Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Характеристика механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Характеристика механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных"

данном случае составила 87,3% (р<0,01). Причём в популяции 5. aureus появлялись клоны, у которых гемолитическая активность полностью отсутствовала.

Соинкубирование P. aeruginosa с ТД крупного рогатого скота в 'А МПК привело к снижению продукции гемолизинов на 27%, а под действием МПК кислоторастворимых белков из кровяных пластинок ГА уменьшилась на 42% от контрольного значения.

120

I. . 15 aureus E55SS P. aeruginosa ES2J Е. faecalis -контроль

Примечание: ** - достоверность различий выраженности гемолитической активности в контроле и после соинкубирования сТД - (р<0,01), *** - (р<0,001).

Рисунок 6. Влияние тромбодефенсинов продуктивных животных на гемолитическую активность бактерий

При изучении действия ТД крупного рогатого скота на ГА Е. faecalis было установлено незначительное подавление исследуемого признака после соинкубирования бактерий с антимикробными пептидами в У* МПК, значение гемолитической активности при этом составило 8,36±1,461%. Тромбодефенсины в МПК способствовали дальнейшему ингибированию фактора патогенности до 7,43±0,746%, что на 14,1% меньше показателя гемолитической активности у интактных клонов энтерококков.

Максимальное подавление признака пептидами из кровяных пластинок лошади регистрировали у P. aeruginosa. Под влиянием 'Л МПК ТД значение гемолитической активности было равным 18,9±6,22%, что на 23,2% меньше контроля. Тромбодефенсины лошади в МПК в меньшей степени снижали способность бактерий разрушать эритроциты: разница с контролем составила 13%. При изучении гемолитической активности грамположительных микроорганизмов показано, что ингибирующий эффект 'А МПК ТД лошади больше в отношении вирулентного признака Е. faecalis, чем S. aureus.

эффект в отношении персистентного свойства обоих видов микроорганизмов проявили АМП кур. Так, значение признака у золотистого стафилококка уменьшалось на 41,3% под влиянием % МПК ТД и на 86,7% при повышении концентрации пептидов до МПК. Кислотный экстракт из тромбоцитов кур в МПК и 1Л МПК уменьшал способность инактивировать карнозин 5. ер1с1егт1сИ.ч в 1,8 раза и в 4,8 раза, соответственно.

Максимальное достоверное подавление признака выявлено при соинкубировании кишечной палочки с АМП из кровяных пластинок лошади в минимальной подавляющей концентрации. АКрА в данном случае снизилась на 68,9% и составила 0,09±0,061 мг/мл (р<0,05).

Аналогичный эффект в отношении АКрА данного микроорганизма был отмечен и после воздействия АМП кур в МПК: значение фактора персистенции стало равным 0,12±0,073 мг/мл, против 0,29±0,124 мг/мл в контроле (р<0,05).

Соинкубирование К. охуЮса с тромбодефенсинами лошади в V* МПК способствовало снижению признака на 22% по сравнению с контролем (рис. 8). В меньшей степени ингибировал антикарнозиновую активность кислоторастворимый белок из кровяных пластинок крупного рогатого скота в этой же концентрации: значение антикарнозиновой активности уменьшалось на 10,5%. АКрА К. охуЮса под влиянием 'А МПК ТД кур возросла незначительно (до 2,30±0,503 мг/мл против 2,28±0,302 мг/мл в контроле), при соинкубировании с МПК АМП из тромбоцитов кур значение рассматриваемого показателя превысило контрольное на 24,1%.

3,5

ТД лошади ТД кр. рог скота ТД кур ТД лошади ТД кр. рог скота ТД кур

ЕсоН К.охНосо I ИЧПц 55Я 1/4 МПК -контроли

Примечание: * - достоверность различий выраженности антикарнозиновой активности в контроле и после соинкубирования с ТД — (р<0,05).

