Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием"

На правах рукописи

БУРЯЧКОВСКАЯ Людмила Ивановна

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ. СВЯЗЬ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМ СОСТОЯНИЕМ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007 г.

003163385

Работа выполнена в Отделе клеточной биологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, академик РАН

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Евгений Иванович Чазов

Алексей Владимирович Мазуров

Аслан Амирханович Кубатиев

ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

Владимир Александрович Макаров

ГУ Гематологический научный центр РАМН

Юрий Аскольдович Романов

ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им М В Ломоносова, биологический факультет

Защита диссертации состоится 23 января 2008 г в 13 30 час

на заседании диссертационного совета Д 208.073.01в РКНПК «Росмедтехнологий» по адресу 121552, г Москва, ул 3-я Черепковская, д 15-А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК «Росмедтехнологий»

Автореферат разослан "_"_2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям тромбоциты играют ведущую роль в образовании тромба Кроме того, они участвуют в иммунных процессах и воспалении, защите организма-хозяина от вирусов и бактерий, в транспорте веществ, регуляции сосудистого тонуса, росте раковых клеток, их метастазировании и уничтожении, в ангиогенезе и ремоделировании сосудов Такая полифункциональность связана со способностью тромбоцитов к активации, которая в свою очередь, зависит от их морфо-функционального состояния

Неоднородность пула циркулирующих в крови тромбоцитов была обнаружена еще в начале прошлого века Различия отмечены в количестве, морфологии, возрасте, объеме, плотности, функциональной активности, содержании белков, гликогена, ферментов и рецепторов, что позволило говорить о гетерогенности пула тромбоцитов (Karpatkin, Khan, 1978)

Интактные тромбоциты имеют характерную форму диска При активации происходит быстрое, занимающее менее секунды, изменение формы из дисковидной в сферическую На разных этапах этого процесса могут появляться переходные формы, которые долгое время рассматривались в качестве одной из причин гетерогенности тромбоцитарного пула, а их выявление использовалось для определения риска тромботических осложнений у больных (Corash, 1990) Кроме того, были обнаружены и другие по форме тромбоциты, которые R Allen (1979) относил к атипичным или артефактным Но в дальнейшем появились неопровержимые данные, что такие формы появляются в результате их рождения мегакариоцитами (Gladwrn, Marfan, 1990, Hartwig, Italiano, 2003, Kozaki, 2005)

Возможны следующие пути появления тромбоцитов из мегакариоцитов 1) разделение цитоплазмы мегакариоцитов демаркационными мембранами и быстрый «взрывной» выброс тромбоцитов, 2) образование эндоплазматических пузырей, содержащих пластинки, и их отделение от материнской клетки, 3) инвагинация мембраны с отделением тромбоцитов в

виде бус, 4) образование из цитоплазмы псевдоподий, которые проникают в синусы костного мозга и отшнуровываются, в результате чего рождаются незрелые формы тромбоцитов, названные протромбоцитами В дальнейшем, уже в кровотоке, они разделяются, образуя тромбоциты дисковидной формы

Важную роль в продукции разных тромбоцитов играет степень полиплоидизации ядра мегакариоцитов (Даук! а1, 2002) С ней связан уровень содержания в тромбоцитах специфичных для них белков Транскрипционные факторы, поэтины, цитокины, молекулы адгезии и катехоламины являются определяющими для созревания и полиплоидизации мегакариоцитов (81ау1:оп et а1,2005)

В настоящее время выделяют три формы тромбоцитов, появление которых в кровотоке зависит от состояния мегакариоцитов и в первую очередь от их плоидности Это дисковидные тромбоциты, удлиненные биполярные протромбоциты (менее зрелые формы, рожденные клетками с низкой плоидностью) и большие сферические («ретикулярные») тромбоциты с высоким содержанием мРНК, происходящие из мегакариоцитов с высокой плоидностью Кроме этих трех, выделяют четвертую субпопуляхщю -сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий За исключением редких патологий их появление в крови не связано с мегакариоцитопоэзом, а происходит в результате активации и изменения дисковидной формы кровяных пластинок

Большинство исследований функциональных свойств тромбоцитов проводится на дисковидных и их производных - сферических формах Что касается протромбоцитов и больших сферических («ретикулярных») форм, они остаются мало изученными, данные о них в основном имеют описательный характер, а сведения об их функциональных свойствах, способности к активации и роли в различных процессах единичны и противоречивы

Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования было выяснение взаимосвязи между морфологической гетерогенностью

тромбоцитов, их функциональными свойствами и участием различных субпопуляций в гемостазе и тромбозе

К задачам исследования были отнесены

1. выявление и характеристика различных субпопуляций тромбоцитов, циркулирующих в крови человека и животных в норме,

2. отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты,

3. подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови,

4. изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок - в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов,

5. поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro,

6. исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагий,

7. изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов

Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопросы существует ли взаимосвязь между морфологией тромбоцитов, приобретенной ими в ходе мегакариоцитопоэза, и функциональной активностью пластинок, а также, какие факторы внешней среды могут оказаться решающими в появлении в кровотоке различных субпопуляций'?

Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые Для исследования особенностей морфологии и функций тромбоцитов была использована модель метаболического стресса у крыс Это позволило выявить условия повышения количества протромбоцитов в крови и провести исследование редко встречающихся в норме форм тромбоцитов До

нашей работы такую модель для исследования морфофункциональной гетерогенности тромбоцитов никто не применял

Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности

Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений

Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции

Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы m vitro Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания

Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов

Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией В больших сферических тромбоцитах не обнаружена типичная для тромбоцитов грануляция и выявлена сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом

Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод

определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов

Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) - фазе геморрагии

Научно-практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о циркулирующих в крови тромбоцитах в норме и при патологических состояниях

За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием Получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы» Этот метод используется в клинической практике

Отмечено, что увеличение количества протромбоцитов в крови соответствует фазе геморрагии В отличие от этого, риск тромботических осложнений возрастает с появлением в крови больших «ретикулярных» тромбоцитов Они обладают повышенной активностью, способны спонтанно

агрегировать Ингибиторы циклооксигеназы не оказывают влияния ни на количество, ни на функциональные свойства этих клеток Результаты этой работы могут оказаться полезными для разработки новых методов диагностики тромботических осложнений и в поиске способов их лечения

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 19 июня 2007 г на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК «Росмедтехнологий» Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на российских и международных конгрессах и симпозиумах Пленум правления ВНОГ (Рига, СССР, 1986 г), Всесоюзная Конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987 г), 1th Congress International Society for Pathophysiology (Москва, 1991 г), Всесоюзная Конференция по тромбозу и гемостазу (Полтава, 1992), Всесоюзный съезд гематологов (Львов, 1993),, VII, XI , XII, XIII, XV European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1995 г, 1999 г, 2001 г, 2003 г, 2005 г), Всероссийская конференция «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром Проблемы лечения» (Москва, 1997 г, 2003 г, Ярославль, 2005 г), XI и XIV International Symposium on Atherosclerosis (Париж, Франция, 1997 г, Рим, Италия, 2006 г ), 31th Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (Киль, Германия, 1997 г), I и III Украинская научная конференция «Микроциркуляция и ее возрастные изменения» (Киев, Украина, 1999 г, 2002 г), XVII, XVIII, XIX, XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Вашингтон США, 1999 г, Париж, Франция, 2001 г, Бирмингем, Англия, 2003 г, Женева, Швейцария, 2007), 18th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Чикаго, США, 2000 г), The 5th UK Meeting on platelets and the 9th и 10th Erfurt Conference on Platelets (Ноттингем, Англия, 2002 г Эрфурт, Германия, 2004 г ), 42nd American Society for Cell Biology Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2002 г), I II и III Всероссийская научная конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой

хирургии" (Москва, 2003 г, 2005 г, 2007 г ); 14 Международный симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами, нарушениями гемостаза и патологии сосудистой стенки (С-Петербург, 2004 г ), Российский национальный конгресс кардиологов (Томск, 2004 г), Симпозиум «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г ), 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005 г ), World Congress of Cardiology (Барселона, Испания, 2006 г,), Всероссийская конференция «Тромбозы в клинической практике факторы риска, диагностика, терапия» (С -Петербург, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ 28 в отечественных и 27 в международных изданиях

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6-ти глав, посвященных собственным результатам и их обсуждению, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы Работа изложена на 210 страницах, содержит 38 рисунков и 8 таблиц Список литературы включает 381 источник

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проводились исследования крови 54 специально отобранных здоровых добровольцев, 24 случайно обратившихся в донорский пункт с целью коммерческой сдачи крови добровольца, состояние здоровья которых не контролировалось, 38 профессиональных доноров, 29 больных бронхиальной астмой, 15 больных с артериальной гипертонией кризового течения, 18 больных феохромоцитомой, 18 больных с различными воспалительными заболеваниями (пневмония, пиелонефрит, абсцессы разной локализации), 14 -с генерализованными формами менингококковой инфекции, 52 больных ИБС с атеросклерозом коронарных сосудов, 11 больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий

Отдельные эксперименты выполнены на 126 самцах крыс линии Wistar весом 250-300 г, 23 белых лабораторных мышах весом 25-30 г, 54 кроликах

породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг, 7 сусликах весом 120-130 г Часть экспериментов проводили на предварительно подвергнутых двусторонней демедуляции надпочечников крысах Кровь брали самотеком из вены или шприцем из сердца, в некоторых экспериментах на крысах и мышах - через имплантированный в брюшную аорту катетер

Метаболический стресс создавали с помощью болюсного введения 500 мг/кг 2-дезокси-Д-глюкозы (2ДГ) Концентрацию эндогенных катехоламинов в плазме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием

Выделение и хранение концентрата тромбоцитов осуществляли в отделении переливания крови ФГУ РКНПК в контейнерах Fenwal PL-1240 Тромбомассу от 38 доноров получали двумя способами «в осадке» и из лейкоцитарной пленки методом «Buffy Coat» Забор образцов для исследования осуществляли непосредственно после помещения тромбомассы в мешки для хранения (0 точка), на 1, 3 и 5 сутки хранения Одновременно с этим проводился анализ контроля стерильности

Исследование морфологии. Для оценки формы тромбоцитов 50 мкл цельной крови непосредственно при взятии или 10 мкл ОТП фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде (1 30), помещали на поликарбонатные мембраны и подготавливпали препараты для исследования Подсчет разных форм тромбоцитов проводили в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «PHILLIPS PSEM 550х» Количество пластинок каждой формы выражали в % по отношению к общему числу клеток в образце

При подсчете выделяли 4 типа тромбоцитов дисковидные (Д) размером 2-4 мкм, сферические (Q) размером 1-2 мкм, с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий, большие сферические (Сг) размером 4-5 мкм, с выраженными инвагинациями плазматической мембраны, часто называемые в литературе «ретикулярными тромбоцитами», вытянутые биполярные протромбоциты (ПТ) длиной 2-20 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм, одинаковые по всей длине или сужающиеся к концам наподобие веретена

Для исследования внутриклеточных структур тромбоцитов 2 мл крови с антикоагулянтом префиксировали в 1% глутаровом альдегиде, отделяли ОТП и проводили более жесткую фиксацию 2,5% глутаровым альдегидом Импрегнацию осуществляли 0,1% раствором четырехокиси осмия Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) "ШОЬ" - 200 СН

Исследование функций тромбоцитов. Агрегацию исследовали с помощью лазерного двухканального анализатора агрегации НПФ «БИОЛА» модели 230ЬА Способность к образованию агрегатов малого размера (от 3 до 100 клеток) оценивали по спонтанной и индуцированной 0,1 и 0,5 мкмоль АДФ агрегации Образование агрегатов среднего и большого размера (свыше 100 клеток) оценивали по индуцированной 1,0 и 5,0 мкмоль АДФ агрегации

Адгезию оценивали с помощью СЭМ 50 мкл ОТП наносили на адгезивную поверхность, инкубировали 5 мин при комнатной 1 в закрытом бюксе, снимали неприкрепленные клетки с поверхности и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом Параллельно исследовали тромбоциты, прикрепившиеся к поверхности и оставшиеся в суспензии, которые характеризовали как не способные к адгезии Подсчет разных форм проводили на 25 полях сканирования, передвигая столик по диагонали, при увеличении 2500х или на 50 полях при увеличении 5000х Для определения количества тромбоцитов (в %), способных к адгезии, использовали формулу А=ТЧах 100/Ка+]Чп, где А - количество тромбоцитов определенной формы, способных к адгезии, - общее число подсчитанных клеток, прикрепленных к поверхности, ТМ„ - общее число подсчитанных клеток, оставшихся в суспензии

Способность к эндо-экзоцигозу регистрировали с помощью флюориметрии методом АО-теста Флюоресцентный зонд акридиновый оранжевый (АО) избирательно поглощается и запасается в основном внутри гранул и по его накоплению и освобождению можно судить о функциональном состоянии тромбоцитов

Средний объем тромбоцитов (СОТ) оценивали по тромбоцитокриту В кювету переменного диаметра добавляли 1 мл ОТП с 0,1 моль ЭДТА и центрифугировали 20 мин при 2000 § Высоту столбика осевших клеток измеряли по линейке бинокуляра и пересчитывали по формуле ОхН/Ы"3, где Б - диаметр капилляра, Н - высота столбика осевших клеток, получившегося после центрифугирования, N - количество клеток в мм3 ОТП Объем тромбоцитов выражается в фл Параллельно для контроля проводили измерение СОТ на гемоанализаторе "Нетавсгееп 5"

Статистическую обработку и оценку корреляций с помощью критерия Спирмана осуществляли с помощью компьютерной программы Statlstlca б 0 Определение различий проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни На рисунках и в таблицах приводятся отклонения от среднего значения, соответствующие стандартной ошибке или стандартному отклонению

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности морфологии и функций тромбоцитов человека и животных

В крови относительно здоровых лиц тромбоциты морфологически достаточно однородны Однако в разных группах людей, наиболее часто используемых в качестве контрольных, могут наблюдаться отличия

В цитратной крови специально отобранных здоровых добровольцев, чье состояние оценивается по отсутствию хронических заболеваний, жалоб на здоровье и обращений к врачу в течение последнего года, 85 - 98 % (в среднем 94±5,2%) тромбоцитов имеют форму дисков С1 формы немногочисленны и в среднем составляют 6,3±0,7% Обнаружено также от 1 до 4% (2,4±0,3%) ПТ небольшой длины (до 6 мкм) Более длинные ПТ, делящиеся или с перетяжками отсутствуют Больших сферических тромбоцитов, относящихся к субпопуляции С2, нет (рис 1)

Диски

Сферы С!

100 80 „во

40 20 О

Ь1 I?«

П ■ _^

-Л 1 1

1

Протромбоциты Большие сферические

С,

100 80

40

20 О

100 во ¡=60 40 20

О

I 2 3 Дельная кровь

12 3

а отп

Рисунок 1. Содержание тромбоцитов разной формы в цельной крови (темные столбики) и в ОТП (светлые столбики) отобранных здоровых добровольцев (1),профессиональных доноров (2) случайных добровольцев (3). * - р<0,05; ** -р<0,01.

Для тромбоцитов отобранных здоровых добровольцев характерно отсутствие способности спонтанно агрегировать. В ответ на добавление ОД мкмоль АДФ агрегация составляет 1,7±0,1 отн ед, а в ответ на 5 мкмоль АДФ - 47,8±3,7 %. СОТ соответствует 8,6±0,6 фл и не превышает 10 фл. Реакция освобождения, оцениваемая по АО-тесту, достигает 19,2±1,9 уел ед, но не выходит за предел 22 уел ед.

У профессиональных доноров содержание Д форм снижено, а С] форм повышено, что может быть связано с активацией, вызванной кровопотерей и перестройкой организма в результате длительного донорства. Содержание ПТ увеличено почти в 2 раза и колеблется от 3 до 7% (в среднем 4,8±0,8%, р<0,05) по сравнению с ЗД. В основном они имеют веретенообразную или биполярную конфигурацию, но в отдельных случаях присутствовали единичные ПТ до 20 мкм длиной с перетяжками на концах. Сг не обнаружены. Спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация (18,6±2,0%), СОТ

(8,2±0,9 фл) и реакция освобождения (18,6±2,0 уел ед) незначительно отличались от сходных показателей у ЗД

У большинства случайных добровольцев, обратившихся в донорский пункт с целью сдачи крови на коммерческой основе, состояние здоровья не контролировалось, и поэтому среди них могли оказаться лица с различными заболеваниями По сравнению со здоровыми добровольцами, у этого контингента исследованных повышено содержание С1 и снижено количество Д форм, хотя это не столь выражено, как у доноров В то же время, у отдельных случайных добровольцев отличий от здоровых добровольцев не наблюдалось В среднем содержание ПТ также не отличалось, но у некоторых представителей этой группы выявлены С2 формы (рис 1) Несмотря на то, что их количество ни у одного случайного добровольца не превышало 1%, у них наблюдается спонтанная агрегация (1,5±0,1 отн ед), повышенные 0,1 мкмоль АДФ-индуцированная агрегация (2,1±0,3 отн ед) и реакция освобождения (20,3±2,9 уел ед), хотя СОТ не менялся Встречающиеся в ряде работ данные о присутствии Сг форм в крови здоровых лиц может быть связано с недостаточно строгим отбором людей для включения в группу нормы

По сравнению с цельной кровью, в ОТП увеличивается количество С1 и уменьшается число Д форм в результате активации, вызванной процедурой выделения тромбоцитов В то же время производимые при выделении действия не влияют на состояние С2 и ПТ, количество которых в ОТП и цельной крови одинаково

Анализ проведенных исследований в различных группах относительно здоровых лиц позволил нам выбрать группу отобранных здоровых добровольцев в качестве контроля для исследования морфо-функциональных особенностей тромбоцитов Можно говорить о минимальной гетерогенности тромбоцитов у этой группы лиц, чей пул представлен преимущественно Д формами, минимальным количеством ПТ и отсутствием Сг форм, что ограничивает возможность исследовать эти субпопуляции

В поиске возможности использования лабораторных животных для изучения функциональных свойств тромбоцитов различных субпопуляций, мы исследовали кровь бодрствующих крыс, кроликов, мышей и сусликов У всех видов животных в цельной крови основная часть пула тромбоцитов представлена Д формами, которые различаются по размеру и структуре У крыс Д формы более уплощенные и крупнее, чем у других животных У кроликов, мышей и сусликов тромбоциты субпопуляции Д более выпуклые, но без признаков активации Максимальное количество Д форм обнаружено в крови крыс и кроликов, в то время как у мышей и сусликов их количество меньше, но одновременно с этим повышено число С1 с гладкой поверхностью и без выраженных псевдоподий, что говорит о минимальной активации

Таблица 1

Морфо-функциональные особенности тромбоцитов у различных видов лабораторных животных Агрегация в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ

животные Форма тромбоцитов (%) Агрегация % Экзоцитоз услед

д с, С, ПТ

кролик 84,8±ЗД 12,2*1,6 0 2„0±0,2 52,3±9,б 31,4 ±2,5

мышь 72,4±6Д 24,6±2,7 0 2,2±0,4 45,2±4,8 27,8 ±2,6

крыса 8б,1±4,7 3,4±0,5 0 10,2±2Д 2б,7±3,1 17,3 ±1,4

суслик 63,3±5,8 35„5±4,2 0 2,5±0,2 31,7±4,2 19,7 ±1,8

Ни у одного из видов интактных животных не обнаружены Сг тромбоциты В то же время у крыс почти в 5 раз увеличено число циркулирующих ПТ У остальных животных их содержание сходно с наблюдаемым у ЗД Такая морфологическая гетерогенность пула тромбоцитов крысы отличает ее от других видов лабораторных животных

Межвидовые различия касаются и функциональной активности кровяных пластинок Спонтанная агрегация отсутствовала у всех видов животных АДФ-индуцированная агрегация была самой высокой у кроликов, а

наиболее низкой у крыс. Сходные различия касаются и способности к экзоцитозу: тромбоциты крыс наименее активны по этому параметру (табл. 1).

Выявленные особенности морфологии и функции тромбоцитов у крыс могут быть связаны с тем, что эти животные наиболее восприимчивы к эмоциональному стрессу, а иммобилизация, которой они подвергались для взятия крови, приравнивается у них к такому состоянию. Это позволило нам предположить, что стрессорные воздействия различной природы могут влиять на изменение пула тромбоцитов, и в частности на появление ПТ. 2. Роль катехоламипов в регуляции тромбоцитарного пула крыс

Одним из компонентов стресс-реакции в организме рассматриваются катехоламины. Принципиальная трудность, связанная с исследованием причин и взаимосвязи между стрессорной ситуацией и ответом, заключается в количественной оценке вызывающего стресс стимула. В этой связи удобной моделью активации симпато-адреналовой системы является метаболический стресс, вызванный введением 2ДГ.

(мин)

Рисунок 2. Изменение концентрации адреналина и норадреналина в крови на фоне метаболического стресса, развившегося в ответ на болюсное введение через вживленный катетер бодрствующим крысам 2ДГ. Первая доза составляла 125 мг/кг, вторую дозу (375 мг/кг) вводили через 15 мин. * — р<0,05; **-р<0,01.

Исходно концентрация адреналина и норадреналина в плазме крови составляли 0.158+0.052 нг/мл и 0,393±0,065 нг/мл соответственно. Через 15 мин после введения крысе первой дозы 2ДГ (125 мг/кг) уровень адреналина возрастал почти в 12 раз. Максимальный его прирост (в 41 раз) наблюдался через 15 мин после введения второй дозы, равной 375 мг/кг, и далее менялся незначительно в течение двух часов. Общий выброс норадреналина после первой дозы увеличивался в 1,4 раза, а после второй дозы - в 2,7 раза, в дальнейшем сохраняясь повышенным в 2,5 раза (рис. 2).

Уже через 15 мин после введения первой дозы 2ДГ количество тромбоцитов в крови возрастает на 31% (рис. 3). х10э/л

800 -т--я-

500 --------

400 --

300 --

200 --

100---

о А-т-,-,

контроль после введения 2ДГ

15 мин 120 мин

Рисунок 3. Количество тромбоцитов в крови крыс до и через 15 мин после введения первой и 120 мин после введения второй доз 2ДГ. * - р<0,05.

Реально в физиологическом состоянии треть тромбоцитов секвестрируется в селезенку. Под действием высоких концентраций катехоламинов они могут достаточно быстро покидать это депо, что и может быть причиной повышения их количества в крови. Через 2 часа наблюдалось увеличение количества тромбоцитов еще на 8%. и одновременно имело место появление более длинных и находящихся на разных стадиях деления ПТ. Это может быть связано со стимуляцией стресс-поэза и запуском продукции тромбоцитов из мегакариоцитов, находящихся на ранних стадиях созревания.

Такой поворот событий вполне реален, если учитывать, что стадия полишкждизации и созревания может занимать менее 90 мин после поступления стимула.

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

* А

15 30 60 120 180 ®реМ*

(мин)

Рисунок 4. Содержание ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса в зависимости от времени взятия проб после введения 2ДГ. * - р<0,05 по отношению к первоначальным показателям до введения 2ДГ (0 точка);л -р<0,05 по отношению к показателям на 15й мин, соответствующей введению первой дозы 2ДГ.

В то же время через 15 минут после введения 2ДГ содержание ПТ возрастает почти в 5 раз (р<0,01) (рис.4). Трудно себе представить, что за такой короткий срок такое повышение может произойти за счет рождения из мегакариоцитов. Это подтверждает высказанное ранее предположение о выбросе запасного пула из селезенки, так как известно, что именно молодые клетки задерживаются в ней, где и происходит их дальнейшее созревание.

Полученные данные позволили выбрать для проведения дальнейших исследований ПТ временной интервал в 120 мин после введения 2ДГ, за который в крови появляется достаточно большое количество ПТ разного происхождения, но животные еще не погибают.

На рис. 5 (А, Б) представлены отдельные ПТ, на дистальных концах которых происходит формирование Д форм (В), остающиеся еще соединенными с основной структурой. Обнаружены ПТ различной длины (от 2 мкм до 20 мкм), находящиеся на разных стадиях деления. Большинство

биполярных ПТ имели длину 2-4 мкм и закругленные или вытянутые сужающиеся концы. Именно такие более короткие формы появлялись в первые 15 мин. после введения 2ДГ, что свидетельствует о том, что именно они находились в селезенке. Можно предположить, что в таком виде ПТ остаются после последнего отделения Д форм и задерживаются в селезенке для «дозревания». Через 2 часа в крови появляются более длинные, делящиеся ПТ.

:

•.•:.:•. . -. . ........... ■ -

■ - ..... : :

• V ВЭЯЮй К» • . ^ р в РШМИНИиШ

ф щ ■■'й- ...... Ш. ~Ж Ж Ж

Д Е

Рисунок 5. А, Б, В - различные формы ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса, СЭМ, увеличение х2500 - 7000. 1 бар - 2мкм. Г, Д, Е - внутренняя структура ПТ, ТЭМ, Г, Д, - увеличение х40000, Е - увеличение 10000, стрелками отмечены места формирования Д тромбоцитов.

Ультраструктура ПТ значительно отличается от структуры Д форм (рис 5 Г, Д) На дистальных концах ПТ концентрируются пучки микротрубочек, которые отличаются плотной упаковкой и способствуют удержанию вытянутой биполярной формы У Д форм микротрубочки располагаются по внутреннему периметру мембраны при активации они рассеиваются хаотически по цитоплазме и вследствие этого происходит изменение формы и переход из Д в С1 формы В делящихся ПТ микротрубочки более выражены в сформировавшемся, но еще не отделившемся участке, который в дальнейшем даст начало Д форме (Е) Понятно, что именно такое расположение микротрубочек способствует как поддержанию формы и формированию перетяжек на концах ПТ, так и отделению новых Д тромбоцитов

Кроме разницы в форме, важнейшим отличием является величина плотных гранул и их количество в ПТ Для биполярных, размером до 4 мкм ПТ характерно почти двукратное снижение количества гранул (р<0,05) и увеличение их размера (р<0,001) В более длинных делящихся ПТ плотные гранулы были единичными, а в отдельных клетках отсутствовали

Мы предположили, что такие различия в морфологической картине могут влиять на функциональную активность тромбоцитов Создавая метаболический стресс, т е условия, когда значительно повышается выброс в кровоток ПТ, у нас появилась возможность исследования функциональной активности этих форм и оценки вклада данной субпопуляции в общее состояние всего пула

Агрегационная способность тромбоцитов крыс по сравнению с человеком снижена У здоровых животных, находящихся в бодрствующем состоянии, агрегация тромбоцитов в крови, взятой через катетер, находится в пределах 18 - 42 % (рис 6) В крови таких животных циркулирует от 4,2 до 7,3 % ПТ, а основную часть (83±9,1 %) составляют Д формы Спонтанная агрегация отсутствует В условиях метаболического стресса спонтанная агрегация тромбоцитов у крыс также отсутствовала, а индуцированная 5 мкмоль АДФ была снижена и ни у одного животного не достигала нижней

границы нормы (рис.6). Возможно, что именно присутствие значительного количества ПТ вызывает такую агрегационную картину всей популяции пластинок.

Рисунок 6. Агрегация тромбоцитов интактных крыс (контроль) и через 2 часа после введения 2ДГ. Жирными горизонтальными линиями отмечены пределы показателей у здоровых животных. Индуктор агрегации - 5 мкмоль АДФ.

Для проверки этой гипотезы были исследованы образцы ОТП после исследования процесса агрегации. Кюветы для агрегатометрии после ее измерения оставляли на столе на 5 мин для того, чтобы образованные агрегаты осели на дно, а затем отбирали надосадок и определяли в нем содержание тромбоцитов разной формы. Подсчитывали также общее количество клеток в ОТП и супернатанте, чтобы выяснить, сколько тромбоцитов не способны к образованию агрегатов.

У контрольных крыс 32,8±2,7% тромбоцитов не участвуют в образовании агрегатов и остаются в суспензии. Среди одиночных тромбоцитов находится 39,3±4,7% Д форм, 44,0+3,9% С1 форм и 16,1±1,8% ПТ. Увеличение числа С) форм связано с активацией тромбоцитов Д формы под действием АДФ, но в основном это были мелкие, с гладкой поверхностью, по-видимому старые или рефрактерные пластинки. Увеличение содержания ПТ в суспензии (р<0,001) свидетельствует о том, что они не участвуют в образовании агрегатов и их число по отношению к другим формам растет.

Более ярко это проявляется при метаболическом стрессе Вне агрегатов остается 23,8±2,7% Д форм, 21,4±3,1% С1 форм и 55 2% ПТ Значительное количество ПТ, не включившихся в состав агрегатов, остается в неизмененном виде Такое увеличение числа ПТ в надосадке по сравнению с ОТП (р<0,001) связано с тем, что часть Д и С1 форм уходит в агрегаты, а все ПТ остаются в нем, и их содержание по отношению к другим формам возрастает

Такая картина подтверждает неспособность ПТ взаимодействовать друг с другом и тромбоцитами других субпопуляций и позволяет сделать вывод об их функциональной инертности в отношении агрегации

Таблица 2

Содержание различных по морфологии тромбоцитов у крыс, находящихся в условиях метаболического стресса среди адгезированных и не способных к адгезии клеток

тага образца общее КОД-ВС по отношению к ОТП (в %) соотношение разных форм тромбоцитов (%) агрегация

д Сг | П1 ;

Фаяиыга

Способные к адгезии 31,4+5,2 32,94-4,2 66,ШЛ 0 | 1,0+0,3

Оставшиеся в смыве 41,7±4,8 5,2±1,1 0 | 53,2*3,6 1 нет

Огекяо

Способные к адгезии 30Д±4,1 31,б±3,8 67,8*5,9 0 0,6 ±0,1

Оставшиеся и омывз 40,2±3,7 5,0±0,9 0 55,2±4,9 нет

Коллюген IV типа

Способные к адгезии 23,2*3,1 21,6±3,7 76,5±4,8 0 3,3±0,4

Оставшиеся в смыве 37,1 ±4,4 4,7±0,7 0 5бДь5Д нет

Адгезивные свойства ПТ также изменены Около трети тромбоцитов крыс, пребывающих в метаболическом стрессе адгезируют к фольге и стеклу, а к подложкам, покрытым коллагеном IV типа еще меньше Остальные, неприкрепивпшеся, легко смываются с поверхностей К поверхностям адгезировали активные формы, а неактивные оставались в смывах Практически все ПТ оказывались среди последних, что говорит об их неспособности выполнять функцию адгезии (табл 2)

Исследование адгезивных свойств тромбоцитов, не способных к агрегации (см раздел на стр 18) показало, что только 7,3±1,5% из них способны к адгезии Но ПТ и в этом эксперименте оставались инертными Сходная картина получена при исследовании агрегации тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии В ответ на 5 мкмоль АДФ ни в одном образце агрегация не наблюдалась Поскольку более 50% пула составляли инертные ПТ, именно они могут снижать агрегационный ответ всего пула Спонтанная агрегация также отсутствовала

Реакция освобождения (экзоцитоз) Тромбоциты контрольных крыс способны захватывать флуоресцентный маркер и накапливать его внутри гранул (эндоцитоз) В ответ на стимул они почти полностью высвобождают его в окружающую среду, удерживая лишь незначительное количество, рассеянное в цитоплазме Через 2 часа после введения 2ДГ, на фоне повышения в крови содержания ПТ, способность к эндоцитозу возрастает на 28% (р<0,05), а освобождение метки снижается на треть (р<0,01) Флуоресцентная микроскопия показала, что метка остается внутри гранул, вызывая ярко-красное свечение У тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии, на фоне повышенного на 33% эндоцитоза, освобождение метки снижается в 2,5 раза (р<0,01) Это может быть связано с тем, что в ПТ как в молодых клетках, внутриклеточные гранулы содержат только небольшое количество веществ и часто даже не визуализируются, так как могут находиться в «слипшемся» состоянии Этим определяется их повышенный потенциал к эндоцитозу В то же время, резкое снижение экзоцитоза может

зависеть как от потребности клеток в насыщении гранул, так и от нарушения в них такой физиологической функции как реакция освобождения

Взаимодействие ПТ с лейкоцитами. Для проверки способности ПТ образовывать лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты, мы добавляли суспензию отмытых аутологичных лейкоцитов (1 50) к образцам тромбоцитов из смыва после адгезии, в которых сконцентрированы ПТ После инкубации этой смеси в течение 15 мин при 37°С и перемешивании (1200 об/мин) с помощью СЭМ было обнаружено образование гетероклеточных агрегатов При подсчете тромбоцитов до и после этих манипуляций выяснилось, что их количество в свободном состоянии снизилось на 7,4±1,1%, и это произошло за счет уменьшения числа Д форм ПТ оставались в суспензии и не участвовали во взаимодействии с лейкоцитами Это свидетельствует об их инертности и по отношению участия в воспалительных реакциях

Анализ полученных данных о неспособности ПТ к адгезии и агрегации, взаимодействию с лейкоцитами, а также сниженной реакции освобождения позволил сделать вывод об их инертности

Демедулляция надпочечников у крыс приводила к тому, что уровень адреналина в плазме крови животных не превосходил предел его хромотографического определения (0,02 нг/мл) ни до, ни после введения 2ДГ Базальная концентрация норадреналина в плазме демедуллированных крыс оказалась выше, чем у крыс с интактными надпочечниками После введения полной дозы 2ДГ она повышалась в 2,5 раза, что было сходным с показателями у интактных крыс

У демедуллированных крыс в крови обнаружено не более 4% ПТ (2,9±0,6%), что было ниже этого показателя у тех же животных до операции Агрегационная активность тромбоцитов не отличалась от показателей у интактных животных После введения 2ДГ количество ПТ не изменялось, но большинство тромбоцитов имели С1 форму Агрегация тромбоцитов в ответ на АДФ у большинства животных превышалась, что может быть связано с

умеренным возрастанием (в 2-3 раза) уровня норадреналина, который оказывает активирующее действие на пластинки

Адреноблокаторы празозин, тропафен и пропраналол предотвращали повышение в крови ПТ, происходящее на фоне стрессорного воздействия, что можно объяснить блокадой выброса запасного пула тромбоцитов селезенкой Агрегация тромбоцитов на фоне блокады а и [3-адренорецепторов повышалась, хотя есть различия в ее степени В первую очередь это связано с отсутствием в общем пуле инертных, неспособных к агрегации ПТ

Эксперименты по демедулляции надпочечников и действию адреноблокаторов указывают на то, что изменения морфологии и функциональных свойств тромбоцитов обусловлено не непосредственным введением 2ДГ, а именно стрессорной реакцией 3. Образование ПТ в условиях in vitro.

В патологических условиях (например, при курении, стрессе и особенно кардиогенном шоке) в крови повышается уровень катехояаминов, которые могут существенно содействовать виутрисосудистой агрегации тромбоцитов Возможно, именно выброс значительного количества инертных ПТ в циркуляцию является защитной реакцией организма против развития массированного тромбоза на фоне гиперкатехоламинемии Хотя нельзя было исключить и более прямого пути, связанного с непосредственным влиянием высоких концентраций катехоламинов на трансформацию тромбоцитов разных субпопуляций, присутствующих в кровотоке, в биполярные формы ПТ В наших экспериментах in vitro адреналин, серотонин и гистамин в концентрациях 10'8 - 10"7 моль индуцируют агрегацию тромбоцитов, а в более высоких (выше 10~5 моль) - являются дезагрегантами Инкубация ОТП с катехоламинами в концентрации 10~7 моль не приводила к появлению ПТ в суспензии Повышение концентрации веществ до 10"4 моль принципиально не меняло картину, что свидетельствует об отсутствии прямого влияния катехоламинов на трансформацию тромбоцитов в формы, характерные для ПТ

Ионы Са играют важную роль в поддержании формы тромбоцитов. По нашим данным, при использовании ЭДТА в качестве антикоагулянта в крови, отсутствуют ПТ. Это позволило предположить, что связывание двухвалентных катионов, происходящее на фоне добавление ЭДТА к ОТП с высоким содержанием ПТ, может приводить к потере их формы.

80 70 60 50 40 30 20 10 О

1..... ....... __ Гг.......

{

д "г 1ТТ

1 * д

с;' §11| П

¡¡Ш 1 1ТТ г5$®я<к .....

Kouipo.ii>

ЭДТА

Рисунок 7. Влияние хелатирования, вызванного добавлением 1 мкмоль ЭДТА, на содержание тромбоцитов разных субпопуляций в крови крыс, пребывающих в состоянии метаболического стресса. * - р<0,05; ** -р<0,001.

