in vitro.

2. Установить зависимость биологической активности исследованных веществ от особенностей их структуры.

3. Оценить специфическое противосвертывающее действие наиболее перспективного из изучаемых веществ in vitro на донорской крови человека.

4. Оценить специфическое противосвертывающее действие наиболее перспективного из изучаемых веществ in vivo на интактных животных.

5. Установить некоторые биохимические механизмы действия наиболее перспективного из изучаемых веществ с использованием модельных состояний, сопровождающихся повышением агрегации и адгезии тромбоцитов.

Научная новизна исследования. Впервые изучена антиагрегационная, дезагрегационная и антикоагулящюнная активность ряда новых производных ксантина и выделены соединения, являющиеся наиболее перспективными. Впервые представлена зависимость фармакологической активности синтетических производных ксантина от структуры. Наиболее активными среди исследованных веществ оказались производные ксантина, содержащие в положении С -пиперазин, в частности соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид (лабораторный шифр-Ф-168). На соединение Ф-168, превосходящее по действию на гемостаз пентоксифиллин, получен патент РФ № 2404181 от 20.11.2010. По результатам проведенной экспериментальной работы выдвинута рабочая гипотеза о вероятном биохимическом механизме действия на систему гемостаза соединения Ф-168, связанным с блокированием рецепторов GP Ilb-IIIa и торможением трансформации фибриногена в фибрин.

Научно-практическая значимость работы. Установленные аспекты закономерности между структурой и антиагрегационной, антикоагуляционной активностью соединений являются основой для целенаправленного поиска и оптимизации синтеза новых производных ксантина с заданной структурой и уровнем биологической активности.

Внедрение результатов работы. Результаты исследования используются для подготовки студентов по специальности «Лечебное дело», «Педиатрия» в рамках дисциплин «Биохимия» и «Фармакология» на кафедрах биологической химии и фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии и научно-исследовательской работе кафедры фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии в области синтеза и поиска потенциально биологически активных веществ на основе азотсодержащих гетероциклических соединений.

Положения, выносимые на защиту:

1. Среди 15 изученных впервые синтезированных производных ксантина наиболее активны соединения, содержащие в положении С - пиперазин.

2. Соединение Ф-168 проявляет более выраженную антиагрегационную и антикоагуляционную активность, чем препарат сравнения - пентоксифиллин.

3. Антитромботический механизм действия соединения Ф-168 связан с ингибированием заключительного этапа свертывания крови - торможением сборки фибрин-мономеров и блокированием рецепторов GP lib-Ilia тромбоцитов.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на: X Молодежной конференции по органической химии (Уфа, 2007 год), Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» совместно с VI Всероссийским научным семинаром (Уфа, 2007 год), научно-практической конференции «Научный прорыв - 2008» (Уфа, 2008 год), Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009 год), 74-й Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2009 год), VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010 год), совместном заседании кафедр биологической химии, фармакологии №1 с курсом клинической фармакологии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии и кафедры лабораторной диагностики ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России (Уфа, 2012 год).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 5 в журналах, рекомендованных ВАК, получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками, 16 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 129 отечественных и 142 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследовано 15 новых производных ксантина, синтезированных в Башкирском государственном медицинском университете на кафедре фармацевтической химии*, ряд лекарственных препаратов-ксантинов, применяемых в практической медицине: пентоксифиллин (1-(5-оксогексил)-3,7-диметилксантин), кофеин-бензоат натрия (соль 1,3,7-триметилксантина с бензоатом натрия), эуфиллин (соль 1,3-диметилксантина с 1,2-этилендиамином), (производства ОАО «Дальхимфарм», Россия), а также ацетилсалициловая кислота (2-ацетилоксибензойная кислота, Фармацевтическая фабрика ШандопгКсинхуаФармасьютикал Ко., ЛТД, Китай) и этамзилат (диэтиламмония 2,5-диоксибензолсульфонат, ОАО «Биохимик», Россия).

Все экспериментальные работы выполнены в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005). Дизайн исследования представлен в таблице 1.

Эксперименты на этапе in vitro выполнены на крови доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. К исследованию допускалась кровь доноров в состоянии относительного здоровья (отсутствие тяжелой соматической патологии, острых и

♦Выражаем признательность заведующему кафедрой фармацевтической химии ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России, профессору Ф.А. Халиуллину, предоставившему для исследования вновь синтезированные производные ксантина.

хронических инфекционных заболеваний), а также не курящих, не употреблявших накануне исследования алкоголь и лекарственные препараты. Забор крови проводили из локтевой вены иглой с широким просветом с использованием систем вакуумного забора крови. В качестве стабилизатора использовали цитрат натрия в соотношении 1:9.

Экспериментальные исследования на этапе in vivo выполнены на белых беспородных половозрелых крысах-самцах с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях [Касаткина Т.В., Капланский A.C., 2000]. Животные содержались в одинаковых условиях вивария с естественным световым режимом, в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре и питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам [Западнюк В.И., 1986]. За 24 часа до забоя животным прекращалась подача пищи, не ограничивая доступ к воде. Экспериментальные исследования проводились согласно правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96, ГОСТР 50258-92) и приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP).

Исследование влияние соединения Ф-168 и пентоксифиллина на гемостаз проводили при внутрибрюшинном введении данных веществ в эквимолярной концентрации. Между инъекцией исследуемого вещества и забором крови проходил 1 час. Животных наркотизировали диэтиловым эфиром и фиксировали на препаровальном столике, далее проводили забор крови из яремной вены, обнажая ее овальным разрезом, в пробирки с 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 1:9.

Все тесты проводились на богатой тромбоцитами (для исследования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза) и обедненной тромбоцитами (коагуляционные тесты) плазмах, полученных при центрифугировании изучаемых образцов цитратной крови.

Исследование влияния изучаемых веществ на адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов проводили in vitro на донорской крови человека на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 230 LA) научно-произодственной фирмы "Биола" (Россия) и агрегометре «Thromlite 1006А» (Россия). В качестве индуктора агрегации в работе использовали АДФ, коллаген, адреналин и ристомицин ("Технология-Стандарт", г. Барнаул).

Тромбоэластографию, как метод комплексного исследования гемостаза, включающего все основные компоненты системы регуляции агрегатного состояния крови, проводили на аппарате TEG 5000 (Haemoscope Corporation, США).

