Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Грибы в круговороте азота в почвах

ВАК РФ 03.00.27, Почвоведение

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кураков, Александр Васильевич

Введение

1- Объекты и методы исследования

1.1. Объекты исследования

1.2. Методы исследования

1.2.1. Выделение, идентификация микроскопических грибов и си- 21 нэкологическая характеристика микобиоты в наземных экосистемах

1.2.2. Проверка штаммов грибов на чистоту от бактериальной кон- 22 таминации

1.2.3. Выделение ассоциаций грибов и азотфиксирующих бакте- 23 рий

1.2.4. Определение нитрифицирующей активности грибов на жид- 23 ких средах

1.2.5. Определение активности образования закиси азота и окиси 24 азота грибами на питательных средах

1.2.6. Изучение способности грибов к восстановлению закиси азо- 26 та

1.2.7. Изучение влияния ацетилена, аммония и кислорода на обра- 26 зование закиси азота грибами

1.2.8. Изучение роста и образования закиси азота Fusarium 26 oxysporum lldnl в анаэробных условиях

1.2.9. Изучение нитратредуктазной активности грибов в аэробных 27 и аэробных условиях

1.2.9.1. Культивирование грибов и получение гомогенатов 27 мицелия

1.2.9.2. Определение нитратредуктазной активности гри- 28 бов

1.2.9.3. Определение локализации нитратредуктазы 29 F. oxysporum lldnl

1.2.9.4. Определение молекулярной массы нитратредукта- 29 зы F. oxysporum 1 ldnl при аэробном и анаэробном росте

1.2.9.5. Ингибиторный анализ синтеза и регуляции актив- 30 ности нитратредуктазы F. oxysporum lldnl при аэробном и анаэробном росте 1.2.10 Определение биомассы грибов и бактерий в почвах

1.2.10.1. Субстрат индуцированное дыхание v

1.2.10.2. Метод люминесцентной микроскопии

1.2.10.3. Метод мембранных фильтров

1.2.10.4. Метод фумигации-экстракции

1.2.11. Расчет продуктивности и числа генераций микроорганизмов 34 в почвах

1.2.12. Определение содержания азота в мицелии грибов, растущих 34 в почве

1.2.13. Определение активности процессов трансформации азота в 35 почвах

1.2.14. Определение нитрифицирующей активности грибов в сте- 37 рильной почве

1.2.15. Определение активности образования закиси азота грибами 37 в стерильных почвах

1.2.16. Определение вклада микроскопических грибов в трансфор- 38 мацию азота в почвах с использованием ингибиторного подхода

1.2.16.1. Определение активности гетеротрофной нитри- 39 фикации в почвах

1.2.16.2. Влияние ингибиторов нитрификации на радиаль- 40 ную скорость роста микроскопических грибов

1.2.16.3. Определение влияния ингибиторов нитрифика- 40 ции на накопление биомассы, нитрифицирующую активность и фитотоксические свойства грибов

1.2.17. Определение численности автотрофных нитрифицирующих 41 бактерий в почвах

1.2.18. Оценка роли грибного гидролиза растительных субстратов 42 на активность азотфиксации в почвах

1.2.19. Изучение продукции ферментов грибами

1.2.20. Статистическая обработка экспериментальных данных

2. Почвенные микроскопические грибы как компонент наземных экосистем

2.1. Роль грибов в почвах и биосфере

2.2. Подходы к изучению структурно-функциональной организации 47 биоты сапротрофных микроскопических грибов наземных экосистем

2.2.1. Трофические особенности почвенных сапротрофных микро- 48 скопических грибов

2.2.2. Методология изучения распространения сапротрофных мик- 49 роскопических грибов в наземных экосистемах

2.2.3. Методы определению биомассы, видового богатства и функ- 50 ций микроскопических грибов в почвах,

2.2.4. Методы количественного анализа видового разнообразия и структуры биоты почвенных микромицетов

2.3. Жизненные стратегии грибов

2.4. Организация биоты сапротрофных микромицетов в почвах 66 3. Ассимиляция азота и его влияние на развитие и метаболическую активность грибов на средах и в почве

3.1. Ассимиляции азота грибами

3.1.1. Ассимиляции . .!> аммонийного азота грибами

3.1.2. Ассимиляция нитратов и нитритов грибами

3.1.3. Ассимиляция органических соединений азота грибами

3.2. Влияние уровня азота в окружающей среде на его содержание в 84 грибах

3.3. Определение содержания азота в мицелии микроскопических 85 грибов, развивающихся в почве

3.4. Влияние соединений азота на прорастание, рост и развитие грибов 87 на средах и in situ

3.4.1 Влияние соединений азота на прорастание спор и жизнеспо- 87 собность грибов

3.4.2 Влияние соединений азота на рост и развитие грибов на пита- 89 тельных средах и почве

3.5. Влияние соединений азота на метаболическую активность и кон- 90 курентные взаимоотношения грибов

3.5.1. Влияние азотсодержащих соединений на гидролитическую 91 активность грибов

3.5.2. Влияние соединений азота на конкурентные взаимоотноше- 93 ния грибов в почвах

3.6. Влияние азотных удобрений на состав микоризных грибов в на- 95 земных экосистемах и микотрофность растений

3.7. Влияние азотных удобрений на почвенную микобиоту и проявле- 97 ния микробного токсикоза почв

3.7.1. Влияние азотных удобрений на сапротрофную микобиоту 97 почв

3.7.2. Влияние азотных удобрений на почвенные фитопатогенные 102 грибы

3.7.3. Азотные удобрения и проявления микробного токсикоза почв 103 3.7.4. Устойчивость микробного комплекса почв к минеральным удобрениям

4. Аммонификация и иммобилизация азота грибами в почвах

4.1. Распределение азота в различных компонентах наземных экоси- 108 стем и его соединения в почвах

4.2. Минерализация и иммобилизация азота микроорганизмами и 110 продуктивность экосистем

