Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных

Шейда, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных"

00461Ь37

Шейда Елена Владимировна

Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 ДЕК 2010

Уфа-2010

004616370

Работа выполнена на кафедрах микробиологии и незаразных болезней животных в ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Защита состоится 25 декабря 2010 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» (450001, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет».

Автореферат размещен на официальном сайте ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» http://www.bsau.ru.

Автореферат разослан «А&» ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор сельскохозяйственных наук,

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Жуков Алексей Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Андреева Альфия Васильевна

кандидат биологических наук, доцент Хазипов Рустем Барисович

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост инфекций, вызванных антибиотико-устойчивыми микроорганизмами, диктует необходимость поиска новых микро-боцидных средств. Используемые в качестве бактерицидных препаратов антибиотики обладают токсичным действием на органы и системы организма человека и животных, способствуют развитию дисбактериозов. Кроме того, у большинства микроорганизмов к ним быстро формируется устойчивость [Апчел А.В. и др., 2008]. Поэтому вопрос об изыскании новых эффективных антимикробных средств остается весьма актуальным.

В настоящее время за рубежом привлекательной альтернативой антибио-тикотерапии считают терапию, основанную на применении катионных антимикробных пептидов (КАМП) [Gopal R. et al., 2009; Goo J. et al., 2010; Nie-lubowicz G.R. et al., 2010; Rackham E.J. et al., 2010; Kai-Larsen Y. et al., 2010]. Среди них особое место занимают низкомолекулярные белки (пептиды) с выраженными катионными свойствами, к которым относятся и тромбодефенсины (тромбоцитарные катионные белки) - пептиды, локализованные в альфа-гранулах тромбоцитов, высвобождающиеся из них при повреждении тканей [Dankert J. et al., 2001] и обладающие антибактериальной, антимикотической и антивирусной активностями [Jenssen H. et al., 2006]. Биологическая активность этих молекул не ограничивается их бактерицидной функцией, а проявляется вовлечением пептидов в широкий круг защитно-приспособительных реакций [Бухарин О.В. и др., 2000]. Перспективным источником тромбодефенсинов или тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) являются тромбоциты сельскохозяйственных животных. Вместе с тем, имеются лишь единичные, порой противоречивые сведения о наличии тромбодефенсинов у сельскохозяйственных животных и их антимикробной активности.

В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, что обеспечивает длительное переживание инфекционного агента в макроорганизме [Бухарин О.В., 1999]. Поэтому изыскание биологически активных веществ, инги-бирующих персистентный потенциал патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, является актуальным. Однако до настоящего времени малоизученным остаётся вопрос о влиянии тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на персистентные свойства бактерий, отсутствует информация о влиянии тромбодефенсинов на способность микроорганизмов к пленкообразо-ванию. Изучение данного вопроса представляется интересным и с точки зрения использования ТКБ в будущем как антимикробных препаратов. Аналитиками делается вывод, что в силу относительной дешевизны, отсутствия побочных эффектов и минимальной вероятности формирования резистентности у бакте- ) ,

рий к этим препаратам, КАМП в 21 веке займут подавляющий сегмент мирового рынка антимикробных препаратов [Hancock R.E.W. et al., 1998].

Целью настоящего исследования явилось получение тромбодефенсинов из крови сельскохозяйственных животных и изучение их биологических свойств.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить тромбоцитарный катионный белок из крови лошадей, круп-

ного рогатого скота, свиней, коз, собак и кур методом кислотной экстракции.

2. Изучить антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка

в отношении Bacillus subtillis № 83, как наиболее чувствительного к нему микроорганизма.

3. Определить антимикробный спеюгр действия тромбодефенсинов в от-

ношении разных видов условно-патогенных микроорганизмов.

4. Изучить влияние тромбодефенсинов на персистентные характеристи-

ки микроорганизмов - антилактоферриновую активность (АЛфА).

5. Оценить влияние тромбодефенсинов на способность микроорганизмов образовывать биопленки.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна работы. Выявлено наличие антимикробных веществ в тромбоцитах лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, коз. Впервые выделен антимикробный белок из тромбоцитов птицы (кур) и изучены его мик-робоцидные свойства.

При сравнительной оценке антимикробной активности тромбодефенсинов исследуемых видов животных в отношении В. subtilis показано, что наиболее эффективно его рост подавляли ТКБ свиней и крупного рогатого скота, средней антимикробной активностью характеризовались ТКБ лошадей и кур, низкой -ТКБ коз и собак.

Установлено, что тромбодефенсины сельскохозяйственных животных оказывают, преимущественно, ингибирующее влияние на антилактоферриновую активность микроорганизмов, наибольшей способностью снижать АЛфА обладал антимикробный белок кур.

Антимикробные пептиды из тромбоцитов сельскохозяйственных животных оказывают модифицирующее влияние на образование биоплёнок микроорганизмами, стимулируя биоплёнкообразование у бактерий и ингибируя данную способность у грибов.

Теоретическая новизна и практическая ценность исследования заключается в расширении представлений об антимикробном и антиперсистентном влиянии ТКБ, выделенных от разных видов сельскохозяйственных животных.

Полученные знания позволят отбирать наиболее эффективные тромбоде-фенсины, перспективные для создания новых средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенами.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах:

- Всероссийской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных» (Новочеркасск, 2008);

- Всероссийской конференции «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009);

- Международной научно-практической конференции «Состояние, перспективы экономико-технологического развития и экологически безопасного производства в АПК» (Оренбург, 2010);

- Международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010);

- III Российском форуме «Российским инновациям — Российский капитал» (Ижевск, 2010);

- Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых Минсельхоза России (диплом I степени, Краснодар, 2010);

- расширенном заседании кафедры микробиологии и кафедры незаразных болезней животных в ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» (Оренбург, 2010).

Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 6 печатных работах, из них 4 - в центральных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Антимикробная активность ТКБ определяется видом животного, являющегося источником тромбодефенсинов, и видовой принадлежностью бактерий, при этом наибольшую активность проявляют ТКБ кур.

2. Тромбодефенсины оказывают разнонаправленное влияние на биологические характеристики микроорганизмов: ингибируют АЛфА и оказывают модифицирующее влияние на биопленкообразование.

За содействие и помощь в освоении методик и проведении цикла экспериментов, запланированных по теме диссертации, выражаем благодарность:

доктору биологических наук, профессору О.Л. Карташовой;

кандидату биологических наук, доценту М.В. Сычевой.

Объем и структура диссертационной работы. Работа изложена на 101 странице компьютерной верстки, содержит 5 таблиц и 8 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений и списка используемой литературы. Список используемой литературы включает 205 наименований, в том числе 177 работ иностранных авторов.

Материалы и методы исследования

Исследования по определению антимикробных свойств тромбодефенси-нов разных видов животных проводились в период с 2007 по 2010 гг. на базе кафедр микробиологии и незаразных болезней животных ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет», а также в ЗАО имени Шевченко Ташлинского района Оренбургской области, птицефабрике «Оренбургская» Оренбургского района Оренбургской области, АО «Донское» Беляевско-го района Оренбургской области.

Исследования проводились в хозяйствах, достаточно удалённых от крупных промышленных комплексов, благополучных по инфекционным заболеваниям животных.

Объектами исследования были клинически здоровые животные хорошей упитанности: лошади - 15 голов, трех-четырех летнего возраста, серой масти; крупный рогатый скот - 15 голов, 5-7 летнего возраста, симментальской породы; куры - бройлеры на заключительном этапе откорма в количестве 2000 голов, козы - 4 головы, двухлетнего возраста, Оренбургской породы, свиньи - 4 головы, возраст 1 год, крупной белой породы, собаки - 25 голов, возраст 2-6 лет, беспородные.

Кровь у клинически здоровых лошадей, крупного рогатого скота, свиней и коз отбирали при убое животных на скотобойнях, у кур - при массовом убое, у собак - из подкожной вены бедра. Убой и взятие крови проводили с соблюдением санитарно-гигиенических правил в чистую пластиковую посуду. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия из расчета 1:10.

При убое крупных животных (лошади, крупный рогатый скот) кровь отбирали в количестве 7-9 литров от одного животного, у свиней, коз — 1,5-2 литра от одного животного, у кур сборную кровь в количестве 3-5 литров, у собак - 200 миллилитров от одного животного.

Автотранспортировку и выделение тромбоцитарной массы проводили в течение шести часов после получения крови.

Кислоторастворимые белки тромбоцитов сельскохозяйственных животных (лошади, куры, крупный рогатый скот, собаки, свиньи, козы) получали методом кислотной экстракции.

Содержание белка в полученных кислотных экстрактах определяли по методу М.М. Брэдфорда (1976) с использованием красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 (SIGMA, Германия).

Антимикробные свойства кислоторастворимых белков тромбоцитов оценивали in vitro чашечным методом в отношении грамположительного микроорганизма В. subtilis N° 83. Суточную агаровую культуру В. subtilis смывали стерильным физиологическим раствором, содержащим 0,1% раствор бычьего сывороточного альбумина (SIGMA, Германия), и готовили микробную взвесь с оптической плотностью 0,270 при длине волны 650 нм. Суспензию В. subtilis разбавляли в соотношении 1:1000 изотоническим раствором хлорида натрия с альбумином. Перед работой pH кислотного экстракта тромбоцитов доводили 0,1% раствором аммиака до 5,5-5,8.

Стерильно в изотоническом растворе хлорида натрия готовили разведения ТКБ: 0; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32. К 0,1 мл взвеси тестируемого штамма микроорганизма добавляли 0,9 мл разведения антимикробного препарата (в контрольные пробы вместо исследуемого препарата добавляли 0,9 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия).

Полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа, после чего высевали по 0,2 мл на питательный агар и инкубировали 24 часа при 37°С. После инкубации подсчитывали количество выросших колоний на опытных и контрольных чашках.

За минимальную бактерицидную концентрацию принимали концентрацию, подавляющую рост 50% колоний бактерий по сравнению с контролем. Активность препарата пересчитывали с учетом содержания количества белка в кислотном экстракте.

Спектр антимикробной активности кислоторастворимых белков тромбоцитов оценивали в отношении музейных культур: Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli K12, Klebsiella pneumoniae № 287, Enterobacter cloacae, Candida albicans по вышеописанной методике. Культивирование бактерий проводили на питательном агаре для культивирования микроорганизмов (ГРМ-агар) (ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск), грибы рода Candida культивировали на питательной среде № 2 ГРМ (Сабуро) (ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, г. Оболенск).

Влияние различных концентраций ТКБ на антилактоферриновую активность определяли на музейных культурах: Е. coli Kl2, Е. faecalis и С. albicans. Изучение регуляции АЛфА тромбодефенсинами осуществляли в два этапа. На первом этапе проводили выделение клонов путём рассева суточной культуры на плотную питательную среду в соответствии с указаниями Дж. Миллера (1976). Затем выбирали клон с наиболее высоким уровнем АЛфА. На втором этапе проводили изучение влияния разведений ТКБ на АЛфА микроорганизмов путём соинкубирования. Антилактоферриновую активность микроорганизмов определяли при помощи комплекса приборов для иммуноферментного анализа фирмы «STAT FAX», с использованием наборов для определения лактоферрина фирмы «Вектор-БЕСТ» «Лактоферрин-ИФА-БЕСТ» по методу Валышевой И.В. и др. (2003), признак выражали в нг/мл.

Оценку влияния кислотных экстрактов из тромбоцитов на способность к биоплёнкообразованию in vitro проводили в отношении музейных культур, способных образовывать биоплёнки: Е. cloacae (3 штамма), Е. agglomerans, S. aureus Р 209, К. pneumoniae № 278, С. albicans (3 штамма) по методу OToole G. (2005).

Полученные численные материалы были обработаны статистически с определением средних значений, среднего квадратического отклонения и средней ошибки средней. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента.

Сравнительная оценка антимикробной активности тромбоцитарного катионного белка сельскохозйственных животных в отношении Bacillus

subtilis

Тромбодефенсины, как и другие антимикробные белки, проявляют высокую активность против грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибов и некоторых оболочечных вирусов, и хотя исследования антимикробной активности КАМП животных проводятся уже более 40 лет, видовой состав изученных организмов незначителен по сравнению с общим числом известных видов и антимикробные свойства некоторых эндогенных антибиотических пептидов изучены еще недостаточно.