Рисунок 8. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных на АКрА Е. coli и К. oxytoca

Таким образом, установлено преимущественно ингибирующее действие АМП из тромбоцитов и кровяных пластинок всех исследованных видов продуктивных животных на АКрА S. aureus и S. epidermidis. Причем в

Максимальное снижение признака наблюдалось при соинкубировании микроорганизма с ТД кур в МПК, при этом значение IgA-протеазной активности С. albicans составило 21,5±1,37%. % минимальной подавляющей концентрации тромбодефенсинов кур оказывала аналогичный эффект, уменьшая IgA-протеазную активность до 23,7±1,34% (р<0,01).

Анализ результатов исследования показал, что по отношению к штаммам S. aureus и К. pneumoniae все ТД проявляли ингибирующее действие, в большей степени способность бактерий инактивировать иммуноглобулин А подавляли ТД кур. Максимальное уменьшение выраженности признака у клонов Е. coli отмечено после соинкубирования с тромбодефенсинами лошади и крупного рогатого скота в минимальной подавляющей концентрации. Стимулирующий эффект на IgA-протеазную активность Е. coli оказали пептиды тех же животных только в меньшей концентрации.

При изучении влияния кислотного экстракта из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных на IgA-протеазную активность К. pneumoniae отмечено максимальное отклонение показателей от контрольных значений в сторону снижения, как под действием МПК, так и V* МПК тромбодефенсинов кур, лошади и крупного рогатого скота.

Выявленное нами регулирующее влияние изученных антимикробных пептидов на факторы вирулентности и персистенции можно объяснить с позиции механизмов антимикробного действия тромбодефенсинов. Процесс нарушения структурной целостности и образования пор при внедрении и прохождении ТД через мембрану сопровождается не только изменением осмотического барьера клеток-мишеней, но и дезорганизацией мультиферментных комплексов, встроенных в мембрану, а также приводит к подавлению дыхания, окислительного фосфорилирования, транскрипции и синтеза белков, то есть ключевых метаболических процессов микробных клеток (Hill С.Р. et al., 1991; Selsted М.Е. et al„ 1993, Friedrich C.L. et al., 2001; Кокряков B.H., 2006).

Подводя итог проделанной работе, следует заключить, что биологическая активность препаратов тромбоцитарного экстракта, полученных из тромбоцитов и кровяных пластинок разных видов продуктивных животных различается количественно, тогда как качественные изменения бактериальных клеток, по сути, сходны. Изменение вирулентных и персистентных свойств микроорганизмов под действием тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных разнонаправлено и определяется видовой принадлежностью как антимикробных пептидов, так и микроорганизмов. В отношении гемолитической, протеолитической активности, а также способности к инактивации карнозина и иммуноглобулина А микроорганизмами наиболее эффективными ингибиторами выступают тромбодефенсины кур и лошади.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Дымова, Вероника Викторовна, Уфа

ФГБОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

па правах рукот 04201450697 •£, С

Дымова Вероника Викторовна

I'

Характеристика механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Сычева Мария Викторовна

УФА-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................... 4

ВВЕДЕНИЕ............................................................................ 5

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................... 12

1.1. Факторы вирулентности и персистенции микроорганизмов........................................................................ 12

1.1.1. Гемолитическая активность и протеолитическая активность, как факторы патогенности микроорганизмов.......................................... 12

1.1.2. Антикарнозиновая и ^А-прогеазная активности - секретируемыё факторы персистенции микроорганизмов.......................................... 20

1.2. Регуляция персистентных и вирулентных свойств микроорганизмов........................................................................ 26

1.3 Антимикробные вещества животного происхождения..................... 31

1.4 Биологические свойства тромбодефенсинов................................. 34

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................... 41

2.1. Материалы и методы исследований.............................................. 41

2.2. Изучение механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных методом атомно-силовой

микроскопии.............................................................................. 50

2.3 Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на

вирулентные свойства микроорганизмов.......................................... 55

2.3.1. Характеристика протеолитической активности микроорганизмов

после соинкубирования с тромбодефенсинами................................... 56

2.3.2 Оценка воздействия антимикробных пептидов из тромбоцитов па

гемолитическую активность бактерий.............................................. 64

