Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

Пермякова, Наталья Фердинандовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений"

Пермякова Наталья Фердинандовна

ОЦЕНКА АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ И ТОКСИЧНОСТИ НОВЫХ ПОЛИКАРБОНИЛЬНЫХ КАРБО- И ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.07 - микробиология

- 3 ДЕК 20иЗ

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 2009

003486860

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Блена Ивановна доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович

доктор медицинских наук, с. н. с. Плотников Олег Петрович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

Защита диссертации состоится 17 декабря 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

университета www.sgau.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Автореферат разослан

года и размещен на сайте

доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Формирование устойчивости бактерий к антимикробным препаратам остается одной из самых актуальных проблем современной медицинской и ветеринарной микробиологии (Навашин, 1994; Сидоренко, 1995, 1998; Страчунский, Козлов, 2001). Природная лекарственная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов и обусловлена отсутствием или недоступностью мишени действия антибиотика; в этом случае традиционные антибиотики клинически неэффективны. Примером может служить резистентность микоплазм и псевдомонад к бензилпеншцшлину или бактерий к противогрибковым препаратам (Егоров, Сазыкин, 1999). Приобретенная устойчивость связана со способностью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Различают первичную, имеющуюся до начала лечения антимикробными препаратами, и вторичную приобретенную устойчивость, которая развивается и возрастает в процессе антимикробной терапии и обусловлена изменением генома микробной клетки в результате мутаций или внехромосомного (плазмидного) переноса генетической информации от одной микробной клетки к другой с последующей селекцией устойчивых штаммов микроорганизмов (Розенфельд, 1986; Сазыкин, 1998; Сидоренко, 1999; Романова, 2001; Страчунский и др., 2002).

Особое внимание с точки зрения клинической значимости и уровня анти-биотикорезистентности заслуживают метициллинорезистентные стафилококки (МБ-БА), у которых метициллинрезистентность является маркером полирезистентности ко всем р-лакгамным антибиотикам и ассоциирована с устойчивостью к аминогликозидам, линкозамидам и фторхинолонам. Кроме того, МБ^А имеют тенденцию к эпидемическому распространению, что делает данную проблему крайне важной (Фомина, 1997; Сазыкин, 1998; Яковлев, 1999; Бело-бородова и др., 2000; Проценко и др., 2005).

Одним из перспективных путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов является поиск и внедрение в практику новых антибакте-

риальных веществ, в том числе с отличным от широко применяемых антибиотиков строением и механизмом действия (Яковлев, 1999; Страчунский, 2001). В связи с вышеизложенным, поиск веществ с антибактериальной активностью среди новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов и изучение их антибактериального действия на различные микроорганизмы является актуальным и имеет прикладное значение.

Цель работы: изучение антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов, токсичности наиболее перспективных соединений и их влияния на метаболические процессы в организме лабораторных животных .

Задачи исследования:

1. Провести отбор перспективных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений различных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов грамположительных и грамотрица-тельных микроорганизмов.

2. Оценить антибактериальное действие отобранных соединений на клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

3. Выявить взаимосвязь проявления антимикробной активности отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с особенностями их химической структуры.

4. Изучить токсичность отобранных соединений на биотест-объектах Daph-nia magna Straus и на белых лабораторных мышах.

5. Определить влияние отобранных соединений на активность ключевых ферментов метаболизма, состояние белкового, липидного и углеводного обменов в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.

Научная новизна. В работе впервые дана характеристика антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов: феиилпентендиона, халкона, полифункциональнозаме-

щенных эфиров, енамина, семикарбазона в отношении тест-штаммов бактерий Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P и грибов Candida albicans 18; отобраны 10 наиболее перспективных в плане дальнейшего изучения. Все соединения были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Отмечена высокая антибактериальная активность препарата ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по отношению ко всем используемым бактериям. Выявлены 8 перспективных антистафилококковых препаратов из ряда халкона (№ 44, 47), полифункциональнозамещен-ных эфиров (№ 45, 46,49), енаминов (№ 4), семикарбазонов (№ 9,10). Показана фунгицидная активность в отношении стандартного тест-штамма Candida albicans 18 соединения из ряда енаминов (№ 4).

Установлена самая высокая антимикробная активность по отношению к метициллинорезистентным клиническим штаммам стафилококка соединения ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по сравнению с другими изучаемыми соединениями; МПК для MRSA составила 3,12 мкг/мл, для MRSE - 1,28 мкг/мл. Данное соединение также обладало высокой антимикробной активностью в отношении метициллиночувствительных клинических штаммов S. aureus, S. epi-dermidis и S. hominis, (МПК 0,80 мкг/мл). Этот же препарат был эффективен и в отношении клинических штаммов Escherichia coli и Proteus vulgaris.

Впервые установлена зависимость антимикробной активности изучаемых соединений от значений их молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.

Определены показатели токсичности отобранных соединений па биотест-объектах D.magna и белых лабораторных мышах и отобраны 4 нетоксичных препарата, для которых впервые изучено влияние на метаболическую активность в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили отобрать перспективные соединения с антимикробной активностью в отношении стандартных тест-штаммов Е. coli 113-13, В. cereus 8035, S. aureus 209 Р, и С. albicans 18, и клинических штаммов грамположительных и грамот-рицательных микроорганизмов, не обладающие токсичностью по отношению к биотест-объектам и не оказывающие существенного влияния на активность ключевых ферментов, состояние белкового, углеводного и липидного обменов в организме лабораторных животных. Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, 44, 46 и 4 являются перспективными анти стаф и л о ко кко вым к препаратами.

Результаты проведенных исследований позволяют проводить направленный синтез новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений с антимикробной активностью в ряду фенилпентендиона, халкона, полифунк-циональнозамещенных эфиров, семикарбазонов и енамина. Результаты исследований внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Антимикробной активностью по отношению к стандартным и клиническим штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также к низшим грибам обладают 10 представителей новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений классов фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов,енаминов.

2. Перспективные по антимикробной активности соединения классов фенилпентендиона (ПНВ-1), халкона (№ 44), енаминов (№ 4) и полифунк-

циональноз&чещенных эфиров (№ 46) являются малотоксичными для гидробионтов (Daphnia magna) и белых лабораторных мышей, 3. Отобранные поликарбонильные карбо- и гетероциклические соединения ПНВ-1, № 44, № 46, № 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не вызывают выраженных изменений активности ключевых ферментов метаболизма и показателей белкового и углеводного обменов в организме белых мышей. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях различного ранга: научной конференции молодых учепых вузов Поволжского региона «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2006-2009), межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); XI Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2009); общероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2009).

Работа выполнена на кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского в рамках темы НИР «Разработка методологии создания и тестирования новых препаратов с антимикробной активностью» совместно с сотрудниками Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского в период с 2005 по 2009 годы. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.

Исследования были частично поддержаны 2 грантами: CRDF RUB 1-570-SA-04 при финансовой поддержке Palomar Medical Technologies, Burlington, USA; грант «Проведение научных исследований молодыми учеными (4 очередь)» 2006-РИ-19.0/001/028 в рамках федеральной целевой научно-технической программы «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, собственных исследований, заключения, выводов, приложения и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 146 страницах текста, включают 10 рисунков, 13 таблиц. Список использованных литературных источников включает 171 наименование, в том числе 51 иностранных авторов.

Собственные исследования Материалы и методы

В работе в качестве экспериментальных моделей по изучению антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений были использованы стандартные тест-штаммы Escherichia coli 11313, Bacillus ceretis 8035, Staphylococcus aureus 209 P, Candida albicans 18, полученные из ГИСК им. JI.A. Тарасевича, клинические штаммы грамположнтель-ных и грамотрицательных бактерий: S. aureus MRSA, S. aureus MSSA, S. epi-deiirtidis MRSE, S. epidermidis MSSE, S. hominis, Salmonella enteritidis, E. coli, Proteus vulgaris - из музея бактериальных культур Государственного научного учреждения Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Рос-сельхозакадемии.

Для исследования использовали 66 новых карбо- и гетероциклических соединений 10 классов: фенилпентендионы, гидроксициклогексаноны, гидроин-дазолы, оксимы, халконы, полифункциональнозамещенные эфиры, циклогексе-ноны, тетрагидротриазолохиназолины, енамины, семикарбазоны. Все соединения были синтезированы на кафедре органической и биоорганической химии Института химии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского. Квантовохимические расчеты для молекулярных характеристик изучаемых соединений проводили полуэмпирическим методом в валентных приближениях самосогласованного поля (ССП) молекулярных орбиталей с линейной комбинацией атомных орбиталей (МО ЛКАО) с параметризацией РМз с полной оптимизацией геометрии (процедура Бройдена-Флетчера-Гольдфарба-

Шанно) (Dewar, Thiels, 1977). Для расчетов использовалась оболочка HyperChem 7.01 Professional (Dewar, McKee, Rzepa, 1978).

Определение чувствительности тест-штаммов ко всем исследуемым соединениям проводили методом двукратных серийных разведений в бульоне Мюллера-Хинтона (pH 7,2-7,4), содержащих различные концентрации изучаемых соединений (Методические указания, 2004). В ходе исследования определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) 66 исследуемых соединений. Для определения бактерицидного или бактериостатического действия веществ делали мерный высев из всех опытных пробирок на агар Мюллера-Хинтона. Для дальнейшей работы отбирали соединения с антимикробной активностью в отношении тестируемых штаммов. В связи с низкой растворимостью соединений в воде их предварительно растворяли в димегилсульфоксиде (ДМСО), а затем готовили рабочие концентрации препаратов путем добавления физиологического раствора. При всех используемых рабочих концентрациях веществ концентрация растворителя составляла от 0,1 до 0,002% и не влияла на чистоту экспериментов, что было подтверждено специально проведенными контрольными исследованиями. Опыт сопровождался двумя контролями: посев культуры в жидкой питательной среде без препарата, и с максимальным количеством растворителя (0,1% ДМСО), использовавшимся в ряду разведений исследуемых веществ.

Исследование токсичности поликарбонильных карбо- и гетероцикшие-ских соединений с антимикробной активностью проводили в два этапа: биотестирование на тест-объекгах дафниях больших (Daphnia magna Straus) с определением летальных и безвредных концентраций (Методические указания, 2001), и определение острой токсичности на лабораторных животных - на половозрелых белых мышах-самцах массой 18-20 г, путем однократного введения различных концентраций препаратов (Методические рекомендации, 1997). Препараты вводили внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. На основании полученных результатов рассчитывали величину LDJ0 и проводили оценку токсичности изучаемых соединений (Гуськова, 1990).

Одновременно проводили определение основных биохимических показателей крови лабораторных животных по общепринятой методике (Камышников, 2000). Биохимические исследования проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS 3000 Р. Определяли активность ключевых ферментов: аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы (КК), щелочной фосфатазы (ЩФ); а также концентрацию общего белка, мочевины, глюкозы. На основании полученных значений вычисляли коэффициент де Ритиса и индекс ферментемии (Малинин, 2009).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам (Ашмарин и др., 1970). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Microsoft Excel 2003 (for Windows XP).