В данной работе нами были исследованы антимикробные свойства кисло-торастворимых белков тромбоцитов некоторых видов сельскохозяйственных животных in vitro в отношении грамположительного микроорганизма В. subtilis № 83, как наиболее чувствительной культуры [Сулейманов К.Г., 1998].

В ходе эксперимента было установлено, что антимикробным действием против тестируемого штамма обладали тромбодефенсины всех изучаемых видов животных, однако уровень их активности был различным (таблица 1).

Таблица 1

Антимикробная активность тромбодефенсинов _разных видов животных_

Вид животных Разведение кислотного экстракта тромбоцитов

Натив-ный препарат 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Контроль

Куры JS я я о ч о к о о Ö 4> 9 Я § 0±0 33±3,2 99±4,3 226±14,6 274±17,3 380±18,8 546±14,4

Лошади 4±0,58 59±2,6 38±5,7 113±11,6 245±14,8 с/р 509±28,7

Козы 141±22,3 208±15, 3 225±24,8 234±17,6 299±18,8 с/р 544±19,1

Собаки 99±14,6 195±22, 5 311±23,7 320±17,7 288±14,5 473±26,7 581±10,9

Свиньи 1±1,0 14±2,7 20±5,7 31±6,1 53±8,3 103±19,5 293±30,9

Кр. рог. скот 20±3,0 68±12,1 125±11,8 162±12,3 203±14,6 с/р 504±57,6

Примечание: с/р - сплошной рост микроорганизмов

Из приведённых данных видно, что самой высокой активностью в отношении В. зиЫШя обладал ТКБ свиней и крупного рогатого скота (за минимальную бактерицидную концентрацию антимикробного препарата принято разведение 1:32).

После соинкубирования с нативным препаратом ТКБ свиней был зафиксирован рост 1 КОЕ В. яиЫШз. При инкубировании исследуемого микроорганизма с разведениями ТКБ 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 наблюдалось постепенное увеличение количества выживших микроорганизмов в зависимости от степени разведения. В контроле отмечался рост 293 КОЕ В. быЫШз.

Количество выживших микроорганизмов В. мЫИи после соинкубирования с нативным препаратом тромбоцитарного катионного белка крупного рогатого скота составило 20 КОЕ. При соинкубировании изучаемого микроорганизма с тромбоцитарным катионным белком в разведениях 1:2; 1:4; 1:8, соот-

ветственно, зафиксирован рост 68, 125 и 162 КОЕ. За минимальную бактерицидную концентрацию, подавляющую рост 50% колоний В. яиЫШз, было принято разведение 1:32, следовательно активность препарата составила 32 ЕД.

Нативный препарат тромбоцигарного катионного белка кур полностью подавлял рост В. БиЬИШ. При инкубировании ТКБ с В. виЫШз в разведении 1:2 зафиксирован рост 33 КОЕ, а после инкубации с белком в разведении 1:4 отмечен рост 99 КОЕ В. зиЫШэ. Кислотный экстракт тромбоцитов кур в разведении 1:8 задерживал рост 58,6% колоний В. хиЫШя, а разведение ТКБ 1:16 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, следовательно антимикробная активность ТКБ кур в отношении изучаемого микроорганизма составила 16 ЕД.

Количество выживших микроорганизмов В. яиЫШа после соинкубирова-ния с нативным препаратом ТКБ лошадей составило 4 КОЕ, после соинкубиро-вания с разведением ТКБ 1:2 зафиксирован рост 59 КОЕ изучаемого микроорганизма; с разведением 1:4 - 38 КОЕ; с разведением 1:8 - 113 КОЕ. Разведение ТКБ 1:16 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, следовательно активность препарата составила 16 ЕД. Количество выживших микроорганизмов в контроле - 509 КОЕ.

После инкубации микроорганизма с нативным препаратом ТКБ коз отмечен рост 141 КОЕ, после соинкубирования с тромбодефенсинами в разведениях 1:2; 1:4; 1:8; 1:16 отмечалось постепенное увеличение количества выживших колоний в зависимости от степени разведения. Соинкубирование с ТКБ в разведении 1:2 привело к подавлению роста В. хмЫШб на 62%, 1:4 на 58,6%. Активность препарата составила 8 ЕД. После соинкубирования с разведением кислотного экстракта 1:16, полученного из тромбоцитов коз, отмечен рост 299 КОЕ, а при разведении 1:32 наблюдали сплошной рост, но количество колоний визуально было меньше, чем в контроле.

Нативный препарат тромбоцитарного катионного белка собак подавлял рост 83% КОЕ. Количество выживших микроорганизмов составило 99±14,64 микробных клеток. После соинкубирования с разведением ТКБ 1:2 количество выросших колоний было на 96 КОЕ больше, чем после инкубации культуры с нативным препаратом (р<0,01). После инкубации с разведением ТКБ 1:4 зафиксирован рост 311±23,71 КОЕ, что почти на 50% меньше, чем в контроле (р<0,05). Следовательно, активность тромбоцитарного катионного белка собак составила 4 единицы. При соинкубировании с ТКБ в разведении 1:8 отмечалось уменьшение количества колоний В. тЬНШ на 45% по сравнению с контролем (р<0,01). Количество колоний в пробах с последующими разведениями белка (1:16 и 1:32) практически не отличалось от контрольных значений.

Для вычисления минимальной бактерицидной концентрации тромбоде-фенсинов было определено количество общего белка в кислотном экстракте

антимикробных белков тромбоцитов; которое составило у кур составило 3,7 мг/мл, лошадей - 3,3 мг/мл, крупного рогатого скота - 3,1 мг/мл, свиней - 2,1 мг/мл, козы -1,8 мг/мл, собак - 4 мг/мл.

Таким образом, нами установлено наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах кур, лошадей, крупного рогатого скота, коз, свиней и собак. В сравнительном аспекте наиболее выраженным антимикробным действием обладали антимикробные катионные белки из тромбоцитов свиней и крупного рогатого скота - 32 ЕД, меньшей активностью обладали тромбодефенсины кур и лошадей - 16 ЕД. Показатели активности тромбоде-фенсинов коз (8 ЕД) занимали промежуточное положение между значениями активности тромбодефенсинов кур, лошадей и коз (4 ЕД). Наименьшей активностью по сравнению с другими видами животных обладали тромбодефенсины собак.

Изучение антимикробного спектра тромбоцитарного катнонного белка лошадей, крупного рогатого скота и кур

Определив наличие у ТКБ сельскохозяйственных животных антимикробной активности в отношении В. subtilis № 83, как наиболее чувствительной культуры, нами была предпринята попытка оценить в эксперименте антимикробное действие тромбодефенсинов крупного рогатого скота, лошадей и кур в отношении разнообразных представителей кокковых, палочковидных грампо-ложительных и грамотрицательных форм бактерий, а также грибов рода Candida.

Антимикробная активность ТКБ сельскохозяйственных животных представлена на рисунке 1, из которого следует, что высокий уровень антимикробной активности тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных выявлен в отношении спорообразующих грамположительных бактерий - В. cereus. Натив-ный препарат ТКБ кур подавлял рост 91,8% КОЕ В. cereus, лошадей - 87,1% КОЕ, крупного рогатого скота - 79,8% КОЕ. При увеличении кратности разведений препарата 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 наблюдалось постепенное увеличение количества выросших колоний В. cereus. Активность кислотного экстракта тромбодефенсинов в отношении B.cereus составила для кур - 32 ЕД, лошадей -16 ЕД, крупного рогатого скота - 8 ЕД, а минимальная бактерицидная концентрация варьировала от 0,10 для ТКБ птиц до 0,38 мг/мл для ТКБ крупного рогатого скота.

В. сет S. aureus Е. feecaüs М. futeus Е. coli Е. cloacae К. pneumoniae С. albicans

^к.р.с. Олошадь «курица

Рис.1. Антимикробная активность тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных (ЕД)

У тромбоцитарного катионного белка лошадей МБК бьша равной 0,20 мг/мл (рис. 2).

Число жизнеспособных клеток М. 1и1еш при обработке нативным кислотным экстрактом из тромбоцитов, полученных от разных видов животных, изменялось в следующих пределах - от 0 КОЕ у птиц до 4 КОЕ у лошадей. При обработке культуры М. Шеш кислотным экстрактом ТКБ крупного рогатого скота и кур в разведении 1:8 зафиксирован рост 245 и 226 КОЕ, соответственно, что почти на 50% меньше, чем в контроле (546 КОЕ). Следовательно, активность тромбоцитарного катионного белка кур и крупного рогатого скота в отношении изучаемого микроорганизма составила 8 единиц (МБК 0,38 мг/мл).

Минимальной бактерицидной концентрацией для тромбодефенсинов лошадей в отношении М. 1и1ет оказалось разведение 1:16, при инкубировании с данным разведением был зафиксирован рост 245 КОЕ, то есть в два раза меньше, чем в контроле (546 КОЕ). Таким образом, активность кислотного экстракта из тромбоцитов лошадей составила 16 ЕД, а МБК - 0,16 мг/мл.

В. cereus S. aureus E. fäecalls M. luleus E. coli E. cloacae К. pneumoniae С. albicans

а к.p.c. □ лошадь (курица!

Рис.2. Минимальная бактерицидная концентрация ТКБ разных видов животных

Достаточно высокой активностью обладали тромбодефенсины в отношении микроорганизма S. aureus. Нативный препарат из тромбоцитов лошадей и кур полностью подавлял рост данного микроорганизма, также как и разведение 1:2 кислотного экстракта из тромбоцитов лошадей. Активность препарата из тромбоцитов крупного рогатого скота в отношении S. aureus была равна 16 ЕД, что в пересчёте на белок составило 0,19 мг/мл.

При разведении ТКБ кур 1:8 зафиксирован рост 1320 КОЕ, что почти на 50% меньше, чем в контроле (р<0,05). Следовательно, активность тромбоци-тарного катионного белка кур составила 8 единиц, а минимальная бактерицидная концентрация - 0,38 мг/мл.

Самым активным в отношении S. aureus оказался ТКБ лошадей, активность препарата составила 32 единицы, а минимальная бактерицидная концентрация оказалась равной 0,1 мг/мл.

Высокая антимикробная активность тромбодефенсинов всех изучаемых видов животных отмечена и в отношении Е. fecaelis. Антимикробная активность тромбодефенсинов составила для кур и лошадей 16 ЕД, для крупного рогатого скота - 8 ЕД, а минимальная бактерицидная концентрация 0,23 мг/мл, 0,21мг/мл и 0,39 мг/мл, соответственно.

Антимикробная активность тромбодефенсинов исследуемых видов животных в отношении грамотрицательных микроорганизмов была несколько ниже. Так, нативный препарат тромбоцитарного катионного белка, полученный от лошадей и крупного рогатого скота, полностью подавлял рост Е. coli, в то время как кислотный экстракт тромбоцитов кур задерживал рост 99,2 % КОЕ. При дальнейшем разведении тромбодефенсинов всех изучаемых видов животных отмечалось постепенное увеличение числа выросших колоний. Разведение ТКБ лошадей 1:8 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, подавляющей рост 50% колоний Е. coli (8 ЕД). Активность ТКБ для кур и крупного рогатого скота составила 6 ЕД. Минимальная бактерицидная концентрация в отношении Е. coli для ТКБ лошадей равна 0,28 мг/мл и 0,51 мг/мл для тромбодефенсинов крупного рогатого скота и птицы.

Активность тромбоцитарного белка лошадей и крупного рогатого скота в отношении К. pneumoniae N° 278 составила 8 ЕД, а МБК - 0,28 мг/мл для ТКБ лошадей, для ТКБ крупного рогатого скота - 0,38 мг/мл. Разведение ТКБ птиц 1:16 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, подавляющей рост 50% К. pneumoniae (16 ЕД), а минимальная бактерицидная концентрация составила 0,23 мг/мл.