Исследование влияния препарата сравнения - пентоксифиллина и Ф-168 на плазменный компонент гемостаза осуществляли с использованием классических методик. Определяли тромбиновое (ТВ), протромбиновое время (ПВ), активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), каолиновое время, количество фибриногена (по A.Clauss), рептилазное время, количество растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и D-димеров, активность фактора Виллебранда и антитромбина III на турбидиметрическом

гемокоагулометре Solar CGL 2110 (Беларусь) и автоматизированном селективном анализаторе гемостаза STA-Compact (Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд., Франция). В работе использовали оригинальные наборы реагентов производства Roche Diagnostics (Франция) и "Технология-Стандарт" (Россия).

Время свертывания цельной крови определяли по методу Сухарева, забор крови осуществляли надрезом кончика хвоста в чистый и сухой капилляр от аппарата Панченкова. В капилляр набирали столбик крови высотой 25—30 мм и переводили ее в середину капиллярной трубки. Включали секундомер и через каждые 30 с наклоняли капилляр вправо и влево под углом 30—45°. По секундомеру отмечали моменты начала и конца свертывания. Дальнейшему анализу подвергали время окончательного свертывания крови [Кишкун A.A., 2007].'

Определение острой токсичности проводили по методу [Deichman и LeBlanc, 1986]. Крысам внутрибрюшинно вводили исследуемые соединения в нарастающих дозировках с шагом в 100 мг/кг. Наблюдение за лабораторными животными проводили в течение 2 недель после инъекции. За ЛД50 принимали наименьшую дозу, вызвавшую летальный исход.

Для исследования влияния Ф-168 на скорость полимеризации фибрин-мономера использовали наборы «Тех-Полимер-тест», производства "Технология-Стандарт", г. Барнаул. При этом отмечали время полимеризации фибрин-мономера в секундах в плазме крыс и рассчитывали показатель Ratio (R) по ti

R = -

формуле: t2 , где ti - время полимеризации фибрин-мономера в плазме

экспериментальной группы крыс, с; t2 - время полимеризации фибрин-мономера в плазме контрольной группы крыс, с.

Моделирование генерализованного тромбоза [DiMinno G.S., 1983] проводили введением смеси растворов коллагена и адреналина (0,5 мг/кг и 0,06 мг/кг соответственно) в хвостовую вену мышей. В качестве критерия эффективности исследуемых соединений фиксировали количество выживших животных по сравнению с контрольной группой. За 1 час до моделирования тромбоза виутрибр!ошинно вводили исследуемые соединения в эквимолярных концентрациях и идентичных объемах - для пентоксифиллина 40 мг/кг и 56 мг/кг для Ф-168. Контрольной группе мышей вводили физиологический раствор в аналогичных объемах.

Математическую обработку результатов исследования проводили в статистических программах «Statistika 6.0» и программного обеспечения Microsoft Excel 2000, используя метод вариационной статистики для малых рядов наблюдений и вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической, и среднеквадратическое отклонение (ш). Для оценки достоверности отличий вычисляли коэффициент Стьюдента и степень вероятностей. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы Р принимали <0.05.

Таблица 1- Дизайн проведенных исследований

I ЭТАП СКРИНИНГ ВПЕРВЫЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ КСАНТИНА, ВЛИЯЮЩИХ НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА IN VITRO. Определение эффективной дозы препарата сравнения -пентоксифиллина в условиях in vitro при АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Исследование влияния 15 производных ксантина в скрииинговой дозе на АДФ- и коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов по методу Born на агрегометре «Thromlite-1006A» на донорской крови человека.

Исследование антикоагуляционной активности 15 производных ксантина в скрининговой дозе стандартными клоттинговыми тестами на донорской крови человека на гемокоагулометре Solar CGL 2110.

Характеристика зависимости изучаемой биологической активности вновь синтезированных производных ксантина от химической структуры.

II ЭТАП ВЛИЯНИЕ ПЕНТОКСИФИЛЛИНА И СОЕДИНЕНИЯ Ф-168 НА ТРОМБОЦИТАРНЫЙ И КОАГУЛЯЦИОННЫЙ КОМПОНЕНТ ГЕМОСТАЗА IN VITRO. Изучение влияния соединения Ф-168 и пентоксифиллина на систему гемостаза методом тромбоэластографии на донорской крови человека на аппарате TEG 5000.

Изучение влияния соединения Ф-168 и пентоксифиллина на агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, коллагеном, адреналином и ристомицином на лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA».

III ЭТАП ВЛИЯНИЕ ПЕНТОКСИФИЛЛИНА И СОЕДИНЕНИЯ Ф-168 НА СОСУДИСТО-ТРОМБОЦИТ АРНЫЙ И КОАГУЛЯЦИОННЫЙ КОМПОНЕНТ ГЕМОСТАЗА IN VIVO. Определение острой токсичности пентоксифиллина и соединения Ф-168 при внутрибрюшинном введении крысам.

Определение дозы пентоксифиллина и Ф-168 для экспериментов на этапе in vivo.

Исследование влия1гая соединения Ф-168 и пентоксифиллина на агрегацию тромбоцитов на лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов «Биола 230 LA» при внутрибрюшинном введении крысам.

Исследование влияния соединения Ф-168 и пентоксифиллина на коагуляционный компонент гемостаза на автоматизированном селективном анализаторе гемостаза STA-Compact при внутрибрюшинном введении крысам.

Влияние соединения Ф-168 и пентоксифиллина на фибринообразование и фибринолиз на автоматизированном селективном анализаторе гемостаза STA-Compact при внутрибрюшинном введении крысам.

Влияние соединения Ф-168 и пентоксифиллина на генерализованный коллаген-ацреналиновый Тромбоз.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенного скрининга установлено, что лекарственные препараты - производные ксантина в концентрации 2><10"3 М/л оказывают различное влияние на функциональную активность тромбоцитов. Среди препаратов сравнения наибольшую активность проявил пентоксифиллин. При концентрации пентоксифиллина 2x10"3 М/л АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов снижалась в сравнении с контролем на

50%, на коллаген-индуцированную агрегацию влияние препарата не регистрировалось. Наименьшую антиагрегационную активность среди лекарственных препаратов - производных ксантина проявил эуфиллин, подавляя агрегацию тромбоцитов в среднем на 3,1% при АДФ- и 2,5% при коллаген-индуцировашюй агрегации тромбоцитов относительно контроля.