2.4. Влияние тромбодефенсинов на персистентные свойства

микроорганизмов........................................................................* 69

2.4.1. Оценка воздействия антимикробных пептидов из тромбоцитов на способность бактерий к инактивации карнозина............................... 69

2.4.2. Регуляция ^А-протеазной активности микроорганизмов

тромбодефенсинами........................................................................................................................................75

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................................83

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................................................90

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................................................................................92

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................93

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКрА - антикарнозиновая активность

AJ1A - антилизоцимная активность

АМП - антимикробные пептиды

АСМ - атомно-силовая микроскопия

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВРТЧ - вирус иммунодефицита человека

ГА - гемолитическая активность

ИЭТ - изоэлектрическая точка

МБК - минимальная бактерицидная концентрация

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ПА - протеолитическая активность

ТКБ - тромбоцитарный катионный белок

ТД - тромбодефенсины

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время наблюдается тенденция перехода многих инфекционных заболеваний человека и животных в хроническую и латентную формы, которые связаны с персистенцией микроорганизмов, то есть со способностью патогенов к длительному переживанию в контакте с иммунной системой макроорганизма (Бухарин О.В., 1999). Кроме того, высокая генетическая изменчивость и скорость размножения микроорганизмов, широкое и зачастую бесконтрольное применение антимикробных препаратов обуславливают возникновение

антибиотикорезистентпых штаммов (Дьяченко C.B., 2010), способных изменять свои патогенные и персистеитиые свойства. Это приводит к снижению терапевтической эффективности лекарственных препаратов и создает серьезные проблемы в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний (Яковлев В.П., Яковлев C.B., 2008).

Одним из приоритетных путей решения проблемы антибиотикорезистентности в настоящее время считается поиск эффективных препаратов на основе природных антимикробных агентов, в том числе имеющих в своем составе естественные защитные компоненты организма-хозяина, сформированные в результате длительного процесса коэволюции микро- и макроорганизмов, к которым со стороны патогенов не наблюдается развития устойчивости (Коробов В.П. и др., 2010; Лазарев В.Н., Говорун В.М., 2010). В связи с этим несомненный научный и практический интерес представляет изучение биологических эффектов природных антимикробных агентов животного происхождения, обеспечивающих реализацию защитных и приспособительных реакций при инфицировании (Zannetti M. et al., 1995; Ayabe T. et al., 2000; Moerman L. et al., 2002; Roch P. et al., 2004; Steinstraesser L. et al., 2005; Home W.S. et al., 2005), стрессорном воздействии (Korneva E.A. et al., 1997), паразитарной инвазии (McGwire В.S.

et al., 2003; Park Y. et al., 2004), опухолевом росте (Сипайлова О.Ю., Корнеев Г.И., 2009).

Наряду с нейтрофильными грапулоцитами (Ganz Т. et al., 1985), макрофагами и эпителиальными клетками барьерных органов (Zannetti М. et al., 1995; Dorschner R.A. et al., 2001) в роли продуцентов антимикробных пептидов в организме человека и ряда животных выступают тромбоциты и кровяные пластинки (Shultz L.D., Wilder M.S., 1971; Сулейманов К.Г. и др. 1979). Они являются носителями тромбодефенсинов (ТД) - пептидов, локализованных в альфа гранулах. Обладая широким спектром биологических свойств: антимикробной, антивирусной, цитотоксической, хемотаксической, иммуномодулирующей активностями, тромбодефенсины являются одним из важных факторов поддержания иммунного гомеостаза макроорганизма (Сулейманов К.Г. и др., 1983). В связи с многофункциональностью данные вещества способны служить не только основой для разработки антимикробных препаратов, но и выступать в качестве соединений, обладающих необходимой модифицирующей активностью в отношении патогенного и персистептного потенциала микроорганизмов.

Кроме тромбодефенсинов человека «матрицей» для антимикробного препарата могут служить антимикробные пептиды тромбоцитов и кровяных пластинок животных, поэтому понимание механизмов биологической активности тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных и комплексное изучение их действия на патогенный и персистентный потенциал микроорганизмов представляется весьма актуальным.