Полученные результаты и их обсуждение На первом этапе работы был проведен скрининг 66 новых карбо- и гетероциклических соединений различных классов на антимикробную активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов (табл. 1).

Было установлено, что соединения классов гидроксициклогексанонов, гид-роиндазолов, оксимов, циклогексенонов и тетрагидротриазолохиназолинов не обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам. Из пяти изученных соединений фенилпентендиона только два препарата обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов. Препарат ПНВ-1 (2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) характеризовался эффективным антимикробным действием в отношении грамположительных бактерий - S. aureus 209 Р и В. cereus 8035. МПК для каждого из этих микроорганизмов составила 6,75 мкг/мл, при этом проявлялось бактерицидное действие данного препарата. В отношении Е. coli 113-13 в зависимости от концентрации ПНВ-1 обладал бактериостатическим и

бактерицидным действием. Концентрации ПНВ-1 от 1 мкг/мл и выше оказывали выраженное бактерицидное действие наЕ. coli 113-13.

Таблица 1 - Антимикробная активность исследуемых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

МПК, мкг/мл

Лабораторный E.coli 113-13 S.aureus 209 Р Bacillus cereus Candida albicans

шифр вещества 8035 18

Соединения фенилпентендиона

ПНВ-1 1,00 6,75 6,75 -

ПНВ-Б - 100 - -

Халконы

44 - 1,60 - -

47 - 1,60 - -

Полифункциональнозамещенные эфиры

45 - 0,80 - -

46 - 0,80 - -

49 - 0,80 - -

Енамины

4 1,60 6,75

Семикарбазоны

9 1,60

10 1,60

Препарат ПНВ-Б (1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) проявил низкую антимикробную активность в отношении стандартных тест-штаммов по сравнению с ПНВ-1. Выявлено антимикробное действие только на S. aureus 209 Р, для которого МПК составила больше 12,5 мкг/мл.

Исследованные соединения ряда халкона (3-(диметиламино) бензили-ден)пентан-2,4-дион - (№ 44) и этшх-2-(4-гидроксибензилиден)-3-оксобутаноат - (№47) характеризовались бактерицидным действием в отношении S. aureus 209 Р (МПК 1,6 мкг/мл). Однако эти вещества не обладали антимикробной активностью в отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035.

Из 5 представителей полифункциональнозамещенных эфиров было отобрано три вещества: 2,2'-ди-(3-(3-метокси-4-гидроксифенил)-2,4-диацетил -5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый (№ 46), 2,2'-ди-(3-фенил-2,4-ди-ацетил-5-гидрокси-5-метил-циклоген-1-ил)-диэтиловый (N° 45) и 2,2'-ди-(3-(3-нитрофенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-этиловый (№ 49). Установлены бактерицидные свойства этих соединений в отношении S. aureus

209 Р (МПК 0,8 мкг/мл). В отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035 исследованные препараты антимикробной активностью не обладали.

Среди 6 изученных представителей енаминов антимикробной активностью обладал только один препарат - этил-2-метил-4-(1-пиперидил)-6-(3-нитрофенил)-циклогекса-1,3-диенкарбоксилат с лабораторным шифром № 4. Это соединение характеризовалось эффективными бактерицидными свойствами в отношении S. aureus 209 Р при МПК 1,6 мкг/мл.

. Из 6 соединений семикарбазонов выявлена высокая антимикробная активность двух препаратов: диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-(4-метоксифенил)-циклогексан-1,3-дикарбоксилат - препарат № 9 и диэтил-4-гадрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-тиешшциююгексан-1,3-дикарбоксилат -препарат № 10. Эти соединения оказывали бактерицидное действие на S. aureus 209 Р, МПК для которого составила 1,6 мкг/мл.

Из всех 66 протестированных карбо- и гетероциклических соединений только препарат № 4 из ряда енаминов проявил выраженную фунгицидную активность в отношении Candida albicans 18, МПК составила 6,75 мкг/мл.

Таким образом, на первом этапе работы среди 66 изученных карбо- и гетероциклических соединений были выявлены 10 представителей 5 различных классов с антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, и Candida albicans 18. Для дальнейшей работы были отобраны 9 препаратов, которые имели значения МПК не более 10 мкг/мл для всех стандартных тест-штаммов микроорганизмов.

На втором этапе работы была изучена антимикробная активность 9 отобранных перспективных препаратов в отношении клинических метициллиноре-зистентных (MR) и метициллиночувствительных (MS) штаммов стафилококков и грамотрицательных палочек. В работе были использованы 50 клинических штаммов стафилококков 3 видов: S. aureus, S. epidermidis, S. hominis. Из грамотрицательных палочек использовали 18 клинических штаммов таких бактерий как Escherichia coli, Proteus vulgaris, Salmonella enteritidis, Pseudomonas

aeruginosa. Установлено, что все отобранные препараты обладали антимикробной активностью в отношении различных видов клинических штаммов стафилококка. Результаты по антимикробной активности исследуемых соединений в отношении клинических штаммов стафилококка представлены в таблице 2. Из всех протестированных соединений наиболее перспективным оказался препарат из ряда фенилпентендиона ПНВ-1, поскольку он проявил наиболее высокую антимикробную активность в отношении метициллинорезистентных и ме-тициллиночувствительных штаммов S. aureus и S. epidermidis, а также клинических штаммов S. hominis, МП К составила от 0,8 до 3,12 мкг/мл. Соединения ряда халкона (44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (45, 46, 49), ена-минов (4) и семикарбазонов (9, 10) также проявляли антимикробную активность по отношению к исследованным штаммам стафилококка, что позволило отобрать эти препараты для дальнейших исследований.

Таблица 2 - Минимальная подавляющая концентрация (мкг/мл) новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений

Шифр соединения S.aureus MS I "- S.aureus MR S.epidermidis MS S.epidermidis MR hominis Escherichia coli Proteus vulgaris Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa

фенилпентендион

ПНВ-1 | 0,80 | 3,12 | 0,80 | 1,28 | 0,80 | 12,5 | 12,5 ) - | -

оныхалк

44 6,25 10,00 1,60 5,00 1,28 - - - -

47 6,25 10,00 3,12 5,00 1,60 - - -

полифункшюналыюзамещенные эфиры

45 6,25 10,00 1,60 5,00 1,28 - - - -

46 6,25 10,00 3,12 5,00 1,60 - - - -

49 6,25 10,00 3,12_ 5,00 1,60 - - - -

диенамин

4 | 3,12 | 10,00 i 1,60 | 6,25 | 0,80 | - | - | - | -

семикарбазоны

9 25,00 100 12,50 50,00 6,25 - - - -

10 25.00 100 12,50 50,00 6Д5 - - - -

Было установлено, что из 9-ти отобранных препаратов только ПНВ-1 об-

ладал антибактериальной активностью по отношению к клиническим штаммам грамотрицательных палочек Е. coli и P. vulgaris при МПК 12,5 мкг/мл. Соеди-

нения рядов халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, енаминов и се-микарбазонов не проявили антибактериальную активность по отношению к этим клиническим штаммам.

Представляло интерес провести анализ проявления антимикробной активности по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям в зависимости от химической структуры соединений.

Были проведены квантовохимические расчеты габаритных пространственных размеров молекул, а также определение молекулярного веса изучаемых соединений. Эффективную антимикробную активность в отношении грамотри-цательных стандартных тест-пггаммов и клинических штаммов Е. соИ соединения фенилпентендиона ПНВ-1(2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) можно объяснить наличием в его составе двух атомов хлора в положении 2 и 4 в структуре карбоцикла, которые отсутствуют у аналогичного по строению соединения фенилпентендиона ПНВ-Б (1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) (рис. 1). Вероятно, это обуславливает его способность проникать через пориновые каналы грамотрицательных бактерий. Каналы поринов имеют диаметр примерно 1 нм (или 10 Ангстрем) и через них могут проникать соединения с низкой молекулярной массой (до 600 дальтон) и определенной пространственной структурой, как соединение ПНВ-1 ряда фенилпентендиона. Другие исследованные соединения разных классов имеют гетероциклическую структуру, крупные объемные пространственные молекулы и большой молекулярный вес, и поэтому не способны проникать в бактериальную клетку грамотрицательных бактерий через эти каналы.

jwy

Ph Fh Ph Pli Pli

а)ПНВ-1 б)ПНВ-Б

Рис. 1. Химическая структура соединений фенилпентендиона ОМе

ЕЮ'

а) №9

б)№ Ю

Рис. 2. Химическая структура соеджений ряда семикарбазона

Me-. ^.Ме N

енкарбонильпый фрагмент ОН

■NO,

б)полифункдионалыюзамещенный в) диенамин эфир

Рис. 3. Химическая структура соединений с енкарбонильным фрагментом В частности, гадроксильные и метоксильные группы соединений классов халконов и семикарбазонов способны взаимодействовать за счет неиоделенной электронной пары; карбонильные, сложноэфирные и нитрогруппы препаратов

рядов халконов, полифункциональнозамещенных эфиров и диенамина - за счет поляризации и повышения электронной плотности на атомах кислорода (рис. 2, 3). Поэтому все эти соединения потенциально способны к ассоциациям с внешней мембраной клетки грамположительных бактерий.

На следующем этапе оценивали острое токсическое действие различных концентраций отобранных соединений по смертности Daphnia magna Straus за 48 часов экспозиции. Через 24 часа экспозиции все особи дафний в опытных и контрольных растворах исследуемых соединений были живые, активно плавали, не отмечено никаких дополнительных морфологических изменений. Через 48 часов были определены показатели острой токсичности для всех исследуемых соединений (табл. 3). Установлено, что соединения № 9, 10 из ряда семи-карбазонов проявили высокую токсичность в отношении тест-организма во всех рабочих концентрациях от 3,2 до 1000 мкг/м, поэтому невозможно было определить средние летальные и безвредные концентрации этих веществ. Исследованные соединения из ряда полифункциональнозамещенных эфиров (№№ 45, 46,49) оказывали различное действие на тест-объект. Препараты № 45 и 49 обладали выраженным токсическим действием: ЛКюо-48 составили 1000 мкг/мл, ЛК5<М8 - 500 мкг/мл. Поскольку даже при низких концентрациях этих веществ (7,5 мкг/мл, 3,2 мкг/мл) наблюдалась гибель 20 % дафний, то безвредные концентрации данных соединений (БКкм8, БКсмв) по отношению к изучаемому тест-объекту не были установлены. Для соединения № 46 значения летальных концентраций были такими же, но значения БКю-48 составили 30,1 мкг/мл, а БК(м8 - 3,2-15,6 мкг/мл, что позволило судить о низкой токсичности данного соединения.

Соединения ряда халкона также проявили неодинаковое влияние на жизнеспособность тест-объектов. Препарат № 47 был высокотоксичным даже при низких концентрациях по отношению к дафниям, вызывая гибель более 20 %, что не позволило рассчитать значения БКю-48 иБКо-48- Препарат № 44 был отнесен к малотоксичным, поскольку оказывал острое токсическое действие при

концентрации 1000 мкг/мл и среднее летальное действие - при 500 мкг/мл; значения БКю^з составили от 15,6 до 30,1 мкг/мл, а БКгм? - 3,2-7,5 мкг/мл.