Ацетилсалициловая кислота, подобно пентоксифиллину, проявляла выраженную антиагрегационную активность лишь при АДФ- индуцированной агрегации, регистрировалась антиагрегационная активность равная 13,5%, при коллаген-индуцированной агрег ации тромбоцитов активность не проявлялась.

Дезагрегационная активность у препаратов сравнения регистрировалась только у пентоксифиллина на АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.

При предварительной инкубации проагрегантного препарата сравнения «Этамзилата» в обогащенной тромбоцитами плазме в концентрации 2x10" М/л спонтанная агрегация тромбоцитов составляла в среднем 22,1%. Препарат оказывал незначительное влияние на индуктор-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

Влияние впервые синтезированных производных ксантина в скрининговой концентрации на тромбоцитарный компонент гемостаза представлены в таблице 2.

Выявлены соединения, проявляющие проагрегантную (С-41, С-53), антиагрегационную активность (Р-14, Р-15, Ф-170, Ф-168). Выраженным проагрегантным эффектом обладали производные ксантина, содержащие моноэтаноламмониевый и трисаммониевый ионы. Наибольшую антиагрегационную активность проявили производные ксантина, содержащие в положении С8- пиперазиновый радикал и ионы металлов. Ряд активности С -замещенных производных ксантина выглядит следующим образом:

Амины (Ф-170, Ф-168) > металлосодержащие соли (Р-14, Р-15) > пиперидиниевые соли (Р-16, С-52) > морфолиниевая соль (Р-19) > диэтиламмониевая соль (Р-1 В) > гексаметилениминиевая соль (М-13).

Различное влияние соединений было установлено и на плазменный компонент гемостаза, проявляющееся изменением показателя внутреннего пути свертывания крови - АПТВ. На ПВ и концентрацию фибриногена значимого влияния исследуемых соединений не регистрировалось.

Влияние изучаемых соединений на адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов и коагуляциопный компонент гемостаза зависело от их химической структуры. Среди исследованных новых производных ксантина выявлено наиболее активное соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид (лабораторный шифр - Ф-168).

В концентрации 2х Ю"3 М/л соединение Ф-168 полностью подавляло АДФ- и коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов. В данной дозе регистрировался так же и дезагрегационной эффект. При введении Ф-168 на пике АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в течение последующих 5 минут наблюдался 100 % распад тромбоцитарных агрегатов. Для соединения Ф-168 и пентоксифиллина была изучена зависимость антиагрегационного эффекта от концентрации (таблица 3).

Таблица 2 - Структуры производных ксантина и показатели антиагрегационной и антикоагуляционной активности

№

Шифр

Я1

Индуктор-индуцированная агрегация тромбоцитов % к контролю

АДФ

Коллаген

н' ж

1

СН3

С-41

Н

5СН2СОО"*МН3 СН2СН2ОН

105,7±2,7

106,5±2,3

С-53

Н

БСНгССЮ'МНз С(СН2ОН)3

103,4±1Д

102,3±1,7

С-52

ЭСНгСОО »Н2М

8б.2±2,1

91,3±1,8

Р-18

С3Н7

5СН2СОО * Н2М (С2Н5)2

96,7±1,8

97,4±2,3

Р-14

С3Н7

вСНоСООК

87,б±2,4

73,9±2,2

Р-15

С3Н7

ЭСНрСООЫа

84,6±ЗД

81,4±2,4

Р-16

С3Н7

Т

ЗСН2СОО"* Н2М

97.1±1,3

98,9±1,2

Р-34

С3Н7

ЗСН2СОО • н2м

97Д±1,9

94,9±2.7

\ _ Т^Г

9.

Р-19

С3Н7

вСНгСОО * н2м

99,1 ±0,9

98,8±1,1

10.

Ф-170

С3Н7

/ \ -И N(4

V-/

72,9±2Д

76,9±2,6

11.

М-7

С2Н5

ЗСН2СОО * Н2М (С2Н5)2

97,2±2Д

98,2±1,6

12.

М-13

С2Н5

5СН2СОО »Н2Ы

98,1±1,9

97,8±2Д

13.

М-8

С2Н5

БСНгСОО" • N Н3—СН2

99Д±0,9

98,9±1,1

^ /

14.

М-16

С2Н5

5СН2СОО • ин4

98,3±1Д

98,3±1,1

15.

Ф-168

С2Н5

-И NN

0,0±0,0

0,0±0,0

Таблица 3 - Зависимость биологической активности соединения Ф-168 и __пентоксифиллина от концентрации, п-7_

Конц., М/л Ф-168 Пентоксифиллин

Антиагрегац. активность, % Дезагрегац. активность, % Антиагрегац. активность, % Дезагрегац. активность, %

2*10"J 100,0±0* 100,0±0* 51,9±1,3* 12,5±2,5*

10J 100,0±0* 52,9±3,2* 13,95±2,6 * 0,0±0

5* І О"4 50,2±2,1 * 37,4±2,1* 0,0±0 0,0±0

2,5*10"4 24,3±1,8* 0,0±0 0,0±0 0,0±0

Примечание: »-отличие от контроля статистически значимо (Р<0,05);

В конечных концентрациях 2х] О"3 и 1(Г! М/л соединение Ф-168 полностью подавляло агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, адреналином, коллагеном, но дезагрегационной активности на адреналин- и коллаген-индуцированных типах кривых в данной концентрации не регистрировалось. На ристомицин-индуцированную агрегацию тромбоцитов влияния соединения Ф-168 не отмечалось. Введение Ф-168 в кювету агрегометра в концентрации 5x10' М/л за 3 минуты до АДФ приводило к снижению агрегации тромбоцитов в среднем на 50,2%. При добавлении Ф-168 на пике АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в течение последующих 5 минут наблюдался распад более 37,0% тромбоцитарных агрегатов. Пентоксифиллин в данной концентрации активности не проявлял.

Дальнейшие исследования влияния соединения Ф-168 и пентоксифиллина на систему гемостаза in vitro проводили методом тромбоэластографии, как способа ее оценки по основным ключевым компонентам изолированно и в комплексе. Регистрацию тромбоэластограмм проводили со всеми типами образцов -цитратная кровь (таблица 4), обогащенная (таблица 5) и обедненная (таблица 6) тромбоцитами плазма.

При внесении в систему исследуемых веществ, статистически значимо снижался MA, характеризующий функциональную активность тромбоцитов. В присутствии пентоксифиллина наблюдалось его падение относительно контроля на обогащенной тромбоцитами плазме и цитратной крови соответственно на 25,6% и 23,8%. За счет этого общий коагуляционный потенциал смещается в сторону гипокоагуляции. Индекс тромбодинамического потенциала (TPI) был снижен на 32,1% и 25,6% относительно контроля соответственно на образцах цитратной крови и обогащенной тромбоцитами плазме. Статистически значимо удлинялось время формирования максимальной прочности сгустка (ТМА) для цитратной крови на 17,7%, для обогащенной тромбоцитами плазме на 12,9%.

При анализе фибринолитического процесса (LY30 и CLT) статистически значимого влияния пентоксифиллина не регистрировалось. Но по механико-физическим характеристикам (A, G) сгусток в присутствии пентоксифиллина уступал контрольным измерениям. На образцах цитратной крови и обогащенной

тромбоцитами плазме показатель фактической меры прочности сгустка (О) был на 14,9% и 27,4% меньше в сравнении с контрольными измерениями. Таблица 4 - Показатели тромбоэластографии исследуемых веществ на цитратной

крови, п=7

Показатель Контроль Пентоксифиллин Ф-168 P2

SP(min) 8,7±2,1 8,4±1,3 11,4±2,2 0,2

R(min) 12,8±1,7 16,1±1,8 21,9±2,3 Pi=0,005 0,001

K(min) 3,7±0,7 4,1±1,1 7,8±0,9 Pi=0,003 0,00005

Angle(deg) 44,7±3,9 43,9±3,1 26,1±2,8 Pi=0,005 0,0001

MA(mm) 57,3±3,7 42,7±2,7 P,=0,003 31,4±3,9 Pi=0,01 0,01

TMA(min) 27,1±2,4 31,9±1,3 P,=0,01 57,2±3,8 Pi=0,006 0,004

G(d/sc) 6,7±1,7 4,8±1,1 P,<0,01 2,1±1,1 Pi=0,007 0,00001

E(d/sc) 148,9±17,2 127,1±12,2 P,<0,0001 61,3±11,7 P,=0,00005 0,0002

TPI(/sec) 11,7±2,9 7,9±2,1 3,9±1,3 P,=0,00001 0,0001

ЕРЦ%) 9,7±3,2 8,8±2,7 10,1±2,9 0,4

A30(mm) 60,4±2,9 59,7±1,9 59,2±2,1 0,5

CL30(%) 96,6±3,1 96,8±2,9 98,1±2,2 0,8

LY30(%) 3,7±1,1 3,1 ±0,9 2,6±1,2 0,3

CLT(min) 38,7±7,5 36,2±9,1 37,2±8,3 0,8

A(mm) 53,4±6,2 41,2±3,5 P,=0,02 34,7±3,1 Pi=0,001 0,0002

CI 1,7±1,1 -0,8±0,4 -2,9±1,1 P i=0,0004 0,01

LTE(min) >3 hrs >3 hrs >3 hrs -

Примечание: в этой и последующих таблицах Pi- уровень статистической значимости различий с контролем; Рг- групп, получавших пентоксифиллин и Ф-168.

Показатели тромбоэластограмм, регистрируемых на бестромбоцитарной плазме, значимого изменения в присутствии пентоксифиллина в сравнении с контролем не претерпевали. Полученные нами данные полностью соотносятся с механизмом действия и биологической активностью пентоксифиллина [Государственный реестр лекарственных средств, 2004].

При анализе тромбоэластограмм, полученных в присутствии Ф-168, регистрировались изменения на всех трех типах образцов крови. На образцах цитратной крови и тромбоцитарной плазмы статистически значимо МА снижался в среднем на 45,3% в сравнении с контролем. Соединение Ф-168 оказывало влияние и на плазменный компонент гемостаза. Показатель Angle, характеризующий функциональное состояние фибриногена, уменьшался на цитратной крови и обогащенной тромбоцитами плазме в среднем на 50%. Показатель R, отражающий энзиматическую часть коагуляции, удлинялся на образцах обогащенной тромбоцитами плазме на 56,4%, на цитратной крови -

практически в 2 раза. Это приводило к более выраженному (в сравнении с пентоксифиллином) смещению общего коагуляционного потенциала в сторону гипокоагуляции. При этом ТМА был удлинен на 111% и 56% соответственно на цитратиой крови и обогащенной тромбоцитами плазме.

Таблица 5 - Показатели тромбоэластографии исследуемых веществ на

Показатель Контроль Пеитоксифиллин Ф-168 P2

SP(min) 6,4±1,9 7,8±1,5 9,5±1,9 0,3

R(min) 9,4±1,6 11,2±1,3 14,7±1,1 Pi=0,02 0,01

K(min) 3,2±0,6 3,8±1,1 9,7±l,3 P,=0,006 0,0008

Angle(deg) 56,8±4,4 54,7±3,9 27,9±3,6 Pj <0,0001 0,002

МА(шга) 72,4±4,2 60,7±3,4 P,=0.03 39,6±3,4 P, <0,0001 <0,00001

TMA(min) 25,6±3,1 28,9±1,1 Pi=0,01 39,7±2,6 Pi=0,0004 0,0004

G(d/sc) 8,8±1,4 6.7±1,3 P i=0,3 3,7±1,1 Pi<0,00001 0,0004

E(d/sc) 169,2±12,7 131,6±11,6 P,=0,004 109,5±10,9 Pi=0,004 0,001

TPI(/sec) 15,6±I,8 11,5±2,2 7,1±1,4 P,=0,001 0,0001

EPL(%) 0,ft±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 -

АЗО(шш) 57,8±3,1 59,6±2,2 57,6±1,9 0,9

CL30(%) 100,0±0,0 !00,0±0,0 100,0±0,0 -

LY30(%) 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 -

CLT(min) 36,4±4,2 35,7±3,9 37,4±3,7 0,8

A(mm) 73,8±4,8 60,9±3,7 P 1=0,02 35,6±2,9 P,<0.0001 0,00007

CI 4,3±1,2 3,1±0,6 -1,9±0,7 P,<0,0001 0,002

LTE(min) >3 hrs >3 hrs >3 hrs -

» VU^ujhwi â ~ " •'f—,---------- Г ' ' ^

168 оказывало выраженное действие на плазменный компонент гемостаза. Статистически значимо на 49,5% удлинялся показатель R, практически в 2 раза снижался показатель Angle. Это приводило к смещению коагуляционного потенциала в сторону гипокоагуляции. Показатели TPI был снижен на 21,8%, а ТМА - удлинен на 14,9% в сравнении с контролем. Образовавшийся сгусток по механико-физическим характеристикам становился неполноценным, рыхлым (А, G). Но чрезмерной активности фибринолитической системы не отмечается (LY30, CL30, АЗО, CLT). Изменение показателей функциональной активности тромбоцитов (MA) и состояния фибриногена (Angle), на фоне нормального содержания тромбоцитов и фибриногена, позволяет предположить, что действие соединения Ф-168 направлено на этап связывания фибриногена с тромбоцитарными рецепторами GP Ilb-IIIa.

Таблица 6 - Показатели тромбоэластографии исследуемых веществ на обедненной

Показатель Контроль Пентоксифиллин Ф-168 P2

SP(min) 10,8±2,3 12,1±2,1 13,4±1,7 0,7

R(min) 11,£±1,7 9,7±2,1 17,8±2,3 P ,=0,04 0,003

K(min) 3,4±1,9 3,1±1,7 4,9±2,1 0,2

Angle(deg) 70,3±4,9 69,4±3,1 41,7±4,2 P i=0,06 0,0003

MA(mra) 40,1±1,7 39,4±1,9 32,4±2,9 P i=0,01 0,04

TMA(min) 32,9±1,2 33,7±2,1 37,8±1,8 0,2

G(d/sc) 3,3±1,1 4,1±1,2 2,1±0,9 0,007

E(d/sc) 66,8± 13,6 67,9±10,7 58,8±11,9 0,4

TPI(/sec) 10,1±1,6 9,2±1,4 7,8±1,7 0,8

EPL(%) 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 -

АЗО(шт) 40,1±4,1 39,8±2,9 39,6±3,1 0,6

CL30(%) 100,0±0,0 100,0±0,0 100,0±0,0 -

LY30(%) 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 -

CLT(rain) 34,2± 11,6 40,2±9,1 32,1±10,2 0,3

A(mm) 41,8±4,7 40,7±2,6 42,9±3,1 0,6

CI -1,1±0,9 -1,7±1,2 -4,9±1,6 P i=0,04 0,00001

LTE(min) >3 hrs >3 hrs >3 hrs -

Таким образом, результаты проведенных исследований in vitro в присутствии соединения Ф-168 выявили следующие биохимические изменения. На фоне нормального уровня тромбоцитов и фибриногена имеется выраженное смещение коагуляционного потенциала в сторону гипокоагуляции. Гипокоагуляция в основном обусловлена снижением адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов, проявляющаяся на АДФ-, коллаген-, адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов. Альтернативный путь агрегации тромбоцитов, опосредованный активностью фактора Виллебранда и мембранным гликопротеином lb-IX, остается интактным. Также наблюдается изолированное ингибирующее действие Ф-168 на активность плазменного компонента гемостаза.

Согласно данным литературы [Долгов В.В., Свирин П.В., 2005], существует заболевание, характеризующееся сходной биохимической картиной тромбастения Гланцманна. Функциональные нарушения тромбоцитов при этом состоянии отличаются высокой специфичностью - отсутствует агрегация тромбоцитов в ответ на все физиологические активаторы (АДФ, коллаген, адреналин), но сохраняется нормальная агрегация тромбоцитов в ответ на ристомицин. Причиной развития тромбастении Гланцманна является отсутствие или резкий дефицит мембранного рецептора тромбоцитов GP Ilb-IIIa [Баркаган З.С., 1988]. Из рисунка 1 видно, что при сопоставлении результатов регистрации агрегации однотипными индукторами при тромбастении Гланцманна и при исследовании Ф-168, изменения на агрегатограммах практически идентичны.

Агрегатшрамшд в „ 1 к

Ф-168 .------------- г-л.

Адренапин

АДФ

Коллаген

Рисгоцетин

Рисунок 1. Сопоставление агрегатограмм в присутствии Ф-168 с данными литературы [Долгов В.В., Свирин П.В., 2005].

В лабораторной диагностике тромбастении Гланцманна используется специальная диагностическая проба. Проводится ристомицин-индуцированная агрегация тромбоцитов с предварительным воздействием АДФ. Тест считается положительным, если уровень подъема кривой агрегации ниже, чем в отсутствии АДФ [Баркаган З.С., 1988].

АДФ+ Ристомицин (Контроль)

Ф-168+АДФ+Ристомицин

мин

Рисунок 2. Ристомицин-индуцированная агрегация тромбоцитов в присутствии

АДФ и Ф-168.

На рисунке 2 представлены агрегатограммы данной диагностической пробы, обработанные с использованием компьютерного обеспечения Aggwbr, при добавлении соединения Ф-168.

По результатам нашего исследования при добавлении в среду соединения Ф-168, согласно данным рекомендациям, выявлено значительное снижение уровня подъема ристомицин-индуцированной агрегации в присутствии АДФ. Тест положительный, что является косвенным признаком функциональной или количественной недостаточности тромбоцитарных рецепторов 01' НЬ-Ша.

Целью дальнейших экспериментов стал анализ биохимических аспектов механизма действия соединения Ф-168 на интактных лабораторных животных и на фоне моделирования гиперкоагуляционных состояний. Предварительно была

-15-

установлена токсичность изучаемых веществ при их внутрибрюшинном введении (таблица 7).

Таблица 7 - Параметры токсичности пентоксифиллина и Ф-168

Соединение ЛД50, мг/кг

Пентоксифиллин 250

Ф-168 >400

В результате проведенного исследования было установлено, что токсичность соединения Ф-168 существенно меньше токсичности пентоксифиллина. По классификации К. К. Сидорова при внутрибрюшинном введении соединение Ф-168 относится к IV классу опасности (малотоксичные).

Для комплексной оценки влияния Ф-168 на систему гемостаза в условии in vivo, проводилась тромбоэластометрия на аппарате TEG 5000. Результаты исследования представлены в таблице 8.

Показатель Контроль Пентоксифиллин Ф-168 P2

SP(min) 1CI,3±1,6 8,6±1,2 18,3±3,2 Pi=0,0006 <0,0001

R(min) 11,6±1,2 9,9±1,2 22,6±3,6 P,<0,0001 <0,0001

K(min) 4,3±1,1 4,8±1,5 19,9±5,9 P, <0,0001 <0,0001

Angle(deg) 43,98±7,0 39,9±2,3 13,1±3,1 P, =0,0002 0,0004

MA(mm) 55,9±3,2 49,6±2,2 Pi=0,003 34,3±9,9 P,=0,000008 0,0006

TMA(min) 35,4±2,3 33,4±1,8 59,7±16,1 Pi<0,000001 0,002

G(d/sc) 6,3±0,8 4,6±0,81 Pi=0,01 2,5±1,3 P,<0,00001 0,4

E(d/sc) 127,3±16,4 101,5±5,9 Pi=0,0007 53,6± 18,8 P, =0,0001 0,003

TPI(/sec) 15,1±4,6 7,7±1,3 P,=0,001 1,7±1,1 P!=0,0003 0,0005

EPL(%) 1,5±1,1 0,0±0,0 Pi=0,0002 0,0±0,0 P,=0,0006 -

A30(mm) 54,6±3,9 39,2±1,7 P,=0,0001 34,2±9,2 Pi=0,00007 0,008

CL30(%) 97,5±2,5 100±0,0 99,3±1,9 0,8

LY30(%) 0,58±0,2 0,0±0.0 0,0±0,0 -

CLT(min) 36,9±14,8 46,5±4,1 Pi=0,003 20,2±14,9 0,4

A(mm) 52,7±7,1 40,7±1,5 Pi=0,004 35,6±7,5 Pi=0,00007 0,3

CI 0,38±0,1 -1,8±0,7 -4,9±1,6 P2<0,0001 0,004

LTE(min) 127,5±3,6 >3 hrs >3 hrs -

Оценка общего коагуляционного потенциала выявила:

- Индекс тромбодинамического потенциала (TPI), который описывает общую коагуляцию, у контрольной группы составил в среднем 15,1±4,6. У группы крыс, получавшей Ф-168, он статистически значимо ниже (1,7±1,1), свидетельствуя о развитии гипокоагуляции.

- Время формирования максимальной прочности сгустка (ТМА) у экспериментальной группы удлиняется по сравнению с контролем практически в 1,7 раза.

Характеристики функциональной активности тромбоцитов и состояния фибриногена выявили следующие изменения:

- Параметр MA, характеризующий функциональную активность тромбоцитов, в экпериментальной группе крыс составил 34,3±9,9 мм, что достоверно различается с группой контроля - 55,9±3,2 мм и пентоксифиллина -49,6±2,2.

- Период R, характеризующий энзиматичсскую часть коагуляции, удлинялся у экспериментальных крыс практически в 2 раза в сравнении с контролем и пентоксифиллином.

- Параметр Angle, отображающий функциональное состояние фибриногена, при введении животным соединения Ф-168, снижен в 3,4 и 3 раза по сравнению с контролем и пентоксифиллином соответственно.

Анализ фибринолитического процесса при введении исследуемого соединения позволил обнаружить, что индекс лизиса сгустка цельной крови (CL30) и LY30, указывающий на процесс фибринолиза в течение 30 мин (динамический показатель) не изменились, а время лизиса сгустка (CLT), в отличие от действия пентоксифиллина, статистически значимо снижался.

Физико-механические свойства сгустка образцов крови (показатели А и G) у животных, получавших соединение Ф-168, были статистически значимо ниже по сравнению с контролем.

Таким образом, при внутрибрюшинном введении соединения Ф-168 характер тромбоэластограмм демонстрирует статистически значимое смещение коагуляционного потенциала в сторону гипокоагуляции (TPI, ТМА). Образовавшийся сгусток по механико-физическим характеристикам становится неполноценным, склонным к повышеному лизису (A, G).

При этом, чрезмерной активности фибринолитической системы не отмечается (LY30, CL30, А30, CLT).

Эти данные вполне согласуются с результатами исследования методом тромбоэластографии in vitro. Изменение показателя связывания тромбоцитов с фибрином (MA), на фоне нормального содержания тромбоцитов и фибриногена, свидетельствует в пользу функционального блока GP Ilb-IIIa, что является дополнительным доказательством действия Ф-168, как потенциального блокатора GP Ilb-IIIa. При этом отмечается ингибирующее влияние Ф-168 на активность плазменного гемостаза (R, Angle). Снижение показателя, характеризующего функциональное состояние фибриногена, может свидетельствовать об антикоагуляционном действии Ф-168 по типу дисфибриногенемии.

Данные, полученные при исследовании влияния на систему гемостаза Ф-168 и пентоксифиллина при внутрибрюшинном введении интактным крысам, по

спектру антиагрегационной активности полностью соотносятся с результатами, полученными на этапе in vitro. Однако соединение Ф-168 проявляло in vivo и антикоагуляционную активность (таблица 9). Удлиненное ПВ, АПТВ и время определения концентрации фибриногена в плазме (определенной коагулометрически по методу D. Clauss) в сочетании с удлиненным ТВ позволяет предположить, что в фибриногенез вступает фибриноген с измененными свойствами. Данная биохимическая картина сходна с состояниями, при которых в крови значительно повышено количество различных (физиологических и патологических) антикоагулянтов. Блокируя действие естественным путем образовавшегося тромбина, они имитируют состояние дисфибриногенемии. На это же указывает и удлинение времени свертывания в тесте с рептилазой.

Таблица 9 - Влияние Ф-168 и пентоксифиллина на показатели гемостаза in vivo,

n=7

№ Показатель Контроль Пентоксифиллин Ф-168 Р2

1 Тромбоциты * 109/л 724,4±27,6 723,8±34,0 Рі=0,96 731,2±31,6 Pi=0,53 Р2=0,54

2 АДФ- агрегация, мм 52,4±3,8 28,6±4,8 Рі<0,00001 17,7±3,2 Рі<0,00001 Р2<0,00001

3 Кол,- агрегация, мм 55,9±4,3 51,6±2,1 Р,=0,001 39,5±3,4 Р!<0,00001 Р2<0,00001

4 Адреналин-агрегация, мм 49,8±1,9 47,6±2,8 Р,=0,95 33,5±2,9 Р,<0,00001 Р2<0,00001

5 Ристомицин-агрегация, мм 57,3±2,9 55,6±2,9 Р 1=0,4 56,3±3,7 Р i=0,8 Р 2=0,6

6 Время свертывания по Г.В.Сухареву, сек 94,2±7,6 98,8±7,1 Рі=0,И 131,0±4,8 Р ,<0,00001 Р2<0,00001

7 Каолиновое время, сек 81,4±3,9 83,2±0.8 Pi =0,2 87,3±1,5 Pi=0,0004 Р2=0,004

8 АПТВ, сек 23,1±1,2 23,4±0,9 Pi=0,7 26,4±1,4 Рі=0,00003 Р2=0,0002

9 ТВ, сек 27,2±0,9 28,3±0,8 Р,=0,2 32,5±0,7 Р,<0,00001 Р2<0,00001

10 ПВ, сек 12,4±0,8 12,9±0,9 Р 1=0,3 16,3±1,1 Pi=0,02 Р2=0,03

11 Фибриноген, сек 24,3±0,8 25,9±1,9 Рі=0,2 27,5±1,4 Р,<0,00001 Р2<0,00001

13 РФМК, хЮ"2г/мл 3,14±0,6 2,9±0,6 Р 1=0,3 8 3,2±0,5 Р,=0,78 Р2=0,23

14 АТIII, % 95,4±0,9 97,2±0,9 Р 1=0,4 96,5±0,7 Рі=0,1 Р2=0,7

15 Б-димеры, мкг/мл 2,2±0,б 3,0±0,6 Pi=0,2 2,6±0,6 Pi=0,3 Р2=0,1

16 Активность ф-ра Виллебранда, % 78,0±0,3 77,4±0,6 Рі=0,14 78,2±0,4 Pi=0,7 Р2=0,8

17 Рептилазное время, сек 19.8±1,4 18,6±1,2 Р,=0,14 24,7±0,7 Р,<0,00001 Р2<0,00001

Примечание: Рі- уровень статистической значимости различий с контролем; Р2 - групп, получавших пентоксифиллин и Ф-168.

Но результаты проведенных исследований исключают ингибирующее действие на тромбин и фибринообразование ПДФ и РФМК, ввиду их нормальной концентрации в сравнении с контролем, при неизмененной активности основного антикоагулянта крови (АТ III). Анализ коагулограммы с применением теста с разведением показывает, что плазма экспериментальной группы крыс пролонгирует время образования сгустка при добавлении ее к плазме контрольных крыс, что, в свою очередь, так же свидетельствует об измененных свойствах фибриногена в присутствии Ф-168. Таким образом, полученные результаты указывают на действие Ф-168 на плазменный компонент гемостаза на уровне III этапа свертывания крови. А определение влияния Ф-168 на время полимеризации фибрин-мономера убедительно свидетельствует о том, что ингибирующий эффект реализуется именно на стабилизирующей стадии трансформации фибриногена в фибрин (таблица 10). Определение активности фактора Виллебранда и данные тромбоэластографии свидетельствуют об интакности этого фактора при введении Ф-168, что дополнительно подтверждает предположение о действии исследуемого соединения на сосудисто-тромбоцитарный компонент гемостаза по механизму блокирования рецепторов ОР ПЬ-Ша.

Таблица 10 - Показатели полимеризации фибрин-мономера животных

контрольной и экспериментальной групп

Показатель п Контроль Ф-168 я

Время сборки фибрин-мономеров, сек. 7 36,3±2,8 45,8±3,1 Р<0,00001 1,3

Исследование влияния соединения Ф-168 на систему гемостаза с использованием модельных состояний, сопровождающихся повышением агрегации и адгезии тромбоцитов, показало его достаточную эффективность при моделировании генерализованного тромбоза. При моделировании генерализованного коллаген-адреналинового тромбоза соединение Ф-168 и пентоксифиллин в разной степени уменьшали гибель животных (рисунок 3).

При введении раствора, содержащего 0,5 мг коллагена и 0,06 мг адреналина из расчета на килограмм массы тела, в хвостовую вену животным контрольной группы, в течение уже первого эксперимента наблюдали гибель животных. В первые час после инъекции гибель составляла 60% мышей, в первые 3 суток падеж составил 100%. Пентоксифиллин достоверно уменьшал гибель мышей при моделировании системного коллаген-адреналинового тромбоза по сравнению с контролем. Выживаемость составила 57,1%. Основной падеж пришелся на первые сутки после введения индукторов тромбоза. В экспериментальной группе у животных, получивших Ф-168, гибель была значимо меньше, чем в контроле и при введении препарата сравнения. Выживаемость составила 85,7%, а основной падеж пришелся в первые 4 часа эксперимента.

Таким образом, соединение Ф-168 оказалось в 1,5 раза эффективнее пентоксифиллина, проявляя выраженное ингибирующее действие на сосудисто-тромбоцитарный и плазменный компоненты гемостаза.

Контроль 100 !

75 >

.' 50 • \ \ ' 25 i. \

Ф-168" ...................................................... Пенток.

и Выживаемость, %

Рисунок 3. Спектры антитромботической активности пентоксифиллина и Ф-168 при моделировании генерализованного тромбоза у мышей.

Все вышесказанное свидетельствует о необходимости дальнейшего подробного изучения производных ксантина данного ряда, как перспективных антитромботических средств.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые синтезированные производные ксантина обладают проагрегантной (С-41, С-53), антиагрегационной и антикоагуляционной активностью (Р-14, Р-15, Ф-170, Ф-168).

2. Удлинение углеродной цепи по ^'-радикалу производных ксантина не влияет на уровень антиагрегационной и антикоагуляционной активности. Активность С -замещенных производных ксантина снижается в следующем порядке: амины (Ф-168, Ф-170) > металлосодержащие соли (Р-14, Р-15) > пиперидиниевые соли (С-52, Р-16) > морфолиниевая соль (Р-19) > диэтиламмониевая соль (Р-18) > гексаметилениминиевая соль (М-13). Наибольшую антиагрегационную и антикоагуляционную активность проявляет соединение Ф-168, содержащее в положении N1 - этильный, С8 - пиперазиновый радикал.

3. По антиагрегационной, дезагрегационной и антикоагуляционной активности соединение 3 -метил- 8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1 -этилксантина гидрохлорид (лабораторный шифр — Ф-168) в экспериментах in vitro на донорской крови человека превосходит пентоксифиллин. Об этом свидетельствует выраженное смещение коагуляционного потенциала на тромбоэластограммах, снижение адгезивно-агрегационной функции при АДФ-, коллаген-, адренапин-индуцированной агрегации тромбоцитов.

4. Антиагрегационную, дезагрегационную и антикоагуляционную активность соединение Ф-168 проявляет и в условиях in vivo при внутрибрюшинном введении интактным крысам. При этом наблюдается ингибирование агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, коллагеном, адреналином; удлиняется ПВ, АПТВ, ТВ, в то время как активность антитромбина III и фактора Виллебранда, содержание РФМК и D-димеров не подвергается существенным изменениям. Соединение Ф-168 эффективнее пентоксифиллина в 1,5 раза при моделировании адреналин-

коллагепового генерализованного тромбоза. По уровню токсичности соединение Ф-168 относится к группе IV (малотоксичные). 5. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что вероятными биохимическими механизмами действия соединения Ф-168 на систему гемостаза in vitro и in vivo является блокирование тромбоцитарных рецепторов GP Ilb-IIIa и ингибированис процесса самосборки фибрин-мономеров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Саитгалнна, А.З. Синтез солей (З-метилксантинил-8-тио) уксусных кислот, содержащих тиетановый цикл, и их влияние на агрегацию тромбоцитов / А.З. Саитгалина, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов. Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин // Башкирский химический журнал. - 2008. - Т.15, №3. - С.63-65.

2. Тимирханова, Г.А. Скрининг соединений, обладающих антиагрегационной активностью среди производных бензимидазола и ксантина / Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов. Е.Э. Клеи, О.Ю. Травников, Д.А. Еникеев, В.А. Катаев // Вестник РУДН, серия «Медицина». - 2008. - №4. - С.68-72.

3. Камилов, Ф.Х. Поиск активных соединений среди производных азотсодержащих гетероциклов, влияющих на систему гемостаза / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов, Е.Э. Клен, H.H. Макарова, Ф.А. Халиуллин // Фундаментальные исследования. - 2011. - №3. - С.66-70.

4. Камилов, Ф.Х. Поиск активных соединений в ряду производных ксантина, влияющих на сосуднсто-тромбоцитарное звено гемостаза / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов, Ф.А. Халиуллин, P.A. Губаева // Вестник РУДН, серия «Медицина». - 2011. - №1. - С.66-70.

5. Камилов, Ф.Х. Поиск соединений, влияющих на систему гемостаза, среди производных солей (3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановый цикл / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов, P.A. Губаева, А.З. Ахмерова, Ф.А. Халиуллин // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - № 6; URL: www.science-education.ru/100-4977.

6. Самородов. A.B. Влияние производных ксантина на функциональную активность тромбоцитов / A.B. Самородов. А.З. Саитгалина, Г.А. Тимирханова, Ф.А. Халиуллин, Ф.Х. Камилов // Сборник научных трудов конференции учёных РБ «Научный прорыв - 2008», посвященный Году социальной поддержки семьи, Дню Республики. - Уфа, 2008. - С.35-37.

7. Тимирханова, Г.А. Поиск активных соединений в ряду производных триазола, влияющих на тромбоцитарный компонент гемостаза / Г.А. Тимирханова, Е.Э. Клен, A.B. Самородов, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин, А.И. Тимирханов // Материалы Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». - Челябинск, 2009. - С.154-156.

8. Самородов, A.B. Результаты первичных исследовашш влияния производных ксантина на функциональную активность тромбоцитов / A.B. Самородов, P.A. Губаева, А.З. Саитгалина, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин, Г.А. Тимирханова // Материалы 74-ой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Вопросы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2009. - Т.2. - С.124-126.

9. Тимирханова, Г.А. Поиск зависимости «структура-активность» производных ксантина в отношении адгезивно-агрегационной функции

-21-

тромбоцитов / Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов, Ф.Х. Камилов, Ф.А. Халиуллин, А.З. Саитгалина // Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции «Химия и медицина» с международным участием. - Уфа, 2010. - С.296-297.

10. Халиуллин, Ф.А. Синтез и биологическая активность солей 1-замещенных (3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановый цикл / Ф.А. Халиуллин, P.A. Губаева, Ю.В. Шабалина, Д.З. Муратаев, Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов // Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции «Химия и медицина» с международным участием. - Уфа, 2010. -С.79.

11. Камилов, Ф.Х. Антиагрегационная и антикоагуляционная активность производных солей (3-метилксантинил-8-тио)уксусных кислот, содержащих тиетановый цикл / Ф.Х. Камилов, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов, А.З. Ахмерова, Ф.А. Халиуллин // Materiály VII mezinárodní vcdecko - praktická konference «Zprávy védeckc ideje - 2011». - Praha, 2011. - D.17. - P.97-100.

12. Катаев, B.A. Корректор системы гемостаза, проявляющий ингибирующее действие на адгезивно-агрегационную функцию тромбоцитов для профилактики патологического тромбообразования / В.А. Катаев, Г.А. Тимирханова, A.B. Самородов. Е.Э. Клен, А.И. Савлуков, Т.Р. Гизатуллин // Патент № 2373929 (РФ) от 27.11.2009.

13. Халиуллин, Ф.А. 3-Метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этил ксантина гидрохлорид, проявляющий антиагрегационную и дезагрегационную активность / Ф.А. Халиуллин, Ю.В. Шабалина, Г.А. Тимирханова, Ф.Х. Камилов, A.B. Самородов. P.M. Шарафутдинов// Патент № 2404181 (РФ) от 20.11.2010.

ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА В ПОЛУЧЕНИИ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ, ИЗЛОЖЕННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ.

Экспериментальные исследования, статистическая обработка и анализ результатов полученных данных, выполнены лично автором или с его участием.

СВЯЗЬ С ПЛАНОМ НИР.

Работа выполнена на базе кафедры биологической химии Башкирского государственного медицинского университета в рамках комплексной темы и включена в план научных исследований ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России (регистрационный номер 0120.0804869).

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:

АДФ - аденозиндифосфат

АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время AT III - антитромбин III ЛД50 - 50% летальная доза ПВ - протромбиновое время

РФМК - растворимые фибрин-мономерные комплексы

Соединение Ф-168 - 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина

гидрохлорид

ТВ - тромбиновое время

ТЭГ - тромбоэластография

GP Ilb-IIIa - гликопротеин Ilb-IIIa

Самородов Александр Владимирович

Поиск новых азотсодержащих гетероциклических соединений, влияющих

на систему гемостаза

Издательская лицензия № 06788 от 01.11.2001 г. ООО «Издательство «Здравоохранение Башкортостана» 450000, РБ, г. Уфа, а/я 1293; тея.: (347) 250-81-20; тел./факс (347) 250-13-82. Подписано в печать 16.03.2012 Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,4. Уч.-изд. л. Тираж 100. Заказ № 781.