4.3. Масштабы иммобилизации азота грибами и бактериями в дерно- 115 во-подзолистых почвах, окультуренных и под ельником-кисличником

4.4. Аммонификация легкодоступных азотсодержащих соединений 119 грибами и бактериями в дерново-подзолистых почвах

4.5. Сопряженность активности минерализации азотсодержащих со- 121 единений и газообразных потерь азота в дерново-подзолистых почвах

5. Участие грибов в нитрификации в почвах

5.1. Экологические последствия активизации нитрификации в почвах

5.2. Нитрифицирующие микроорганизмы: разнообразие, активность, 129 ферменты нитрификации

5.2.1. Автотрофные нитрифицирующие бактерии

5.2.2. Гетеротрофные нитрифицирующие микроорганизмы

5.3. Нитрифицирующая активность микроскопических грибов на 134 питательных средах и стерильной почве

5.3.1. Распространение способности к нитрификации среди почвен- 134 ных микроскопических грибов

5.3.2. Нитрифицирующая активность микроскопических грибов на 139 питательных средах

5.3.3. Образование нитратов грибами в стерильной почве

5.4. Эколого-физиологические аспекты образования грибами гидро- 144 ксамовых кислот при гетеротрофной нитрификации

5.5. Автотрофная и гетеротрофная нитрификация в почвах природ- 148 ных экосистем и агроэкосистем

5.5.1. Разработка ингибитороного подхода для дифференциальной 149 оценки вклада автотрофных и гетеротрофнных микроорганизмов в нитрификацию в почвах

5.5.1.1. Действие ингибиторов нитрификации на рост, нако- 149 пление биомассы и образование нитритов и нитратов грибами на питательных средах

5.5.1.2. Влияние возрастающих концентраций ингибиторов 151 нитрификации на образование нитратов в почвах

5.5.2. Численность автотрофных нитрифицирующих бактерий в 154 почвах

5.5.3. Нитрификация в почвах естественных биоценозов и агроцено- 155 зов при внесении сульфата аммония и пептона

5.5.4. Интенсивность гетеротрофной и автотрофной нитрификации 157 в почвах: ингибиторный подход

5.5.5. Взаимосвязь активности нитрификации и плотности популя- 159 ций автотрофных нитрифицирующих бактерий в почвах

5.6. Нитрификация в почвах: активность автотрофных и гетеротроф- 160 ных нитрификаторов и факторы ее определяющие

6. Восстановление нитратов и образование окислов азота (N2O и 166 NO) • -- ' микроскопическими грибами

6.1. Источники поступления и баланс закиси азота в атмосфере

6.2. Участие бактерий в образовании и потреблении окислов азота

6.2.1. Денитрифицирующие бактерии и эмиссия газообразных со- 168 единений азота из почв

6.2.2. Автотрофная нитрификация и образование N2O в почвах

6.2.3. Другие микробиологические источники закиси азота

6.2.4. Микробиологические пути стока N2O в почвах

6.3. Установление у грибов способности образовывать окислы азота

6.3.1. Условия и источники азота для образования окислов азота 176 грибами

6.3.2. NO-синтазная активность грибов

6.4. Анаэробное восстановление оксидов азота грибами: диссимиляторная нитритредуктаза и NO-редуктаза

6.4.1. Принципиальные отличия ассимиляторного и 179 диссимиляторного восстановления соединений азота

6.4.2. Диссимиляторная нитритредуктаза и NO-редуктаза грибов

6.5. Образование окислов азота (N2O и NO) и диссимиляторная нитратредуктаза у микроскопических грибов

6.5.1. Распространенность среди микроскопических грибов способ- 183 ности к образованию N2O

6.5.2. Анаэробный рост F. oxysporum lldnl и образование N2O и 184 N0 в зависимости от концентрации и формы неорганического азота в среде

6.5.3. Активность образования N2O микромицетами на питательных 187 средах

6.5.4. Образование окиси азота (N0) микроскопическими грибами в 188 анаэробных условиях

6.5.5. Сопряженность образования закиси азота с активностью нит- 188 ратредуктазы у грибов в условиях аноксии на средах снитра-тами

6.5.6. Свойства нитратредуктазы Fusarium oxysporum. Функциони- 190 рующей в аэробных и анаэробных условиях

6.6. Оценка влияния ацетилена на накопление N2O грибами и способности грибов к редукции N2O

6.7. Активность выделения N2O микроскопическими грибами в поч- 194 вах

6.8. Участие почвенных микроскопических грибов в анаэробном вое- 197 становлении нитратов и нитритов и формировании потока закиси азота в атмосферу

7. Грибы и азотфиксация в почвах

7.1. Взаимоотношения грибов и бактерий 203 в природных местообитаниях

7.2. Ассоциации и взаимоотношения диазотрофных бактерий и сапро- 206 трофных грибов

7.3. Ассоциации и взаимодействия бактерий и микоризных грибов

7.4. Роль гидролиза растительных полимеров грибами в протекании 214 азотфиксации в почвах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Грибы в круговороте азота в почвах"

Актуальность проблемы. Среди многообразных форм жизни в поддержании стабильного функционирования биосферы первостепенное значение принадлежит микроорганизмам. Они осуществляют круговорот большинства элементов периодической системы и трансформацию всех известных природных соединений. Благодаря их деятельности почвенный покров играет роль биогеохимической мембраны, обеспечивающий устойчивый обмен веществом и энергией между литосферой, атмосферой, гидросферой и всеми обитающими на Земле организмами (Добровольский, 1996).

Микроорганизмы играют ведущую роль в круговороте азота-- главного элемента, лимитирующего продуктивность большинства наземных экосистем. Вместе с тем, применение в возрастающих количествах азотных удобрений ведет к серьезным негативным последствиям - резкому увеличению эмиссии парниковых газов (N2O, СО2) в атмосферу, деградации гумуса, токсикозу почв, миграции нитратов в грунтовые воды и водоемы и повышенному содержанию в растениях.

