Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антимикробное действие и экологическая роль полифункциональных белков

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антимикробное действие и экологическая роль полифункциональных белков"

005060975

На правах рукописи

Го Даньян

АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

03.02.03- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6 ш 2013

Москва-2013

005060975

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Юдина Татьяна Георгиевна

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Баскова Изольда Парфирьевна

Официальные оппоненты: Полянская Любовь Максимовна

доктор биологических наук, профессор Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, кафедра биологии почв, ведущий научный сотрудник

Ананьева Надежда Дмитриевна доктор биологических наук,

Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 20 июня 2013 г. в 15,30 на заседании диссертационного совета Д.501.001. 21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп. 12, Биологический факультет, ауд. М-1. Тел.8(495)939054-83, эл. почта npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ. Автореферат разослан 20 мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Пискункова Нина Федоровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Многим белкам свойственна полифункцнональность, то есть способность проявлять не одну, а две или более разных активностей, причем, с помощью различных механизмов. Лизоцимы полифункциональны, так как, помимо известных ферментативных активностей (мурамидазной и некоторых других), они способны и к неферментативному действию на клетки, включающему, прежде всего, связывание с цитоплазматической мембраной и нарушение её проницаемости, результатом чего является выраженный антимикробный эффект, проявляющийся и после потери их мурамидазной активности. Способность к мембранотропной активности лизоцимов и ряда других белков дали основание исследователям отнести их к группе антимикробных белков и пептидов (АМБП) - перспективной альтернативы антибиотикам для борьбы с возбудителями многих заболеваний. АМБП являются важной составляющей врождённого иммунитета (Wiesner, Vilcinkas, 2010).

Последние исследования показали сходство ряда АМБП с амилоидными белками, способными к образованию in vivo и in vitro агрегатов из фибрилл на основе перекрещивающихся р-слоёв (Torrent et al., 2010, 2012). Установлена способность с-лизоцима и других белков к формированию амилоидных фибрилл (Gharibyan et al., 2007; Harris et al., 2012). Многие исследователи сходятся во мнении, что амилоидогенность - общее свойство полипептидных цепей (Dobson, 1999; Bucciantini et al., 2002). Причём, образуемые различными белками агрегаты часто токсичны (Stefani, Dobson, 2003). Цитотоксичность амилоидов играет ключевую роль при возникновении многих заболеваний (например, болезней Альцгеймера, Паркинсона, амилоидозов, диабета 2 типа) и в то же время - в борьбе с патогенными микроорганизмами. Общим свойством амилоидов также является полиморфизм, в связи с множественностью путей образования фибрилл (Gharibyan et al., 2007). Поэтому исследование антимикробного действия полифункциональных АМБП представляет значительный теоретический и практический интерес.

Уникальный представитель полифункциональных белков, родоначальник семейства i-лизоцимов - Дестабилаза-Лизоцим (Д-Л) из секрета слюнных клеток медицинской пиявки, действие которого направлено на гидролиз бета-(1,4)-гликозидных связей между N-ацетил-мурамовой кислотой и N-ацегил-глюкозамином пептидогликана бактериальной стенки, обладающий также эндо-£-(у-С1и)-Ьуз-изонептидазной активностью. Д-Л способна к растворению стабилизированного фибрина и к расщеплению Д-димера (фрагмента деградации стабилизированного фибрина) до мономеров путем не протеолиза, а изопептидолиза эндо-в-(у-Глу)-Лиз связей, соединяющих мономеры, такой механизм приводит к медленному разрушению старых, предобразованных тромбов (Баскова и др., 2000, 2008, 2010, 2012; Завалова и др., 2010). Д-Л - высокоэффективный антимикробный агент благодаря своим ферментативной и мембранотропной активностям (Zavalova et al., 2006).

Изучение различных проявлений активности Д-Л имеет особую практическую значимость в связи с разработкой новых лекарственных средств, сочетающих тромболитичсские и антимикробные свойства.

Полифункциональны и Cry-белки - основной компонент кристаллических параспоральных включений энтомопатогенной бактерии Bacillus ihuringiensis - высокоспецифичные токсины некоторых насекомых и других беспозвоночных. Их молекулы могут по-разному проявлять свою

биологическую активность в зависимости от клеток - мишеней: 1) не только высокоспецифично разрушать клетки чувствительных беспозвоночных, связываясь с рецепторами на их мембранах и оказывая мембранотропное действие, 2) но и с меньшей специфичностью подавлять рост микроорганизмов посредством не изученного пока механизма, конечный эффект которого мембранотропный. Кристаллы ряда подвидов В. thuringiensis кроме Cry содержат и Cyt белки, которые также полифункциональны, так как проявляют, помимо неспецифичной инсектицидной активности, и антимикробную (Юдина и др., 1988; 1996; 2003; 2004, 2006, 2007).

Полифункциональность Cry и Cyt белков проявляется также в том, что они разрушают клеточную стенку микроорганизмов. Такой механизм отличается от мембранотропного и требует исследований. Имеются сообщения о влиянии белков кристаллов и на клетки млекопитающих.

Актуальность изучения антимикробной активности Cry-белков намного возросла в связи с введением cry-генов в растения для защиты последних от вредных насекомых. При этом большое количество таких белков, синтезируемых всеми частями генетически модифицированных растений, может накапливаться как в самих растениях, так и в почвах, и влиять на биоценозы. Особенно важны экологические последствия изменения почвенных микробиоценозов.

При попадании токсинов (например, белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis) в насекомое у последнего возникает иммунный ответ, приводящий к синтезу лизоцимов, лизоцим-подобных и многих других белков. В этот период вышеуказанные токсины и лизоцимы могут взаимодействовать. Такие процессы представляют несомненный интерес для понимания экологической роли этих белков, их влияния на факторы врождённого иммунитета и на развитие инфекции. Принципиальные этапы этих процессов можно смоделировать in vitro, первым шагом при этом является изучение антимикробных эффектов Cyt, Cry белков, а также лизоцимов. Поэтому сравнительное изучение особенностей антимикробного действия полифункциональных белков из параспоральных кристаллов В. thuringiensis и Д-Л из медицинской пиявки актуально, имеет большую теоретическую и практическую значимость.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение антимикробной активности и определение её экологической роли у различных полифункциональных белков: а) образующих параспоральные кристаллы энтомопатогенной бактерии В. thuringiensis и б) двух форм реюомбинантного белка Дестабилазы-Лизоцима. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Выделить белки параспоральных кристаллов В. thuringiensis, изучить антимикробный эффект прежде всего Cryl А белка на представителей царств грибов и бактерий, а также на архей.

2) Получить форму рД-Л, лишённую мурамидазной активности (p/I-J[)t, провести сравнительное исследование антимикробного эффекта этих белков на представителей царств грибов и бактерий.

3) Провести электронно-микроскопическое изучение морфологии лизирующихся микроорганизмов, чувствительных к антимикробной активности исследуемых белков, установить основные закономерности такого лизиса.

4) Исследовать с помощью ТЭМ морфологию фибрилл кристаллов В. thuringiensis и определить роль амилоидогенности белков кристаллов.

5) Подобрать различные инкубационные условия, которые бы дали возможность моделировать in vitro некоторые изменения антимикробной активности белков.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Белок рД-Ли лишённый мурамидазной активности, оказывает больший

антибиотический эффект на грибы, чем нативный рД-Л.

2) На поверхности кристаллов В. thuringiensis обнаружены амилоидные фибриллы, их больше всего на поверхности кристаллов В. thuringiensis ssp. amagiensis, состоящих из уникальных белков.

3) Прединкубацня белков кристаллов с препаратом клеточных стенок и GalNAc активирует образование амилоидных фибрилл этими белками, антибактериальная активность которых выше, чем у олигомеров.

4) Биогенные амины серотонин ослабляет антибиотическую активность белков кристаллов, а дофамин не оказывает на неё влияния.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Сравнительное исследование антимикробной активности разных полифункциональных белков дало возможность проанализировать её экологическое и практическое значение. Впервые обнаружены амилоидные фибриллы на поверхности кристаллов В. thuringiensis и определено как их экологическое значение, так и их роль в проявлении антимикробной активности белков кристаллов. Впервые показано in vivo, что антимикробная активность СгуЗА В. thuringiensis ssp. tenebrionis, приводит к гибели значительного количества клостридий-симбионтов в средней кишке мучного хрущака Tenebrio molitor. Эти клостридии чувствительны также к антибиотическому влиянию рД-Л и CytlA. Смоделирован in vitro анализ некоторых реакций иммунного ответа на цитотоксические полифункциональные АМБП. Изученное антимикробное действие полифункциональных белков имеет большое практическое значение для анализа последствий распространения генетически модифицированных растений, синтезирующих белки параспоральных кристаллов В. thuringiensis, а также для разработки нового лекарственного препарата на основе рД-Л, которая проходит в настоящее время.

Апробация работы и публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 3 научные статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных Министерством Образования и ВАК РФ, а также 3 научные статьи в сборниках. Опубликовано 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов» (Москва, 2010), Asian Congress on Biotechnology (Shanghai, 2011), VII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011), Chinese Fourteenth National Conference on Environmental Microbiology (Xiamen, 2011), Съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 2012), XIX и XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» и «Ломоносов-2013» (Москва, 2012, 2013), Международной конференции Ассоциации гирудологов (Харьков, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), The 15th Guangzhou Convention of Oversea Chinese Scholars in Science and Technology (Guangzhou, 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Работа изложена на 131 страницах, содержит 12 таблиц и 37 рисунков, приложения. Список литературы содержит 205 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследований.