Таблица 3 - Показатели острой токсичности исследуемых соединений (мкг/мл)

Шифр соединения ЛКюо-48 JDCJO-48 БКЮ-48 БКО-48

фенилпентендион

ПНВ-1 1000 500 125-250 3,2-60,2

халконы

44 1000 500 15,6-30,1 3,2-7,5

47 1000 500 - -

полифункциональнозамещенные эфиры

45 1000 500 - -

46 1000 500 30,1 3,2-15,6

49 1000 500 - -

диенамин

4 10 00 500 125-250 3,2-60,2

семикарбазоны

9 125-1000 - - -

10 125-1000 - - -

Наименьшей токсичностью из всех изученных соединений характеризовались ПНВ-1 из ряда фенилпентендионов и препарат № 4 из енаминов, так как они имели наиболее высокие значения БК10^ -125-250 мкг/мл 3,2-60,2 мкг/мл.

Таким образом, все исследованные соединения по отношению к тест-объекту были разделены натри группы: 1) высокотоксичные соединения (№№ 45,47,49); 2) малотоксичные соединения с низкими значениями БКю-48 и БК0-48 (№ 44, № 46); 3) нетоксичные соединения с высокими значениями БК1См8 и БКо-48 (ПНВ-1 и № 4). Для дальнейшей работы были отобраны 4 соединения, относящиеся ко второй и третьей группам, для которых определили острую токсичность на белых лабораторных мышах (табл. 4). Установлено, что все отобранные соединения по величине 1Х>50 (420 и 500 мг/кг) являются малотоксичными (Гуськова, 1990). В этой связи представляло интерес в дальнейших исследованиях провести оценку действия этих соединений на активность ключевых метаболических ферментов, состояние белкового и углеводного обменов в организме белых лабораторных мышей (рис. 2).

Таблица 4 - Значения LD30 карбо- и гетероциклических соединений

Лабораторный шифр соединений Класс соединений LD5o, мг/кг

ПНВ-1 Фенилпентендион 420

44 Халкон 500

46 Полифункционально-замещенный эфир 500

4 Диенамин 500

Показано, что соединения ПНВ-1, 46 и 4 в концентрации 10 мкг/мл увеличивали на 23, 22 и 56% соответственно активность ACT по сравнению с контролем и действием в концентрации 1 мкг/мл. Все препараты, за исключением ПНВ-1, в дозе 10 мкг/мл уменьшали активность AJIT по сравнению с контролем. Известно, что значения AJIT отражают активность анаболических процессов периферической зоны метаболизма, в частности, цикла аланина (глюкозо-аланинового шунта). Коэффициент де Ритиса (соотношение ACT и AJIT) при всех дозах испытуемых препаратов был выше контрольных значений (за исключением препарата 4), что свидетельствовало об активизации центрального звена метаболизма, увеличении поступления субстратов в цикл Кребса и эффективности аэробного энергетического обмена (рис. 2 А).

Значения индекса ферментемии при введении мышам препаратов № 44 и ПНВ-1в концентрации 1 мкг/мл и № 46 и № 4 в концентрации 10 мкг/мл были существенно выше, чем в контроле (рис. 2 Б).

Ё (и 5 Р, и

(Д р

12 10 8 6 -4 -2

МПНВ-1 □ 44 И 46 Ш4

¡мкг/мл 10мкг/мл контроль

концентрации препаратов А - Значения коэффициента де Ритиса

1 мкг/мл

10 мкг/мл

контроль

концентрации препаратов Б - Индекс ферментемии

§ 10

1 мкг/мл 10 мкг/мл контроль концентрации препаратов В - Содержание общего белка

1 мкг/мл

10 мкг/мл

контроль

концентрации препаратов Г - Содержание глюкозы

Рис. 2. Значения основных биохимических показателей крови белых лабораторных мышей через 48 часов после введения исследуемых препаратов

В целом индекс ферментемии характеризует совокупную активность ключевых ферментов метаболизма и коррелирует со значениями коэффициента де Ритиса, однако имеется существенная разница по отношению к контролю.

Наибольшая концентрация общего белка отмечена при введении препаратов № 44 и ПНВ-1 в концентрации 1 мкг/мл (рис. 2 В). Введение препаратов № 46 и № 4 в дозе 10 мкг/мл мышам увеличивало концентрацию глюкозы, а введение 10 мкг/мл ПНВ-1 уменьшало по сравнению с контролем (рис. 2 Г). При этом показатели общего белка и глюкозы у животных всех опытных групп находились в пределах референтных значений, что указывало на то, что негативные изменения метаболизма либо были скомпенсированы или отсутствовали.

Следовательно введение препаратов ПНВ-1,44,46, 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не нарушало функции основных метаболических процессов и не вызывало признаков интоксикации в организме лабораторных животных.

Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотроп-ной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, 44, 46 и 4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.

Выводы

1. Установлена антимикробная активность в отношении стандартных тест-штаммов Escherichia coli 113-13, Staphylococcus aureus 209 P, Bacillus cereus 8035 и Candida albicans 18 десяти препаратов из 66 изученных новых представителей карбо- и гетероциклических соединений; отобранные перспективные поликарбонильные препараты относятся к классам: фенилпентендиона, халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов и енаминов.

2. Отобранные соединения фенилпентендиона (ПНВ-1, Г1НВ-Б), халкона (№№ 44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№ 45,46,49), диенамин (№ 4) и семикарбазоны (№№ 9, 10) оказывают выраженное антимикробное действие на метищшлиноустойчивые и метициллиночувствительные клинические штаммы стафилококков разных видов при значениях минимальных подавляющих концентраций в интервале от 0,8 до 12,5 мкг/мл. Препарат фенилпентендиона ПНВ-1 эффективен также в отношении клинических штаммов грамотри-цательных палочек Escherichia coli 18, 57, 59 и Proteus vulgaris 3, 4, 9 (МПК 12,5 мкг/мл).

3. Проявление антимикробной активности изучаемых соединений связано с комплексным взаимодействием с мембраной бактериальной клетки и зависит от значений их молекулярной массы, пространственных характеристик молекул, наличия гидроксильных, метоксильных, карбонильных и нитрогрупп, за счет поляризации и повышения электронной плотности на атомах кислорода.

4. Выявлена слабая токсичность отобранных соединений с антимикробной активностью ПНВ-1, №№ 44, 46, 4 при биотестировании на гидробионтах (Daphnia magna Straus) при значениях безвредных концентраций 3,2; 60,2; 125 и 250 мкг/мл и белых лабораторных мышах (LD50 420 и 500 мг/кг); показано отсутствие признаков интоксикации в организме экспериментальных животных.

5. Установлено, что введение препаратов ПНВ-1, 44, 46, 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не вызывает достоверных изменений показателей белкового, углеводного обменов и активности ключевых ферментов метаболизма в организме экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: (* - публикации в журналах ВАК РФ) 1. Пермякова, Н.Ф. Перспективы использования новых гетероциклических соединений, обладающих антимикробной активностью / Н.Ф. Пермякова, Ю.А. Алексеева, О.В Нечаева // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно практической конференции

студентов и молодых ученых с международным участием YSRP. -Изд-во СГМУ, 2008. - №6. - С. 58-59.

2. * Пермякова, Н.Ф. Изучение антимикробной активности некоторых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева Ю.А. Алексеева, В.В. Сорокин, B.C. Субботин // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11. - № 2. - С. 30.

3. * Пермякова, Н.Ф. Антимикробная активность некоторых новых карбо-и гетероциклических соединений / Н.Ф Пермякова, О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - № 5. - С. 93-97.

4. Пермякова, Н.Ф. Оценка противомикробного действия некоторых новых карбо- и гетероциклических соединений / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, М.С. Карнаухова, Е.И. Тихомирова // Фундаментальные исследования. - 2009. - № 8. - С. 25-31.

5. Пермякова, Н.Ф. Проявление антимикробной активности новых гетероциклических соединений в зависимости от особенностей их химического строения / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева // Современные проблемы науки и образования. -. 2009. - № 6. - С. 20-23.

6. Пермякова, Н.Ф. Нечаева О.В., Тихомирова Е.И. Перспективные гетероциклические соединения с антимикробной активностью / Н.Ф. Пермякова, О.В. Нечаева, Е.И. Тихомирова// Инновационные медицинские технологии: Материалы общероссийской научной конференции РАЕ с международным участием (г. Москва, 2009) // Успехи современного естествознания. - 2009. -№ 10. - С. 5-7.

Подписано в печать 12.11.2009. Объем 2 печ.л.

Тираж 100 экз. Заказ Na 54 Отпечатано в типографии ЗАО «КомТехСнаб» 410054, г. Саратов, ул. Политехническая, д. 122

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пермякова, Наталья Фердинандовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные проблемы и перспективы антимикробной терапии.

1.2. Использование гетероциклических соединений в качестве антимикробных препаратов.

1.3. Антимикробное действие новых гетероциклических соединений.

1.4. Химические соединения гетероциклических рядов с антиоксидантной активностью.

1.5. Использование гетероциклических соединений в качестве ауторегуляторных веществ.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Экспериментальные модели.

2.2. Химические соединения, использованные в работе.

2.3. Определение антимикробной активности соединений.

2.4. Изучение токсичности исследуемых соединений.

2.4.1. Определение токсичности на тест-объектах дафниях больших (Daphnia magna Straus).

2.4.2. Определение острой токсичности соединений на белых лабораторных мышах.

2.5. Определение основных биохимических показателей крови белых лабораторных мышей.

2.6. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Изучение антимикробной активности веществ из разных классов поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений.

3.1. Отбор перспективных химических соединений разных классов по антимикробной активности на модели стандартных тест-штаммов микроорганизмов.

3.2. Изучение антибактериальной активности отобранных соединений по отношению к клиническим штаммам микроорганизмов.

Глава 4. Анализ проявления антимикробной активности в зависимости от химической структуры соединений.

Глава 5. Определение токсичности отобранных поликарбонильных карбо-и гетероциклических соединений на разных биотест-объектах.

5.1. Определение острой токсичности отобранных поликарбонильных карбои гетероциклических соединений на биотест-объектах D. magna Straus.

5.2. Определение токсичности отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений на белых лабораторных мышах.

5.3. Оценка действия отобранных поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений на метаболическую активность в организме белых мышей по биохимическим показателям крови.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений"

Актуальность темы. Устойчивость бактерий к антимикробным препаратам остается одной из самых серьезных проблем современной медицины. Основой терапевтического действия антимикробных препаратов является подавление жизнедеятельности возбудителя за счет угнетения различных метаболических процессов в результате связывания антибиотика с мишенью бактериальной клетки [9, 64, 94]. Однако в процессе эволюции многие микроорганизмы адаптировались к присутствию в среде антимикробных препаратов, что привело к возникновению устойчивости к ним. Различают два основных типа лекарственной резистентности микроорганизмов: природную и приобретенную [30, 97, 103].