Понять природу этих явлений, прогнозировать изменения в биосфере при нарушениях природных экосистем и успешно разрабатывать новые технологии выращивания растений невозможно без дальнейшего прогресса в микробиологии цикла азота и, в частности, выяснения экологической роли основных представителей почвенной биоты в трансформации азотсодержащих соединений. Определение участия бактерий и грибов в превращениях азота представляется базисным, так как они доминируют в почвах по биомассе и обладают наиболее высокой удельной биогеохимической активностью среди живых организмов. В настоящее время рассмотрение круговорота азота в биосфере и почве сводится к анализу функционирования различных групп бактерий (азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов). Деятельность же грибов, которые также способны использовать и трансформировать многие азотсодержащие соединения не учитывается. Такая ситуация сложилась в связи с недостаточностью усилий, прилагаемых для раскрытия их метаболических возможностей, недооценкой запасов грибной биомассы в почвах, разнообразия почв по физико-химическим условиям и взаимосвязи циклов азота и углерода, в котором роль грибов, как основных редуцентов органических веществ, признана. Грибы - гетеротрофные организмы, обладающие в большинстве своем мощными и разнообразными гидролазами, занимают в наземных экосистемах ведущее положение деструкторов растительных полимеров и, поддерживая потоки углерода и энергии, уже тем самым должны влиять на активность процессов азотного цикла в почвах.

Наши знания об участии грибов в трансформации азотных соединений в почвах крайне ограничены. Известно, что грибы ассимилируют аммонийный и аминный азот и подавляющее большинство видов - нитраты и нитриты, однако оценка их роли в иммобилизации азота и аммонификации в почвах отсутствует. Существуют виды грибов, окисляющие аммонийный и органический азот до нитритов и нитратов, но чтобы определить их вклад в нитрификацию в почвах необходимо знать, насколько это явление распространено среди микромицетов, какова их активность не только на средах, но и в почве, и какова интенсивность гетеротрофной нитрификации в почвах разных экосистем. Перед началом работы имелись единичные сообщения о возможности грибов образовывать закись азота (N2O). Поэтому предстояло исследовать ряд аспектов этого метаболизма у грибов и выявить наиболее активные виды для оценки экологической значимости данного процесса. Для выяснения экологии микробных процессов азотного цикла необходимо было также составить представление о том, насколько типичны и обильны виды микроорганизмов, их осуществляющие, в почвах конкретных экосистем.

Целью работы было установление особенностей структуры комплексов микроскопических мицелиальных грибов в почвах и их роли в круговороте азота.

Основные направления исследований. 1) Сравнительное изучение структуры комплексов микроскопических грибов в почвах, на растениях и горных породах.

2) Определение участия грибов в сопоставлении с бактериями в иммобилизации азота, аммонификации легкодоступных азотсодержащих соединений и влияния грибов на азотфиксацию в почвах.

3) Оценка распространенности среди микроскопических грибов способности к нитрификации и их роли в окислительном звене цикла азота в почвах. Изучение действия ингибиторов нитрификации на рост и нитрифицирующую активность микромицетов. Определение интенсивности автотрофной и гетеротрофной нитрификации в почвах зональных типов под естественной растительностью и в агроэкосистемах.

4) Определение видового разнообразия микромицетов, продуцирующих N2O, и активности образования ими N2O на питательных средах и в почвах. Изучение особенностей нитратредуктазной системы, функционирующей у грибов в анаэробных условиях.

Научная новизна. 1. На основе количественных синэкологических критериев и моделей рангового распределения относительного обилия видов выявлены особенности структуры комплексов микроскопических грибов в различных компонентах наземных экосистем. Доминирование ограниченного числа видов снижается, а видовое разнообразие микромицетов растет в ряду от выветренных горных пород к примитивным и сформировавшимся почвам, при переходе от надземных частей растений и опада к подстилке и верхним минеральным горизонтам, от поверхности корней к почве.

2. Впервые дана количественная оценка относительного участия грибов и бактерий в трансформации азота в почвах природных экосистем и агроэкосистем и сформулировано положение о взаимодополняющей роли этих групп микроорганизмов в круговороте азота.

3. Грибам принадлежит ведущая роль в иммобилизации азота в почвах по сравнению с бактериями, особенно, в естественных экосистемах, а синтез ими устойчивых к деградации азотсодержащих веществ (меланопротеидов, комплексов хитина с меланинами) представляет важнейший механизм поддержания и накопления устойчивых органических форм азота в почвах. В дерново-подзолистой почве под ельником-кисличником грибами удерживается до 90% азота от его запаса в микробной биомассе, что составляет 5-14% от общего азота почвы, а в окультуренных почвах около 3-4% общего азота закреплено в грибной биомассе, что составляет 50-70%) от всего азота иммобилизованного микроорганизмами.

4. Многие виды почвенных микроскопических грибов способны окислять аммонийный и аминный азот до нитритов и нитратов, а наиболее активные нитрифицирующие микромицеты продуцируют экологически значимые количества нитратов в почве. Впервые показано, что интенсивность гетеротрофной нитрификации, в проведении которой доминируют грибы, выше в почвах природных экосистем по сравнению с соответствующими зональными почвами агроэкосистем. Вклад гетеротрофных микроорганизмов в образование нитратов снижается (с 95 до 5%), а автотрофных нитрифицирующих бактерий растет в следующем ряду почв: ненарушенная дерново-подзолистая почва под климаксным еловым лесом, серая лесная почва под мелколиственным лесом, темно-каштановая почва под разнотравной целинной степью, почвы разных типов под широколиственными, смешанными лесами и степными залежами и почвы агроэкосистем; .,

5. Установлено, что резкое повышение нитратредуктазной активности у грибов, образующих N2O на среде с нитратами при пониженном парциальном давлении кислорода, связано с функционированием диссимиляторной нитратредуктазы. Впервые получены доказательства синтеза диссимиляторной нитратредуктазы de novo грибами при смене аэробных условий на анаэробные. Определено, что она в отличие от ассимиляторной нитратредуктазы имеет у Fusarium oxysporum более высокий молекулярный вес, температурный оптимум, не ингибируется аммонием и локализована в цитоплазме.