Целыо настоящего исследования явилось изучение механизмов биологической активности тромбодефенсинов продуктивных животных.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить особенности морфофуикциональной реакции микроорганизмов на воздействие тромбодефенсинов, выделенных из тромбоцитов кур и кровяных пластинок крови лошади и крупного рогатого скота.

2. Оценить влияние тромбодефенсинов на вирулентные свойства условно-патогенных микроорганизмов (гемолитическую и протеолитическую активности).

3. Исследовать антиперсистентные свойства тромбодефенсинов на примере способности условно-патогенных микроорганизмов к инактивации карнозина и иммуноглобулина А.

Область исследования: Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна исследований.

В результате проведенных экспериментов получены новые данные, характеризующие функциональные свойства природных антимикробных пептидов, выделенных из тромбоцитов и кровяных пластинок сельскохозяйственных животных. Приоритетный характер носят результаты исследования воздействия тромбодефенсинов кур, крупного рогатого скота и лошадей на внешние структуры, вирулентные и персистеитные свойства условно-патогенных микроорганизмов.

Впервые с использованием атомно-силовой микроскопии оценена морфо-функциональная реакция бактериальных клеток с различным типом строения клеточной стенки на воздействие антимикробных пептидов из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных. Зафиксирована гетерогенность морфологических и механических свойств клеток в популяциях Е. coli и S. aureus при воздействии тромбодефенсинов. Отмечены пороподобные повреждения поверхности бактериальных клеток, что

позволяет отнести ТД сельскохозяйственных животных к классу пороформирующих катионных антимикробных пептидов.

При изучении влияния тромбодефепсинов на способность бактерий разрушать эритроциты, установлено преимущественно ингибирующее действие данных антимикробных веществ на гемолитическую активность микроорганизмов. Наиболее эффективно снижают вирулентный признак у Staphylococcus aureus и Pseuclomonas aeruginosa ТД кур, а у Enterococcus faecalis - ТД крупного рогатого скота.

Показано, что антимикробные пептиды, выделенные из тромбоцитов и кровяных пластинок сельскохозяйственных животных, оказывают разнонаправленное действие на протеолитическую активность микроорганизмов: выраженность вирулентного признака микроскопических грибов Candida albicans уменьшается под действием ТД. Условно-патогенные бактерии реагируют на присутствие антимикробного средства в большинстве случаев повышением протеолитической активности.

Выявлено ингибирующее действие тромбодефепсинов на способность к инактивации карнозина бактериями рода Staphylococcus. Максимальное подавление признака отмечено после соинкубирования бактерий с ТД кур. Наиболее выраженное антиперсистентное действие в отношении грамотрицательных микроорганизмов (Е. coli и Klebsiella oxytoca) оказали антимикробные пептиды лошади. Повышение уровня АКрА у Е. coli отмечено при использовании ТД крупного рогатого скота и при соинкубировании К. oxytoca с пептидами из кровяных пластинок лошади.

Установлено, что антимикробные пептиды из тромбоцитов и кровяных пластинок продуктивных животных способны модифицировать IgA-протеазную активность микроорганизмов. Снижение уровня персистентного признака отмечено у К. oxytoca и S. aureus после действия тромбодефепсинов всех исследованных видов сельскохозяйственных животных.

Антимикробные пептиды оказывают разнонаправленное влияние на изученный показатель у Е. coli и С. albicans.

Практическая значимость работы.

Полученные в результате работы данные о способности тромбодефеисинов изменять вирулентный и персистептпый потенциал условно-патогенных микроорганизмов открывают перспективу ' для разработки путей коррекции инфекциопно-воспалительпых заболеваний животных с помощью антимикробных пептидов. Понимание механизмов биологической активности противомикробных агентов из тромбоцитов создает предпосылки для их использования в терапии различных инфекций.

Результаты исследований используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» и вошли в содержание курса лекций дисциплин «Иммунология», «Антибиотики» и «Ветеринарная микробиология и микология» для студентов специальностей «Микробиология»' и «Ветеринария».