Антимикробное действие тромбодефенсинов изучаемых видов животных в отношении Е. cloacae зависело от вида животного, от которого белок был выделен, причем наибольшая активность отмечалась у тромбодефенсинов кур, а наименьшая - у крупного рогатого скота. Активность тромбодефенсинов лошадей была ровна 16 ЕД, что в пересчёте на белок составило 0,21 мг/мл. Разведение ТКБ кур 1:32 оказалось минимальной концентрацией, подавляющей рост 50% Е. cloacae, активность препарата составила 32 ЕД, а МБК 0,12 мг/мл. МБК препарата из тромбоцитов крупного рогатого скота составила 0,52 мг/мл.

Антимикотическое действие ТКБ в отношении дрожжеподобного гриба С. albicans имело следующие особенности. Разведение ТКБ крупного рогатого скота и кур 1:4 оказалось минимальной бактерицидной концентрацией, ингиби-рующей рост 50% С. albicans. При этом минимальная бактерицидная концентрация варьировала от 0,13 мг/мл для тромбодефенсинов лошадей до 0,76 мг/мл для ТКБ крупного рогатого скота и кур. Антимикотическая активность кислотного экстракта из тромбоцитов лошадей составила две единицы.

Таким образом, ТКБ разных видов животных обладает высокой антимикробной активностью в отношении спорообразующих грамположительных бактерий, в меньшей степени - против исследованных кокков, энтеробактерий и грибов С. albicans. Наиболее высокий уровень антимикробной активности отмечен у тромбодефенсинов из кислотного экстракта тромбоцитов птиц и лошадей.

Влияние тромбодефенсинов на антилактоферриновую активность микроорганизмов

В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, в том числе и лактоферрин, что обеспечивает длительное переживание инфекционного агента в макроорганизме. Поэтому изыскание биологически активных веществ (к их числу относятся и тромбодефенсины), ингибирующих персистентный потенциал патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, является актуальным.

При анализе полученных результатов была выявлена высокая исходная гетерогенность популяции Е. coli Kl 2, E.faecalis и С. albicans по АЛфА, с разбросом значений для Е. coli от 124,5 до 277,2 нг/мл, для Е. faecalis от 40,83 до 129,2 нг/мл и для С. albicans от 60 до 269,1 нг/мл, при среднем уровне признака 181,3±13,75, 88,8±14,31 и 177,9±21,59 нг/мл, соответственно.

Изучение влияния препаратов ТКБ на АЛфА Е. coli показало снижение способности данного микроорганизма к инактивации лактоферрина (рис. 3).

□ МПК ■ 1ИМПК

Разведения ТКБ

Примечание: *- достоверность различий значений АЛфА в контроле и после соинкубирования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,05); **-(р<0,01)

Рис.3. Изменение АЛфА Е. coli под воздействием разведений кислотного экстракта из тромбоцитов

Максимальное подавление признака выявлено при культивировании бактерий с тромбоцитарным катионным белком лошадей и крупного рогатого скота в минимальной подавляющей концентрации, при этом АЛфА составила 32,4±11,56 и 37,3±18,72 нг/мл, соответственно, против 111,3±5,58 нг/мл в контроле (р<0,01). Культивирование Е. coli в присутствии ТКБ птицы в МПК сопровождалось достоверным снижением АЛфА в 2,08 раза по сравнению с кон-

тролем (р<0,05). В меньшей степени рассматриваемый признак изменялся при культивировании бактерий с ТКБ сельскохозяйственных животных в разведении 'А МПК. АЛфА Е. coli после культивирования с ТКБ лошадей в этом разведении снижалась на 55,3% (р<0,05); птиц - на 31,2% (р<0,05); крупного рогатого скота - на 44,0% (р<0,01).

Нами отмечено, что с уменьшением концентрации ТКБ выявлено нарастание способности R coli ингибировать лактоферрин.

При изучении влияния кислотных экстрактов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на АЛфА Е. faecalis было выявлено снижение уровня признака (рис. 4), при этом максимальное подавление способности инакгивиро-вать лактоферрин отмечено в результате культивирования бактерий с тромбо-дефенсинами лошадей и птиц, после которого антилактоферриновая активность перестала определяться (р<0,001).

Контроль ТКБ лошади ТКБ птицы ТКБ к.р.с.

□ МПК и V. МПК

Разведения ТКБ

Примечание: **- достоверность различий значений АЛфА в контроле и после соинкубирования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,01); ***-(р<0,001)

Рис.4. Изменение АЛфА Е. faecalis под воздействием разведений кислотного экстракта из тромбоцитов

В меньшей степени АЛфА Е. faecalis изменялась под влиянием ТКБ крупного рогатого скота. При сокультивировании бактерий с тромбодефенсинами в МПК изучаемый признак снижался в 1,9 раз (р<0,01), а в 1/4 МПК - в 1,5 раза.

Модификация антилактоферриновой активности С. albicans под влиянием испытуемых разведений препаратов из тромбоцитов животных представлена на рисунке 5.

Кислотный экстракт тромбоцитов сельскохозяйственных животных оказывал преимущественно ингибирующее влияние на АЛфА грибов С. albicans.

Так, тромбоцитарный катионный белок птицы в изучаемых разведениях оказывал ингибирующее действие на АЛфА С. albicans. Кислотный экстракт тромбо-цитарного катионного белка лошадей в 1/4 минимальной подавляющей концентрации приводил к снижению АЛфА на 24,3%, а то же разведение ТКБ крупного рогатого скота на 100%. Однако в 33,3% случаев отмечено повышение изучаемого свойства, в частности при культивировании с тромбодефенсинами лошадей и крупного рогатого скота в МПК.

Контроль ТКБ лошади ТКБ птицы ТКБ к.р.с

□ МПК ■ 1/4МПК

Рис.5. Изменение АЛфА С. albicans под воздействием разведений кислотного экстракта из тромбоцитов

Изменения значений антилактоферриновой активности С. albicans были в пределах ошибки средней арифметической, а поэтому различия между величинами оказались недостоверными.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о модифицирующем влиянии тромбодефенсинов на АЛфА микроорганизмов. Статистически значимое снижение уровня изучаемого признака у Е. coli и Е. faecalis под действием ТКБ выявлено в 100% случаев. В 66,7% случаев ТКБ сельскохозяйственных животных ингибировал способность С. albicans инактивировать лак-тоферрин.

Наибольшей способностью снижать АЛфА изученных микроорганизмов обладал антимикробный белок тромбоцитов кур, так как его ингибирующая способность отмечалась во всех разведениях и в отношении всех изучаемых по данному признаку микроорганизмов.

тарным белком, доказанное в работах К.Г. Сулейманова (1997), приведёт к снижению персистентного потенциала бактерий.

Влияние тромбодефенсинов на способность микроорганизмов к образованию биопленок

На основании проведённых исследований выявлено разнонаправленное влияние тромбодефенсинов на способность микроорганизмов к образованию биоплёнок (таблица 2).

Таблица 2

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на спо-

Микроорганизмы Показатель образования биоплёнок S^x

контроль МПК 1/4МПК

Е. cloacael247 ТКБ лошадей 1,33±0,013 1,44±0,041* 1,63±0,039*"

Е. cloacael236 1,31±0,017 1,67±0,019"' 1,72±0,049"*

Е. cloacael479 1,97±0,046 1,86±0,074 1,92±0,022

Е. agglomérons 1,63±0,024 1,68±0,029 1,79±0,020"

S. aureus 1,2±0,08 1,11±0,027 1,14±0,043

К. pneumoniae 1,13±0,008 1,12±0,046 1,15±0,009

Е. cloacael247 £ <Ь о S я ° с о >» Ь к 1,53±0,017 1,65±0,025" 1,86±0,008***

Е. cloacaeI236 1,27±0,02 1,28±0,01 1,29±0,017

Е. cloacae 1479 1,59±0,036 1,6±0,059 1,45±0,031

Е. agglomerans Ч Ö 2 с ° Н о. 1,64±0,058 1,63±0,03 1,67±0,031

S. aureus 1,34±0,082 1,17±0,013 1,27±0,072

К. pneumoniae 1,32±0,035 1,47±0,025* 1,81±0,029'"

Е. cloacael247 ТКБ кур 1,10±0,01 1,31±0,018" 1,28±0,014*"

Е. cloacael236 1,10±0,016 1,23±0,009" 1,19±0,014*

Е. cloacae 1479 1,25±0,012 1,33±0,012 1,35±0,019

Е. agglomerans 1,39±0,051 1,54±0,052" 1,57±0,062"

S. aureus 1,04±0,026 1,12±0,044 1,1±0,017

К. pneumoniae 1,22±0,026 1,21 ±0,028 1,41±0,03"

Примечание: * - достоверность различий показателя биоплёнкообразова-ния в контроле и после соинкубирования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,05); ** - (р<0,01); *** - (р<0,001).

Установлено, что изменение свойств микроорганизмов зависело от вида бактерий и происхождения тромбодефенсинов. Так, под влиянием ТКБ лошадей отмечалось увеличение интенсивности плёнкообразования (ПО) у 80% эн-теробактерий: на 1,8% у К. pneumoniae, в среднем на 27%у Е. cioacae (р<0,001) и на 9,8% у Е. agglomérons (р<0,01) от исходного уровня признака

Под действием тромбодефенсинов лошадей отмечалось снижение способности образовывать биоплёнки у S. aureus и одного штамма Е. cloacae, однако уменьшение коэффициента биоплёнкообразования было в пределах ошибки средней арифметической, а потому различия между величинами были недостоверными.

При воздействии тромбоцитарного катионного белка, полученного из тромбоцитов крупного рогатого скота, в большинстве случаев отмечался стимулирующий эффект в отношении плёнкообразующей способности изучаемых микроорганизмов. Способность формировать биоплёнки увеличивалась в среднем на 11,6% у Е. cloacae, на 37,1% у К. pneumoniae (р<0,05), и на 1,8% у Е. agglomerans. Выявлен ингибирующий эффект в отношении плёнкообразущей способности S. aureus и одного штамма Е. cloacae, однако в обоих случаях изменения носили недостоверный характер, т.е. бьши на уровне тенденций.

Как показали наши исследования, антимикробные пептиды из тромбоцитов кур оказывали наибольший стимулирующий эффект на способность микроорганизмов к формированию биоплёнок. Усиление биоплёнкообразования было отмечено в 100% случаев, причём у Е. cloacae коэффициент ПО достоверно увеличился в среднем на 12,2%, у Е. agglomerans - на 13% (р<0,01), у К. pneumoniae - на 15,6% (р<0,01) и у 5. aureus - на 5,8% от исходного уровня признака.

Особый интерес представляют данные о дозозависимом эффекте влияния тромбоцитарного катионного белка на способность микроорганизмов формировать биоплёнки. Как показали наши исследования, независимо от природы тромбодефенсинов наибольший стимулирующий эффект в отношении плёнкообразующей способности микроорганизмов наблюдался при соинкубировании бактерий с тромбодефенсинами в концентрации, соответствующей 1:4 МПК, то есть с уменьшением концентрации ТКБ отмечено повышение способности бактерий формировать биоплёнки.

Как видно из представленных результатов, наибольший стимулирующий эффект на пленкообразующую функцию микроорганизмов характерен для ТКБ птиц (усиление ПО в 100% случаев), меньшей активностью обладали трободе-фенсины лошадей, которые стимулировали пленкообразование в 80% случаев. Кислотный экстракт, полученный из тромбоцитов крупного рогатого скота, в 66,7% случаев способствовал увеличению способности микроорганизмов формировать биоплёнки.

Возможно, под воздействием антимикробных пептидов из тромбоцитов in vitro большая часть микробной популяции гибнет, а сохранившие жизнеспособность клетки-персистеры, присутствующие в бактериальной популяции до

её контакта с тромбодефенсинами, обеспечивают более активное формирование биоплёнок.