6. Выявлены виды грибов, ответственные за образование N2O в почвах. Многие из них представлены факультативно-анаэробными микромицетами, видовой список которых значительно расширен. Впервые с использование^ацетилена, ингибитора ^О-редуктазы, показано, что N2O конечный газообразный продукт восстановления нитратов и нитритов у грибов в анаэробных условиях. Впервые определена активность этого процесса на питательных средах и в почвах. Установлено, что эмиссия N2O, обусловленная деятельностью грибов, не превышает нескольких процентов от газообразных потерь азота при денитрификации в почвах.

7. Непосредственно в условиях почвы показано, что активность азотфиксирующих бактерий и эффективность несимбиотической азотфиксации зависит от внеклеточного гидролиза грибами растительных полимеров. Частота обнаружения и нитрогеназная активность ассоциаций бактерий и грибов значительно выше в известкованных дерново-подзолистых почвах агроэкосистем, чем в кислых почвах.

8. Сделано обобщение о происходящем перераспределении биогеохимических нагрузок между грибами и бактериями, а именно, о снижении значения грибов и возрастании роли бактерий в биологических процессах в почве, и соответственно, в биосфере, вызванное уничтожением естественного растительного покрова Земли, техногенными воздействиями на природные экосистемы и вовлечением почв в сельскохозяйственное производство. Грибы удерживают в клетке подавляющую часть азота в ходе его трансформации, бактерии способны к резкому ускорению всех процессов цикла азота и образованию соединений, легко удаляемых из почв, и поэтому такое изменение в микробном комплексе ведет к возрастанию потерь азота из почв в смежные среды (атмосферу, гидросферу и литосферу).

Практическая значимость работы. Определен вклад грибов в эмиссию закиси азота из почв, что важно для расчетов баланса этого парникового газа в атмосфере. Показано, что грибы среди микроорганизмов преимущественно ответственны за закрепление азота в почвах и их роль в иммобилизации азота снижается в почвах агроэкосистем. Возрастание участия бактерий в круговороте азота в окультуренных почвах, обусловливает меньшую степень удержания азота в системе «почва-растение». Показано, что причиной микробного токсикоза почв в агроэкосистемах может быть не только накопление фитотоксичных форм грибов, но и стимуляция синтеза токсинов у грибов под действием агрохимикатов (ингибиторов нитрификации). Установлена важная роль внеклеточного гидролиза грибами растительных остатков в поддержании несимбиотической азотфиксации в почвах. Эти положения необходимо учитывать при разработке альтернативных приемов земледелия.

Разработан и модифицирован ряд методов количественной оценки участия грибов и бактерий в процессах трансформации азота в почвах.

Полученные в работе данные по видовой структуре комплексов микромицетов в почвах и других компонентах наземных экосистем позволяют проводить целенаправленный поиск штаммов конкретных систематических групп грибов для биотехнологических целей. Разработано несколько стратегий скрининга грибов-продуцентов экзоферментов и оригинальных методик выделения микромицетов из природных объектов (введения индукторов в среды и почвенные суспензии, др.). При поиске штаммов для борьбы с корневыми патогенами предложено в качестве дополнительного критерия, наряду с использованием типичных для ризопланы видов, определять их локализацию в ризоплане, а сам вид и его штамм отбирают среди первых колонизаторов тех участков поверхности корня, которые являются «воротами» инфекции.

Реализация результатов. Создана коллекция микроскопических грибов (более 1000 штаммов 50 видов), которая включает микромицеты из различных эколого-трофических групп, продуцентов протеазы, каталазы, глюкозооксидазы (патент РФ 2001 г, №2170762), термостабильных и алкалостабильных целлюлаз. Отобран штамм Aspergillus sydowi (патент РФ 1993 г., №2002800) для использования в качестве тест-культуры при испытаниях пластика и смазок на устойчивость к биоповреждениям. Культуры из коллекции используются в учебном процессе и научной работе на кафедрах биологии почв и микробиологии МГУ.

Результаты исследований используются в лекциях по почвенной биотехнологии, микологии, экологии и геохимической деятельности микроорганизмов, читаемых на кафедре биологии почв МГУ, включены в учебные и учебно-методические пособия и рекомендованы для применения в криминалистике.

Основные защищаемые положения. 1. Особенностями комплексов микроскопических грибов верхних минеральных горизонтов почв является их более высокое разнообразие и выравненность видов по обилию в сравнении с другими компонентами наземных экосистем (выветриваемыми горными породами, опадом, разлагающимися растительными остатками, поверхностью живых растений).

2. Функциональные возможности бактерий и грибов в трансформации азота во многом носят дублирующий характер, что является одним из факторов, обеспечивающих стабильность круговорота азота в наземных экосистемах.

3. Грибам, по сравнению с бактериями, принадлежат ведущие позиции в иммобилизации и долговременном закреплении азота в почвах, меньше их роль в аммонификации легкодоступных азотсодержащих соединений и заметно ниже в нитрификации, кроме кислых подзолистых почв под климаксными хвойными лесами. Грибы не фиксируют молекулярный азот, но, осуществляя внеклеточный гидролиз растительных полимеров, обеспечивают легко--доступны ми соединениями углерода азотфиксаторов в почве. Бактерии доминируют в денитрификации и, в большинстве почв, в окислительном звене цикла азота, в аммонификации их вклад не ниже чем у грибов, за исключением кислых лесных почв, и существенно меньше их роль в иммобилизации азота, особенно, в почвах природных экосистем.