В работе использовали типовые штаммы различных подвидов Ш, полученные из Института Пастера, хранящиеся на кафедре микробиологии МГУ. Использовали также штаммы, полученные и хранящиеся в ФГУП ВНИИГенетика.

Параспоральные кристаллы получали после выращивания тнтомо патогенных бактерий на жидких или агаризованных питательных средах, для получения белков отделяли кристаллы от спор по известной методике с помощью п-ксютола (СЬеяШкЫла е1 аЬ, 1980). Смесь белков кристаллов В1 получали путём растворения отмытых кристаллов в 0,02н ЫаОН в течение 1 часа при перемешивании. Разделение белков кристаллов проводили с помощью жидкостной хроматографии посредством системы РРЬС на колонке МопоС? ("РЬагшаС1а", Швеция) разработанными методами (СИезШкЫпа И а1., 1980, 1986, 1994; га!ипщ й а1., 1982, 1998, 2004). Молекулярную массу белков и их фрагментов определяли электрофоретически в 10% ПААГ в присутствии 0,1% БОБ. Полученные растворы, диализованные против 0,05М трис-НС1 буфера рН 8,2 - 8,5, или 0,02 - 0,05М фосфатного буфера, рН 7,8 использовали для определения их антимикробной активности методом диффузии в агаре (Егоров и др., 1987, 1988; Юдина, Егоров, 1996).

В качестве тест-культур использовали микроорганизмы Музея кафедры микробиологии МГУ, а также полученные из коллекции (Брауншвейг, ФРГ)-

Тест-микроорганизмы выращивали на агаризованной среде №1(6), г/л: К2НРО4 — 7,0; КН2Р04 - 2,0; цитрат натрия - 0,4; \lgS04 - 0,05; (ЫНд^О., - 1,0; 0,5% триптозного агара ('НеапаГ, Венгрия), Н2Одист.; рН 7,4.; а также на среде Чапека с 2% глюкозы, на картофельной, и на некоторых других средах (Нетрусов, 2005). Во всех случаях для приготовления агаризованных сред добавляли в них 13 г/л высокоочищенного агара производства фирм 011со (США) или Регак (Германия).

Антибиотическую активность белков параспоральных кристаллов, а также рекомбинантного белка Дестабилазы-Лизоцима и некоторых его мутантов определяли, учитывая размер зоны подавления роста тест-культуры от конца лунки. Выражали удельную активность в единицах 1/а (ед.), где 1 - ширина (не диаметр) четкой зоны подавления роста от края лунки (мм); а - количество белка, внесенного в лунку (мкг) (УисИпа е1 а1., 2003; Леута е1 а1., 2005). Антибиотическую активность выражали и в ед/мг, используя при расчётах концентрацию раствора белка, внесённого в лунку, в мкг/мл (Юдина с соавт., 1992, 1996). Минимальные ингибирующие (или подавляющие) концентрации (МИК) растворов белков определяли известным способом путем учета антибиотических активностей ряда разведений. МИК выражали в мкг/мл раствора белка, внесенного в лунку. Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами, достоверность различий р<0,05. Изучение влияния препаратов КС и некоторых их компонентов, а также биогенных аминов, на проявление антибиотической активности белков кристаллов В. проводили так, как

описано ранее (Уис1ша е1 а1., 2007, 2011).

При проведении опытов in vivo исследовали влияние СгуЗА белка (он один образует параспоральные кристаллы использованного штамма В. thuringiensis subsp. tenebrionis, токсичного для личинок мучного хрущака Tenebrio molitor), на клостридий, обитающих в средней кишке этих личинок. Кормили личинок мукой с добавлением спор и кристаллов СгуЗА белка, выделяли среднюю кишку в контроле и в опыте - после потери личинками подвижности и гибели под влиянием СгуЗА белка. Количественно делали посевы в жидкую среду для роста клостридий из этого гомогенизированного, прокипячённого материала и проводили подсчёт клеток, выросших из спор в анаэробных условиях. Также исследовали вид этих клеток в СЭМ и их чувствительность к антибиотическому действию СгуЗА и рД-Л.. Выделение колоний кристаллообразующих бацилл проводили на селективной среде с помощью метода ацетатной селекции (Нетрусов, 2005).

Изучение электронно-микроскопической картины влияния изучаемых белков на клетки микроорганизмов проводили после инкубации выращенных на агаризованной среде и отмытых клеток в 0,02М фосфатном или трис-НС1-буфере pH 7,8 - 8,2, соответственно, с 0,01% триптона или трипказина при 30°С в течение 15 - 120 мин., а также выращенных на агаризованной среде и помещённых в стерильную воду клеток. При приготовлении препаратов для сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии (СЭМ и ТЭМ, в том числе, негативное контрастирование) использовали описанные способы. Контрастирование препаратов проводили с помощью 2% фосфовольфрамовой кислоты (Юдина, Богданов, 2005). Препараты изучали с помощью электронных микроскопов JeollOl 1, JSM-6380 LA (Япония), Cam Scan (Великобритания) в Лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ. При работе с красителем Конго красным (Nilsson, 2004) использовали поляризационно-интерференционный световой микроскоп MPI-3 (Польша).

Исследовали антимикробное действие рекомбинантных Дестабилазы-Лизоцима (рД-Л) и некоторых мутантов этого белка, полученных в Институте Биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и НИИ Физико-химической медицины ФМБА России. Для получения модифицированной формы рД-Л, лишённой мурамидазной активности (рД-Л0, этот белок прогревали на водяной бане при 90°С в течение 50 мин (Баскова и др., 2008, 2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование антнмикробного действия двух форм рекомбинантной Дестабилазы-Лизоцима (рД-Л и рД-Лг). а также некоторых мутантов этого белка.

Полифункциональные белки лизоцимы обладают признаками АМБП (Torrent et al., 2009). Однако, антимикробное действие первого представителя i-семейства лизоцимов, дсстабилазы-лизоцима из медицинской пиявки Hirudo medicinalis, только начали изучать (Zavalova et al., 2006; Завапова и др., 2010). В составе белков этого семейства не выявлено HLH последовательности (Baskova et al., 2000), характерной для представителей большинства других семейств лизоцимов, поэтому различные проявления активности полифункционального рД-Л могут иметь свои особенности.

Изучение антибиотического влияния двух форм рД-Л из медицинской пиявки на грибы.

Исследованные дрожжи Candida guillermondii, Shizosaccharomyces pombe и мицелиальные грибы Botrytis cinerea и Verticillium lateriticum. чувствительны к антимикробному действию

рД-Л, и в ещё большей степени - к рД-Лг, что отчётливо наблюдается в световом микроскопе (рис. 1).

1) 2) 3)

Рис. !. Световая микроскопия клеток Botrytis cinerea после их инкубации при 30° С в течение 3 ч с 20 мкг/мл рД-Л (2) или рД-Л1 (3). Контроль (1). Условия опыта идентичны для обеих форм белка. Лизис гиф гриба под влиянием рД-Л1 более интенсивный, чем под влиянием рД-Л.

Ш'

'■4'

ЯШ

iJ

и

о

2)

3)

Рис.2. ТЭМ лизирующихся гиф В.cinerea после их инкубации при 30° С в течение 3 ч с 20 мкг/мл рД-Л1: 1- разрушение участков клеточных стенок (указано стрелками); просветление цитоплазмы; образование кольцевых мембранных структур; 2 и 3 - поперечный срез мицелия, видно разрушение клеточных оболочек, образование кольцевых мембранных структур, лизис остатков клеток.

Картина лизиса гиф гриба V. Lateriticum под влиянием рД-Л была сходной.

2)

Рис. 3. ТЭМ лизирующихся гиф V. lateriticum после их инкубации при 30° С в течение 3 ч с 20

мкг/мл рД-JIt: слева - контроль, справа - лизирующисся гифы (разрушение клеточных оболочек, образование кольцевых мембранных структур, лизис остатков клеток).

Жизнеспособность клеток различных исследуемых грибов утрачивалась через 5 - 8 часов после воздействия рД-Л„ а после воздействия рД-Л1 - через 3 - 5 часов, что также подтверждает более активное антибиотическое действие модифицированной формы белка. Активность рД-Л и pflJIt, определённая методом диффузии в агар, составила 8 и 10 ед, в отношении В. cinerea, а в отношении С. guillermondii - 11 и 15 ед., соответственно. МИК рД-Ле для С. guillermondii составила 25мкг/мл.

Для количественного определения различий в величинах активностей двух форм рД-Л проводили подсчёт в СЭМ количества клеток с нарушенной морфологией - раздувшихся, лизирующихся после их инкубации при 30° С в течение 3 ч с 20 мкг/мл, а после 5 ч такой инкубации лизировались практически все клетки (табл.1).

(

Ф-ш

в т

> JT 3

"С

L ^f # 1И t

ш

2)

3)

f

!

4)

5)

6)

Рис. 4. ТЭМ срезов клеток Candida guillermondii, разрушающихся под влиянием рД-Ли 1 - контроль, 2 -начало лизиса клеток; 3 - разрыхление и начало расслоения клеточной стенки, просветление цитоплазмы, начало впячивания мембраны; 4 - нарушение наружных слоев клеточной стенки, их лизис в более молодой почкующейся клетке, потеря значительной части внутренних компонентов клетки: 5 -раздувшаяся за счёт осмотического лизиса клетка; 6 - расслаивание капсулы, локальное её разрушение, образование кольцевых апоптических структур.

Табл. 1.

Процентное содержание лизирующихся под влиянием рД-Л и рД-. It клеток популяции дрожжей

Белок Candida guillermondii Shizosaccharomyces pombe

рД-Л 69,0 + 7,0 65,8+4,3

рД-Л( 85,3 ±7,5 78,5 + 5,2

фото (полей зрения).

Таким образом, впервые установлено антифунгальное действие рД-Л и рД-Л1 на мицелиальные грибы и дрожжи, причём, рД-Л1 примерно на четверть более активен - вероятно, благодаря тому, что его модифицированная молекула амфипатична, имеет более выраженные свойства АМБП и поэтому способна с большей лёгкостью приобретать различные конформации (вплоть до амилоидных фибрилл), проявляющие повышенную цитотоксичность по сравнению с исходными олигомерами (Gharibyan et al., 2007). С помощью ТЭМ нами впервые описаны основные признаки лизиса грибных мицелиальных и дрожжевых клеток под действием рД-Л. Возможно, гибель клеток грибов под влиянием рД-Л идёт по пути апоптоза, на такую вероятность указывает большое количество кольцевых мембранных структур, образующихся в процессе лизиса этих клеток. Повышенная антифунгальная активность рД-Л1 по сравнению с нативным рД-Л установлена нами впервые для представителей всех семейств лизоцимов.

Изучение антибиотического влияния двух форм рД-Л из медицинской пиявки на бактерий.

Потеря мурамидазной активности рД-Л после прогревания обычно приводит к разному ослаблению антибиотического действия на Грам-положительных бактерий и усилению - на Грам-отрицательных. Особый интерес представляет изучение активности рД-Л на бактерий, которые могут взаимодействовать с клеточным эпителием человека, способствуя склеротизации сосудов (Rosenfeld, Campbell, 2011). Так, МИКи рД-Л и рД-Л1 для Pseudomonas ßuorescens составили 4,5 и 1,5 мкг/мл, соответственно. Патоген беспозвоночных Moraxella osloensis также лизировался (МИК 15 мкг/мл) под влиянием рД-Л1 (рис.5).

-1 щШт

0.2 цш 0.2 цт 0 2 цт

1) 2) 3)

Рис.5. ТЭМ контрастированной фосфовольфраматом клетки Moraxella osloensis, лизирующейся под влиянием рД-Л1 (30 мкг/мл, 1ч, 30°С): 1 - контроль, видна клеточная стенка; 2 - разрушение клеточной стенки, разрыхление цитоплазмы; 3 - остатки лизировавшейся клетки.

В табл.6 представлены результаты сравнения антибактериальных активностей двух форм рекомбинантного лизоцима (растворы одинаковой концентрации 30 мкг/мл). Потеря мурамидазной активности обычно уменьшает эффект лизоцима на Грам-положительных бактерий, и, наоборот, усиливает и расширяет спектр действия в отношении Грам-отрицательных бактерий.

Таблица 2.

Антибактериальная активность (ед.) рД-JT и рД-JIt

Kokuria Moraxella Clostridium Pseudo- Xenor-

rosea osloensis acetobytylicum monas habdus

aeruginosa bovienii.

(1 фаза)

70,8 8,5 47,5 2,3 1,3

1,5 52,0 0,5 19,7 17,0

исходного рД-Л, а в нижней - для рД-Л1 без мурамидазной активности.

Следовательно, полифункциональный белок - рекомбинантный лизоцим из медицинской пиявки, способен проявлять свой антимикробный эффект с помощью различающихся механизмов: ферментативных активностей мурамидазной (лизоцимной), гликозидазной, изопептидазной и других (Завалова и др., 2010), мембранотропной активности отдельных АМБП (Thammasirirak et al„ 2010), а также конформационно изменённых (Ibrahim et al„ 1996; 2005) и структурированных молекул (Gharibyan et al., 2007).

Антибиотический эффект рД-Л1 на представителя семейства энтеробактерий - клетки 1 фазы Xenorhabdus bovienii, усилился по сравнению с рД-Л более, чем в 10 раз (табл. 2).

Белок рД-Л стабилен, сохраняет свою активность по отношению к Moraxella osloensis в течение 2-х лет, однако, теряет активность после прогревания (90°С, 50 мин), в отличие от исходного и хранящегося при +4°С не более нескольких месяцев (табл. 3).

Белок МИК, мкг/мл, для Moraxella osloensis

рД-Л, исходный 75

(рД-Л, исходный)! - прогретый 15

рД-Л после хранения 100

(рД-Л после хранения)! - прогретый 0

изопептидазном активном центре (К38А) сохраняли часть своей антимикробной активности (табл.3). Это подтверждает, что молек>лы рД-Л амфипатичны, способны к ферментативной и неферментативной антимикробной активности. Табл. 4.

Сравнение антибактериальных активностей рД-Л и мутаитных белков

рД-Л и его мутанты МИК, мкг/мл, ДЛЯ Kokuria rosea

рД-Л исходный 0,8

Б26А (точечная мутация белка в каталитическом глиюзидазном активном центре привела к потере гликозидазной активности с сохранением изопептидазной) 3,9

К38А (точечная мутация белка в каталитическом изопептидазном активном центре привела к потере изопептидазной активности с сохранением гликозидазной функции) 12,5

Исследована электронно-микроскопическая картина лизиса бактерий под влиянием рД-JIt. Причины изменения спектра антибиотического действия рД-JIt в сравнении с рД-JI могут быть обусловлены (информационными изменениями молекулы (Ibrahim et al., 1996; 2005; Höring et aL, 2012). Так как доказана способность лизоцима к образованию in vitro амилоидных агрегатов, более токсичных, чем исходный белок-олигомер (Gharibyan et al., 2007), то можно также предположить, что подобное структурирование более эффективно проходит у рД-JIt, чем у рД-Л, поэтому антимикробная активность рД-Л1 выше. Таким образом, разные формы рД-Л оказывают различающееся антибиотическое действие на грибы, архей, на аэробных и анаэробных бактерий.

рД-Л - стабильный белок, так как сохраняет свою активность без замораживания в течение не менее 2-х лет. Однако, после длительного (2 года) хранения прогревание рД-Л приводит к потере её активности. рД-Л1 имеет обычно более широкий спектр антимикробного действия, чем рД-Л. Мутантные формы рД-Л отличаются своей антимикробной активностью. Эти и другие характеристики делают рД-Л перспективным для разработки нового лекарственного тромболитического и антимикробного препарата, которая проходит в настоящее время.

Изучение антимикробного действия белков параспоральных кристаллов Bacillus thurineiensis

Антибиотическое действие CytlA на представителей царства грибов.

Ранее не изучали антибиотическое влияние CytlA белка на микроскопические грибы, многие из которых обитают в почвенных отходах, других природных эконишах, являясь активными деструкторами. Грибы встречаются и среди симбиотической микробиоты. Известно о различиях в составе клеточных стенок бактерий и грибов (Калебина и др., 2001), поэтому интересно, способен ли CytlA белок разрушать клеточные стенки грибов и их мембраны. Лизис клеток дрожжей под влиянием CytlA (50 мкг/мл, 3 ч, 30° С) хорошо заметен с помощью светового микроскопа. При подсчёте в СЭМ количества клеток с нарушенной морфологией -раздувшихся, лизирующихся, выявилось, что такие клетки составляют более 2/3 от общего числа клеток через 3 ч инкубации с CytlA (табл. 5), а через 5 ч практически все клетки лизируюгся.

Таблица 5.

Процентное содержание лизирующихся под влиянием СуНА клеток дрожжей в их популяции._____

Белок Candida guilliermondii Shizosacchammyces pomber

CytlA, 50 мкг/мл, 3 ч, 30°С 65 ± 3,7 79,1+6,5

Примечание: указан процент лизирующихся клеток, средний из 20 фото (полей зрения).

CytlA лизирует и клетки некоторых мицелиальных грибов (рис. 6).

1) 2)

Рис. 6. Лизис Verticillium lateriticum под влиянием CytlA белка. I) - контроль; 2-опыт -образование кольцевых мембранных структур, разрушение участков клеточных стенок (отмечено стрелками).

Антибиотическое действие CytlA на архей.

Археи имеют уникальное строение как КС, так и ЦМ (Howland, 2000; Beveridge, Schultze-Lam, 1996). Полифункциональные белки рД-Л и Cry оказывают антибиотическое действие на ряд представителей архей, приводящее к лизису их клеток (Завалова и др., 2010; Юдина и др., 2004; Yudina et al„ 2007). Археи Methanosarcina barken оказались чувствительны к антибиотическому влиянию и Cyt 1А белка. Вид срезов этих клеток в ТЭМ представлен на рис.

в ТЭМ: 2) - контроль, срез конгломерата клеток; 3) - вид лизирующегося под влиянием

CytlA (50 мкг/мл, 1 ч) конгломерата клеток; 4 - 6) - вид отдельных лизирующихся под действием CytlA клеток архея.