О влиянии тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на способность грибов С. albicans формировать биоплёнки, обеспечивающие входящим в их состав клеткам защиту от факторов резистентности хозяина и устойчивость к действию антибактериальных препаратов, можно судить по коэффициентам биоплёнкообразования, которые приведены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на спо-

собность грибов Candida albicans к образованию биоплёнок

Микроорга- Показатель образования биоплёнок S^kx

низмы ТКБ контроль МПК 1/4МПК

С. albicans 446 « 0> 1,19±0,042 1,33±0,107 1,29±0,020

С. albicans 447 S а 1,33±0,044 1,04±0,103 0,98±0,087*

С. albicans 275 о ц 1,03±0,021 0,85±0,081 0,84±0,071

С. albicans 446 § 2 Г, 1,19±0,042 1,01±0,044* 1,46±0,104

С. albicans 447 111 1,33±0,044 1,03±0,033** 0,98±0,065*

С. albicans 275 1,03±0,021 0,88±0,030* 1,26±0,012***

С. albicans 446 1,19±0,042 1,14±0,079 1,20±0,059

С. albicans 447 о. 1,33±0,044 0,83±0,07** 1,01±0,110

С. albicans 275 1,03±0,021 0,71±0,054** 0,83±0,40*

Примечание: * - достоверность различий показателя биоплёнкообразования в контроле и после соинкубирования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,05); ** - (р<0,01); *** - (р<0,001).

Из данных таблицы следует, что тромбодефенсины сельскохозяйственных животных оказывают преимущественно ингибирующее влияние на способность грибов С. albicans формировать биоплёнки.

Снижение биоплёнкообразования у грибов после соинкубирования с антимикробными белками из тромбоцитов крупного рогатого скота и кур выявлено в 83,3%; антимикробные белки из тромбоцитов лошадей уменьшали способность микроорганизмов образовывать биоплёнки в 66,7% случаев.

Изменение свойств С. albicans зависело от происхождения тромбодефенсинов. Как показали наши исследования, наибольший ингибирующий эффект в

отношении плёнкообразующей способности грибов наблюдался при соинкуби-ровании бактерий с тромбодефенсинами кур.

Так, под влиянием минимальной подавляющей коцентрации и V* МПК тромбодефенсинов кур средние значения биопленкообразования у С. albicans 447 уменьшались на 37,5% (р<0,01) и 24%, соответственно, а у С. albicans 275 на 31,1% (р<0,01) и 19,4% (р<0,05) от исходного уровня признака.

Коэффициент биопленкообразования у грибов под действием тромбодефенсинов лошадей и крупного рогатого скота уменьшался в среднем на 21% и 19,5%, соответственно. Ингибирование способности грибов С. albicans формировать биоплёнки не зависело от концентрации ТКБ животных.

Увеличение коэффициента биопленкообразования у С. albicans 446 под действием ТКБ лошадей и кур было в пределах ошибки средней арифметической, а потому различия между величинами были недостоверными.

Как видно из представленных результатов, антимикробные пептиды из тромбоцитов сельскохозяйственных животных оказывают модифицирующее влияние на образование биоплёнок микроорганизмами, стимулируя биоплёнко-образование у бактерий и ингибируя изучаемый признак у грибов.

Поскольку известно, что биоплёнки - многофакторный феномен, то вероятно ТД действуют на различные этапы их развития по нескольким механизмам, приводя к различным эффектам у бактерий и грибов.

Подводя итог проделанной работе, следует отметить: во-первых, в тромбоцитах сельскохозяйственных животных имеются антибиотические вещества, обладающие широким спектром антимикробного действия. Во-вторых, тром-боцитарные катионные белки способны изменять биологические свойства микроорганизмов, определяющие их взаимодействие с макроорганизмом.

ВЫВОДЫ

1. Установлено наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах лошадей, крупного рогатого скота, коз, свиней, собак. Впервые обнаружены антимикробные пептиды в тромбоцитах кур.

2. Тромбодефенсины всех исследуемых видов животных обладали высокой антимикробной активностью в отношении В. subtilis, являющейся тест-культурой, при этом антимикробный эффект ТКБ нарастал в ряду: собаки (4 ЕД) < козы (8 ЕД) < лошади, куры (16 ЕД) < крупный рогатый скот, свиньи (32 ЕД).

3. Установлено, что тромбодефенсины сельскохозяйственных животных обладают широким спектром действия в отношении грамположительных, грамотрицательных форм бактерий и Candida albicans, при этом

наибольшую активность проявляет тромбоцитарный катионный белок кур и лошадей, меньшую - ТКБ крупного рогатого скота.

4. Тромбодефенсины влияют на факторы персистенции микроорганизмов, снижая антилактоферриновую активность у Е. coli и Е. faecalis в 100 %, а у С. albicans в 66,7 % случаев. Максимальное подавление способности микроорганизмов инактивировать лактоферрин выявлено при их культивировании с тромбоцитарными катионными белками лошадей и птицы.

5. Антимикробные пептиды из тромбоцитов сельскохозяйственных животных оказывают модифицирующее влияние на биопленкообразование микроорганизмов, стимулируя формирование пленок у бактерий и ингибируя у грибов С. albicans.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Тромбодефенсины могут быть использованы для лечения и профилактики в ветеринарии и медицине инфекционно-воспалительных заболеваний, санации бактерионосителей, коррекции дисбиозов различной этиологии (в составе фармацевтических композиций вместе с пробиотиками).

2. В качестве дополнения или замены антибиотиков микробного происхождения.

3. Результаты исследования могут быть использованы:

- в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий

на ветеринарном и медицинском факультетах высших учебных заведений;

- лабораториях, НИИ;

- при написании соответствующих разделов учебников, учебных пособий и

рекомендаций.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жуков, А.П. Сравнительная оценка антимикробной активности ТКБ разных видов животных / А.П. Жуков, О.Л. Карташова, М.В. Сычёва, Е.В. Лу-кашова (Шейда) // Материалы Всероссийской научно-практической конференция «Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных». Новочеркасск: Изд-во «ЦВВР». - 2008. - С. 170 - 172.

2. Сычёва, М.В. Антимикробная активность тромбоцитарного катионного белка собак / М.В. Сычёва, Е.В. Шейда, А.П. Жуков, О.Л. Карташова // Сборник научных работ Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки». 22 апреля 2009 г. Ярославль: Тезисы докладов. - Ярославль: Изд-во ООО «ЯрМедиаГруп», 2009. - С. 77.

3. Сычёва, М.В. Антимикробная активность тромбодефенсинов разных видов животных / М.В. Сычёва, Е.В. Шейда, А.П. Жуков, ОЛ. Карташова U Известия ОГАУ. - 2009. - №4 (24). - С. 177-179.

4. Сычёва, М.В. Антибактериальный спектр тромбодефенсинов некоторых видов животных / М.В. Сычёва, Е.В. Шейда, А.П. Жуков, ОЛ. Карташова // Аграрный вестник Урала. - 2010. - №7(73). - С. 50-51.

5. Сычёва, М.В. Влияние тромбодефенсинов некоторых видов животных на антилактоферриновую активность микроорганизмов / М.В. Сычёва, Е.В. Шейда, ОЛ. Карташова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. - Казань, 2010. - С.256-259.

6. Сычева, М.В. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биопленок / М.В. Сычева, Е.В. Шейда, ОЛ. Карташова, И.В. Ва-лышева // Известия КрасГАУ. - 2011. -№1 - С. 15-17.

Шейда Елена Владимировна

АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА ТРОМБОЦИТАРНОГО КАТИ-ОННОГО БЕЛКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003 Подписано в печать 12.И.2010. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шейда, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ, ИХ СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ (обзор литературы).

1.1 Антимикробные пептиды: структурное многообразие и механизм действия.

1.2 Функциональные свойства КАМП.

1.3 Антимикробный белок тромбоцитов.

1.4 Практическое применение антимикробных пептидов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТАРНОГО КАТИОННОГО

БЕЛКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ В

ОТНОШЕНИИ BACILLUS SUBTILIS.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОГО СПЕКТРА ТРОМБОЦИТАРНОГО КАТИОННОГО БЕЛКА ЛОШАДЕЙ, КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

И КУР.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ НА АНТИЛАКТОФЕРРИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ

МИКРООРГАНИЗМОВ.

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ НА СПОСОБНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ К ОБРАЗОВАНИЮ

БИОПЛЕНОК.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных"

Рост инфекций, вызванных антибиотико-устойчивыми микроорганизмами, диктует необходимость поиска новых микробоцидных средств. Используемые в качестве бактерицидных препаратов антибиотики обладают токсичным действием на органы и системы организма человека и животных, способствуют развитию дисбактериозов. Кроме того, у большинства микроорганизмов к ним быстро формируется устойчивость [1]. Поэтому вопрос об изыскании новых эффективных антимикробных средств остается весьма актуальным.

В настоящее время за рубежом привлекательной альтернативой антибиотикотерапии считают терапию, основанную на применении катионных антимикробных пептидов (КАМП)[84, 88, 141, 146, 195]. Среди них особое место занимают низкомолекулярные белки (пептиды) с выраженными катионными свойствами, к которым относятся и тромбодефенсины (тромбоцитарные катионные белки) — пептиды, локализованные в альфа-гранулах тромбоцитов, высвобождающиеся из них при повреждении тканей [152] и обладающие антибактериальной, антимикотической и антивирусной активностями [120]. Биологическая активность этих молекул не ограничивается их бактерицидной функцией, а проявляется вовлечением пептидов в широкий круг защитно-приспособительных реакций [8]. Перспективным источником тромбодефенсинов являются тромбоциты сельскохозяйственных животных. Вместе с тем, имеются лишь единичные, порой противоречивые сведения о наличии тромбодефенсинов у сельскохозяйственных животных и их антимикробной активности.

В настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, что обеспечивает длительное переживание инфекционного агента в макроорганизме [4]. Поэтому изыскание биологически активных веществ, ингибируюгцих персистентный потенциал патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, является актуальным. Однако до настоящего времени малоизученным остаётся вопрос о влиянии тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на персистентные свойства бактерий, отсутствует информация о влиянии тромбодефенсинов на способность микроорганизмов к пленкообразованию. Изучение данного вопроса представляется интересным и с точки зрения использования ТКБ в будущем как антимикробных препаратов. Аналитиками делается вывод, что в силу относительной дешевизны, отсутствия побочных эффектов и минимальной вероятности формирования резистентности у бактерий к этим препаратам, КАМП в 21 веке займут подавляющий сегмент мирового рынка антимикробных препаратов [101].

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Получить тромбоцитарный катионный белок (ТКБ) из крови лошадей, крупного рогатого скота, свиней, коз, собак и кур методом кислотной экстракции.

2. Изучить антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка в отношении Bacillus subtillis № 83, как наиболее чувствительного к нему микроорганизма.

3. Определить антимикробный спектр действия тромбодефенсинов в отношении разных видов условно-патогенных микроорганизмов.

4. Изучить влияние тромбодефенсинов на персистентные характеристики микроорганизмов - антилактоферриновую активность (АЛфА).

5. Оценить влияние тромбодефенсинов на способность микроорганизмов образовывать биопленки.

Научная новизна работы. Выявлено наличие антимикробных веществ в тромбоцитах лошадей, крупного рогатого скота, свиньи, собаки, козы. Впервые выделен антимикробный белок из тромбоцитов птицы (кур) и изучены его микробоцидные свойства.

При сравнительной оценке антимикробной активности тромбодефенсинов исследуемых видов животных в отношении В. эиЫШБ установлено, что наиболее эффективно его рост подавляли ТКБ свиней и крупного рогатого скота, средней антимикробной активностью характеризовались ТКБ лошадей и кур, низкой - ТКБ коз и собак.

Практическая ценность исследования заключается в расширении представлений об антимикробном и антиперсистентном влиянии ТКБ, выделенных от разных видов сельскохозяйственных животных.