Природная устойчивость обусловлена отсутствием или недоступностью у микроорганизмов мишени действия антибиотика. Примером может служить резистентность микоплазм и псевдомонад к бензилпенициллину или бактерий к противогрибковым препаратам. При наличии у бактерий природной устойчивости антибиотики клинически неэффективны. Природная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов [34].

Актуальной проблемой прикладной микробиологии является приобретенная устойчивость, которая связана со способностью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Различают первичную и вторичную приобретенную устойчивость [32]. Первичная устойчивость возбудителей имеет место еще до начала лечения антимикробными препаратами, вторичная устойчивость развивается и возрастает в процессе антимикробной терапии. Приобретенная устойчивость обусловлена изменением генома микробной клетки в результате мутаций или внехромосомного (плазмидного) переноса генетической информации от одной микробной клетки к другой с последующей селекцией устойчивых штаммов микроорганизмов [85, 86, 95, 99, 103 ].

Инфекции, вызванные грамположительными и грамотрицательными бактериями, представляют серьезную проблему в связи с глобальным ростом устойчивости этих микроорганизмов к традиционным антибактериальным средствам. На современном этапе развития медицины и биологии проблема гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) привлекает внимание специалистов разного профиля. Среди грамположительных возбудителей ГВЗ ведущее место занимают стафилококки [83, 89, 97]. Они демонстрируют выраженную способность к формированию устойчивости к антимикробным препаратам, используемым в клинической практике.

Особое внимание с точки зрения клинической значимости и уровня анти-биотикорезистентности заслуживает метициллинорезистентный Staphylococcus aureus (MRSA). Особая значимость MRSA связана с тем, что метициллинрези-стентность является маркером полирезистентности к Р-лактамным антибиотикам и ассоциирована с устойчивостью к аминогликозидам, линкозамидам и фторхинолонам. Кроме того, MRSA имеет тенденцию к эпидемическому распространению, что делает данную проблему крайне важной. В настоящее время стафилококки, устойчивые к метициллину, рассматривают в качестве одного из ведущих нозокомиальных патогенов [94, 95, 98, 99]. Перечисленные особенности формирования устойчивости у возбудителей являются причиной существенного ограничения выбора антибактериальных препаратов для лечения инфекций, вызванных такими микроорганизмами и необходимости поиска путей и средств преодоления антибиотикорезистентности. Для борьбы с развитием лекарственной устойчивости возможны различные пути: предупреждение формирования и ограничение распространения лекарственноустойчивых штаммов, снижение уровня уже сформировавшейся резистентности, использование антимикробных препаратов, относящихся к разным классам химиотерапевтических средств [103, 109, 117].

Одним из перспективных путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов является поиск и внедрение в практику новых антибактериальных веществ, в том числе с отличным от широко применяемых антибиотиков строением и механизмом действия. В связи с вышеизложенным, поиск веществ с антибактериальной активностью среди новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений и изучение их антибактериального действия на различные микроорганизмы является актуальной задачей, определившей необходимость проведения настоящего исследования и позволившей сформулировать его цель и задачи.

Задачи исследования:

4. Изучить токсичность отобранных соединений на биотест-объектах Daph-nia magna Straus и на белых лабораторных мышах.

Научная новизна. В работе впервые дана характеристика антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов: фенилпентендионы, халконы, полифункциональнозамещенных эфиры, енамины, семикарбазоны в отношении тест-штаммов микроорганизмов Escherichia coli 113-13, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P, и Candida albicans 18 и отобраны 10 наиболее перспективных в плане дальнейшего изучения. Отмечена высокая антибактериальная активность препарата ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона по отношению ко всем используемым бактериям. Выявлены 8 перспективных антистафилококковых препаратов из ряда халкона (№ 44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№ 45, 46, 49), енаминов (№ 4), семикарбазонов (№ 9, 10). Показана фунгицидная активностью в отношении стандартного тест-штамма Candida albicans 18 соединения из ряда енаминов (№ 4).

Установлено, что соединение ПНВ-1 из ряда фенилпентендиона показало самую высокую антимикробную активность по отношению к мети-циллинорезистентным клиническим штаммам стафилококка по сравнению с другими изучаемыми соединениями. МПК данного соединения для MRSA составила 3,12 мкг/мл, для MRSE - 1,28 мкг/мл. Данное соединение также обладало высокой антимикробной активностью в отношении метициллиночувстви-тельных клинических штаммов S. aureus, S. epidermidis и S. hominis, (МПК 0,80 мкг/мл). Этот же препарат был эффективен и в отношении клинических штаммов Escherichia coli и Proteus vulgaris.

Впервые установлена зависимость антимикробной активности изучаемых соединений от значений их молекулярной массы, пространственных характерис тик молекул, распределения электронных зарядов и наличия определенных химических функциональных групп для комплексного взаимодействия с мембраной бактериальной клетки.

Определены показатели токсичности отобранных соединений на биотест-объектах D. magna и белых лабораторных мышах и отобраны 4 нетоксичных препарата, для которых впервые изучено влияние на метаболическую активность в организме лабораторных животных по биохимическим показателям крови.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили отобрать перспективные соединения с антимикробной активностью в отношении стандартных тест-штаммов Е. coli 113-13, В. cereus 8035, S. aureus 209 Р, и С. albicans 18, и клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, не обладающие токсичностью по отношению к биотест-объектам и не оказывающие существенного влияния на активность ключевых ферментов, состояния белкового, углеводного и липидного обменов в организме лабораторных животных. Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, 44, 46 и 4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Перспективные по антимикробной активности соединения классов фенилпентендиона (ПНВ-1), халкона (№ 44), енаминов (№ 4) и полифункциональнозамещенных эфиров (№ 46) являются малотоксичными для гидробионтов (Daphnia magna) и белых лабораторных мышей.

3. Отобранные поликарбонильные карбо- и гетероциклические соединения ПНВ-1, № 44, № 46, № 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не вызывают выраженных изменений активности ключевых ферментов метаболизма и показателей белкового и углеводного обменов в организме белых мышей. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях различного ранга: научной конференции молодых ученых вузов Поволжского региона «Исследования молодых ученых в биологии и экологии» (Саратов, 2006-2009), межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2008); XI Международном конгрессе по антимикробной терапии (Москва, 2009); общероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Пермякова, Наталья Фердинандовна

110 выводы

1. Установлена антимикробная активность десяти препаратов из 66 изученных новых представителей карбо- и гетероциклических соединений в отношении стандартных тест-штаммов Escherichia coli 113-13, Staphylococcus aureus 209 P, Bacillus cereus 8035 и Candida albicans 18; отобранные перспективные поликарбонильные препараты относятся к классам фенилпентендиона, халкона, по-лифункциональнозамещенных эфиров, семикарбазонов и енаминов.

2. Отобранные соединения фенилпентендиона (ПНВ-1, ПНВ-Б), халкона (№№ 44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№№ 45, 46, 49), диенамин (№ 4) и семикарбазоны (№№ 9, 10) оказывают выраженное антимикробное действие на метициллиноустойчивые и метициллиночувствительные клинические штаммы стафилококков разных видов при значениях минимальных подавляющих концентраций в интервале от 0,8 до 12,5 мкг/мл. Препарат фенилпентендиона ПНВ-1 эффективен также в отношении клинических штаммов грамотрицательных палочек Escherichia coli 18, 57, 59 и Proteus vulgaris 3, 4, 9.

4. Выявлена слабая токсичность отобранных соединений с антимикробной активностью ПНВ-1, №№ 44, 46, 4 при биотестировании на гидробионтах (Daphnia magna Straus) при значениях безвредных коцентраций 3,2; 60,2; 125 и 250 мкг/мл и белых лабораторных мышах (LD30 5 0 0 мг/кг); показано отсутствие признаков интоксикации в организме экспериментальных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Формирование устойчивости бактерий к антимикробным препаратам остается одной из самых актуальных проблем современной медицинской и ветеринарной микробиологии [95, 97, 103,105]. Природная лекарственная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов и обусловлена отсутствием или недоступностью мишени действия антибиотика; в этом случае традиционные антибиотики клинически неэффективны. Примером может служить резистентность микоплазм и псевдомонад к бензилпенициллину или бактерий к противогрибковым препаратам [32, 33]. Приобретенная устойчивость связана со способностью отдельных штаммов бактерий сохранять жизнеспособность при концентрациях антибиотиков, которые подавляют рост основной части микробной популяции. Различают первичную, имеющуюся до начала лечения антимикробными препаратами, и вторичную приобретенную устойчивость, которая развивается и возрастает в процессе антимикробной терапии и обусловлена изменением генома микробной клетки в результате мутаций или внехромосомного (плазмидного) переноса генетической информации от одной микробной клетки к другой с последующей селекцией устойчивых штаммов микроорганизмов [93, 95, 97, 99, 104]. Особое внимание с точки зрения клинической значимости и уровня антибиотикорезистентности заслуживает метицил-линорезистентные стафилококки (М118А), у которых метициллинрезистент-ность является маркером полирезистентности и ассоциирована с устойчивостью к аминогликозидам, линкозамидам и фторхинолонам. Кроме того, МИБА имеют тенденцию к эпидемическому распространению, что делает данную проблему крайне важной [90, 94, 98].

Одним из перспективных путей преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов является поиск и внедрение в практику новых антибактериальных веществ, в том числе с отличным от широко применяемых антибиотиков строением и механизмом действия [103, 116]. В связи с вышеизложенным, поиск веществ с антибактериальной активностью среди новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений разных классов и изучение их антибактериального действия на различные микроорганизмы является актуальным и имеет прикладное значение.

В работе в качестве экспериментальных моделей по изучению антимикробной активности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений были использованы стандартные тест-штаммы Escherichia coli 11313, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus 209 P, Candida albicans 18, полученные из ГИСК им. JI.A. Тарасевича, клинические штаммы грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий: S. aureus MRS A, S. aureus MS SA, S. epi-dermidis MRSE, S. epidermidis MSSE, S. hominis, Salmonella enteritidis, E. coli, Proteus vulgaris - из музея бактериальных культур Государственного научного учреждения Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Рос-сельхозакадемии.

На первом этапе работы был проведен скрининг 66 новых карбо- и гетероциклических соединений различных классов на антимикробную активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов. Было установлено, что соединения классов гидроксициклогексанонов, гидроиндазолов, ок-симов, циклогексенонов и тетрагидротриазолохиназолинов не обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам. Из пяти изученных соединений фенилпентендиона только два препарата обладали антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам микроорганизмов. Препарат ПНВ-1 (2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) характеризовался эффективным бактерицидным действием в отношении грам-положительных бактерий - S. aureus 209 Ри5. cereus 8035, МПК для каждого из этих микроорганизмов составила 6,75 мкг/мл. В отношении Е. coli 113-13 в зависимости от концентрации ПНВ-1 обладал бактериостатическим и бактерицидным действием. Концентрации ПНВ-1 от 1 мкг/мл и выше оказывали выраженное бактерицидное действие на Е. coli 113-13.

Препарат ПНВ-Б (1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) проявил низкую антимикробную активность в отношении стандартных тест-штаммов по сравнению с ПНВ-1. Выявлено бактерицидное действие только на S. aureus 209 Р, для которого МПК составила 100 мкг/мл.

Исследованные соединения ряда халкона (З-(диметиламино) бензили-ден)пентан-2,4-дион - (№ 44) и этил-2-(4-гидроксибензилиден)-3-оксобутаноат - (№ 47) характеризовались бактерицидным действием в отношении S. aureus 209 Р при МПК 1,6 мкг/мл. Однако эти вещества не обладали антимикробной активностью в отношении палочковидных бактерий Е. coli 113-13 и В. cereus 8035.

Из 5 представителей полифункциональнозамещенных эфиров было отобрано три вещества: 2,2'-ди-(3-(3-метокси-4-гидроксифенил)-2,4-диацетил -5-гидрокси-5-метилциклоген-1-ил)-диэтиловый (№ 46), 2,2'-ди-(3-фенил-2,4-ди-ацетил-5-гидрокси-5-метил-циклоген-1-ил)-диэтиловый (№ 45) и 2,2'-ди-(3-(3-нитрофенил)-2,4-диацетил-5-гидрокси-5-метилциклоген-1 -ил)-этиловый (№ 49). Установлены бактерицидные свойства этих соединений в отношении S. aureus 209 Р при МПК 0,8 мкг/мл. В отношении Е. coli 113-13 и В. cereus 8035 исследованные препараты антимикробной активностью не обладали.

Из 6 соединений семикарбазонов выявлена высокая антимикробная активность двух препаратов: диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-(4-метоксифенил)-циклогексан-1,3-дикарбоксилат - препарат № 9 и диэтил-4-гидрокси-4-метил-6-семикарбазоно-2-тиенилциклогексан-1,3-дикарбоксилат — препарат № 10. Эти соединения оказывали бактерицидное действие на S. aureus 209 Р, МПК для которого составила 1,60 мкг/мл.

Из всех 66 протестированных карбо- и гетероциклических соединений только препарат № 4 из ряда енаминов проявил выраженную фунгицидную активность в отношении С. albicans 18, МПК составила 6,75 мкг/мл.

Таким образом, на первом этапе работы среди 66 изученных карбо- и гетероциклических соединений были выявлены 10 представителей 5 различных классов с бактерицидной антимикробной активностью по отношению к стандартным тест-штаммам грамположительных и грамотрицательных бактерий, и С. albicans 18. Для дальнейшей работы были отобраны 9 препаратов, которые имели значения МПК не более 10 мкг/мл для всех стандартных тест-штаммов микроорганизмов.

На втором этапе работы была изучена антимикробная активность 9 отобранных перспективных поликарбонильных препаратов в отношении клинических метициллинорезистентных (MR) и метициллиночувствительных (MS) штаммов стафилококков и грамотрицательных палочек. В работе были использованы 50 клинических штаммов стафилококков 3 видов: S. aureus, S. epider-midis, S. hominis. Из грамотрицательных палочек использовали 18 клинических штаммов таких бактерий как Е. coli, Р. vulgaris, S. enteritidis, P. aeruginosa. Установлено, что все отобранные препараты обладали выраженной бактерицидной антимикробной активностью в отношении различных видов клинических штаммов стафилококка. Из всех протестированных соединений наиболее перспективным оказался препарат из ряда фенилпентендиона ПНВ-1, поскольку он проявил наиболее высокую антимикробную активность в отношении метициллинорезистентных и метициллиночувствительных штаммов S. aureus и S. epidermidis, а также клинических штаммов S. hominis. Соединения ряда халкона (№№ 44, 47), полифункциональнозамещенных эфиров (№№ 45, 46, 49), енаминов (№ 4) и семикарбазонов (№ 9, 10) также имели достаточно выраженную антимикробную активность по отношению к исследованным штаммам стафилококка, что позволило отобрать эти препараты для дальнейших исследований.

Было установлено, что из 9-ти отобранных препаратов только ПНВ-1 обладал антибактериальной активностью по отношению к клиническим штаммам Е. coli и Р. vulgaris при МПК 12,5 мкг/мл. Соединения рядов халкона, полифункциональнозамещенных эфиров, енаминов и семикарбазонов не проявили антибактериальную активность по отношению к клиническим штаммам гра-мотрицательных палочек.

Были проведены квантовохимические расчеты габаритных пространственных размеров молекул, а также определение молекулярного веса изучаемых соединений. Эффективную антимикробную активность в отношении* грамотри-цательных стандартных тест-штаммов и клинических штаммов Е. coli соединения фенилпентендиона ПНВ-1 (2,4-дихлор-1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион) можно объяснить наличием в его составе двух атомов хлора в положении 2 и 4 в структуре карбоцикла, которые отсутствуют у аналогичного по строению- соединения фенилпентендиона ПНВ-Б (1,3,5-трифенил-2-пентен-1,5-дион). Вероятно, это обуславливает его способность проникать через пориновые каналы грамотрицательных бактерий. Каналы поринов имеют диаметр примерно 1 нм (или 10 Ангстрем) и через них могут проникать соединения с низкой молекулярной массой (до 600 дальтон) и определенной пространственной структурой, как соединение ПНВ-1 ряда фенилпентендиона. Другие исследованные соединения разных классов имеют гетероциклическую структуру, крупные объемные пространственные молекулы и большой молекулярный вес, и поэтому не способны проникать в бактериальную клетку грамотрицательных бактерий через эти каналы.

Для грамположительных бактерий важнейшим условием взаимодействия соединений с клеткой является их способность к межмолекулярной ассоциации с белками внешней мембраны. Все исследуемые нами соединения с антимикробной активностью имеют необходимые функциональные группы для такого взаимодействия. В частности, гидроксильные и метоксильные группы соединений классов халконов и семикарбазонов способны взаимодействовать за счет неподеленной электронной пары; карбонильные, сложноэфирные и нитрогруп-пы препаратов рядов халконов, полифункциональнозамещенных эфиров и дие-намина - за счет поляризации и повышения электронной плотности на атомах кислорода. Поэтому все эти соединения потенциально способны к ассоциациям с внешней мембраной клетки грамположительных бактерий.

На следующем этапе оценивали острое токсическое действие различных концентраций отобранных соединений по смертности Daphnia magna Straus за 48 часов экспозиции. Через 24 часа экспозиции все особи дафний в опытных и контрольных растворах исследуемых соединений были живые, активно плавали, не отмечено никаких дополнительных морфологических изменений. Через 48 часов были определены показатели острой токсичности для всех исследуемых соединений. Установлено, что соединения № 9, 10 из ряда семикарбазонов проявили высокую токсичность в отношении тест-организма во всех рабочих концентрациях от 3,2 до 1000 мкг/м, поэтому невозможно было определить средние летальные и безвредные концентрации этих веществ. Исследованные соединения из ряда полифункциональнозамещенных эфиров (№№ 45, 46, 49) оказывали различное действие на тест-объект. Препараты № 45 и 49 обладали выраженным токсическим действием: ЛКюо-48 составили 1000 мкг/мл, JIK5o-48 -500 мкг/мл. Поскольку даже при низких концентрациях этих веществ (7,5 мкг/мл; 3,2 мкг/мл) наблюдалась гибель 20 % дафний, то безвредные концентрации данных соединений (БКю-48, БК0-48) по отношению к изучаемому тест-объекту не были установлены. Для соединения № 46 значения летальных концентраций были такими же, но значения БКю-48 составили 30,1 мкг/мл, а БК0-48 -3,2-15,6 мкг/мл, что позволило судить о низкой токсичности данного соединения. Соединения ряда халкона также проявили неодинаковое влияние на жизнеспособность тест-объектов. Препарат № 47 был высокотоксичным даже при низких концентрациях по отношению к дафниям, вызывая гибель более 20 %, что не позволило рассчитать значения БКю-48 иБК048- Препарат № 44 был отнесен к малотоксичным, поскольку оказывал острое токсическое действие при концентрации 1000 мкг/мл и среднее летальное действие - при 500 мкг/мл; значения БКю-48 составили от 15,6 до 30,1 мкг/мл, а БКо-48 — 3,2-7,5 мкг/мл.

Таким образом, все исследованные соединения по отношению к тест-объекту были разделены на три группы: 1) высокотоксичные соединения (№№ 45, 47, 49), 2) малотоксичные соединения с низкими значениями БКю-48 и БК0-48 (№ 44, № 46); 3) нетоксичные соединения с высокими значениями БКю-48 и БКо-48 (ПНВ-1 и № 4). Для дальнейшей работы были отобраны 4 соединения, относящиеся ко второй и третьей группам, для которых определили острую токсичность на белых лабораторных мышах.

Установлено, что все отобранные соединения по величине LD50 (420 и 500 мг/кг) являются малотоксичными (Гуськова, 1990). В этой связи представляло интерес в дальнейших исследованиях провести оценку действия этих соединений на активность ключевых метаболических ферментов, состояние белкового и углеводного обменов в организме белых лабораторных мышей.

Показано,, что соединения ПНВ-1, 46 и 4 в концентрации 10 мкг/мл увеличивали на 23, 22 и 56% соответственно активность ACT по сравнению с контролем и действием в концентрации 1 мкг/мл. Все препараты, за исключением ПНВ-1, в дозе 10 мкг/мл уменьшали активность AJTT по сравнению с контролем. Известно, что значения AJTT отражают активность анаболических процессов периферической зоны метаболизма, в частности, цикла аланина (глюкозо-аланинового шунта). Коэффициент де Ритиса (соотношение ACT и AJ1T) при всех дозах испытуемых препаратов был выше контрольных значений (за исключением препарата 4), что свидетельствовало об активизации центрального звена метаболизма, увеличении поступления субстратов в цикл Кребса и эффективности аэробного энергетического обмена.

При введении мышам всех исследуемых препаратов, кроме ПНВ-1 в дозе 1 мкг/мл, активность ЛДГ в сыворотке крови мышей была выше, чем в контроле, а активность КК - ниже по сравнению с контрольными показателями. При этом не выявлена сколько-нибудь значительная корреляция между значениями КК и ЩФ. Значения индекса ферментемии при введении мышам препаратов № 44 и ПНВ-1 в концентрации 1 мкг/мл и № 46 и № 4 в концентрации 10 мкг/мл были существенно выше, чем в контроле. В целом индекс ферментемии характеризует совокупную активность ключевых ферментов метаболизма и коррелирует со значениями коэффициента де Ритиса, однако имеется существенная разница по отношению к контролю.

Введение препаратов № 46 и № 4 в дозе 10 мкг/мл мышам увеличивало концентрацию глюкозы, а введение 10 мкг/мл ПНВ-1 уменьшало по сравнению с контролем. Наибольшая концентрация общего белка отмечена при введении препаратов № 44 и ПНВ-1 в концентрации 1 мкг/мл. При этом показатели общего белка и глюкозы у животных всех опытных групп находились в пределах референтных значений, что указывало на то, что негативные изменения метаболизма либо были скомпенсированы или отсутствовали.

Следовательно введение препаратов ПНВ-1, №№ 44, 46, 4 в концентрациях 1 и 10 мкг/мл не нарушало функции основных метаболических процессов и не вызывало признаков интоксикации в организме лабораторных животных.

Таким образом, в нашем исследовании впервые была установлена антимикробная активность 10 новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений 5 классов: фенилпентендионы, халконы, полифункцинально-замещенные эфиры, енамины и семикарбазоны. Данные препараты могут быть рекомендованы для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии инфекционных заболеваний. Соединения с лабораторным шифром ПНВ-1, №№ 44, 46 и 4 являются перспективными антистафилококковыми препаратами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пермякова, Наталья Фердинандовна, Саратов

1. Алимова, E.K. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний / Е.К. Алимова, А.Т. Аствацатурьян, Л.В. Жаров // М.: Медицина. 1975. - 279 с.

2. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин., A.A. Воробьев // Л.: Изд-во мед. лит. 1986. - 184 с.

3. Ашмарин, И.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях /И.А. Ашмарин, A.A. Воробьев // Л.: Изд-во мед. лит. 1962. - 180 с.

4. Бабенышева, A.B. Синтез и антимикробная активность замещенных бензок-сазинов и хиноксалинов / A.B. Бабенышева, H.A. Лисовская // Химико-фармацевтический журнал 2006. - №10. - С.34-36.

5. Бакалова, P.A. Эффективность действия а-токоферола и его гомологов на люминолзависимую хемилюминесценцию / P.A. Бакалова, Ц. Н. Соколова, С.А. Рибаров, В. Каган // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1991. - № 5.-С. 482-485.

6. Бакуев, М.М. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюминес-центного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы / М.М. Бакуев, М.З. Саидов, A.A. Бутаков // Иммунология. 1991. -№ 1.-С. 15-17.

7. Батраков, С.Г. Фенольные липиды из Azotobacter chroococcum / С.Г. Батраков, H.H. Придашина, Е.Б. Кругляк // Хим. прир. соед. 1977. - № 4. - С. 494-499.

8. Батраков, С.Г. Тирозол ауторегуляторный фактор di дрожжей Saccharomy-ces cerevisiae / С.Г. Батраков, Г.И. Эль-Регистан, H.H. Придачина // Микробиология. - 1993. - Т. 62, № 4. - С. 633-638.

9. Белобородова, Н.В. Алгоритмы антибиотикотерапии / Н.В. Белобородова, М.Б. Богданов, Т.В. Черненькая // Москва. 2000. - 191 с.

10. Биленко, М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов / М.В. Биленко // М.: Медицина. 1989. - 368 с.

11. Блинов, В.А. Основы клинической биохимии человека и животных / В.А. Блинов, И.И. Калюжный // Саратов: Приволж. кн. изд-во. 1996. - 248 с.

12. Борисов, Д. Антилизоцимная активность менингококков и ее применение в диагностике менингококковой инфекции: Автореф. дис.канд. мед. наук / Д. Борисов. Челябинск, 1988. - 20 с.

13. Брюханов, А.Л. Каталаза и супероксиддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов / А.Л. Брюханов, Р.К. Тауэр, А.И. Нетрусов // Микробиология. 2002. - Т. 71, № 3. - С. 330-335.

14. Бурлакова, Е.Б. Модуляция перекисного окислениялипидов биогенными аминами в модельных системах / Е.Б. Бурлакова, А.Е. Губарева, Г.В. Архи-пова// Вопр. мед. химии. 1992. - № 2. - С. 17-20.

15. Бут, А. и др. Современная микробиология: Прокариоты: в 2-х томах: Т.1. Пер. с англ. / Под ред. А. Ленглера , Г. Древса, Г. Шлегеля. М.: Мир, 2005. -496 с.

16. Бухарин, О.В. Механизмы выживания бактерий / О.В. Бухарин, А.Л. Гинц-бург, Г.И. Эль-Регистан // М.: Медицина. 2005. - 367 с.

17. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий / О.В. Бухарин // М.: Медицина, Екатеринбург: УроРАН, 1999. 366 с.

18. Бухарин, О.В. Бактерионосительство (медико-экологический аспект) / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвятцов // Екатеринбург: УроРАН, 1984. 203 с.

19. Бухарин, О.В. Биология патогенных кокков / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвятцов, О.Л. Карташов // М.: Медицина; Екатеринбург: УроРАН, 2002. 283 с.

20. Бухарин, О.В. Резидентное стафилококковое бактерионосительство в популяции человека как показатель микроэкологического мониторинга среды его обитания / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвятцов, О.Л. Чернова // Журн. микро-биол. 1996. - № 3. - С. 71-74.

21. Вишняков, В. В. Синтез, структура и реакционная способность И-цианопроизводных ароматических азотсодержащих гетероциклических соединений / В. В. Вишняков // М.: Наука, 2001. 253 с.

22. Галкин, Д.В. Карбепенемы через 20 лет после открытия: современные микробиологические и клинические аспекты / Д.В. Галкин // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2007. - Т.9, № 2. - С. 1-21.

23. Георгиева, Н. Изоникотиноилгидразоновые аналоги изониазида: взаимосвязь между антиоксидантной активностью и бактериостатической активностью / Н. Георгиева, В. Гаджаева // Биохимия. 2002. - Т. 67, Вып. 5. - С. 705-710.

24. Гиссенс, И.К. Оценка качества антимикробной химиотерапии / И.К. Гиссенс // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. -Т.З, № 2. - С. 1-5.

25. Горбатенкова, Е.А. Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует су-пероксиддисмутазу /» Е.А. Горбатенкова, Ю.А. Владимиров, Н.В. Парамонов //Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1989. -№ 3. - С. 302-305.

26. Гуськова, Т.А. Доклиническая оценка безопасности лекарственных средств на стадии доклинического изучения / Т.А. Гуськова // Химико-фармацевтический журнал. 1990. - № 7. - С. 10-15.

27. Гуськова, Т.А. Оценка безопасности лекарственных средств различных фармакологических групп / Т.А. Гуськова // Новые препараты в фармакологии. Москва. - 2003. - № 9. - С. 20-30.

28. Давиденкова, Е.Ф. Атеросклероз и процесс перекисного окисления липидов / Е.Ф. Давиденкова, Н.Г. Шафран // Вест. АМН СССР. 1989. - № 3. - С. 10-18.

29. Давыдова, М.Н. Антиоксидантные ферменты сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio desulfuricans: супероксиддисмутаза и пероксидазы / М.Н. Давыдова, Р.З. Сабирова // Биохимия. 2002. - Т. 67, Вып. 7. - С. 990-994.

30. Дикема, Д.Дж. Использование антибактериальных препаратов и антибиоти-корезистентность у Streptococcus, pneumoniae / Д.Дж. Дикема, А.Б. Бругге-манн, Г.В. Доэрн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т.З, № 2. - С. 10-16.

31. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров // М.: Изд-во МГУ, 2004. 528 с.

32. Егоров, A.M. Антимикробные агенты в будущем. Вклад геномики в их создание / A.M. Егоров, Ю.О. Сазыкин //Антибиотики и химиотерапия. 1999. -Т. 4, №12.-С. 5-14.

33. Егоров, A.M. Развитие антимикробной химиотерапии и новые парадигмы / A.M. Егоров, Ю.О. Сазыкин, И.С. Иванов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. -2001. -Т.З, № 2. С. 17-25.

34. Ертанов, И.Д. Дальнейшее расширение перечня унифицированных методов: Инструкция Минздрава СССР/ И. Д. Ертанов // Лабораторное дело. 1987. -№ 10.-С. 784-786.

35. Ефименко, H.A. Инфекции в хирургии. Фармакотерапия и профилактика / H.A. Ефименко, И.А. Гучев, C.B. Сидоренко // Смоленск, 2004. 296 с.

36. Жандарев, В.В. Синтез и противомикробная активность тетрагидрохино-лин-8-олов / В.В. Жандарев, М.Е. Гошин // Химико-фармацевтический журнал. 2006. - №3. - С.27-29.

37. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях /.М.Н. Запрометов // М.: Наука. 1993. -272 с.

38. Зарифуллина, Л.А. Антилизоцимная активность менингококков: Автореф. дис. канд. мед. наук / Л.А. Зарифуллина // Челябинск. 1986. - 18 с.

39. Зубков, М.Н. Роль карбепенемов в условиях эскалации антибиотикотера-пии грамотрицательных бактерий / М.Н. Зубков // Русский медицинский журнал. 2008. - № 2. - С. 106-119.

40. Зыкова, Л.С. Клиническое значение антиинтерфероновой активности энте-робактерий при пиелонефрите у детей / Л.С. Зыкова, Л.Н. Свистуненко, O.E. Челпаченко // Самара, 1990. С. 93-100.

41. Ильина, Т.С. Структурная организация и механизмы перемещения генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий / Т.С. Ильина // Молекуляр. генетика. 2001. - № 1. - С. 312.

42. Ильина, Т.С. Суперинтегроны бактерий источники новых генов с адаптивными функциями / Т.С. Ильина // Генетика. - 2006. - Т.42, № 11. - С. 1536-1546.

43. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Г.И. Ко-зинца, В.А. Макарова // М.:Триада-Х. 1997. - 480 с.

44. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 2/ B.C. Камышников // Мн.: Беларусь. - 2000. - 463 с.

45. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 1/ B.C. Камышников // Мн.: Беларусь. 2000. - 495 с.

46. Козлов P.C. Клиническое значение резистентности грамположительных бактерий // Инфекции в хирургии. 2009. - Т.7. - Приложение № 1. - С. 310.

47. Козлов, P.C. Эртапенем представитель новой группы карбепенемов / P.C. Козлов, A.A. Никулин // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2009. - Т. 11, № 1.-С. 1-16.

48. Кравченко, Д. В. Синтез и биологическая активность сульфанилзамещен-ных азотсодержащих гетероциклических соединений / Д. В. Кравченко // М.: Наука, 2003.- 186 с.

49. Красновский, A.A. Синглетный молекулярный кислород: механизмы образования и пути дезактивации в фотосинтетических системах / A.A. Красновский //Биофизика. 1994. - Т. 39, Вып. 2. - С. 236-250.

50. Кудрявцев, А. А. Клиническая гематология животных/ А. А. Кудрявцев, Л.

51. A. Кудрявцева // М.: Колос. 1974. - 322 с.

52. Куликов, О. А. Супероксиддисмутазы чумного микроба / O.A. Куликов,

53. B.И. Дробков, И.В. Дармов // Вестник РАМН. 1995. - № 5. - С.45-49.

54. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В. В. Меншико-ва// М.: Медицина. 1987. - 365 с.

55. Лакин, Г. Ф. Биометрия: уч. пособие для биол. спец. ВУЗов 4-е изд., пе-рераб. и доп./ Г. Ф. Лакин// М.: Высш. Школа. - 1990. - 352 с.