4. Роль грибов в цикле азота весомей в почвах природных экосистем, что обусловливает его более высокий уровень удержания и депонирования в почвах. Снижение участия грибов в трансформации азота в почвах агроэкосистем и возрастание роли бактерий ведет к интенсификации круговорота азота, особенно, процессов окисления и восстановления азотных соединений, что повышает потери азота из почв.

Работа выполнялась на кафедре биологии почв факультета почвоведения и Международном биотехнологическом центре МГУ. Автор выражает глубокую благодарность своим учителям, заведующему кафедрой, проф. Д.Г. Звягинцеву, с.н.с. Т.Г. Мирчинк, проф. М.М. Умарову, проф. B.C. Гузеву, доц. И.П. Бабьевой за поддержку и ценные советы, своих коллег Б.А. Вызову, О.Е. Марфениной, Н.В. Костиной, И.Ю. Чернову, А.Л. Степанову, В.В. Демину, Т.Г. Добровольской, Г.М. Зеновой, J1.B. Лысак, JI.M. Полянской, И.Н. Скворцовой, П.А. Кожевину, А.Е. Ивановой, М. Оразовой, весь коллектив кафедры и биоцентра, за благожелательное отношение, помощь и консультации. Большой вклад в работу на разных этапах исследований внесли работавшие совместно со мной студенты и аспиранты - А.И. Попов, И.В. Евдокимов, Д.М. Соколов, Е.М. Култышева, О.А. Пахненко, Н.Г. Сомова, Е.В. Скрынникова, Р.Б. Лаврентьев, Ю.А. Козлова, Ю.А. Завгородняя, А.Н. Носиков, С.В. Зайцев, М.А. Давыдова, Л.А. Лежнева, И.В. Дорошенко, A.M. Пашинский, М.В. Бирюков, И.С. Прохоров. Изучение нитратредуктазы у грибов в лаборатории металлсодержащих белков Института биохимии РАН проф. Н.П. Львова, нитрификации в почвах прерий и широколиственных лесов был осуществлен в Висконсинском университете (г. Мэдисон, США) в лабораториях проф. Л.Банди и Р. Харриса, выделение грибов в анаэробных условиях в Институте микробиологии РАН в лаборатории д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловской, за что автор выражает им искреннюю благодарность, а также акад. В.Г.Минееву, проф. А.П.Синицыну, директору ЦЛГЗ А.С.Желтухину, с.н.с. А.В Болобовой, М.Б.Куплетской, доц.В.С.Егорову, с.н.с.Гомоновой и многим другим руководителям и сотрудникам научных учреждений, с полевых опытов которых были отобраны образцы почв и с которыми проводились совместные исследования. Ряд разделов работы выполнен при поддержке РФФИ и в рамках международных проектов.

Заключение Диссертация по теме "Почвоведение", Кураков, Александр Васильевич

230 Выводы

1. Особенностями организации комплексов сапротрофных микроскопических грибов почв в отличии от других ярусов наземных экосистем, которые определяют стабильность и сложность в регулировании их структуры и функционирования, является высокое видовое разнообразие, отсутствие выраженных доминантов, широкая адаптированность видов к олиготрофным условиям, наличие видов, с различными жизненными стратегиями и способные к развитию в экстремальных условиях, большой пул грибного мицелия и спор. Видовое разнообразие микромицетов растет в ряду от выветренных горных пород (известняка, гранита) к примитивным и сформировавшимся почвам, при переходе от надземных частей растений и опада, к подстилке и верхним минеральным горизонтам, от поверхности корней к почве. Максимальным разнообразием характеризуются комплексы почв лесных и лесостепных экосистем.

2. Микробная иммобилизация азота существенно выше в дерново-подзолистых почвах лесных экосистем в сравнении с окультуренными почвами этого типа. Подавляющее количество азота иммобилизованого в микробной биомассе сосредоточено в грибах: в почве под ельником-кисличником до 90%, что составляет 5-14% от общего азота почвы и в окультуренных почвах - 50-70%, около 3-4% от общего азота почвы. Ежегодное поступление азота грибных меланинов в почвы варьирует в пределах 0,0050,01% от общего содержания азота в почвах агроэкосистем и - достигает 0,2% от его содержания в почве под ельником-кисличником. Запасы азота в микробной биомассе почв агроэкосистем сопоставимы с количеством азота ежегодно ассимилируемого растениями. Пул азота микробной биомассы в почве под зрелым ельником-кисличником близок к количеству азота, закрепленному в древесном ярусе, и практически на порядок превосходит его ежегодное потребление растениями.

3. Грибы доминируют в процессе аммонификации легкодоступных азотсодержащих соединений в дерново-подзолистой почве из-под ельника-кисличника. Вклад грибов и бактерий в этот процесс был равным в окультуренных дерново-подзолистых почвах. Более высокая активность минерализации в почвах агроэкосистем при внесении в них соединений азота, чем в почве из-под леса, обусловлена повышением при окультуривании почв удельной аммонифицирующей активности грибов и бактерий и увеличением биомассы бактерий, что компенсирует существенное снижение в этих почвах биомассы грибов.

4. Способность к нитрификации, в том числе до нитритов и нитратов довольно широко распространена среди почвенных микроскопических грибов и наряду с Aspergillus flavus, A. niger, A. wentii, установлена у Penicillium nigricans, P. janthinellum, P. chrysogenum, P. martensii, P. lanoso-coeruleum, P. melenii, P. canescens, Alternaria alternata, Gliocladium roseum, Fusarium solani. Отмечено возрастание нитрифицирующей активности у грибов при их развитии непосредственно в почве и добавке в нее легкодоступных органических соединений азота.

5. Ингибиторы нитрификации действуют на рост и продукцию нитритов и нитратов у грибов при концентрациях, превышающих их активность по отношению к автотрофным нитрифицирующим бактериям на 2-4 порядка. Обнаружена взаимосвязь между продукцией грибами в ходе нитрификации соединений из группы гидроксамовых кислот и проявлением ими фитотоксических свойств. Синтез грибами токсических соединений из группы гидроксамовых кислот меняется под действием ингибиторов нитрификации и может быть одной из причин микробного токсикоза почв.