Полученные знания позволят отбирать наиболее эффективные тромбодефенсины, перспективные для создания новых средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенами.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах:

- Всероссийской конференции «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009);

Международной научно-практической конференции «Кадровое и научное обеспечение инновационного развития отрасли животноводства» (Казань, 2010);

- III Российском форуме «Российским инновациям - Российский капитал» (Ижевск, 2010);

Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в 5 печатных работах, из них 3 - в центральных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. I

Научные положения, выносимые на защиту:

За содействие и помощь в освоении методик и проведении цикла экспериментов, запланированных по теме диссертации, выражаем благодарность: доктору биологических наук, профессору О.Л. Карташовой; кандидату биологических наук, доценту М.В. Сычевой.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Шейда, Елена Владимировна

3. Результаты исследования могут быть использованы:

- в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на ветеринарном и медицинском факультетах высших учебных заведений;

- лабораториях, НИИ;

- при написании соответствующих разделов учебников, учебных пособий и рекомендаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микроорганизмы представляют собой постоянную угрозу для всех многоклеточных организмов, которые сохраняют способность к самоподдержанию и самовоспроизводству лишь потому, что могут противостоять агрессивному потенциалу окружающей их микробной флоры. Необходимым условием эволюции всего живого являлось развитие защитных механизмов, то есть способности противостоять инфекциям — иммунитета.

Одним из компонентов системы врождённого иммунитета организма, без которого невозможно выживание в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами, являются противомикробные пептиды [17]. Обладая антимикробной активностью, эти соединения характеризуются относительно низкой токсичностью по отношению к собственным клеткам макроорганизма, что позволяет их рассматривать в будущем в качестве дополнения и замены конвенциальным антибиотикам микробного происхождения [120]. Среди них особое место занимают низкомолекулярные белки (пептиды) с выраженными катионными свойствами, к которым относятся и тромбодефенсины - пептиды, локализованные в альфа-гранулах тромбоцитов, высвобождающиеся из них при повреждении тканей и обладающие антибактериальной, антимикотической и антивирусной активностью [152].

Однако анализ литературных данных показал, что имеются лишь единичные, порой противоречивые сведения о наличии тромбодефенсинов у сельскохозяйственных животных, их антимикробной активности. Малоизученной остаётся проблема влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на персистентные свойства бактерий и способность формировать биоплёнки. Это и определило цель нашего исследования, задачи которой изложены во введении.

В результате проведенных исследований были выделены тромбодефенсины из тромбоцитов сельскохозяйственных животных -лошадей, крупного рогатого скота, свиней, коз, собак и кур. Впервые было обнаружено наличие антимикробных пептидов в тромбоцитах кур.

Тромбодефенсины всех исследуемых животных обладали высоким уровнем антимикробной активности в отношении различных представителей грамположительных и грамотрицательных форм бактерий и грибов. Однако необходимо отметить зависимость уровня активности от видовой принадлежности животных. ТКБ всех животных наибольшую активность проявляли в отношении грамположительных спорообразующих микроорганизмов В. зыЫШб и В. сегет. Активность в отношении грамотрицательных микроорганизмов, энтеробактерий и грибов была значительно ниже. Полученные нами данные согласуются с исследованиями ряда авторов, указывающих на тот факт, что к действию тромбоцитарного катионного белка наиболее чувствительны грамположительные микроорганизмы [117, 132]. Не исключено, что подобный эффект связан с различием качественного и количественного состава фосфолипидов биомембран различных бактерий, что влияет на реализацию тропности и бактерицидной активности ТКБ.

Наиболее высокий уровень антимикробной активности был отмечен у ТКБ кур.

На следующем этапе исследования изучено регулирующее влияние тромбоцитарного катионного белка на факторы персистенции микроорганизмов, в частности на антилактоферриновую активность, поскольку известно, что микроорганизмы способны ингибировать многие факторы естественной резистентности организма хозяина, в том числе и лактоферрин, что способствует длительному переживанию инфекционного агента в организме.

В ходе аналитической работы с полученными данными было установлено модифицирующее влияние ТКБ на АЛфА Е. coli и С. albicans. В частности, отмечено ингибирующее влияние тромбодефенсинов на способность бактерий инактивировать лактоферрин. Наибольшее ингибирующее воздействие на факторы персистенции микроорганизмов выявлено под влиянием антимикробных пептидов, выделенных из тромбоцитов лошадей и крупного рогатого скота, чуть меньшей активностью обладал ТКБ кур.

Полученные результаты согласуются с опубликованными ранее данными в отношении влияния тромбоцитарного катионного белка на факторы персистенции - антилизоцимную активность [22]. Выраженность изменений признака АЛфА была неоднозначной у микроорганизмов каждого вида. Исследования показали, что действие ТКБ на антилактоферриновую активность может быть ингибирующим, как для Е. coli, либо разнонаправленным, как для С. albicans. Следовательно, действие антимикробных пептидов из тромбоцитов животных зависит от действующей концентрации и видовой принадлежности микроорганизмов.

Уместно предположить, что поскольку бактериальная пероксидаза способна вызывать деструктивную окислительную трансформацию жизненно значимых соединений, в том числе белков [65], то блокирование фермента тромбоцитарным белком, доказанное в работах К.Г. Сулейманова (1997), приведёт к снижению персистентного потенциала бактерий.

Для защиты от факторов иммунной системы организма хозяина, фагоцитоза, а также от воздействий окружающей среды и действия антибиотиков микроорганизмы способны формировать своеобразные сообщества - биопленки. Биопленки - это непрерывный слой бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности и друг к другу и заключенных в биополимерный мат-рикс. Микроорганизмы, ассоциированные с биопленками, более устойчивы к антибиотикам и дезинфектантам, и имеют большое клиническое значение.

Поскольку в настоящее время идет активный поиск новых эффективных средств, которые смогут снизить патогенный потенциал микробных биопленок, нами был рассмотрен вопрос о влиянии тромбодефенсинов на способность микроорганизмов образовывать биопленки.

На основании полученных в нашей работе данных установлено модифицирующее влияние тромбодефенсинов на биоплёнкообразование микроорганизмами. Антимикробные пептиды из тромбоцитов сельскохозяйственных животных оказывали, преимущественно, ингибирующее влияние на способность грибов формировать биоплёнки.

Вместе с тем, нами были получены результаты, свидетельствующие о стимулирующем влиянии тромбодефенсинов на формирование биоплёнок у бактерий. Так, ТКБ кур усиливали эту способность в 100% случаев, а кислотный экстракт тромбоцитов лошадей и крупного рогатого скота у 66,7% изученных штаммов.

Полученные факты согласуются с данными М. Lyte et al. (2003), которые указывают на существенное увеличение роста микроорганизмов и образование биоплёнки S. epidermidis под действием катехоламинов. При этом способность катехоламинов активировать образование биоплёнки имела дозозависимый эффект [130]. Стимулирующее влияние на формирование биоплёнок у 61-66% культур грибов С. albicans оказывал полиоксидоний [9].

Снижение биоплёнкообразования у грибов С. albicans после соинкуби-рования с антимикробными белками из тромбоцитов крупного рогатого скота и кур выявлено в 83,3% случаев, лошадей - в 66,7% случаев. Аналогичные результаты были получены группой итальянских учёных, которые установили, что инкубация С. albicans с тимолом приводила к значительному уменьшению размера и структуры зрелых биопленок, подавляя метаболическую активность фиксированных клеток зрелой биопленки С. albicans более чем на 90% [25]. Имеются данные, что циклоферон также оказывает преимущественно ингибирующее действие на образование биопленок грибами родов Candida и Rhodotorula в 94,4% [9]. Известно, что уменьшение биоплён-кообразования может быть связано с влиянием препаратов на механизмы первоначальной адгезии микроорганизмов к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, а также нарушение межклеточного обмена информацией. Исходя из вышеперечисленного, уместно предположить, что механизмы активности тромбодефенсинов против биопленок могут быть связаны с нарушением адгезии грибов к поверхности, за счёт изменения экспрессии детерминант адгезии вследствие адсорбции мембрано-тропного катионного белка.

Обнаруженное действие тромбодефенсинов на биоплёнки грибов может быть использовано при создании антимикотических препаратов, способных также противостоять формированию биоплёнок.

Полученные нами данные представляются верными, поскольку известно, что биоплёнки - многофакторный феномен, то вероятно, ТКБ действуют на различные этапы их развития по нескольким механизмам, приводя к различным эффектам у бактерий и грибов.

Все вышеуказанные свойства тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных создают предпосылки для создания в будущем на их основе новых препаратов для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.

Таким образом, полученные результаты расширяют представления о биологических свойствах антимикробных белков из тромбоцитов, механизмах их антимикробного действия и роли в защите организма. В результате изложенного нами материала, тромбодефенсины сельскохозяйственных животных следует рассматривать как высокоактивные биологические регуляторы с бактерицидной функцией.

Оценивая материал в целом, следует выделить основные моменты: во-первых, в тромбоцитах сельскохозяйственных животных имеются антибиотические вещества, обладающие широким спектром антимикробного действия. Во-вторых, тромбоцитарные катионные белки способны изменять биологические свойства микроорганизмов, определяющие их взаимодействие с макроорганизмом. Изучение функциональных свойств антимикробных белков из тромбоцитов сельскохозяйственных животных перспективно как с теоретической, так и с практической точек зрения.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Шейда, Елена Владимировна, Оренбург

1. Апчел, A.B. Изучение антимикробной активности пептидов в отношении антибиотикорезистентных микроорганизмов: тез. науч. практ. конф. / A.B. Апчел, О.В. Попова, A.B. Румянцева -С.Петербург, 2008. С. 15-16.

2. Бритвина, Е.И. Факторы естественного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: бета-лизины и лизоцим в секретах и тканях организма человека / Е.И. Бритвина. -Омск, 1976. -В.4. С. 92-93.

3. Бухарин, О.В. Природа и биологическая роль тромбоцитарного катионного белка / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Успехи современной биологии. 1997. - № 3. - С. 10-15.

4. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий: монография. -Екатеринбург: УРО РАН, 1999. 370 с.

5. Бухарин, О.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и экспериментальной медицине: монография / О.В. Бухарин, Н.В. Васильев. Томск: ТГУ, 1977. - 174 с.

6. Бухарин, О.В. Биологические характеристики тромбоцитарного катионного белка — бета-лизина / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Вопросы мед. химии. 1997. - № 3. - С. 45 - 47.

7. Бухарин, О.В. Роль тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) — бета-лизина в противоинфекционной защите / О.В. Бухарин, К.Г. Сулейманов // Ж. микроб., эпидем. и иммунологии. 1997. - №1. - С. 37.

8. Бухарин, О.В. Антимикробный белок тромбоцитов: монография / О.В. Бухарин, В.А. Черешнев, К.Г. Сулейманов. Екатеринбург, 2000 г. -200 с.

9. Влияние иммуномодулирующих препаратов на образование биоплёнок дрожжевыми грибами / C.B. Гордеева, Е.В. Иванова, C.B. Андрющенко и др. // Проблемы медицинской микологии. 2009. - Т. 11.- №2. - С. 66.

10. Гинодман, JI.M. Хромотография белков на ионообменниках и фракционирование смесей, содержащих белки, на колонках с сефадексом / JI.M. Гинодман // Современные методы в биохимии. — 1964.-Т.1.-С. 37-73.

11. Горюхина, O.A. Выделение катионных белков из тромбоцитов крови кроликов и изучение их бактериостатической активности / O.A. Горюхина, A.A. Ткаченко // Вопросы мед. химии. — 1978. № 1. - С. 17-22.

12. Замотринский, A.B. Систематический подход к изучению белков тромбоцитов человека. Построение двухмерной карты / A.B. Замотринский, С.С. Шишкин // Биохимия. 1991. - Т. 56. - № 5. - С. 863-873.

13. Иванов, Ю.Б. Способность анаэробной фекальной микрофлоры к инактивации антимикробного белка тромбоцитов / Ю.Б. Иванов, H.H. Елагина // Вестник ОГУ. 2005. - № 6. - С. 135 - 137.

14. Катионные белки из нейтрофилов как ингибиторы неферментативной фибринолитической и антикоагулянтной активности плазмы крови / Б. А. Кудряшов, JI. А. Ляпина, В. Н. Кокряков и др. // Вопросы мед. химии. 1989. - № 3. - С. 103 - 108.

15. Кокряков, В.Н. Катионные белки лизосом нейтрофильных гранулоцитов при фагоцитозе и воспалении / В.Н. Кокряков // Вопросы мед. химии. 1990. - Т. 36. - №6. - С. 13-16.

16. Кокряков, В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения: монография. СПб.: Наука, 1999. -162 с.

17. Кокряков, В.H. Очерки о врождённом иммунитете: монография. -СПб.: Наука, 2006. 261 с.

18. Лакин, Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - 288 с.

19. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Пер. с анг. -М.: Мир, 1976.-350 с.

20. Новый метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов / Валышева И.В., Валышев A.B., Карташова О.Л. и др. // Журн. микробиол. 2003. - № 4. - С. 64-67.

21. Сипайлова, О.Ю. Исследование противоопухолевой активности тромбодефенсинов in vivo / О.Ю. Сипайлова, Г.И. Корнеев // Вестник ОГУ. 2009. - № 6. - С. 344 - 347.

22. Сулейманов, К.Г. Бета лизин из сыворотки крови человека: тез. докл. IV Всесоюзн. биохим. Съезда / К.Г. Сулейманов, О.В. Бухарин, Г.Т. Сухих. - Ленинград, 1979. - Т. 3. - С. 143.

23. Сулейманов, К.Г. Использование лизоцимного и бета лизинового тестов для диагностики маститов у коров: тез. докл. IV Всесоюзн. симпоз. по машинному доению с.-х. животных / К.Г. Сулейманов, О.В. Бухарин, О.Л. Карташова. - Таллин, 1983. — С. 113-114.

24. Сулейманов, К.Г. Свойства и иммунорегулятивная роль катионного белка (бета лизина) из сыворотки крови человека: тез. докл. V Всесоюзн. симпоз. «Взаимодействие нервной и иммунной систем» / К.Г. Сулейманов. - Оренбург, 1990. - С. 185 - 186.

25. Шубич, М.Г. Цитохимическое изучение катионных белков лейкоцитов у человека и некоторых лабораторных животных / М.Г. Шубич, А.А. Славинский // Цитология. 1977. - Т. 19. - № 2. - С. 154 - 157.33

26. Эволюционная биохимия и физиология / Кокряков В.Н., Стефанов В.Е., Алешина Е.М. и др. // Журн. эволюционная биохимия и физиология. 1997. - №1. - Т. 33. - С. 109-123.

27. Эффект многократного внутримышечного введения дефенсина на противосвёртывающую систему и ангиоархитектонику скелетной мышцы / Кудряшов Б.А., Кондашевская М.В., Ляпина Л.А. и др. // Докл. АН СССР, 1989. 304 (2). - С. 494-498.

28. Activity of two synthetic amphiphilic peptides and magainin-2 against herpes simplex vims types 1 and 2. Int. / Y. Aboudy, E. Mendelson, I. Shalit et al. // J. Pept. Protein Res. 1994. - Vol. 43. - P. 573-582.

29. Albiol Matanic V. C., Castilla V. Antiviral activity of antimicrobial cationic peptides against Junin virus and herpes simplex virus. // Int. J. Antimicrob. Agents. -2004. Vol. 23. - P. 382-389.

30. Analysis of the interaction of an anti-HIV peptide, T22 (Tyr5, 12, Lys7.-polyphemusin II), with gpl20 and CD4 by surface plasmon resonance / H. Tamamura, A. Otaka, T. Murakami et al. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. -Vol. 1298.-P. 37-44.

31. Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds / F. R. Terras, H. M. Schoofs, M. F. De Bolle et al. //J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 15301-15309.

32. An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 / R. Koczulla , G. von Degenfeld, C. Kupatt et al. // J. Clin. Investig. 2003. -Vol. 111.-P. 1665-1672.

33. A novel anti-HIV synthetic peptide, T-22 (Tyr5,12,Lys7.-polyphemusin II) / M. Masuda, H. Nakashima, T. Ueda et al. // Biochem. Biophys. Res. Coramun. 1992. - Vol. 189. - P. 845-850.

34. Antibacterial action of structurally diverse cationic peptides on grampositive bacteria / C. L. Friedrich, D. Moyles, T. J. Beveridge et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. - Vol. 44. - P. 2086-2092.

35. Antibacterial and antifungal properties of alpha-helical, cationic peptides in the venom of scorpions from southern Africa. Eur / L. Moerman, S. Bosteels, W. Noppe et al. // J. Biochem. 2002. - Vol. 269. - P. 4799-4810.

36. Anti-HIV-l activity of indolicidin, an antimicrobial peptide from neutrophils / W. E. Robinson, B. McDougall, D. Tran et al. // J. Leukoc. Biol. 1998. -Vol. 63.-P. 94-100.

37. Anti-HSV activity of lactoferricin analogues is only partly related to their affinity for heparan sulfate / H. Jenssen, J. H. Andersen, L. Uhlin-Hansen et al. //Antiviral Res. 2004. - Vol. 61. - P. 101-109.

38. Antimicrobial peptide therapeutics for cystic fibrosis / L. Zhang, J. Parente, S. M. Harris et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - Vol. 49. - P. 2921-2927.

39. Antimicrobial specificity and mechanism of action of disulfide-removed linear analogs of the plant-derived Cys-rich antimicrobial peptide lb-AMPI / P. Wang, J. K. Bang, H. J. Kim et al. // Peptides. 2009. - Vol. 30(12). - P. 2144-2149.

40. Antinematodal effect of antimicrobial peptide, PMAP-23, isolated from porcine myeloid against Caenorhabditis elegans / Y. Park, S. H. Jang, D. G. Lee et al. // J. Pept. Sci. 2004. - Vol. 10. - P. 304-311.

41. Antiviral cyclic d,l-alpha-peptides: targeting a general biochemical pathway in virus infections / W. S. Home, C. M. Wiethoff, C. Cui et al. // Bioorg. Med. Chem. 2005. - Vol. 13. - P. 5145-5153.

42. A phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled, study of iseganan for the reduction of stomatitis in patients receiving stomatotoxic chemotherapy / F. J. Giles, R. Rodriguez, D. Weisdorf et al. // Leukoc. Res. 2004. - Vol. 28. - P. 559-565.

43. Augmentation of the bactericidal activities of human cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial peptides by amino acid substitutions / I. Nagaoka, K. Kuwahara-Arai, H. Tamura et al. // Inflamm. Res. 2005. -Vol.54.-P. 66-73.

44. Avrahami, D. Bestowing antifungal and antibacterial activities by lipophilic acid conjugation to d,l-amino acid-containing antimicrobial peptides: a plausible mode of action / D. Avrahami, Y. Shai // Biochemistry. 2003. -Vol. 42. - P. 14946-14956.

45. A wide range of medium-sized, highly cationic, alpha-helical peptides show antiviral activity against herpes simplex virus / H. Jenssen, J. H. Andersen, D. Mantzilas et al. // Antiviral Res. 2004. - Vol. 64. - P. 119-126.

46. Bactericidal activities of the cationic steroid CSA-13 and the cathelicidin peptide LL-37 against Helicobacter pylori in simulated gastric juice / K. Leszczynska, A. Namiot, D. E. Fein et al. // BMC Microbiol. 2009. - Vol. 3.-P. 9-187.

47. Bastian, A. Human alpha-defensin 1 (HNP-1) inhibits adenoviral infection in vitro / A. Bastian, H. Schafer // Regul. Pept. 2001. - Vol. 101. - P. 157161.

48. Bechinger, B. Membrane association and pore formation by alpha-helical peptides / B. Bechinger // Adv Exp Med Biol. 2010. - Vol. 677. - P. 24-30.

49. Boman, H. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity / H. G. Boman // Annu. Rev. Immunol. 1995. - Vol. 13. - P. 61-92.

50. Boman, H. G. Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin PI and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine / H. G. Boman, B. Agerberth, A. Boman // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 2978-2984.

51. Boman, H. Peptide antibiotics: Holy or Heretic Grails of Innate Immunity II Scand / H. Boman // J. Immunol. 1996. - Vol. 43. - P. 475-482.

52. Bovine lactoferrin peptidic fragments involved in inhibition of Echovirus 6 in vitro infection / A. Pietrantoni, M. G. Ammendolia, A. Tinari et al. // Antiviral Res. 2006. - Vol. 69. - P. 98-106.

53. Bowdish, D. M. A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity / D. M. Bowdish, D. J. Davidson, R. E. Hancock // Curr. Protein Pept. Sci. 2005. - Vol. 6. - P. 35-51.

54. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochev. 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

55. Breukink, E. Lipid II as a target for antibiotics / E. Breukink, B. Kruijff // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. - P. 63.

56. Brogden, K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? / K.A. Brogden // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3. - P. 238-250.

57. Brown, K.L. Cationic host defense (antimicrobial) peptides / K.L. Brown, R.E. Hancock // Curr. Opin. Immunol. 2006. - Vol. 18. - P. 24-30.

58. Bulet, P. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates / P. Bulet, R. Stocklin, L. Menin // Immunol. Rev. 2004. - Vol. 198. - P. 169184.

59. Cathelicidin anti-microbial peptide expression in sweat, an innate defense system for the skin / M. Murakami, T. Ohtake, R. A. Dorschner et al. // J. Investig. Dermatol. 2002. - Vol. 119. - P. 1090-1095.

60. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate / H. Barth, C. Schafer, F. Adah et al. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 41003-41012.

61. Cherry, R.J. Comparison of p25 presequence peptide and melittin. Red blood cell haemolysis and band 3 aggregation / R.J. Cherry, MJ. Clague // Biochem J. 1988. - Vol. 252(3). P. 791-794.

62. Correlation of binding of rabbit granulocyte peptides to Candida albicans with candidacidal activity / R. I. Lehrer, D. Szklarek, T. Ganz et al. // Infect. Immun. 1985. - Vol. 49. - P. 207-211.

63. Cotter, P.D. Bacteriocins: developing innate immunity for food / P. D. Cotter, C. Hill, R. P. Ross // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3. - P. 777.

64. Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus / R. A. Dorschner, V. K. Pestonjamasp, S. Tamakuwala et al. II J. Investig. Dermatol. 2001. - Vol. 117.-P. 91-97.

65. Daher, K.A. Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins / K. A. Daher, M.E. Selsted, R. Lehrer // J. Virol. 1986. - Vol. 60. - P. 1068-1074.

66. Dathe, M. Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells /M. Dathe, T. Wieprecht // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1462. - P. 71-87.

67. Davis, A. J. Recent advances in antileishmanial drug development / A. J. Davis, L. Kedzierski // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2005. - Vol. 6. - P. 163-169.

68. Defensins modulates tissue-type plasminogen activator and plasminogen binding to fibrin and endothelian cells / Higazi A.A., Ganz T., Kariko et al. II J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271 (30). - P. 17650-17655.

69. Deficiency of antibacterial peptides in patients with morbus Kostmann: an observation study / K. Putsep, G. Carlsson, H. G. Boman et al. // Lancet. —2002.-Vol. 360.-P. 1144-1149.

70. Different from the HIV fusion inhibitor C34, the anti-HIV drug fuzeon (T-20) inhibits HIV-1 entry by targeting multiple sites in gp41 and gpl20 / S. Liu, H. Lu, J. Niu et al. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 1125911273.

71. Differential expression of alpha- and beta-defensins in human peripheral blood / X. M. Fang, Q. Shu, Q. X. Chen et al. // Eur. J. Clin. Investig.2003.-Vol. 33.-P. 82-87.

72. Donaldson, D.M. Studies on serum bactericidal activity / D.M. Donaldson, S. Marcus // J. Immunology. 1958. - Vol. 81. - P. 292 - 296.

73. Donaldson, D.M. Beta lysin of platelet / D.M. Donaldson, J.G. Tew // J. Bacteriol. Rev. - 1977. - Vol. 41. - P. 501 - 513.

74. Donaldson, D.M. Separation and purification of P lysine from normal serum / D.M. Donaldson, C. Matheson, B. Ellsworth // J. Bacteriol. - 1964. -Vol. 92.-P. 897-901.

75. Donaldson, D.M. Beta lysine, lysozyme, and antibody - complement / D.M. Donaldson // J. Infect. Immunity - 1974. - Vol. 10. - P. 652 - 666.

76. Dual role of alpha-defensin-1 in anti-HIV-1 innate immunity / T. L. Chang, J. Vargas, A. DelPortillo et al. // J. Clin. Investig. 2005. - Vol. 115. - P. 765-773.

77. Effect of Leucine and Lysine substitution on the antimicrobial activity and evaluation of the mechanism of the HPA3NT3 analog peptide / R. Gopal, S.C. Park, K.J. Ha et al. // J Pept Sci. 2009. - Vol. 15(9). - P. 589-594.

78. Elsbach, P. What is the real role of antimicrobial polypeptides that can mediate several other inflammatory responses? / P. Elsbach // J. Clin. Investig.-2003.-Vol. 111.-P. 1643-1645.

79. Epple, P. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis against Fusarium oxysporum / P. Epple, K. Apel, H. Bohlmann // Plant Cell. 1997. - Vol. 9. - P. 509-520.

80. Evaluation of the inactivation of infectious herpes simplex virus by host-defense peptides. Eur / B. Yasin, M. Pang, J. S. Turner et al. // J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2000. - Vol. 19. - P. 187-194.

81. Expression of antimicrobial peptides such as LL-37 and hBD-2 in nonlesional skin of atopic individuals / J. Goo, J. H. Ji, H. Jeon et al. // Pediatr Dermatol. 2010. - Vol. 27(4). - P. 341-348.

82. Expression of the alpha-thionin gene from barley in tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens / M. J. Carmona, A. Molina, J. A. Fernandez et al. // Plant J. 1993. - Vol. 3. - P. 457-462.

83. Fungicidal effect of indolicidin and its interaction with phospholipid membranes / D.G. Lee, H.K. Kim, S.A. Kim et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 305. - P. 305-310.

84. Fungicidal effect of three new synthetic cationic peptides against Candida albicans / H. Nikawa, H. Fukushima, S. Makihira et al. // Oral Dis. 2004. -Vol. 10.-P. 221-228.

85. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity / T. Ganz // Nat. Rev. Immunol. 2003. - Vol. 3. - P. 710-720.

86. Ganz, T. Antimicrobial activity of phagocyte granule proteins / T. Ganz, M.E. Selsted, R.I. Lehrer // Semin. Respir. Infect. 1986. - Vol. 1. - P. 107117.

87. Gennaro, R. Purification, composition, and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils / R. Gennaro, B. Skerlavaj, D. Romeo // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 3142-3146.

88. Gennaro, R. Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides / R. Gennaro, M. Zanetti // Biopolimers. -2000.-Vol.55.-P. 31-49.

89. Gough, M. Antiendotoxin activity of cationic peptide antimicrobial agents / M. Gough, R.E.W. Hancock, N.M. Kelly // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64.-P. 4922-4927.

90. Hallock, K.J. MSI-78, an analogue of the magainin antimicrobial peptides, disrupts lipid bilayer structure via positive curvature strain / K.J. Hallock, D.K. Lee, A. Ramamoorthy // Biophys. J. 2003. - Vol. 84. - P. 3052-3060.

91. Hancock, R.E.W. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials / R.E.W. Hancock // Lancet Infect. Dis. 2001. - Vol. 1. — P 156-164.

92. Hancock, R.E.W., Chappie D. S. Peptide antibiotics / R.E.W. Hancock // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 1317-1323.

93. Hancock, R.E.W. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences / R.E.W. Hancock, G. Diamond // Trends Microbiol. 2000. -Vol. 8.-P. 402-410.

94. Hancock, R.E.W. Cationic peptides: a new source of antibiotics / R.E.W. Hancock, R. Lehrer // Trends Biotechnol. 1998. - Vol. 16. - P. 8288.

95. Hancock, R.E.W. Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics / R.E.W. Hancock, A. Patrzykat // Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2002. - Vol. 2. - P. 79-83.

96. Hancock, R.E.W. Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides / R.E.W. Hancock, A. Rozek // FEMS Microbiol. Lett. -2002. Vol. 206. - P. 143-149.

97. Hancock, R.E.W. The role of antimicrobial peptides in animal defenses / R.E.W. Hancock, M.G. Scott // PNAS. 2000. - Vol. 97. - P. -8856-8861.

98. HB-107, a nonbacteriostatic fragment of the antimicrobial peptide cecropin B, accelerates murine wound repair / P. H. Lee, J. A. Rudisiii, K. H. Lin et al. // Wound Repair Regen. 2004. - Vol. 12. - P. 351-358.

99. Henzler-Wildman, K.A. Mechanism of lipid bilayer disruption by the human antimicrobial peptide, LL-37 / K.A. Henzler-Wildman, D.K. Lee, A. Ramamoorthy // Biochemistry. 2003. - Vol. 42. - P. 6545-6558.

100. Hirsch, J.W. Comparative bactericidal activities of blood serum and plasma serum / J.W. Hirsch // J. Exper. Med. 1960. - Vol. 112. - P. 15 -22.

101. Human lactoferrin and peptides derived from its N terminus are highly effective against infectionswith antibiotic-resistant bacteria / P. H. Nibbering, E. Ravensbergen, M. M. Welling et al. // Infect. Immun. 2001. -No. 69.-P. 1469-1476.

102. Identification of hBD-3 in respiratory tract and serum: the increase in pneumonia / H. Ishimoto, H. Mukae, Y. Date et al. // Eur. Respir. J. 2006. -Vol. 27.-P. 253-260.

103. Imler, J.L. Antimicrobial peptides in Drosophila: structures, activities and gene regulation / J. L. Imler, P. Bulet // Chem. Immunol. Allergy. -2005.-Vol. 86.-P. 1-21.

104. Immunomodulatory activities of small host defense peptides / D. M. Bowdish, D. J. Davidson, M. G. Scott et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - Vol. 49. - P. 1727-1732.

105. Impact of LL-37 on anti-infective immunity / D. M. Bowdish, D. J. Davidson, Y. E. Lau et al. // J. Leukoc. Biol. 2005. - Vol. 77. - P. 451459.

106. Inhibition of early steps in the lentiviral replication cycle by cathelicidin host defense peptides / L. Steinstraesser, B. Tippler, J. Mertens et al. // Retrovirology. 2005. - Vol. 2. - P. 2.

107. In vitro and in vivo antimicrobial activity of two alpha-helical cathelicidin peptides and of their synthetic analogs / M. Benincasa, B. Skerlavaj, R.Gennaro et al. // Peptides. 2003. - Vol. 24. - P. 1723-1731.

108. In vitro antibacterial properties of pexiganan, an analog of magainin / Y. Ge, D. L. MacDonald, K. J. Holroyd et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 782-788.

109. In vitro antiviral activity of dermaseptins against herpes simplex virus type 1 / A. Belaid, M. Aouni, R. Khelifa et al. // J. Med. Virol. 2002. -Vol. 66.-P. 229-234.

110. Ishikawa, K. Research Support / K. Ishikawa // 1971. - Vol. 144(2). P. 476-484

111. Iwanaga, S. Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab / S. Iwanaga, S. Kawabata // Front. Biosci. 1998. - Vol. 3. - P. 973-984.

112. Jenssen, H. Modelling of anti-HSV activity of lactoferricin analogues using amino acid descriptors / H. Jenssen, T.J. Gutteberg, T. Lejon // J. Pept. Sei.-2005.-Vol. 11.-P. 97-103.

113. Jenssen, H. Peptide antimicrobial agents / H. Jenssen, P. Hamill, R.E. Hancock // Clinical Microbiology Reviews. 2006. - Vol. 19. - No 3. - P. 491-511.

114. Johnstone, S.A. In vitro characterization of the anticancer activity of membrane-active cationic peptides / S.A. Johnstone // Anticancer drug des. -2000.-Vol. 15.-P. 151.

115. Kavanagh, K. Histatins: antimicrobial peptides with therapeutic potential / K. Kavanagh, S. Dowd // J. Pharm. Pharmacol. 2004. - Vol. 56. -P. 285-289.

116. Klaenhammer, T.R. Bacteriocins of lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer // Biochimie. 1988. - Vol. 70. - P. 337-349.

117. Lactoferrin and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovirus into human fibroblasts / J. H. Andersen, S. A. Osbakk, L. H. Vorland et al. // Antiviral Res. -2001.- Vol. 51. P. 141 -149.

118. Lee, D.G. Structure and fungicidal activity of a synthetic antimicrobial peptide, PI8, and its truncated peptides / D.G. Lee, K.S. Hahm, S.Y. Shin // Biotechnol. Lett. 2004. - Vol. 26. - P. 337-341.

119. Lehrer, R. Defensins: Endogenous Antibitic Peptides of Animal Cell / R. Lehrer, T. Ganz, M. Selsted // Cell. 1991. - V. 64. - P. 229 - 230.

120. Lehrer, R.I. Antimicrobial peptides in mammalian and insect host defence / R.I. Lehrer, T. Ganz // Curr. Opin. Immunol. 1999. - №11 (1). -P. 23-27.

121. Lehrer, R. Defensins: Antimicrobial and Cytotoxic Peptides of Mammalian Cell / / R. Lehrer, T. Ganz, A. Lichtenstein // Ann. Rev. Immunol. 1993.-№1.-P. 105-128.

122. Li, C.Y. Proline-rich domain of penaeidin molecule exhibits autocrine feature by attracting penaeidin-positive granulocytes toward the wound-induced inflammatory site / C.Y. Li, Y.L. Song // Fish Shellfish Immunol. -2010. Vol. 29(6)/ - C. 1044-1052.

123. Lyte, M. Stimulation of Staphylococcus epidermidis growth and biofilm formation by catecholamine inotropes / M. Lyte, P.P.E. Freestone, C.P.Neal //Lancet.- 2003.-Vol. 361.-P. 130-135.

124. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal / D. Yang, A. Biragyn, L. W. Kwak et al. // Trends Immunol. 2002. - Vol. 23. -P. 291-296.

125. Marcus, S.J. Studies on human platelet granules and membranes / S.J. Marcus, Zucker Franklin, L.B. Safier // J. Clin. Invest. - 1968. - V. 46. -P. 580-584.

126. Matsuzaki, K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defens? Magainins and tachypplesins as archetypes / K. Matsuzaki // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1462. - P. 1-10.

127. Mattick, A.T.R. Further observations on an inhibitory substance (nisin) from lactic streptococci / A.T.R. Mattick, A. Hirsch // Lancet. -1947.-P. 5-7.

128. Mc Keown, S.T. The cytotoxic effect of human peptid-1 (HNP1) and lacto-ferrin on oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro / S.T. Mc Keown // Oral oncol. 2006. - Vol. 42 (7). - P. 685.

129. Merritt, J.H. Growing and Analyzing Static Biofilms / J.H. Merritt, D.E. Kadouri, G.A. O'Toole // Curr. Protoc. Microbiol. 2005. 1B.1.1 -IB.1.17.

130. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host defense / D. Yang, A. Biragyn, D. M. Hoover et al. // Annu. Rev. Immunol. 2004. - Vol. 22. - P. 181-215.

131. Myrvik, Q.N. Studies on antibacterial factors in mammalian tissues and fluids. I A Serum Bactericidin for Bacillus subtilis / Q.N. Myrvik, R.S. Weiser // J. Immunol. 1956. - V. 74. - № 9. - P. 9 - 16.

132. Neutron scattering in the plane of membranes: structure of alamethicin pores / K. He, S. J. Ludtke, D. L. Worcester et al. // Biophys. J. 1996. -Vol. 70.-P. 2659-2666.

133. Nielubowicz, G.R. Host-pathogen interactions in urinary tract infection / G.R. Nielubowicz, H.L. Mobley // Nat Rev Urol. 2010. - Vol. 7(8).-P. 430-441.

134. Nisin inhibits dental caries-associated microorganism in vitro / Z. Tong, L. Dong, L. Zhou et al. // Peptides. 2010 - № 3.

135. Novel synthetic, salt-resistant analogs of human beta-defensins 1 and 3 endowed with enhanced antimicrobial activity / O. Scudiero, S. Galdiero, M. Cantisani et al. // Antimicrob Agents Chemother. 2010. - Vol. 54(6). -P. 2312-2322.

136. NP-1, a rabbit alpha-defensin, prevents the entry and intercellular spread of herpes simplex virus type 2 / S. Sinha, N. Cheshenko, R. I. Lehrer et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - Vol. 47. - P. 494-500.

137. Ourth, D.D. Induction of cecropin-like and attacin-like antibacterial but not antiviral activity in Heliothis virescens larvae / D.D. Ourth, T.D. Lockey, H.E. Renis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 200.-P. 35-44.

138. Pacidamycin biosynthesis: identification and heterologous expression of the first uridyl Peptide antibiotic gene cluster / E. J. Rackham, S. Griischow, A. E. Ragab et al. // Chembiochem. 2010. - №16. - Vol. 11(12).-P. 1700-1709.

139. Park, Y. HP(2-9)-magainin 2(1-12), a synthetic hybrid peptide, exerts its antifungal effect on Candida albicans by damaging the plasma membrane / Y. Park, D.G. Lee, K.S. Hahm // J. Pept. Sci. 2004. - Vol. 10. - P. 204209.

140. Persister Cells and the Mechanism of Multidrug Tolerance in Escherichia coli / I. Keren, D. Shah, A. Spoering et.al. // Specialized J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - P. 8172-8180.

141. Pettersson, A. Die adsorption der ß lysine aus dem Blutserum / A. Pettersson //Aus der hygienischen. Abteilung der Karolinischen Instituts in Stockholm. - 1935. - P. 408 - 416.

142. Platelet Microbicidal Activity Is an Important Defense Factor against Viridans Streptococcal Endocarditis / J. Dankert, J. Krijgsveld, J. van der Werff et al. // The Journal of Infectious Diseases. 2001. - Vol. 184, No 1. - P. 597-605.

143. Porcine polymorphonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation of secreted proprotegrins / A. Panyutich, J. Shi, P. L. Boutz et al. // Infect. Immun. -1997.-Vol. 65.-P. 978-985.

144. Powers, J.P. The relationship between peptide structure and antibacterial activity / J.P. Powers, R.E. Hancock // Peptides. 2003. - Vol. 24.-P. 1681-1691.

145. Powers, J.P. Structure-activity relationships for the beta-hairpin cationic antimicrobial peptide polyphemusin I / J.P. Powers, A. Rozek, R.E. Hancock // Biochim. Biophys. Acta. 2004. - Vol. 1698. - P. 239-250.

146. Presented at the 24th General Meeting of the American Society of Microbiology / L. Zhang, S. Parente, S. M. Harris et al. New Orleans, La.2004.

147. Primate b-defensins Structure, Function and Evolution / S. Crovella, N. Antcheva, I. Zelezetsky et al.// Current Protein and Peptide Science.2005.- Vol.6.-P. 7-21.

148. Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin / N. H. Salzman, D. Ghosh, K. M. Huttner et al. // Nature. 2003. - Vol. 422. - P. 522-526.

149. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins / V.N. Kokryakov, S.S. Harwig, E.A. Panyutich et al. // FEBS Lett. 1993. - Vol. 327. - № 2. - P. 231-236.

150. Protegrin-1: a broad-spectrum, rapidly microbicidal peptide with in vivo activity / D. A. Steinberg, M. A. Hurst, C. A. Fujii et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1997. - Vol. 41. - P. 1738-1742.

151. Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37 / A. Schmidtchen, I. M. Frick, E. Andersson et al. // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 46. - P. 157-168.

152. Purification and in vitro activities of rabbit platelet microbicidal proteins/ M. R. Yeaman, Y. Q. Tang, A. J. Shen et al. // Infect Immun. -1997. Vol. 65. - P. 1023 - 1031.

153. Regulation of intestinal alpha-defensin activation by the metalloproteinase matrilysin in innate host defense / C. L. Wilson, A. J. Ouellette, D. P. Satchell et al. // Science. 1999. - Vol. 286. - P. 113-117.

154. Retrocyclin: a primate peptide that protects cells from infection by Tand M-tropic strains of HIV-1 / A. M. Cole, T. Hong, L. M. Boo et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002.-Vol. 99.-P. 1813-1818.

155. Riley, M.A. Molecular mechanisms of bacteriocin evolution / M.A. Riley // Annu. Rev. Genet. 1998. - Vol. 32. - P. 255-278.

156. Rinaldi, A.C. Antimicrobial peptides from amphibian skin: an expanding scenario / A.C. Rinaldi // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - Vol. 6.-P. 799-804.

157. Roch, P. Antiprotozoan and antiviral activities of non-cytotoxic truncated and variant analogues of mussel defensin / P. Roch, A. Beschin, E.

158. Bernard // Evid Based Complement Alternat. Med. —2004.-Vol. l.-P. 167-174.

159. Role of positional hydrophobicity in the leishmanicidal activity of magainin 2 / E. Guerrero, J. M. Saugar, K. Matsuzaki et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. - Vol. 48. - P. 2980-2986.

160. Scott, M.G. Cationic antimicrobial peptides and their multifunctional role in the immune system / M.G. Scott, R.E. Hancock // Crit. Rev. Immunol. 2000. - Vol. 20. - P. 407-431.

161. Secretion of microbicidal alpha-defensins by intestinal Paneth cells in response to bacteria / T. Ayabe, D. P. Satchell, C. L. Wilson et al. // Nat. Immunol.-2000.-Vol. l.-P. 113-118.

162. Selsted, M.E. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response / M.E. Selsted, A.J. Ouellette // Nat. Immunol. 2005. - Vol. 6. -P. 551-557.

163. Shultz, L.D. Cytotoxity of Rabbit Blood for Listeria monocytogenes / L.D. Shultz, M.S. Wilder // Infect and Immunity. 1971. - V. 4. - № 6. - P. 703-708.

164. Simmaco, M. Antimicrobial peptides from amphibian skin: what do they tell us? / M. Simmaco, G. Mignogna, D. Barra // Biopolymers. 1998. -Vol. 47.-P. 435-450.

165. Solution structure and interaction of the antimicrobial polyphemusins with lipid membranes / J. P. Powers, A. Tan, A. Ramamoorthy et al. // Biochemistry. -2005. Vol. 44. - P. 15504-15513.

166. Structure-activity relationships of an anti-HIV peptide, T22 / H. Tamamura, T. Murakami, M. Masuda et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 205. - P. 1729-1735.

167. Structure and mechanism of action of an indolicidin peptide derivative with improved activity against gram-positive bacteria / C. L. Friedrich, A. Rozek, A. Patrzykat et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 2401524022.

168. Structure-antiviral activity relationships of cecropin A-magainin 2 hybrid peptide and its analogues / D. G. Lee, Y. Park, I. Jin et al. // J. Pept. Sci.-2004.-Vol. 10.-P. 298-303.

169. Structure-based design of an indolicidin peptide analogue with increased protease stability / A. Rozek, J. P. Powers, C. L. Friedrich et al. // Biochemistry. 2003. - Vol. 42. - P. 14130-14138.

170. Subbalakshmi, C. Mechanism of antimicrobial action of indolicidin / C. Subbalakshmi, N. Sitaram // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 160. -P. 91-96.

171. Synthesis and HIV-1 integrase inhibitory activity of dimeric and tetrameric analogs of indolicidin / K. Krajewski, C. Marchand, Y. Q. Long et al. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004. - Vol. 14. - P. 5595-5598.

172. Synthesis of protegrin-related peptides and their antibacterial and antihuman immunodeficiency virus activity / H. Tamamura, T. Murakmi, S. Horiuchi et al. // Chem. Pharm. Bull. 1995. - Vol. 43. - P. 853-858.

173. Tang, Y. Antimicrobial peptides from human platelets / Y. Tang, M.R. Yeaman, M.E. Selsted // Infection and Immunity. 2002. - Vol. 70. - №. 12.-P. 6524-6533.

174. Tang, Y.Q. Microbicidal and synergistic activities of human platelets factor-4 (hPF-4) and connective tissue activating peptid-3 (CTAP-3) (abstract no 2212) / Y.Q. Tang, M.R. Yeaman, M.E. Selsted // Blood. -1995.-Vol. 86.-P. 556.

175. Tang, Y.Q. Purification, characterization and antimicrobial properties of peptides released from thrombin induced human platelets (abstract no 3626) / Y.Q. Tang, M.R. Yeaman, M.E. Selsted // Blood. - 1995. - Vol. 86. -P. 910.

176. The antimicrobial peptide dermaseptin S4 inhibits HIV-1 infectivity in vitro I C. Lorin, H. Saidi, A. Belaid et al. // Virology. 2005. - Vol. 334. -P. 264-275.

177. The antimicrobial peptides lactoferricin B and magainin 2 cross over the bacterial cytoplasmic membrane and reside in the cytoplasm / H. H. Haukland, H. Ulvatne, K. Sandvik et al. // FEBS Lett. 2001. - Vol. 508. -P. 389-393.

178. The cationic antimicrobial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell-induced T cell polarization / D. J. Davidson, A. J. Currie, G. S. Reid et al. // J. Immunol. 2004. - Vol. 172. -P. 1146-1156.

179. The effect of bovine lactoferrin and lactoferricin B on the ability of feline calicivirus (a norovirus surrogate) and poliovirus to infect cell cultures / K. B. Mc Cann, A. Lee, J. Wan et al. // J. Appl. Microbiol. 2003. - Vol. 95.-P. 1026-1033.

180. The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunctional modulator of innate immune responses / M. G. Scott, D. J. Davidson, M. R. Gold et al. // J. Immunol. 2002. - Vol. 169. - P. 3883-3891.

181. The human cationic peptide LL-37 induces activation of the extracellular signal-regulated kinase and p38 kinase pathways in primary human monocytes / D. M. Bowdish, D. J. Davidson, D. P. Speert et al. // J. Immunol.-2004.-Vol. 172.-P. 3758-3765.

182. Theta defensins protect cells from infection by herpes simplex virus by inhibiting viral adhesion and entry / B. Yasin, W. Wang, M. Pang et al. // J. Virol. -2004. Vol. 78. - P. 5147-5156.

183. Tuning the biological properties of amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides: rational use of minimal amino acid substitutions / I. Zelezetsky, U. Pag, H. G. Sahl et al. // Peptides. 2005. - Vol. 26. - P. 2368-2376.

184. Uropathogenic Escherichia coli modulates immune responses and its curli fimbriae interact with the antimicrobial peptide LL-37 / Y. Kai-Larsen, P. Lüthje, M. Chromek et al. // PLoS Pathog. 2010. - Vol. 22. - № 6(7). -P. 100-110.

185. Weksler, B.B. Rabbit platelet bactericidal protein / B.B. Weksler, R.L. Nachman // J. Exp. Med. 1971. - Vol. 134. - P. 114 - 1130.

186. Yamasaki, K. Antimicrobial peptides in human skin disease / K. Yamasaki, R.L. Gallo // J. Dermatol. 2008. - Vol. 18(1). - P. 11-21.

187. Yeaman, M.R. The role of platelets in antimicrobial host defense / M.R. Yeaman // Clin Infect Dis. 1997. - V. 25. - № 5. - P. 951 - 968.

188. Yeaman, M.R. Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance / M.R. Yeaman // Farmacol. Rev. 2003. - Vol.55 - P. 27-55.

189. Zanetti, M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity / M. Zanetti // J. Leukoc. Biol. 2004. - Vol. 75. - P. 39-48.

190. Zasloff, M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor / M. Zasloff // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1987. Vol. 84. - P. 5449-5453.

191. Zasloff, M. Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues / M. Zasloff, B. Martin, H.C. Chen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 910-913.

192. Zhang, L. Antimicrobial peptides—therapeutic potential / L. Zhang, T.J. Falla // Expert Opin. Pharmacother. 2006. - Vol. 7. - P. 653-663.

193. Zhang, L. Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes / L. Zhang, A. Rozek, R.E. Hancock // J. Biol. Chem. 2001. -Vol. 276.-P. 35714-35722.

Информация о работе

Шейда, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Антимикробные свойства тромбоцитарного катионного белка сельскохозяйственных животных - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы