Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Трансформация азотсодержащих гетероциклических соединений некоторыми грибами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Трансформация азотсодержащих гетероциклических соединений некоторыми грибами"

. МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА. ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ У РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ , ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМВНИ М.ВЛОМОНОСОВА

Г>(. —■———————————^______________

Биалмический факультет

на правах рукописи УДК 579.2214:528.28

Паршиков Игорь Альбертович

ТРАНСФОРМАЦИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ГШЕГОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ НЕКОТОРЫМИ ГРИБАМИ

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат

шсонсешш"

умной степзнп танддш гга йаологнчюзих вауг

Москва - 1993

Работа фшюлвена ва кафедре кикробислоши биологического факультета Московского государственного университета им. М-ВЛомоносова.

Научный руководитель - доктор биологических наук, ■ профессор Воробьева JLH.

Научнай консультант - доктор химических наук, ведущий научный сшрудняк Терсшъсв ILB. Официальные оппоневтъе

доктор зршнческих наук, профессор Суворов Н.Н. кандидат бааологоческшс наук, ведущий научный сотрудник Сгаровойгов И.И. Ведущая организация: Ащвснерног общество "Акрихин"

Защита даосертадцш состоится 'Л.&. "G-ft-J>Pt /Л 1993 года в "/<4 " часов ва заседании спецвализнроьанного ученого совета Д 053.05.66 в Московской государственном университете им. М.ВЛомонс сова но адресу 119899, Москва, Ленинские горы, биологический факультет МГУ.

С диссертационной работой иажао ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан Ч1993 года.

Ученый секретарь специализярсванного совета кандидат биологических наук

ЪсиР Пискунвова Н.Ф.

Актуальность темы. Использование ферментных систем микроорганизмов в сфере химических, (шотгхнологачгсхих и фармацевтических производств нашло ухе давно свое промышленное применение, в частности при производстве стероидов и щгпгбнотиюав. .

Одзако, в значительна меньшей степени иоеждогзнн процессы михро-бгологачесхях превращений более простых органзчесхнх соединений и, в частностигааотистнх гетероциклов. Это связано с тих. что ыаогае соединения этого класса' обладают зысохой тогеичноеткю по отношению к юиро-сргЕНкамям.

Между тем, Есследоззиие процессов мпхробЕслотячгсгой трансформации азотистых гетероцшогов представляется чрезвжаЙЕа перспективным, поскольку. такие процессы протекают в мягких условиях, строго рагио-мгецифичпо и стереоселгшпавно.

Среди разнообразных химических преЕращспгй сргвнгиееаос соедзие-гпта одаин ез вгннейлех халггтея процесс ex окисления, в частности,введения в 1.:слку!гу хндрозхялнной группн.

ГвдртЕгтшжрсЕзлиа азотаздчтащнх гск-ропрхзюг» цредспжукт бсш>-rscü пргвггчесжй 1лтгсргсд;0сгюльку погйолдег ¡з одну стадии» залучить каг нззгетпкз, иге: и ногыь ягжчетагннкг лре-пераяы.

Дельта аасто^дгггй гкботц жилось изучение глщюйгслсгйгаезсой трансформации серии коно- п полицкклзчеянх вготсодегжшдих гетероцшопг-чеехт совдЕкензй, мало ксследозанных до настоящего времгни, а таске noscE козьи штаммов МЕхрсорпзнЕзиот, способных осущсствлззь такие реагцЕИ. Карzjsy с этим (шло .'янтьресно аыоешзь пепракжкпе врогехргия процесса в зааняшостп от пасса соединения л тамма мнгрсоргзппз/а.

Шучняя KQBEaga. В результате прсгЗДЕЗзсго ■ скрининга иужйпых пзтамков, я тжхе штаммов, выделенных автором пз природных источников, еыезлоно 15 хрибоз, облэдалшщх гцдроггжшруалцгми сЕсйсязами по отяо-

шеиию х 2-этзшшрндану. Из них шесть штаммов гадрокскларовали мгш-леновую (-CHj-)-rpynny 2-этилдврилина. Пять ппвммов из шести: Aspergillus awamori В KM F-758, Aspergillus niger В KM F-1119, Beauveria baszima BKM F-ЗПЩ, CwminghameUa verticillata ВКПМ F-430, Pemcillium simpli-cissimum KM-16 - это граоы, ранее не исследованные в данном направлении. Три последних из пяш перечисленных ипаммов быш выделены автором из ириродша нсточгтаков.

Наибольшей гидрокешгаруалцей активностью во отношению к 2-этил-пврздиау обладал гриб Beauveria bassiana АТСС 7159, который превращал этот субстрат в оптически частый (-)-2-(1-гидрохЕиэтял)пирцдЕн с препаративным выходом ¡9,7%.

При трансформации 1-бензошщипгридина исследованными штаммами были получены 3- и 4- щцрогхипроизводные (причем 4-гадроксн-- производное было подучено с препаративными выходами), которые являются исходными веществами в синтезе ценных лекарственных и косметических средств.

При трансформации 1-бевзоядпврролидина грибом Cunninghamella verticillata ВКПМ F-430 с выходом 38,2% был получен оппнчесги »«™мнй (-) -1 -бензоил-З-пвдроксшшрролндин, который является циклическим аналогом у-аыино- Э-гадрошшмасгЕной кислоты, к тнвзеб ысоэт быть использован в синтезе серии жхвргагенннх препаратов.

Практическая значимость. Выявлено пять ягшдных штаммов хрибоз, способных эффективно рано- и стереосслг.ггакно гадрокендировззь насыщенные атомы углерода пяш и шестичзюнных азотсодержащих гетероцшаюв. Подобраны условия проведения процесса с целью получения продуктов

Результаты исследования трансформации тиишидлштт препарата "Димебон", а также аналога лекарственного препарата "Тахрин"- 9-амино-

1,2,3,4,5,6,7,8-оггагедроахрндЕка могут представлять существенный интерес для фармакологов кис модели метаболизма данных соединений в организме человека.

Пубдикчиии, По мкгериалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов, а также результатов исследования, обсуждения результатов, выводов я списка цитируемой литература, включающего 127 библиографических ссылок. Материалы диссертации изложены на /¿¡»"страницах машинописного текста, содержат 10 таблиц и 15 рисунков.

Апробапия работы. Основные положения работы догадывались на 20-й конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 1989), на Втором республиканском совещании со асснмстргчесхим реакциям (Телави, ГССР, 1989), на Всесоюзном семинаре но химии физиологически штатных соединений (Черноголовка, 1989), на V Всесоюзной конференции по химии азотсодержащих гетероцпглэчесхнх соединений (Черноголавга, 1991), а пахе на гаггдгегтл гафедры инкробкохожа биологического факультета МГУ (1992).

1. ЗКСПЕРКМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Материалы и методы исследования

• Объектами исследования слугия рад мрейпых штаммов грибов, а тах-гк пееггшькг) штаммов грабов доделенных автором нз природных источников.

Грибк АярлуШиз т°ег В КМ Р-Ш9, Ахрет&Ших аюатоп (ВКМ Р' 746, ВШ Р-437, ВКМ Р-758), Аыгг&иш Сгпгеиз ВКМ1Ч025, /капает зо'мгй ВКМ Р-1021, РаесИапуса уогюШ ВКМ Р-378, $сорх!агюрзи ЬгЫ-ссиШз ВКМ Р-406, Ошеитйщ ¿кЬохит ВКМ Р-109, Беаяепа Ьазтлапа

БХМ F-2533 (АТСС 7159), Bamsria bassiaxi (BKM ¥-71, В KM F-73, BKM F-75) были получены из Всесоюзной коллекции михроорганнзмов ИВФМ АН СССР, грибы: Aspergillus amatori (ВКПМ F-203 и ВКПМ ВУД Т-2) были получены из ВКПМ ВНИИ Генетнки, культура Beauveria bassiana 1 за коллекции ВНИХФИ им. СОйюкопиюидое. Культура гриба Aspergillus nigsr NRRL 322S была получена из коллекции Северных региональных лабораторий США.

Ряд грибов, представителей родов Aspergillus, Beauveria, РепкШшп, Rhizopus и CumünghaneUa были выделены автором из окружающей среды в определены как: Aspergillus sp. (1 - 10), Aspergillus nigsr KB-30, Beauvsria bassiana BKM F-311W, Cwminghamella verticiltoa ВКПМ F-430, Rhizopus sp. 11, Penicilliwn simplicissim'jm KM-16*.

Микроорганизмы поддергивали ва твердых средах следующего состава:

Среда N1 для паддерхапия культуры В. bassiana BKM F-2533 (АТСС 7159) и С. vertidüata ВКПМ F-430 (г/л): глюкоза - 20,0; пептон - 10,0; агар-агар - 20,0; вода водопроводная; pH 5,0

Среда N2 дал поддержания культуры £. bassiana BKM F-ЗШД (г/л): глюкоза - 10,0; кукурузный экстракт - 20,0; агар-агар - 15,0; иода водопроводная; pH 5,0.

Все остальные культуры микроскопических грибов поддерживались на 3-4 баллинговом агзриэовавном сусле.

Для проведения реакции трансформации использовала жидкие среды следующего состава: -

* Выражаю сердечную благодарность сотруднику кафедры шшши растений биологического факультета МГУ Т.П.Снэовой за оказанную помощь в определении грибов.

Среда N3 (г/л): ппзкоза - 10,0; кукурузный эгстрагг - 20,0; вода водопроводная; pH 5,0.

Среда N4 (г/л): ппокоза - 20,0; кукурузный экстракт - 10,0; пептон -5,0; КН2РО4 - 5,0; вода водопроводная; pH 5,0.

Среда N5: среда Чапека-Докса, е добавлением 5,0 г/л пептона, pH 5,0.

В качестве субстратов для трансформации использовали соединения, синтезированные на химическом факультете МГУ, такие как: 2-'этилпиридан (1). 1-бензоилпипервдин (2), 1-бензоилпирролидин (2), 1-бевзоилпир-ролидон-2 (á), 3,б-дтктал-9-[2-(2-мстилпнридил-5)эгил]-1ДЗ^етрашдро-у-хврболин дищцрохлорид ("Димебон") (5).

В качестве субстрата использовали таххе синтезированный во Всероссийском научно-исследоЕаггельсгом центре безопасности бяологачески активных вещеси (ВИД ЕАВ) аналог лекврственного препграта "Тахрин" - улучшающего память - 9-амино-1ДЗ,л,5,б,7,8-оЕтггидроахридЕН CD-

Кулвгуры грибов инкубкрозели на твердой среда в течение 10-14 сугох (до обильного спорзноизкета) при 28"С Затем проводили ошв ссор с поверхности среды 5мя стерильной водопроводной води я иьсхуяят переносили в холбу обьпгои 753 мл, содержащую 100 мк пвтатеиьной среды.

Микроорганизмы выращивали в течение 24-48 «гвсаз на круговой ка-чалзе (200-220 оборотов в минуту) при 2£РС и полученную биомассу использовали в качестве посевного материала, тторый введши з среду в птгаес-тве 5 % (объемных). Далее микроорганизмы выращивали тапке на круговой качалке в колбах на 750 кх со ICO мл среды и затем проводили реакцию трансформации в растущей культуре или э суспензии неразмшжающизся хлеток.

Субстраты для трансформации добавляли в концентрации 50-300 мг/л.

Продукт трансформации извлекали ва шдубационвой смеси методом

эквграхции ГОр£ЧИМ хлороформом В ЭКЕфШЕХЕфе ЖЯЯ тяжелых жидкостей в

» ,

течение 30 часов.

Выделение иидилипуя таптг продукз&в тгрвдсформации осуществляли с помощью флэш - хроматхнрафии ва колонке« еияисвгелелг (Й1йа®е1 40/100, СЬетаро1,ЧССР) в хроматографичесгих д»"" "" ""й полярности.

Полученные соединения идентифицврсваш на основании физико-химических и спектральных свойств: тешврвзуры плавления, хроматогра-фической подвижности (К^, гаэо-жидпхавпй хроматографии (ГЖХ), высокоэффективной зидкосшай хроматографии {ВЭЖХ), ультрафиолетовых (УФ), инфракрасных (ИК) спектров и спехзравздхионного магнитного резонанса (ПМР), ядерного магнитного резонанса {ЯМР), а также анализа мвсс-спехзрального распада.

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микробиологическая трансформация азотистых гетероциклов сравнительно мало изучена. Для проведения таких лдхздрссов ранее наиболее часто использовался гриб Веашстш Ьазз'шпа АГСС 7139, но после проведения серии исследований оказалось, что данный пггамм при пересевах теряет свою щдрахсшшрукицую.актасзвость, поэтому основная задача исследования заключалась в поиске новых, более стабильных при хранении и более активных по отношению к широкому ряду гетероцшзшчЕских соединений штаммов

Исследования проводились по трем следующим направлениям:

- сьрщшщ- микроорганизмов для тмин пения наиболее яттштмт по отношению к аэответам гетероцихлам штаммов.

- исследование напрвяения протекания процессов в зависимости от штамма микроорганизма и жттгеа соединения.

- поиск оптимальные ¡алией проведения процесса с цвеыо получения максимального выхода продавав трансформации, обладающих ценными практическими свойствами дня фвржахплогии.

В качестве субстраза для скрининга грибов был выбрав 2-этилпиридпн, трансформация которого paste не била исследована.

В этом соединении шютежмешленовая группа, которая является про-хирахьным центром, при гадрокиошроваиии которого мохао было ожидать образования отпически шнэного спирта. Известно, что некоторые производные таких спиртов обладахтг фармакологическими свойствами (антигос-таминные препараты), а химический способ их тюлучеззия достаточно сложен.

Грибы для скрининш подбирались нами в основном из тех родов, представители которых известны гак трансформаторы органических соединений. Такие процессы слоссбиы осуществлять многие представители рода Aspergillus, а из рода Beaureria разве был известен только один штамм -В. bassiana АТСС 7159, соосбный осуществлять окисление и восстановление различных классов органических соединений.

Кроме того известно» то» иешгорые предегашзтеди-родов РепсШшт, Rhizopus и Chaetomhm таваю осущсствхянгг такие процессы. В тове время грибы из родов Scopulariopsij и Paecilomyces peace не баян известны как трансформяхорк <~*prauuuy*'im пщ^ичрлцй

Широкое обследование трансформирующих сл>Ияи 32 штаммов макроорганизмов вз перечисленных выше родов, по отааисяию к 2-этнх-пиридину (|) наказало, что только 15 из них обладали гвдрокпиирукяцей активностью, причем, некоторые проявляли Ее только ретя>-, во и стереосе-лективвость в процессе шдршгигщхтяния этого субстрата, продуцируя оп-

тичссги активный (-)-2-(1-гидрогсиэтил)пиридиа;©. Такие свойства проявляли только шесть штаммов, причем пять из них - Asp. niger ВКМ F- 1119, Asp. awamori ВКМ F-75S, & bassiana ВКМ F-311Щ, С. verticillata ВКПМ F-430 и Pen. simpUcissimum КМ-16 - впервые выявленные нами отечественные культуры. Три последние из перечисленных ппаммов были выделены вами из природных источников и депонированы в коллекциях России и ФРГ.

Таблица 1

Выходы продуктов трансформации 2-этилпиридива грибами.

Грибы* Выход соединений, %

8 9 10

В. bassiana ВКМ F-2533 (АТСС 7159) 59.7 следы -

В. bassiana ВКМ F-ЗШД 7.0 следы -

Pen. simpUcissimum КМ-16 10.C следн -

Asp. awamori BKM F-758 0.04 - -

Asp. niger BKM F-1119 0.24 - следы

C. verticillata ВКПМ F-430 следы - -

Asp. niger KB-30 - 40.0 35.0

Aspergillus sp. 4 - - 30.0

Asp. awamori ВКПМ ВУД T2 - - 310

S. brevicaulis BKM F-406 - - 37.0

Aspergillus sp. 6 - - следы

Asp. niger NRRL 3228 - - следы

Aspergillus sp. 10 - - следы

B. bassiana BKM F-73 - - следы

Rhizopus sp. 11 - - следы

'Штаммы : Asp. awamori ВКПМ F-203, Asp. awamori (ВКМ F-746, ВКМ F-437), Aspergillus sp.. (1-3, 5, 7-9), Asp. terreus BKM F-1025, B. bassiana 1, B. bassiana (BKM F-72, BKM F-75), F. solani BKM F-1021, Paecilomyces variotii BKM F-378, Ch. globosum BKM F-109 - не осуществляли трансформацию 2-этилпиридаша.

Наилучший результат был получен с грибом В. bassiana ВКМ F-2533 (АТСС 7159), присланным из США. Целевой продукт - (-)-2-(1-гидрокеи-

и

этил)пнридин - был выделен с хорошим выходом (59,7%) и высокой оптической чистотой - 56,7° (с 2.2, метанол), что свидетельствует о большом сродстве данного субстрата с гидроксилирующей ферментной системе этого штамма.

Процесс трансформации 2-этилпиридина (1) другими грибами в зависимости от штамма (табл. 1) протекал различно, с образованием таг правило нескольких продуктов окисления:

СХц

О 10

Так, грибы В. basskma В КМ F-ЗНЩ и Раи simp^dssvnum КМ-16 хотя и трансформировали 2-этилпиридкн с образованием преимущественно вторичного спирта 8, однако с гораздо меньшими выходами - 7,0 и 10,0 % соответственно* (табл. 1), а оптическая чистота продукта окисления не превышала 75 % (табл. 2).

Штаммы Asp. awamori ВКМ F-758 и Asp. itigar ВКМ F-1119 также гадроксилнровали 2-этнлпиридин с образованием вторичного ошрха 8, но с очень низкими значениями выхода 0,04 и 0,24 % соответственно. Гриб С verticSkua ВКПМ F-43Q осуществлял процесс трансформации 2-этил-пирвдина с образованием следовых количеств вторичного спирта 8. Остальные штаммы не были способны окислять метиленовое заеш в 2-этилпирн-:

* Здесь и далее выходы даны в 56 на внесенный субстрат.

дине, однако их ферментные системы направляли процесс окисления или на

v.

терминальный атом угаерода и атом азота пиридинового ядра, с образованием первичного спирта 9 и N-оксвда 10 (культура Asp. niger КВ-30), или же только с образованием N-оксвда (Asp. awamori ВКПМ ВУД Т-2, Aspergillus sp.4, Aspergillus sp.6, Aspergillus sp.10. Asp. niger NRRL 3228, B. bassiana В KM F-73, Rhizopus sp.ll, S. brcvkaulis В KM F-406) (табл. 1).

Таблица 2

Зависимость величины удельного вращения и оптической чистоты (-)-2-(1-щдрохсиэшл)пиридина от штамма микроорганизма, осуществляющего трансформацию

Микроорганизм Удельное вращение Оптическая чистота, %

В. bassiana В KM F-2533 (АТСС 7159) -56.7° (с 2.2, СНзОН) 100

В. bassiana ВКМ Р-3111Д -43.40 (о о.38, С?Н<ОН) 76

Pen. simplicissimum КМ-16 -14.2° (с 0.007, OjHsOH) 25

Литературные данные -56.70 (с 3.88, С2Н5ОН), -56.10 (с 0.5, СэНфН)

2.2. Трансформация 1 -бензоилшшеридина

Выявленные в результате скрининга пять штаммов грибов были проверены на способность гадрсахилнравать мешленовое звено 1-бенэоилпипери-дина (2) - шесшчленного насыщенного гетероцикла. Этот объект был выбран нами потому, что его щцроксипроизаодные входят в состав многих природных алкалоидов и являются синтонами для тттг^ лекарственных и косметических средств. Кроме того, недавно показано/то политндрокЕи-пиперидины обладают антивирусной (анти-ВИЧ) активностью.

Из литературных данных известно, что процесс гидроксилирования 1-бензоилпиперидвна (2) способна осуществлять растущая культура триба В. Ыкзшпа АТСС 7159 с выходом 1-бензоил-4-гадрои.сишшерадина (11) не

превышающим 18 %. Кроме того, штамм В. Ъазжпа АТСС 7159 (ВКМ Р-2533) при пересевах быстро теряет свою гидрохсилирующую активность,, поэтому необходим был поиск новых штаммов, способных более эффективно осуществлять такие процессы и более стабильных при хранении.

Исследование гадрокснлврукяцей активности шли выявленных вами штаммов по отношению к 1-бенэоилшшеридину показало, но процесс трансформации идет по-разному в зависимости от условий эксперимента и штамма микроорганизма (Табл 3):

о»

пА'о

Было установлено,что при трансформации 1-бензоихпиперидвна (2) как растущей культурой, так и суспензией веразмножающихея клеток триба В. bassiana BKMF 3111Д (1) среди продуктов трансформации хроме 4-гад-роксиизомера (11) был обнаружен оптически аггияяпй (-Ь)-З-гидроксиизомер (12) [а]20з00 + 124,48*(с 0,45,метанол).

Гриб Pen. simplicissimum КМ-16 (3) в суспензии веразмножающихея клеток гадроисилировал 1-бенэошшиперидин с образованием трех соединений - 4-гидрокся, 3-тадрокси и 2-гидроксипэомеров.

При трансформации того же субстрата суспензией веразмножающихея клеток гриба Asp. awamori ВКМ F-758 (4) в инкубационной смеси найдены 4-гидрокси- и 2-гадрокси-изомеры. В остальных случаях процесс шел регио-

селективно с образованием тольи) одного продула - 1-бевэонл-4-гндроксн-шшеридина (табд. 4), причем растущая культура гриба Asp. niger В KM F-1119 (2) осуществляла процесс регяоселехзивно и выход 4-щдрохсиизомера достигал 80 %.

Таблица 3

Результат трансформации 1-бензоилпинеридина грибами

N Грибы Условия трансформации Выходы продуктов трансформации, %

ОН иАо СГ А Ptl о а Р/Ч

11 12 13

1. В. bassiana ВКМ F-ЗШД а£успензня теток в буфере б.Растущая культура .21 60 3 5 -

2 Asp. niger ВКМ F-1119 а. б. 13 80 -

3 Pen. simplitii-simian KM-16 а. б. . 3 3 1 12

4 Asp. awamori В KM F-758 • а. б. 7 34 _ 4

5 С. уегйсШаШ. ВКПМР-430 а. б. 22 19 - -

Важно сплетать, что штаммы В. bassitma ВКМ F-ЗПЩ, Asp. niger В KM F-1119 и Asp. awcmori ВКМ F-7S8 более активны в растущей культуре, чем в суспензии неразмнахшощихся клеток, что позволило повысить выход 1-бензоил-4-гидроксипиперидина до 60, 80 и 34% соответственно. Мы полагаем, что в данном случае, по-видимому, происходит индукция субстратом гвдракЕнхирующих ферментных систем микроорганизмов.

\

2.3. Трансформация 1-бензоилпирролидина и 1-бензоилпирролидона-2

Дальнейшие опыты проводились нами с штпленными аналогами 1-бензоилшшеридина - 1-бензоилпирролидином (3) и 1 -бснзоилпирролидоном-2 (4). Гидрохсипроизводные таких соединений представляют значительный интерес как аналоги т-амино-р-гадрокитмясляной кислоты, обладающей антаэтшлетпкчесгими свойствами и являющейся медиатором проведения нервного импульса. Хроме того, гидрохсипроизводные И-замещенных пир-ролидинов являются сннтонами в синтезе серии лекарственных препаратов.

В работе использовались пять выбранных нами ранее штаммов микроорганизмов.

При исследовании микробиологической трансформации 1-бенэоилпир-ролидина

(3) наиболее удачным оказался гриб С. \ertiaUata ВКПМ 1М30. Нам удалось с выходом 38,2 % (41,7 мг/л) выделить оптически активный (-)-!-бензоил-3 -гидрогситтрролидин (14) [а]£)20 -4б,5б"(с 1.89,этанол): (

Vой

^^ С.УстсШа ВКПМ р-430 ^ ¡^^

Р^О рь-^о

3 14

Как и при трансформации 1-бензоилпиперидииа, процесс идет с препаративным выходом в случае растущей культуры. В суспензии неразмно-жаютцихся клеток трансформация происходит аналогично, но выход (-)-!-бензоил-З-гадрохЕипиперидина составляет лишь 18,9 % (20,8 мг/л).

Из литературы известно, что гидроксилирование 1-бензовлпирроли-дина растущей культурой В. Ыизита АТСС 7159 происходит в положение 2

пирролидинового цикла, что приводит к раскрытию кольца и образованию К-(4-гидроксибутил)бсюамида с выходом 8 %.

Успешное проведение нами процесса в случае 1 -бенэоилпиррсагидина явилось стимулом к изучению трансформации 1 -бенэоилпирролидона-2 (4) с целью получения оптически активного 4-гидроксипроизводного. Однако, проведенные нами исследования поквэии, что культура С. УсгПсЦШа ВКПМ Р-430 менее специфично взаимодействует с этим субстратом. В куяьтураль-вой жидкости были обнаружены бензамид (15) (выход 1 %) и большая гамма продуктов, что указывало на неспецифичность процесса, -сопровождаемого деструкцией субстрата:

Ж,

у \ С.уегНсОЫа ВКПМ 7-430

0 I-* и

4 16

Согласно литературным данным, растущая культура В. Ьаззита АТСС 7159, в отличие от штамма С. \ertkUlaia ВКПМ Р-430, гидроксилирует 1-бензоилпирролидон-2 с образованием 4-гвдрохсипроизводвого, однако выход его был невелик (17 % в смеси с бензамидом).

Приведенные примеры гидроксилнрования 1-бензоилпирролидииа (3) и 1-бензоилпирролидона-2 (4) грибами С. \еПкШаШ ВКПМ Р-430 и В. Ъазхита АТСС 7159 валидно иллюстрируют различие в субстратной специфичности систем двух. разных штаммов: преимущество гриба С. VсгйсШаХа ВКПМ Р-430 при гадроксилировании 1-бенэонжшрролидина в преимущество В. Ьазз'шпа АТСС 7159 при гадроксилировании 1-бснэоил-пирролидона-2.

2.3.1. Влияние индукторов и ингибитора на щдроксилнрующую актив!лъ гриба Curuiinghamella rerOeillata ВКПМ F-430

Мы полагаем, что достижение большего выхода (-)-1-бенэоил-3-гид-роксшшрролидина (14) при трансформации 1-бензовлпирролидина Q) растущей культурой гриба С. verticillata ВКПМ F-430 по сравнению с трансформацией суспензией веразмножающихся клеток можно , объяснить двумя-причинами. Первая - это присутствие в среде с растущей культурой глюкозы и фруктозы (из сахарозы). Известно, что процесс гадроксилирования азотистых гетероцшогов осуществляется цнгохром-Р-450 - зависимыми моноохсиге-наитыми системами микроорганизмов, а такие процессы требуют присутствия восстановленного НАД+, который регенерируется за счет окисления Сатаров.

Вторая причина может состоять в том, что в этом случае происходит индукция субстратом гадроксилирующей ферментной системы гриба С. verticiUata ВКПМ F-430.

Как видно из данных таблицы . 4, при увеличении концентрации субстрата до 100 мг/л в растущей культуре на среде N5 выход в мг/г сухой биомассы возрастает и составляет 3,0.

Увеличение концентрации субстрата до 150 мг/л не приводит х возрастанию выхода продукта трансформации (14). В остальных случаях, при разных концентрациях субстрата в при разных условиях трансформации выход продукта в мг/г сухой биомасса остается постоянным и равен 1,6-1,7. Поэтому наиболее вероятным является предположение о том, что происходит индукция субстратом шдроксилирующей ферментной системы триба С. verticillata ВКПМ F-430. Это предположение необходимо было проверить постановкой дальнейшего эксперимента.

Таблица 4

Выход (-) -1 - бензоил -3 -гидрокеипирролндина в зависимости от состава

среды, концентрации субстрата и условий трансформации

Условия трансформации Концентрация субстрата, мг/л Состав среды Выход продукта 11 Сухая биомасса в г/л Выход про- ' дукга & «¿сухой биомассы

мг/л %

Суспензия веразмножаю-щихся клеток 50.0 Среда N4 без пептона 10.8 19.8 6.4 1.7

50.0 Среда N4 с ; 13.2 петоном > 24.4 1 8.4 1 1.6 1 1

100.0 Среда N4 с ! 13.0 i 12.8 { 8.0 пептоном ' ! I 1.6

100.0 Среда N5 ' 20.8 ! 18.9 ! 13.0 1.6

Растущая культура 50.0 ! Среда N5 ! 20.4 ! 37.4 ! 13.2 1.6

100.0 1 Среда N5 141.7 ! 38.2 1 I4.I 3.0

150.0 1 Среда N5 ' 41.1 • 25.2 < 13.8 3.0

Нами ставилось шесть вариантов опытов, в которых в качестве индукторов использовались 1-бензоилпирролндан (2) и фенобарбитал, а в качестве ингибитора- циклогексимид (табл. 5), как ингибитор синтеза белка de novo в хлетке. В результате проведенных исследований было выяснено, что только в опыте, где в качестве индуктора использовался субстрат 3, наблюдается увеличение »"ff продукта J4 до 19,0 мг/л по сравнению с 12,0 мг/л (контроль). Использование же в качестве индуктора фенобарбитала не приводит к увеличению выхода продукта И (табл. 5).

Из литературы известно, что фермент (цигохром Р-450) достигает максимальной концентрации в клетках во время стационарной фазы роста, а на ранних стадиях культивирования он отсутствует.

Таблица 5

Результаты влияния индукторов и ингибиторов на пхдрохсшшрованве 1 -бензошширрояидина грибом С verticillata ВКПМ F-430

N п/п Добавленный индуктор или ингибитор Выход продукта 14 Сухая биомасса в г/л Выход продукта в мг/г сухой биомассы

в мг/л в%

I. Контроль 12,0 Н.0 6,9 1,6

2. 1-бензоилшгоролидин 19,0 17,5 6,6 2,9

3. фенобарбитал 1U 10,4 6.1 1,7

4. цпюгогеютмид 5,7 5,2 6,4 0,9

5. 1 -бензешшврршшдин И ППЕЛОГеКЕИМНД 12,8 11,7 6,3 2а

6. фенобарбитал и цпклогсксимид 5,4 4,9 6,7 0,8

В опыте нами использовалась суспензия неразмножающихся клеток, причем клетки, находящиеся в стационарной фазе роста. Добавление в

буферный раствор вместе с биомассой и субстратом циююгексимида, в случав индукции фенобарбиталом н без индукции (варианты опыта 4 и 6), приводит х яишбиротин им синтеза фермента de novo, и выход продукта трансформации снижается до 3,4-5,7 мг/л. Тогда как, в случае использования в качестве индуктора субстраха (вариант опыта 5), выход продукта (14) после добавления цкклогексимида снизился с 19,0 мг/л до уровня контроля -12,8 мг/л. Это свидетельствует о том, . что индукция субстратом щцроксилирухяцей ферментной системы С verticillata В KM F-430 имеет ■ место. То есть, в процессе трансформации участвует только фермент, который присутствовал в клетках к моменту добавления ингибитора. Из проведенных исследований можно сделать вывод, что при использовании в

качестве индуктора 1 -бензоилпирролидина происходит индукция ферментной системы в клетках (увеличивается синтез м РНК дня дальнейшего синтеза белка). Если в буферную смесь добавлялся щшюгексимид, то он инги-бировал синтез необходимого фермента и выход продукта становился ниже. Так как трансформацию проводили суспензией клеток в буфере, то влияние восстановленного за счет окисления Сахаров НАД+ па выход продукта исключается. Поэтому в данном случае речь может идти только об индукции субстратом ферментной системы микроорганизма.

Тот факт, что фенобарбитал не индуцирует ферментную систему, можно объяснить тем, что цитохром Р-450 имеет множественные формы с различной специфичностью к разным субстратам и данная форма фермента не индуцируется фенобарбиталом, а индуцируется I-бензоилпирролидином и проявляют специфичность к Этому субстрату тидроксилированпя.

2.4. Трансформация пол ациклических азотсодержащих гетсроцихличесгих

соединений .

В дальнейшей работе вам было интересно перейти к изучению превращений под действием микроорганизмов лекарственных препаратов, представляющих собой полициклические азотсодержащие гетероциклические соединения. „

Известно, что микробиологическая трансформация лекарственных препаратов, с одной стороны, моделирует процессы их превращения в организме человека и животных, а с другой стороны, является методом получения препаративных количеств потенциально активных метаболитов.

Мы изучали процесс микробиологической трансформации 3,6-ди-метил-9-12-(2-метилш|ридил-5)зтил}-1,2,3,4-тстрагидро-у-кярб<мина дигидпо-

хлорида (5) - эффективного антигистаминного препарата "Димебон" (СССР) и аналога улучшающего память - препарата "Такрин" - 9-амино-" 1,2,3,4,5,6,7,8-окгагидроакрвдина (7). Микробиологические превращения этих соединений ранее не исследовались.

2.4.1. Трансформация 3,б-диметил-9-[2-(2-метилшгридил-5)-зта]-1,2,3,4-тетращдро-т-харбсошш ("Димебон")

Изучение процесса трансформации "Димебона" -представляло для нас интерес, так как в качестве фрагмента он содержит остаток моноциклического азотистого гетероцЕКла 2-метил-5-;лилциридина, трансформация которого культурой В. Ьазхита ВКМ Р-2533 (АТСС 7159) была изучена ранее. В качестве продукта трансформации был выделен вторичный спирт 2-метил- 5- (1 -гидроксиэтил) пиридин, обладавший оптической акгавносгло [а!^20 -30,0*(с 3.17, метанол).

С другой стороны в молекуле "Димебона" © тлеется фрагмент пиперидина, что позволило надеяться на возможность окисления и этой части молекулы. Поэтому мы ожидали, что гидроксилированне метиленовых групп как того, так и другого фрагмента может привести к оптически активным гадроксипроизводным "Димебона" *с новыми эффективными фармакологическими свойствами.

При изучении трансформации соединения (5) исследуемой серией грибов оказалось, что только культура Реп. ¡трИаххапит КМ-16 трансформирует дяиттмй субстрат. При этом мы выделила не ожидаемые гид-роксипроизводные, а соединения 2* и 12. выход которых был невелик и составлял всего по 10,0 % каждого из веществ:

"ХдсГ

• Чх.

FjtnphdBbmm Ш-IS

i IjL 'ХХХГ "Tx£r

Соединение IS образовалось за счет дегидрирования соединения 5, то есть за счет потери двух атомов водрородд из тетрашдрошрндиновой част молекулы. Тахого рода процессы дегидрирования ферментными системами микроорганизмов отмечены при трансформации природного алкалоида гяау-цина грибом Fusarium solani АТСС 12823. Аналогичные процессы отмечены в организме человека.

Соединение 17 образовалось, вероятно, в результате демешлкрования соединения 16 с последующим окислением в положенно £ и едетилированием амивотруппы. }

Z4.2. Трансформация 9-амино-1,2,3,4,5,6,7,8-остагЕДроакридина (аналог лекарственного препарата Такрин")

Мы' проверили • пять исследуемых штаммов грибов на способность трансформировать аналог лекарственного препарата "Тахран" (7), такяе содержащего в молекуле ашшшрндиновый фрагмент, и обнаружили, что наиболее активной оказалась культура С verticilhua ВКПМ F-430.

В результате трансформации 2 было выделено вещество 18 с выходом 90

1 Л

То естъ.и а данном случае мы не наблюдали пщроксилироБания метил еловых групп субстрата, окислению подвергался лишь гетероциклический атом азота. Тем не менее образование Л-окиси вещества 18 может представлять существенный интерес для фармакологов, как модель метаболизма данного соединения в организме человека.

Кроме того, мы получили дополнительную информацию о функционировании ферментной системы триба С. уегйсйШа ВКПМ Р-430 по отношению к зхщденсирсванным системам, содержащим в качестве фрагмента пиридиновое кольцо.

Таким образом, те закономерности, которые мы наблюдали при трансформации моноциклических азотистых гетероциклов, ве реализовались при трансформации конденсированных систем теми же микроорганизмами.

В ж результате дроврденных исследований можно отмешц>, что выявленные нами в результате скрининга пять штаммов грибов способны осуществлять процессы трансформации по-разному в зависимости от штамма \ и класса соединения.

ВЫВОДЫ:

1. В результате проведенного скрининга музейных штаммов, а так хе . штаммов выделенных из природных источников, выявлено 15 грибов обладающих гидроксилируютдими свойствам по отношению к 2-этил-

пиридину. Из них шесть штаммов обладали способностью гадроксилировать метиленовую (-СН2-) группу 2-этилпиридина.

2. Наиболее эффективно гидроксшшровали азотистые гетероциклы В. bassiana ВКМ F-ЗШД, С. verticillata ВКПМ F-430 и Pen. simplicissimum КМ-16 - выделенные из природных источников - и два коллекционных япамма - Aspergillus awamori ВКМ F-758 и Aspergillus niger ВКМ F-1119.

3. Наибольшей гидрохсилирующей активностью по отношению к 2-этилгшридину обладал штамм Beauveria bassiana АТСС 7159, который превращает этот субстрат в оптически чистый (-)-2-(1-щдрохсиэтЕл)1шридин с препаративным выходом (59,7 %).

4. Выявлены три штамма (Аур. awamori ВКМ F-758, В. bassiana ВКМ F-ЗШД и Asp. niger ВКМ F-1119) и подобраны условия гадроксияирования ими 1-бензоилпнперидина с препаративными выходами 1-бенэоил-4-гид-рохсипиперидина - 34, 60 и 80 % соответственно. Штамм B.bassiana ВКМ F-ЗПЩ дополнительно.образовывал, оптически активный (+)-1-6оезоил-3-гидроксипиперидин.

5. Штамм С. verticillata ВКПМ F-430 регио- и стереоселсктивно падроксилировал Ьбекзоилпиррслдаш с образованием оптически активного 3-гидроксипроизвсдесго (выход до 38 9S). Подобраны условия трансформации и состав среды для эффективного проведении этого процесса.

6. При трансформации частично щдрировгнного акридина (сналога препарата "Такрик"), С. verticillata ВКПМ F-430 осуществляя только N-ok-сидирование гетерокольца с выходом N-ошзида 90

7. Штамм Pen. simpliebsimum КМ-16 трансформировал лятргтаенный препарат "Димебоя" путем дещдрировшия пиперэдинсгого кольца, сто оксидирования, деметилироваппя к последующею N-ацсшлировгння. Пири-дилзтальная часть молекулы при этом не затрагивалась.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Довшлевич Е.В., Моденова JLB., Паршиков И.А., Теренгьез ILB., Воробьева Л.И., Бувдель Ю.Г. Способ получения (-)-(1-оксизтил)пири-динов. Авторское свидетельство N1364521 (СССР), 1987; Б.И., 1988. - N1.

2. Терензьев П.Б., Паршиков НА., Довшлевич ЕЛ., Воробьева Л.И. МодяЕова JLB., Гришина Г.В. Микробиологический синтез изомерных щпрокеи- Ьбензошшвперидиноз: Техдокл. "Химия физиологически активных соединений". - Черногсшовка, 13-15 ноября 1989-С1226.

3. Паршиков ИА.Доигилевич Е.В., Модянова JLB., Воробьева Л.И. Тсрснтьсп П.Б., Стерео селективное гидроксилирование этшширидинов: Тез. дохл. Республиканского совещания по асимметрическим реакциям.-Телаии, 12-14 окт. Д989.-С.47.

4. Паршиков НА., Алварес XJB. Скрининг микроскопических грибов -трансформаторов азотсодержащих гетероциклических соединений // Проблемы совремгнной биологии / Тр. 20 науч. хонф. мол. ученых биол. фаг. МГУ, Москва, 24-28 апр. 1989 / МГУ.- М., 1989, -4.2 - С. 78-91 Деп. в ВИНИТИ 05.0Z90.

5. Воробьева JUL, Паршнхоз ИА., Дорре М., Довгялевич Е.В., Мода-нова J1B., Теренться П.Б., Нихшпова Н.Г. Микробные превращения азотсодержащих гетероциклических соединений. Гидроксилирование этилпиридинов микроскопическими грибами // Биотехнология. - 1990. -N4-С. 24-24.

6. Паршиков ИА., Воробьева ЛЛ, Модянова JLB., Довтилевич ЕЛ. Терентии П.Б., Хофманн X. Штамм гриба Becutveria bassiam 3111Д в качестве трансформатора для гидроксилирования 1-бензоилпипершшна

и I- 6ензоиламино-3,7-диметилокга- диена-2,6. Заявка на авторское свидетельство N4903326 /13/110558, полож. решение от 24.01.92 г.

7. Ларшихов И_А., Воробьева Л.И., Модянова Л.В.Довгилевич Е.В., Теренгьев П.Б., Хофманн X. Штамм гриба Cimninghamella verticillata трансформатор для хидроксшшрования 1 -бснзошпшрролидина и 1-бен-зоиламано-3,7-диметалокгадиена-2,6. Заявка на авторское свидетельство N4882787/13/110407, полож. решение от 25.0S.92 г.

8. Воробьева Л.И., Терентьев' П.Б., Модянова Л.В., Довгилезич HB., Паршиков НА. Микробиологическая трансформация азотистых гетероциклов. Литературный обзор // Межфакуяьтетсккй сборник / МГУ.-М, 1993 (в печати).

9. Паршиков НА, Модянова Л.В., Довгалевкч Е.В., Теренгьев П.Б. Воробьева Л.И., Гришина Г.В. Микробиологические превращения гетероциклических соединений Ш. Микробиологический синтез гщцлкьн-пропзвэдных 1-бгнзоылшш5ридина и Г-бешоилпирролидина //Химия гетероциклических сосдиневий.-1992.- N2 -C.195-1S9.

10. ДоЕгияевич Б.В., Модянова Л.В., Парников И.А_, Тергнтьгв П.Б., Дудучагз М.В. Микробиологический синтез описи 9-алощо-1,2,3,4,5,6,7,8,-осгащдроакрЕДИна: Теадокл. Зсесоюзной конференции по амии гзотеодержащих гетероциклических сосд5некЕЙ.-ЧерноголсБна 2225 ост. 1991,- Ч.1.-С 118.

11. Dovgilcvich EV., Paithitov LA., Mouj-anova L.V., Tcientcv P.B., Buîakbov GA. A novel microbial transformation of y-caiboiine dsrivath-e 3,6-dtmethyl-9-[2-(2-methj^o^-5-yl)ethyl]-l,2,3,4-tet^}-dro-7-carboline // Mendckcv Commun. - 1991. - P.42-43.