После инкубации с ЭДТА тромбоцитов крыс с метаболическим стрессом, ПТ теряли свою биполярную форму и их количество уменьшалось, содержание С[ форм повышалось, а количество Д форм снижалось (рис. 7). Микроскопический анализ выявил, что среди сферических тромбоцитов попадаются более крупные, с гладкой поверхностью или с длинными псевдоподиями, т.е. формы, которых не было до добавления ЭДТА. Вероятно, они появляются в результате преобразования ПТ, которые первоначально присутствовали в ОТП. Изменение их формы может влиять на показатели СОТ, исследование которого проводят на фоне ЭДТА.

ИЛ-2 и ИЛ-6, влияющие на созревание и пролиферативную активность мегакариоцитов и стимулирующие рождение ПТ, после инкубации с ОТП в

течение 3 мин при 37° С не влияют на форму и агрегационную активность тромбоцитов in vitro Известно, что ИЛ-2 стимулирует иммунную реактивность лимфоцитов, а также синтез и экспрессию ИЛ-1 и ФНО-а Добавление к ОТП предварительно инкубированных с ИЛ-2 аутологичных лимфоцитов приводило к активации тромбоцитов и увеличению количества C¡ форм на фоне снижения Д форм, что может быть связано с взаимодействием с лейкоцитами Но интерлейкины, ни непосредственно сами, ни опосредованно через лейкоциты, не вызывают образования ПТ 4. Состояние тромбоцитов в условиях хранения тромбомассы.

Для выяснения возможности трансформации тромбоцитов при длительном нахождении в условиях in vitro (5 дней), исследовали концентраты тромбомассы, полученные с помощью разных методов - традиционным «в осадке» и с использованием процедуры получения из лейкоцитарной пленки, так называемым «buffy coat»

В течение хранения количество тромбоцитов в тромбомассе менялось В «bufíy coat» уже в первые сутки хранения количество тромбоцитов повышалось в среднем на 7,1%, незначительно падало к 3 суткам и затем понижалось на 5-е сутки (рис 8 А) В контейнерах с «осадком» через сутки количество пластинок сохранялось, на 3 сутки повышалось на 9,7%, после чего снижалось к 5 дню На первые сутки хранения в «buffy coat» увеличивается количеств ПТ, среди которых есть тромбоциты длиной до 10 мкм В дальнейшем их число снижалось и к 5 дню достигало первоначального уровня В «осадке» сходное, но более выраженное повышение начиналось на 3 сутаи и продолжало расти и к 5 дню (рис 8 Б) Сг формы отсутствовали во всех исследованных пробах

Спонтанная агрегация во всех исследованных образцах отсутствовала АДФ-индуцированная (5 мкмоль) агрегация в начале хранения была достоверно выше (р<0,01), чем в донорской крови (рис 8 В) Однако в дальнейшем она снижалась в зависимости от срока хранения Это может быть связано как с деградацией тромбоцитов, так и с повышением количества

функционально инертньгх ПТ, хотя до 3-х суток агрегация сохранялась в

пределах нормальных величин.

О 1 3 S сутки - «Ни±Ту coat»--«осалок»

Рисунок 8. Динамика изменения количества тромбоцитов в тромбомассе, полученной разными методами, при хранении в течение 5 суток (А); содержание ПТ в общем пуле (Б); агрегация тромбоцитов в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ (В). * - р<0,05; ** - р<0,001 по сравнению с показателями в Iй час хранения.

СОТ в образцах «buffy coat» через сутки хранения повышался (р<0,05), а затем постепенно снижался и к 5-му дню был меньше, чем в первый час хранения. Повышение СОТ объясняется скорее всего тем, что под действием ЭДТА ПТ изменяют форму и увеличиваются в объеме, и именно присутствие в контейнерах ПТ ведет к повышению СОТ на 1-3 сутки хранения. Появление на 5 сутки мелких тромбоцитов приводит к снижению СОТ.

Повышение общего количества тромбоцитов и увеличение числа ПТ в контейнерах при 5-ти дневном хранении in vitro и сохраняющейся

контролируемой стерильности можно объяснить присутствием в них циркулирующих мегакариоцитов, которые нам удалось выявить при микроскопии (рис. 9). По разным данным в венозной крови здоровых лиц присутствует от 1 до 20 мегакариоцитов на 1,5 мл. С учетом того, что один мегакариоцит может продуцировать от 103 до 6x104 тромбоцитов, достаточно попадания в контейнер нескольких мегакариоцитов, чтобы значительно повысить количество тромбоцитов. Мощным регулятором тромбоцитопоэза в данных условиях могут служить цитокины, которые вырабатываются лейкоцитами, находящимися в тромбомассе. Есть данные, что содержание интерлейкинов зависит от величины контаминации лейкоцитами (\Vadliwa е!а1., 1996). Это относится в первую очередь к ИЛ-1, ИЛ-6 и ТСГ-р. уровень которых постепенно возрастает к 5-му дню хранения. В то же время содержание ИЛ-8 повышается уже в первые сутки.

То, что ни в одном из образцов не обнаружено С2 форм, подтверждает мнение о невозможности трансформации в эти формы тромбоцитов других субпопуляций. Мы предполагаем, что С2 тромбоциты вырабатываются только клетками костного мозга и не образуются из циркулирующих мегакариоцитов, которые по литера гурным данным имеют пониженную плоидность.

Рисунок 9. Мегакариоцит из контейнера с тромбомассой на 3-й сутки хранения. 1 Бар соответствует 5 мкм.

В то же время быстрое появление ПТ в условиях in vitro позволяет предположить, что и в организме человека ш vivo они могут образовываться не только в костном мозге, но и из циркулирующих мегакариоцитов 5. Гетерогенность тромбоцитов человека с различными патологиями. У больных атопической бронхиальной астмой, которая часто сопровождается воспалительной реакцией, отмечены повышенная активность тромбоцитов и накопление на их поверхности IgE и IgG С целью снижения содержания этих иммуноглобулинов, играющих важную роль в патогенезе заболевания, у больных проводили процедуру тромбоцитофереза, удаляя из организма до 60% (в среднем оставалось 102,4±9,7 тыс/мм3) тромбоцитов Количество тромбоцитов восстанавливалось до первоначального уровня через сутки (до - 295,7±31, после - 316,6±27 тыс/мм3) До проведения процедуры тромбоциты были активированы, в пуле присутствовали Сг формы, содержание которых кореллировало с уровнем спонтанной агрегации (г=0 448 р>0,05) После процедуры тромбоцитофереза, на фоне достоверного повышения количества Д и снижения содержания Q форм, исчезали С2 тромбоциты и почти в 6 раз увеличивалось число ПТ (табл 3)

Таблица 3.

Содержание тромбоцитов разной формы и их агрегация у больных бронхиальной астмой до и после тромбоцитофереза * - р<0,05, ** - р<0,001 -по сравнению с данными до процедуры

Исследуемые группы Форма тромбоцитов агрегация

Д с, Сг ПТ спонтанная 2 мМ АДФ

Здоровые добровольцы 85^=7,2 11,8*2,7 0 2,0*0,7 1,2 ±«,1 20,6 ±1,6

Больные астма до процедуры 74,2*4,3 2,7*1.4 1,5*0,8 1,9*»,4 31,0

1 сутки после процедуры 55,5*6,4* 38,3*6,1** в 8,7±1,5* 1,3*6,2* 16*7 ±1,5*

*-р<0,05, **p<QsQl

Такая картина свидетельствует о стимуляции мегакариоцитопоэза и включении пути быстрой выработки тромбоцитов для пополнения утерянного пула Агрегационный ответ снижался, спонтанная агрегация исчезала у всех больных, а индуцированная была даже ниже нормальных величин у большей части больных Это может быть связано с повышением количества неактивнях, функционально инертных ПТ

Феохромоцитома (ФХЦ). Учитывая ранее установленный факт, что избыточная концентрация катехоламинов изменяет состав пула и функциональное состояние тромбоцитов у крыс, логично было предположить, что у больных ФХЦ возможна сходная картина Экскреция адреналина, норадреналина и ВМК с суточной мочой у больных ФХЦ в десятки раз выше, чем у здоровых лиц и больных АГ с подозрением на ФХЦ, которая после детального обследования была отвергнута

Таблица 4.

Соотношение различных форм тромбоцитов и экскреция катехоламинов

Группы Субпапуляции тромбоцита» (в % к общему числу клеток) катехшшиним

д с, с, ПТ А мкг/сут НА мкг/сут ВМК

Бальные ФХЦ (ИР=18) (пределыколзб) * 46,6*3,9 йй 20,6±2Д 0 л» 32,8±1,5 (17-49,7) ЙЯ 110,5^28 яй 266±ё5 10,7±3,8

Больные АГ (11=15) (прчйепы кгавзб ) & 43Д±4^ Яй 0 Й 3,?±0,5 (1,6-7,7) Й 5Д±3,4 ЯЙ 45,1±12,б 4,2±1*4

Здоровые добровольцы <п=22) (пределы каксб ) 82,0±1Д 15,7±М 0 2,3±0,2 С!,1-2.9) 4,8±1,8 1б,8±3,4 3,8±0,9

АГ - артериальная гипертонии А — адреналин; НА — нсрадреналян, ВМК — винилшшиндедьная кислота; * -р<0,02, ** - р<0,001

Содержание ПТ у больных ФХЦ также на порядок больше, чем у здоровых и больных АГ (р<0,001) Длина их может колебаться от 3 мкм до 10

мкм, а толщина - от 0,4 мкм до 1 мкм Клетки субпопуляции С2 не обнаружены (табл 4) Общее число тромбоцитов в периферической крови во всех случаях было сходным Агрегация тромбоцитов, индуцированная 2 мкмоль АДФ, у больных ФХЦ достоверно снижена по сравнению со здоровыми, хотя для больных АГ характерно даже некоторое ее повышение После операции удаления ФХЦ уровень экскреции катехоламинов и содержание ПТ нормализуются, что существенно отличает их от значений до хирургического вмешательства Изменения количества Д и С[ форм недостоверны После удаления опухоли агрегационный ответ также восстанавливается Спонтанная агрегация наблюдалась у всех больных после операции, что может быть вызвано воспалительным процессом, сопровождающим вмешательство, и у 3 из 15 пациентов с АГ

Присутствие в пуле тромбоцитов значительного количества инертных ПТ снижает его общую функциональную активность Этим можно объяснить невысокую агрегационную способность тромбоцитов у больных ФХЦ, что в свою очередь может служить причиной геморрагических осложнений Так, у одного из 18 больных ФХЦ (случай злокачественной АГ) во время операции удаления опухоли возникло массивное интраоперационное кровотечение В основе кровотечения лежало нарушение тромбоцитарного звена гемостаза с развитием ДВС-синдрома, в связи с чем больная умерла на третьи сутки после операции, несмотря на повторные переливания донорской крови Сходные осложнения отмечены и другими авторами

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество тромбоцитов биполярной формы значительно повышается только у больных с ФХЦ Содержание их в крови, превышающее 17% может служить диагностическим тестом ФХЦ (Авторское свидетельство № 1446527), что особенно важно в случаях с "нехарактерной" клинической симптоматикой и должно нацеливать на дальнейший поиск в плане топической диагностики ФХЦ

Воспаление. Тот факт, что ингерлейкины регулируют мегакариоцитопоэз, и в то же время их уровень повышается при воспалительных процессах разной природы, позволил нам предположить, что это может повлиять на появление в крови разных субпопуляций тромбоцитов

У больных пневмонией, острым пиелонефритом, с гнойными абсцессами, содержание С-реактивного белка в крови было повышено (>5мг/дл) Известно, что его повышение сопровождается увеличением уровня цитокинов, и в первую очередь ФНО-а На этом фоне в 3-4 раза увеличивалось содержание ПТ (р<0,001) и появилось до 4% С2 форм (р<0,001) Спонтанная агрегация регистрировалась у всех больных Выявлена корреляция между спонтанной агрегацией и содержанием С2 форм (г=0,596, р=0,02) АДФ-индуцированная агрегация у большинства больных оставалась в пределах нормальных величин

Еще более выраженной была картина у больных менингитом и менингококкцемией, при которых уровень цитокинов может быть повышен в сотни раз При генерализованных формах менингококковых инфекций у больных развивается тромбогеморрагический синдром, для различных фаз которого характерны либо тромбозы, либо геморрагические явления

У 8 больных количество тромбоцитов в момент взятия крови сохранялось в пределах нормальных величин и наблюдалась гиперкоагуляция Основную часть пула составляли тромбоциты, находящиеся на разных стадиях перехода из Д в С1 форму, Количество ПТ повышалось по сравнению с ЗД (8,6±0 7%) и в основном они имели веретенообразную форму Также обнаружено 10,4±1,4% С2 форм, большинство из которых находились во взаимодействии с другими тромбоцитами и редко оставались одиночными, что говорит об их суперактивности Отмечена повышенная способность тромбоцитов к эндоцитозу флуоресцентного маркера (35,3±4,1 уел ед р<0,05) и его экзоцитозу (31,4±2,6 уел ед, р<0,05) Можно предположить, что именно присутствие Сг форм приводит к такому эффекту У всех больных наблюдалась высокая спонтанная агрегация (2,3±0,4 отн ед), но в то же время

индуцировнная 5 мкмоль АДФ агрегация у 5 из них была ниже границ нормы (21,4±2,2%), а в образцах после регистрации оставалось 58,4±6,7% одиночных, не вошедших в агрегаты тромбоцитов Это свидетельствует об их рефрактерности, приобретенной в результате повышения в крови активирующих веществ, в первую очередь АДФ Несмотря на сниженную АДФ-индуцированную агрегацию, тот факт, что есть сверхактивные и способные спонтанно агрегировать тромбоциты, свидетельствует о высоком тромботическом потенциале этих пластинок и их вкладе в возникновение риска тромбоза, присущем этим пациентам Исследование образцов после проведения агрегации показало, что среди не включенных в агрегаты клеток отсутствовали Сг формы

Противоположная картина обнаружена у 6 больных с выраженными геморрагическими явлениями У всех этих пациентов наблюдались гипокоагуляция и тромбоцитопения Количество тромбоцитов не превышало 100 тыс/мм3 При этом в крови половину пула составляли ПТ (46,4±5,2%) У одного больного, который умер от желудочного кровотечения, их количество превышало 50% Остальная часть пула представлена Д формами и мелкими (менее 1,5 мкм), с гладкой поверхностью С1 формами Спонтанная агрегация у всех больных этой группы отсутствовала АДФ-индуцированная агрегация была снижена (22,3±3,1 отн ед), что еще раз подтверждает функциональную инертность ПТ Кроме того, на фоне повышенной способности к захвату флуорохрома (38,2±3,7 уел ед, р<0,001 по сравнению со здоровыми лицами), наблюдалось снижение его выброса (21,8±1,1 уел ед, р<0,001) Сходную картину мы наблюдали у больных феохромоцитомой Несмотря на принципиальные отличия в факторах, на фоне которых в крови повышается число ПТ, их вклад в функциональное состояние всего пула одинаков, что свидетельствует в пользу их инертности, несмотря на то, что это молодые формы

6. Атеросклероз.

Атеросклеротическое поражение сосудов часто сопровождается повышенным риском артериального тромбоза, развитие которого зависит от большого количества разнообразных факторов. Но одним из основных является функциональная активность тромбоцитов, так как именно они первыми взаимодействуют с поврежденной сосудистой стенкой.

в г

Рисунок 10. СЭМ С2 тромбоцитов у больных ИБС (А, Б - увеличение х5000) и ТЭМ (В - увеличение 42000, Г - увеличение 120000).

В крови больных ИБС с верифицированным коронарным атеросклерозом присутствует 2,8±1,1% С2 тромбоцитов. Чаше всего С2 встречаются в составе мелких агрегатов, состоящих из нескольких тромбоцитов, но могут оставаться и одиночными (рис. 10 А, Б). Они присутствуют в крови всех без исключения больных ИБС.

Анализ внутриклеточных структур выявил, что мембрана С2 формы рыхлая с множеством инвагинаций, приводящих к увеличению площади поверхности, внутриклеточные гранулы единичны и практически не видны плотные гранулы. В то же время сильно развита система открытых канальцев,

которая ответственна за захват и интернализацию чужеродных частиц (В, Г) Сложно сказать, почему эти молодые пластинки выходят из мегакариоцитов с такой внутренней организацией, но это еще один признак, по которому их можно отличить

Кроме того, в крови больных ИБС повышается количество ПТ, в среднем до 6,9±2,1% У отдельных больных их число достигает 10% Такая картина свидетельствует о повышении мегакариоцитопоэза и запуске пути быстрого поэза, что может быть вызвано как усиленным потреблением тромбоцитов, часто происходящим при атеросклерозе, так и сокращением срока их жизни до 6 суток Сходная картина наблюдалась и у больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий

У 20 из 53 больных ИБС регистрировалась спонтанная агрегация В целом по группе она соответствовала 1,5±0,9 отн ед и не коррелировала с содержанием тромбоцитов различных субпопуляций Но если разбить группу больных по содержанию в их крови С2 форм и выделить подгруппу с их числом менее 2% (группа 1) и более 2% (группа 2), можно отметить, что во вторую группу попали больные с высоким уровнем спонтанной агрегации (г=0,37б), что свидетельствует о влиянии этих форм на регистрацию общей активности тромбоцитов В то же время индуцированная 5 мкмоль АДФ агрегация у 5 больных из группы 2 была даже понижена В группе 1 спонтанная агрегация отсутствовала АДФ-индуцированная агрегация у 2 больных выходит за верхние границы нормы Такая картина свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к оценке морфо-функционального состояния тромбоцитов и факторов, влияющих на активность пула в целом

Показательным оказалось определение СОТ с помощью тромбоцитокрита, позволившее выявить положительную корреляцию между СОТ и числом С2 пластинок (г=0,372) Определение СОТ с помощью гемоанализатора не дает возможности обнаружить подобную закономерность

Различные антитромбоцитарные препараты влияют на функциональную активность и морфологическую гетерогенность пула

тромбоцитов Среди широко применяющихся в клинической практике препаратов, есть лекарства, которые могут менять морфофункциональные свойства тромбоцитов Наиболее широко используемый препарат - аспирин, в дозе 125 мг/сут не влияет на количество С2 форм и ПТ На фоне его приема спонтанная агрегация в среднем по группе достоверно снижается, но у отдельных больных сохраняется выше нормальных значений ОиЙикожЗа ег а1 (2007) показали, что присутствие «ретикулярных» тромбоцитов снижает эффективность терапии аспирином, что связано с увеличенным содержанием в них СОХ-1 и СОХ-2 По нашим данным, если в крови повышено количество С-2 форм, действие аспирина снижается, т е наблюдается резистентность к нему (р<0,05) Более эффективными в этом случае оказались тиклид, клопидогрель, трентал и индометацин На фоне приема этих препаратов количество С2 форм значительно снижается или они исчезают полностью (р<0,001), что можно расценивать как способность упомянутых лекарств воздействовать на мегакариоцитопоэз Известно, что метаболиты тиенопиридинов могут трансформировать рецепторы к АДФ на мегакариоцитах, в результате чего вышедшие из них тромбоциты попадают в циркуляцию уже с измененными свойствами (Сагепауе, ОасЬе1 1997) Спонтанная агрегация у большинства больных исчезает, а АДФ-индуцированная значительно снижается в ответ на прием тиклида и клопидогреля (р<0,05) Полученные данные свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием С2 форм Следует отметить, что при выявлении резистентности к аспирину оценка морфологической гетерогенности тромбоцитов может помочь в более правильном выборе терапии

Широко применяемые в настоящее время для лечения больных ИБС статины не обладают прямым действием на тромбоциты Но на их фоне наблюдается некоторое снижение количества Сг форм и уровня спонтанной агрегации И хотя симвастатин не приводит к достоверным изменениям, можно говорить об имеющейся тенденции к нормализации морфофункциональных свойств тромбоцитов на фоне его приема

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Принципиальные различия в морфологии и функциональной активности тромбоцитов закладываются на этапе мегакариоцитопоэза, и большинство качеств, характерных для этих форменных элементов, даны им при рождении

Целью данного исследования была попытка изучения природы появления в крови разных субпопуляций тромбоцитов, не связанных с их переходом из Д в Q формы К моменту начала работы было известно, что у человека и лабораторных животных существует 3 пути мегакариоцитопоэза, но уже к концу 80-х годов появились первые работы, свидетельствующие о четвертом пути рождения тромбоцитов, когда из мегакариоцитов выходят незрелые длинные фрагменты, названные ПТ В это же время стало ясным, что повышение плоидности мегакариоцитов приводит к усилению синтеза и накопления в них большего количества специфичных для тромбоцитов белков, которые затем передаются формируемым ими тромбоцитам В результате появляются крупные, получившие при рождении повышенное количество различных белков тромбоциты субпопуляции С2 Одновременно с этим, в конце 70-х - начале 80-х годов впервые заговорили о морфологической гетерогенности тромбоцитов, как о явлении, возможно влияющем на функциональное состояние пула тромбоцитов и их участие в тромбообразовании

Предложено выделять три субпопуляции - Д, ПТ и С2 тромбоцитов, появление которых в крови связано с мегакариоцитопоэзом Кроме того, во многих случаях наблюдаются различные переходные формы, которые связаны с активацией Д тромбоцитов, приводящей к их сферуляции Поэтому в отдельную субпопуляцию выделены тромбоциты Q, хотя их появление и не связано с поэзом До сегодняшнего дня практически не было данных о функциональном состоянии ПТ и достаточно ограниченными оставались знания о поведении С2 тромбоцитов Поскольку проводить прямые исследования мегакариоцитопоэза в условиях организма m vivo в большинстве случаев сложно (из-за необходимости

проводить трипанобиопсию), о нем можно судить по появлению в циркуляции тромбоцитов различных субпопуляций

Образование ПТ происходит и в норме, у здоровых людей и животных В крови присутствуют ПТ разной длины, редко, но достигающие значительного размера В основном циркулируют более короткие ПТ, находящиеся на разных стадиях отделения от них Д тромбоцитов После выхода в кровь ПТ депонируются в селезенке, где, по-видимому, происходит их окончательное созревание и затем вторичное поступление в циркуляцию уже в функционально активном виде Мы показали, что сами по себе ПТ функционально инертны и не способны к осуществлению ими в полной мере основных функций - адгезии, агрегации и реакции освобождения Это затрудняет их участие, как в процессе нормального гемостаза, так и в транспорте веществ Но, будучи молодыми клетками, они содержат все необходимые для жизнедеятельности белки, которые передаются отделяющимся от них Д тромбоцитам, уже функционально активным Можно предположить, что интенсивное включение такого пути поэза в условиях тромбоцитопении, с одной стороны, может быть связано с необходимостью быстрого пополнения утраченного пула тромбоцитов, а с другой - сокращения одновременного выброса пластинок с гемостатическим потенциалом Особенно важно это в условиях повышеного содержания в крови агоиистов тромбоцитов, наблюдаемое при стрессе или воспалении Так организм защищается от повышения гемостатической реактивности тромбоцитов Хотя могут быть ситуации, при которых на фоне повышения потребления тромбоцитов и тромбоцитопении в крови преобладают ПТ Это способствует развитию геморрагий, например, при ДВС-синдроме Так что появление ПТ в крови - это и физиологический процесс, и защитная реакция, но в ряде случаев может приводить и к катастрофическим последствиям

Другая ситуация связана с появлением в циркуляции субпопуляции Сг тромбоцитов Так как их продукция в результате тромбоцитопоэза редко отмечена в здоровом организме и связана с различными патологическими ситуациями, появление в крови Сг может говорить о развитии патологии Кроме

того, высокая функциональная активность С2 тромбоцитов и их агрессивность в отношении агрегатообразования, делают важным проведение контроля их появления в крови пациентов

Проведенные фундаментальные исследования делают простым и доступным подход к оценке и пониманию вклада тромбоцитов различных субпопуляций в процесс тромбообразования и возникновения риска тромбозов и геморрагий у пациентов различных групп

Наши исследования показали, что выявление морфологических и функциональных особенностей тромбоцитов разных субпопуляций может быть полезным при оценке риска тромбоза у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями Это особенно важно для назначения адекватной корригирующей терапии

ВЫВОДЫ.

1 Выявлена морфологическая гетерогенность популяции циркулирующих тромбоцитов в крови человека и животных в норме и при различных патологических состояниях Выделяются три различных по форме и функциям типа - дисковидные размером 2-4 мкм с гладкой поверхностью или небольшими кратерами открытой системы канальцев, биполярные протромбоциты длиной от 2 до 20 мкм веретенообразной или биполярной конфигурации, в отдельных случаях с перетяжками на концах, и большие сферические или «ретикулярные» тромбоциты размером 4-5 мкм с неровной, складчатой или слоистой поверхностью

2 Показано, что дисковидные тромбоциты, преобладающие в здоровом организме человека и животных, способны активироваться в кровотоке под действием различных факторов окружающей среды и преобразовываться в сферические формы размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий,

3 Протромбоциты в незначительных количествах присутствуют в крови здоровых лиц и животных, где способны отделять формирующиеся на их

концах зрелые дисковидные формы Количество протромбоцитов значительно возрастает в условиях гиперкатехоламинемии различной природы и может в отдельных случаях составлять половину пула

4 Доказано, что протромбоциты функционально инертны Они не способны к адгезии на различные поверхности, агрегации друг с другом и лейкоцитами, для них характерна сниженная способность к реакции освобождения Повышение их содержания в крови может приводить к развитию геморрагических явлений Увеличение уровня интерлейкинов и катехоламинов в крови повышает содержание протромбоцитов

5 Циркулирующие мегакариоциты присутствуют в крови здоровых лиц и могут быть выделены in vitro с фракцией тромбоцитов В условиях хранения тромбомассы они способны к тромбоцитопоэзу, который идет по пути продукции биполярных протромбоцитов

6 Большие сферические тромбоциты отсутствуют в крови здоровых лиц и животных Они появляются в условиях воспаления при повышении уровня провоспалительных медиаторов, при инфекции и атеросклерозе

7 Большие сферические «ретикулярные» формы - наиболее активная субпопуляция тромбоцитов Для них характерна развитая открытая система канальцев, увеличенная площадь мембраны за счет большого количества инвагинаций, пониженное количество внутриклеточных гранул, повышенный объем, склонность к агрегатообразованию

8 Аспирин не влияет на содержание протромбоцитов и больших сферических «ретикулярных» тромбоцитов в крови, но присутствие повышенного количества последних снижает эффективность действия аспирина и может быть одной из причин резистентности к нему Прием тиклида и клопидогреля приводит к полному исчезновению или значительному снижению количества больших тромбоцитов и одновременному подавлению спонтанной агрегации, что свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием таких форм

СЛИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Действие полисахарида менингоккка на функциональные свойства тромбоцитов / В И Покровский, В В Булычев, X Д Ломазова, A M Грачева, A M Полякова, Л.И Бурячковская, H Ю Мольков // Бюлл Эксперим Биол Мед - 1982 - №3 - С 8-10

2 Действие токсических субстанций стафилококка на функциональные свойства тромбоцитов / В В Малеев, A M Полякова, Л И. Бурячковская, О С Астрина // Бюлл Эксперим Биол Мед - 1986 -№12 - С 678-681

3 Коррегируюшее действие индометацина на изменение функции тромбоцитов при экспериментальной сальмонеллезной интоксикации / С Г Пак, M П Синельникова, Д Б Цукерман, Л.И Бурячковская, О С Ас грина // Материалы пленума Правления ВНОГ, Рига -1986 - С 654-655

4 Некоторые особенности тромбогеморрагического синдрома при генерализованной форме менингококковой инфекции, осложненной токсикоинфекционным шоком / A M Полякова, Л И. Бурячковская, О С Астрина, X Д Ломазова // Тер архив - 1986 - № 10 -С 38-42

5 Нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза при эндотоксинемии и коррекция их ингибитором биосинтеза простаглавдинов индометацином / С А Пак, M M Синельникова, Д Б Цукерман, M В Нелюбов, Д В Беликов, Л И Бурячковская, О С Астрина // Биологичнауки - 1987 -№7 - С 68-72

6 Морфо-функциональные особенности биполярных форм тромбоцитов / ЛИ Бурячковская, Р А Маркосян // Бюллетень ВКНЦ АМН СССР - 1987 -№1 -С 66-72

7 Нарушение РАСК при генерализованной форме менингококковой инфекции, осложненной токсико-инфекционным шоком / X Д Ломазова, A M Полякова, Л.И Бурячковская, О С Астрина, В В Малеев // Всесоюзная конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» - M, 1987 - С 347-348

8 Способ диагностики феохромоцитомы / Г Г Арабидзе, Г H Потапова, Л И Бурячковская, Р А Маркосян / Авторское свидетельство № 1446527 от 22 августа 1988 г

9 Функциональное состояние тромбоцитов при иерсиниозной инфекции / А В Кравченко, X Д Ломазова, A M Почякова, Л.И Бурячковская, В В Малеев // Вестник академии медицинских наук - 1991 -№10 - С 9-13

10 Pathogenesis of platelet activation by endotoxine / X Lomazova, A Polyakova, D Zukerman, V Maleev, L Buryachkovskaya // I Congress International Society for Pathophysiol poster/Abstract - M, 1991 -p 220-221

11 Морфофункциональные свойства биполярных тромбоцитов в норме и при некоторых патологических состояниях / ЛИ. Бурячковская, X Д Ломазова Г H Потапова // Всесоюзная конференция «Физиология и патология гемостаза» Тезисы доклада - Полтава, 1991 - С 68

12 Корреляция между формой и функциями тромбоцитов при стрессе / Л.И. Бурячковская, О А Тюрмина, Е Ю Бычкова, О А Семенова // Всесоюзная конференция «Физиология и патология гемостаза» Тезисы доклада - Полтава, 1991 - С 69

13 Platelet shape change, aggregation and adhésion m diagnostic of pheochromocytoma m hypertensive patients / L Bourjachkovskaya, G Arabidze, G Potapova, I Uchitel // J Hypertension - 1992 - V 10 №4 - P 190

14 Role of mterleukm-2 and mononuclear cells m platelet tumor interaction / L Oleksowicz, D Zuckerman, К D Lomazova. L. Bourjachkovskaya, О S Astnna, E G Slavma // Invasion Metastasis - 1994 -№13 -P 119-131

15 Исследование морфочогии тромбоцитов у больных бронхиальной астмой до и после тромбоцитофереза /АР Татарский, К М Алиева, Л.И. Бурячковская, JIЕ Петрова, А Г Чучалин //Терархив - 1995 -№3 - С 39-41

16 Platelet shape change ш essential hypertensive patients with and without coronary atherosclerosis / L Bourjachkovskaya, Ye Parfyonova, T Polevaya, G Potapova, I Uchitel // 7th European Meeting on Hypertension Abstract/poster - Milan, 1995 - P 29

17 Значение морфо-функциональной гетерогенности тромбоцитов при различных патологических состояниях, сопровождающихся тромбогеморрагическими явлениями / Л И Бурячковская, И А Учитель, Г Н Потапова // Всероссийская конференции «Патология гемокоагуляции» Тезисы доклада -М 1995 - С 34-36

18 Опыт длительного лечения ловастатином больных с гетерозиготной формой наследственной гиперхолестеринемии / X Г Алиджанова, А О Елисеев, М Г Творогова, ЛИ Бурячковская, И А Учитель, В В Кухарчук //Тер архив -1997 - № 8 - С 13-17

19 Особенности морфо-функционильного состояния тромбоцитов у больных с сосудистыми патологиями разного генеза /ЛИ Бурячковская, И А Учитель, Г Н Потапова, Е Я Позин, 3 А Габбасов, Е В Парфенова, Г Г Арабидзе // Симпозиум «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром Проблемы лечения» Тезисы доклада - М, 1997 - С 33-34

20 Simvastatin effect on platelet activity m patients with familial hypercholesteriaemia / Kh Ahdhanova, L Bourjachkovskaya, I Uchitel, Z Gabbasov, V Kukharchuk / Atherosclerosis 1997 -V 134 -№ 1,2 -P 182

21 Platelet count, morphology and aggregation in patients with familial hypercholesterolaemia ' L Bourjachkovskaya, Kh Ahdhanova, I Uchitel, Z Gabbasov, V Kukharchuk // Atherosclerosis 1997 -V 134 № 1,2 -P 183

22 Семейная гиперхолистеринемия фактор риска церебрального атеросклероза / X Г Алиджанова, Л И Бурячковская, М А Творогова, В В Кухарчук // Терапевтический архив - 1997 -№10 - С 26-32

23 Platelet morphology, aggregation and adhesion in patients with pheochromocytoma / L Bourjachkovskaya, I Uchitel, G Potapova //J Clm Invest - 1997 -V 27 №1 -P 123-124

24 Myocardial ischemia and platelet function m patients with essential hypertension / Z Gabbasov, Ye Parfyonova, Ye Djakonova, L Bourjachkovskaya. // J Clin invest - 1997 - V 27 №1 -P 122

25 Platelet moiphology and functions in vascular diseases / L. Bourjachkovskaya, I Uchitel, G Potapova, Z Gabbasov, E Popov, G Arabidze / J Amer College Cardiol, Suppl - 1998 - С 124C

26 Platelets and erythrocytes involvement m cobalt-mduced thrombosis m mice / S Dugin, L Bouryachkovskaya, T Orlova, I Uchitel, Z Gabbasov, T Dugma / Thromb Haemost - 1999 -Suppl 1 - P 778

27 Platelet activation m patients with hypertensive crisis / L Bouryachkovskaya, I Uchitel, G Potapova, T Polevaya G Arabidze, A Sumarokov // 9th European Meeting on Hypertension Abstract/poster - Milan, 1999 -P SI85

28 Особенности морфологии тромбоцитов у больных феохрочацитомой / ЛИ Бурячковская, ГН Потапова, И А Учитель, Г Г Арабидзе //Кардиология - 1999 - №6 -С 49-53

29 Platelet activity and thrombo-haemorrhagical complications m patients with hypertension / G Potapova, L Bourjachkovskaya, I Uchitel //JHypertens -2000 -V 18, SuppH С S59

30 Number and morphology of platelets incapable to aggregation and adhesion / L Bourjachkovskaya, I Uchitel, A Rvazanov, G Potapova // Thromb Haemost - 2001 - V 86, Suppl 1 -P 1052

31 Number and moiphology of platelets incapable of aggregation / L Bouriachkovskaia, I Uchitel, G Potapova //Platelets -2002 -V 13 № 5/6 -P 330-331

32 Mean platelet volume and the number of large platelet m atherosclerotic patients / L Bouriachkovskaia, I Uchitel, E Rogova, A Sumarokov, G Tchernina // Atherosclerosis - 2002 - V 163, Suppl 3/2 - P 78-79

33 Influence of high dose of catecholamines on appearance of elongated platelets m circulation / G Potapova, L. Bouriachkovskaia, V Sitina, I Uchitel // Molecular Biology of Cell - 2002 -V 13 P 125a

34 Platelet activity and circulating leukocyte-platelet aggregates can be markers of thrombotic and inflammatory processes in patients with coronary atherosclerosis / L. Bouriachkovskaia, E Rogova, I Uchitel, A Sumarokov, N Dovlatova // J Thrombosis Haemostasis - 2003 - V 1, suppl 1 -P 1805

35 Leukocyte-platelet interaction modulation by lipids different density and inhibition by high dose of catecholmmes / N Dovlatova, L Bouriachkovskaia, I Uchitel, V Masenko // J Thrombosis Haemostasis -2003 -V 1, suppl 1 -P 0193

36 Влияние активации тромбоцитов на образование лейкоцитарно-тромбоцигарных агрегатов у больных ишемической болезнью сердца / И А Учитель, Л.И. Бурячковская, Н Л Довлатова, А Б Сумароков // Первая Всероссийская научная Конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" Тезисы доклада -М,2003 - С 161-162

37 Способность тромбоцитов к взаимодействию и необходимость дифференциального подхода к ее коррекции у больных с сердечно-сосудистыми патологиями / ЛИ Бурячковская, И А Учитель, А Б Сумароков, В П Масенко // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов, Москва - 2003 - приложение №2 - С 27

38 Platelet activity and platelet-leukocyte conjugates m hypertensive patients with famihan hypercholesterolaemia / L Bouriachkovskaia , N Dovlatova, Sumarokov A Masenko V //13th European Meeting on Hypertension Abstract/poster - Milan, 2003 - P S276

39 Relation of thrombo-haemorrhagical complications with platelets activity and action prazosin m patients with paroxysmal hypertension / G Potapova, L. Bourjachkovskaya, V Sitma, I Uchitel //13th European Meeting on Hypertension Abstract - Milan, 2003 -P SI 87

40 Гетерогенность тромбоцитов и ее роль в развитии тромботических осложнений при сердечно-сосудистых патологиях / Л.И Бурячковская, И А Учитель, А Б Сумароков, Н Л Довлатова // Симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами и нарушениями гемостаза Тезисы доклада - С-Петербург, 2004 - С 71