Исследование влияния CytlA белка на клетки Грам-отрицательных бактерий.

Мы исследовали действие CytlA на представителей семейства энтеробактерий -Xenorhabdus bovienii, являющихся симбионтами почвенных энтомопатогенных нематод, откуца мы их выделили и определили видовую принадлежность. Для диссоциантов 1 фазы X. bovienii МИК CytlA для X. bovienii составляет 12 мкг/мл.

Изучение картины лизиса клеток Xenorhabdus с помощью ТЭМ выявило просветление цитоплазмы, нарушение структуры клеточных оболочек, выход внутриклеточного содержимого после 1 часа лизиса клеток под влиянием раствора CytlA (Рис. 8). Описанные признаки свидетельствуют о нарушении проницаемости цитоплазматической мембраны (наружной и внутренней), а также о разрушении клеточной стенки, приводящим к осмотическому лизису клеток под влиянием CytlA.

Л ««А

А*- *

kß>" щ,; Зрв^1"

1

2)

3)

WS?

W,

шм

\

5)

6)

Рис. 8. Вид клеток ХепогИаЬЛиэ Бр. 1 фазы в СЭМ (1 - контроль, виден белковый кристалл снаружи клетки) и ТЭМ (2 - контроль, виден белковый кристалл внутри клетки); вид клеток, лизирующихся под действием Су1-белка из параспоральных кристаллов В. ¡кипп&гпх'я Бэр кгас/вкц (50 мкг/мл, 1 ч): 3 -разбухание клетки, нарушение её внутреннего содержимого за счёт разрушения клеточной стенки и нарушения проницаемости мембран, 4, 5 - лизис клеток, впячивание цитоплазматичекой мембраны, образование из неё кольцевых мембранных структур; 6 - разрыв остатков оболочек клетки и выход белкового кристалла. Видны кольцевые остатки мембран лизировавшихся клеток..

Исследование антибиотического влияния CytlA белка на клетки Грам-положительных бактерий при различных условиях их культивирования.

Ранее было установлено антибиотическое влияние CytlA на Micrococcus luteus (Yudina et al.,

2003), затем - на кишечную палочку и стрептококка (Cahan et al., 2008). Картина лизиса под влиянием CytlA клеток микрококков в ТЭМ, в общем, сходна с изученной ранее картиной лизиса микрококков под влиянием различных Cry белков (Юдина, Егоров, 1996; Юдина и др., 1996; Yudina et al., 2003). CytlA также приводит к разрежению пептидогликана клеточной стенки, отхождению его слоев, осмотическому разбуханию клеток за счёт нарушения проницаемости их цитоплазматической мембраны, нарушению их внутреннего содержимого, иногда - к образованию кольцевых мембранных структур. Однако, лизис микрококков под влиянием CytlA белка проходит в 2 - 5 раз более интенсивнее, чем под влиянием исследованных ранее Cry белков (рис. 9).

4) 5) 6)

Р

Рис. 9. Вид в ТЭМ и СЭМ начала лизиса клеток микрококков под влиянием СуИ А (20 мкг/мл, 10 мин). Верхний ряд - контроль, нижний ряд - видно нарушение поверхности клеток, их слипание, разрушение клеточных стенок, разрежение цитоплазмы из-за нарушения проницаемости ЦМ. Это указывает на связывание СуИ с КС и его активность по отношению к КС и ЦМ.

> IV

> •

W II р. ' щ

¿ш

Щ 4 * % »

ф~ Ф i

psT : W

т

sí,

1) 2) 3)

Рис. 10. Вид в ТЭМ лизиса клеток М. 1и1еш под влиянием СуОА (20 мкг/мл, 30 мин.). Видно разрушение клеточных стенок, разрежение цитоплазмы, осмотический лизис, наличие кольцевых

мембран внутри лизирующихся клеток.

Полифункциональные белки кристаллов (особенно в случае, когда они синтезируются трансгенными растениями), могут попадать in vivo в инкубационные условия, различающиеся составом ионов и других компонентов (разные ткани растений, организмы животных и другие составляющие почвенных биоценозов), которые способны изменять активность этих белков и их компонентов. Поэтому сравнение антибиотического эффекта белков кристаллов мы проводили, выращивая тест-микроорганизмы на средах разного состава (табл.6). Кроме того, такие различающая условия оказывают влияние на рост тест-культур и чувствительность их к антибиотическому действию белков. Действительно, соли, содержащиеся в среде №1, способствуют более активному проявлению антимикробного действия белков кристаллов, чем солевой состав среды №2. Так, активность CytlA в этой среде в полтора раза меньше чем в среде № 1 (а) (Табл .6).

Таблица 6.

Чувствительность клеток М. luíeus, растущих на различных питательных средах,

Активность CytlA, ед., при росте M. luteus на средах №:

1(а) 1(6) 1(в) Кд)2 1(е) 1(г)' 1(ж) 2(6) 3(а) 3(6) 3(в)

25,9 22,7 20,1 24,0 17,1 23,1' 0,54 17,3 7,3 11,72 19,33

культуры, зоны подавления роста проявлялись, но не четко;3рост удовлетворительной интенсивности; рост средней интенсивности, зоны подавления роста не проявлялись.

Увеличение концентрации добавленного в среду NaCl до 1,25 M (5%) (среда №1(е)) приводило к уменьшению активности CytlA в 1,5 раза. Добавление в контрольную среду вместо триптозного бульона 2% глюкозы (среда №1(г)) привело к замедленному росту газона тест-культуры, на котором только примерно через 5 сут. появляются зоны подавления роста, сравнимые с таковыми на контрольной №1(6) среде. Важность солевого состава среды №1(6) для проявления антибактериального действия белков кристаллов особенно наглядно доказывается, если выращивать микрококки на водопроводной воде с таким же количеством триптозного агара (среда №3(а)). В этом случае, несмотря на рост клеток, Су11Абелок проявлял свою активность примерно втрое слабее, чем на других средах.

Таким образом, чувствительность микрококков к антибиотическому действию CytlA в меньшей степени зависит от состава питательных сред, чем к CryllA (что было исследовано ранее). С другой стороны, полученные данные указывают на существенное значение осмолярности сред для проявления антимикробной активности белков: крупная трёхдоменная молекула CryllA (70 кДа) более выраженно изменяет свою антимикробную активность в разных инкубационных средах, в отличие от CytlA (28 кДа).

CytlA оказывает антибиотическое влияние, приводящее к лизису не только клеток микрококков - частых обитателей филлопланы, но и типичных обитателей почв -стрептомицетов.

CytlA приводил к эффективному разрушению клеток и поверхностных спор стрептомицетов Streptomyces chrysomallus (табл.7). Такие споры в 2 - 6 раз устойчивее к антибиотическому действию изученных белков, чем клетки. Стрептомицеты интенсивно росли также на среде №4(а), однако, антибиотическая активность CytlA проявлялась слабо. Замена в среде №4(а) глицерина на трипказин (№4 (б)) способствовала интенсивному росту

стрептомицета и проявлению антибиотической активности белка, однако, меньшей, чем на среде Чапека. МИК СуНА для стрептомицета на среде Чапека составила около 12 мкг/мл.

Таблица 7.

Сравнение антибактериальной активности СуИА по отношению к клеткам и поверхностным спорам З^ерМтуогэ сИгухотаИих, растущим на различных питательных средах._______

Белок Активность, ед.

Среда №2 Среда№4(б) Среда№4(а)

споры клетки споры клетки споры клетки

CytlA 9,1 ±0,8 21,4 ±2,1 3,4 ± 0,4 6,5 ±0,5 0,5 ±0,1 1,9 ±0,3

1) 2)

Рис. 11. Лизис Streptoniyces citrofluorescens под влиянием CytlA. 1) - контроль, 2) опыт.

Следовательно, CytlA проявляет выраженную антибиотическую активность по отношению к микрококкам и стрептомнцетам — типичным обитателям филлопланы, ризопланы и почв.

Таким образом, состав сред, на которых выращиваются тест-микроорганизмы, а также состав инкубационной среды, в которой находятся белки кристаллов, оказывает существенное влияние на проявление их активности, а также на чувствительность тест-микроорганизмов к антибиотическому действию белков. CytlA оказывает антимикробный эффект на клетки ряда грамположительных бактерий - типичных обитателей почв, обычно, в общем сходный с эффектом Cry-белков, но в 2 - 5 раз более интенсивный. Минеральные, а также органические компоненты биоценозов оказывают существенное влияние на проявление антимикробной активности Cyt, и особенно - Cry белков. В различных участках почвенных биоценозов соотношение таких белков и их фрагментов различается. Поэтому белки параспоральных кристаллов В. thuringiensis, в значительных количествах синтезируемые трансгенными растениями, вероятно, способны негативно влиять на микробоценозы почв и на некоторых беспозвоночных - почвенных обитателей, симбионтами которых являются прокариоты, чувствительные к Cry и Cyt-белкам.

Определение антимикробного действия СгуЗА in vivo.

Ранее антимикробную активность множества белков параспоральных кристаллов В. thuringiensis изучали in vitro (Юдина и др., 1988. 1996, 1997; Yudina et al., 2003, 2007,2011). Было показано при культивировании тест-культур в жидких и на твёрдых средах, а также с помощью электронно-микроскопических методов, что Ciy белки параспоральных включений Bt оказывают

17

антибиотическое действие на ряд прокариот, в том числе - на клостридий, различные виды которых могут быть как свободно живущими обитателями почв, так и симбионтами кишечника животных (Юдина, 2006; Yudina et al., 2007).

В данной работе мы подтвердили in vivo, что такая чувствительность есть и у клостридий, обитающих в кишечнике личинок насекомых. В качестве модели исследовали влияние Ciy3A белка, образующего параспоральные кристаллы у бактерий В. thuringiensis subsp. tenebrionis, токсичного для личинок мучного хрущака Tenebrio molitor, на клостридий, обитающих в средней кишке этих личинок. Количественный учёт выросших через сутки клеток показал, что в опыте число клеток было в 150 раз меньше, чем в контроле, значит, в посевном материале опыта было значительно меньше спор, чем в контрольном. В контроле выросло за сутки на селективной среде для клостридий (5,7х109) клеток многообразной морфологии, а в опыте - только (3,8х107), так как клетки клостридий - симбионтов погибли в результате антибиотического влияния СгуЗА белка. В опыте проросли клетки только из оставшихся спор. При СЭМ выросших анаэробов установлено, что в контроле морфология клеток, выросших на селективной среде для клостридий, была более разнообразна, чем в опыте. Выросшие клетки были чувствительны к антибиотическому действию Cyt белка и рД-Л . Кроме того, только из погибших личинок с помощью метода ацетатной селекции нам удалось выделить культуру В. thuringiensis subsp. tenebrionis. Количество кристаллообразующих бацилл, выделенных из средней кишки погибших личинок, составило 5,2x10 /мл. СЭМ показала, что выделенная культура - это В. thuringiensis subsp. tenebrionis, что определили по характерной форме параспоральных кристаллов. В средней кишке контрольных личинок бациллы, причём, не кристаллообразующие, находились в небольшом количестве -(0,2x10 /мл). В муке обнаружили мало бацилл - 5/мл, некристаллообразующих. Проведённые in vivo эксперименты дают основание полагать, что in vivo полифункциональный СгуЗА привёл к гибели личинок благодаря своей высокоспецифичной инсектицидной активности и способствовал преимущественному развитию в них из спор подвида tenebrionis популяций этих бактерий благодаря своей антимикробной активности. Именно эти две способности полифункциональных белков Bt определяют их основную экологическую роль - создавать благоприятные условия для развития из спор молодых дочерних популяций, обеспечивая их питанием в новых экологических нишах и защищая от микроорганизмов-конкурентов при завоевании таких ниш (Юдина, 2006; Yudina et al., 2007).

Фибриллы на поверхности параспоральных кристаллов В. thuringiensis

ТЭМ позволила нам обнаружить фибриллы на поверхности кристаллов разных подвидов В. thuringiensis, о чём ранее сведений в литературе нет (рис. 12-14).

Важно отметить, что Cyt и Сгу белки могут формировать общие белковые включения (см. рис.14, 1), что описано многими исследователями (Tarn, Fitz-James, 1986; Federici, 2005). Большинство кристаллов В. thuringiensis, как известно, содержит несколько разных Сгу белков (Cnckmore, 2013). Из этого можно предположить, что фибриллы также могут формироваться разными белками, из которых состоят включения одного подвида В. thuringiensis.

Наибольшее количество фибрилл наблюдали вокруг кристаллов В. thuringiensis subsp. amagiensis, серотип Н29 (рис. 15).

Рис. 15. Кристаллы В. 1Иигт§1еп$1з эиЬзр. amagiensis. 1) кристалл и спора, соединённые выростами споры и фибриллами кристалла, 2) два кристалла, соединённые фибриллами, 3) кристалл с фибриллами.

ш*

1 Mm

-> •4' -Л

2)

5)

6)

Л

4)

! Ш

i. Р

7)

Рис. 14. ТЭМ кристаллов В. thuringiensis subsp. israelensis (1 -3) и В. thuringiensis subsp. kurstaki (4 - 7). 1) Срез клетки Bti с кристаллами из разных белков (Tarn, Fitz-James, 1986); 2)

спора и кристаллы ВЦ, 3) часть кристалла ВП с отходящими от него фибриллами; 4) споры и кристалл йг кнЫаЫ; 5-7) кристалл с отходящими от него фибриллами.

Важно отметить, что фибриллы вокруг кристаллов имеют разную толщину, степень их упорядоченности самая высокая вблизи кристалла. На рис. 16 представлены фибриллы разной степени упорядоченности. Вид этих фибрилл очень похож на вид амилоидных фибрилл, образуемых разными белками, представленный во множестве публикаций (ЗсгоссЫ е1 а1 2003' К11з5оп,2004; Ка1еЬша е1 а1„ 2008). Взаимодействие фибрилл с красителем Конш красным наблюдается в поляризационно-интерференционном микроскопе (фото в диссертации) в виде зелёного окрашивания, что считается диагностическим тестом на присутствие амилоидных фибрилл. (№1ззоп, 2004).

Й

ШЗР

У.?- '""J"* '

* ' Ч"' > Ш

4)

5)

Рис.16. Фибриллы разной степени упорядоченности, окружающие кристаллы В. thuringiensis .

Полифункциональность белков кристаллов В. thuringiensis, их антимикробная активность, наличие нескольких активных доменов в молекуле и другие свойства, а также полученные нами данные, дают основание считать, что белки кристаллов В. thuringiensist амилоидогенны, способны к образованию фибрилл. Может быть, фибриллы участвуют в формировании кристаллов (это предположение требует исследований).

Наличие фибрилл имеет положительное экологическое значение. Благодаря фибриллам кристаллы легче адсорбируются на разных поверхностях, соединяются между собой и со спорами, что необходимо для оптимального выполнения их биологических функций. Кроме того, амилоидным фибриллам разных белков присуща цитотокичность, они индуцируют агглютинацию бактерий (Torrent et al„ 2012) - значит, кристаллы ещё до своего растворения в кишечнике чувствительных беспозвоночных начинают выполнять свою мембранотропную функцию, нарушая, во-первых, проницаемость ЦМ клеток жертвы, а также могут связываться с КС конкурентных Bt микроорганизмов кишечника, разрушая её и нарушая проницаемость ЦМ,

что приводит к гибели этих микроорганизмов.

Мы определили, что кристаллы В. thuringiensis subsp. amagiensis состоят из белков с мол. массами 52,5 кДа (главная полоса), 43 кДа и 28 кДа (ЭФ в ПААГ в диссертации). Ранее данные о белках кристаллов этого подвида не были опубликованы, что указывается в каталоге белков кристаллов В. thuringiensis (Crickmore, 2013 http://www.biols.susx.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/) Уникальные белки кристаллов В. thuringiensis subsp. amagiensis проявляют самую высокую антибактериальную активность среди всех других изученных белков кристаллов В. thuringiensis (Юдина, 2006).

Влияние условий инкубирования на антибиотическую активность белков параспоральных кристаллов В. thuringiensis.

При изучении механизмов антимикробного действия АМБП необходимо исследование их влияния не только на ЦМ, но и на КС. Ранее было установлено, что разные препараты КС и некоторые их компоненты, добавленные к инкубационной среде, стимулируют антибиотическую активность Сгу9А белка (Yudina et al., 2007). Мы продолжили эти исследования с целью установить причину данного явления. Белки СгуЗА и CytlA усиливают свой антибактериальный эффект, если предварительно (перед внесением в лунки в агаризованной среде с тест-культурой) их инкубируют 1,5 - 3 ч в среде с коммерческим препаратом КС Micrococcus luteus, а также - с Ы-ацетил-О-галактозамином (GalNAc). Прединкубация белков с обоими этими компонентами дополнительно увеличивает антибактериальное действие в несколько (2 - 6) раз, то есть, оказывает синергический эффект (табл. 8, 9).

Табл. 8.

Влияние N-ацетил-О-галактозамина и препарата КС Micrococcus luteus на

Вариант опыта Антибактериальная активность, уд. ед.

СгуЗА (контроль, К) 1,2 ±0,1

К + КС М. luteus 3,0±0,4

К + GalNAc 3,9±0,3

К + КСМ. luteus+ GalNAc 21,1±1,9

Примечание. Во всех вариантах опыта концентрация белка 20 мкг/мл , концентрация добавленного компонента 50 мкг/мл, они не проявляют антибиотическую активность.

Табл.9.

Влияние GalNAc и препарата КС М. luteus на антибактериальную активность CytlA по отношению к Streptomyces citrofluorescens.

Вариант опыта Антибактериальная активность, уд. ед.

CytlA (контроль, К) 2,5 ±0,3

К + КС М. luteus 5,1±0,6

К + GalNAc 6,3±0,7

К + К СМ. luteus+ GalNAc 16,8±1,8

Примечание. Во всех вариантах опыта концентрация белка 15 мкг/мл, концентрация добавленного компонента 50 мкг/мл, они не проявляют антибиотическую активность.

Мы исследовали с помощью ТЭМ структурированность инкубационной среды (СгуЗА + КС М. 1шеи$+ Са1ЫАс) и обнаружили, что белки кристаллов образовали фибриллы (рис. 17).

1) 2) Рис. 17. Вид в ТЭМ инкубационной среды (белок СгуЗА + КС М. 1шеил+ Оа1ЫАс) через 2 сут после опыта: слева - контроль, раствор СгуЗА; справа - опытная инкубационная среда с СгуЗА, видны фибриллы.

Таким образом, проведённые исследования дают основание предполагать, что КС М. Шею и Оа1ЫАс, а в ещё большей степени - их смесь, с которыми прединкубируют белки кристаллов перед опытом, активируют процессы образования амилоидных фибрилл белками кристаллов В1. Как установлено для разных белков, амилоидные агрегаты проявляют большую цитотоксичность, чем олигомеры, хотя механизм этого явления пока не установлен (ОЬагйуап е! а!., 2007). Это и является, по-видимому, основной причиной возрастания антибактериальной активности белков кристаллов, прединкубировавшихся с КС или некоторыми её компонентами.

Мы также исследовали влияние экзогенных биогенных аминов серотонина и дофамина,

добавленных к инкубационной среде с СгуЗА белком, на его антибактериальное действие (Табл.10).

Таблица 10.

Влияние серотонина и дофамина на антибактериальную активность СгуЗА белка отношению к Streptomyces citrofluorescens.

Растворы, добавленные к инкубационной смеси до концентрации: Антибактериальная активность, уд. ед

Контроль 0,05М Трис-HCl (рН 8,6) (I) 20,7±2,1

1 + Cry ЗА до 35мкг/мл (11) 1,9± 0,2

I + дофамин до 2 мкг/мл 21,5±2,4

11 + дофамин до 2 мкг/мл 2,6±0,2

I + серотонин до 2 мкг/мл 21,1±2,3

II + серотонин до 2 мкг/мл 18,7±1,3

Серотонин, в отличие от КС и некоторых её компонентов, ослабляет антибактериальный эффект СгуЗА, а дофамин практически не оказывает на него влияния. По-видимому, серотонин уменьшает проницаемость клеточных оболочек, и, таким образом, существенно ослабляет антибиотическое действие СгуЗА. Также возможно, что серотонин связывается с теми же участками на клеточной оболочке, с которыми должен был бы связываться и СгуЗА, закрывая белку к ним доступ. Проницаемость клеточных оболочек под влиянием дофамина в использованных концентрациях не изменяется, в отличие от влияния серотонина. Дофамин, как и серотонин, немного усиливает интенсивность роста тест-культур на газоне.

Синергизм антибактериального действия CytlA и рД-Л1 определили, исследуя влияние каждого из этих белков, а также их смеси, на Kokuria rosea (табл. 11).

22

Табл. 11.

Синергизм антибактериального действия CytlA и рД-JIt.

Вариант опыта Антибактериальная активность, уд. ед., по отношению к Kokuria rosea

CytlA, 20 мкг/мл 27,5 ±3,6

рД-Л1, 20 мкг/мл 7,1 ±0,7

CytlA+ рД-Л1, 20 мкг/мл 120,7±U,9

Смоделированные варианты инкубационных сред могут возникать и in vivo, т.к. в организме чувствительного животного есть как биогенные амины, так и клетки многих прокариот. Поэтому такие опыты представляют собой частичный анализ реакций иммунного ответа на цитотоксические полифункциональные АМБП.

ВЫВОДЫ.

1. Проведено сравнительное исследование антимикробного действия двух форм рекомбинантного белка Дестабипазы-Лизоцима (рД-Л и рД-Л1) на аэробные и анаэробные бактерии и на микроскопические грибы. Показано, что рД-Л1, лишённый мурамидазной активности, оказывает больший антибиотический эффект на Грам-отрицательные бактерии, а также на грибы, чем нативный рД-Л. Усиление антифунгальной активности лизоцима, лишённого мурамидазной активности, установлено впервые.

2. Изучено антибиотическое влияние CytlA белка из параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, рД-Л и рД-Л1 на выделенных из энтомопатогенных нематод бактерий-симбионтов Xenorhabdus bovienii.

3). Проявление антибиотической активности CytlA белка зависит от состава сред для роста тест-микроорганизмов, но - в меньшей степени, чем установленная ранее таковая зависимость для Cry белков.

4) Впервые показано in vivo, что антимикробная активность СгуЗА В. thuringiensis ssp. tenebrionis, приводит к гибели значительного количества клостридий-симбионтов в средней кишке мучного хрущака Tenebrio molilor. Эти клостридии чувствительны также к антибиотическому влиянию рД-Л и CytlA.

5). Впервые на поверхности кристаллов трёх изученных подвидов В. thuringiensis обнаружены амилоидные фибриллы. Больше всего фибрилл на поверхности кристаллов В. thuringiensis ssp. amagiensis, состоящих из белков, молекулярная масса которых, ранее неизвестная, определена элекгрофоретически.

6). Препарат бактериальных клеточных стенок и GalNAc, с которыми прединкубируют белки кристаллов перед определением их антибактериальной активности, активируют образование амилоидных фибрилл белками В. thuringiensis. Сделано предположение, что это является, по-видимому, основной причиной возрастания антибактериальной активности белков кристаллов, прединкубировавшихся с КС или некоторыми её компонентами. Смесь КС и некоторых её компонентов оказывает синергический эффект, многократно усиливая активность белков кристаллов.

7). Биогенные амины, добавленные к инкубационной среде, влияют на антибиотический

эффект СгуЗ А: серотонин его ослабляет, а дофамин практически не влияет. 8). Смесь полифункциональных белков CytIA и рД-JIt проявляет значительно большую антибактериальную активность, чем каждый отдельный этот белок (синергический эффект). Смоделирован in vitro анализ некоторых реакций иммунного ответа на цитотоксические полифункциональные АМБП.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Юдина Т.Г., Залупим И.А., Кирсанова Л.А., Го Даньян. Булушова Н.В., Нетрусов А.И.

Сравнение антимикробного действия Cyt, Cry белков Bacillus thuringiensis и их фрагментов // Бюлл. МОИП. Отд . Биологический, 2009. Т. 114, Прил.1, 4.2, С. 516-522.

2. Т.Г. Юдина, Го Даньян. А.И. Нетрусов. Антибиотическое влияние 5-эндотоксинов Bacillus thuringiensis на бактерии и дрожжи // Сборник «Актуальные проблемы биологической безопасности», посвященный 300-летию со дня рождения М.В.Ломоносова. Брянск, 2011. С.154-162.

3. T.GYudina, I.A. Zalunin, А.Р. Zarubina, Danyang Guo. N.S. Shepeleva, S.E. Spiridonov Antimicrobial activity of protein inclusions from bacteria symbiotic with entomopathogenic nematodes. Russian Journal of Hematology, 2011. 19(2), P.181-188.

4. T.G. Yudina, LA. Zalunin, Danyang Guo. A.I. Netrusov. The influence of bacterial cell walls preparations and some of their components on antibiotic activity of Cryl A proteins from Bacillus thuringiensis. ISTEC-2011, Istanbul. The proceedings book, 2011. P. 812 - 817.

5. T. G Yudina, Danyang Guo. N. F. Piskunkova, I. B. Pavlova, L. L. Zavalova, I. P. Baskova. Antifungal and antibacterial functions of medicinal leech recombinant destabilase-lysozyme and its heated-up derivative. Frontiers of Chemical Science and Engineering. 2012. 6(2), P. 203-209.

6. Го Даньян, Павлова И.Б. Сравнение антибиотического действия секрета слюнных клеток медицинской пиявки и фермента дестабилазы-лизоцима, входящего в состав этого секрета // Медицинский академический журнал. Приложение. Санкт- Петербург, 2012. С. 485-486.

Тезисы конференций:

1. Го Даньян. Юдина Т.Г., Залупим И.А.,Жужиков Д.П., Лютикова Л.И., Нетрусов А.И.

Антибактериальный эффект СгуЗА белка кристаллов Bacillus thuringiensis in vivo в кишечнике личинок Tenebrio Molitor И Материалы всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» М:МАКС Пресс, 2009. С.56.

2. Го—Даньян, Юдина Т.Г., Нетрусов А.И. Морфологические изменения клеток микроорганизмов, лизирующихся под влиянием белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis // Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» М:МАКС Пресс, 2010. С.32

3. Го Даньян. Залунин И.А., Пискункова Н.Ф., Юдина Т.Г., Нетрусов А.И., Егоров Н.С. Антибиотическое действие CytlA-белка из параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis subsp. israelensis на микроскопические грибы // Материалы всероссийского симпозиума с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов». Москва, 2011. С.32

4. Danyang Guo. L.L. Zavalova, N.F. Piskunkova, T.G Yudina, I.P. Baskova. The effect of heat-denaturation of recombinant Destabilase-Lysozyme from medicinal leech on its antifungial and antibacterial functions. Asian Congress on Biotechnology. Shanghai, 2011. P.245

5. Го Даньян. Н.С.Шепелева. Влияние инсектицидных белков Bacillus thuringiensis на бактерий-симбионтов энтомопатогенных нематод // Материалы VII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2011. С.98-100

6. Clio Danyang. Yudina T.G., Netrusov A.I. Morphological changes in the Prokaryotes lysed by protein in crystal-like inclusions of Bacillus thuringiensis (in Chinese). Fourteenth National Conference on Environmental Microbiology. Xiamen, The proceedings book, 2011. P.308.

7. Т.Г. Юдина, Го Даньян. И.Б. Павлова, И.П. Баскова. Чувствительность стрептомицетов к антибиотическому действию секрета слюнных клеток медицинской пиявки //' Тезисы докл. Съезда микробиологов Узбекистана. Ташкент, Секция 3, 2012. С. 140 - 141.

8. Т.Г. Юдина, Го Даньян. И.Б. Павлова, В.Н. Лазарев, ЛЛ. Завалова, И.П. Баскова. Антимикробное действие секрета слюнных клеток медицинской пиявки, рекомбинантного дестабилазы-лизоцима и его мутантных форм // Материалы Мсждунар. Конф. Ассоциации гирудологов 2012. Харьков, 2012. С. 59 — 60.

9. Го Даньян. Антибактериальная активность двух форм перспективного лекарственного препарата - рекомбинантной дестабилазы-лизоцима из медицинской пиявки // Тезисы докл. Секции «Биология» XIX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012». Москва, 2012. С.168.

10. Guo Danyang. T.G Yudina, I.B. Pavlova, A.I. Shestakov, A.I. Netrosov, I.P. Baskova. Development and Application of Novel Thrombolytic and Antimicrobial Agent and Probiotic Preparations (in Chinese.) The 15111 Guangzhou Convention of Oversea Chinese Scholars in Science and Technology ("OCS"). Guangzhou, The proceedings book, 2012. P.3I7.

11. Го Даньян. Павлова И.Б. Сравнение антифунгального эффекта секрета слюнных клеток медицинской пиявки и его компонента - рекомбинантного фермента «дестабилазы-лизоцима» // Тезисы докл. Секции «Биология» XX международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013». Москва, 2013. С. 190-191.

Автор благодарит коллег, оказавших большую помощь в работе: И.А. Залунина, Г.Г. Честухину,

Н.В. Булушову (ГОСНИИГенетика), Л.Л. Завалову (Институт биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН), В.Н. Лазарева (ФГУ НИИ ФХМ

ФМБА), а также всех сотрудников кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Подписано в печать 17.05.2013 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1319 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Го Даньян, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Биологический факультет Кафедра микробиологии

На правах рукописи

04201353080

Го Даньян

АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

03.02.03- микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Юдина Татьяна Георгиевна

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Баскова Изольда Парфирьевна

Москва-2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМБП - антимикробные белки и пептиды;

АМП - антимикробные пептиды;

Д-Л - дестабилаза-лизоцим из медицинской пиявки;

рД-Л - рекомбинантная дестабилаза-лизоцим;

рД-Л1° - прогретая рД-Л, лишённая мурамидазной активности;

КС - клеточная стенка;

ЛПС - липополисахарид

ПГ - пептидогликан;

ПФБ - полифункциональные белки;

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия (или сканирующий электронный микроскоп);

ТЭМ - просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия (или просвечивающий электронный микроскоп). ЦМ - цитоплазматическая мембрана; Са1ЫАс - Ы-ацетил-О-галактозамин;

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Введение

Многим белкам свойственна полифункциональность, то есть, способность проявлять не одну, а две или более разных активностей, причем, с помощью различных механизмов. Особый интерес вызывают полифункциональные белки, одна из активностей которых - антимикробная. В настоящее время проводятся многосторонние исследования антимикробного действия множества белков и пептидов. Среди полифункциональных белков, проявляющих такую активность - ферменты, токсины, белки врождённой иммунной системы. Значительный интерес исследователей вызывают две группы полифункциональных антимикробных белков.

Во-первых, это белки, образующие параспоральные включения энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis:

а) Cry-белки, молекулы которых могут по-разному проявлять свою биологическую активность в зависимости от клеток - мишеней: высокоспецифично разрушать клетки чувствительных беспозвоночных, связываясь с рецепторами на мембранах клеток их средней кишки, и с меньшей специфичностью оказывать антимикробный эффект, для чего они должны приводить к разрушению клеточных стенок микроорганизмов и проявлять мембранотропную активность, подобно многим антимикробным белкам и пептидам;

б) Cyt белки, которые также полифункциональны, так как проявляют неспецифическую инсектицидную, гемолитическую, антимикробную активности, в последнем случае они способны разрушать клетки микроорганизмов и нарушать проницаемость цитоплазматических мембран, как многие антимикробные белки и пептиды.

Актуальность изучения антимикробной активности 5-эндотоксинов В. thuringiensis намного возросла в связи с введением с/у-генов в растения для

защиты последних от вредных насекомых. При этом большое количество таких белков, синтезируемых всеми частями генетически модифицированных растений, может накапливаться как в самих растениях, так и в почвах, и влиять на биоценозы.

Во-вторых, это фермент - представитель лизоцимов беспозвоночных животных: рекомбинантная дестабилаза-лизоцим (рД-JT) из медицинской пиявки, проявляющая гликозидазную, и мурамидазную, эндо-изопептидазную активности, а также неферментативную антимикробную активность. Проводили сравнительное изучение антимикробной активности этого белка и его модифицированной формы, лишённой мурамидазной активности в результате прогревания рД-Л (90 С, 50 мин.).

Лизоцимы - конститутивные белки врождённой иммунной системы, они участвуют в иммунном ответе животных в ответ на воздействие токсинов. Поэтому при попадании токсинов (в том числе — 5-эндотоксинов В. thuringiensis) в насекомое у последнего возникает иммунный ответ, в котором участвуют и лизоцимы, наряду со многими другими белками и пептидами. В этот период вышеуказанные токсины и лизоцимы могут взаимодействовать. Такие процессы представляют несомненный интерес для понимания экологической роли этих белков, их влияния на факторы врождённого иммунитета и на развитие инфекции. Принципиальные этапы таких процессов можно смоделировать in vitro, первым шагом при этом является изучение антимикробных эффектов Cyt, Cry белков, а также лизоцимов. Поэтому сравнительное изучение особенностей антимикробного действия полифункциональных белков из параспоральных кристаллов В. thuringiensis и рД-Л из медицинской пиявки актуально, имеет большую теоретическую и практическую значимость.

2. Общая характеристика полифункциональных белков с антимикробной активностью.

Многим белкам свойственна полифункциональность, то есть, способность проявлять не одну, а две или более разных активностей, причем, с помощью различных механизмов. Вызывают интерес полифункциональные белки (ПФБ), одна из активностей которых - антимикробная, причём, часто обусловленная, прежде всего, нарушением проницаемости ЦМ. Такое нарушение является ключевым (но не единственным) в механизме гибели клеток. Среди ПФБ известны ферменты, токсины, много белков врождённой иммунной системы животных, белки растений, микроорганизмов. В качестве примеров можно привести белки азотфиксирующей бактерии Bacillus polymyxa, проявляющие активность протеаз, лектинов, бактерицидную и ряд других (Карпунина и др., 2003; Мельникова и др., 2001); многие порообразующие белки - токсины, проявляющие и антимикробную активность (Андреева-Ковалевская и др., 2008), некоторые полифункциональные ферменты, например, РНК-азы (Torrent et al., 2007 -2012).

Особенно много ПФБ с антимикробной активностью среди компонентов врождённой (самой древней) иммунной системы. Это как крупные белки, так и более мелкие антимикробные пептиды (АМП) из эпителиальных тканей, биологических жидкостей, фагоцитов и других источников. Некоторые из них синтезируются постоянно (конститутивны, как, например, лизоцим), синтез других индуцибелен в ответ на проникновение в организм чужеродных белков, на инфекцию. Основные пути ответа беспозвоночных животных на проникновение чужеродных белков, а, главное - патогенных микроорганизмов (врождённый иммунитет) сохранились и у позвоночных животных, причём, этот путь может работать как независимо, так и в комплексе с приобретённым иммунитетом (адаптивной иммунной системой). Следует подчеркнуть, что АМП являются не только активными антимикробными компонентами

врождённой иммунной системы, но и играют важную роль в поддержании и регуляции адаптивной иммунной системы.

2.1. Примеры антимикробных белков и пептидов, основные признаки их действия на бактерий.

Приведём некоторые примеры важных ПФБ и АМБП врождённой иммунной системы: белки молока, слюны, плазмы - лактоферрин (мол. м. 80 кДа), а-лактальбумин - белок, сходный с лизоцимом (мол. масса примерно 14 кДа), многие белки эпителия кишечника (Florisa et al., 2003;Van Nieuw et al., 2004). Известно, что при гидролизе таких ПФБ часто выделяются фрагменты, также обладающие антимикробной активностью, причём, часто более высокой, чем у исходных белков. Например, пептид лактоферрицин (25 аминокислотных остатков N-концевой области лактоферрипа) сохраняет большинство протекторных функций нативного лактоферрипа, причём, многие его активности возрастают (Самохина и др., 2012). Такие небольшие пептиды относят к АМП (Becker et al., 2013; Carvalho et al., 2012).

Интересно, что небольшие АМП выделили и из а-меланоцит-стимулирующего гормона, эндогенного нейропептида. Часть этих АМП, состоящих из 6 - 13, 11 - 13 аминокислотных остатков С-концевой части гормона, так же, как и исходный гормон, оказывала бактерицидное действие не только на чувствительных, но и на устойчивых к метициллину стафилококков. Пептиды N-концевой части гормона активности не проявляли. АМБП связывались с КС бактерий, приводя к её морфоголическим изменениям, что показано с помощью электронной микроскопии, а затем деполяризовали ЦМ, нарушали её проницаемость (Singh, Mukhopadhyay, 2011).