6. Интенсивность гетеротрофной нитрификации, в проведении которой доминируют грибы, значительно выше в почвах природных экосистем в сравнении с соответствующими зональными почвами агроценозов. Плотность популяций и активность автотрофных нитрифицирующих бактерий возрастает в окультуренных почвах, и они практически полностью ответственны за образование в них нитратов (от 84 до 99%). Вклад гетеротрофных микроорганизмов в нитрификацию был максимален в дерново-подзолистой почве под ельником-кисличником (до 95%), в серой лесной почве под березняком и темно-каштановой почве под разнотравной целинной степью достигал 33-46%, в почвах под широколиственными лесами и многолетними залежами - 25%, ниже был в почвах молодых лесов, залежей и окультуренных почвах различных зональных типов - 1-16%, причем существенно (2-5 раз) уменьшался при внесении аммонийных и белковых соединений азота.

7. Определение продукции закиси азота (N2O) у микроскопических грибов в различных условиях показало, что выделение небольших количеств N2O возможно в условиях гипоксии и при наличии нитритов и, заметно реже, нитратов в среде. Эта способность обнаружена у многих видов микроскопических мицелиальных грибов, для которых это свойство ранее не было известно. Выявлена группа микромицетов родов Fusarium, Cylindrocarpon, Trichoderma, Chaetomium, Talaromyces, Gliocladium, Neosartorya, обладающих наиболее высокой активностью образования N2O. Выделение N0 грибами отмечено в следовых количествах.

8. Обнаружена взаимосвязь между выделением N2O грибами на средах с нитратами при пониженном парциальном давлении кислорода с возрастанием активности нитратредуктазы. Резкое повышение нитратредуктазной активности у Fusarium oxysporum lldnl связано с синтезом нового фермента, отличного от ассимиляторной нитратредуктазы по молекулярному весу, локализации и температурному оптимуму.

Высокая активность фермента, отсутствие ее ингибирования аммонием и зависимость роста гриба от концентрации нитратов свидетельствуют, что это диссимиляторная нитратредуктаза.

9. Отсутствие влияния ацетилена на продукцию N2O указывает на то, что это конечное газообразное соединение восстановления нитратов и нитритов у грибов в анаэробных условиях, и они не способны образовывать N2. Активность выделения N2O грибами на 3-6 порядков ниже, чем диссимиляторными денитрифицирующими бактериями и близка к таковой у нереспираторных ^О-образующих бактерий. Низкая активность процесса и отсутствие взаимосвязи продукции N2O с ростом грибов свидетельствуют о детоксикационном механизме ее образования. Эмиссия N2O за счет деятельности грибов составляет от десятых долей до нескольких процентов (5-8%) от газообразных потерь азота из почв при денитрификации.

10. Непосредственно в условиях почвы показано, что внеклеточный гидролиз грибами растительных полимеров представляет важный механизм для поддержания жизнедеятельности диазотрофных бактерий и эффективного протекания несимбиотической азотфиксации в почвах.

11. Бактерии играют роль ускорителей процессов трансформации азота, а функциональные возможности грибов позволяют им успешно удерживать и сохранять азот в почвах и экосистеме в целом. При сельскохозяйственном использовании почв и интенсификации их обработки снижается участие грибов и возрастает роль бактерий в процессах азотного цикла, что обусловливает меньшую степень удержания азота в системе «почва-растение».

233

Заключение

Грибы в почвах участвуют во всех основных процессах цикла азота: иммобилизации, аммонификации, нитрификации, восстановлении окисленных форм азота до закиси азота и не способны только к азотфиксации. В отличие от бактерий они не могут восстанавливать закись азота до молекулярного азота и молекулярный азот до аммиака.

Выявлена определенная специфика в способности разных систематических групп микроскопических грибов осуществлять различные процессы цикла азота. Микромицеты активно ассимилируют в почвах аммонийный и аминный азот и подавляющее большинство из них - нитраты и нитриты. Среди типичных почвенных обитателей широким спектром видов родов Penicillium, Mucor, Aspergillus, Stachybotrys, Alternaria, Paecylomyces, Cladosporium, Fusarium, Chaetomium и многих других представлены активные протеолитики. Меньше среди микромицетов разнообразие нитрификаторов, но эта способность наиболее выражена у распространенных в почвах видов родов Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Myrothecium и ряда других. Восстановление нитратов и нитритов до закиси азота в условиях пониженного парциального давления кислорода наиболее свойственна некоторым видам родов Fusarium, Trichoderma, Cylindrocarpon, Chaetomium, Gliocladium и в заметно меньшей степени другим таксонам.

Грибы выработали разнообразные механизмы адаптации для ассимиляции и сохранения азота при развитии в почве и других компонентах наземных экосистем. Большинство из них усваивают разнообразные азотсодержащие соединения, растут в широком диапазоне концентраций азота и содержание азота в мицелии может существенно варьировать в зависимости от его наличия в окружающей среде. Многие из них синтезируют ферменты, необходимые для расщепления растительных субстратов, при крайне низких концентрациях азота в местообитании. Грибы, благодаря гифальному строению, а у некоторых групп и ризоморфам, имеют возможность вести широкий поиск азота в почвах и других эконишах и перераспределять его в зоны роста мицелия и репродуктивные органы, и области, где доступного азота недостаточно. Некоторые группы грибов способны к реутилизации азота посредством автолиза части старых гиф и использования собственных азотсодержащих соединений для синтеза новых клеточных структур. В природных местообитаниях широко распространено развитие грибов в ассоциациях с азотфиксирующими микроорганизмами, благодаря чему они могут получать дополнительные источники азота. В случае высокого содержания азота в среде они способны к образованию в больших количествах белков и хитина, запасанию азота в форме мочевины. При избыточном количестве азота грибы имеют возможность ограничивать его поступление в клетку до определенных пределов, удалять его резервы (мочевину) и другие азотсодержащих соединения во внешнюю среду, а в условиях гипоксии - снижать концентрацию нитритов, восстанавливая их до закиси азота.

Попадающие в почву азотсодержащие соединения оказывают разнообразное влияние на развитие и метаболическую активность грибов. Они могут существенно модифицировать состав и структуру комплекса микромицетов и сообществ, разрушающих различные органические субстраты в почвах. Одним из серьезных последствий длительного применения азотных удобрений или внесения их в высоких дозах является возрастания обилия фитотоксичных микромицетов в почвах. В случае применения их с некоторыми ингибиторами нитрификации возможно стимуляция или усиление синтеза токсических веществ грибами, что может вызвать микробный токсикоз почвы.

Сопоставление функциональных возможностей бактерий и грибов в трансформации азота в почвах указывает на их взаимодополняющий характер, что во многом обеспечивает стабильность круговорота азота в наземных экосистемах. Огромное разнообразие денитрифицирующих бактерий сопряжено с небольшой группой грибов, способных менее эффективно восстанавливать нитраты и нитриты в анаэробных условиях. Активность выделения ими N20 на несколько порядков ниже, чем у денитрифицирующих бактерий и их вклад не превышает нескольких процентов от газообразных потерь азота из почвы при денитрификации. Наличие среди бактерий узкой группы высоко активных автотрофных нитрификаторов сбалансированно широкой распространенностью в почвах гетеротрофных нитрифицирующих микроорганизмов, главным образом, микроскопических грибов. Это обусловливает возможность дублирования ими этого процесса в ситуациях, когда активность и плотность популяции автотрофов-нитрификаторов низка и подавлена. Близкие потенциальные возможности в иммобилизации и аммонификации легкодоступных соединений азота у грибов и бактерий реализуются в разной степени в зависимости от пула их биомасс и активности, определяемых условиями почв конкретного биогеоценоза. Грибам, доминирующим по биомассе в большинстве почв, принадлежит ведущая роль в иммобилизации азота, а синтез ими устойчивых к деградации азотсодержащих гетероциклических и полимерных соединений (меланина, комплексов хитина с белками и меланинами) представляет важный механизм поддержания и накопления устойчивых органических форм азота в почвах. Поступление таких соединений значительно выше в почвы природных экосистем, чем в почвы агроэкосистем. В аммонификации легкодоступных белковых соединений преобладание грибов над бактериями возможно только в случае значительного (на порядок) превосходства их биомассы, т.е. преимущественно в кислых почвах под лесом. В других ситуациях заметно более значимую роль играют бактерии. Грибы, осуществляя внеклеточный гидролиз растительных полимеров, обеспечивают поступление доступного углерода и оптимизацию физико-химических условий азотфиксаторам-гетеротрофам и регулируют, тем самым, поступление азота в почву. Одним из механизмов лучшего удержания азота в природных экосистемах является мокотрофность растений. Посредством микоризных грибов у них не только возрастает возможность успешно конкурировать с почвенными микроорганизмами за минеральные формы азота, но и использовать азот органических соединений почвы. Таким образом, в почвах природных экосистем в определенной мере снижается необходимость интенсивновной минерализации азотсодержащих соединений, так как микотрофные растения имеют возможность использовать некоторые органические соединения азота (аминокислоты) (Chalot, Brun, 1998). Круговорот азота, с ослабленной активностью минерализации, представляется наиболее азотосберегающим, но его значение ограничено экосистемами крайних северных лесов и тундр (Chapin et. al., 1993; Schimel, Chapin, 1996). В силу суровых климатических условий эти процессы там крайне замедленны и микотрофные растения восполняют недостаток азота из органическоих источников почвы.

Проведенный анализ позволяет заключить, что бактерии играют роль ускорителей процессов трансформации азота, а функциональные возможности грибов позволяют им успешно удерживать и сохранять азот в почвах и экосистеме в целом. Об этом свидетельствуют наблюдения, что уменьшение соотношения грибной и бактериальной биомассы, при практически неизменной общей микробной биомассе, ведет к возрастанию аммонификации и газообразных потерь азота в окультуренных почвах

В целом, участие грибов в цикле азота (иммобилизации, аммонификации и ряде случаев, нитрификации) значимей в почвах природных экосистем, что обусловливает его более высокий уровень запасания и удержания в системе (рис.24, табл.11п, приложение). Роль бактерий возрастает в почвах агроэкосистем, что ведет к интенсификации круговорота азота и возможности получения его растениями в короткий период. Одновременно, более высокая удельная метаболическая активность бактерий, особенно в окислении и восстановлении азотных соединений, обусловливает увеличение потерь азота из этих почв.

Агроценоз

Гидролиз 1\Т полимеров ^^ /-Л J.^2 v грибами ^Л NO

NHt=C>

R-NH no2

NO

Органическое вещество почвы

Климаксный ельник-кисличник

Гидролиз полимеров грибам и» л

2 W N,0

NH3

-Mr

R-NH no2 no,

Органическое вещество почвы

Бактерии

Рис.24. Участие бактерий и грибов в круговороте азота в дерново-подзолистых почвах; ширина стрелки отражает относительную роль микроорганизмов в процессах трансформации азота.

Рассмотрение цикла азота и ряда других аспектов экологии бактерий и грибов в почвах, позволяет констатировать, что деятельность человека по изменению природных экосистем (уничтожению естественного растительного покрова, обработке почв, применению химических средств защиты растений и минеральных удобрений, извести) ведет к "бактеризации" почв и снижению значения грибов в почвенно-биологических процессах.

Этот вывод находится в соответствии с общим принципом стратегии изменения сообществ, если бактерии и грибы рассматривать в контексте r-К континиума, а агроценозы как хронически молодые нестабильные экосистемы в сравнении с природными климаксовыми экосистемами.

Регулирование соотношения активной биомассы грибов и бактерий представляется важным инструментом для снижения потерь азота и оптимизации процессов его трансформации в агроэкосистемах. Использование органической и органо-минеральной систем удобрения в отличие от минеральной системы имело четкую тенденцию к увеличению соотношения активных биомасс грибов к бактерий (в еще большей мере, грибной биомассы к биомассе денитрифицирующих бактерий) и одновременно снижению эмиссии газообразных соединений азота из дерново-подзолистой почвы.

Грибы

Итак, анализ участия в цикле азота в нем важнейших групп почвенной биоты -бактерий и грибов, хотя и не несет, естественно, всех возможных деталей, но дает во многом базисную картину, позволяющую глубже понять механизмы изменения ряда основных характеристик экосистем при их естественном развитии и различных нарушениях - возрастание и снижение запаса азота в системе, времени его оборота, замкнутости круговорота и эффективности использования азота.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кураков, Александр Васильевич, Москва

1. Александрова Е.И., Хрущева Е.П. Влияние удобрений на содержание сахара и развитие микоризы у ячменя.Новое в с.-х. микробиологии. Тр. Горьковского СХИ. 1975. Т.65. С.31-55.

2. Алтон JI. Влияние нитритов на жизнедеятельность микромицетов в морской и речной воде и в почве // Микология и фитопатология. 1994. Т.28. Вып.1. С.27-29.

3. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М. Наука. 1983. 280 С.

4. Аристовская Т.В. Микробиология подзолистых почв. M.-J1. Наука. 1965. 182 С.

5. Аристовская Т.В. Микробиология процессов почвообразования. Л.: Наука. 1980. 187 С.

6. Бабьева И.П. Дрожжи в биоценозах разных природных зон // Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза. М.: Наука. 1984. С.131-141.

7. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М. МГУ. 1989. 336 С.

8. Бабьева И.П., Меавад X., Марченко А.И. Азотфиксация в совместных культурах Lipomyces с бактериями. Микробиология, 1977. Т.46. Вып.2. С.270-272.

9. Бабьева И.П., Россихина О.Г. Бактериально-дрожжевые диазотрофные ассоциации в сокотечениях деревьев // Биол. науки. 1987. №2. С.87-91.

10. Бабьева И.П., Садыков Б.Ф. Состав и численность дрожжей в филлосфере растений // Микология и фитопатология. 1980. Т. 14, № 6. С. 473-476.

11. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М. МГУ. 1988. 230 С.

12. Белюченко И.С., Кураков А.В. Состав микроорганизмов в коричневой карбонатной почве при возделывании многолетних злаков и хлопчатника // Доклады ВАСХНИЛ, 1990. № 3. С.23-26.

13. Берестецкий О.А. Фитотоксины почвенных микроорганизмов и их экологическая роль/Фитотоксические свойства почвенных микроорганизмов. Л. 1978. С.7-30.

14. Бернат, 1983 (цит. по Кудеяров В.Н. Цикл азота в почве и эффективность удобрений. М. Наука. 1989. С.20.).

15. Бигон М., Дж.Харпер, К.Таунсенд. Экология. Особи популяции и сообщества. В 2-х т. Т.2, М.Мир. 477 С.

16. Билай В.И. (ред.) 1982. Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев. Наукова Думка. 550 С.

17. Билай В.И. Биологически активные вещества микроскопических грибов и их применение. Киев. Наукова Думка. 1965. 267 С.

18. Билай В.И. Биология целлюлозоразрушающих грибов / Проблемы биоконверсии растительного сырья (отв.ред. Г.К.Скрябин, ЕЛ.Головлев, А.А.Клесов). М. Наука.1986. С.6-29.

19. Билай В.И. Основы общей микологии. Вища школа, Киев, 1974, 396 с.

20. Билай В.И., Билай Т.И., Мусич Е.Г. Трансформация целлюлозы грибами. Киев. Наукова думка. 1982. 296 С.

21. Билай В.И., Коваль Э.З. 1988. Аспергиллы. Определитель.Киев: Наукова Думка, 203 С.

22. Благодатский С.А. Микробиологическая иммобилизация азота в серой лесной почве в зависимости от агротехнических приемов. Автореф. дис. канд.биол.наук. М. МГУ.1987. 25 С.

23. Болобова А.В., Кураков А.В. Поиск грибных продуцентов алкалостабильных и термостабильных целлюлаз // Прикл. биохимия и микробиология, 1999, т.35, №4, С.360-366.

24. Бондаренко Н.Г. Микробиологическое состояние дерново-подзолистой почвы при использовании минеральных удобрений и извести / Автореф. дисс. канд. биол.наук.М. 1980. 25 С.

25. Борисова В.Н. Гифомицеты лиственного опада. В: Микромицеты почв. Киев: Наукова думка, 1984, с. 155-179.

26. Брикун И.К., Козловский Т.М., Никитина JI.B. Гидразин и гидроксиламин, и их применение в аналитической химии // Алма-Ата. Наука. 1967. 220 С.

27. Булавская Е.С., Хрущева Е.П. Микрофлора корней микоризных растений кукурузы. Новое в с.-х. микробиологии. Труды Горьковского СХИ. 1975. 65. С.47-50.

28. Бурова Л.Г. Экология грибов макромицетов. 1986, М. Наука, 222 с.

29. Валагурова Е.В. Азотсодержащие удобрения регулятор жизнедеятельности почвенной микрофлоры / Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой. Киев. Наукова Думка. 1982. С.20-28.

30. Василенко Е.С. Роль активной микрофлоры в превращении органических азотсодержащих веществ в дерново-подзолистой почве и типичном черноземе. Автореф. канд. дисс. М. 1983. 24с.

31. Веденина И.Я., Заварзин Г.А. Удаление закиси азота комбинированной культурой бактерий // Микробиология, 1979, т.48, в.4, с.581-585.w