41 Leukocyte-platelet aggregates as a marker of inflammation / L Bouriachkovskaia, I Uchitel, N Dovlatova, T Pogorelova // Platelets - 2004 - V 16 № 8 - P 483-484

42 Морфо-функциональная гетерогенность тромбоцитов и ее значение для организма человека и животных /ЛИ. Бурячковская, И А Учите чь // Научные труды съезда физиологов СНГ Тезисы доклада - Сочи, 2005 - Т 1 - С 93-94

43 Formation of small size platelet aggregates as a risk factor of thrombosis m hypertensive patients / L. Bouriachkovskaia, I Uchitel, N Dovlatova, T Pogorelova, G Potapova //15 Meeting ESH Abstract/poster - Milan, 2005 - P S75

44 Circulating leukocyte-platelet aggregates and biochemical markers of inflammation in patients with coronary heart disease and depression / N L Dovlatova, LI Bouriachkovskaia, E О Poliakova, A V Zonn, IA Uchitel, А В Sumarokov, V P Masenko // Eur J Cardiol Abstract -2006 - V 27 (suppl) - P 756

45 Platelet activation and biochemical markers of inflammation m patients with CHD and depression / L Buriachkovskaia, E Poliakova, A Zonn, I Uchitel, V Masenko, A Sumarokov, N Dovlatova, T Kuznetsova // Atherosclerosis - 2006 - V 7 №3 - P 283

46 Platelet activation and red blood cells abnormalities m coronary heart disease / ТЕ Pogorelova, А В Sumarokov, L.I Buriachkovskaia, IA Uchitel // Atherosclerosis - 2006 - V 7№3 -P 394

47 Активация тромбоцитов и маркеры воспаления у больных ИБС с депрессивными расстройствами / ЛИ. Бурячковская, Е О Полякова, А В Зорин И А Учитель, H Л Довлатова, В П Масенко, А Б Сумароков, T А Кузнецова, Т Л Погорелова, Е И Чазов // Тер архив -2006 -№10 - С 9-14

48 Влияние депрессивных расстройств на развитие и исход сердечно-сосудистых забо теваний Обзор /ЛИ Бурячковская, Е О Полякова, А Б Сумароков // Тер архив -

2006 -№11 - С 82-87

49 Полифункциональность тромбоцитов, их активация и возможности ее оценки / Л.И Бурячковская, И А Учитель, А Б Сумароков, Е Г Попов // Сердечно-сосудистые заболевания Бюллетень НЦССХ им А H Бакулева РАМН -2007 -T 8№2 С 43-50

50 Modulation of platelet reactivity by erythrocytes m coronary arthery disease patients taking aspirin /TE Shirokova, LI Buriachkovskaia, IA Uchitel, А В Sumarokov, E G Popov // J ThrombHaemost Abstract -2007 - V 5 Suppl 2 -P W-367

51 Circulating proplatelets in healthy subjects and patients / LI. Buryachkovskaya, IA Uchitel, А В Sumarokov, E G Popov // J Thromb Haemost Abstract - 2007 - V 5 Suppl 2 - P S-253

52 Витание эритроцитов и лейкоцитов на чувствительность тромбоцитов к антиагрегантной терапии / Л.И Бурячковская, И А Учитель, А Б Сумароков, ЕГ Попов // Научно-практический журнал Клинико-лабораторный Консилиум -2007 -№16 - С 64

53 Функциональная активность тромбоцитов и их способность захватывать и интернализировать вирусы у больных ДКМП /ЕМ Гуппало, А Б Сумароков, И А Учитель, Л И Бурячковская // Третья Всероссийская конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» Тезисы доклада - M, 2007 - С 27

54 Клеточные и биохимические предпосылки применения Омега-3 ПНКЖ для профилактики и лечения ИБС /ЛИ Бурячковская, А И Каминный, В В Кухарчук, H А Мазур, А Б Сумароков, И А Учитель, T Е Широкова // Российский медицинский журнал -

2007 -Т 15, №4 - С 290-295

55 Участие гликопротеина IIB-IIIA в спонтанной агрегации тромбоцитов / О В Сироткина, AM Заботина, ЕБ Тараскина, Л.И. Бурячковская, И А Учитель, С Г Хаспекова, ТВ Вавилова, А Л Шварцман, А В Мазуров // Бюлл Эксперим Биол и Мед - 2007 - Т 143, № 4 - С 398-401

СОКРАЩЕНИЯ

АДФ - аденозиндифосфорная кислота

АО - акридиновый оранжевый

ВМК - ванилилминдальная кислота

Д - тромбоциты дисковидной формы

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

2ДГ - 2-дезокси-Д-глюкоза

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ОТП - обогащенная тромбоцитами плазма ПТ - протромбоциты

С1 - сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий, активированные формы

С2 - большие сферические тромбоциты размером 3-4 мкм с выраженными инвагинациями плазматической мембраны

СОТ - средний объем тромбоцитов

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия

ФНОа - фактор некроза опухоли

ФХЦ - феохромоцитома

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат №

СОХ - циклооксигеназа

^ - иммуноглобулин

ТвБ-р - трансформирующий фактор роста

Подписано в печать 28 ноября 2007 г

Формат 60x90/16

Объем 2,0 п л

Тираж 100 экз

Заказ№ 281107103

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912Y772801001

Адрес 117292, г Москва, ул Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тел 740-76-47, 125-22-73 http //www univerprmt ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Бурячковская, Людмила Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гетерогенность циркулирующих тромбоцитов Теории тромбоцитопоэза

История исследования происхождения тромбоцитов Образование тромбоцитов Продукция тромбоцитов путем фрагментации цитоплазмы

Способность к образованию пузырьков или почкование

Инвагинация мембраны с дальнейшим отделением тромбоцитов в виде бус

Формирование и отшнуровка протромбоцитов Циркулирующие мегакариоциты Полиплоидность ядра мегакариоцитов и ее значение для тромбоцитопоэза

Плоидность мегакариоцитов и средний объем тромбоцитов (СОТ)

Молекулярный механизм регуляции мегакариоцитопоэза

ТПО и его рецептор c-Mpl

Транскрипционный фактор GATA-1.

Транскрипционный фактор NF-E

Регуляция мегакариоцитопоэза цитокинами

Интерлейкин

Интерлейкин

Интерлейкин

4.4.4. Интерлейкин

4.4.5. Интерлейкин

4.4.6. Интерлейкин

4.4.7. Интерлейкин

4.4.8. ГМ-КСФ

4.4.9. Эритропоэтин

4.5. Молекулы адгезии

4.6. Катехоламины

5. Апоптоз мегакариоцитов

6. Нарушения мегакариоцитов и связанные с этим изменения в тромбоцитах.

7. Дисковидные тромбоциты и их активация

8. Протромбоциты или биполярные тромбоциты

9. Большие и ретикулярные тромбоциты МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Подготовка обогащенной тромбоцитами плазмы

1.1. Растворы антикоагулянтов

1.2. Взятие крови и выделение ОТП

2. Изучение морфологии тромбоцитов

2.1. Химические реактивы

2.2. Подготовка образцов

2.3. Визуализация тромбоцитов

3. Изучение структуры тромбоцитов

4. Функции тромбоцитов

4.1. Агрегационная активность

4.2. Адгезия тромбоцитов

4.3. Реакция эндо-экзоцитоза

4.4. Средний объем тромбоцитов (СОТ)

5. Выделение и хранение концентратов тромбоцитов

6. Модели животных

6.1. Создание модели гипер и гипокатехоламинемии у крыс

6.1.1. Вживление катетеров

6.1.2. Модель метаболического стресса

6.1.3. Модель демедулированных крыс

6.1.4. Введение фармакологических препаратов

6.2. Определение концентрации эндогенных катехоламинов

7. Группы здоровых лиц и пациенты

7.1. Здоровые лица

7.2. Пациенты

8. Статистическая обработка результатов РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности морфологии и функций тромбоцитов человека и животных

1.1. Морфо-функциональное состояние тромбоцитов человека

1.2. Влияние различных антикоагулянтов на морфо-функциональное состояние тромбоцитов человека

1.3. Влияние способа взятия крови на морфо-функциональное состояние тромбоцитов человека

1.4. Морфо-функциональные особенности тромбоцитов животных разных видов

2. Роль катехоламинов в регуляции тромбоцитарного пула

2.1. Влияние способа взятия крови на содержание ПТ в крови крыс

2.2. Состояние тромбоцитов при гиперкатехоламинемии, вызванной метаболическим стрессом Морфологические свойства ПТ крыс Функциональные особенности ПТ крыс Агрегационная способность Адгезия

Реакция освобождения (экзоцитоз)

Взаимодействие ПТ с лейкоцитами

Влияние демедуляции крыс на появление ПТ в крови

Влияние наркоза на морфо-функциональные особенности тромбоцитов у крыс

Влияние адреноблокаторов на содержание ПТ в крови крыс

Возможность образования ПТ в условиях in vitro

Влияние различных веществ на трансформацию ПТ человека в условиях in vitro

Роль С а в поддержании формы ПТ

Влияние интерлейкинов на тромбоциты in vitro

Состояние тромбоцитарного пула в условиях хранения тромбомассы

Гетерогенность тромбоцитов человека с различными патологиями

Состояние тромбоцитов больных бронхиальной астмой после лечения с помощью тромбоцитафереза Тромбоциты больных феохромоцитомой Морфо-функциональное состояние тромбоцитов у больных с воспалением Атеросклероз

Влияние дезагрегантной терапии на функциональную активность и морфологическую

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

2ДГ - 2-дезокси-Д-глюкоза

2N-512N - плоидность ядра

Р-ТГ - р-тромбоглобулин

АДФ - аденозиндифосфат

АО - акридиновый оранжевый

АТФ - аденозинтрифосфат

БТП - бедная тромбоцитами плазма

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колоние-стимулирующий фактор ГП - гликопротеин

ГП Ib-V-IX - гликопротеиновый комплекс плазматической мембраны, в котором к гликопротеину lb присоединены ГП V и ГП IX

ГП Ilb/IIIa - специфичный гликопротеиновый рецептор, ответственный за взаимодействие с фибриногеном

ГП VI - гликопротеин VI, рецептор к коллагену, ответственный за активацию тромбоцитов

Д - тромбоциты дисковидной формы ДМС - демаркационная мембранная система ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ИЛ - интерлейкин

ИТП - иммунная тромбоцитопеническая пурпура ИФ-у - интерферон-у кД - килодальтон

КСФ-1 - колоние-стимулирующий фактор-1 ЛТА - лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты мкм - микрометр

М-КСФ - макрофагальный колоние-стимулирующий фактор мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ОТП - обогащенная тромбоцитами плазма

ПТ - протромбоциты

ПТС - плотная тубулярная система

С1 - сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий, активированные формы

С2 - большие сферические тромбоциты размером 3-4 мкм с выраженными инвагинациями плазматической мембраны

СОК - система открытых канальцев

СОТ - средний объем тромбоцитов

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ТПО - тромбопоэтин

ТФ-4 - тромбоцитарный фактор

ТФР-|3 - трансформирующий фактор роста

ТХА2 - тромбоксан А

ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия ФВб - фактор Виллебранда фл - фемтолитры

ФНОа - фактор некроза опухолей альфа

ФХЦ - феохромоцитома цАМФ - циклический аденозинмонофосфат цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

Вс1-2 - семейство антиапоптозных белков Вс1

Bcl-xL - антиапоптозный белок c-Mpl - рецептор тромбопоэтина

FGF - fibroblast growth factor - фактор роста фибробластов

GATA1 - erythroid transcription factor - эритроидный транскрипционный фактор HLA-DR - human leukocyte antigen - антиген лейкоцитов человека hNUDC - a human homolog of a fungal nuclear migration protein - человеческий гомолог грибкового белка ядерной миграции hNUDC - human homolog of a fungal nuclear migration protein - человеческий гомолог белка ядерной миграции

ICAM - intercellular adhesion molecule - межклеточная молекула адгезии Ig - иммуноглобулин

МАРК - mitogen-activated protein kinase - митогенактивируемая протеинкиназа NF-E2 - nucltar factor erythroid 2 - эритроидный ядерный фактор 2 NK-клетки - натуральные киллеры N0 - оксид азота

PDGF- platelet derived growth factor - фактор роста выделяемый тромбоцитами УСАМ - vascular cell adhesion molecule - сосудистая молекула клеточной адгезии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием"

Согласно современным представлениям, тромбоциты играют ведущую роль в запуске процесса образования тромба. Активация тромбоцитов приводит к изменению их формы из дисков, покоящихся клеток в циркулирующей крови, в сферы - активированные клетки, с повышенной способностью к адгезии, образованию агрегатов и секреции биологически активных соединений, которые непосредственно участвуют или влияют на гемостаз. Кроме наиболее изученного участия тромбоцитов в гемостазе, они играют важную роль в иммунных процессах и воспалении (Weyrich A., Zimmerman G., 2004; Gawaz М, Langer Н. et.al., 2005). Активированные тромбоциты способны вступать во взаимодействие с лейкоцитами, формируя JITA. Образование JITA происходит на ранних стадиях развития воспалительного процесса в результате активации тромбоцитов под действием появившихся в крови провоспалительных медиаторов, в том числе цитокинов, и играет важную роль в патогенезе воспаления.

Провоспалительные медиаторы, освобождаемые в основном активированными моноцитами и макрофагами, такие как ИЛ-1(3, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11 и ФНОа, а также эндотоксины, в первую очередь воздействуют на эндотелий сосудов. В его клетках синтезируются молекулы адгезии, делающие поверхность эндотелия «липкой» — клетки приобретают провоспалительный и прокоагулянтный фенотип. Вслед за этим происходит активация тромбоцитов — ключевое событие не только гемостаза и тромбоза, но и воспалительного и иммунного ответов. В результате этого запускается замкнутый каскад реакций. С одной стороны, повышается способность тромбоцитов к адгезии, агрегации и освобождению из них ряда прокоагулянтных и провоспалительных веществ, в том числе и цитокинов, стимулирующих активное движение различных типов лейкоцитов к очагу воспаления. С другой стороны, взаимодействие тромбоцитов с лейкоцитами приводит к внутренней перестройке последних и выбросу из них прокоагулянтных факторов (в частности тканевого фактора), провоцирующих реакцию свертывания крови. В итоге риск тромботических осложнений возрастает. Кроме того, увеличивается синтез и секреция цитокинов моноцитами, усиливается их прикрепление и передвижение внутрь сосудистой стенки, подавляется апоптоз, в результате чего они продолжают жить и поддерживать в крови высокий уровень цитокинов (Strukova S., 2006).

Благодаря присущей им способности к экзо-эндоцитозу, тромбоциты участвуют в защите организма-хозяина от вирусов и бактерий (Youssefian Т., Drouin A. et al., 2002; White J. 2005), транспорте веществ, регуляции сосудистого тонуса (Harrison Р., 2005), росте, метастазировании и уничтожении раковых клеток (Okada М., Sagawa Т. et al., 1996; Gupta G., Massague J., 2004), a также в ангиогенезе и ремоделировании сосудов. Взаимодействуя с клетками-предшественниками из костного мозга, тромбоциты помогают привлечению их в зоны повреждения сосудов и выделяют большое количество ростовых факторов, влияющих на рост и развитие сосудистой сети (Jurasz P., Santos-Martinez М., Radomska A. et al., 2006; Massberg S., Konrad I., Schurzinger K. et al, 2006).

Исследование способности тромбоцитов к активации, их структурных и функциональных изменений является важной проблемой, так как понимание механизмов, лежащих в их основе, расширяет возможности профилактики и коррекции нарушений в системе гемостаза, не только отягощающих течение заболевания, но нередко определяющих его исход.

Актуальность исследования. Неоднородность циркулирующих тромбоцитов периферической крови была обнаружена еще в начале прошлого века. Первоначально рассматривались только морфологические и количественные изменения, часто варьирующие при различных патологических состояниях. Но в дальнейшем было показано, что различия наблюдаются не только в их количестве, морфологии, возрасте, плотности, объеме, но и в функциональной активности, содержании белков, гликогена, ферментов и рецепторов, что позволило говорить о гетерогенности пула тромбоцитов (Karpatkin S., Khan Q., Freedman M., 1978).

Связь этих особенностей друг с другом не однозначна и остается до конца невыясненной. При отсутствии патологии, все эти свойства клеток у одного лица сохраняются в течение длительного времени и имеют незначительные индивидуальные колебания (Thompson С., Jakubowski J., 1988).

Основная часть циркулирующих интактных тромбоцитов в норме имеет характерную дисковидную форму со средним диаметром 3,1 ±0.3 мкм, толщиной 1,0±0,2 мкм и средним объемом до 10 фл. (White J., 1987). Двухслойная фосфолипидная мембрана тромбоцитов, с большим количеством включенных в нее интегральных гликопротеинов и белков, служит барьером, который опосредует взаимодействие клеток с изменяющейся внешней средой и запуск начальных этапов активации. Соединение лигандов с рецепторами запускает определенную последовательность изменений, которая, через систему реакций в цитоплазме, передается к эффекторным структурам, реализующим функциональные реакции клетки (Clemetson К., 1995).

Масспектрометрический анализ показал, что в тромбоцитах содержится более 700 белков, из которых на сегодняшний день идентифицированы только около 200 (Coppinger J., Cagney G., Toomey S. et al., 2004). Большинство из них хранится в а-гранулах, плотных тельцах и лизосомах. Они поступают туда как в ходе мегакариоцитопоэза, так и путем включения из плазмы. Тромбоциты, являясь секреторными клетками, после стимуляции высвобождают большое число хранящихся активных субстанций, выполняя таким путем транспортную функцию и регулируя многие процессы в организме, в том числе и мегакариоцитопоэз.

Поверхность интактных дискоцитов гладкая, с многочисленными небольшими (0,2 - 0,3 мкм) углублениями, которые служат местами соединения плазматической мембраны и каналов открытой канальцевой системы. Благодаря этому происходит обмен веществ между внутриклеточной и окружающей средой, а также выполняется захват вирусов, бактерий и инородных частиц (Zucker-Franklin D., 1981; Escolar G., White J., 1991; White J., 2006). При активации происходит быстрое, занимающее менее секунды, изменение формы пластинок из дисковидной, которая характерна для их циркуляции в кровотоке здорового организма, в сферическую. На разных этапах этого процесса могут появляться переходные формы. Первоначально возникают дисковидные формы с измененной поверхностью - от гладкой до складчатой, с единичными или множественными псевдоподиями различной длины. В дальнейшем тромбоциты меняют свою форму из дисковидной на сферическую. На них могут появляться различные выросты, начиная с бугорков и заканчивая псевдоподиями. По их количеству и структуре предлагалось судить о степени активации (Corash L., 1990). Долгое время переход из дисковидной в сферическую форму рассматривался в качестве одной из причин гетерогенности тромбоцитарного пула. Именно на основе такого взгляда были созданы классификации тромбоцитов по форме, размеру и плотности, которые долгое время применялись для определения риска тромботических осложнений у больных (Дроздова В.А., 1955; Безносиков Б.О., Измайлова Е.Ф., 1961; Тоцкая А.А., 1967; Кассирский И.А., Алексеев Г.А., 1970). Кроме покоящихся дисковидных и активированных сферических, были обнаружены и другие по форме тромбоциты, которые R. Allen относил к атипичным или артефактным (Allen R., Zacharski L., Widirtski S. et al., 1979). Но в дальнейшем появились неопровержимые данные, что такие формы появляются в результате их рождения при мегакариоцитопоэзе (Kosaki G., 2005).

Различия в размере, плотности и реактивности кровяных пластинкок закладываются при тромбоцитопоэзе (Thompson С., Eaton К., Princiotta S. et al., 1982; Martin J., Shaw Т., Heggie J. et al., 1983). Предположение о том, что «гиганты костного мозга порождают карликов крови» высказано более 100 лет назад. Но только в последние два десятилетия получено подтверждение об изначальной продукции ими разных по форме тромбоцитов (Gladwin A., Martin

J., 1990; Hartwig J., Italiano J., 2003). В процессе созревания мегакариоцит проходит три стадии: мегакариобласт, промегакариоцит и мегакариоцит. Количественно соотношение этих групп выражается как 1,0:1,2:4,1. Общее транзитное время созревания в условиях культуры составляет 60 часов, соответственно для мегакариобластов - 11, промегакариоцитов - 15 и мегакариоцитов - 34 час. В норме мегакариоциты редко покидают костный мозг и там продуцируют кровяные пластинки, которые затем попадают в кровоток. Но единичные мегакариоциты могут выходить в кровоток и затем, попадая в капилляры альвеол легких, производить там тромбоциты. В условиях патологии (острые инфекции, гепатит, кровопотеря, онкологические заболевания, при операциях аортокоронарного шунтирования) в десятки раз возрастает количество циркулирующих мегакариоцитов в крови. Они могут быть причиной развития нарушений мозгового кровообращения и легочных тромбоэмболий (Bowles В., Lee J., Dang С., 2001;Van Dijk D., Jansen E., Hijman R., 2002; Mark D., Newman M., 2002).

Возможны следующие пути появления тромбоцитов из мегакариоцитов: 1) образования демаркационных мембран в цитоплазме мегакариоцитов с быстрым одномоментным выбросом тромбоцитов, носящим взрывной характер; 2) образование эндоплазматических пузырей, содержащих пластинки с последующим их отделением от материнской клетки; 3) инвагинация мембраны с дальнейшим отделением тромбоцитов в виде бус; 4) появление на поверхности волосков и дальнейшее образование из цитоплазмы псевдоподий, проникновение которых в синусы костного мозга сопровождается отшнуровкой тромбоцитов. Мегакариоцитопоэз из циркулирующих клеток в основном происходит по четвертому типу. В результате него рождаются незрелые формы тромбоцитов, которые были названы протромбоцитами. В дальнейшем уже в кровотоке они разделяются на тромбоциты дисковидной формы. Ультраструктура поверхности мембран клеток мегакариоцитарного ряда определяет, на какой стадии созревания находятся клетки. Более ранним стадиям созревания соответствует гладкая, лишенная выростов цитоплазматическая мембрана. Далее происходит появление волосков и различного размера удлиненных выростов, что вероятнее всего связано с начальной стадией образования протромбоцитов. По мере созревания мембрана становится неровной и приобретает складчатую конфигурацию. На ней появляются пузырьки и часто видны соединенные с материнской клеткой тромбоциты (Вашкинель В., Петров М., 1982).

Важную роль в продукции тромбоцитов играет полиплоидизация ядра мегакариоцитов (Ravid К., Lu J., Zimmet J. et al., 2002). Плоидность мегакариоцитов из костного мозга обычно варьирует от 4N до 64N. До 50% мегакариоцитов здорового человека имеют плоидность 16N. Остальные клетки приблизительно в равном соотношении имеют плоидность ниже или выше. Уже на ранних стадиях созревания, при плоидности 4N, когда мегакариоциты морфологически еще трудно отличить от других клеток мононуклеарного ряда, в них появляются специфичные для тромбоцитов белки. Не смотря на то, что уровень этих белков значительно ниже, чем в зрелых мегакариоцитах, их присутствие свидетельствует о способности этих молодых клеток передавать основные, специфичные свойства, тромбоцитам. Однако нет однозначных данных о конкретных условиях и стимулах, которые приводят к запуску поэза мегакариоцитами с низкой плоидностью. Максимальная плоидность ядра соответствует 128N, после чего эндомитоз прекращается и происходит апоптоз клеток. Повышение плоидности приводит к накоплению в цитоплазме более высокого количества биологически активных веществ, которые могут передаваться рожденным ими тромбоцитам. Такие мегакариоциты дают начало крупным, большим сферическим, или часто называемым «ретикулярными» тромбоцитам. Состав окружающей среды является определяющим фактором созревания и полиплоидизации мегакариоцитов и именно от него зависит, какой из путей поэза будет иметь место (Slayton W., Wainman D., Li X. et al.,

2005). Влиять на мегакариоцитопоэз могут транскрипционные факторы, поэтины и цитокины, а также молекулы адгезии и катехоламины.

В настоящее время выделяют три формы тромбоцитов, появление которых в кровотоке зависит от стояния мегакариоцитов и в первую очередь от их плоидности. Это дисковидные тромбоциты (Д), характерные для кровотока здоровых лиц и рожденные зрелыми мегакариоцитами с плоидностью 16N и 32N. Удлиненные биполярные протромбоциты (ПТ), которые быстро поступают в кровь при необходимости восстановления пула тромбоцитов при тромбоцитопении, рождаются из мегакариоцитов, находящихся на ранних стадиях созревания и имеющих низкую плоидность (4N, 8N и 16N). Большие сферические («ретикулярные») тромбоциты (Сг) размером 4-5 мкм, имеющие слоистый вид или множественные бабулярные образования на мембране и высокое содержание мРНК, появляются из мегакариоцитов с плоидностью выше 64N при патологических состояниях, не связанных с генетическими нарушениями. Кроме этих трех, зависящих от мегакариоцитопоэза кровяных пластинок, выделяют четвертую субпопуляцию - сферические тромбоциты размером 1 -2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий (Ci). За исключением редких патологий, их появление в крови не связано с мегакариоцитопоэзом, а происходит в результате активации кровяных пластинок и изменения их формы из дисковидной в сферическую.

Большинство исследований функциональных свойств тромбоцитов проводится на Д тромбоцитах и их производных - Cj формах. Что касается ПТ и Сг форм, они остаются мало изученными, данные о них носят в основном описательный характер, а сведения о функциональных свойствах и роли в различных процессах единичны и носят противоречивый характер.

Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования было выяснение взаимосвязи между морфологической гетерогенностью тромбоцитов, их функциональными свойствами и участием различных субпопуляций в гемостазе и тромбозе.

К задачам исследования были отнесены:

1. выявление и характеристика различных субпопуляций тромбоцитов, циркулирующих в крови человека и животных в норме;

2. отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты;

3. подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови;

4. изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок - в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов;

5. поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro;

6. исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагий;

7. изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов.

Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопрос: существует ли взаимосвязь между морфологией тромбоцитов, приобретенной ими в ходе мегакариоцитопоэза, и функциональной активностью пластинок, а также, какие факторы внешней среды могли бы оказаться решающими в появлении различных субпопуляций?

Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые. Для исследования особенностей морфологии и функций тромбоцитов была использована модель метаболического стресса у крыс. Это позволило выявить условия повышения количества протромбоцитов в крови и провести исследование редко встречающихся в норме форм тромбоцитов. До нашей работы такую модель для исследования морфофункциональной гетерогенности тромбоцитов никто не применял.

Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности.

Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию. Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений.

Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов. Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции.

Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы in vitro. Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания.

Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов.

Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула. Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией. Выявлено отсутствие типичной для тромбоцитов грануляции и сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом.

Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту. Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов.

Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев. У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты.

Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью. Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) - фазе геморрагий.

Научно-практическаязначимостьработы. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о циркулирующих в крови тромбоцитах в норме и при патологических состояниях.

За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов. Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях. Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии. Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием. Нами получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы». Этот метод используется в клинической практике.

Отмечено, что увеличение количества протромбоцитов в крови соответствует фазе геморрагии. В отличие от этого, риск тромботических осложнений возрастает с появлением в крови больших «ретикулярных» тромбоцитов. Они обладают повышенной активностью, способны спонтанно агрегировать. Ингибиторы циклооксигеназы не оказывают влияния ни на количество, ни на функциональные свойства этих клеток. Результаты этой работы могут оказаться полезными для разработки новых методов диагностики тромботических осложнений и в поиске способов их лечения.

Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на отечественных и международных конгрессах и симпозиумах: Пленум правления ВНОГ (Рига, СССР, 1986); Всесоюзная Конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987); 1st Congress International Sosiety for Pathophysiology (Москва, 1991); Всесоюзная Конференция по Тромбозу и Гемостазу (Полтава, 1992); Всесоюзный Съезд Гематологов (Львов, 1993); 7th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1995); Всероссийская конференция: Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения (Москва, 1997); 11th International Symposium on Atherosclerosis (Париж, Франция, 1997); 31st Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (Киль, Германия, 1997); Украинская Научная Конференция Микроциркуляция и ее возрастные изменения (Киев, Украина, 1999); 17th Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Вашингтон. США, 1999); 11th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1999); 18th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Чикаго, США, 2000); 18th Congress of the International. Society on Thrombosis and Haemostasis (Париж, Франция, 2001); 12th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 2001); The 5th UK Meeting on platelets and the 9th Erfurt Conference on Platelets (Ноттингем, Англия, 2002); 3rd Украинская Научная Конференция Микроциркуляция и ее возрастные изменения (Киев, Украина, 2002); 42nd American Society for Cell Biology Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2002); Первая Всероссийская научная Конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2003); Всероссийская конференция "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром, современные достижения" (Москва, 2003); 13th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 2003); 19th International Congress of the Thrombosis and Haemostasis (Бирмингем, Англия, 2003); 14th Международный симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами, нарушениями гемостаза и патологии сосудистой стенки (С-Петербург, 2004); 10th Erfurt Conference on Platelets (Эрфурт, Германия, 2004); Российский национальный конгресс кардиологов (Томск, 2004); 2nd Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2005); Симпозиум "Человек и лекарство" (Москва, 2005); 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005); 15th European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 2005); Всероссийская конференция "Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром, современные достижения", (Ярославль, 2005); 14th International Symposium on Atherosclerosis (Рим, Италия, 2006); World Congress of Cardiology (Барселона, Испания, 2006); 3nd Всероссийская научная конференция «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно сосудистой хирургии» (Москва, 2007); 16th Всероссийская конференция «Нейроиммунология» И Научно-практическая конференция неврологов (С.Петербург, 2007); Всероссийская конференция «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия (С.-Петербург, 2007); 21st Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Женева, Швейцария, 2007).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Гетерогенность (от греч. heteros - другой) - разнородность, нерегулярность и непредсказуемость являются важными характеристиками здоровья, а снижение изменчивости и возникновение ярко выраженной периодичности причинно связаны со многими заболеваниями (Голдбергер Э. Л., Ригни Д. Р., Уэст Б. Д., 1990).

Общепризнано, что тромбоциты периферической крови являются гетерогенной популяцией. Вариации имеются не только в их числе, но и в возрасте, плотности, размере, функциональной активности, содержании белка, гликогена, ферментов. Большинство из этих различий закладываются уже на этапе мегакариоцитопоэза, но часть из них приобретается после поступления в циркуляторное русло и зависит от условий, существующих в нем. Связь этих параметров друг с другом неоднозначна, равно как и причина различий по отдельным признакам.

1. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ТРОМБОЦИТОВ

Первые сведения о неоднородности пула тромбоцитов по форме, величине, окраске, объему, функциональным характеристикам, появились вскоре после открытия A. Donne в 1842 г третьих частиц крови, которые он называл глобулинами. Первоначально эти форменные элементы предлагали называть амебоцитами, элементарными частицами или телами, гематобластами, плазмоцитами, тромбопластидами, пластинками, третьими корпускулами, тромбоцитами (Owen D., 2001). На сегодняшний день общепринятыми остались два из них: "кровяные пластинки" - термин, предложенный в 1882 г. профессором J. Bizozzero из Турина и впоследствии использованый доктором J. Wright из Бостона в многочисленных публикациях 1906-1917 гг., и "тромбоциты", впервые названные так М. Dekhuyzen в 1901 г. По мнению А.А. Маркосяна (1970) несмотря на то, что первоначально «тромбоцитами» именовались форменные элементы низших позвоночных, в дальнейшем, из-за широкого применения этого термина в физиологической литературе, правомерно использовать его наравне с «кровяными пластинками».

Эволюционно тромбоциты как специализированная клетка появились у низших позвоночных. У пойкилотермных рыб, амфибий, рептилий и даже теплокровных птиц эти форменные элементы крови содержат ядро, и только у млекопитающих его нет. Хотя и у низших позвоночных есть исключения. Например, у коротконогих саламандр (batrachoseps attenuatus) ядро в тромбоцитах отсутствует (Eisen G, 1899). Предполагается, что ядерные тромбоциты происходят из клеток-предшественников костного мозга гемангиобластов. Одна клетка-предшественник может продуцировать только 16 ядерных тромбоцитов, в то время как мегакариоцит дает начало 104 безъядерным тромбоцитам млекопитающих. Популяция ядерных тромбоцитов в основном гомогенна. В них содержится более низкое количество нуклеотидов, снижена их секреция и отсутствует агрегационный ответ на АДФ, в то время как добавление тромбина или коллагена приводит к их активации и взаимодействию друг с другом (Schineider W, Gatterman N, 1994). Хотя в более поздних работах у отдельных видов рыб обнаружены тромбоциты различных форм: заостренные (игольчатые), веретенообразные, фрагментированные, закругленные, но in vivo они обычно веретенообразные. Кроме того, они способны агрегировать в ответ на АДФ, хотя этот ответ наступает на 10-15 минуте, в то время как у большинства видов ответа нет (Rowley A, Hill D, Ray С. et al, 1997).

G. Zimmermann еще в 1860 г. отметил, что размер циркулирующих в крови человека тромбоцитов варьирует от 1 до 5 мкм, а их объем может различаться в 2-3 раза. В тромбоцитограмме по Fonio разделение проводили по размеру: первая группа - тромбоциты с диаметром 1-2 мкм, вторая - 2-3 мкм, третья - 3-4 мкм и четвертая - 4 мкм и больше. Также были предложены тромбоцитограммы, составленные на основе возраста, степени раздражения (активации) и способности к окрашиванию. Уже в конце XIX в. были сделаны первые попытки классификации тромбоцитов по форме. Выделяли мелкие зрелые клетки, большие незрелые, иногда гигантские, появление которых связывали с течением патологического процесса, так как их обнаружили при кровопотерях. Между этими двумя крайними формами зрелых и незрелых корпускул выявлено существование множества переходных форм (анизоцитоз). Кроме наиболее часто встречающихся округлых и овальных тромбоцитов, отмечали удлиненые, хвостатые, грушевидные (Лапчинский М., 1875). В первой половине XX века считали, что морфологические признаки тромбоцитов в первую очередь зависят от их возраста, а также состояния организма. В крови здорового человека различали юные, зрелые, старые, вакуолизированные пластинки, а также формы раздражения. К последним относили и пластинки колбасовидной или вытянутой овальной формы, длина которых доходила до 10-12 мкм, а большая часть поверхности была занята грануломером. В норме они встречались редко, но у больных с новообразованиями их число повышалось.

Попытку свести воедино разрозненные тромбоцитарные формулы предпринял в 1961 г. V. Gule. Он предложил разделять кровяные пластинки на нормальные, большие патологические незрелые без зерен, патологически реактивные, патологические с пикнозом зерен, старые, но с нормальной величиной, реактивные формы, к которым относились тромбоциты значительной величины (до 25-50 мкм), колбасовидные, сигаровидные, палочковидные. Перераспределение соотношения между ними тесно связано с возрастом человека. У пожилых лиц увеличивалось количество старых и реактивных форм. Несмотря на большое количество работ, связанных с классификацией тромбоцитов, в этот период практически отсутствуют исследования, позволяющие проследить закономерности связи морфологических изменений с функциональным состоянием (Гусейнов Ч.С., 1971). Появление в 70-е годы электронной микроскопии позволило продолжить исследования по пути выяснения взаимосвязи формы и структуры тромбоцитов с их ролью при патологии. В отличие от лейкоцитов и эритроцитов, для которых уже в начале века такая взаимосвязь была установлена, несмотря на значительную вариабельность состава тромбоцитов, ее роль в этиологии и клинической картине выглядела крайне противоречивой. В это же время наблюдался всплеск работ по гетерогенности кровяных пластинок, которую связывали с их объемом, плотностью, содержанием внутриклеточных структур и биохимическим составом. Однако и по этим параметрам однозначных результатов добиться не удалось. До конца остается невыясненной связь морфологических изменений с функциональной активностью клеток.

В 80-е годы сложилось устойчивое мнение, что различия тромбоцитов по размеру, плотности и реактивности закладывается при тромбопоэзе (Thompson С., Eaton К., Princiotta S. et al., 1982; Martin J., Shaw Т., Heggie J. et al, 1983.). Изменения этих параметров может быть связано с возникновением и течением сосудистых заболеваний.

Большие и функционально более активные тромбоциты обнаружены после инфаркта миокарда и при диабете (Martin J., Plumb J., Killy R. et al., 1983; Wincour P., Halushka P., Colwell J., 1985; Tschoepe D., Esser J., Schwippert B. et al., 1991). В ранних исследованиях утверждалось, что гетерогенность тромбоцитов по плотности, размеру и функциональным способностям связана со старением в процессе циркуляции, которое сопровождается увеличением доли клеток малой плотности и размера (Karpatkin S., Amorosi Е., 1977; Blajchman М., Senyi A., Hirsh J. et al., 1981). В настоящее время считается, что старение тромбоцитов вносит определенный вклад в гетерогенность циркулирующего пула, но не в отношении различий их плотности или размера, а в формирование популяции пластинок с измененными мембранными свойствами. Очевидно, что одной из причин появления в периферической крови тромбоцитов с особыми признаками может быть изменение части клеток в результате выполнения ими защитных реакций, которые сопровождаются их активацией и дегрануляцией. Но, гетерогенность тромбоцитов в первую очередь обусловлена различиями в путях продукции и свойств мегакариоцитов. В физиологических условиях сохраняются и количество образуемых тромбоцитов, и их средний размер. В отсутствии гемостатического стресса оба параметра у одного лица длительное время сохраняют тенденцию к постоянству. В результате этого сохраняется стабильной и циркулирующая функциональная масса тромбоцитов, которая определяется как произведение среднего объема клетки на их количество в периферической крови. Весьма существенно, что реализация функций тромбоцитами обусловлена не только их числом, но и размером, поскольку большие тромбоциты сильнее проявляют агрегационную и секреторную активность. Поэтому тромбоцитарная продукция регулируется в костном мозге таким образом, чтобы обеспечить в целом постоянство массы циркулирующих пластинок (Шитикова А.С., 2000).

Мегакариоцитарный аппарат костного мозга - это не только источник продукции тромбоцитов, но и причина большинства тромбоцитарных аномалий у больных. В связи с этим, круг проблем патофизиологии, традиционно обозначаемой термином "тромбоцит" в последнее десятилетие предложено расширить до понятия "система мегакариоцит-тромбоцит" (Ермолаева Т.А., Пономаренко В.М., Головина О.Г., 1996).

Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют о тесной взаимосвязи процессов развития и созревания мегакариоцитов и тромбоцитопоэза с кинетикой и морфофункциональными свойствами циркулирующих кровяных пластинок. Очевидно, что для уточнения патогенеза тромбоцитарных нарушений необходимо одновременное рассмотрение тромбоцитопоэза и структурно-функциональных особенностей кровяных пластинок.

2. ТЕОРИИ ТРОМБОЦИТОПОЭЗА

2.1. История исследования происхождения тромбоцитов.

О происхождении тромбоцитов начали задумываться с момента их открытия. Высказывались предположения, иногда достаточно курьезные, что тромбоциты появляются из лейкоцитов, при развале лимфоцитов, в результате рождения бактериями, как производные фибрина, а также как артефакт, наблюдаемый in vitro (Owen D., 2001). В 1878 г. G.H. Hayem высказал предположение об образовании тромбоцитов из эритроцитов. Такое мнение поддерживалось и в дальнейшем в работах И.В. Алмазова (1951) и S. Leiter (1984). Оно базировалось на непонимании того, каким образом большое количество тромбоцитов, продуцируемых в костном мозге, могут покидать его и выходить в кровоток и незнании о способности самих мегакариоцитов выходить в циркуляцию и продуцировать кровяные пластинки в капиллярах альвеол легких (Zucker-Franklin D., 2000). Однако уже в 1880 г. В.П. Образцов высказал предположение об образовании кровяных пластинок из гигантских клеток костного мозга. J.G. Wright (1906) показал, что тромбоциты происходят из мегакариоцитов костного мозга. В дальнейшем было обнаружено присутствие мегакариоцитов в легких, селезенке и печени (Sharnoff J., 1959). Из всех клеток костного мозга мегакариоциты встречаются наиболее редко, составляют около 0.05% и являются самыми крупными (до 100 мкм) по размеру.

Большинство биохимических и функциональных особенностей тромбоцитов закладывается в мегакариоцитах, что в значительной степени зависит от степени зрелости последних. Зрелые мегакариоциты, по сравнению с незрелыми, содержат большее количество АТФ, активнее включают нуклеотиды, аденин и арахидоновую кислоту, в них в несколько раз интенсивнее, чем в незрелых, происходит синтез белков, фосфолипидов, холестерина (Wojenski С., Schick Р., 1993).

Зрелые мегакариоциты локализуются у синусоидов костного мозга, которые представляют собой специализированные капилляры с расширенным просветом. Через так называемые финестры эндотелия зрелые мегакариоциты высвобождают тромбоциты в циркулирующую кровь (Corriveau D., Fritsma G., 1988). Оставшиеся голые мегакариоцитарные ядра фагоцитируются макрофагами (Thiagarajan D., Pacheco J., Hillman N., 1985).

2.2. Образование тромбоцитов.

Продукция тромбоцитов мегакариоцитами может происходить разными путями. Предлагаются следующие четыре модели образования и отшнуровки тромбоцитов: фрагментация цитоплазмы; образование пузырьков или почкование; инвагинация мембраны с дальнейшим отделением тромбоцитов в виде бус; формирование псевдоподий или пропластинок. Подобный взгляд на тромбоцитопоэз возник в 70 годы прошлого столетия и базировался на исследовании морфологии мегакариоцитов костного мозга. Тогда было обнаружено, что по мере созревания, цитоплазма становится неровной, на поверхности клеток появляются неоднородные образования, по которым их можно разделить на 4 типа: с морщинами и складками, с выпячиваниями различного размера, с круглыми пузырьками и клетки с тромбоцитами на их мембране. Выявленные различия в ультраструктуре поверхности мембраны связывали с их принадлежностью к клеткам, находящимся на разных стадиях созревания. В процессе развития мегакариоцитов они проходят 4 стадии созревания - от промегакариобластов к базофильным, гранулярным, и, наконец, к зрелым (мегакариобласты) формам. На ранней стадии созревания цитоплазматическая мембрана гладкая, лишена выростов. Далее наблюдалось появление волосков, что вероятнее всего свидетельствовало о начальной стадии продукции через псевдоподии. По мере созревания мембрана становится неровной и приобретает различную конфигурацию.

2.2.1. Продукция тромбоцитов путем фрагментации цитоплазмы.

Фрагментация цитоплазмы может происходить благодаря разделению ее на отдельные участки демаркационной мембранной системой (ДМС), которые представляют собой "тромбоцитарные территории" или "поля". Образование ДМС, происходящее в результате инвагинации мембраны клеток и увеличивающие ее поверхность в 1,4 раза, служит этапом, предшествующим образованию и отшнуровке тромбоцитов и составляет их наружную мембрану

Schulze H., Korpal V., Hurov J. et al., 2006). Сложное ветвление ДМС возникает уже на ранних стадиях формирования клетки (Behnke О., 1968). Благодаря такому разделению, цитоплазма может дробиться на отдельные тромбоциты, которые постепенно отделяются от периферической зоны родительской клетки и высвобождаются с помощью экзоцитоза, или одновременно покидают материнскую клетку, что напоминает «взрыв салюта» (Zucker-Franklin D., Peturson S., 1984). Существование такого пути подтверждается тем, что мембрана тромбоцита отличается от наружной мембраны мегакариоцита и более сходна с мембраной ДМС, что указывает на образование пластинок из внутренних структур материнской клетки (Zucker-Franklin D., Stahl С., Hyde P., 1987).

2.2.2. Способность к образованию пузырьков или почкование.

Образование пузырьков или отпочковывание тромбоцитов от мегакариоцитов может происходить путем замыкания участков мембраны ДМС с последующим их отделением. (Murata Т., 1975). Исследование морфологии мегакариоцитов из костного мозга человека выявило, что на ранних стадиях созревания их цитоплазматическая мембрана гладкая, лишенная выростов. Однако по мере созревания, на их поверхности, кроме выростов в виде псевдоподий, появляются подобные виноградным гроздьям образования, состоящие из пузырьков, от которых могут отпочковываться тромбоциты (Djaldetti М., Fishman P., Bessler Н. et al., 1979). Возможно, такой путь продукции связан с определенной стадией созревания мегакариоцита. Продукция тромбоцитов характерна для зрелых мегакариоцитов. Образование же пузырьков обнаружено в клетках гранулярного типа развития (Bessis М., 1973). Отделившиеся пузырьки не содержат тромбоцитарных органелл (Murata Т., 1975), и это одна из причин, по которой возможность продукции таким путем не поддерживалась многие годы (Hovig Т., 1989). Однако такой путь все же возможен при патологических состояниях, например при острой миелобластной лейкемии (Shukla J., Rai S., Singh V., 2004).

2.2.3. Инвагинация мембраны с дальнейшим отделением тромбоцитов в виде бус.

Подобная модель связана с перемещением мембранных структур (модель потока). Инвагинация тубулярной системы плазматической мембраны мегакариоцитов приводит к образованию ДМС, которая и становится мембранным материалом псевдоподий. После вытягивания до 10 мкм, на них через определенные интервалы появляются сужения, в результате чего их вид напоминает бусы. В местах констрикций концентрируются микротрубочки, напоминающие мосты, соединяющие контурированные расширения - будущие тромбоциты. В ходе высвобождения тромбоцитов эти мосты истончаются и разрываются. В этой модели подвергается сомнению предварительное разделение цитоплазмы мегакариоцита на участки будущих тромбоцитов с помощью ДМС, которая вовлекается в формирование последних не непосредственно, а служит источником мембранного материала для образования вначале отростков, и только затем происходящих из них тромбоцитов (Radley J, 1986). В то же время такой путь может оказатося и часным случаем образования протромбоцитов.

2.2.4. Формирование и отшнуровка протромбоцитов

Согласно теории протромбоцитов - до образования кровяных пластинок в синусоиды из мегакариоцитов вытягиваются и отделяются длинные (иногда достигающие 150 мкм) отростки, включающие участки цитоплазмы разного размера, которые уже в циркуляции распадаются на отдельные тромбоциты. Еще в своих ранних исследованиях костного мозга с помощью световой микроскопии J. Wright (1906, 1910) обнаружил, что отдельные участки цитоплазмы мегакариоцита вначале выступают через синусоиды, а затем отделяются в кровоток в виде тромбоцитов. При изучении длинных цитоплазматических структур мегакариоцитов, названных ими протромбоцитами (proplatelets), J.Thiery (1956) и М. Bessis (1956, 1973) предположили, что из них образуются отдельные тромбоциты. Позднее J.

Radley (1980) подтвердил теорию о том, что продукция тромбоцитов начинается с перестройки в мегакариоцитах, приводящей к вытягиванию толстых псевдоподий.

Рисунок 1. Анатомия протромбоцитов. Фото представлено из обзора Patel S., Hartwig J., Italiano J., (2005).

В условиях культуры in vitro мегакариоциты способны выбрасывать длинные псевдоподии, на которых вокруг участков, соответствующих по размеру тромбоцитам, образуются перетяжки (Handagama P., Jain N., Копо С. et al., 1986, 1987). В дальнейшем именно эта теория получила наибольшую поддержку. Вначале происходит перетекание цитоплазмы мегакариоцитов в длинные (от 100 до 500 мкм) ветвящиеся отростки, которые и служат основой организации отдельных протромбоцитов. Процесс формирования отростков начинается с одного места на мегакариоците, называемом эрозивным полюсом, в котором одна или более псевдоподий начинают создавать длинные тяжи. В течение 4-10 часов псевдоподии удлиняются, а затем начинается процесс постепенного уменьшения их диаметра и преобразования в протромбоциты. Уже в этом периоде на протяжении всего протромбоцита беспорядочно появляются утолщения или набухания, идентичные по размеру тромбоцитам (Рис. 1). В дальнейшем длинные ветви протромбоцитов отделяются от материнской клетки, и только после этого с их концов происходит отделение тромбоцитов (Italiano J., Patel S., Hartwig J., 2007).

Однако механизм, регулирующий этот процесс, остается неясным. Образование последующих протромбоцитов продолжается в том же месте, или в непосредственной близости от него, и продолжается ли данный процесс до тех пор, пока цитоплазма мегакариоцита способна создавать такие протяженные отростки (Italiano J., Lecine P., Shivdasani R. et al., 1999). Многолопастные ядра мегакариоцитов перемещаются в центральную часть, остаются окруженными быстро уменьшающейся цитоплазмой и в итоге голые ядра выталкиваются и подвергаются разрушению.

Очевидно, что в процессе тромбоцитопоэза существенную роль играют элементы цитоскелета мегакариоцитов. Все физиологические реакции, связанные с движением клетки и ее структурных элементов, обусловлены функционированием опорно-сократительной системы, которая работает благодаря способности ее белков к полимеризации-деполимеризации и сократительной активности. Тромбоциты превосходят все не мышечные клетки организма по содержанию сократительных белков и макроэргических фосфатных соединений, по богатству мембранными образованиями и гранулами. Все это тромбоциты приобретают из мегакариоцитов.

Важным компонентом, участвующим в отделении тромбоцитов от протромбоцитарных тяжей служат микротрубочки. Они образуются путем полимеризации димерного а(3-тубулина и являются главным структурным компонентом, управляющим вытягиванием протромбоцитов. Скорость полимеризации микротрубочек в 10 раз быстрее, чем образование протромбоцитов (Торр К., Tablin F., Levin J., 1990; Schwer H., Lecine P., Tiwari S. et al., 2001; Italiano J., Lecine P., Shivdasani R. et al., 1999.). В экспериментах in vitro усиление с помощью ретровируса экспрессии (З-тубулина в мегакариоцитах приводит к тому, что микротрубочки плотно заполняют образующиеся протромбоциты (Schulze Н., Korpal М., Bergmeier W. et al., 2004). Протромбоциты прекращают формироваться в мегакариоцитах, обработанных 1-10 мкм нокодазолом, подавляющим сборку микротрубочек (Tablin F., Castro М., Leven R., 1990). У трансгенных мышей, лишенных [З-тубулина, образование микротрубочек снижено. У них развивается тромбоцитопения, а в крови циркулируют преимущественно сферические тромбоциты. Количество микротрубочек в них соответствует 2-3, по сравнению с 8-12 в нормальных клетках (Schwer Н., Lecine P., Tiwari S. et al., 2001). Непосредственно перед формированием протромбоцитов микротрубочки собираются вместе под плазматической мембраной и затем на самых ранних этапах образования псевдоподий перемещаются в них. В дальнейшем они концентрируются по концам набухших участков протромбоцитов, но часть их располагается также и по всей длине. На концах протромбоцитов микротрубочки собираются в кольца, что приводит к отделению тромбоцитов именно в этих местах (Italiano J., Lecine P., Shivdasani R. et al., 1999). Предполагают, что в определенной степени микротрубочки способствуют передвижению органелл из мегакариоцитов в образующиеся псевдоподии и затем продвигают их к концам формирующихся протромбоцитов. Показано, что их продвижение не зависит от актина, а определяется в основном кинезином и данеином (Richardson, J., Shivdasani, R., Boers et al., 2005). Так как протромбоциты могут иметь в длину несколько миллиметров, мегакариоцитам необходима система сборки соответствующих длинных микротрубочек. Она работает за счет полимеризации дополнительных количеств тубулина и сборки мелких микротрубочек в более крупные. Такая сборка служит доминирующим механизмом увеличения размера микротрубочек, в то время как полимеризация тубулина второстепенна (Patel S., Hartwig J., Italiano J., 2005). Это подтверждено данными, полученными другими исследователями (Abrams С., 2005).

Образованию протромбоцитов предшествует появление в цитоплазме мегакариоцитов ДМС, формирующейся в результате инвагинации плазматической мембраны. Именно ДМС служит источником мембран протромбоцитов и тромбоцитов (Schulze Н., Korpal М., Hurov J. et al., 2006).

В условиях культуры отделение протромбоцитов от мегакариоцитов крысы достаточно хорошо изучено. От длинных тяжей протромбоцитов могут отделяться более короткие, но состоящие из целого ряда будущих тромбоцитов, которые затем начинают отшнуровываться от концов (Italiano J., Lecine P., Shivdasani R. et al., 1999). Показано, что в условиях in vivo протромбоциты проникают из костного мозга в сосуды через отверстия в синусоидах, где они отделяются и поступают в кровоток (Italiano J., Patel S., Hartwig J., 2007). Однако, еще в 1987 г. R. Leven и M. Yee высказали предположение, что выход псевдоподий через синусы может быть начальным этапом миграции всего мегакариоцита через сосудистую стенку.

2.3. Циркулирующие мегакариоциты.

Долгое время основным местом продукции тромбоцитов из мегакариоцитов рассматривался костный мозг, но в 1965 г. R. Kaufman, R. Airo, S.Pollack et.al. (1965) предположили, что такой же процесс возможен в легких. В последующем это получило подтверждение (Pedersen N., 1978; Trowbridge Е., MartinJ., Slater D., 1982).

Одним из фактов, натолкнувшим на такую мысль было то, что в крови из легочной артерии количество интактных мегакариоцитов в 10 раз выше, чем в крови из аорты. Кроме того, 98% мегакариоцитов, покинувших легочную циркуляцию, лишены цитоплазмы (Levine R., Eldor A., Shoff P. et al., 1993).

Л <2^

Присутствие мегакариоцитов в легких было обнаружено более 100 тому назад (Aschoff L, 1893). Еще тогда высказывалось предположение, что из костного мозга мегакариоциты проходят в кровь, идут в легкие, где большинство из них задерживается, а незначительная часть попадает в другие органы, такие как почки, печень и сердце. P. Foa (1899) допустил, что такой процесс происходит в нормальном физиологическом состоянии, но при патологии он усиливается и благодаря этому легче выявляется. Н. Oelhafen (1914) впервые обнаружил циркулирующие в кровотоке мегакариоциты, что было подтверждено в дальнейшем другими исследователями (Tavassoli М, Aoki М, 1981; Levine R, Eldor A, Shoff P. et al, 1993). К этому времени появились фактические данные о том, что циркулирующие в крови мегакариоциты здоровых лиц и больных накапливаются в селезенке, печени и легких, особенно в капиллярах альвеол (Scott G, 1982; Trowbridge Е, Martin J, Slater D, 1982).

После прохождения венозной крови через капилляры легких взрослых крыс, число циркулирующих мегакариоцитов снижется на 65%, одновременно с этим в оттекающей из легких крови количество тромбоцитов возрастает на 34% (Howell W, Donohue D, 1937; Kallinikos-Maniakas A, 1969). Это подтвердило сделанное ранее предположение, что в легких происходит фрагментация мегакариоцитов и рождение тромбоцитов. Создание шунта сердце-легкие в экспериментах на собаках позволило выявить, что число мегакариоцитов в легких прямо соотносится с током венозной крови (Kaufman R, Airo R, Pollack S. et al, 1965). Еще одним доказательством служит тот факт, что у больных, подвергающихся операции аортокоронарного шунтирования, количество мегакариоцитов в артериальной крови значительно увеличивается. Если до и после операции в ней присутствует 0,25 клеток/мл, то на протяжении операции их количество в среднем возрастает до 19,49 клеток/мл, в то же время в венозной крови их становится значительно меньше (Wilde N, Burgess R, Keenan D. et al, 1997). Мегакариоциты в легких почти всегда находят при посмертном осмотре, включая случаи гибели от травмы. Наибольшее число их обнаружено у больных, умерших от тромбоэмболий, острых инфекций, гепатита, кровопотери, онкологических заболеваний (Smith Е., Butcher J. et al., 1952; Sharnoff J., Kim E., 1958). Эти факты позволили сделать заключение, что циркулирующие мегакариоциты могут играть роль в возникновении послеоперационных тромбоэмболий (Sharnoff J., 1959). Кроме того, они могут быть причиной развития нарушений мозгового кровообращения у больных, перенесших аортокоронарное шунтирование (Wilde N., Burgess R., Keenan D. et al., 1997; Mark D., Newman M., 2002).

Процессы выхода мегакариоцитов в циркуляцию и продукция тромбоцитов зависят от циркадных ритмов и наиболее продуктивны в утренние часы, с чем может быть связан пик возникновения сердечно-сосудистых осложнений именно в этот период (Behnke О., Forer А., 1998).

Для поддержания нормального количества тромбоцитов в кровотоке достаточно всего 20 мегакариоцитов, распадающихся в легочной циркуляции. Этот процесс рассматривается как результат физической фрагментации цитоплазмы, которая вызвана попаданием мегакариоцитов (обладающих высокой кинетической энергией) в капиллярные сосуды легких. Диаметр этих сосудов значительно меньше размера клетки, что приводит к распаду их на отдельные фрагменты, из которых рождаются тромбоциты (Trowbridge Е., Martin J., Slater D., 1982).

При внутриутробном развитии местами фрагментации мегакариоцитов служат капиллярные синусы легких (Graeve J., de Alarcon P., 1989) и плацента (Woods M., Landon С., Wagner В. et al., 1992). Вероятнее всего, что и после рождения именно в легких этот процесс продолжает осуществляться, так как там находится капиллярное русло, которое первым оказывается на пути покинувших костный мозг клеток (Pedersen N., 1974). D. Zucker-Franklin и С. Philipp (2000) опубликовали статью, которая начиналась со вступления: "Хотя свидетельств того, что освобождение тромбоцитов происходит в легких достаточное количество, большинство из них получены косвенным путем, и все еще оставляют вопросы. Поэтому мы решили посмотреть на данную проблему с помощью усиления тромбопоэза у мышей под действием более физиологичных стимулов, таких как флеботомия и введение ТПО, а затем подвергнуть образцы легких ультраструктурному анализу. Значительное количество интактных мегакариоцитов, их фрагментов и голых ядер, наблюдаемое в капиллярном русле легких этих животных, было поразительным". После проведения работы было сделано заключение: "Вместе с убедительными косвенными доказательствами, представлеными в большом количестве замечательных работ, полученые нами данные не оставляют сомнения в том, что у здоровых животных значительное количество мегакариоцитов задерживаются в капиллярном русле легких. Именно в этом месте они и продуцируют тромбоциты ".

Легкие, играющие важную роль в формировании тромбоцитов, одновременно с этим ответственны за их захват и разрушение. Повреждение эндотелия, часто наблюдаемое в легких новорожденных с респираторным дистресс-синдромом или баротравмой, с одной стороны сопровождается тромбоцитопенией, а с другой - образованием тромбов, которые состоят из клеток иммунного ряда, сети фибрина, белкового экссудата и агрегатов тромбоцитов. В такой ситуации, вызванное потреблением снижение в кровотоке числа тромбоцитов приводит к появлению сигнала на усиление их продукции. В ответ на это в легких возрастает количество мегакариоцитов и усиливается тромбоцитопоэз, но молодые кровяные пластинки, попадая после рождения в зоны повреждения эндотелия, быстро активируются и агрегируют, что еще больше усиливает тромбоз (Yang J., Yang М., Xu F. et al., 2003). Вероятнее всего, именно такой механизм вызывает развитие тромбоэмболии у больных с хронической обструкцией дыхательных путей и повышает число смертельных исходов от сердечно-сосудистых патологий у больных со сниженным уровнем выдоха. Часто наблюдаемая связь между хроническими респираторными заболеваниями и развитием осложнений при сердечнососудистых патологиях, также может быть следствием нарушений в фрагментации мегакариоцитов и продукции тромбоцитов в легких (Martin J., Slater D., Trowbridge E., 1983). У крыс после повреждения легких снижается количество циркулирующих тромбоцитов, что свидетельствует о нарушении их продукции (Xiao da W., Yang M., Yang J. et al., 2006).

Несмотря на существование различных теорий мегакариоцитопоэза, механизм рождения тромбоцитов окончательно не определен, так же как и остается спорным место их продукции (костный мозг или легкие). J. Martin и R. Levine (1991) придерживаются мнения о продукции в легких, в то время как J. Levin (1990) считает, что рождение тромбоцитов происходит в костном мозге. Скорее всего, в организме человека и животных продукция тромбоцитов может происходить разными путями и зависит от конкретного состояния организма и потребности в возобновлении пула этих форменных элементов крови (Kosaki G., 2005).

3. ПОЛИПЛОИДНОСТЬ ЯДРА МЕГАКАРИОЦИТОВ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ ТРОМБОЦИТОПОЭЗА

Морфологические и физиологические особенности тромбоцитов в первую очередь закладываются при фрагментации их родоначальной клетки, мегакариоцита (Chernoff A., Levine R., Goodman D., 1980; Rabellino E., Levene R., Leung L. et al., 1981; Bentfield-Barker M., Bainton D., 1982; Gladwin A., Carrier M., Beesley J. et al., 1990). Предшественниками мегакариоцитарного ростка служат полипотентные стволовые клетки, дающие начало появлению миелоидных форм, которые под действием соответствующих стимулов могут снижать свою способность к дифференциации и превращаться в коммитированные клетки мегакариоцитарного ряда. Популяция исходных мегакариоцитов гетерогенна по пролиферативным свойствам и плоидности (Burstein S., Harker L., 1983).

Характерной и уникальной чертой развития мегакариоцитов является процесс полиплоидизации ядра, известный общебиологический факт, характерный для растений и часто встречающийся у насекомых. Так, например, в железах пчелы, отвечающих за продукцию меда, при необходимости быстрой выработки дополнительного количества веществ наблюдается полиплоидный эндомитоз (Nagl W., 1978). Такой феномен достаточно редко, но встречается в клетках млекопитающих. Полиплоидизация наблюдается в клетках печени, миоцитах, особенно из стенки левого желудочка сердца, плоидность которых может увеличиваться под действием стресса и гипертрофии, в гладкомышечных клетках аорты гипертензивных животных и в гладких мышцах матки, а также в клетках эндокринной системы, таких как териоциты и клетки желез надпочечников. Что касается мегакариоцитов, вероятно именно эта способность позволяет им осуществлять быстрый ответ на возникающие геморрагии и тромбоцитопении. После нескольких митозов пролиферирующие мегакариоцитарные предшественники (с плоидностью 2N) постепенно прекращают делиться и переходят в стадию эндомитоза, процесса редупликации ДНК без образования дочерних клеток, что приводит к полиплоидизации их ядра (Ravid К., Lu J., Zimmet J. et al., 2002). В результате эндомитоза уровень плоидности промегакариоцита становится 4N. Морфологически их трудно отличить от других клеток-предшественников. По размеру они сходны с клетками мононуклеарного ряда, обладают бедной базофильной агранулярной цитоплазмой, округлым несегментированным ядром, которое занимает большую часть цитоплазмы и имеет небольшие ядрышки (Gerwitz А., 1995). Но уже на этой стадии в них экспрессируется характерная для тромбоцитов ацетилхолинэстеразная активность и типичные для их мембраны ГП Ilb/IIIa, ГП1Ь, ГШНа. Кроме того, в цитоплазме диффузно появляются белки тромбоцитарных а-гранул: ФВб, ТФ-4, (3-ТГ, тромбоспондин, а в эндоплазматическом ретикулуме - пероксидаза, принимающая участие в синтезе простагландинов (Breton-Gorius J., Vainchenker W., 1986; Tomer A., 2004). ФВб и мембранные ГП обнаружены в клетках с плоидностью 2N-4N, и хотя их количество в несколько раз ниже, чем в зрелых мегакариоцитах, присутствие этих белков позволяет говорить о том, что эти молодые мегакариоциты уже способны передавать основные, специфичные свойства тромбоцитам. На ранних стадиях созревания в условиях стресса предшественники мегакариоцитов могут экспрессировать типичные для лимфоидного ростка гены иммуноглобулинов, что при патологических ситуациях может приводить к появлению измененных тромбоцитов (Jacquelin В., Kortulewski Т., Vaigot P. et al., 2005). Плоидность нормальных мегакариоцитов из костного мозга обычно варьирует от 4N до 64N. До 50% мегакариоцитов здорового человека имеют плоидность 16N. Остальные клетки приблизительно в равном соотношении имеют плоидность ниже или выше 16N. (Levine R., Bunn P., Hazzard К. et al., 1980; Jackson C., Brown K., Somerville B. et al., 1984; Worthington R., Nakeff A., Micko S., 1984)

Мегакариоцитарные предшественники из пупочной и периферической крови отличаются по способности к полиплоидизации. В культуре мегакариоцитов из пупочной крови к 14 дню 80% клеток имеют плоидность 2N и способны к продукции менее 2000 тромбоцитов на клетку, и только 2,6% достигают плоидности 8N, а клетки 16N не появляются и к 21 дню. В то же время мегакариоциты из венозной крови созревают на 12 день и 40% из них имеют плоидность 8N или более и способны достигать 64N, при этом из каждой клетки в среднем появляется около 6000 тромбоцитов. Полученные в культуре тромбоциты обеих линий имели сходный объем и обладали одинаковой способностью к активации в ответ на тромбин (Mattia G., Vulcano F., Milazzo L. et al., 2002). In vitro отделение тромбоцитов от мегакариоцитов, наблюдаемое в условиях культуры эмбриональных стволовых клеток, имеет двухволновой характер. Первая волна прослеживается на 8-е сутки нахождения клеток в культуре, когда размер и плоидность мегакариоцитов низкие. Появившиеся тромбоциты содержат незначительное число гранул. Вторая волна наблюдается на 12-16 сутки, когда мегакариоциты достигают крупных размеров и высокой плоидности. Они рождают на порядок больше тромбоцитов с достаточным гранулярным аппаратом (Fujimoto Т., Kohata S., Suzuki H. et al., 2003). В ранних работах с помощью световой микроскопии в костном мозге здоровых людей были обнаружены мегакариоциты с плоидностью от 4N (12%), 8N (65%) до 16N (23%). Что касается клеток с более высокой плоидностью, то 32N были единичными, a 64N - не обнаружены (Harker L., Finch С., 1969). Позднее, в работах с привлечением методов иммунофлуоресценции, были обнаружены мегакариоциты как более низкой плоидности, соответствующей 2N (3,3%), так и более высокой - 32N (33,4%), 64N (14.2%) и даже 128N (2,6%) (Mazur Е., Lindquist D., de Alarcon PA. et al., 1988). У большинства млекопитающих наибольшее число мегакариоцитов имеет плоидность 16N, хотя всегда присутствуют клетки более высокой плоидности (Jackson С., Arnold J., Pestina Т. et al., 1997). Зрелыми принято считать мегакариоциты с плоидностью ядра от 8N до 64N. Максимальная обнаруженная плоидность ядра соответствует 128N, после чего эндомитоз прекращается и происходит апоптоз клеток. Хотя есть данные, что у больных идиопатической тромбоцитемией они могут быть 256N и 512N (Mazur Т. 1988). Такой же плоидности клетки были получены в культуре под действием ИЛ-6 (Stahl С., Zucker-Franklin D., Evatt В. et al., 1991).

Время созревания мегакариоцитов от одной стадии до другой в условиях культуры составляет около 9 час. Исходя из этого, от момента начала созревания до достижения максимальной плоидности необходимо 54 часа (Алексеев Н.А., 2005), хотя есть данные, что период одного эндомитоза продолжается 90 мин. (Wang Z., Zhang Y., Kamen D. et al., 1995). To, что полиплоидизация может происходить за такой короткий срок, свидетельствует о возможности быстрого восстановления количества тромбоцитов в крови при определенных условиях, возникающих в организме.

Созревание и полиплоидизация мегакариоцитов, в значительной мере, зависит от состава окружающей среды (Slayton W., Wainman D., Li X. et al., 2005). Наиболее важными на всех этапах полиплоидизации факторами являются ТПО и форболовый эфир (Zimmet J., Toselli P., Ravid К., 1998). ТПО, с одной стороны, усиливает пролиферацию ранних клеток-предшественников в сторону формирования мегакариоцитарного ростка, а с другой - участвует в полиплоидизации, запуская процесс эндомитоза (Ravid К, Lu J, Zimmet J. et al, 2002).

По мере увеличения плоидности значительно увеличивается объем мегакариоцитов, происходит созревание ядра и цитоплазмы. Ядро вначале приобретает неправильные очертания, затем становится дольчатым, хроматин его конденсируется с образованием глыбчатых структур. Уменьшение соотношения ядра и цитоплазмы сопровождается усилением синтеза белков, характерных как для тромбоцитов, так и для мегакариоцитов, и образованием типичных органелл. Появляются такие специфичные структуры, как СОК, ДМС, электронноплотные гранулы, а также а-гранулы, отшнуровывающиеся от цистерн аппарата Гольджи, (Hovig Т, 1989). В процессе созревания мегакариоцитов изменяются их функциональные свойства, метаболическая активность и способность накапливать из окружающей среды различные биологически активные соединения. Им свойственна высокая способность к синтезу большого количества белков, протеогликанов, фосфолипидов, жирных кислот, простагландинов, тромбоксанов. Кроме того, в них синтезируются вещества, специфичные для тромбоцитов, такие как ТФ-4, (3-ТГ, PDGF. Неспецифические белки, локализующиеся в а-гранулах (фибриноген, фактор V, ФВб, тромбоспондин) могут как синтезироваться мегакариоцитами de novo, так и захватываться ими из плазмы, где они находятся в достаточном количестве. Альбумин поступает в мегакариоцит только путем эндоцитоза. Мембранные ГП Ilb/IIIa и ГП lb, рассеянные в цитоплазме на ранних стадиях развития, в дальнейшем, по мере созревания клеток, перемещаются. Они появляются в демаркационных мембранах (Miyazaki Н, Inoue Н, Yanagida М. et al. 1992; Debili N, Issaad С, Masse J. et al, 1992), а также в мембранах плотных гранул (Youssefian Т, Masse J, Rendu F. et al, 1997). Уровень экспрессии ГП Ilb/IIIa и ГП1Ь возрастал соответственно увеличению плоидности ядра, в то время как их плотность падала при переходе от 2N к 4N, затем прогрессивно увеличивалась, достигая максимума в клетках с 32N, без дальнейшего изменения при переходе к 64N. Снижение плотности рецепторов в 4N клетках связано с быстрым увеличением размера клетки. В то время как при переходе от 2N к 4N клеточная поверхность увеличивается в 1,8 раз, общее количество экспрессированных рецепторов увеличивается только в 1,3 раза. (Tomer А., 2004).

Большинство биохимических и функциональных особенностей тромбоцитов закладывается в мегакариоцитах, что в значительной степени зависит от степени зрелости последних. Зрелые мегакариоциты, по сравнению с незрелыми, содержат больше АТФ, активнее включают аденин, нуклеотиды, арахидоновую кислоту. В них в несколько раз интенсивнее происходит синтез белков, фосфолипидов, холестерина (Wojenski С., Schick Р., 1993). Г.И. Козинец (1982) показал, что тромбоциты, образованные мегакариоцитами с плоидностью 32N, пронизаны большим количеством СОК, чем те, которые появились из клеток с меньшим содержанием ДНК. Повышение плоидности приводит к появлению функционально более полноценных тромбоцитов, так как в результате связывания структуры СОК с сократительным белком тромбостенином, АТФ, ионами кальция, увеличивает способность этих форменных элементов к ретракции кровяного сгустка. В то же время, тромбоциты, образованные мегакариоцитами с низкой (менее 8 N) плоидностью - незрелые, оптически плотные, содержат митохондрии, незрелые гранулы. (Козинец Г.И., Макаров В.А., 1997).

Более крупные зрелые мегакариоциты остаются в костном мозге и через финестры эндотелия высвобождают тромбоциты в циркулирующую кровь. Скорее всего, сами они не проникают в циркуляторное русло (Corriveau D., Fritsma G., 1988). Мелким мегакариоцитам диаметром менее 6 мкм (с низкой плоидностью) легче проникать в кровоток, где они задерживаются в капиллярах легких и продуцируют тромбоциты. Благодаря этому процессу может пополняться до 10 % от общего пула кровяных пластинок (Stenberg Р., Levin J., 1989). В экспериментах in vitro выявили подавление миграционной способности мегакариоцитов при их созревании. Наиболее значительно она снижается при дифференциации >4N, то есть, при повышении плоидности менее вероятен выход мегакариоцитов в кровоток (Mathur A., Hong Y., Martin J. et al., 2001).

3.1. Плоидность мегакариоцитов и средний объем тромбоцитов (СОТ).

Обнаружена прямая связь между плоидностью мегакариоцитов, с одной стороны, и СОТ, с другой. Это послужило основанием для предположения, что повышение класса плоидности связано с более высоким гемостатическим потенциалом тромбоцитов (Brown A., Martin J., 1994). Как бы там ни было, изменение плоидности мегакариоцитов млекопитающих - это путь адаптации системы к изменяющимся потребностям гемостаза.

В. van der Loo и J. Martin (1999) поддерживают мнение о взаимосвязи между плоидностью, объемом цитоплазмы мегакариоцитов и СОТ. Однако прямых данных, подтверждающих такой взгляд, до сих пор не получено, а имеющиеся сведения противоречивы. В модельных экспериментах на мышах, тромбоцитопения приводит к быстрому повышению СОТ без изменения содержания ДНК в мегакариоцитах (Corash L., Chen Н., Levin J. et al., 1987). А у больных ИТП, увеличение СОТ наблюдалось на фоне повышения плоидности мегакариоцитов и содержания ИЛ-11 в крови (Chang М., Suen J., Meng G. et al., 1996). Введение рекомбинантного ТПО здоровым животным вызывало снижение СОТ и увеличение как числа мегакариоцитов, так и их плоидности (Harker L., Hunt P., Marzec U. et al., 1996). А после введения антитромбоцитарной сыворотки кроликам, вызывающей развитие тромбоцитопении в течение 6 дней, увеличивается объем цитоплазмы мегакариоцитов, удваивается количество продуцируемых тромбоцитов и их СОТ (Martin J., Trowbridge Е., Salmon G. et al., 1982). Кроме того, при сепсисе наблюдается как повышение, так и понижение СОТ, однако именно рост этого показателя коррелирует со смертностью больных (Becchi С., Al Malyan М., Fabbri L. et al, 2006).

У больных диабетом, особенно при наличии сосудистых осложнений, наблюдается повышение содержания клеток с более высокой плоидностью, чем 16N (нормальная модальная плоидность у млекопитающих), с одновременным снижением количества 16N и 8N мегакариоцитов. Вместе с этим у них повышается СОТ. Рост плоидности и СОТ коррелирует с увеличением в крови ИЛ-6 и фибриногена, которые регулируют мегакариоцитопоэз (Brown A., Hong Y., de Belder A. et al., 1997). Такая же картина отмечена и у пациентов с нарушением поступления глюкозы, что может повышать риск развития тромботических осложнений у этих категорий пациентов (Coban Е., Bostan F., Ozdogan М., 2006). Все это свидетельствуют о том, что и СОТ, и плоидность мегакариоцитов находятся под особым гормональным контролем и в зависимости от его состояния могут меняться как независимо друг от друга, так и однонаправлено.

СОТ может варьировать от 2 до 40 фл. и меняться в ответ на различные физиологические и патологические состояния. В отличие от СОТ, возраст и размер тромбоцитов не служат определяющими факторами их функциональной активности (Thompson С., Love D., Quinn P. et al., 1983; Thompson C., Jakubowski J., Quinn P. et al., 1984). В условиях экспериментальной тромбоцитопении у мышей повышение СОТ на ранних стадиях продукции (12 час) сопровождалось снижением плотности тромбоцитов (Corash L., Мок Y., Levin J. et al., 1990). У здоровых добровольцев наблюдается обратная взаимосвязь между СОТ и количеством тромбоцитов. Подобное соотношение этих параметров остается постоянным у каждого индивидуума на протяжении длительного времени до тех пор, пока продукция происходит в здоровом организме (Thompson С., Diaz D., Quinn P. et al., 1983). Однако, при стимуляции тромбопоэза, эта связь нарушается. В условиях тромбоцитопении, индуцированной введением антисыворотки, уже через 8 часов начинают рождаться тромбоциты большего объема (Corash L., Chen Н., Levin J. et al., 1987). А при тромбоцитозе у крыс, вызванном винкристином, увеличение количества тромбоцитов не сопровождалось повышением из объема (Gladwin A., Martin J., 1990). То есть, в условиях патологии происходит расбалансировка тромбоцитопоэза, которая приводит к появлению в крови тромбоцитов с нарушенной активностью.

Объем тромбоцитов используется в качестве маркера их функций. По величине СОТ предлагается судить об активности тромбоцитов, их способности к агрегации и реакции освобождения ТХА2, ТФ-4 и (3-ТГ (Martin J., Bath P., 1991; Sharp D., Bath P., Martin J., 1995). Повышение COT наблюдается у больных инфарктом миокарда (Cameron Н., Ibbotson R., Carson P., 1983), инсультом (O'Malley Т., Langhorne P., Elton R., 1995), хроническими сосудистыми патологиями (Bath P., Buckenham Т., MacGregor G., 1994; Endler G., Klimesch A., Sunder-Plassmann H., 2002), диабетом (Sharpe P., Trinick Т., 1993). Значительное увеличение COT служит показателем плохого прогноза выживаемости больных инфарктом миокарда (Pabon О., Nieto В., Morinigo М. et al., 1998), инсультом (Butterworth R., Bath P., 1998), с повышенным риском рестеноза после коронарной ангиопластики (Smyth D., Martin J., Michalis L. et al., 1993). У больных с повышенным СОТ в течение первые 6 месяцев после инфаркта миокарда наблюдается большее число повторных эпизодов и выше уровень внезапной смертности (Martin J., Bath P., Burr M., 1991). Это может быть связано с возросшим риском тромбоза коронарных артерий и особенно выражено у больных с диабетом.

Кроме того, установлено, что СОТ может служить независимым предиктором риска развития инсульта среди лиц, у которых ранее наблюдались нарушения мозгового кровообращения (Bath P., Algert С., Chapman N. et al., 2004). Однако, в этом исследовании, проведенном на 6105 испытуемых, не обнаружили связи между СОТ и серьезными коронарными осложнениями.

Возможно, такой результат связан с тем, что только у 8% из включенных в протокол лиц, ранее наблюдался инфаркт миокарда, в отличие от других исследований, включавших больных с наличием этого заболевания в анамнезе (PROGRESS, 2001). Кроме того, отличия в результатах могут быть связаны с разными способами измерения и отсутствием единого стандартизованного метода оценки. Показано, что величина СОТ значительно колеблется в зависимости от типа антикоагулянта и наиболее воспроизводима в случае использования ЭДТА, по сравнению с цитратом Na и гепарином. Время проведения измерения также может влиять на величину СОТ. Так, за первые 30 мин после взятия крови СОТ уменьшается, а через 24-48 ч увеличивается. Еще одним из важных моментов, который необходимо учитывать, может быть то, что измерения, проводимые на различных счетчиках и гемоанализаторах, сложно сравнивать друг с другом из-за различий в получаемых значениях.

4. МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ МЕГАКАРИОЦИТОПОЭЗА

Для поддержания нормального количества тромбоцитов в крови, при средней продолжительности их жизни около 10 дней и хранении одной трети в селезенке, во взрослом организме каждый день должно появляться 1x1011 новых клеток. В то же время, в ситуациях повышенного потребления тромбоцитов уровень продукции может повышаться в 10 раз. Поддержание нормального поэза и переход к ускоренной выработке тромбоцитов - это сложный многокомпонентный процесс, который регулируется большим количеством биохимических факторов.

Стимуляция мегакариоцитопоэза происходит на двух разных уровнях в клетках-предшественниках и в фазе эндомитоза мегакариоцитов с их конечной дифференциацией. На первом уровне важнейшим, специфичным гуморальным стимулятором служит колониестимулирующий фактор, усиливающий пролиферацию клеток-предшественников и вовлечение их в образование последующих элементов мегакариоцитарной линии. Созревание мегакариоцитов и продукция тромбоцитов регулируется транскрипционными факторами и цитокиинами, важнейшие из которых ТПО, GATA-1 и NF-E2.

Гуморальный регулятор ТПО специфичен только для мегакариоцито- и тромбоцитопоэза, действует преимущественно на отдельные мегакариоцитарные элементы и ускоряет их ядерное и цитоплазматическое созревание, включая стадию отделения тромбоцитов. (Kaushansky К., 1995). Кроме того, оба эритроидных транскрипционных факторов - ядерный фактор GATA-1 и NF-E2 необходимы для созревания мегакариоцитов и подготовке к продукции тромбоцитов. У мышей, лишенных генов одного из этих факторов, наблюдается тромбоцитопения вследствие нарушения созревания мегакариоцитов (Sauvage F., Carver-Moore К. et al., 1996).

4.1. ТПО и его рецептор c-Mpl.

Впервые в 1958 г. E.Kelemen с соавт. назвали гуморальный фактор, приводящий к увеличению продукции тромбоцитов, тромбопоэтином. И только в 90-е годы было выяснено, что ТПО - это цитокин, служащий лигандом рецептора c-Mpl, экспрессированого на поверхности мембраны мегакариоцитов и тромбоцитов (Kaushansky К., 1995). ТПО синтезируется в печени, почках, селезенке, легких и костном мозге. Однако ТПО, образующийся в почках, не участвует в тромбоцитопоэзе (von dem Borne A., Folman С. et al., 2002).

Рассматривается несколько путей регуляции содержания ТПО в организме. Согласно первому, синтез ТПО находится на постоянном уровне, а его содержание в крови контролируется связыванием с рецептором c-Mpl на тромбоцитах и мегакариоцитах, что зависит от общей массы клеток, их метаболизма и способности разрушать данный цитокин. Второй возможный механизм заключается в регуляции гена экспрессии ТПО по принципу обратной связи и поэтому содержание его мРНК может варьировать. Показано, что белки а-гранул тромбоцитов регулируют тромбоцитопоэз, влияя на экспрессию гена мРНК ТПО в стромальных клетках костного мозга. PDGF и FGF оказывают стимулирующее действие, а ТФ-4, тромбоспондин и ТФР-Р, угнетающее. В последнее время обсуждается третий путь регуляции, имеющий место в условиях реактивного тромбоцитоза, когда уровень ТПО выше, чем можно предположить исходя из количества тромбоцитов. Подобная ситуация может быть вызвана усилением его синтеза в печени, которое происходит в результате повышения уровня ИЛ при воспалении (Kaushansky К., 2005). Хотя главенствующая роль ТПО в регуляции продукции тромбоцитов не подлежит сомнению, до сих пор до конца остается неясным механизм, с помощью которого этот контроль осуществляется.

Одним из важнейших этапов регуляции может быть присоединение ТПО к его рецептору c-Mpl, который также синтезируется в печени, почках и мегакариоцитах. Этот рецептор обнаружен на всех клетках мегакариоцитарной линии, включая тромбоциты. Некоторое количество c-Mpl присутствует и на эндотелиальных клетках. Тромбоциты содержат наибольшее число этих рецепторов, доходящее до 200 копий. Снижение или отсутствие c-Mpl на клетках костного мозга блокирует мегакариоцитопоэз. У 85% мышей с генетическим дефицитом c-Mpl отмечается тромбоцитопения и снижение количества мегакариоцитов в костном мозге на фоне неизмененного числа других гемопоэтических клеток.

Когда в организме возникает необходимость снижения продукции тромбоцитов, регуляция идет по пути увеличения присоединения ТПО к своим рецепторам, что понижает его концентрацию и приводит к недостаточному влиянию на мегакариоцитпоэз. И наоборот, когда в крови циркулирует мало тромбоцитов и необходимо их пополнение, снижается количество присоединеного к кровяным пластинкам лиганда. В следствии этого большее его количество остается для воздействия на мегакариоциты, что способствует усилению продукции. Подобная система контролирует и размер рождающихся тромбоцитов. Большие тромбоциты более реактивны и для поддержания нормального гемостаза их необходимо меньше, чем клеток малого размера. Большие тромбоциты содержат повышенное число рецепторов ТПО, ГП lb и

ГГШЬ/IIIa, что позволяет им присоединять больше лиганда, тем самым, сокращая его количество, остающееся для взаимодействия с мегакариоцитами. Учитывая это, более крупные тромбоциты значительнее понижают уровень ТПО в крови по сравнению с клетками меньшего размера при равном количестве их в крови. Так что существует обратная взаимосвязь между количеством и размером тромбоцитов при мегакариоцитопоэзе (van der Loo В., Martin J., 1999).

ТПО, являясь главным гормоном контроля развития мегакариоцитов, обладает способностью индуцировать их полное созревание, полиплоидизацию, увеличивать размеры клеток и экспрессию в них гликопротеинов, образование внутригранулярных структур, демаркационных мембран и фрагментацию цитоплазмы. Он регулирует мегакариоцитопоэз, запуская освобождение мегакариоцитами других факторов роста (Nagata Y., Muro Y., Todokoro К., 1997).

4.2. Транскрипционный фактор GATA-1.

В клетках-предшественниках поздних стадий дифференцировки транскрипционный фактор GATA-1, связываясь с одноименным участком промотера гена, дает направление дальнейшему развитию клетки в сторону эритроцитарно-мегакариоцитарного ростка. При отсутствии гена GATA-1 у эмбрионов наступает гибель плода, связанная с развитием у него анемии в сочетании с аномальным или полным отсутствием мегакариоцитопоэза. У мышей мутация этого гена может сопровождаться тромбоцитопенией и увеличением числа мегакариоцитов с нарушенной ультраструктурой. При культивировании in vitro костного мозга таких мышей наблюдается гиперпролиферация мегакариоцитарных колоний, содержащих мутантные формы клеток с задержкой в них развития ядра и цитоплазмы. В большинстве мегакариоцитов отсутствовал эндомитоз, они меньше экспрессировали мРНК генов, специфичных для этих клеток (ГП1Ь, c-mpl, NF-E2, ТФ-4). У людей с наследственными мутациями в аминотерминальных участках GATA-1 развивается клинико-гематологическая картина тромбоцитопении, иногда сочетающаяся с анемией. (Chang A., Cantor A., Fujiwara Y. et al., 2002; Mehaffey M., Newton A., Gandhi M. et al., 2001).

Транскрипционный фактор GATA-1 обеспечивает регуляцию мегакариоцитопоэза как на ранних стадиях дифференцировки, так и на стадии роста и созревания клеток. Взаимодействие GATA-1 с другими представителями его семейства, такими как Fli-1 и RUNX1 приводит к повышению в мегакариоцитах экспрессии ГП1Х и ГП1Ь. Образующиеся при этом тромбоциты отличаются аномальной структурой и нарушениями в способности к активации (Kostyak J., Naik U., 2007).

4.3. Транскрипционный фактор NF-E2.

Транскрипционный фактор NF-E2, представляющий собой ДНК-связывающий белок ядра клеток, участвует в дифференцировке мегакариоцитов. Под действием ФНОа NF-E2 кратковременно активируется и перемещается в ядро мегакариоцитов, что способствует их выживаемости и пролиферации. При отсутствии NF-E2 у мышей отмечается тяжелая тромбоцитопения, но не развивается анемия, чем его действие отличается от GATA-1. Также происходит задержка дифференцировки мегакариоцитов, их дисплазия и значительное увеличение количества незрелых форм. (Shivdasani R., Rosenblatt М., Zucker-Franklin D., 1995). NF-E2 играет существенную роль в регуляции созревания и выхода в кровоток тромбоцитов. Отсутствие этого фактора в мегакариоцитах приводит к исчезновению в них (3-1 тубулина и его мРНК, необходимого для формирования тяжей протромбоцитов. В этом случае нарушается продукция ПТ (Lecine P., Italiano J., Kim S. et al., 2000). Подавление гена, ответственного за синтез NF-E2, приводит к нарушению созревания и биогенеза тромбоцитов (Chen Z., Ни М., Shivdasani R. et al., 2006). Дефицит NF-Е2, приводящий к снижению продукции тромбоцитов у матери, может вызывать замедление эмбрионального роста, снижение васкуляризации плаценты и развитие геморрагий в плаценте (Isermann В., Nawroth Р., 2006).

4.4. Регуляция мегакариоцитопоэза цитокинами.

Цитокины не только усиливают действие ТПО, но и непосредственно влияют на разные стадии мегакариоцитопоэза (Bunting S, Widmer R, Lipari Т. et al, 1997).

4.4.1. ИЛ-1.

ИЛ-ip индуцирует мегакариоцитопоэз и его действие сходно с ИЛ-3 и ИЛ-6, но несколько ниже, чем ТПО. ИЛ-1а регулирует созревание мегакариоцитов и отшнуровку тромбоцитов (Vainchenker W, Debili N, Mouthon M. et al, 1995). Но более выражено его влияние за счет вторичной стимуляции других цитокинов (колониестимулирующие факторы, ИЛ-3), высвобождающихся из макрофагов и стромальных клеток, и увеличения чувствительности клеток-предшественников к их действию. Все они экспрессируют рецепторы, общие для а- и (3-форм ИЛ-1. Также ИЛ-1 обладает способностью индуцировать продукцию ИЛ-2, ИЛ-6 (Рукавицын О. А, Поп В. П, 2005). Запуск синтеза ИЛ-1 в моноцитах и макрофагах происходит в результате их адгезии и фагоцитоза, а также активации бактериальными и иными продуктами (липополисахариды, некоторые экзотоксины, мурамилдипептид, пептидогликаны, митогены). Продукция усиливается под действием цитохалахина В, колхицина и ингибитора синтеза белка циклогексимида (явление супериндукции). Ингибиторами синтеза ИЛ-1 являются простагландин Е2, глюкокортикоиды, факторы, повышающие уровень цАМФ.

4.4.2. ИЛ-3.

ИЛ-3 в основном действует на ранних стадиях развития полипотентных кроветворных предшественников. Он влияет на все дифференцирующиеся клетки мегакариоцитарного ростка и его эффект прекращается на уровне зрелого мегакариоцита. Кроме того, ИЛ-3 способствует увеличению продукции ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНОа (Рукавицын О. А, Поп В. П, 2005). Синтез ИЛ-3 клетками стромы кроветворных органов невелик и в основном он осуществляется активированными Т-лимфоцитами. Из-за того, что он проявляет свое действие при стрессе (когда Т-клетки мигрируют в костный мозг) и иммунном ответе, сопровождающемся активацией Т-клеток, его называют экстренным регулятором кроветворения. 4.4.3. ИЛ-6.

ИЛ-6 относится к многофункциональным цитокинам, одним из эффектов которого является стимулирвание тромбоцитопозза. В экспериментах на животных ИЛ-6 вызывал повышение числа тримбоцитов, увеличение их размеров и плоидности мегакариоцитов (Burstein S., Downs Т., Friese P. et al., 1992).

При этом ИЛ-6 не является фактором роста мегакариоцитов, так как не увеличивает их общее число и количество колониеобразующих единиц в костном мозге. Уровень ИЛ-6 повышается при реактивных тромбоцитозах, но не меняется при тромбоцитопении. Введение ИЛ-6 больным, не получающим химиотерапию, приводило к увеличению числа тромбоцитов вдвое в течение 10 дней. Он, в большей степени, служит фактором терминального созревания мегакариоцитов, способствует увеличению их размеров, полиплоидии и контролирует размер рождающихся тромбоцитов (Peng J., Friese P., George J. et al., 1994). Однако, есть данные, что при отсутствии ТПО рецептора c-Mpl у мышей инъекция ИЛ-6 приводит не только к повышению количества тромбоцитов, но и к увеличению числа мегакариоцитарных предшественников и самих мегакариоцитов (Gainsford Т., Roberts A., Kimura S. et al., 1998).

Клетки, вырабатывающие ИЛ-6 чрезвычайно многочисленны. К ним относятся фибробласты (Weissenbach J., Chernajovsky Y. et al. 1980), моноциты, макрофаги (Aarden L., De Groot E., Schaap O., 1987), тучные клетки (Van Snick J. 1990), кератиноциты (Baumann H., Jahreis G., Sauder D.N. et al., 1984), эндотелий (Podor Т., Jirik F., Loskutoff D. et al. 1989) и мегакариоциты (Navarro S., Debili N., Le Couedic J. et al., 1991).

В норме продукция ИЛ-6 незначительна, однако она возрастает при инфицировании клеток вирусами или в ответ на добавление липополисахаридов (Frei К., Malipiero U., Leist Т., 1989; Nakajima К., Martinez-Maza О., Hirano Т., 1989). Кроме этого, индуцировать секрецию ИЛ-6 могут ИЛ-1, ФНОа (один или в сочетании с ИФН-у), PDGF, ИЛ-3 и ГМ-КСФ (Shalaby М., Waage A., Espevik Т., 1989; Sanceau J., Beranger F., Gaudelet С. et al., 1989). Экспрессия мРНК для ИЛ-6 происходит в пределах 1 ч после активации, а секреция фактора наблюдается уже через несколько часов. Спустя 2 ч после внутривенного введения липополисахарида уровень ИЛ-6 в сыворотке крови повышается в 1 ООО раз.

На кроветворные клетки ИЛ-6 в основном действует как кофактор, способствуя проявлению эффектов ИЛ-3, ГМ-КСФ и М-КСФ. В результате ИЛ-6 усиливает образование in vitro колоний всех типов (Pang L., Weiss М., Poncz М., 2005).

4.4.4. ИЛ-7

ИЛ-7 принадлежит к колониестимулирующим факторам. Он способствует дифференцировке как стволовых клеток на ранних стадиях развития, так и мегакариоцитов (Mouthon М., Freund М., Titeux М. et al., 1994). ИЛ-7 индуцирует секрецию других цитокинов моноцитами, усиливает экспрессию ингибитора апоптоза bcl-2, способствуя тем самым выживаемости клеток (Mizoguchi Н., Masuda М., 1991).

ИЛ-7 высвобождается из мегакариоцитов и тромбоцитов и может повышать активирующее действие тромбина и АДФ. Выделяясь из тромбоцитов, он может совместно с цитокинами, продуцируемыми другими клетками, быть причиной активации гемостаза и тромбоза, особенно в участках повреждения сосуда (Soslau G., Morgan D., Jaffe J., 1997). Он усиливает развитие воспаления в процессе атерогенеза, содействует взаимодействию тромбоцитов с моноцитами и другими цитокинами. Его уровень повышается в крови больных стабильной, и еще выше, нестабильной стенокардией, за счет освобождения из активированных тромбоцитов. Аспирин подавляет выброс ИЛ-7 тромбоцитами (Damas J., Waehre Т., Yndestad А., 2003).

4.4.5. ИЛ-9.

ИЛ-9 стимулирует выделение IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, ИФ-у, влияет на кроветворение, апоптоз (Pilette С., Ouadrhiri Y., Van Snick J., 2002).

Показано, что он значительно усиливает действие ТПО на созревание и увеличение размера мегакариоцитов. В условиях культуры, добавление ИЛ-9 вызывает значительное увеличение плоидности клеток и повышение количества мегакариоцитов с плоидностью больше 16N (Cortin V., Gamier А., Pineault N., 2005). Его эффект усиливается в присутствии эритропоэтина и фактора роста стволовых клеток. Нейтрализация моноклональными антителами рецептора ИЛ-9 приводила к полному исчезновению такого совместного эффекта, что свидетельствует о важности именно этого цитокина в данной смеси (Fujiki Н., Kimura Т., Minamiguchi Н., 2002).

Уровень ИЛ-9 повышается у больных аллергией и астмой, коррелирует с аллерген-специфичным IgE при хронических обструктивных заболеваниях легких (Liu Z., Yao W., Chen Y. et al., 2004; Devos S., Cormont F., Vrtala S. et al., 2006).

4.4.6. ИЛ-11.

ИЛ-11 способствует пролиферации ранних кроветворных предшественников, подготавливает стволовые клетки к восприятию действия ИЛ-3, индуцирует развитие и созревание мегакариоцитов, что приводит к увеличению продукции тромбоцитов (Bruno Е., Briddell R., Cooper R. et al., 1991; Burstein S., Mei R., Henthorn J. et al., 1992).

Увеличение уровня ИЛ-11 у больных ИТП после их излечения свидетельствует о его роли в регуляции тромбоцитопоэза в ситуациях тромбоцитопении, вызванной усиленным разрушением тромбоцитов. Кроме того, повышеный СОТ, типичный для этой патологии, нормализуется после выздоровления. Возможно, именно ИЛ-11 регулирует появление клеток разного объема (Chang М., Suen J., Meng G. et al., 1996).

Введение ИЛ-11 стимулировало плюропотентные стволовые клетки в костном мозге и периферической крови и способствовало мегакариоцитопоэзу и тромбоцитопоэзу (Orazi A., Cooper R., Tong J. et al., 1996). Рекомбинантный ИЛ-11 приводит к увеличению числа тромбоцитов в костном мозге (Cantor S., Elting L., Hudson D. et al., 2003).

Клинические исследования больных, получавших высокие дозы химиотерапии и имевшие высокий риск развития тромбоцитопении, выявили способность препаратов ИЛ-11 уменьшать количество тяжелых осложнений и снижать количество переливаний тромбоцитарной массы (Lawitz Е., Hepburn М., Casey Т., 2004).

4.4.7. ИЛ-12.

ИЛ-12 в синергизме с ИЛ-3 и фактором роста стволовых клеток стимулирует пролиферацию ранних предшественников гемопоэза. В присутствии ИЛ-11 и фактора роста стволовых клеток, ИЛ-12 ускоряет образование мультилинейных колоний клетками-предшественниками гемопоэза (Wickenhauser С., Lorenzen J., Thiele J. et al., 1995). ИЛ-12 обусловливает выход стволовых кроветворных клеток в циркуляцию и формирование экстрамедуллярных очагов кроветворения, с чем связано развитие гепато- и спленомегалии при его системном введении (Rodriguez-Sosa М., Elizondo G., Lopez-Duran R. et al., 2005). Именно с выходом клеток в циркуляцию может быть связан тот факт, что костномозговой гемопоэз под влиянием ИЛ-12 несколько подавляется, вплоть до развития анемии (Chang К., Stevenson М., 2004). Кроме того, ИЛ-12 подавляет ангиогенез (Siddiqui F., Ehrhart Е., Charles В. et al., 2006).

4.4.8. ГМ-КСФ.

ГМ-КСФ играет важную роль в росте и дифференциации не только гемопоэтических предшественников, но и мегакариоцитов. Совместно с другими стимулирующими факторами, он вызывает пролиферацию мегакариоцитарных предшественников (McNiece I., McGrath Е., Quesenberry P., 1988). ГМ-КСФ может регулировать репликацию ДНК в выделенных мегакариоцитах (Ishida Y., Yano S., Yoshida Т., 1991). В более ранних работах этот эффект на мегакариоцитопоэз обнаружен не был (Williams N., Jackson Н., Iscove N., 1984). Однако, дальнейшие исследования показали, что рекомбинантный ГМ-КСФ оказывает влияние как в условиях in vivo, так и в культуре клеток, но только в присутствии ИЛ-3 (Vannucchi A., Grossi А., Rafanelli D., 1990; Cardier J., Erickson-Miller С., Murphy Mr., 1997).

ГМ-КСФ увеличивает выход в кровь ранних предшественников стволовых клеток у больных острым инфарктом миокарда и, благодаря этому, способствует ангиогенезу и восстановлению величины фракции выброса (Deng Z., Yang С., Deng Н. et al., 2006). Также он повышает продукцию ИЛ-1 макрофагами (Adkins К., Levan Т., Miesfeld R. et al., 1998) и инфильтрацию моноцитов в зоне поражения миокарда (Parissis J., Filippatos G., Adamopoulos S. et al., 2006).

В норме экспрессия ГМ-КСФ находится на низком уровне и чаще всего он не определяется в плазме. Но она значительно возрастает в ответ на появление других цитокинов, инфекционных агентов, полиэлектролитов, митогенов и антигенов (King С., Brennan S., Thompson P. et al., 1998; Takizawa H., Ohtoshi Т., Kawasaki S. et al., 2000). Его уровень возрастает у больных астмой (Sousa A., Poston R., Lane S. et al., 1993).

4.4.9. Эритропоэтин

Долгое время главной мишенью эритропоэтина считался эритропоэз (Faura J., Ramos J., Reynafarje С. et al., 1969; Jelkman W., 1992). Но в более поздних работах было выяснено, что он влияет на пролиферацию и дифференциацию мегакариоцитов, что позволило отнести его к многофункциональным цитокинам.

Введение эритропоэтина больным хронической почечной недостаточностью приводило к повышению содержание предшественников мегакариоцитов в костном мозге (Stone W, Graber S, Krantz S. et al, 1988). In vitro эритропоэтин стимулирует как мегакариоцитопоэз, так и созревание мегакариоцитов (McLeod D, Shreeve М, Axelrad A. et al, 1976). Введение животным рекомбинантного эритропоэтина вызывало увеличение числа тромбоцитов (Krafft A, Huch R, Hartmann S. et al, 2004).

Лечение эритропоэтином анемии у новорожденных с недостаточным весом кроме стимуляции эритропоэза приводило к повышению экспрессия Р-селектина на тромбоцитах в первые недели терапии. В дальнейшем, при сохраняющемся на прежнем уровне количестве клеток, повышалось число ретикулярных тромбоцитов (Haiden N, Cardona F, Schwindt J. et al, 2005).

Все это свидетельствует о том, что тромбоцитопоэз зависит от большого числа факторов. Продукция тромбоцитов тесно связана с состоянием организма и в первую очередь с развитием воспалительного процесса и гормональным статусом организма. Нарушение различных звеньев мегакариоцитопоэза приводит к структурным изменениям в этих гемопоэтических клетках, что ведет к нарушению количества и качественных характеристик образовавшихся тромбоцитов. В последнее время появились сведения о влиянии других, ранее не относящихся к гемопоэтическим факторам веществ, которые необходимо также рассмотреть.

4.5. Молекулы адгезии

Гемопоэтические предшественники из костного мозга содержат и экспрессируют рецепторы адгезии, через которые происходит взаимодействие клеток друг с другом и с компонентами экстрацеллюлярного матрикса (Simmons Р, Levesque J, Zannettino А, 1997). Молекулы адгезии играют важную роль в процессах гемопоэза (Hurley R, McCarthy J, Verfaillie С, 1995; Simmons P, Zannettino A, Levesque J, 1998). Они способствуют росту и развитию гемопоэтических предшественников (Jiang Y., Prosper F., Verfaillie С., 2000).

На клетках гемопоэтического ряда идентифицировано более 20 рецепторов адгезии. Учитывая структурные и функциональные особенности, их принято делить на интегрины, кадерины, селектины, члены семейства муциноподобных молекул и семейство рецепторов иммуноглобулинов (Verfaillie С., Hurley R., Bhatia R., 1994).

Рг и р2-интегрины отвечают за взаимодействие между клетками и компонентами экстрацеллюлярного матрикса, такими как фибронектин, коллаген, ламинин, тромбоспондин, а также с экспрессированными на поверхности клеток молекулами VCAM и ICAM (Prosper F., Verfaillie С., 2001). Во взрослом организме ргинтегрин играет доминирующую роль в заякоривании гемопоэтических клеток в костном мозге и выходе их в кровоток (van der Loo J., Xiao X., McMillin D., 1998). В печени эмбрионов мышей, дефицитных по Pi-интегрину, отсутствуют клетки-предшественники, что свидетельствует о необходимости данного интегрина для их перемещения между гемопоэтическими органами в процессе развития (Hirsch Е., Iglesias А., Potocnik А., 1996). р2-интегрин, взаимодействуя с 1С AM, способствует мобилизации предшественников (Pruijt J., van Kooyk Y., Figdor C., 1998). p3-интегрин входит в состав ГППЬ/IIIa, ответственного за связывание этих клеток с фибриногеном. Он появляется на ранних стадиях развития гемопоэтических предшественников и может регулировать их развитие (Corbel С., Vaigot Р., Salaun J., 2005).

Интегральный мембранный белок Р-селектин присоединяется к муцино-подобному Р-селектин-гликопротеин лиганду-1, экспрессирующемуся на примитивных гемопоэтических клетках-предшественниках (Sako D., Chang X., Barone К. et al., 1993). Р-селектин экспрессируется только на поздних стадиях развития мегакариоцитов, способствует их прикреплению к эндотелию, что содействует тромбоцитопоэзу. Отсутствие Р-селектина у мышей приводит к нарушению адгезивных свойств экстрацеллюлярного матрикса в костном мозге, повышению количества предшественников и незрелых мегакариоцитов и увеличению секреции ТФР-^ (Banu N., Avraham S., Avraham Н., 2002).

Такие молекулы адгезии, как ГП lb, ГППЬ/IIIa и Р-селектин являются важнейшими медиаторами адгезии мегакариоцитов, необходимой для их роста и созревания. Цитокины повышают экспрессию молекул адгезии не только на клетках крови, но и на мегакариоцитах, чем можно объяснить усиление тромбоцитопоэза при воспалении. Молекулы адгезии участвуют в передвижении и закреплении мегакариоцитов в гемопоэтических органах, их пролиферации и дифференциации.

4.6. Катехоламины

Активация иммунной системы, компоненты которой играют важную роль в стимуляции мегакариоцитопоэза, часто протекает одновременно с активацией нейроэндокринной системы.

Катехоламины способны стимулировать экспрессию цитокинов. Адреналин повышает уровень ИЛ-10 на фоне введения в кровь здоровым добровольцам липополисахаридов (van der Poll Т., Coyle S., Barbosa К. et al., 1996). Наиболее существенно катехоламины влияют на повышение уровня ИЛ-6. Подкожные аппликации адреналина крысам приводят к повышению уровня этого цитокина в сыворотке (DeRijk R., Boelen A., Tilders F. et al., 1994). В модельных экспериментах с перфузией печени добавление адреналина в раствор повышало экспрессию ИЛ-6. Источником продукции служили Купферовские клетки (Liao J., Keiser J., Scales W. et al., 1995). Кроме того, применение катехоламинов в терапевтических дозах приводит к увеличению уровня мРНК многих цитокинов в печени, абдоминальных лимфатических узлах и селезенке свиней с эндотоксинемией (Gornikiewicz A., Sautner Т., Brostjan С. et al., 2000).

Катехоламины опосредуют регуляцию выработки цитокинов лейкоцитами. Несмотря на то, что они снижают продукцию лейкоцитами ИЛ-6, вызванную липополисахаридами, уровень этого лейкина в крови животных с эндотоксинемией впечатляюще увеличивался под действием адреналина. Оказалось, что он стимулирует образование ИЛ-6 в эндотелиальных клетках. В условиях культуры клеток норадреналин обладал такими же свойствами, но в условия целого организма эффективным был только адреналин. Кроме того, катехоламины усиливают индуцированную липополисахаридами продукцию белка ИЛ-6 (Bergmann М., Gornikiewicz A., Tamandl D. et al., 2003). Инфузия адреналина мышам приводит к повышению в 15 раз белка ИЛ-6 и в 40 раз его мРНК в скелетных мышцах и миоцитах (Frost R., Nystrom G., Lang С. et al., 2004).

Катехоламины, опосредованно через регуляцию уровня цитокинов, могут влиять на мегакариоцитопоэз. Но они также могут воздействовать на него и непосредственно, хотя механизм этого до сих пор остается неясным. Так, введение собакам адреналина усиливает тромбоцитопоэз, в то время как односторонняя адреналэктомия подавляет его. Двухсторонняя адреналэктомия приводит к увеличению количества и функциональной активности тромбоцитов на фоне значительного снижения количества мегакариоцитов в костном мозге (Абесадзе А., Мосидзе М., Квернадзе М. с соавт., 1990). Есть одно сообщение, свидетельствующее о способности зрелых мегакариоцитов захватывать значительное количество катехоламинов, но влияют ли они на жизнедеятельность этих клеток не ясно (Gordon В., DeBoer J., Wooldridge L. et al., 1991). На предшественниках мегакариоцитов обнаружены рецепторы к гистамину, который играет роль в пролиферации клеток (Tan М., Pan Z., Wang Q. et al., 1998).

Введение (3-адреностимулятора изопреналина крысам приводит к повышению количества тромбоцитов в кровотоке и значительному увеличению числа всех клеток мегакариоцитарного ряда, свидетельствующее о стимулировании тромбоцитопоэза. Высказывается предположение, что это может быть связано с известным действием изопреналина на многие процессы, такие как углеводный и жировой обмен, потребление кислорода, которые могут усиливать обмен веществ в мегакариоцитах и усиливать их пролиферативные свойства (Негреев Н.Н., Ганчев Т.С., 1986).

Все эти данные свидетельствуют о сложной регуляции созревания мегакариоцитов и продукции тромбоцитов, в которой участвует большое количество взаимозаменяемых и дополняющих друг друга биологически активных стимулов.

5. АПОПТОЗ МЕГАКАРИОЦИТОВ

В терминальной фазе жизни мегакариоцитов процесс их апоптоза и продукции тромбоцитов тесно связанные явления. После отделения тромбоцитов от цитоплазмы мегакариоцитов и выхода в кровь, голые ядра остаются в костном мозге, подвергаются апоптозу и фагоцитируются макрофагами. Процесс апоптоза мегакариоцитов имеет четкий механизм регуляции. С одной стороны, он регулируется анти-апоптозным белком Bcl-xL, который в больших количествах синтезируется в дифференцирующихся мегакариоцитах и исчезает в зрелых клетках, продуцирующих тромбоциты (Sanz С., Benet I., Richard С., 2001). Сверхэкспрессия Bcl-xL у трансгенных мышей приводила к умеренному повышению количества мегакариоцитов в костном мозге без изменения их плоидности и способности к продукции тромбоцитов. В то же время число мегакариоцитов, находящихся в стадии апоптоза снижалось, а образующиеся тромбоциты сохраняли нормальную реакцию в ответ на различные агонисты (Kaluzhny Н., Yu G., Sun S. et al., 2002). С другой стороны, в зрелых мегакариоцитах еще до отделения тромбоцитов происходит последовательная активация каспаз, которые представляют собой протеолитические ферменты. Они обнаружены в цитоплазме клеток в виде зернистых образований, не связанных с гранулами. Под их действием происходит расщепление ядерной мембраны клетки. Все эти белки, включая прокаспазу-3 и прокаспазу-9, присутствуют и в тромбоцитах (Shcherbina А., Remold-O'Donnell Е., 1999). Подавление активности каспаз приводит к снижению продукции тромбоцитов (De Botton S, Sabri S, Dauglas E. et al, 2002).

Кроме того, NO и циклические нуклеотиды могут участвовать в запуске апоптоза мегакариоцитов и одновременно способствовать продукции тромбоцитов на последних стадиях мегакариоцитопоэза. В отличие от хорошо известного ингибирующего эффекта N0 и простациклина на агрегацию тромбоцитов, эти два агента обладают разнонаправленным действием на апоптоз мегакариоцитов. Простациклин повышает уровень внутриклеточного цАМФ, но подавляет накопление цГМФ, вызываемое N0. Увеличение уровня цАМФ защищает мегакариоциты от NO-опосредованного апоптоза и сопровождается снижением активации каспазы-3. Накопление внутри клетки цГМФ или ингибитора цГМФ-специфической фосфодиэстеразы помогает усилению апоптоза. Важным моментом является то, что антиапоптическое действие простациклина (Gordge М, 2005).

Апоптоз представляет собой главный, кардинальный процесс, контролирующий длительность функциональной жизнеспособности клеток, которая может также регулироваться различными медиаторами воспаления. Среди клеток мегакариоцитарного ростка апоптоз наблюдается главным образом в зрелых мегакариоцитах (Falcieri Е, Bassini A, Pierpaoli S. et al, 2000).

6. НАРУШЕНИЯ МЕГАКАРИОЦИТОВ И СВЯЗАННЫЕ С ЭТИМ ИЗМЕНЕНИЯ В ТРОМБОЦИТАХ

Подавление мегакариоцитопоэза приводит к возникновению кровоточивости. Такая картина наблюдается у больных с вирусом иммунодефицита и при других инфекциях, сопровождающихся постинфекционной пурпурой. При этих патологиях в мегакариоцитах раньше чем в тромбоцитах происходят изменения, вызванные патологическим процессом (Nieuwenhuis Н, Sixma J, 1992). Развитие воспалительного процесса приводит к повышению уровня провоспалительных цитокинов, служащих важнейшими регуляторами мегакариоцитопоэза. Они не только усиливают его, но и стимулируют появление тромбоцитов с повышенной активностью. Все воспалительные заболевания способствуют увеличению количества тромбоцитов. Чаще всего это связано с повышением уровня ИЛ-6. Клиническое обследование и минимум исследований маркеров воспаления при выявленном тромбоцитозе часто позволяют заподозрить развитие воспалительного процесса (Mialou V., Kagialis-Girard S., Galambrun С. et al., 2005).

В случаях онкологических патологий, при которых опухоль обычно окружена фагоцитами, секретирующими большое количество цитокинов, наблюдается повышенная пролиферативная активность предшественников мегакариоцитов (Kristensen S., Bath P., Gladwin A. et al., 1992). У всех больных с новообразованиями на стадии метастазирования наблюдается повышение плоидности мегакариоцитов, что приводит к продукции суперактивных тромбоцитов, провоцирующих развитие тромбоэмболии (Schneider W., Gattermann N., 1994). При атеросклерозе у больных с повышенным уровнем цитокинов также увеличивается плоидность мегакариоцитов и выработка высокореактивных тромбоцитов (Mathur A., Hong Y., Wang G. et al., 2004).

При остром коронарном синдроме происходят нарушения в мегакариоцитах и тромбоцитах, что может быть связано с изменение уровня цитокинов, которые контролируют продукцию кровяных пластинок. Повышение уровня ИЛ-6 может быть связующим звеном между воспалением и окклюзией коронарных артерий. В то же время при активации тромбоцитов в результате их взаимодействия с измененным эндотелием повышается уровень ТПО, что приводит к повышению не только выработки кровяных пластинок, но и увеличению СОТ у этих больных (van der Loo В., Martin J., 1999).

Такие изменения при различных патологиях зависят в первую очередь от мегакариоцитопоэза и продукции различных по своим морфологическим и функциональным свойствам тромбоцитов.

7. ДИСКОВИДНЫЕ ТРОМБОЦИТЫ И ИХ АКТИВАЦИЯ

В крови здоровых людей и лабораторных животных большинство циркулирующих интактных тромбоцитов имеют характерную дисковидную форму (дискоцит), диаметр 2-4 мкм, толщину до 1,0 мкм и объем 6-9 фл. Поверхность дискоцитов гладкая с многочисленными небольшими углублениями, которые представляют собой места соединения плазматической мембраны и каналов открытой канальцевой системы (СОК). Дисковидная форма интактного тромбоцита поддерживается кольцом микротрубочек, которое располагается непосредственно у внутренней стороны плазматической мембраны вдоль наибольшей окружности клетки ("экватора"). В цитоплазме беспорядочно распределены тонкие актиновые филаменты, отдельные частицы гликогена или его группы, несколько типов органелл, отличающихся по плотности и внутреннему содержанию, а также каналы, относящиеся к двум мембранным системам - СОК и ПТС.

Дисковидная форма интактных тромбоцитов поддерживается в основном актином и тубулином, полимеризованные формы которых образуют микротрубочки и микрофиламенты. В таких клетках 25-50% актина находится в полимеризованном состоянии. Связывание и заякоривание на мембране концов актиновых филаментов ограничивает скорость их дальнейшей полимеризации и одновременно создает относительно жесткую субмембранную зону, которая функционирует как мембранный скелет. Он стабилизирует форму интактного тромбоцита и, что наиболее важно, не допускает контакта запасающих гранул с наружной и СОК мембранами, препятствуя созданию условий для выброса биологически активных веществ или «реакции освобождения». Фиксация цитоскелетных структур на плазматической мембране играет важную роль в обеспечении формы и интактного состояния клетки (Barkalow К., Witke W., Kwiatkowski D. et al., 1996). Кроме того, под плазматической мембраной у экваторов клетки располагаются кольца микротрубочек, состоящие из полимеризованных димеров тубулина, что создает жесткий и одновременно эластичный каркас, обеспечивающий форму диска (Hartwig J., Barkalow К., Azim A. et al., 1999). Тубулин тромбоциты получают в процессе терминальной дифференцировки мегакариоцитов. Его отсутствие в мегакариоцитах мышей приводит к тому, что у животных резко подавляется тромбоцитопоэз, развивается тромбоцитопения, а образующиеся тромбоциты имеют сферическую или эллипсовидную форму (Schwer Н., Lecine P., Tiwari S. et al., 2001).

Активация тромбоцитов обычно начинается в результате воздействия на плазматическую мембрану многообразных внешних стимулов и представляет собой процесс быстрого перехода из интактного в активированное состояние. По своей химической природе таким стимулирующим эффектом обладают нуклеотиды (АДФ), амины (адреналин, серотонин и др.), белки (тромбин, коллаген), арахидоновая кислота и ее производные (ТХА2, простагландины), липиды (фактор активации тромбоцитов) и другие соединения. Большинство из них действуют как лиганды, специфически связывающиеся с поверхностно ориентированными белковыми структурами плазматической мембраны -рецепторами, или разрушающие участки рецепторных молекул (протеолитические ферменты), что приводит к активации. В основе отдельных этапов активации лежат такие процессы, как структурно-функциональная перестройка мембраны, мобилизация и движение ионов, гидролиз фосфоинозитидов, высвобождение и окисление арахидоновой кислоты, фосфорилирование белков, повышение энергетического метаболизма, сокращение белков цитоскелета, изменение метаболизма циклических нуклеотидов. Именно благодаря способности тромбоцитов к активации, реализуется их функциональное предназначение в организме. В ходе и в результате активации клетки подвергаются ряду многообразных преобразований - изменяют форму, агрегируют, секретируют биологически активные субстанции (Шитикова А.С., 2000).

Активация тромбоцитов - быстрый процесс, начальная ее фаза взаимодействия агонист-рецептор занимает доли секунды, после чего запускается весь каскад реакций. Первая из них - изменение в структурной организации и функционировании белков опорно-сократительной системы, происходящее в ответ на повышение уровня свободного цитоплазматического Са , фосфорилирование легкой цепи миозина и плексина. При этом раньше всего наступают изменения в структурах, обеспечивающих поддержание формы тромбоцитов. Уже при незначительном увеличении концентрации цитоплазматического Са2+ происходит угнетение полимеризации тубулина и его деполимеризация, распад микротрубочек. Так в начале процесса активации ликвидируется основная структура, обеспечивающая поддержание дискоидной формы тромбоцитов. Стадия деполимеризации быстро сменяется реполимеризацией, в результате чего кольцо микротрубочек восстанавливается, но с уменьшением его диаметра. В таком виде оно окружает переместившиеся в центр клетки секреторные гранулы. Позднее, концентрически расположенные микротрубочки расходятся и располагаются беспорядочно в цитоплазме (Hartwig J., Barkalow К., Azim A. et al., 1999). Еще одним из важнейших участников начального этапа реорганизации цитоскелета при активации служит мембранный ГШЬ-IX. В интактных тромбоцитах он экспонирован на мембране и служит для взаимодействия с ФВб. Его цитоплазматический участок имеет цепь, взаимодействующую с актин-связаным белком филамином, и благодаря этому ГП1Ь участвует в поддержании скелета мембраны. (Englund G., Bodnar R., Li Z. et al., 2001). При нарушении синтеза, образования или экспрессии ГП16, характерных для синдрома Бернара-Сулье, тромбоциты теряют способность поддерживать форму диска. У таких больных большинство кровяных пластинок имеют сферическую форму и размер более 4 мкм (Lopez J., Andrews R., Afshar-Kharghan V. et al., 1998).

Весьма существенную роль в изменении формы играет преобразование актиновых структур. Непосредственно после появления активирующего стимула и повышения уровня цитоплазматического Са2+ происходит исчезновение нежной рыхлой сети микрофиламентов интактных тромбоцитов с почти одновременным взрывом нового процесса полимеризации, который захватывает уже не 25-50%, а 70-80% имеющегося в них актина. Для этой стадии характерна и новая организация актиновых филаментов в виде плотных пучков, или стресс-фибрилл. Бурно протекающая полимеризация актина сама может вызывать передвижение образующихся структур к краю клетки, где они формируют выросты или псевдоподии. Параллельно происходит и полимеризация миозина. Это создает условия для комплексования этих белков. Головки миозиновых молекул взаимодействуют с полимером актина, что приводит к образованию единой структуры актомиозина. Сокращение актомиозиновых тяжей, соединяющих, с одной стороны, плазматическую мембрану и мембраны СОК, а с другой, мембраны запасающих гранул, приводит к перемещению последних по направлению к границе клетки и после их слияния - к высвобождению содержимого органелл в СОК и внеклеточную среду (Hartwig J., 2006). В свою очередь могут возникать условия для деполимеризации актомиозина и дефосфорилирования миозина, что приводит к обратимости изменения формы и восстановлению некоторых функциональных особенностей тромбоцитов. В результате этого в кровоток возвращаются так называемые рециркулирующие кровяные пластинки, которые появляются там после их дезагрегации (Frojmovic М., Milton J., 1982).

Еще в 80-е годы прошлого столетия было предложено классифицировать тромбоциты по морфологическим признакам. Дисковидные тромбоциты в зависимости от характера поверхности мембраны подразделяют на три подгруппы: гладкие, рифленые и дискоциты с короткими отростками. К гладким дискоцитам относят тромбоциты округлой или овальной формы, плазматическая мембрана которых имеет ровные или неправильные округлые контуры. На некоторых из них определяются вдавливания или поры, которые представляют собой места выхода на поверхность СОК. Рифленые дискоциты имеют складчатую мембрану. Эти две популяции относят к формам покоя. Дискоциты с короткими единичными отростками имеют овальное или округлое очертание с гладкой или неправильной формой и тонкими псевдоподиями. К недискоидным тромбоцитам относят сферические формы и дегенеративно-измененные. Сферические пластинки могут быть гладкими, с отростками разной формы, сигарообразными, мечевидными. Дегеративно-измененные формы в норме встречаются редко (0,3%) и главным признаком их служит бугристая, напоминающая по внешнему виду цветную капусту мембрана. (Гаврилов O.K., Козинец Г.И, Черняк Н.Б, 1985). При патологических состояниях наблюдается увеличение количества сферических форм раздражения, что связано с их активацией. Наиболее подробную классификацию тромбоцитов по форме предложил R. Allen в 1979 г. Согласно его данным, тромбоциты периферической крови здоровых лиц, в основном имеют форму дисков, для которых характерны наличие плотных гранул и СОК. Кроме того, встречаются дискоциты с разнонаправленными бугорками и выростами, дискоциты с лучевидными выростами, сферические формы с выростами различной длины и без них, в форме сперматозоидов и двухполюсной биполярной формы. Содержание недисковидных тромбоцитов колеблется от 5% до 95% в зависимости от времени и способа выделения клеток. Однако все они обнаружены и в крови, фиксируемой глутаровым альдегидом непосредственно при венопунктуре, но их содержание составляло не более 14,2 % (Allen R, Zacharki L, Widirsky S. et al, 1979). Изменения морфологии тромбоцитов происходят и под действием силы напряжения сдвига в потоке. При умеренном повышении скорости потока, когда сила напряжения сдвига повышается незначительно, на поверхности мембраны начинают появляться небольшие выросты, при более высоких скоростях потока происходит сферуляция клетки и удлинение псевдоподий. Дальнейшее повышение скорости приводит к подтягиванию псевдоподий внутрь, их исчезновению, и возникновению гладких сферических форм (Maxwell М, Dopheide S, Turner S. et al, 2006). Сходные преобразования могут происходить в кровотоке под действием различных биохимических стимулов, и все различия в морфологии связаны с активацией тромбоцитов, ее степенью и тем, на какой стадии этого процесса проводится исследование. Родоначальником же всех этих различных морфологических форм служат дисковидные клетки, которые в такой форме появляются в кровотоке в результате мегакариоцитопоэза.

8. ПРОТРОМБОЦИТЫ ИЛИ БИПОЛЯРНЫЕ ТРОМБОЦИТЫ

Удлиненные цилиндрические, биполярной или веретенообразной формы тромбоциты иногда обнаруживают в циркулирующей крови и чаще всего для их обозначения в последние годы применяют термин «протромбоциты». Впервые в 1906 г. James Wright, опубликовавший исследование о морфологии тромбоцитов, предположил, что они образуются из мегакариоцитов, которые выбрасывают длинные цитоплазматические тяжи, проникающие через костномозговые синусы в просвет сосудов. Там они отделяются и дают начало кровяным пластинкам. Понадобилось почти сто лет, чтобы это предположение получило достаточно доказательств (Leavitt А., 2006). Формирующиеся длинные разветвленные тяжи, впервые названные протромбоцитами в 1976 r.R.Beker и P. De Broyn, могут в таком виде отделяться от материнской клетки и поступать в кровоток (Hartwig J., Italiano J., 2003; Schulze H., Shivdasani R., 2005; Junt Т., Schulze H., Chen Z. et al., 2007).

Поступление протромбоцитов различной длины в циркулирующую кровь одними из первых в 1987 г. показали М. Tong, P. Seth и D.Penington. В артериальной и венозной крови взрослых крыс они обнаружили различные по морфологии протромбоциты и их фрагменты, количество которых составляло около 6%. При этом основная часть тромбоцитов имели форму гладких дисков, формирование псевдоподий было минимальным, что свидетельствует об отсутствии активации. Внутривенное введение крысам антитромбоцитарной сыворотки, приводящее к развитию тромбоцитопении, уже через 24 часа вызывало повышение в несколько раз количества протромбоцитов (в среднем до 18%), которые были длиннее обнаруженных ранее и часто встречались формы в виде нанизанных бус с перетяжками. На длинных истонченных концах собирались кольца микротрубочек. Было предложено называть эти формы стрессовыми тромбоцитами», но этот термин не привился и почти не применяется. Удаление Са хелатированием с помощью ЭДТА приводило к сферуляции клеток и потере протромбоцитами их формы. При этом возникали сферы большого размера, в которые, возможно, превращались протромбоциты. Также было показано, что через сутки после введения сыворотки почти в 2 раза по сравнению с контролем повышался СОТ, а его восстанавление до первоначального уровня происходило только к 6-7 суткам.

Вслед за выходом этой работы, в том же журнале было опубликовано письмо к редактору, в котором критиковались как методы, примененные в исследовании, так и подвергались сомнению полученные результаты, которые были со скепсисом названы «сюрпризом», а авторы обвинены в публикации артефактов (Trowbridge А., 1987). Однако в дальнейшем результаты этой работы были подтверждены многими исследователями и представлены в последующих публикациях, посвященных изучению протромбоцитов, где можно обнаружить ссылку на это основополагающее исследование.

Кроме того, что у здоровых крыс были обнаружены циркулирующие протромбоциты, их количество в крови из правого желудочка значительно выше, чем из левого. Это свидетельствует о их продукции в легких (Handagama P., Feldman В., Jain N. et al., 1987).

Протромбоциты обнаружены и в крови различных животных. У живущих в дикой природе белых и черных носорогов, непосредственно после поимки быстро убегавших особей, проводили забор крови. У черных носорогов большое количество тромбоцитов имели форму длинных цилиндрических тяжей с перетяжками, которые подобны отделяющимся протромбоцитам при мегакариоцитопоэзе. У белых носорогов такие формы присутствовали, но были единичными. Возможно, это связано с видоспецифичностью: черные носороги часто страдают гемолитической анемией, в отличие от белых, у которых такая патология не отмечена. В то же время, появление протромбоцитов может быть связано с тем, что кровь получали непосредственно после стресса и повышенной физической нагрузки, связанной с длительным периодом быстрого бега. Кроме того, в тромбоцитах черного носорога снижено количество плотных гранул и митохондрий, практически отсутствует СОК и повышено число митохондрий (Du Plessis L., Botha A., Stevens K., 1999). Большое количество протромбоцитов обнаружено также в крови африканских слонов (Du Plessis L., Stevens К., 2002) и арабских тигров, у которых также отмечено сниженное количество а-гранул и отсутствие СОК (Johnson Е., Muirhead D., Wood R. et al., 2002).

У здоровых лиц в крови обнаружено около 1% протромбоцитов (или называемых отдельными авторами стресс-тромбоцитов). У пациентов с ИТП их количество возрастает до 2,6%. К подобным формам относили неправильной конфигурации удлиненные с выраженной сегментацией тромбоциты и структурами микрофиламентов и микротрубочек, поддерживающих их конфигурацию. Подсчет проводился только длинных с перетяжками форм, более короткие биполярные или веретенообразные в расчет не принимались. При инкубации in vitro сегментация протромбоцитов увеличивалась, в основном за счет перераспределения микротрубочек, вплоть до появления четко выраженных дисковидных форм в общей цепи, которые могли отделяться в окружающую среду (Hattori A., SogaN., Mito М. et al., 1992).

Протромбоциты, полученные при культивировании мегакариоцитов in vitro, содержат на поверхности ГП1Ь и ГППЬ, кольца микротрубочек на концах, и повышенное содержание фибриногена, который рассеян в цитоплазме и не связан с мембранными структурами (Choi Е., Nichol J., Hokom М. et al., 1995). Возможно, что такое распределение фибриногена связано с тем, что он необходим для формирования протромбоцитов в мегакариоцитах и их отшнуровки. Его концентрация на поверхности синусоидов, местах выхода протромбоцитов в кровоток, значительно повышена (Larson М., Watson S., 2006). Хотя ранее было показано, что такими же свойствами обладают ламинин и коллаген IV типа (Nilsson S., Debatis М, Dooner ML et al., 1998). Процесс отшнуровки протромбоцитов от мегакариоцитов регулируется большим количеством внеклеточных веществ. Витронектин, фибриноген, ФВб, коллаген/ активируют отделение. В то же время, фактор, выделяемый стромой, FGF, коллаген (при взаимодействии с a2pl-рецептором) ингибируют его (Larson М., Watson S. et al., 2006). Однако, до сих пор нет окончательной ясности в том, как окружающая костный мозг среда регулирует развитие и разделение протромбоцитов на тромбоциты и каковы условия появления их в циркуляторном русле. Рассматривается несколько механизмов, ответственных за этот процесс. Наиболее вероятными могут быть отделение тромбоцитов от концов протромбоцитов после выхода их в циркуляцию, освобождение пластинок в результате взаимодействия протромбоцитов с клетками эндотелия и, наконец, под влиянием сходного с апоптозом механизма, который запускает комплекс внутриклеточного сигнального пути (Larson М., Watson S., 2006).

Большинство исследований, касающихся этих форм тромбоцитов, посвящены механизмам их отделения в ходе мегакариоцитопоэза и регуляции этого процесса. Практически отсутствуют работы, посвященные изучению функций, присущих циркулирующим протромбоцитам, что затрудняет понимание их роли в норме и при патологии.

9. БОЛЬШИЕ И РЕТИКУЛЯРНЫЕ ТРОМБОЦИТЫ Кроме дисковидных и протромбоцитов, в ходе мегакариоцитопоэза образуются «большие», или «ретикулярные» тромбоциты с высоким содержанием мРНК. В основном, появление в кровотоке тех или других форм пластинок первично закладываются до или во время фрагментации их родоначальных клеток - мегакариоцитов (Rabellino Е., Levene R., Leung L. et al., 1981). Одним из наиболее важных факторов, ответственных за появление тех или иных тромбоцитов, выступает полиплоидизация ядра мегакариоцита.

Повышение плоидности мегакариоцитов выше нормальных величин (с 16-32N до 64-128N), может приводить к продукции больших, гиперактивных тромбоцитов, которые играют активную роль в возникновении тромботических осложнений при различных патологиях, в том числе связанных с сердечнососудистыми нарушениями (Martin J., 1989). Хотя есть данные, полученные на мышах, которые противоречат этому утверждению. Согласно им, появление пула мегакариоцитов с плоидностью 128N не приводит к изменению СОТ. Но такое заключение может быть связано с тем, что содержание клеток с такой плоидностью у мышей составляет 2-3 %. Такое малое число родоначальных клеток могут вносить незначительный вклад в общее состояние поступивших в циркуляцию тромбоцитов (Corash L., Levin J., 1990).

Большие тромбоциты по содержанию ферментов и уровню метаболизма более активны, быстрее агрегируют в ответ на коллаген и АДФ, обладают повышенной способностью синтезировать ТХА2 (Jakubowski J., Thompson С., Vaillancourt R. et al., 1983), освобождают больше серотонина и (3-тромбоглобулина (Thompson С., Jakubowski J., Quinn P. et al., 1983), и экспрессируют повышенное количество рецепторов ГП lb и ГП Ilb/IIIa (Giles Н., Smith R., Martin J., 1994). Их продукция сопровождается укорочением времени кровотечения, которое коррелирует с СОТ (Martin J., Trowbridge Е., Salmon G. et al., 1983). После операции аутокоронарного шунтирования, во время которого тромбоциты разрушаются в экстракорпоральной циркуляции и их число значительно падает, СОТ практически остается на предоперационном уровне, то есть, его величина не зависит от числа пластинок (Martin J., Daniels Т., Trowbridge Е., 1987). Такая же картина наблюдается и при ИТП (Levin J., Bessman J., 1983).

COT остается достаточно адекватным методом контроля над появлением в крови больших тромбоцитов (Macey М., Azam U., McCarthy D. et al., 2002). С помощью микроскопии показано, что в крови больных инфарктом миокарда и модельных животных с индуцированной тромбоцитопенией циркулируют тромбоциты более крупного размера (до 4 мкм) сферической формы с неровной поверхностью мембраны. Применение различных приборных методик для их исследования внесло некоторое несоответствие в применяемую на сегодняшний день терминологию для определения этих клеток. Так, исследователи, использующие оценку СОТ, характеризуют эти клетки как «большие» тромбоциты, а применяющие флуоресцентные маркеры, связывающиеся с мРНК, называют их «ретикулярными» тромбоцитами.

Термин "ретикулоциты" был предложен в начале прошлого века для обозначения молодых эритроцитов. Но в 1969 г. впервые были обнаружены аналогичные им "ретикулярные тромбоциты", популяция которых быстро (в течение нескольких часов) появляется на фоне острого кровотечения (Ingram М, Coopersmith А, 1969). Эти образующиеся тромбоциты содержали крупные и точечные уплотнения, которые визуализируются с помощью нового метиленового голубого, что и позволило провести аналогию с ретикулоцитами. После выхода из мегакариоцитов, тромбоциты содержат некоторое количество информационной РНК (мРНК) и благодаря этому способны самостоятельно синтезировать различные белки (Kieffer N, Guichard N, Farcet J. et al, 1987).

Содержание мРНК в «ретикулярных» тромбоцитах значительно выше, чем в других формах, что позволяет их выявлять с помощью флуорохромов или витальных красителей. Данная процедура основана на том, что рибосомы реагируют с метиленовым голубым. В результате этого образуется осадок из гранул и филаментов (ретикулярная или сетчатая структура), который можно увидеть под световым микроскопом. Однако этот метод расценивали, как трудоемкий и требующий времени для приготовления образцов, субъективный при их просмотре, что вызвало необходимость поиска новых инструментальных подходов. Применяемые ранее флуоресцентные красители, такие как акридиновый оранжевый, пиронин, тиофлавин, тиазол и корифосфин-О позволяли количественно выявлять с помощью поточной флуориметрии ретикулоциты среди красных клеток крови. Теоретически все они могут быть применены и для выявления ретикулярных тромбоцитов. Но исторически сложилось так, что еще с 1986 г. в качестве метки с наиболее подходящими по длине волны свойствами для регистрации, легко проходящей через мембрану живых тромбоцитов и способную в 3000 раз увеличивать флуоресценцию при взаимодействии с мРНК, начали использовать тиазоловый оранжевый (Lee L.G., Chen С.Н., Chiu L., 1986). В 1990 г. впервые было показано, что выявление «ретикулярных» тромбоцитов может быть использовано в качестве показателя уровня тромбоцитопоэза (Kienast J., Schmitz G., 1990). У здоровых лиц, по данным разных исследований, содержание «ретикулярных» тромбоцитов, выявляемых с помощью тиазолового оранжевого, значительно варьирует и колеблется от 0,9% (Watanabe К., Takeuchi К., Kawai Y. et al., 1995) до 6,1% (Salvagno G., Montagnana M., Degan M. et al., 2006). Такой разброс данных можно объяснить разнородностью по физическому состоянию лиц, включенных в группы, среди которых могут находиться и больные негематологическими патологиями. Также это объясняется включением красителя в тромбоциты с низким содержанием мРНК, которые не относятся к субпопуляции «ретикулярных», и отсутствием "золотого стандарта" при определении. Кроме того, сообщается о значительных различиях в содержании «ретикулярных» тромбоцитов у мужчин и женщин (Bonan J., Rinder Н., Smith В. et al., 1993). В результате реакции освобождения, из плотных гранул тромбоцитов высвобождаются нуклеотиды, которые также способны поглощать краситель и снижать на 50 % флуоресценцию. Все это вносит достаточно серьезные погрешности в результаты измерения, и не позволяет адекватно оценивать содержание в пуле субпопуляции анализируемых клеток (Robinson М., Mackie I., Khair К. et al., 1998).

В более поздних работах, после модификации применяемого метода с помощью предварительной обработки РНКазой, у здоровых лиц выявляемое количество «ретикулярных» тромбоцитов было менее 1% (Fujii Т., Shimomura Т., Fujimoto Т.Т. et al., 2000).

В то же время в условиях патологии количество ретикулярных тромбоцитов может значительно возрастать. Показано, что у больных ИТП в крови может циркулировать до 33% ретикулярных тромбоцитов, что значительно выше, чем при лимфобластной анемии и аплазии (Saxon В., Blanchette V., Butchart S. et al., 1998). У отдельных больных с тромбоцитопенией из-за сниженной продукции пластинок, и у пациентов с тромбоцитозом «ретикулярные» тромбоциты не появляются. Они образуются, и их количество возрастает в ситуациях, когда усиливается мегакариоцитопоэз, и снижается, когда он угнетен. Это позволяет использовать их в качестве показателя уровня тромбоцитопоэза.

А Б

Рисунок 2. «Ретикулярные» тромбоциты. А - световая микроскопия, окрашивание новым метиленовым голубым, короткая стрелка указывает на ретикулоцит (эритроцит); длинными стрелками показаны ретикулярные тромбоциты; Б - трансмиссонная электронная микроскопия, стрелкой указана система открытых канальцев. Фото взяты из доклада К.A. Ault. A New Era in the Management of the Thrombocytopenic Patient представленного в интернете на сайте http://sites.intercall.eom/abbott/archive.php#Management.

Ретикулярные» тромбоциты представляют собой молодые формы. Это подтверждается тем, что при регенерации у пациентов после химиотерапии их уровень возрастает раньше, чем восстанавливается общее количество форменных элементов (Richards Е., Baglin Т., 1995). Время жизни «ретикулярных» тромбоцитов резко укорочено. По разным данным оно составляет от одних (Dale G., Friese P., Hynes L. et al., 1995) до 1,8 суток (Ault К., Knowles С., 1995). Морфологически они представляют собой крупные сферические клетки с большим количеством инвагинаций на мембране и повышенной активностью (Рис. 2). У них в ответ на стимуляцию тромбином увеличена экспрессия а-гранулярного белка Р-селектина (Peng. J., Friese P., Heilmann E. et al., 1994) и усилена способность накапливать фибриноген (Heilmann Е., Hynes L., Friese P. et al., 1994). Количество «ретикулярных2 тромбоцитов у больных с тромбоцитопенией повышается параллельно с подъемом содержания СОХ-2, но не СОХ-1. У здоровых лиц такой закономерности не наблюдается (Rocca В., Secchiero P., Ciabattoni G. et al., 2002).

Отмечено одновременное и значительное повышение содержания «ретикулярных» тромбоцитов и индекса гликокалицина у больных ИТП на фоне незначительного подъема ТПОа, что может свидетельствовать о независимости появления таких пластинок от этого цитокина (Kurata Y., Hayashi S., Kiyoi Т. et al., 2001). Хотя есть данные, что введение рекомбинантной формы ТПОа приводило через 3 дня к повышению количества «ретикулярных» тромбоцитов (O'Malley С., Rasko J., Basser R. et al., 1996).

Такие гематологические патологии, как идиопатическая тромбоцитемия, ИТП и тромботическая тромбоцитопеническая пурпура, сопровождаются повышением числа «ретикулярных» тромбоцитов (Harrison P., Robinson М., Mackie I. et al., 1997). Кроме того, индуцированая эндотоксинемия, уже в первые 6 часов, усиливает тромбоцитопоэз, что можно оценить по увеличению в 2 раза количества «ретикулярных» тромбоцитов (Stohlawetz P., Folman С., von dem Borne A. et al., 1999). Содержание в крови таких тромбоцитов повышено у больных гипертиреоидизмом, в то время как СОТ находится в пределах нормы (Stiegler G., Stohlawetz P., Brugger S. et al., 1998). После трансплантации печени больным циррозом, у которых до операции наблюдалась тромбоцитопения, уже на 2 день в 4-5 раз возрастало число «ретикулярных» тромбоцитов, хотя общее количество пластинок восстанавливалось только к 11 дню. К этому времени содержание «ретикулярных» тромбоцитов снижалось до уровня предоперационного (Stiegler G., Stohlawetz P., Peck-Radosavljevic M. et al., 1998). Гемодиализ значительно снижает количество «ретикулярных» тромбоцитов у больных с почечной недостаточностью. Параллельно с этим понижается агрегация тромбоцитов. Это можно объяснить тем, что при проведении процедуры из циркуляции выводится наиболее активный пул, в результате чего снижается риск развития тромбопатий, характерных для этой патологии (Tassies D., Reverter J., Cases A. et al., 1995). Увеличение продукции тромбоцитов и повышение количества «ретикулярных» форм обнаружено у беременных с гипертонией раньше, чем появились соответствующие патологии симптомы (Rinder Н., Bonan J., Anandan S. et al., 1994). После трансплантации костного мозга онкологическим больным, выявление образования «ретикулярных» тромбоцитов может служить удобным критерием для оценки повышения тромбоцитопоэза, что позволяет оценивать результат пересадки (Consolini R., Calleri A., Bengala С. et al., 2001).

В последнее время появились отдельные работы, посвященные исследованию «ретикулярных» тромбоцитов у сердечно-сосудистых больных. Обнаружено, что у больных после инфаркта миокарда на фоне некоторого снижения общего количества тромбоцитов, возрастает число «ретикулярных» тромбоцитов по сравнению с больными стенокардией. При этом у больных инфарктом миокарда без подъема ST-сегмента их количество было ниже, чем у пациентов с подъемом ST-сегмента. Также выявлена корреляция уровня тропонина с количеством «ретикулярных» тромбоцитов и одновременным повышение СОТ (Lakkis N., Dokainish H., Abuzahra M. et al., 2004). Сходная картина наблюдается и у больных с ишемическим инсультом. Наиболее высокое их количество обнаружено у больных с кардиоэмболическим инсультом, при котором их появляется больше, чем при атеротромботической или лакунарной форме. Лечение дезагрегантами приводило к снижению количества «ретикулярных" тромбоцитов в 2-3 раза (Nakamura Т., Uchiyama S., Yamazaki М. et al., 2002). В другом исследовании, проведенном на большой группе пациентов, общее количество тромбоцитов, «ретикулярных» форм и СОТ не различались у больных ишемическим инсультом в более ранней (1-27 дней) и поздней (79-725 дней) стадиях и у лиц с транзиторными атаками, но без сердечно-сосудистых заболеваний. Лечение аспирином не приводило к каким-либо изменениям этих параметров (McCabe D., Harrison P., Sidhu P. et al., 2004).

Исходя из данных, имеющихся на сегодняшний день, невозможно четко разграничить «ретикулярные» и «большие» тромбоциты. Единственное, что объединяет в знаниях о них, это то, что они появляются в условиях патологии и в результате повышенной плоидности ядра мегакариоцитов. Вероятнее всего, речь идет об одной и той же фракции тромбоцитов, но использование разных методов для исследования, вносит путаницу в терминологию, определяющую одни и те же формы кровяных пластинок. Их объединяет сходная морфологическая картина, которая характеризует такие тромбоциты как большие сферические с неровной поверхностью и инвагинациями. Вероятнее всего, именно из-за несоответствия в терминологии, так мало данных о их морфо-функциональных особенностях, и это не смотря на то, что именно эти формы появляются в ситуациях повышенного риска тромбоза.

Имеющиеся на сегодняшний день и приведенные выше сведения о морфо-функциональных особенностях тромбоцитов и причинах их появления, свидетельствуют о существовании многочисленных факторов, оказывающих влияние, как на процесс рождения различных пластинок, так и на их

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бурячковская, Людмила Ивановна

выводы

1. Выявлена морфологическая гетерогенность популяции циркулирующих в крови тромбоцитов человека и животных в норме и при различных патологических состояниях. Выделяются три различных по форме и функциям типа - дисковидные размером 2-4 мкм с гладкой поверхностью или небольшими кратерами открытой системы канальцев, биполярные протромбоциты длиной от 2 до 20 мкм веретенообразной или биполярной конфигурации, в отдельных случаях с перетяжками на концах, и большие сферические или «ретикулярные» тромбоциты размером 4-5 мкм и с неровной, складчатой или слоистой поверхностью;

2. Показано, что дисковидные тромбоциты, преобладающие в здоровом организме человека и животных, способны активироваться в кровотоке под действием различных факторов окружающей среды и преобразовываться в сферические формы размером 1 -2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий;

3. Протромбоциты в незначительных количествах присутствуют в крови здоровых лиц и животных, где способны отделять формирующиеся на их концах зрелые дисковидные формы. Количество протромбоцитов значительно возрастает в условиях гиперкатехоламинемии различной природы, и может в отдельных случаях составлять половину пула;

4. Доказано, что протромбоциты функционально инертны. Они не способны к адгезии на различные поверхности, агрегации друг с другом и лейкоцитами, для них характерна сниженная способность к реакции освобождения. Повышение их содержания в крови может приводить к развитию геморрагических явлений. Увеличение уровня интерлейкинов и катехоламинов в крови повышает содержание протромбоцитов;

5. Циркулирующие мегакариоциты присутствуют в крови здоровых лиц и могут быть выделены in vitro с фракцией тромбоцитов. В условиях хранения тромбомассы они способны к тромбоцитопоэзу, который идет по пути продукции биполярных протромбоцитов;

6. Большие сферические тромбоциты отсутствуют в крови здоровых лиц и животных. Они появляются в условиях воспаления при повышении уровня провоспалительных медиаторов, при инфекции и атеросклерозе;

7. Большие сферические «ретикулярные» формы - наиболее активная субпопуляция тромбоцитов. Для них характерна развитая открытая система канальцев, увеличенная площадь мембраны за счет большого количества инвагинаций, пониженное количество внутриклеточных гранул, повышенный объем, склонность к агрегатообразованию;

8. Аспирин не влияет на содержание протромбоцитов и больших сферических «ретикулярных» тромбоцитов в крови, но присутствие повышенного количества последних снижает эффективность действия аспирина и может быть одной из причин резистентности к нему. Прием тиклида и клопидогреля приводит к полному исчезновению или значительному снижению больших тромбоцитов и одновременному подавлению спонтанной агрегации, что свидетельствуют о преимуществе применения этих препаратов для лечения больных с повышенным содержанием таких форм. При выявлении резистентности к аспирину оценка морфологической гетерогенности тромбоцитов может помочь в более правильном назначении терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С момента открытия тромбоцитов появлялись свидетельства о разнообразии их морфологии и функций. Долгие годы эти различия рассматривались на основе представления, что нативные тромбоциты имеют форму диска и все преобразования, происходящие с ними, случаются при их активации в результате действия различных факторов окружающей среды.

Были созданы различные классификации разнообразия форм тромбоцитов, которые предлагалось использовать в лабораторной практике для определения риска тромбозов и геморрагий. Все они основаны на выявлении соотношения субпопуляций Д и Ci форм, находящихся на разных стадиях активации. Но такой подход имел ряд недостатков, так как подобные преобразования в большой степени зависели от условий подготовки и выделения тромбоцитов, и был связан с субъективными взглядами исследователей. Вплоть до 80-х годов тромбоциты, не относящиеся к этим формам, принимались за «артефактные».

Но в последнее время, с появлением работ J. Martin с соавт. (1982-1999) и J. Italiano с соавт. (1999-2007) о различных путях тромбоцитопоэза и связанном с этим выходом в кровоток тромбоцитов разной формы, стало возможным пересмотреть этот взгляд.

Принципиальные различия в морфологии и функциональной активности тромбоцитов закладываются на этапе мегакариоцитопоэза и большинство качеств, характерных для этих форменных элементов, даны им при рождении.

Целью данного исследования была попытка изучения условий возникновения и природы появления в крови разных субпопуляций тромбоцитов, не связанных с их переходом из Д в С\ формы. К моменту начала работы было известно, что у человека и лабораторных животных существует 3 пути мегакариоцитопоэза, но уже к концу 80-х годов появились первые работы, свидетельствующие о 4-м пути рождения тромбоцитов, когда из мегакариоцитов выходят незрелые длинные фрагменты, названные ПТ. В это же время стало ясным, что повышение плоидности мегакариоцитов приводит к усилению синтеза и накопления в них большего количества специфичных для тромбоцитов белков, которые затем передаются формирующимся ими тромбоцитам. В результате - появляются более крупные, получившие при рождении повышенное количество различных белков тромбоциты субпопуляции С2, часто называемые «ретикулярными.

Одновременно с этим, в конце 70-х - начале 80-х годов впервые заговорили о морфологической гетерогенности тромбоцитов, как о явлении, возможно влияющем на функциональное состояние пула тромбоцитов и их участие в тромбообразовании.

Известно, что при некоторых редких наследственных патологиях, таких как синдром Бернара-Сулье, псевдоболезнь Виллебранда, синдром «серых тромбоцитов», в крови появляются крупные, или даже гигантские тромбоциты. Но их появление связано с генетическими аномалиями, что ставит на отдельную ступень исследования, связанные с ними.

Предложено выделять три субпопуляции - Д, ПТ и С2 тромбоцитов, появление которых в крови связано с мегакариоцитопоэзом. Кроме того, необходимо учитывать, что во многих случаях наблюдаются различные переходные формы, которые связаны с активацией Д тромбоцитов и в конечном счете приводят к их сферуляции. Поэтому в отдельную субпопуляцию выделены тромбоциты Сь хотя их появление и не связано с поэзом. До сегодняшнего дня практически не было данных о функциональном состоянии ПТ, и достаточно ограничены знания о поведении С2 тромбоцитов.

Из-за того, что невозможно проводить прямые исследования мегакариоцитопоэза в условиях организма in vivo по причине ничтожного количества этих клеток в костном мозге (их количество составляет 0,1% от общего числа костномозговых клеток), о нем можно судить по появлению в циркуляции различных субпопуляций тромбоцитов.

Образование ПТ происходит и в норме, у здоровых людей и животных. В крови присутствуют ПТ разной длины, редко, но достигающие значительного размера. В основном циркулируют более короткие, находящиеся на разных стадиях отделения от них Д формы. После выхода в кровь, они депонируются в селезенке, где, по-видимому, происходит их окончательное созревание и затем вторичное поступление в циркуляцию уже в функционально активном виде. Мы показали, что сами по себе ПТ функционально инертны и не способны к осуществлению ими в полной мере основных функций - адгезии, агрегации и реакции освобождения. Это затрудняет их участие, как в процессе нормального гемостаза, так и в транспорте веществ. Но в то же время, как молодые клетки, только что родившиеся, они содержат все необходимые для их жизнедеятельности белки, которые они передают отделяющимся от них Д формам, уже функционально активным.

Можно предположить, что более интенсивное включение такого пути поэза в условиях тромбоцитопении с одной стороны может быть связано с необходимостью быстрого пополнения утраченного пула тромбоцитов, а с другой - сокращения одновременного выброса молодых, с высоким гемостатическим потенциалом пластинок. Особенно важным это может быть в ситуациях, когда в крови имеется повышенное содержание агонистов тромбоцитов, что наблюдается при стрессе или воспалении. Так организм защищается от повышения тромботической реактивности тромбоцитов. Хотя могут быть ситуации, при которых на фоне повышенного потребления и значимой тромбоцитопении, в крови преобладают ПТ. Это способствует развитию геморрагий, как например при ДВС-синдроме. Так что появление ПТ в крови и физиологический процесс, и защитная реакция, но может приводить и к катастрофическим последствиям.

Другая ситуация связана с появлением в циркуляции субпопуляции С2 тромбоцитов. Так как их продукция в результате тромбоцитопоэза редко отмечена в здоровом организме и связана с различными патологическими ситуациями, появление в крови С2 может говорить о развитии патологии. Кроме того, высокая функциональная активность С2 и агрессивность в отношении агрегатообразования, делает важным проведение контроля их появления в крови пациентов. В отличие от фракции Д тромбоцитов, которые после появления в кровотоке не создают угрозы образования микроагрегатов и могут до 10 суток циркулировать в крови в неизменном виде, и необходимы серьезные изменения условий окружающей среды, чтобы они активировались, С2 несут повышенную активность уже с момента рождения.

Проведенные фундаментальные исследование делают простым и доступным подход к оценке и пониманию вклада тромбоцитов различных субпопуляций в процесс тромбообразования и возникновения риска тромбозов и геморрагий у пациентов различных групп.

Наши исследования показали, что выявление морфологических и функциональных особенностей тромбоцитов разных субпопуляций является необходимым при оценке риска тромбоза у сердечно-сосудистых больных. Особенно важно это для адекватного назначения коррегирующей терапии.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Бурячковская, Людмила Ивановна, Москва

1. Абесадзе А., Мосидзе М., Квернадзе М., Соселия Т., Мдивнишвили М. Механизм гормональной регуляции тромбоцитопоэза. // Вестн Акад Мед Наук. 1990. - № 9. - С. 47-52.

2. Алексеев Н.А. Геморрагические диатезы и тромбофилии. Гиппократ.: Питер, 2005. - 607 с.

3. Алмазов И.В. Происхождение кровяных пластинок: Дис. Д-ра мед. Наук. -Винница, 1951.-420 с.

4. Андреев С.В., Кубатиев А.А. Система регуляции агрегатного состояния крови в норме и патологии./Ред. O.K. Гаврилов. М., 1982. - С. 19-22.

5. Арабидзе Г.Г., Потапова Г.Г., Бурячковская Л.И., Маркосян Р.А. Способ диагностики феохромоцитомы. Авторское свидетельство N 1446527 от 22 августа 1988 г.

6. Безносиков Б.О., Измайлова Е.Ф. Тромбоцитарная формула здоровых людей, изученная при помощи электронного микроскопа. // Лаб дело. -1961.-№ 11.-с. 43-47.

7. Вашкинель В.Н., Петров М.Н. Ультраструктура и функции тромбоцитов человека. Наука.: Л, 1982. - 86 с.

8. Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю., Позин Е.Я., Маркосян Р.А. Новый высокочувстительный метод анализа агрегации тромбоцитов. // Лабораторное дело. 1989. - №. 10. - С.15-18.

9. Гаврилов O.K., Козинец Г.И., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. Медицина.: М, 1985. - 288 с.

10. Ю.Голдбергер Э. Л., Ригни Д.Р., Уэст Б.Д. Хаос и фракталы в физиологии человека. // В мире науки. 1990. - № 4. - С. 25-32.).

11. П.Гусейнов Ч.С. Физиология и патология тромбоцитов. Медицина.: М, 1971.- 175 с.

12. Дроздова В.А. Тромбоцитарная формула при раке. // Клин мед. 1955. -№4.-с. 32-38.

13. Ермолаева Т.А., Пономаренко В.М., Головина О.Г. Система мегакариоцит-тромбоцит. // Вестник РАМН. 1996. - № 12. - С. 34-43.

14. И.Кассирский И.А., Алексеев Г.А. Клиническая гематология. Медицина.: М, 1970.-780 с.

15. Козинец Г.И., Макаров В.А.Исследования системы крови в клинической практике. -Триада X.: М, 1997. - 313 с.

16. Козлов В. К. Лизосомоподобные альфа-грвнцлы тромбоцитов: выявление при обработке акридиновым оранжевым , некоторые свойстваи преобразование в ходе реакции гемокоагуляции. // Цитология. 1075. - Т. 17№7.-С. 762-766.

17. Комахидзе М.Е. Селезёнка. М.: Наука, 1971. - 254 с.

18. Лапчинский М. Гистологические исследования крови человека при различных болезнях: Дис. Д-ра мед.наук. СПБ, 1875. - 324 с.

19. Маркосян А.А. Физиология тромбоцитов. Наука, Ленингр. Отд.; Л, 1970.- 163 с.

20. Медведев О.С. Современные методические возможности для изучения механизмов адаптационных реакций сердечно-сосудистой системы. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия:Физиология человека и животных. 1990.-Т. 41.-С. 35-67.

21. Медведев О.С., Орановская Е.В., Аширова О.П., Мурашев А.Н. Реакции системной и региональной гемодинамики на метаболический стресс, вызванный 2-дезокси-Д-глюкозой. // Бюлл эксп биол мед. 1991. - Т. 111. -С. 132-135.

22. Негреев Н.Н., Ганчев Т.С. Влияние неселективных бета-адренергических воздействий на мегакариоциты и тромбоциты крыс. // Гематол Трансфузиол. 1986. - №11. - с. 32-34.

23. Образцов В.П. К морфологии образования крови в костном мозге у млекопитающих: Дис. д-ра мед. наук. СПБ. - 1880. 354 с.

24. Рукавицын О.А., Поп В.П. Иммунотерапия при лечении больных с заболеваниями системы крови. // Мистецтво лшування. 2005. - № 5. - С. 46-54.

25. Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В. Низкомолекулярные гепарины: возможности применения. // Кардиология. 1995. - №10. - С. 86-90.

26. Судаков К.В., Юматов Е.А., Ульянинский J1.C. Системные механизмы эмоционального стресса. // Механизмы развития стресса. Штиинца., Кишинев, 1987. С. 52-79.

27. Тоцкая А.А. Кровяные пластинки в норме, тромбастении, тромбоцитопении (фазово-контрастная и электронная микроскопия). Автореферат канд. Дис. М., 1967.

28. Тюрмина О. Роль симпато-адреналовой системы в реализации эффектов, вызываемых гликопенией центральной нервной системы. Канд. Дис. М., 1994

29. Шилов A.M. Профилактика «венозного тромбоэмболизма» низкомолекулярными гепаринами: место фрагмина. // Человек и лекарство. 2005. - Т. 13 № 7. - С. 440-444.

30. Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб ГМУ.; С-Питер, 2000. 222 с.

31. Aarden L., De Groot Е., Schaap О. Production of hybridoma growth factor by monocytes // Eur. J. Immunol. 1987. - V. 17. - P. 1411-1416.

32. Abrams C. Packing platelets to go. // Blood. 2005 - V 106 № 13 - P. 40194020.

33. Adkins K., Levan Т., Miesfeld R., Bloom J. Glucocorticoid regulation of GM-CSF: evidence for transcriptional mechanisms in airway epithelial cells. // Am J Physiol. 1998. - V. 275. - P. L372-L378.

34. Allen R., Zacharki L., Widirsky S., Rosenstein R., Zaitlin L., Burgess D. Transformation and motility of human platelets. // J Cell Biology. 1979. - V. 83.-P. 126-142.

35. Aschoff L. Ueber capillare Embolie von riesenkernhaltigen Zellen. // Virchows Arch Pathol Anat Physiol Klin Med. 1893 - V 134 - P. 11-26.

36. Ault K., Knowles C. In vivo biotinylation demonstrates that reticulated platelets are the youngest platelets in circulation. // Exp Hematol. 1995. - V. 23 №9.-P. 996-1001.

37. Backalov K., Witke W., Kwiatkowski D., Hartwig J. Coordinated regulation of platelet actin filament barbed ends by gelsolin and capping protein. // J Cell Biol. 1996. - V. 134 № 2. - P. 389-399.

38. Banu N., Avraham S., Avraham H. P-selectin, and not E-selectin, negatively regulates murine megakaryocytopoiesis. // J Immunol. 2002. - V. 169 № 8. -P. 4579-4585.

39. Bath P., Algert C., Chapman N., Neal B. Association of mean platelet volume with risk of stroke among 3134 individuals with history of cerebrovascular disease. // Stroke. 2004. - V. 35. - P. 622-631.

40. Bath P., Buckenham Т., MacGregor G. Increased platelet volume and platelet mass in patients with atherosclerotic renal artery stenosis. // Clin Sci. 1994. -V. 87. - P. 253-257.

41. Baumann H., Jahreis G., Sauder D., Koj A. Human keratinocytes and monocytes release factors which regulate the synthesis of major acute phase plasma proteins in hepatic cells from man, rat and mouse // J Biol Chem. -1984. V. 259.-P. 7331-7342.

42. Becchi C., Al Malyan M., Fabbri L., Marsili M., Boddi V., Boncinelli S. Mean platelet volume trend in sepsis: is it a useful parameter? // Minerva Anestesiol. 2006. - V. 72 № 9. p. 749-756.

43. Becker R., de Bruyn P: The transmural passage of blood cell into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. // Am J Anat. 1976. - V. 145. - P. 183189.

44. Behnke 0. An electron microscope study of the megacaryocyte of the rat bone marrow. I: the development of the demarcation membrane system and the platelet surface coat. // J Ultrastruct Res. 1968. - V. 24. - P. 412-433.

45. Behnke 0., Forer A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. // Eur J Haematol. 1998 (Suppl) - V 61 - P. 3-23.

46. Bentfield-Barker M., Bainton D. Identification of primary lysosomes in human megakaryocytes and platelets. // Blood. 1982. V. 59. - P. 472-481.

47. Berent H, Uchman B, Wocial B, Januszewicz W. II Platelet norepinephrine and epinephrine concentration in patients with pheochromocytoma. Am J Hypertens. - 1990. - V. 3 № 8. - P. 618-621.

48. Bessis M. Electron microscopy of human bone marrow with sections technic // Sem Hop. 1956 - V 32 - 7 - p.372-388.

49. Bessis M. Living blood cells and their ultrastructure. New-York.: Springer -Verlag, 1973.-370 p.

50. Biddle N. Gelb A., Hamilton J. Propofol differentially attenuates the responses to exogenous and endogenous norepinephrine in the isolated rat femoral artery in vitro. // Anesth Analg. 1995. - V. 80 № 4. - P. 793-799.

51. Bizzozero G. bber einen neuen formbestandteil des blutes und dessen rolle bei der thrombose und blutgerinnung. // Virchow's Arch Path Anat Physiol Klin Med. 1882. - V. 90. - P. 261-332.

52. Blajchman М., Senyi A., Hirsh J., Genton E., George J. Hemostatic function, survival, and membrane glycoprotein changes in young versus old rabbit platelets. // J Clin Invest. 1981. - V. 68. - P. 1289-1294.

53. Boehlen F., Clemetson K. Platelet chemokines and their receptors: what is their relevance to platelet storage and transfusion practice. // Transfusion Medicine. 2001. - V. 11 № 6. - P. 403-417.

54. Bonan J., Rinder H., Smith B. Determination of the percentage of thiazole orange (TO)-positive, "reticulated" platelets using autologous erythrocyte TO fluorescence as an internal standard. // Cytometry. 1993. - V. 14 № 6. - P. 690-694.

55. Born GV., Dearnley R., Foulks I., Sharp D. Quantification of the morphological reaction of platelets to aggregating agents and of its reversal by aggregation inhibitors. // J Physiol. 1978. - V. - № 280. - P. 193-212.

56. Bowles В., Lee J., Dang C. Coronary artery bypass performed without the use of cardiopulmonary bypass is associated with reduced cerebral microemboli and improved clinical results. // Chest. 2001. V. 119. - P. 25-30.

57. Breton-Gorius I., Vainchenker W. Expression of platelet proteins during the in vitro and in vivo differentiation of megakaryocytes and morphological aspects of their maturation. // Semin Hematol. 1986. - V. 23. - P. 43-67.

58. Brodde О., Bock K. Changes in platelet alpha 2-adrenoceptors in human pheochromocytoma. // Eur J clin Pharmacol. 1984. - V. 26. - P. 265-267.

59. Brown A., Hong Y., de Belder A., Beacon H., Beeso Y., Sherwood R., Edmonds M., Martin J., Erusalimsky J. Megakaryocyte Ploidy and Platelet Changes in Human Diabetes and Atherosclerosis. // Arterioscl Thrombos Vase Biol. 1997. - V. 17. - P. 802-807.

60. Brown A., Martin J. The megakaryocyte platelet system and vascular disease. // Eur J Clin Invest. 1994. - V. 24 (Suppl 1). - P. 9-15.

61. Вгипо Е., Briddell R., Cooper R., Hoffman R: Effects of recombinant interleukin 11 on human megakaryocyte progenitor cells. // Exp Hematol. -1991.-V. 19 №5.-P. 378-381.

62. Bubel S., Wilhelm D., Entelmann M., Kirchner H., Kluter H. Chemokines in stored platelet concentrates. // Transfus. 1996. - V. 36 № 5. - P. 445-449.

63. Burstein S., Downs Т., Friese P., Lynam S., Anderson S., Henthorn J., Epstein R., Savage K. Thrombocytopoiesis in normal and sublethally irradiated dogs: response to human interleukin-6. // Blood. 1992. - V. 80. - P. 420-428.

64. Burstein S., Harker L. Control of platelet production. // Clin Haematol. 1983. -V. 12 № l.-P. 3-22.

65. Burstein S., Mei R., Henthorn J., Friese P., Turner K: Leukemia inhibitory factor and interleukin-1 1 promote maturation of murine and human megakaryocytes in vitro. // J Cell Physiol. 1992. V. 153 № 2. - P. 305-312.

66. Butchart E.G., Bodnar E. Trombosis, embolism and bliding. ICR Pablisher London., 1992. P. 123-172.

67. Butterworth R., Bath P. The relationship between mean platelet volume, stroke subtype and clinical outcome. // Platelets. 1998. - № 9. - P. 359-364.

68. Cameron H., Ibbotson R., Carson P. Platelet size in myocardial infarction. // BMJ. 1983. - V. 287. - P. 449-451.

69. Cardier J., Erickson-Miller C., Murphy Mr. Differential effect of erythropoietin and GM-CSF on megakaryocytopoiesis from primitive bone marrow cells in serum-free conditions. // Stem Cells. 1997. - V. 15 № 4. - P. 286-290.

70. Chang A., Cantor A., Fujiwara Y., Lodish M., Droho S., Crispino J., Orkin S. GATA-factor dependence of the multitype zinc-finger protein FOG-1 for itsessential role in megakaryopoiesis. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. V. 99 № 14.-P. 9237-9242.

71. Chang K., Stevenson M. Effect of anemia and renal cytokine production on erythropoietin production during blood-stage malaria. // Kidney Int. 2004. -V. 65 №5.-P. 1640-1646.

72. Chaudhary R. Aggarwal A. Khetan D. Dayal R. Cytokine generation in stored platelet concentrate: comparison of two methods of preparation. // Indian J Med Res. 2006. V. 24 № 4. - P. 427-430.

73. Chen Z., Ни M., Shivdasani R. Expression analysis of primary mouse megakaryocyte differentiation and its application to identify stage-specific molecular markers and a novel transcriptional target of NF-E2. // Blood. -2007.-V. 109№4. -P. 1451-1459.

74. Chernoff A., Levine R., Goodman D. Origin of platelet derived growth factor in megakaryocytes in guinea pigs. // J Clin Invest. 1980. - V. 65. - P. 926930.

75. Choi E., Nichol J., Hokom M., Hornkohl A., Hunt P. Platelets Generated In Vitro From Proplatelet-Displaying Human Megakaryocytes Are Functional. // Blood. 1995. -V. 85 № 2. - P. 402-413.

76. Corash L. Platelet density, heterogeneity and platelet ageing // Platelet Heterogeneity. Biology and Pathology / Ed. by Martin J., Trowbridge A. -Amsterdam, The Netherlands, Elseveier/North Holland, 1990. P. 1-24.

77. Corash L., Chen H., Levin J., Baker G., Lu H., Мок Y. Regulation of thrombopoiesis: Effects of the degree of thrombocytopenia on megakaryocyte ploidy and platelet volume // Blood. 1987. - Y. 70. - P. 177-185.

78. Corash L., Мок Y., Levin J., Baker G. Regulation of platelet heterogeneity: effects of thrombocytopenia on platelet volume and density. // Exp Hematol. -1990.-V. 18.-P. 205-212.

79. Corbel C., Vaigot P., Salaun J. allb integrin, a novel marker for hemopoietic progenitor cells. // Int J Dev Biol. 2005. - V. 49. - P. 279-284.

80. Corriveau D., Fritsma G. Hemostasis and thrombosis. Lippincott.; Philadelphia, 1988. - 443 p.

81. Cortin V., Gamier A., Pineault N, Lemieux R., Boyer L., Proulx C. Efficient in vitro megakaryocyte maturation using cytokine cocktails optimized by statistical experimental design. // Exp Hematol. 2005. - V. 33 № 10. - P. 1182-1191.

82. Dale G., Friese P., Hynes L., Burstein S. Demonstration that thiazole orange-positive platelets in the dog are less than twentyfour hours old. // Blood. -1995.-85.-P. 1-4.

83. Damas J., Waehre Т., Yndestad A., Otterdal K., Hognestad A., SolumN., Gullestad L., Froland S. Aukrust P: Interleukin-7-mediatedinflammation inunstable angina: possible role of chemokinesand platelets. // Circulation. -2003. V. 107. - P. 2670-2676.

84. Dandona P., Thusu K., Khurana U., Love J., Aljada A., Mousa S. Calcium, calmodulin and protein kinase С dependence of platelet shape change. // Thromb Res. 1996. - V. 81 № 2. - P. 163-175.

85. De Botton S., Sabri S., Dauglas E., Zermati Y., Guidotti J.E., Hermine O., Kroemer G., Vainchenker W., Debili N. Platelet formation is the consequence of caspase activation within megakaryocytes. // Blood. 2002. V. 100. - P. 1310-1317.

86. Debili N., Issaad C., Masse J., et al. Expression of CD34 and platelet glycoproteins during human megakaryocyte differentiation. // Blood. 1992.- V. 80. P. 3022-3035.

87. Deng Z., Yang C., Deng H., Yang A., Geng Т., Chen X., Ma A., Liu Z. Effects of GM-CSF on the stem cells mobilization and plasma C-reactive protein levels in patients with acute myocardial infarction. // Int J Cardiol. 2006. - V. 113 № 1. - P. 92-96.

88. DeRijk R., Boelen A., Tilders F., Berkenbosch F. Induction of plasma interleukin-6 by circulating adrenaline in the rat. // Psychoneuroendocrinology.- 1994. V. 19.-P. 155-163.

89. Donne A. De l'origine des globules du sang, de leur mode dw formation et de leur fin. // Acad. Sci 1842. - № 14. - P. 366-368.

90. Du Plessis L., Botha A., Stevens K. Morphology of rhinoceros platelets. // J Morphol. 1999. - V. 239 № 3. - P. 245-253.

91. Du Plessis L., Stevens K. Blood platelets of the African elephant. // J Comp Pathol. 2002. - V. 127 № 2-3. - P. 208-210.

92. Eisen G. On the blood-plates of human blood. // J Morphol. 1899. - V. 15. №3.-P. 635-666.

93. Endler G., Klimesch A., Sunder-Plassmann H. Mean platelet volume is an independent risk factor for myocardial infarction but not for coronary artery disease. // Br J Haematol. 2002. - V. 117. - P. 399^104.

94. Englund G., Bodnar R., Li Z., Ruggeri Z., Du X. Regulation of von Willebrand factor binding to the platelet glycoprotein Ib-IX by a membrane skeleton-dependent inside-out signal. // J Biol Chem. 2001. - V. 276 № 20. -P. 16952-16959.

95. Escolar G., White J. The platelet open canalicular system: a final common pathway. // Blood Cells. 1991. - V. 17 № 3. - P. 467-485.

96. Faura J., Ramos J., Reynafarje C., English E., Finne P., Finch C. Effect of altitude on erythropoiesis. // Blood. 1969. - V. 33. - P. 668-676.

97. Foa P. Beitrad zum stadium der knockermarks. // Beitr Path Anat. -1899. -№25.-P. 376-394.

98. Fratantoni J., Sturdivant В., Poindexter B. Aberrant morphology of platelets stored in five day containers. Thromb Res. // 1984. V. 33 № 6. - P. 607-615.

99. Freden K., Olsson L., Suurkula M., Kutti J. The exchangeable splenic platelet pool in response to intravenous infusion of isoprenaline. // Scand J Haematol. 1978. - V. 20 № 4. - P. 335-340.

100. Freden К., Olsson L., Vilen L., Kutti J. Peripheral platelet count in response to salbutamol before and after adrenergic beta-receptor blockade. // Acta Haematol. 1978. - V. 60 № 5. - P. 310-315.

101. Frei K., Malipiero U., Leist T. On the cellular source and function of interleukin 6 produced in the central nervous system in viral diseases. // Eur J Immunol. 1989. - V. 19. - P. 689-694.

102. Frojmovic M., Milton J. Human platelet size, shape, and related functions in health and disease. // Physiol Rev. 1982. - V. 62 № 1. - P. 185261.

103. Frost R., Nystrom G., Lang C. Epinephrine stimulates IL-6 expression in skeletal muscle and C2C12 myoblasts: role of c-Jun NH2-terminal kinase and histone deacetylase activity. // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004. - V. 286 №5.-P. E809-E817.

104. Fujii Т., Shimomura Т., Fujimoto T.T., Kimura A., Fujimura K. A new approach to detect reticulated platelets stained with thiazole orange in thrombocytopenic patients. // Thromb Res. 2000. - V. 97 № 6. - P. 431-440.

105. Fujiki H., Kimura Т., Minamiguchi H., Harada S., Wang J., Nakao M., Yokota S., Urata Y., Ueda Y., Yamagishi H., Sonoda Y. Role of human interleukin-9 as a megakaryocyte potentiator in culture. // Exp Hematol. -2002. V. 30 № 12 - P. 1373-1380.

106. Fujimoto Т., Kohata S., Suzuki H., Miyazaki H., Fujimura K. Production of functional platelets by differentiated embryonic stem (ES) cells in vitro. // Blood. 2003. - V 102 № 12. - P. 4044-4051.

107. G.H.Hayem. Recherches sur revolution des hematies dans le sang de l'homme et des vertebres. // Arch physiol normal pathol. 1878. - V. 2 № 5. -P. 692-734.

108. Gabbasov Z.A., Popov E.G., Gavrilov I.Yu., Posin E.Ya. Platelet aggregation: the use of optical density fluctuations to study microaggregateformation in platelet suspension. // Thromb.Res. 1989. - V. 54 № 3. - p. 215223.

109. Ganchev Т., Negrev N., Ilkova R. Adrenergic dependence of the platelet aggregation in rats. Acta Physiol Pharmacol Bulg. // 1990. V. 16 № 1. - P. 46-49.

110. Gawaz M., Langer H. May A. Platelets in inflammation and atherogenesis. // J Clin Invest. 2005. V. 115. № 12. - P. 3378-3384.

111. Gerwitz A. Megakaryocytopoiesis: the state of the art. // Thromb Haemost. 1995. - V. 74 № l. - p. 204-209.

112. Giles H., Smith R., Martin J. Platelet glycoprotein Ilb-IIIa and size are increased in acute myocardial infarction. // Eur J Clin Invest. 1994. - № 24. -P. 69-72.

113. Girolami В., Girolami A. Heparin-induced thrombocytopenia: a review. // Semin Thromb Hemost. 2006. - V. 32 № 8. - P. 803-809.

114. Gladwin A., Carrier M., Beesley J., Lelchuck R., Hancock V., Martin J. Identification of mRNA for PDGF b-chain in human megakaryocytes isolated using a novel immunomagnetic separation method. // Br J Haematol. 1990. -V. 76.-P. 333-339.

115. Gladwin A., Martin J. The control of megakaryocyte ploidy and platelet production: biology and pathology. // Int J Cell Cloning. 1990. - №. 8. - P. 291-298.

116. Goldstein D., Eisenhofer G., Garty M., Folio C., Stull R., et. al. Implications of plasma levels of catechols in the evaluation ofsympathoadrenomedullary function. // Am J Hypertens. 1989. V. 2 № 3. - P. 133S-139S.

117. Gordge M. Megakaryocyte apoptosis: sorting out the signals. // British J Pharmacol. 2005. - V. 145. - P. 271-273.

118. Gordon В., DeBoer J., Wooldridge L., Sharp J. Effect of 6-hydroxydopamine on murine hematopoietic stem cells: enhanced cytotoxicity on megakaryocyte colony forming units. // Life Sci. 1991. V 49 № 2. - P. 121-127.

119. Graeve J., de Alarcon P. Megakaryocytopoiesis in the human fetus. // Arch Dis Child. 1989 - V 64 - P. 481^84.

120. Gupta G., Massague J. Platelets and metastasis revisited: a novel fatty link.//J Clin Invest. -2004. V. 114 № 12.-P. 1691-1693.

121. Guthikonda S., Lev E., Patel R., DeLao T,Bergeron AL, Dong JF, Kleiman NS. Reticulated platelets and uninhibited COX-1 and COX-2 decrease the antiplatelet effects of aspirin. // J Thromb Haemost. 2007. - V. 5 № 3. - P. 490-496.

122. Handagama P., Feldman В., Jain N., Farver Т., Kono C. Circulating proplatelets: isolation and quantitation in healthy rats and in rats with induced acute blood loss // Am J Vet Res. 1987 - V 48 № 6 - p. 962-965.

123. Handagama P., Jain N., Kono C., Feldman F. Scanning electron microscopic studies of megakaryocytes and platelet formation in the dog and rat // Am J Vet Res. 1986 - V 47 № 11 - p. 2454-2460.

124. Hansen M., Pedersen N. Circulating megakaryocytes in blood from the antecubital vein in healthy, adult humans. // Scand J Haematol. 1978. - V. 20 №4.-P. 371-376.

125. Harker L., Finch C. Thrombokinetics in man. // J Clin Invest. 1969. -V. 48 № 6. - P. 963-974.

126. Harker L., Hunt P., Marzec U., Kelly A., Tomer A., Hanson S., Stead R. Regulation of platelet production and function by megakaryocyte growth and development factor in nonhuman primates. // Blood. 1996. - V. 87. - P. 1833-1844.

127. Harrison P. Platelet function analysis. // Blood Rev. 2005. - V. 19 № 2.-P. 111-123.

128. Harrison P., Robinson M., Mackie I., Machin S. Reticulated platelets. // Platelets. 1997. - V. 8. - P. 379-383.

129. Hartwig J. The platelet: form and function. // Semin Hematol. 2006. -V. 43(Suppl 1).-P. .S94-100.

130. Hartwig J., Barkalow K., Azim A., Italiano J. The elegant platelet: signals controlling actin assembly. // Thromb Haemost. 1999. - V. 82 № 2. -P. 392-398.

131. Hartwig J., Italiano J. The birth of the platelet. // J Thromb Haemost. -2003.-№ l.-P. 1580-1586

132. Hattori A., Soga N., Mito M., Koike Т., Shibata A. Stress platelets in normal individuals and patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. // Blood Cells. 1992. -V. 18 № 2. - P. 281-294.

133. Hegyi E., Nakazawa M., Debilili N., Navarro S., Katz A., Breton-Gorius J., Vainchenker W. Developmental changes in human megakaryocyte ploidy. // Exp Hematol. 1991. - V. 19 № 2. - P. 87-94.

134. Heilmann E., Hynes L., Friese P., George J., Burstein S. Dog platelets accumulate intracellular fibrinogen as they age. // J Cell Physiol. 1994. - V. 161.-P. 23-30.

135. Hirsch E., Iglesias A., Potocnik A. Impaired migration but not differentiation of haematopoietic stem cells in the absence of beta 1 integrins. // Nature. 1996. - V. 380 № 6570. - P. 171-175.

136. Hovig T. Megakaryocyte and platelet morphology // Baillieres Clin Haematol 1989-V. 2 №3.-P. 503-541.

137. Howell W., Donohue D. The production of blood platelets in the lungs. // J Exp Med. 1937 - V. 65 - P. 171-204.

138. Hurley R., McCarthy J., Verfaillie C. Direct adhesion to bone marrow stroma via fibronectin receptors inhibits hematopoietic progenitor proliferation. // J Clin Invest. 1995. - V. 96. - P. 511-512.

139. Ingram M., Coopersmith A. Reticulated platelets following acute blood loss. // Brit J Haematol. 1969. - V. 17. - P. 225-229.

140. Isermann В., Nawroth P. The role of platelets during reproduction. // Pathophysiol Haemost Thromb. 2006. - V. 35 № 1-2. - P. :23-27.

141. Ishida Y., Yano S., Yoshida T. Biological effects of recombinant erythropoietin, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interleukin 3, and interleukin 6 on purified rat megakaryocytes. // Exp Hematol. 1991. -V. 19.-P. 608-612.

142. Italiano J., Lecine P., Shivdasani R., Hartwig J. Blood platelets are assembled principally at the ends of proplatelet processes produced bydifferentiated megakaryocytes // J. Cell Biol. 1999 - V 147 № 6 - P. 12991312.

143. Italiano J., Patel S., Hartwig J. Mechanics of proplatelet elaboration. // J Thromb Haemost. 2007 - Suppl 1. -P. 18-23.

144. Jackson C., Brown K., Somerville В., Lyles S., Look A. Two-color flow cytometric measurement of DNA distributions of rat megakaryocytes in unfixed, unfractionated marrow cell suspensions. // Blood. 1984. - V. 63. -P. 768-778.

145. Jakubowski J., Thompson C., Vaillancourt R., Valeri C., Deykin D. Arachidonic acid metabolism by platelets of differing size. // Br J Haematol. -1983.-V. 53.-P. 503-511.

146. Jelkman W. Erythropoietin: structure, control of production, and function. // Physiol Rev. 1992. - V. 72. - P. 449-489.

147. Jiang Y., Prosper F., Verfaillie C. Opposing effects of engagement of integrins and stimulation of cytokine receptors on cell cycle progression of normal human hematopoietic progenitors. // Blood. 2000. - V. 95. - P. 846854.

148. Johnson E., Muirhead D., Wood R., King G., Al-Busaidy R. Ultrastructural observations on the platelets of the Arabian tahr (Hemitragus jayakari). // Anat Histol Embryol. 2002. - V. 31 №. 3. p. 148-250.

149. Junt Т., Schulze H., Chen Z., Massberg S., Goerge Т., Krueger A., Wagner D., Graf Т., Italiano J., Shivdasani R., von Andrian U. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. - 2007. - V. 317 №5845. -P. 1767-1770.

150. Jurasz P., Santos-Martinez M., Radomska A., Radomski M. Generation of platelet angiostatin mediated by urokinase plasminogen activator: effects on angiogenesis. J Thromb Haemost. - 2006. - V. 4 № 5. - P. 1095-1106.

151. Kallinikos-Maniakas A. Megakaryocytes and platelets in central venous and arterial blood. // Acta Haematol. 1969 - V.42 - P. 330-335.

152. Kaluzhny H., Yu G., Sun S., Toselli P., Nieswandt В., Jackson C., Ravid K. BclxL overexpression in megakaryocytes leads to impaired platelet fragmentation. // Blood. 2002. - V. 100 № 5. - P. 1670-1678.

153. Karpatkin S., Amorosi E. Platelet heterogeneity (Letter). // Br J Haematol. 1977. - V. 35. - P. 681-684.

154. Karpatkin S., Khan Q., Freedman M. Heterogeneity of platelet function. Correlation with platelet volume. // Am J Med. 1978. - V. 64 № 4. - P. 542546.

155. Kaufman R., Airo R., Pollack S., Crosby W. Circulating megakaryocytes and platelet release in the lung. // Blood. 1965 - V 26 № 6 - P. 720-731.

156. Kaushansky K. The molecular mechanisms that control thrombopoiesis. //J Clin Invest.-2005.-V. 115№. 12.-P. 3339-3347.)

157. Kaushansky K. Thrombopoietin: the primary regulator of platelet production.//- Blood. 1995. - V. 86. - P. 419-431.

158. Kelemen E., Cserhati I., Tanos B. Demonstration and some properties of human thrombopoietin in thrombocythemic sera. // Acta. Haematol. 1958. -V. 20.-P. 350-355.

159. Kieffer N., Guichard N., Farcet J., Vainchenker W., Breton Gorius J. Biosynthesis of major platelet proteins in human platelets. // Eur J Biochem. -1987.-V. 164 № l.-P. 189-195.

160. Kienast J., Schmitz G. Flow cytometric analysis of thiazole orange uptake by platelets: a diagnostic aid in the evaluation of thrombocytopenic disorders. // Blood. 1990. - V. 75. - P. 116-121.

161. King C., Brennan S., Thompson P., Stewart G. Dust mite proteolytic allergens induce cytokine release from cultured airway epithelium. // J Immunol. 1998. - V. 16. - P. 3645-3651.

162. Kluter H„ Schlenke P., Muller-Steinhardt M., Paulsen M., Kirchner H. Impact of buffy coat storage on the generation of inflammatory cytokines and platelet activation. // Transfusion. 1997. - V. 37 № 4. - P. 362-367.

163. Kosaki G. In Vivo Platelet Production from Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur via Proplatelets? // Int J Hematol. 2005 - V 81 № 3 - P. 208-219.

164. Kostyak J., Naik U. Megakaryopoiesis: transcriptional insights into megakaryocyte maturation. // Front Biosci. -2007. № 12. - P. 2050-2062.

165. Krafft A., Huch R., Hartmann S., Breymann C. Combined thrombopoietin and platelet response to altitude in a patient with autoimmune thrombocytopenia. // Thromb Haemost. 2004. - V. 91 № 3. - P. 626-627.

166. Kristensen S., Bath P., Gladwin A., Martin J. The relationship between increased platelet count and megakaryocyte size in bronchial carcinoma. // Br J Haematol. 1992. - V. 81 № 2. - P. 247-251.

167. Kuwahara M., Sugimoto M., Tsuji S., Matsui H., Mizuno Т., Miyata S., Yoshioka F. Platelet shape changes and adhesion under high shear flow. // Arterioscl Thromb Vase Biol. 2002. - V. 22. - P. 329-334.

168. Lakkis N., Dokainish H., Abuzahra M., Tsyboulev V., Jorgensen J., De Leon A., Saleem A. Reticulated platelets in acute coronary syndrome: A marker of platelet activity. // J Am Coll Cardiol. 2004. - V. 44 № 10. - P. 2091-2093.

169. Larson M., Watson S. A product of their environment: Do megakaryocytes rely on extracellular cues for proplatelet formation? // Platelets. 2006. V. 17 № 7. - P. 435^40.

170. Larson M., Watson S. Regulation of proplatelet formation and platelet release by integrin alpha lib beta3. // Blood. 2006. - V. 108 № 5. - P. 15091514.

171. Latimer P., Born G., Michal F. Application of light-scattering theory to the optical effects associated with the morphology of blood platelets. // Arch Biochem Biophys. 1977. V. 180№1.P. 151-159.

172. Lawitz E., Hepburn M., Casey T. A pilot study of interleukin-11 in subjects with chronic hepatitis С and advanced liver disease nonresponsive to antiviral therapy. // Am J Gastroenterol. 2004. - V. 99 № 12. - 2359-2364.

173. Leavitt A. Proplatelet formation: unraveling the megakaryocyte swan song. // Blood. 2006. - V. 107 № 10. - P. 3816-3817.

174. Lecine P., Italiano J., Kim S., Villeval J., Shivdasani R. Hematopoietic-specific beta 1 tubulin participates in a pathway of platelet biogenesis dependent on the transcription factor NF-E2. // Blood. 2000. - V. 96. - P. 1366-1373.

175. Lee L.G., Chen C.H., Chiu L. Thiazole Orange: a new dye for reticulocyte analysis. // Cytometry. 1986. - № 7. - P. 508-517.

176. Leiter S. The human blood platelet: Its derivation from the red blood cell. // Folia Haematol. 1984. - V. 111. № 1. - P. 60-65.

177. Leven R., Yee M. Megakaryocyte morphogenesis stimulated in vitro by whole and partially fractionated thrombocytopenic plasma: a model system for the study of platelet formation. // Blood. 1987 - V. 69 № 4 - P. 1046-1052.

178. Levin J. An overview of megakaryocytopoiesis. // Prog Clin Biol Res. -1990.-V. 356.-P. 1-10.

179. Levin J., Bessman J. The inverse relationship between platelet volume and platelet number. // J Lab Clin Med. 1983. - V. 101. - P. 295-307.

180. Levine R., Eldor A., Shoff P., Kirwin S., Tenza D., Cramer E: Circulating megakaryocytes. Delivery of large numbers of intact, mature megakaryocytes to the lungs. // Eur J Haematol. 1993 - V 51 - P. 233-246.

181. Levine R., Olson Т., Shoff P., Miller M., Weisman L. Mature micromegakaryocytes: an unusual developmental pattern in term infants. // Br J Haematol. 1996. - V. 94 № 2. - P. 391-399.

182. Liao J., Keiser J., Scales W ., Kunkel S., Kluger M. Role of epinephrine in TNF and IL-6 production from isolated perfused rat liver. // Am J Physiol. -1995. V. 268. - P. R896-R901.

183. Liu Z., Yao W., Chen Y., Ding Y. Role of interleukin-9 in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. // Beijing Da Xue Xue Bao. 2004. - V. 36 № 4. - P. 403-406.

184. Loetscher P., Seitz M., Baggiolini M., Moser B. Interleukin-2 regulates CC chemokine receptor expression and chemotactic responsiveness in T lymphocytes. // J Exp Med. 1996. V. 184 № 2. P. 569-577.

185. Mark D., Newman M. Protecting the brain in coronary artery bypass graft surgery. JAMA. // 2002. V. 287. - № 11. - P. 1623-1629.

186. Markosyan R.A. A new mechanism for the regulation of platelet functional state. // Acta Med Scand Suppl. 1980. - V. 642. - P. 30-34.

187. Martin J. The relationship between megakaryocyte ploidy and platelet volume. // Blood Cells. 1989. - V. 15. - P. 108-117.

188. Martin J., Bath P., Burr M. Influence of platelet size on outcome after myocardial infarction. // Lancet. 1991. - V. 338 № 8780 - P. 1409-1411.

189. Martin J., Daniels Т., Trowbridge E. Acute and chronic changes in platelet volume and count after cardiopulmonary bypass-induced thrombocytopenia in man. // Thromb Haemost. 1987. - V. 57. - P. 55-58.

190. Martin J., Levine R. Evidence in favour of the lungs and against the bone marrow as the site of platelet production // The platelet in health and disease. / Ed. C.P. Page. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1991. — P. 1-9.

191. Martin J., Plumb J., Killy R., Kishk Y. Changes in volume and density of platelets in myocardial infarction. // Br Med J. 1983. - V. 287. - P. 456459.

192. Martin J., Shaw Т., Heggie J., Penington D. Measurement of the density of human platelets and its relationship to volume. // Br J Haematol. 1983. -V. 54.-P. 337-352.

193. Martin J., Slater D., Trowbridge E. Abnormal intrapulmonary platelet production: a possible cause of vascular and lung disease. // Lancet. 1983. -V. 1 № 8328. - P. 793-796.

194. Martin J., Trowbridge E., Salmon G., Slater D. The relationship between platelet and megakaryocyte volumes. // Thromb Res. 1982. - V. 28. - P. 447459.

195. Mathur A., Hong Y., Martin J., Erusalimsky J. Megakaryocyte differentiation is accompanied by a reduction in cell migratory potential. // Br J Haematol. 2001. - V.l 12 № 2. - P. 459-465.

196. Mathur A., Hong Y., Wang G., Erusalimsky J. Assays of megakaryocyte development: surface antigen expression, ploidy, and size. // Methods Mol Biol. 2004. - V. 272. P. 309-322.

197. Maxwell M., Dopheide S., Turner S., Jackson S. Shear induces a unique series of morphological changes in translocating platelets: effects of morphology on translocation dynamics. // Arterioscler Thromb Vase Biol. -2006. V. 26 № з. p. 663-669.

198. Mazur E., Lindquist D., de Alarcon PA., Cohen J. Evaluation of bone marrow megakaryocyte ploidy distributions in persons with normal and abnormal platelet counts. J Lab Clin Med. // 1988. V. 111 № 2. - P. 194-202.

199. McCabe D., Harrison P., Sidhu P., Brown M., Machin S. Circulating reticulated platelets in the early and late phases after ischaemic stroke and transient ischaemic attack. // British J Haematol. 2004. - V. 126 № 6. - P. 861-864.

200. McLeod D., Shreeve M., Axelrad A. Induction of megakaryocyte colonies with platelet formation in vitro. // Nature. 1976. - V. 26 № 1. - P. 492-494.

201. McNiece I., McGrath E., Quesenberry P. Granulocyte colony-stimulating factor augments in vitro megakaryocyte colony formation by interleukin-3. // Exp Hematol. 1988. - V. 16. - P. 807-810.

202. Mehaffey M., Newton A., Gandhi M., Crossley M., Drachman J. X-linked thrombocytopenia caused by a novel mutation of GATA-1. // Blood. -2001.-V. 98.-P. 2681-2688.

203. Mialou V., Kagialis-Girard S., Galambrun C., Pondarre C., Kebaili K., Ffrench M., Pages M., Bertrand Y. Thrombocytoses et thrombocytemies essentielles de l'enfant. // Archives de pediatrie. 2005. - № 12. - P. 12491254.

204. Miyazaki H., Inoue H., Yanagida M., et al. Purification of rat megakaryocyte colony-forming cells using a monoclonal antibody against rat platelet glycoprotein Ilb/IIIa. // Exp Hematol. 1992. - V. 20. - P. 855-861.

205. Mizoguchi H., Masuda M. Interleukin 7 and its receptor. // Nippon Rinsho. 1991. - V. 49 № 11. - P. 2717-2724.

206. Mrowiec Z.R, Oleksowicz L, Dutcher J.P, De Leon-Fernandez M, Lalezari P, Puszkin E.G. A novel technique for preparing improved buffy coat platelet concentrates. // Blood Cells Mol Dis. 1995. - V. 21 № 1. - P. 25-33.

207. Muller-Steinhardt M., Kirchner H., Kluter H. Impact of storage at 22 degrees С and citrate anticoagulation on the cytokine secretion of mononuclear leukocytes. // Vox Sang. 1998. - V. 75 № 1. - P. 12-17.

208. Murata T. Mechanism of platelet liberation. // Tohoku J Exp Med. -1975.-V. 116№ 1. P. 67-75.

209. Nagata Y., Muro Y., Todokoro K. Thrombopoietin-induced polyploidization of bone marrow megakaryocytes is due to a unique regulatory mechanism in late mitosis. // J Cell Biol. 1997. - V. 139. - P. 449-457.

210. Nagl W. Endopolyploidyand polyteny in differentiation and evolution. -North Holland publishing company.: Amsterdam, 1978. 283 p.

211. Nakajima K., Martinez-Maza O., Hirano T. Induction of IL-6/B cell stimulatory factor-2/IFN-(32 production by HIV. // J Immunol. 1989. - V. 142.-P. 531-536.

212. Nakamura Т., Uchiyama S., Yamazaki M., Kenshi O., Takakuwa Y., Iwata M. Flow cytometric analysis of reticulated platelets in patients with ischemic stroke. // Thromb Res. 2002. - V. 106. - P. 171-177.

213. Navarro S., Debili N., Le Couedic J., Kelin В., Breton-Gorius J., Doly J., Vainchenker W. Interleukin-6 and its receptor are expressed by human megakaryocytes: In vitro effects on proliferationand endoreplication. // Blood. 1991. - V. 77.-P. 461-470.

214. Newman M. Protecting the Brain in Coronary Artery Bypass Graft Surgery. // JAMA. 2002 - V. 287 № 11 - P. 1448-1450.

215. Nieuwenhuis H., Sixma J. Thrombocytopenia and the neglected megakaryocyte. //N Engl J Med. 1992. - V. 327.-P. 1812-1813.

216. Nilsson S., Debatis M., Dooner M., Madri J., Quesenberry P., Becker P. Immunofluorescence characterization of key extracellular matrix proteins in murine bone marrow in situ. // J Histochem Cytochem. 1998. - V. 46 № 3. P. 371-377.

217. O'Malley Т., Langhorne P., Elton R. Platelet size in stroke patients. // Stroke. 1995. - V. 26. - P. 995-999.

218. Oelhafen H. Uber Knochenmarkriesen Zellen im Stromenden. // Blut FoliaHaemer.- 1914-№ 18-P. 171-181.

219. Okada M., Sagawa Т., Tominaga A., Kodama Т., Hitsumoto Y. Two mechanisms for platelet-mediated killing of tumour cells: one cyclo-oxygenase dependent and the other nitric oxide dependent. // Immunology. 1996. - V. 89 № 1. - P. 158-164.

220. Oleksowicz L., Paciucci P., Zuckerman D., Colorito A., Rand J., Holland J. Alterations of platelet function induced by interleukin-2. // J Immunother. 1991. - V. 10 № 5. - P. 363-370.

221. Oomura Y. CNS regulation of carbohydrate metabolism // Advances in metabolic disorders / New York: Academic Press, 1983. P. 20 31.

222. Owen D. A History of blood coagulation. Mayo FMERR.; Minnesota, 2001.-355 p.

223. Oyekan A., Botting J. Adrenaline inhibits adenosine diphosphate induced intravascular aggregation of rat platelets through stimulation of alpha 2 adrenoceptors. // Cardiovasc Res. 1991. - V. 25 №5 - P. 431-437.

224. Packham M., Mustard J. // progress in hemostasis and thrombosis. V. 7 / Ed. Т.Н. Spaet. New-York, 1984/ - P. 211-288.

225. Parissis J., Filippatos G., Adamopoulos S., Li X., Kremastinos D., Uhal B. Hematopoietic colony stimulating factors in cardiovascular and pulmonary remodeling: promoters or inhibitors? // Curr Pharm Des. 2006. - V. 12 № 21. -P. 2689-2699.

226. Patel S., Hartwig J., Italiano J. The biogenesis of platelets from megakaryocyte proplatelets // J Clin. Invest. 2005 - V. 115 - P. 3348-3354.

227. Pedersen N. Occurrence of megakaryocytes in various vessels and their retention in the pulmonary capillaries in man. // Scand J Haematol. 1978 - V. 21 №5-P. 369-375.

228. Pedersen N. The pulmonary vessels as a filter for circulating megakaryocytes in rats. // Scand J Haematol. 1974 - №13 - P. 225-231.

229. Peng J., Friese P., George J., Date G., Burstein S. Alteration of platelet function in dogs mediated by interleukin-6. // Blood. 1994. - V. 83. - P. 398

230. Peng. J., Friese P., Heilmann E., George J., Burstein S., Dale G. Aged platelets have an impaired response to thrombin as quantitated by P-selectin expression.//Blood. 1994.-V. 83. - P. 161-166.

231. Pietersz R., Reesink H., Dekker W., Fijen F. Preparation of leukocyte-poor platelet concentrates from buffy coats. I. Special inserts for centrifuge cups. // Vox Sang. 1987. - V. 53 № 4. - P. 203-207.

232. Pilette C., Ouadrhiri Y., Van Snick J., Renauld J., Staquet P., Vaerman J., Sibille Y: Oxidative burst in lipopolysaccharide-activatedhuman alveolar macrophages is inhibited by interleukin-9. // Eur Respir J. 2002. - V. 20. - P. 1198-1205.

233. Platelet involvement in diabetes mellitus / Wincour P., Halushka P., Colwell J. // The Platelets: Physiology and Pharmacology / ed. Longenecker G.- New York.; Academic Press Inc, 1985. p. 341-366.

234. Platelets and megakaryocytes in vascular disease / J. Martin, P. Bath// Antithrombotics: pathophysiological rationale for pharmacological inventions/ Ed. A.G. Herman. Dordrecht, Boston.: Kluwer Academic Publishers, 1991. P. 49-62.

235. Podor Т., Jirik F., Loskutoff D., Carson D., Lotz M. Human endothelial cells produce IL-6. Lack of responses to exogenous IL-6. // Ann N Y Acad Sci.- 1989. V. 557.-P. 374-385.

236. PROGRESS Collaborative Group. Randomised trial of a perindopril-based blood pressure lowering regimen among 6,105 individuals with previous stroke or transient ischaemic attack. // Lancet. 2001. - V. 358. - P. 10331041.

237. Prosper F., Verfaillie C. Regulation of hematopoiesis through adhesion receptors. // J Leukocyte Biol. 2001. - V. 69. - P. 307-316.

238. Pruijt J., van Kooyk Y., Figdor C. Anti-LFA-1 blocking antibodies prevent mobilization of hematopoietic progenitor cells induced by interleukin-8. // Blood. 1998. - V. 91. - P. 4099-4108.

239. Rabellino E., Levene R., Leung L., Nachman R. Human megakaryocytes, II: expression of platelet proteins in early marrow megakaryocytes. // J Exp Med. 1981. - V. 54. - P. 88-100.

240. Radley J. Ultrastructural aspects of platelet production // Prog Clin Biol Res. 1986. - V. 215. - p. 387-398.

241. Radley J., Scurfield G. The mechanism of platelet release // Blood. -1980-V 56-p. 996-999.

242. Rao G., White J. Disaggregation and reaggregation of 'irreversibly' aggregated platelets: a method for more complete evaluation of anti-platelet drugs. // Agents Actions. 1985. - V. 16 № 5. - P. 425-434.

243. Ratge D., Wisser H. Alpha-and beta-adrenergic receptor activity in circulating blood cells of patients with pheochromocytoma: effects of adrenalectomy. // Acta Endocrinol. 1986. - V. 111. - P. 80-88.

244. Ravid K., Lu J., Zimmet J., Jones M. Roads to polyploidy: The megakaryocyte example. // J Cellular Physiol. 2002. - V. 190. - P. 7-20.

245. Richards E., Baglin T. Quantitation of reticulated platelets:methodology and clinical application. // Br J Haematol. 1995. - V. 91. - P. 445-451.

246. Richardson, J., Shivdasani, R., Boers, C., Hartwig, J., Italiano J. Mechanisms of organelle transport and capture along proplatelets during platelet production. Blood. // 2005 V 106 № 13 - P 4076-4085.

247. Rinder H., Bonan J., Anandan S., Rinder C., Rodrigues P., Smith B. Non invasive measurement of platelet kinetics in normal and hypertensive pregnancies. // Am J Obstet Gynecol. 1994. - V. 170. - P. 117-122.

248. Rocca В., Secchiero P., Ciabattoni G., Ranelletti F. Cyclooxygenase-2 expression is induced during human megakaryopoiesis and characterizes newlyformed platelets. // Proc Natl Acad Sci US A. 2002. - V. 99 № 11. - P. 76347639.

249. Rodriguez-Sosa M., Elizondo G., Lopez-Duran R., Rivera I., Gonzalez F., Vega L. Over-production of IFN-gamma and IL-12 in AhR-null mice. // FEBS Lett. 2005. - V. 579 № 28. - P. 6403-6410.

250. Rowley A., Hill D., Ray C., Mumro R. Haemostasis in Fish an evolutionary perspective.// Thromb Haemost. - 1997. - V. 77. № 2. - P. 227233.

251. Sako D., Chang X., Barone K., Vachino G., White H., Shaw G., Veldman G., Bean K., Ahern Т., Furie B. Expression cloning of a functional glycoprotein ligand for P-selectin. // Cell. 1993. - V. 75. - P. 1179-1186.

252. Salvagno G., Montagnana M., Degan M., Marradi P., Ricetti M., Riolfi P., Poli G., Minuz P., Santonastaso C., Guidi G. Evaluation of platelet turnover by flow cytometry. // Platelets. 2006. - V.17 № 3 - P. 170-177.

253. Sanceau J., Beranger F., Gaudelet C., Wietzerbin J. IFN-y is an essential cosignal for triggering IFN-|32/BSF-2 gene expression in human monocytic cell lines.//Ann NY Acad Sci.// 1989-V. 557.-P. 130-143.

254. Sanz C., Benet I., Richard C. Antiapoptotic protein Bcl-x(L) is up-regulated during megakaryocyte differentiation of CD34 progenitors but is absent from senescent megakaryocytes. // Exp Hematol. 2001. - V. 29. - P. 728-735.

255. Sauvage F., Carver-Moore K., Luoh S., Ryan A., Dowd M., Eaton D., Moore M. Physiological regulation of early and late stages of megakaryocytopoiesis by thrombopoietin. // J Exp Med. 1996. - V. 183. - P. 651-656.

256. Saxon В., Blanchette V., Butchart S., Lim-Yin J., Poon A. Reticulated Platelet Counts in the Diagnosis of Acute Immune Thrombocytopenic Purpura. // J Pediatric Hematol/Oncol. 1998. - V. 20 № 1. - P. 44-48.

257. Schineider W., Gatterman N. Megakaryocytes: origin of bleeding and thrombotic disordes. Eur J Clin Invest. //1994. V. 24(Suppl 1). - P. 16-20.

258. Schultze M. Ein heisbarer objecttisch und seine vermendung bei untersuchungen des bluyes. // Arch Mikroscop Anat. 1865. - № l.P. 1-42.

259. Schulze H., Korpal V., Hurov J., Kim S., Zhang J., Cantley L., Graf Т., Shivdasani R. Characterization of the megakaryocyte demarcation membrane system and its role in thrombopoiesis. // Blood. 2006. - V. 107. № 10. - P. 3868-3875.

260. Schulze H., Shivdasani R. Mechanisms of thrombopoiesis. // J Thromb Haemost. 2005. -№ 3. - P. 1717-1724.

261. Schwer H., Lecine P., Tiwari S., Italiano J., Hartwig J. A lineage-restricted and divergent beta-tubulin isoform is essential for the biogenesis, structure and function of blood platelets. // Curr Biol. 2001 - №11 - P. 579589.

262. Scott G. Circulating megakaryocytes. // Histopathology. 1982 - V. 6 № 4 - P. 467-475.

263. Shalaby M.R., Waage A., Espevik T. Cytokine regulation of interleukin 6 production by human endothelial cells // Cell Immunol., 1989, 121: 372-382.

264. Sharnoff J. Increase pulmonary megakaryocytes-probable role in postoperative thromboembolism. // JAMA. 1959. V. 169 - P. 688-691.

265. Sharnoff J., Kim E. Evaluation of pulmonary megakaryocytes. // Arch Path. 1958-V. 66-P. 176-182.

266. Sharp D., Bath P., Martin J. Cigarette smoking sensitizes and desensitizes impedance-measured ADP-induced platelet aggregation in whole blood. // Thromb Haemost. 1995. - V. 74. - P. 730-735.

267. Sharpe P., Trinick T. Mean platelet volume in diabetes mellitus. // Q J Med 1993. - V. 86. - P. 739-742.

268. Shcherbina A., Remold-O'Donnell E. Role of caspase in a subset of human platelet activation respondes. // Blood. 1999. - V. 93. - P. 4222-4231.

269. Shivdasani R., Rosenblatt M., Zucker-Franklin D. Transcription factor NF-E2 is required for platelet formation independent of the actions of thrombopoietin/MGDF in megakaryocyte development. // Cell. 1995. - V. 81.-P. 695-704.

270. Shukla J., Rai S., Singh V. Acute megakaryoblastic leukaemia: a clinico-haematological profile of five cases // Indian J Pathol Microbiol. 2004 - V. 47 №2.-p. 266-268.

271. Simmons P., Levesque J., Zannettino A. Adhesion molecules in haemopoiesis. // Baillieres Clin Haematol. 1997. - V. 10. - P. 485-492.

272. Simmons P., Zannettino A., Levesque J. Mucin-like molecules as regulators of hematopoiesis. // Exp Hematol. 1998. - V. 26. - P. 69a.

273. Smith E., Butcher J. The incidence, distribution and significance of megakaryocytes in normal and diseased human tissue. // Blood. 1952 - № 7 -P. 214-224.

274. Smyth D., Martin J., Michalis L., Bucknall C., Jewitt D. Influence of platelet size before coronary angioplasty on subsequent restenosis. // Eur J Clin Invest. 1993. - № 23. - P. 361-367.

275. Snavely M., Motulsky H., O'Connor D., Ziegler M., Insel P. Adrenergic receptors in human and experimental pheochromocytoma. Clin Exp Hypertens. -1982.-№ 4.-P. 829-848.

276. Soslau G., Morgan D., Jaffe J., Brodsky I., Wang Y. Cytokine mRNA expression in human platelets and a megakaryocyte cell line and cytokine modulation of platelet function. // Cytokine. 1997. - V. 9 № 6. - P. 405-411.

277. Sousa A., Poston R., Lane S., Nakhosteen J., Lee T. Detection of GM-CSF in asthmatic bronchial epithelium and decrease by inhaled corticosteroids. // Am Rev Respir Dis. 1993. - V. 147.-P. 1557-1561.

278. Stahl СР., Zucker-Franklin D., Evatt В., Winton E. Effects of human interleukin-6 on megakaryocyte development and thrombocytopoiesis in primates. // Blood. 1991. - V. 78 № 6. - P. 1467-1475.

279. Stenberg P., Levin J. Mechanisms of platelet production. // Blood Cells.- 1989.-V. 15 № l.-p. 23-47.

280. Stiegler G., Stohlawetz P., Brugger S., Jilma В., Vierhapper H., Hocker P., Panzer S. Elevated numbers of reticulated platelets in hyperthyroidism: direct evidence for an increase of thrombopoiesis. // Br J Haematol. 1998. -V. 101 №4.-P. 656-658.

281. Stiegler G., Stohlawetz P., Peck-Radosavljevic M., Jilma В., Pidlich J., Wichlas M., Hocker P., Panzer S. Direct evidence for an increase in thrombopoiesis after liver transplantation. // Europ J Clin Invest. 1998. - V. 28 №9.-P. 755-759.

282. Stohlawetz P., Folman C., von dem Borne A., Pernerstorfer Т., Eichler H., Panzer S., Jilma B. Effects of Endotoxemia on Thrombopoiesis in Men. // Thromb Haemost. 1999. -V. 81 № 4. - P. 613-617.

283. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis. // Frontiers in Bioscience. 2006. - №. 11. - P. 59-80.

284. Sun C.L., Thoa N.B., Kopin I J. Comparison of the effect of 2-Deoxyglukose and immobilization of on plasma levels of catecholamines and corticosterone in awake rats. // Endocrinol. 1979. - V. 105. - P. 306-311.

285. Tablin F., Castro M., Leven R. Blood platelet formation in vitro. The role of the cytoskeleton in megakaryocyte fragmentation. // J Cell Sci. 1990 -V. 97-P. 59-70.

286. Tavassoli M., Aoki M: Migration of entire megakaryocytes through the marrow-blood barrier. // Br J Haematol. 1981 - V 48 - P. 25-29.

287. Terres W., Becker В., Schrodl W., Gerlach E. Effects of chronic treatment with adrenaline or propranolol on platelet function and c-AMP levels in the rat. Cardiovasc Res. - 1989. - V. 23 № 2. - P. 112-116.

288. Thiagarajan D., Pacheco J., Hillman N. Marrow cell uptake by megakaryocytes and naked megakaryocyte nuclei in routine bone marrow examination. // South Med J. 1985. V. 78 № 9. - P. 1127-1128.

289. Thiery J., Besis M. Genesis of blood platelets from the megakaryocytes in living cells // С R Hebd Seances Acad Sci. 1956 - V 242 № 2 - p. 290292.

290. Thompson C., Diaz D., Quinn P., Lapins M., Kurtz S., Valeri C. The role of anticoagulation in the measurement of platelet volumes. // Am J Clin Pathol. 1983. - V. 80. - P. 327-332.

291. Thompson C., Eaton K., Princiotta S., Kushkin C., Valeri C. Size dependent platelet subpopulations: relationship of platelet volume to ultra structure, enzymatic activity and function. // Br J Haematol. 1982. - V. 50. -P. 509-519.

292. Thompson C., Jakubowski J. The pathophysiology and clinical relevance of platelet heterogeneity. // Blood. 1988. - V. 72 № 1. - P. 1-8.

293. Thompson C., Jakubowski J., Quinn P., Deykin D., Valeri C. Platelet size as a determinant of platelet function. // J Lab Clin Med. 1983. - V. 101. -P. 205-213.

294. Thompson C., Jakubowski J., Quinn P., Deykin D., Valeri C. Platelet size and age determine platelet function independently. // Blood. 1984. - V. 63. - P.l372—1375.

295. Thompson C., Love D., Quinn P., Valeri C. Platelet size does not correlate with platelet age. // Blood. 1983. - V. 62. - P. 487-494.

296. Tinggaard-Pedersen N, Cohn J. Intact megakaryocytes in the venous blood as a marker for thrombopoiesis. // Scand J Haematol. 1981. - V. 27 № l.-P. 57-63.

297. Tomer A. Human marrow megakaryocyte differentiation: multiparameter correlative analysis identifies von Wilillebrand factor as a sensitive and distinctive marker for early (2N and 4N) megakaryocytes. // Blood. 2004. V. 104 № 9. - P. 2722-2727.

298. Tong M., Seth P., Penington D. Proplatelets and stress platelets. // Blood. 1987. - V. 69 № 2. - P. 522-528.

299. Торр К., Tablin F., Levin J. Culture of isolated bovine megakaryocytes on reconstituted basement membrane matrix leads to proplatelet process formation. // Blood. 1990 - V 76 - P. 912-924.

300. Trowbridge A. Proplatelets and stress platelets. // Blood. 1987. - V. 70 №2.-P. 600.

301. Trowbridge E., Martin J., Slater D. Evidence for a theory of physical fragmentation of megakaryocytes, implying that all platelets are produced in the pulmonary circulation. // Thromb Res. 1982 - V 28 - P. 461-475.

302. Tschoepe D., Esser J., Schwippert В., Rosen P., Kehrel В., Niewuenhuis H., Gries F. Large platelets circulate in an activated state in diabetes mellitus. // Semin Thromb Hemost. 1991. V. 17. - P. 433-439.

303. Vainchenker W., Debili N., Mouthon M., Wendling F. Megakaryocytopoiesis: cellular aspects and regulation. // Crit Rev Oncol Hematol. 1995.-V. 20 № 1-2.-P. 165-192.

304. Van Dijk D., Jansen E., Hijman R. Cognitive outcome after off-pump and on-pump coronary artery bypass graft surgery: a randomized trial. // JAMA.- 2002. -V. 287.-P. 1405-1412.

305. Van Snick J. Interleukin-6. // Annu Rev Immunol. 1990. - № 8. - P. 253-278.

306. Vannucchi A., Grossi A., Rafanelli D. In vivo stimulation of megakaryocytopoiesis by recombinant murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. // Blood. 1990. - V. 76. - P. 1473-1480.

307. Verfaillie C., Hurley R., Bhatia R. Role of bone marrow matrix in normal and abnormal hematopoiesis. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. 1994. -V. 16.-P. 201-216.

308. Wadhwa M., Seghatchian M., Lubenko A., Contreras M., Dilger P., Bird C., Thorpe R. Cytokine levels in platelet concentrates: quantitation by bioassays and immunoassays. // British Journal of Haematology. 1996. - V. 93 № 1. - P. 225-234.

309. Wang Z., Zhang Y., Kamen D., Lees E., Ravid K. Cyclin D3 is essential for Megakaryocytopoiesis. // Blood. 1995. - V. 86. - P. 3783-3788.

310. Watanabe K., Takeuchi K., Kawai Y., Ikeda Y., Kubota F., Nakamoto H. Automated measurement of reticulated platelets in estimating thrombopoiesis. // Eur J Haematol 1995. - V. 54 № 3. - P. 163-171.

311. Weyrich A., Zimmerman G. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. // 2004. V. 25 № 9. - P. 489-495.

312. White J. An overview of platelet structural physiology. // Scanning Microsc.- 1987.-V. 1 №4.-P. 1677-1700.

313. White J. EDTA-induced changes in platelet structure and function: clot retraction. // Platelets. 2000. - V. 11 № 1. - P. 49-55.

314. White J. Platelets are covercytes, not phagocytes: Uptake ofbacteria involves channels of the open canalicular system. // Platelets. 2005. - V. 16. -P. 121-131.

315. White J. Why human platelets fail to kill bacteria. // Platelets. 2006. -V. 17 №3-P. 191-200.

316. White J., Krivit W., An ultrastructural basis for the shape changes induced in platelets by chilling. // 1967. Blood. - V. 30. - P. 625-635.

317. White P. Propofol: pharmacokinetics and pharmacodynamics/ / Semin Anasth. 1988. - White.7 № 1 (Suppl. 1). - P. 4-20.

318. Wilde N., Burgess Rio, Keenan D., Lucas G: The effect of cardiopulmonary bypass on circulating megakaryocytes. // Br J Haematol. -1997-V. 98-P. 322-327.

319. Williams N., Jackson H., Iscove N. The role of erythropoietin, thrombopoietic stimulating factor, and myeloid colony-stimulating factors on murine megakaryocyte colony formation. // Exp Hematol. 1984. - V. 12. - P. 734-740.

320. Wojenski C., Schick P. Development of storage granules during megakaryocyte maturation: accumulation of adenine nucleotides and thecapacity for serotonin sequestration. 11J Lab Clin Med. 1993. - V. 121 № 3 -P. 479-485.

321. Woods M., Landon C., Wagner В., Greaves M., Trowbridge E. Isolation of circulating megakaryocytes in man. //Med Lab Sci. 1992 - V. 49 - P. 252-258.

322. Worthington R., Nakeff A., Micko S. Flow cytometric analysis of megakaryocyte differentiation. // Cytometry. 1984. - № 5. - P. 501-508.

323. Wright J. The histogenesis of the blood platelets. // J Morphol. 1910. -V. 21 №2-P. 263-278.

324. Wright J. The origin and natureof the blood platelets. // Boston Med Surg J. 1906. - V. 154. - P. 643-645.

325. Xiao da W., Yang M., Yang J., Hon K., Fok F. Lung damage may induce thrombocytopenia. // Platelets. 2006. - V. 17 № 5. - P. 347-349.

326. Yang J., Yang M., Xu F., Li K., Lee S., Рак-Cheung N., Tarn J., Yuen P., Fok T. Effects of Oxygen-Induced Lung Damage on Megakaryocytopoiesis and Platelet Homeostasis in a Rat Model. // Pediatric Research. 2003 - V. 54 -P. 344-352.

327. Yip J., Shen Y., Berndt M., Andrews R. Primary platelet adhesion receptors // IUBMB Life. 2005. - V. 57 № 2. - P. - 103-108.

328. Youssefian Т., Masse J., Rendu F., Guichard J., Cramer E. Platelet and megakaryocyte dense granules contain glycoproteins lb and Ilb-IIIa. Blood. -1997. - V. 89 № 11. - 4047-4057.

329. Zimmermann G. Zur Blutkorperchenfrage. // Virch Arch Pathol Anat. -1860. -№ 18.-P. 221-242.

330. Zimmet J., Toselli P., Ravid K. Cyclin D3 and megakaryocyte development: exploration of a transgenic phenotype. // Stem Cells. 1998 - V. 16-P. 97-106.

331. Zucker-Franklin D. Endocytosis by human platelets: metabolic and freeze-fracture studies. // J Cell Biol. 1981. - V. 91 № 3. - P. 706-715.

332. Zucker-Franklin D., Peturson S. Thrombocytopoiesis—analysis by membrane tracer and freeze-fracture studies on fresh human and cultured mouse megakaryocytes. // J Cell Biol. 1984. - V. 99 № 2. - P. 390-402.

333. Zucker-Franklin D., Philipp C. Platelet Production in the Pulmonary Capillary Bed New Ultrastructural Evidence for an Old Concept. // American Journal of Pathology. 2000 - V 157 - P. 69-74.

334. Zucker-Franklin D., Stahl C., Hyde P. Megakaryocyte ultrastructure. Its relationship to normal and pathologic thrombocytopoiesis. Ann N Y Acad Sci. - 1987. - V. 509. - P. 25-33.