В настоящее время известно несколько сотен антимикробных белков и пептидов (АМБП), проявляющих ярко выраженные антимикробные, противоопухолевые, иммуномодулирующие свойства (I-Iuang et al., 2010; Hu, Aroian, 2012). В обзоре мы уделяем больше внимания тем из них, которые

синтезированы на рибосомах, не подвергались посттрансляционной модификации, состоят из L-аминокислот.

Особенно интенсивно изучаются небольшие антимикробные пептиды (АМП). Это амфифильные молекулы, у которых есть ярко выраженные гидрофобный участок, взаимодействующий с липидами ЦМ, и гидрофильный, взаимодействующий с водой (Wiesner, Vilcinskas, 2010). Молекулы АМП, как правило, заряженные положительно, легко взаимодействуют с ЦМ бактерий, заряженной отрицательно, так как она содержит до 25% отрицательно заряженных фосфолипидов и не содержит холестерина, в противоположность ЦМ эукариот, состоящей из цвиттерионных липидов и содержащей до 25% холестерина. Взаимодействие многих АМП с ЦМ не требует наличия рецептора, однако, благодаря своему положительному заряду, АМП связываются с анионными липидами ЦМ, такими, например, как фосфатидилглицерол и кардиолипин, которые широко распространены в микроорганизмах. ЦМ млекопитающих, напротив, состоит главным образом из незаряженных фосфолипидов (фосфатидилхолина, сфингомиелина), что обуславливает слабое влияние многих АМП (кроме тех, которые проявляют высокую гемолитическую активность) на клетки млекопитающих (Dawson, Liu, 2009). Вследствие отсутствия холестерина липидный бислой бактериальных мембран обладает большей текучестью, и образование в нём пор при встраивании АМП происходит легче. Этому способствует и большой отрицательный потенциал на внутренней ЦМ клеток бактерий (Окороченков и др., 2012).

Во вторичной структуре АМП преобладают чаще а-спирали, но бывают и ß-складчатые АМП, все они проявляют амфифильные свойства (Tang, Hong, 2009). Спиральность оказывает большее влияние на активность АМП против эукариотических клеток (например, на гемолитическую активность, свойственную многим АМП), а не на антибактериальную их активность (Окороченков и др., 2012). Более крупные ПФБ также способны к образованию пор в ЦМ (Андреева-Ковалевская и др., 2008).

Таким образом, антимикробная активность ПФБ, некоторых их фрагментов часто, хотя и не всегда, обусловлена влиянием на КС, образованием пор в ЦМ. Мы будем применять в литературном обзоре обобщающее название таких соединений - антимикробные белки и пептиды (АМБП).

Накопилось много примеров того, что во многих случаях гибель бактерий под влиянием АМБП не может быть объяснена только дисфункцией ЦМ, а может являться, например, результатом взаимодействия АМБП с внутриклеточными мишенями (Окороченков и др., 2012). Поэтому проводится изучение разных механизмов антимикробного действия АМБП.

Особую важность представляют исследования влияния АМБП на защитный барьер микробных клеток - КС. Первичный блок связывания с КС - это макромолекулярный комплекс пептидогликан (ПГ), так как его синтез неразрывно связан с целостностью и нормальным функционированием ЦМ (Vollmer, 2008; Vollmer, Bertsche, 2008). Связывание АМБП с поверхностью клетки отражает первую ключевую ступень в механизмах их антимикробного действия. На КС разных микроорганизмов есть определённые мишени для действия АМБП (Yount, Yeaman, 2013). Так, было установлено, что участком первичного связывания АМП лактоферрицина В является тейхоевая кислота в КС Staphylococcus aureus, причём, это необходимо для проявления мембранотропного действия лактоферрицина. Полученные результаты показали, что тейхоевая кислота в КС S. aureus может являться местом первичного связывания АМБП. Липотейхоевая кислота таковой не является, видимо, по причине того, что участки связывания АМБП в этом случае должны были бы находиться внутри КС. Однако, показано, что липотейхоевая кислота может служить промежуточным звеном в транспортировке АМБП от тейхоевой кислоты к ЦМ, на последнюю АМБП оказывают, как известно, разрушающее действие (Vorland et al., 1999).

Исследование роли КС в проявлении антибактериальной активности АМБП описано в цикле работ с ПФБ - РНК-азами 3 и 7, секретируемыми

активированными эозинофилами человека. Кроме ферментативной активности, эти белки, являющиеся частью врождённой иммунной системы, проявляют разнообразные антимикробные свойства против бактерий, вирусов, грибов, простейших, паразитических гельминтов благодаря своей поликатионности и амфипатичности, и поэтому имеют ещё одно название -эозинофильные катионные белки. Их структура содержит три a-спирали и пять [3-слоёв, стабилизирована четырьмя дисульфидными мостиками (Torrent et al., 2007 - 2012). Сравнили влияние обеих РНК-аз на бактериальные КС. Ключевое свойство РНК-азы 3 при действии на поверхность бактерий — её высокая аффинность к липополисахаридам (ЛПС) и способность осаждать клетки кишечной палочки (агглютинирующая активность), нарушая их наружную мембрану. Механизм действия этого АМБП зависит от полисахаридной половины ЛПС (Pulido et al., 2012). РНК-аза 3 способна деполяризовать ЦМ грамотрицательных бактерий значительно быстрее, чем грамположительных. Авторы определили аминокислотные

последовательности в N-концевом гидрофобном домене этого ПФБ, ответственные за способность к агрегации и за антимикробную активность (Navarro et al., 2008). Более высокая аффинность к ПГ проявляется у РНК-азы 7, этот белок нарушает ПГ, а затем и проницаемость ЦМ без их агглютинации. РНК-аза 7 взаимодействует с гетерополисахаридами ПГ, что и приводит к бактерицидному эффекту без предварительной агглютинации быстро лизирующихся клеток. Важно отметить, что при антимикробном действии РНК-аз их ферментативная активность не проявляется, в отличие от некоторых других АМБП - например, лизоцима (Torrent et al., 2008, 2010). РНК-аза 3 легко связывается с гепарином и другими анионными глюкозаминогликанами бактериальной КС, это зависит от её ферментативного каталитического сайта, поэтому последний блокируется при таком связывании. РНК-аза также связывается со структурой ПГ на поверхности клетки, и это является триггером её действия. Интересно выяснить главные структурные детерминанты связывания Сахаров (Torrent et al., 2010).

Таким образом, высокая аффинность связывания с различными структурами КС является первым этапом, обеспечивающим последующее нарушение проницаемости ЦМ и антимикробную активность описываемых АМБП. Были определены различные структурные детерминанты (аминокислотные последовательности), ответственные за различные проявления активности этих белков: например, за связывание с ЦМ, её лизис, связывание с ЛПС и гепарином, агглютинирующую активность наиболее ответственны (1 - 45) аминокислотные остатки, за дестабилизацию ЦМ — (1 — 19) остатки РНК-аз (Boix et al., 2012).

Имеются сведения о взаимодействии АМБП и с разными токсинами (Torrent et al., 2009, 2011).

2.2. Исследование влияния антимикробных белков и пептидов на представителей царства грибов.

Влияние АМБП на вирусы, грибы изучено значительно слабее, чем на бактерий. Мы не будем рассматривать полученные данные о возможных механизмах антивирусной активности АМБП, но кратко укажем основные результаты интенсивно проводящегося в последние годы изучения антигрибной активности АМБП. Различные АМБП приводят к лизису клеток разных грибов (Lam, Nag, 2013; Salazar, Asenjon, 2007; Zhao et al., 2013). Уже известные нам своей высокой антибактериальной активностью лактоферрин и его фрагменты вызывают утечку АТФ из клеток дрожжей Candida albicans и приводят к нарушению функционирования их ЦМ (Окороченков и др., 2012; Weerden et al., 2013). Два близкородственных растительных дефензина оказывают не только антибактериальный, но и антигрибной эффект на ряд дрожжей и мицелиальных грибов, причём, исследователи предполагают, что механизм их действия включает образование активных форм кислорода в чувствительных грибных клетках (Garvey et al., 2013). Дефензин-подобный АМБП выделен из клеток Neosartorya fischeri, он подавляет прорастание конидий Aspergillus niger после гетерологичной экспрессии в этот гриб, и

приводит к гибели последнего по механизму апоптоза (Galgoczy et al., 2013). Небольшой антифунгальный АМБП из Pénicillium chrysogenum ингибирует рост важных мицелиальных грибов - представителей аспергиллов, но не оказывает токсического эффекта на клетки млекопитающих, в связи с чем авторы указывают на возможность его использования в качестве лекарства (Palicz et al., 2013). Мономерный АМБП с мол. массой 9,4 кДа из семян Phaseollis vulgaris подавляет рост мицелия многих грибов, среди которых Helminhtosporium maydis, Rhizoctonia solani, Mycosphaerella arachidicola, Fusarium oxysporium, посредством нарушения проницаемости их ЦМ (Lam, Nag, 2013). Имеется несколько примеров АМБП, активных против грибов, но не против бактерий. Авторы указывают, что механизм их антифунгалыюй активности более сложный, часто включает проникновение в клетку (Weerden , Bleackley, 2013). Белки с �