56. Ларкий Э.Г. Методы определения и метаболизм металлобелковых комплексов // В сб.: Итоги науки и техники. Сер. Биологическая химия. 1990. -Т. 41.-С. 41-53.

57. Лойт, А.О. Токсикологическая оценка новых химических веществ. Часть 1 / А.О. Лойт, М.Ф. Савченков // Изд-во Ирк. ун-та, 1992. С. 74-83.

58. Малинин, М.В. Оценка устойчивости цыплят к колибактериозу по микробиологическим и биохимическим показателям: Автореф. дис.канд. мед. наук / М.В. Малинин. Саратов. - 2009. - 22 с.

59. Маркова, Л. И. Синтез и биологическая активность О, - N, - S содержащих гетероциклических соединений / Л. И. Маркова // М.: Высшая школа. -1996.-382 с.

60. Мельников В. С. Химия и биологическая активность 1,2,4 триазола / В. С. Мельников //М.: Высшая школа. - 1994. - 143 с.

61. Меныцикова, Е.Б. Биохимия окислительного стресса / Е.Б. Меныцикова, Н.К. Зенков, С.М. Шергин // Оксиданты и антиоксиданты. Новосибирск, 1994.-203 с.

62. Методические рекомендации по изученгю общетоксического действия фармакологических средств. Материалы фармкомитета РФ (Протокол № 13 от 25 декабря 1997 года) / Составители Е В. Арзамасцев, Т.А. Гуськова, С.С. Либерман.

63. Методическое руководство по биотестированию воды / Утверждено Мин-природой России от 27 апреля 2001 г.

64. Навашин, С.М. Отечественному пенициллину 50 лет: история и прогнозы / С.М. Навашин // Антибиотики и химиотерапия. 1994. -Т. 39, № 1. - с. 310.

65. Навашин, С.М. Рациональная антибиотикотерапия / С.М. Навашин, И.П. Фомина // М.: Наука. 1982. - 460 с.

66. Олескин, A.B. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов / A.B. Олескин, И.В. Ботвинко, Е.А. Цевкалова // Микробиология. 2000. - Т.69, № 3. - С. 309-327.

67. Олескин, A.B. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях / A.B. Олескин // Микробиология. 1993. - Т.62, № 3. - С. 389-403.

68. Олескин, A.B. Экологически важные свойства популяций микроорганизмов / A.B. Олескин // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т.7, № 8. -С. 7-12.

69. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890-04 // Клинич. микро-биол. и антимикроб, химиотер. 2004. - № 6. - С. 306-359.

70. Осадчая, А.И. Влияние некоторых факторов на криорезистентность и сохранение жизнеспособности при лиофилизации культур Bacillus subtilis / А.И. Осадчая, В.А. Кудрявцев, JI.A. Сафронова // Биотехнология. 2002. -№3.-С. 45-54.

71. Осипов, Г.А. Химическая природа ауторегуляторного фактора di Pseudomonas carboxydoflava / Г.А. Осипов // Микробиология. 1985. - Т.54. - С. 186-190.

72. Панюшкин, Ю.А. Использование некоторых продуктов растительного происхождения как клеточных антиоксидантов / Ю.А. Панюшкин, Н.В. Па-нюшкина // Тез. I Всесоюзной конф. «БиоАО». Черноголовка. - 1983. - Т. 1.-С. 12.

73. Первушина, JI.А. Антилизоцимный признак микроорганизмов в бактериологической диагностике и лечении воспалительных заболеваний внутренних женских половых органов: Автореф. дис. канд. мед. наук / Л.А. Первушина. -Челябинск. 1990. - 21 с.

74. Первушина, Л.А. Лечение эндометрита и сальпингоофорита под контролем антилизоцимной активности возбудителя / Л.А. Первушина, О.В. Бухарин, Б.Я. Усвятцов // Акушерство и гинекология. 1991. - № 6. - С. 48-50.

75. Петровская, В.Г. Роль антилизоцимного признака для выживания бактерий в макрофагах периферической крови человека / В.Г. Петровская // Эпидемиология и микробиология раневых инфекций. М., 1986. — С. 34-35.

76. Пименова, Е.В. Противомикробная активность пиразолов и пиридазинов / Е.В. Пименова, Э.В. Воронина // Химико-фармацевтический журнал 2006. - № 11.-С.31-31.

77. Победимский, Д.Г. Влияние антиоксидантов на получение микробной биомассы / Д.Г. Победимский, А.Ю. Винаров, O.A. Решетник // Биотехнология-1988.-Т. 8, № 1.-Р, 55-69.

78. Поберезкина, Н.Б. Биологическая роль супероксиддисмутазы / Н.Б. Побе-резкина, Л.Ф. Лосинская // Укр. биохим. журн. 1989. - Т.61, № 2. - С. 1427.

79. Потапович, А.Ю. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств и цитопротективной активности флавоноидов / А.Ю. Потапович, В.А. Костюк // Биохимия. 2003. - Т. 68, Вып. 5. - С. 632-638.

80. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусовой, С.Н Козловой. Москва, 2002. - 381 с.

81. Предтеченский, В. Е. Руководство по лабораторным методам исследования/ В. Е. Предтеченский, В. М. Боровская, JI. Т. Марголина // М.: Медгиз. -1950.-804 с.

82. Проценко, Д.Н. Цефоперазон/сульбактам (сульперазон) в схемах ротации антибактериальных препаратов в ОРИТ / Д.Н. Проценко // Инфекции и антимикробная терапия. 2005. - Т.7, № 4. - С. 15-23.

83. Рогинский, В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и эффективность / В.А. Рогинский // М.: Наука. 1988. - С. 247.

84. Розенфельд, Г.С. Лактамные антибиотики / Г.С. Розенфельд // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1986. - Т. 31, № 4. - С. 302.

85. Романова, Ю.М. Мобильные генетические элементы и их роль в эволюции патогенных бактерий / Ю.М. Романова, Т.С. Ильина, А.Л. Гинцбург // Вестн. РАМН.-2001.-№ 11.-С. 15-20.

86. Руднов, В.А. Антибиотикотерапия госпитальных инфекций, вызванных Р. aeruginosa / В.А. Руднов // Русский медицинский журнал. — 2005. Т. 13, № 7.-С. 3-6.

87. Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов / М.: РЭ-ФИА, НИА-Природа, 2002.

88. Сазыкин, Ю.О. Механизмы резистентности к макролидам у их продуцентов и эубактерий: Обзор / Ю.О. Сазыкин, А.К. Швец, В.П. Иванов // Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т.43, № 6. - С. 32-40.

89. Сазыкин, Ю.О. П.Эрлих и начало современной антимикробной химиотерапии / Ю.О. Сазыкин // Антибиотики и химиотерапия. 1999. -Т. 44, № 12. -с. 12-19.

90. Светличный, В.А. Характеристики ауторегуляторного фактора сЬ, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoßava и Bacillus cereus / В.А. Светличный, Г.И. Эль-Регистан, А.К. Романова// Микробиология. 1983. -Т.52, № 1.-С. 33-38.

91. Селезнева, Е.С. Изучение способности Staphylococcus aureus адаптироваться к производным 1,2,4-триазола / Е.С. Селезнева, З.П. Белоусова // Химико-фармацевтический журнал 2001. - №11. - С. 18-20.

92. Сидоренко С.В. Метициллинрезистентные стафилококки /С.В. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. 1995. - Т. 11, № 12. - С. 57-69.

93. Сидоренко, С.В. Механизмы антибиотикорезистентности. В кн.: Страчунский JI.C., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. / Антибактериальная терапия. Практическое руководство. Москва: Фармединфо, 2000. - С. 1-6.

94. Сидоренко, С.В. Механизмы резистентности микроорганизмов. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под редакцией Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. Москва: Фармединфо, 2002. -с. 1-6.

95. Сидоренко, С.В. Перспективы контроля распространения антибиотикорезистентности / С.В. Сидоренко // Антибиотики и химиотерапия. 1998. -Т.43, № 7.-С. 3-6.

96. Сидоренко, С.В. Резистентность микроорганизмов и антибактериальная терапия / С.В. Сидоренко //Русский медицинский журнал. 1998. - Т. 6, № 11. -С. 717-725.

97. Сидоренко, С.В. Бета-лактамные антибиотики / С.В. Сидоренко, С.В. Яковлев //Русский медицинский журнал. 1997. -Т.5, № 21. С. 20-30.

98. Синопальников, А.И. Цефалоспорины: спектр активности, направления клинического применения / А.И. Синопальников, О.В. Фесенко // Российские медицинские вести. 1997. - Т. 2, № 3. - С. 10-18.

99. Смирнова, Н.С. Синтез и биологическая активность 7-аза-8-(оксо-бицикло-4.3.0.-нонадиенов-6.9) / Н.С. Смирнова, О.П. Плотников, Н.А. Виноградова // Химико-фармацевтич. журн. 1995. - № 1. - С. 44-46.

100. Смирнов, С.Г. Этология бактерий новое направление в исследовании прокариотов / С.Г. Смирнов // Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования. Иваново. -ИвГУ. - 1985. -С. 5-10.

101. Страчунский, JT.C. Современная антимикробная химиотерапия / JT.C. Стра-чунский, С.Н. Козлов // Москва. 2001. - 381 с.

102. Сурикова, Е.В. Факторы персистенции клебсиелл: Автореф. дис.канд. мед. наук / Е.В. Сурикова. Челябинск. - 1992. - 22 с.

103. Титов, В.Ю. Взаимодействие нитрита с каталазой как важный элемент его токсичности / В.Ю. Титов, Ю.М. Петренко // Биохимия. 2003. -Т. 68, Вып. 6. - С. 769-776.

104. Федорова, А.И. Практикум по экологии и охране окружающей среды / А.И. Федорова, А.Н. Никольская // М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС. 2001. -288 с.

105. Федотов, П.В. Антиоксидантные свойства некоторых овощных соков / П.В. Федотов, Ю.А. Синявский, Б.Б. Айдарханов // Тез. I Всесоюзной конф. «БиоАО». Черноголовка. - 1983. - Т. 1. - С. 14.

106. Фомина, И.П. Современные аминогликозиды: значение в инфекционной патологии, особенности действия / И.П. Фомина // Русский медицинский журнал. 1997.-Т.5, №21.-С. 5-8.

107. Фомина, И.П. Современные макролиды особенности действия, значение в лечении бактериальных инфекций / И.П. Фомина // Антибиотики и химиотерапия. - 1995. - Т. 40. - № 9. - С. 47-56.

108. Хохлов, A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы / A.C. Хохлов // М.: Наука. 1988. - С. 270.

109. Шеенков, Н.В. Роль антилизоцимной активности бактерий в развитии инфекционного процесса и пути ее регулирования: дисс. канд. мед. наук / Н.В. Шеенков // Оренбург. 1993 .-215 с.