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Функциональные свойства антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных» (№ государственной регистрации 0120.1252048).

Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на:

- Международной научно-практической конференции,

посвященной 55-летию со дня рождения профессора Ю. В. Храмова «Энтузиазм и творчество молодых учёных, студентов в развитии ветеринарной медицины» (Оренбург, 2011);

- международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики» (Оренбург, 2011);

- международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011);

- первой молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011);

- II региональном молодежном инновационном конвенте Оренбургской области (Оренбург, 2012) (приложение 1);

- IV международной научно-практической конференции «Проблемы устойчивости биоресурсов: теория и практика» (Оренбург, 2013);

- международной научно-практической конференции «Современные проблемы животноводства и ветеринарии: состояние и пути решения» (Краснодар, 2013).

Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 3 от 27 сентября 2013 года).

Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 5 печатных работах, из них три - в центральных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Материалы диссертации представлены на областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2011» (Оренбург, 2011) и отмечены сертификатом победителя (приложение 2). Работа удостоена медали и диплома Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук на Всероссийском фестивале науки (Ульяновск, 2011) (приложение 3).

Фрагменты работы были представлены на областном конкурсе научно-исследовательских работ и отмечены премией Губернатора Оренбургской области (2011) (приложение 4).

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Биологическая активность препаратов тромбоцитарного экстракта, полученных из тромбоцитов и кровяных пластинок разных видов сельскохозяйственных животных различается количественно, тогда как качественные изменения бактериальных клеток, по сути, сходны.

2. Изменение вирулентных и персистентных свойств микроорганизмов под действием тромбодефенсинов продуктивных животных разнонаправлено и определяется видовой принадлежностью как антимикробных пептидов, так и микроорганизмов.

3. В отношении гемолитической, протеолитической активности, а также способности к инактивации карнозина и иммуноглобулина А микроорганизмами наиболее эффективными ингибиторами выступают тромбодефенсины кур и лошади.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 странице компьютерной верстки, содержит 2 таблицы и 18 рисунков. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, который включает 201 наименование, в том числе 86 работ иностранных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Факторы вирулентности и персистенции микроорганизмов

Одним из основных фундаментальных направлений современной микробиологии и медицины является изучение факторов вирулентности и персистенции микроорганизмов. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают широкий спектр веществ, . как непосредственно повреждающих или убивающих клетки микро- и макроорганизмов, так и способствующих проникновению бактерий в организм хозяина, вследствие преодоления защитных систем. Эти соединения предопределяют развитие заболеваний бактериальной этиологии (Литвин В.Ю., Пушкарева В.Н., 1994; McDonel J.L. et al., 1986).

1.1.1. Гемолитическая активность и протеолитическая активность, как факторы патогенности микроорганизмов

Многие исследователи отводят значительную роль в патогенезе инфекций гемолизинам - внеклеточно секретируемым молекулам с мембраноповреждающей способностью, выработку которых следует рассматривать как один из факторов патогенности микроорганизмов (Boehm D.F. et al., 1990; Бондаренко В.М., 1999; Бухарин О.В. и др., 2005).

Впервые способность синтезировать гемолизины была установлена у представителей родов Staphylococcus, Streptococcus, а также у Escherichia coli (Бондаренко В.М., Голубев А.В., 1988). Микроорганизмы, синтезирующие данные молекулы, обладают гемолитической активностью, определяющуюся как способность к лизису эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина.

В настоящее время гемолитическая активность обнаружена у широкого

круга грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, для части из которых она является основным токсическим фактором, как, например, для патогенной кишечной палочки, вызывающей диарею (Walker В., Bayley П., 1995; Elliott S.J. et al., 1998).

F. Raimondi et al. (2000) установили, что у Vibrio parahaemolyticus ведущим вирулентным фактором является гемолизин, обладающий секреторной и цитотоксической активностью.

По данным Г.К. Азнабаева (2003), способность синтезировать энтерогемолизин, которая обуславливает развитие диареи, характерна не только для энтеропатогеппой кишеч