110. Эйделыитейн, М.В. Выявление b-лактамаз расширенного спектра у грамот-рицательных бактерий с помощью фенотипических методов / М.В.Эйделыдтейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т.З, № 2. - С. 5-10

111. Эль-Регистан, Г.И. Регуляция роста и развития микроорганизмов специфическими аутогенными факторами / Г.И. Эль-Регистан, В.И. Дуда, A.C. Ка-прельянц // Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов: Материалы симпоз. Пущино. 1989. С. 280-290.

112. Эль-Регистан, Г.И. Выявление и характеристика специфических ауторегу-ляторных факторов, синтезируемых про- и эукариотными микроорганизмами / Г.И. Эль-Регистан, Ю.М. Хохлова, М.В. Дужа // Изв. АН СССР. Сер. Биология. - 1979. - № 6. - С. 869-877.

113. Энциклопедия клинических лабораторных тестов/ Под ред. Н.У. Тица. -М.: Лабинформ. 1997. - 510 с.

114. Яковлев, В.П. Новые полусинтетические макролиды. Кларитромицин -значение в современной терапии бактериальных инфекций / В.П. Яковлев // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т. 44, № 10. - С. 22-27.

115. Яковлев, C.B. Азитромицин: основные свойства, оптимизация режимов применения на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров / C.B. Яковлев, С.А. Ухтин // Антибиотики и химиотерапия. -2003. Т.48, № 2. - С. 22-27.

116. Яковлев, В.П. Рациональная антимикробная терапия / В.П. Яковлев, С.В. Яковлев // Москва. 2003. - 104 с.

117. Aaronson, S. Chemical Communicaition at the Microbial Level / S. Aaronson // Florida CRC Press, Inc. Boca Raton. 1981. - V. 1. - P. 189.

118. A General Regression Procedure for Method Transformation/ W. Bablock et al.// J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. - V. 26. - P. 783-790.

119. Bessey, O.A. A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeters of serum/ O.A. Bessey, O.H. Lowry, M.J. Brock// J. Biol. Chem.- 1946,-V. 164.-P. 321-329.

120. Brenot, A. Contribution of glutathione peroxidase to the virulence of Streptococcus pyogenes / A. Brenot, K.Y. King, В.Janowiak // J. Infect. Immun. 2004. -V. 72, N 1. - P. 408-413.

121. Cessi, D. Prophylaxis of Escherichia coli infection in fowls with emulsified vaccines/ D. Cessi// Clin. Vet. 1979. - V. 102. - P. 270-278.

122. Creatine kinase and B-subunit activity in serum in cases of suspected myocardial infarction/ W. Gerhardt et al. // Clin. Chem. 1982. - V. 28. - P. 277-283.

123. Demple, B. Amabile-Cuevas C.F. Redox redux: The control of oxidative stress responses / B. Demple // Cell. 1991. - V. 67, N 2. - P. 837-839.

124. Dewar, M.J.S. MNDO Parameters for Third Period Elements / M.J.S. Dewar, M.L. McKee, H.S. Rzepa // J. Amer. Chem. Soc. 1978. - V. 100, N 11. - P. 3607.

125. Dewar, M.J.S. Ground States of Molecules. 39. Results for Molecules Containing Hydrogen, Carbon, Nitrogen and Oxygen / M.J.S. Dewar, W. Thiels // J. Amer. Chem. Soc. 1977. - V. 99, N 15. - P.4907-4917.

126. Dewar, M.J.S. Ground States of Molecules. 38. The MNDO Method. Approximation and Parameters / M.J.S. Dewar, W. Thiels // J. Amer. Chem. Soc. 1977. -V. 99, N15.-P. 4899-4907.

127. Fridovich, I. Superoxide dismutases / I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264, N 11.-P. 7761-7764.

128. Glick, M.R. Graphical Comparisons of Interferences in Clinical Chemistry Instrumentation/ M.R. Glick, K.W. Ryder, S.A. Jackson// Clin. Chem. 1986. - V. 32.-P. 470-474.

129. Gray, K.M. Intercellular communicaition and group behavior in bacteria / K.M. Gray//Trend Microbiol. 1997.-V.5.N. 5.-P. 184-188.

130. Gregory, E.M. Superoxide dismutase in anaerobes: survey / E.M. Gregory, W.E.C. Moore, L.V. Holdeman // Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V. 35, N 5. -P. 988-991.

131. Kaplan, M.M. Alkaline phosphatase/ M.M. Kaplan// New England Journal of Medicine. 1972. - V. 286. - P. 200-203.

132. Kobayashi, T. Ultrastructural localization of superoxide dismutase in human skin / T. Kobayashi, N. Saito, N. Takemori // Acta Derm. Venerol. 1993. - V. 73, N 1.-P. 41-45.

133. Kozubek, A. Resopcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphi-philes and their biological activity / A. Kozubek, J.H.P. Tyman // Chem. Rev. -1999. V.99, N. 1.-P. 1-31.

134. Laboratory diagnostics of acute myocardial infarction/ Ed. by W. Stein// Darmstadt. 1988. -73 p.

135. Lang, H. Creatine Kinase enzymes/H. Lang//Springer Verlag. 1981.-317 p.

136. Law/ J.H. Pheromones / J.H. Law, F.E. Regnier // Annu. Rev. Biochem. 1971. — V.40.-P. 533-548.

137. Livermore, D. M. B-lactamases in laboratory and clinical resistance / D.M. Liv-ermore // Clin Microbiol Rev. 1995.-N. 8.-P. 557-584.

138. McCord, J.M. Superoxide dismutase. An enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein) / J.M. McCord, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 1969. - V. 244, N 9.-P. 6049-6055.

139. Mills, G.C. Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxidative breakdown / G.C. Mills // J. Biol. Chem. 1957.-V. 229, N l.-P. 189-197

140. Moss, D.W. Digestiv enzymes of pancreatic origin. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry/ D.W. Moss, A.R. Henderson // Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1999. - P. 721

141. Munkres, K.D. Selection and analysis of superoxide dismutase mutants of neuro-spora / K.D. Munkres // Free Radical Biol. Med. 1992. - V. 13, N 2. - P. 305318.

142. Nijssen, S. Unnoticed spread of integron carrying Enterobacteriacae in intensive care units / S. Nijssen, A. Florijn // Clinical Infection Diseases. - 2005. - V. 41,№9.-P. 10-11.

143. Oleskin, A.V. Social behavious of microbial population / A.V. Oleskin // J. Basic Microbiol. 1994. - V.34, N. 6. - P. 425-439.

144. Passing, H. A New Biometrical Procedure for Testing the Equality of Measurements from two Different Analytical Methods/ H. Passing, W. Bablock // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1983. - V. 21.-P. 709-720.

145. Percy, M.E. Catalase: an old enzyme with a new role? A review / M.E. Percy // Can. J. Biochem. Cell. Biol. 1984. - V. 63, N 5. - P. 1006-1014.

146. Pesce, M.A. The CK isoenzymes: Findings and their meaning/ M.A. Pesce // Lab. Management. 1982. - V. 20. - P. 25-37.

147. Privalle, C.T. Superoxide dismutase and O2 lethality in Bacteroides fragilis / C.T. Privalle, E.M. Gregory//J. Bacteriol. 1979. - V. 138, N l.-P. 139-145.

148. Puppo, A. Superoxide dismutase: an essential role in the protection of nitrogen fixation process / A. Puppo, J. Riguad // FEBS Lett. 1986. - V. 201. - P. 187189.

149. Reusch, R.N. 5-n-Alkylresorcinols from encysting Azotobacter vinelendii: isolation and characterisaition / R.N. Reusch, H.L. Sadoff // J. Bacteriol. 1979. -V.139.-P. 448-453.

150. Reusch, R.N. Novel lipid components of the Azotobacter vinelendii cest membrane / R.N. Reusch, H.L. Sadoff// Nature. 1983. - V.302. - P. 268-270.

151. Salin, M.L. Iron containing superoxide dismutases in eucaryotes: Localization in chloroplasts from water lily, Nuphor luteum / M.L. Salin, D.S. Lyon // Oxy Radicals and Their Scavenger Systems. Vol. 1. - N.Y.: Elsevier. - 1983. - P. 344347.

152. Schaefer, E.J. Overview of the diagnosis and treatment of lipid dis-orders. In: Handbook of lipoprotein testing / E.J. Schaefer, J. McNamara // Washington: AACC press. 1997. - P. 448.

153. Scott, M.D. Erythrocyte defense against hydrogen peroxide: Preeminent importance of catalase / M.D. Scott, B.H. Lubin, F.A. Kuypers // J. Lab. Clin. Med. -1991.-V. 118,N 1.-P. 7-16.

154. Shapiro, J.A. The significances of bacterial colony pattens / J.A. Shapiro // BioEssay. 1995. - V. 17, N. 7.- P. 597-607

155. Su, C.- J. Isolation and characterization of several unique lipid from Azotobacter vinelandii cyst / C.- J. Su, R.N. Reusch, H.L. Sadoff// J. Bacteriol. . — 1981. — V.147. P.80-90.

156. Suzuki, Y. Structural and dynamic membrane properties of a-tocopherol and a-tocopherol implication to the molecular mechanism of their antioxidant potency / Y.Suzuki, M. Tauchiya, S.R. Wassail // Biochemistry. - 1993. - V. 32, N 11. -P. 10692-10699.

157. Talke, H. Enzymatische Harnstoffbestimmung im Blut und Serum im optischen Test nach Warburg / H. Talke, G.E. Schubert // Klin. Wschr. 1965. - V. 43. - P. 174-175.

158. Thomas, L. Alanine aminotrasferase (ALT), Aspartate aminotrasferase (AST). In: Clinical laboratory Diagnostics / L. Thomas // Frankfurt: TH-Books Verlagsgesellschaft. 1998. - P. 565.

159. Tietz, N.W. Clinical Guide to Laboratory Tests / N.W. Tietz // Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1995. - P. 629.

160. Tietz, N.W. Fundamentals of clinical chemistry / N.W. Tietz // Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1987. - P. 761.

161. Tsuge, N. Adipostatins A and B, new inhibitors of glycerol-3-phospate dehydrogenase / N. Tsuge, M. Mizokami, S. Imai // J. Antibiot. 1992. - V.45. -P.886-891.

162. Urea: its distribution, in and. elimination from the animal body/ E.K. Marshall et al.// J. Biol. Chem. 1914. - V. 18. - P. 53-80.

163. Vanasbeck, B.S. Involvement of oxygen radicals and blood cells in the pathogenesis of ARDS by endotoxin and hyperoxia / B.S. Vanasbeck // Appl. Cardio-pulm. Pathophysiol. 1991.-V. 4, N l.-P. 127-138.

164. Whittaker, R.H. Allelochemics: chemical interactions between species / R.H. Whittaker, P.P. Fenny// Sciens. 1971. - V. 171. - P. 757-770.

165. Wroblewski, F. Lactate dehydrogenase activity in blood / F. Wroblewski, J.S. La Due // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1955. - V. 90. - P. 210.

166. Wu, A. Cardiac markers / A. Wu // New Jersey. 1998. - 225 p.

Информация о работе

Пермякова, Наталья Фердинандовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Оценка антимикробной активности и токсичности новых поликарбонильных карбо- и гетероциклических соединений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы