Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические свойства основных групп белков крови у различных по экологии и таксономическому положению представителей хрящевых, хрящевых ганоидов и костистых рыб

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства основных групп белков крови у различных по экологии и таксономическому положению представителей хрящевых, хрящевых ганоидов и костистых рыб"

од

• Г» уД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ВНУТРЕННИХ ВОД им.И.Д-ПАПАНИНА

На правах рукописи УДК 597.442 -1.05 + 591.111.2

АНДРЕЕВА Алла Михайловна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОСНОВНЫХ ГРУПП БЕЛКОВ КРОВИ У РАЗЛИЧНЫХ ПО ЭКОЛОГИИ И ТАКСОНОМИЧЕСКОМУ ПОЛОЖЕНИЮ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ХРЯЩЕВЫХ, ХРЯЩЕВЫХ ГАНОИДОВ И

КОСТИСТЫХ РЫБ.

Специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Борок-1997

Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им.И ДЛапанина РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.Н.Яковлев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.Г.Новиков доктор биологических наук, профессор В.Р.Микряков

Ведущая организация:

Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН

заседании специализированного совета К 200.02.01 при Институте биологии внутренних вод имИ ДЛапанина РАН, п.Борок.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять в специализированный совет по адресу:

152742, Ярославская область, Некоузский р-н, п/о Борок, ИБВВ РАН им.ИДПапанина РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБВВ РАН.

Автореферат разослан .1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук Л.Г.Корнева

1997 г. в

часов на

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Известно, что возникновение, формирование и развитие целого ряда белков и белковых семейств позвоночных животных происходит у рыб и рыбообразных. При этом основные эволюционные преобразования для большинства белков и их семейств завершаются у рыб, и в последующих классах позвоночных существенных трансформаций уже не наблюдается. Поскольку на начальных этапах эволюции белков отмечается значительное их разнообразие как по структурным, так и по функциональным параметрам, анализ структурных и функциональных особенностей белков в различных таксонах рыбообразных и рыб позволяет подойти к пониманию основных закономерностей их эволюции у позвоночных в целом. Особый интерес представляют исследования по выявлению возможных механизмов, вызывающих наблюдаемые преобразования. С одной стороны, эволюция белков может быть обусловлена собственно организменной эволюцией. При этом наблюдается согласованность прежде всего структурных изменений с филогенезом организмов. С другой стороны, и это касается функциональных свойств белков, определяемых параметрами устойчивости пространственной организации молекул и формирования функциональных центров, изменения могут быть вызваны адаптацией к средовым воздействиям (Шульц, Ширмер, 1982; Хочачка, Сомеро, 1977). Вышесказанное наиболее актуально в отношении белков системы крови, поскольку последняя является специфическим приобретением и характерной чертой всех хордовых животных. Необходимой предпосылкой успешного развития работ в этом направлении должно быть всестороннее изучение структуры и функций основных групп белков крови и их строгая идентификация у рыб. Рыбы и рыбообразные, и в особенности первичные таксоны, к которым относятся хрящевые и хрящевые ганоиды -наиболее удобный и информативный материал при исследовании физико -химических свойств белков. Однако, степень изученности белков крови рыб (за исключением гемоглобина и иммуноглобулина) крайне низкая, особенно в плане анализа их физико - химических характеристик и связи последних с субъединичной структурой.

Цель работы. В ходе настоящего исследования решались следующие задачи: I - идентификация основных групп белков крови различных по экологии и таксономическому положению рыб; II - описание основных структурных и

функциональных преобразований белков; III - анализ закономерностей формирования белковой системы крови рыб; IY - определение роли преобразований структурной организации и физико-химических свойств белков в формировании адаптивной стратегии белковой системы крови рыб.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование практически всех основных высоко- и низкомолекулярных белков сыворотки крови представителей 3 таксонов рыб (хрящевых, хрящевых ганоидов, костистых), различающихся как в таксономическом, так и в экологическом отношении. На основе исследования структуры-и функций идентифицированы основные группы белков крови: альбумины и альбуминоподобные белки, трансферрины, гем-содержащие пероксидазы, гаптоглобины. Впервые обнаружены и описаны пероксидазы и альбуминоподобные белки катрана; аг-нейраминогликопротеин у осетровых; "челнок" - транспортный белок у леща и судака, меняющий параметры молекулярной массы (ММ) и электрофоретической подвижности (Rt) в зависимости от физиологического состояния организма; "быстрый белок* -белок с высоким значением Rf, появляющийся только накануне нереста; показано, что альбумин леща, по всей видимости, состоит из 2 ковалентно связанных субьединиц. Представляется вероятным, что обнаруженная у леща, стерляди и севрюги в зоне подвижности агглобулинов субьединица с ММ около 20 кД может быть структурным аналогом оц-цепи гаптоглобина высших позвоночных, что, в свою очередь, позволяет предположить возможность структурной дупликации гена at - цепи гаптоглобина не у непосредственных предков Homo sapient (Шупьц, Ширмер, 1982), а у хрящевых ганоидов. Впервые показано, что белки крови костистых рыб полифункциональны в отличие от специализированных белков крови хрящевых и хрящевых ганоидов. Выявлены существенные различия молекулярной структуры белков не только между таксонами, но и внутри них, между видами, имеющими различный экологический статус. Анализ структурных и функциональных характеристик и взаимосвязь последних с таксономическим и экологическим статусом позволил установить приспособительный характер Выявленных различий и считать, что изменения структуры исследованных белков имеют адаптивную природу и вызваны влиянием внешних условий и особенностей внутренней среды существования как отдельных представителей, так и таксонов в целом.

Практическое значение. Исследование структуры и физико-химических свойств белков крови и установление эволюционного и экологического значения выявляемых особенностей необходимы для сферы рационального природопользования, в деле охраны генофонда, практики рыборазведения и реинтродукции, при разработке систем контроля и мониторинга. Помимо этого, возможно использование результатов работы в области биотехнологий, связанных с синтезом белков, а также при создании тест-систем клинико-диагностического характера.

Апробация. Основные положения работы докладывались и обсуждались на Конференциях Молодых Ученых (Борок, 1984; 1986), на IX Совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986), i Симпозиуме по экологической биохимии рыб (Ярославль-Ростов, 1987), на ежегодных научных сессиях Института биологии внутренних вод им И Д.Папанина РАН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, 1 находится в печати.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Диссертация изложена на 199 машинописных страницах, содержит 11 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 188 источников, из которых 89 - зарубежных авторов. Приложение содержит 7 таблиц и 13 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Объекты исследования. В основу работы положены результаты изучения белков крови 9 видов рыб (Табл.), представителей 2 ветвей (хрящевые

Таблица. Основные сведения об обьектах исследования.

Вид Кол-во Место лова Время лова

особей

Катран 10 Черное море (г.Батуми) 4.1985, 04.1988

Морская лисица 3 м

Морской кот 2 в

Белуга 60 р.Волга (Волгоградское в/У) 1983-1988

Стерлядь 50 р.Волга (Волгоградское,

Горьковское в/У, Дельта;

р.Волга (Волгоградское в/х)

Русский осетр 50

Севрюга 50

Судак 31 р.Волга (Рыбинское в/х) 19B4-198S

Лещ 204 1983-1988

и костные), 4 отрядов, 6 семейств, 7 родов: катран (Squalus acanthias L.),морская лисица [Raja clavete L.),морской кот (Dasyatis pastinaca L.),русский осетр (Acipenser guldenstadtti Brandt.), стерлядь (A.ruthenus L.),ceBpwra (A.stelíatus Pall.), белуга (Huso huso L.), лещ (Abramls brama L.), судак (Stfzostedion áicioperca L ). В работе использовались половозрелые особи. У всех исследованных рыб определяли вес, длину, пол и стадию зрелости гонад.

Для оценки влияния таксономии и экологии рыб на характеристики белков крови исследовали структуру и функции альбумина, трансферрина (Tf), гаптоглобина (Нр), гем-содержащих пероксидаз, гемоглобина (НЬ) и других белков по следующим параметрам: электрофоретическая подвижность Ri; величина молекулярной массы ММ нативной молекулы и субьединицы (если таковая имеется); определение в структуре молекулы ковалентно связанного с белком углевода; свободных поверхностных и скрытых SH-rpynn (для альбумина); центров специфического (или неспецифического) связывания альбумин-специфического красителя бромкрезолового пурпурного (БКП), синьки Эванса (СЭ) и бромфенолового синего (БФС); связывание белками НЬ и гемина; определение устойчивости глико- и липопротеидных комплексов; Я.макс для Tf; выяснение роли сиаловых кислот в формировании гетерогенности Tf; определение формы и размеров кристаллов НЬ, а также устойчивости НЬ к высаливанию сульфатом аммония.

2. Методы. Пробы крови у крупных рыб отбирали из жаберных сосудов, у мелких - из хвостовых. Кровь собирали в пробирки. Отстоявшуюся сыворотку использовали для получения фракций альбумина, Tf и Нр в течение 1-2 суток, сыворотку хранили в холодильнике при 4°С. Для получения НЬ под струю крови помещали пробирку с необходимым количеством 0.5%-ного раствора гепариноида в физиологическом растворе в качестве антикоагулянта. Эритроциты отмывали 20-25-кратным обьемом физиологического раствора, далее центрифугировали при 3000 обор./мин. 5-7 минут. Эту процедуру повторяли 5-6 раз. Гемолиз эритроцитов осуществляли 5-кратным обьемом дистилированной воды. Осадок удаляли центрифугированием при 8 тыс. обор./мин. в течение 20-30 минут. В работе использовали надосадочную жидкость. Фракционировали белки электрофоретическими, хроматографическими и другими методами. Из электрофоретических методов использовали диск-электрофорез (Davis, 1964; Ornstein, 1964), электрофорез в градиенте

концентраций полиакриламидного геля (ПААГ) (Kopperschlander et at., 1969), и двухмерный электрофорез с мочевиной и без нее (Гааль и др., 1982). Из хроматографических методов - гель-фильтрацию на сефадексе (Детерман, 1970). Также для фракционирования белков крови использовали риванол (Palmour, Sutton. 1971) и сульфат аммония (Кушманова, Ивченко, 1983). После электрофореза проводили специфическое и неспецифическое окрашивание белков красителями, выявляющими различные функциональные группы (Гааль и др., 1982). Чистые белки получали с помощью препаративного электрофореза и электроэлюции (Гааль и др., 1982). Величины ММ нативных молекул определяли в градиенте ПААГ с мочевиной и без нее (Гааль и др., 1982) и гель-фильтрацией на сефадексе G-100 и 200 (Мешкова, Северин, 1979). ММ субьединиц, связанных в белке нековалертно или с помощью S-S-мостиков, определяли в электрофорезе с додецилсульфатом натрия (ДСН) (Weber, Osborn, 1969; Laemmli, 1970). В качестве свидетелей использовали набор белков с известной ММ: бычий сывороточный альбумин БСА (67 кД), овальбумин (45 кД), цитохром С (12 кД), тропонины Т, I, С (38 кД, 24 кД и 18.5 кД соответственно). ДСН-электрофорез применяли и при определении ММ| белкового компонента в неховаленгных комплексах белка с углеводами и лйлидами. Характер связи -ко валентный или нековалентный - определяли обработкой комплекса денатурирующей смесью (мочевина, ДСН, р-меркаптозтанол) и последующим сравнением величин ММ и окрашивания на лиганд (углевод) до и после обработки. SH-группы определяли колориметрически с 5,5'-дитиобис (2-нитробензойной) кислотой (ДТНБ) (Ellman, 1959). Взаимодействие белков с лигандами (красителями и гемином) контролировали спектрофотометрически и электрофоретически. Сиаловые кислоты определяли методом Гесса (Кушманова, Ивченко,1983). Их связь с белком разрывали нейроаминидазой из холерного вибриона активностью 5 единиц.

АНАЛИЗ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКОВ КРОВИ.

1.Структура белков.

1.1. Гемоглобин.

Хрящевые рыбы. Белковая система крови хрящевых рыб формировалась в условиях содержания 0.3-0.4 М мочевины, что и определило ее особенности. В диск-электрофорезе НЬ катрана и морской лисицы имеют 7-8 компонентов (Ri 0.4-0.85), морского кота 10-12 компонентов (Rf 0.4-0.5). Hb катрана представлен

мономерами (13.5-15 кД), димерами (34-36 кД), тетрамерами (66-68 кД) и высокомолекулярным белком; скатов - тетрамерами, димерами, мономерами с ММ 13.5-15.0 кД (морская лисица) и 14.5-16 кД (морской кот). Форма кристаллов - гексагональная с углами, повторяющимися через 2, с 1=100 мкм.

Хрящевые га но иды. В диск-электрофорезе НЬ стерляди представлен 3 основными компонентами, 5 минорными; русский осетр - 4 основными, 5 минорными; севрюга - 4 основными, 5 минорными, белуга - 2 основными, 4 минорными. Диапазон для НЬ белуги составил 0 45-0.8, для других видов 0.30.82. Применение двухмерного электрофореза позволило показать, что каждая фракция в диск-электрофорезе содержит несколько компонентов с одинаковым зарядом и различными (но близкими по значению) ММ, а каждая фракция в градиенте ПААГ - несколько компонентов с одинаковой ММ и различными зарядами (Рис.1). Все компоненты являются тетрамерами. Определены ММ субьединиц: 15-17 кД (осетр), 16,5-18.0 кД (стерлядь), 17-18 кД (белуга, севрюга). Форма кристаллов - гефа - и гексагональные призмы: у севрюги и белуги - крупные, правильной формы с 1=1200 мкм., у стерляди и осетра -мелкие, часто неправильной формы усеченные призмы с 1= 100 мкм.

Рис.1. Двухмерная элеюрофоре-грамма НЬ стерляди. А- направление диск-электрофореза, Б - направление градиентного 7 электрофореза.

О - оптическая плотность, усл.ед.

Костистые рыбы. Гемоглобины костистых в диск-электрофорезе имеют по 1 компоненту с Яг 0.44 (судак) и 0.28 (лещ). Тетрзмеры. У судака встречается октамер с ММ 130-140 кД. ММ субьединицы 16-18 кД. Кристаллы - мелкие тетра- и гексагональные призмы, часто неправильной усеченной формы с 1=100 мкм.

1.2. Сывороточные белки.

Хрящевые рыбы. У катрана обнаружена обширная низкомолекулярная фракция. Самый подвижный в диск-электрофорезе компонент с 0.6 в двухмерном градиентном электрофорезе разделяется на 3 компонента с ММ 5860 кД, 5-6 компонентов с ММ 64-70 кД и 3 компонента с ММ 130-134 кД. В ДСН-электрофорезе все они имеют ММ +5-48 кД. Содержат ковалентно связанный углевод. Идентифицированы как альбуминоподобные белки.

На Ре3* окрасился компонент с Н, 0.44. Он состоит из 2 белков с ММ 77-80 кД. Идентифицирован как ТГ Белок катрана с 0.31 окрашивается бензидином и идентифицирован как гем-содержащая лероксидаза. Состоит из 12 компонентов с ММ 180-200 кД. Содержит ковалентно связанный с белком углевод.

Хрящевые ганоиды. Низкомолекулярная фракция насчитывает до 12 компонентов, из которых 4 относится к альбуминовой системе. В диск-электрофорезе альбумин осетровых 1-2 компонентен с Яг 0.65-0.73. В ДСН-электрофорезе ММ компонентов составила 67-74 кД, что позволяет предположить, что гетерогенность альбуминов обусловлена нековалентным присоединением к белку соединений, меняющих заряд и ММ. Ими могут быть адсорбированные на поверхности белка липиды, углеводы и лиганды, связанные с белком через в-в-мостики. Ковалентно связанного углевода в составе молекулы альбумина не обнаружено. Есть 1 поверхностная свободная БН-группа. Расчет проводили по формуле : [5Н]=0/г V« Мб/С (Веревкина и др.,1977), где [БН] - искомая концентрация в молярных величинах, О-прирост оптической плотности опытной пробы за время, достаточное для завершения реакции, ^коэффициент молярной экстишции тионитрофенильного аниона ТНФА=11400, V* -обьем кюветы, Мг - 67 кД, С-концентрация белка в г/л.

Получен и очищен ТГ стерляди - белок розового цвета с Яиакс =408.3 нм. В диск-электрофорезе ТГ севрюги имеет 1, белуги - 3, стерляди - 4 и осетра - 2 компонента. В градиенте ПААГ и ДСН-электрофорезе ММ ТГ составила 76-81 кД, что предполагает его мономерную структуру. Расчет сиаловых кислот проводили по формуле: Сск =(С0 Мп)/(С& Мс») (Кушманова, Ивченко, 1983), где Сек- искомая концентрация в молярных величинах, Со - концентрация сиаловых кислот в пробе (мг/мл), Мтг =80 кД, Сц-концентрация белка в кювете (мг/мл),

М0=309 Д. Получили, что на 1 моль ТГ стерляди приходится 6.73 молей сиаловых кислот. Связь сиаловых кислот с К стерляди непрочная: нейроаминидаза активностью 5 единиц устраняет гетерогенность К в диск-электрофорезе. Из чего представляется вероятным, что гетерогенность ТГ по заряду определяется сиаловыми кислотами.

Нр у осетровых не обнаружен. Обнаружены 2 группы структурно различающихся гем-содержащих пероксидаэ: I - в зоне подвижности од-глобулинов и II - в зоне подвижности у- и аз-глобулинов. На двухмерных ДСН-электрофореграммах в зоне подвижности а?-глобулинов обнаружена низкомолекулярная субьединица с ММ 19.5-24 кД. Не исключено, что она может быть структурным аналогом а?-цепи Нр высших позвоночных с ММ 19,8 кД.

У русского осетра в области аг-глобулинов обнаружен желтый пигмент -глико- и липопротеид с ММ 525-540 кД. Встречается у особей обоего пола. У стерляди обнаружен белок с высоким содержанием сиаловых кислот. Идентифицирован как аналог человеческого аг.нейраминогликопротеинэ.

Костистые рыбы. Низкомолекулярная фракция судака в диск-электрофорезе состоит из 2-9 белков с Яг 0.62-0.85 и ММ от 28 до 80 кД, в двухмерном электрофорезе - из 8-10 компонентов. К альбуминам относятся 1-6 компонентов с ^0.57-0.65 и ММ 66-70 кД. В ДСН-элекгрофореэе все альбумины имели ММ 67-69 кД. Альбумины судака имеют ковалентно связанный с белком углевод. Низкомолекулярная фракция леща имеет до 11 компонентов, к альбуминовой системе относится 1-5 компонентов. Альбумины леща представлены 2 фракциями с 0.62-0.67 (А) и 0.57-0.61 (Б) с ММ нативных молекул 80-81 кД и 94-95 кД соответственно. Каждая фракция имеет 1-2 компонента. Можно предположить, что альбуминовая система кодируется 2 независимыми локусами (А и Б соответственно). В случае совпадения гетерозигот по обоим локусам мы обнаружили гибридную полосу, что позволило предположить вероятность взаимодействия локусов. Этот феномен может быть обьяснен только наличием субъединиц в структуре молекулы альбумина и согласуется с полученными нами данными. Так, в ДСН-электрофорезе все компоненты альбуминовой системы имеют ММ 46-50 кД. Сопоставление ММ белков в градиентном и ДСН-электрофорезе позволяет предположить, что альбумин леща может содержать 2 ковалентно связанные (через 5-8-мостики)

субъединицы. Альбумины леща имеют ковалентно связанный с белком углевод. Альбумин А не содержит вН-групп.

Содержание низкомолекулярных белков в крови леща зависит от сезона. Зимой - до 23 % , в марте - до 15.5 %. В апреле фракция альбуминов А практически исчезает. Вместо нее появляется белок с 0.8 - 0.83 ("быстрый белок"). Колебания содержания альбуминов, по-видимому, связаны с белково-синтезирующей активностью гепатоцитов (Кирсипуу, Лаугасте, 1979).

ТГ леща в диск-электрофорезе имеет до 6 компонентов, в ДСН-электрофорезе 1 компонент. ММ нативной молекулы 80-85 кД, денатурированной 76-81 кД, что, вероятно, свидетельствует о мономерной структуре белка. "киж = 410 нм. Содержит 5,9 молей сиаловых кислот на 1 моль белка. Нейроаминидаза активностью 5 единиц не устраняет гетерогенность белка по заряду.

У костистых обнаружен Нр: у судака 1-компонентный с ^ 0.1, у леща - 1-2 -компонентный с 0.07 и 0.05 соответственно, ММ - около 220 кД. У леща в зоне подвижности Нр выявлены субьединицы с ММ 19.5 - 22 кД и 41-45 кД (Рис.2). Не исключено, что они могут быть структурными аналогами аг-и р-

А

вГ

Рис.2. Двухмерная ДСН-электрофореграмма сывороточных белков леща. А-направление диск-злектрофореза; Б-направление ДСН-электрофореза; граница Кольрауша; гемин; а?, р - обозначение субьединиц Нр.

цепей Нр высших позвоночных с ММ 19.8 кД и 42.6 кД соответственно. Обнаружен не описанный ранее "быстрый белок" с ^ 0.8-0.83 и ММ 48-53 кД, появляющийся накануне нереста, и, так называемый, белок "челнок*, меняющий параметры ММ (от 130-160 кД до 90 кД) и (от 0.55 до 0.7) перед нерестом. "Челнок" окрашивается на углеводы и липиды, В ДСН-электрофорезе представлен 10-13 белками с ММ от 57 до 73 кД, среди которых только 1 макрокомпонент с ММ 67 кД. Перемещение "челнока" на электрофореграмме обнажает полосу неспецифической эстеразы с 0 .54.

2. Параметры физико-химического состояния.

2.1 Гемоглобин.

Хрящевые рыбы. Тетрамер НЬ катрана неустойчив, лолимеризуется в высокомолекулярные агрегаты, не содержащие гема. Дегидратация белка сульфатом аммония происходит быстро при всех значениях насыщения сопи (от 5 до 75%).

Хрящевые ганоиды. НЬ склонности к полимеризации не проявляет. По устойчивости к дегидратации выявлена межвидовая дифференциация по концентрациям сульфата аммония, при которых достигается максимум абсорбции: 35-40% (белуга, севрюга) и 20-25% (стерлядь, осетр) (Рис.3). При

% насыщения сульфатом аммония

Рис.3. Кривые высаливания гемоглобина осетровых сульфатом аммония. 1- белуга, 2-севрюга, 3-русский осетр, 4- стерлядь.

этом у белуги и севрюги преобладают окси - и дезоксиНЬ, у стерляди и осетра -метНЬ. По устойчивости к замораживанию-оттаиванию и хранению при 4°С также выявлено 2 группы: 1 - севрюга, белуга (устойчивы) и 2 - стерлядь и осетр (неустойчивы).

Костистые рыбы. НЬ судака лолимеризуется в октамеры. Тетрамеры НЬ легко разрушаются до тема и глобина. При этом в диск-электрофорезе образуются 1 (лещ) или 2 (судак) дополнительные полосы. Кривые высаливания НЬ леща во многом аналогичны севрюге и белуге, у судака - стерляди и осетру.

2.2. Сывороточные белки.

Хрящевые рыбы. Альбумины катрана образуют димер. Не связывают БКП и БФС, связывают гемин и СЭ. Tf и пероксидаза связывают СЭ.

Хрящевые ганоиды. Альбумины связывают СЭ, БФС, БКП (специфически), сдвигая Ямакс к 606 нм (Рис.4): альбумины стерляди и осетра связывают БКП мгновенно, севрюги и белуга - около часа. Не связывают гемин. Являются глико- и липопротеидами (кроме стерляди). Прочность липолротеидного комплекса нарастает от осетра к белуге. Не содержат ковалентно связанный с белком углевод. Образуют димеры. Для Tf отличительных особенностей не обнаружено.

Костистые рыбы. Альбумины летних лещей в отличие от зимних

0.Э5

0 30 0.25 0 20 0.15 0,10 0.05 0.00

I I __ 3

1

I I I 1 \

560 570 580 590 500 610 620 610 I

Рис.4. Спектр поглощения БКП(1) и комплексов БКП-альбумин у леща (2) и севрюги (3).

окрашиваются на липолротеады, что доказывает их участие в транспорте пипидов и о расходовании последних в зимний период. Альбумины леща не связывают СЭ, БФС и гемин, связывают неспецифически БКП, смещая Хижс к 596 нм (Рис.4). СЭ связывается аг-глобулинами леща, БФС - "челноком", БКП неспецифически связывают все белки. Альбумины судака связывают БФС и гемин. Альбумин Б леща образует димеры.

Т! судака проявляет пероксидазную активность, ТI костистых неспецифически связывает БКП. Нр связывает гемин, СЭ, БКП. Большинство белков связывают НЬ или гемин. У леща у-, ау- и ои-глобулины, а у судака все сывороточные белки обладают пероксидазной активностью.

СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БЕЛКОВ КРОВИ РЫБ.

1. Разнокачественность структурных параметров белков у видов разных систематических категорий.

Гемоглобин. В ряду хрящевые рыбы хрящевые ганоиды костистые наблюдается тенденция к становлению и стабилизации тетрамера. У катрана имеется весь спектр структур: мономеры, димеры, тетрамеры, высокомолекулярные агрегаты. У скатов - мономеры, димеры и тетрамеры. У осетровых и костистых - тетрамеры (исключение - октамер НЬ у судака). Снижается степень дифференциации по заряду: от 7-10 компонентов у хрящевых до 1 у костистых. ^ всех НЬ 0,3- 0,85 за исключением морского кота (0.04-0.52) и белуги (0.45-0.8). Есть тенденция к росту величины ММ субьединиц от 13.5-15 кД (катран, морская лисица) и 14-16 кД (морской кот) до 16-18 кД (осетровые, костистые). Различия в структуре отражаются в форме кристаллической решетки (гексагональные призмы с углами, повторяющимися через 2, у хрящевых; тетра- и гексагональные призмы осетровых и костистых) и размерах кристаллов (севрюга, белуга - с одной стороны; стерлядь, осетр, костистые - с другой).

Альбумин. По заряду менее всех дифференцирован альбумин хрящевых (1 компонент). У осетровых - 2, у костистых - до 6 компонентов. По ММ наоборот -у хрящевых наиболее дифференцированный альбумин (до 9 компонентов). У

осетровых и костистых до 4 и 6 соответственно. По величинам ММ в ДСН-

! -

электрофорезе альбумины образуют 2 группы: 1 - 45-48 кД (катран) и 46-50 кД

(лещ); 2 - 67-74 кД (осетровые) и 67-69 кД (судак). Учитывая полученные величины ММ в градиенте ПААГ и ДСН- электрофорезе, представляется вероятным, что все альбумины могут иметь мономерную структуру. Альбумин леща, по-видимому, имеет в составе 2 ковалентные субьединицы в отличие от других видов. Альбумины осетровых не имеют ковалентно связанного с белком углевода, в отличие хрящевых и костистых рыб. Наличие в структуре ковалентно связанного с белком углевода, как правило, рассматривается, в качестве примитивного признака, в сравнении с белками, увеличивающими ММ за счет белка (Шульц, Ширмер, 1982). Все альбумины являются липопротеидами (кроме стерляди). Альбумины осетровых, в отличие от альбумина А леща, имеют 1 свободную 5Н-группу.

Трансферрин. Степень дифференциации по заряду растет от 1-2 компонентов у катрана до 6 у костистых. ММ нативных молекул у костистых выше, чем в первичных таксонах: 80-85 кД (костистые), 77-80 кД (хрящевые) и 76-81 кД (хрящевые ганоиды). В ДСН - электрофорезе ММ одинаковы - 76-81 кД. Поэтому представляется вероятным, что у всех видов V является мономером. Отмечена тенденция к сдвигу Хиаа в длинноволновую область: от 408,3 нм (осетровые) к 410 нм (костистые), что вписывается в общую тенденцию сдвига Я.изя; от 405 нм к 465 нм в филогенезе позвоночных (БИеи 2М-пш е( а1., 1991). Т1 осетровых и костистых содержат 6.73 и 5.9 молей сиаловых кислот на 1 моль белка соответственно. Из чего следует, что ТГ осетровых более разветвлен в пространстве. Связь сиаловых кислот с белком более прочная у леща. Гетерогенность ТГ осетровых по заряду формируется сиаловыми кислотами.

Гаптоглобин и гем-содержащие пероксидазы. Обнаружены гем-содержащие пероксидазы у катрана, стерляди и севрюги. У костистых обнаружен Нр. Их ММ несколько различаются - 180-200 кД у катрана и 220 кД у леща. Нр 1-2-компонентен, что свидетельствует о небольшом числе НЬ - связывающих мест на белке. Пероксидазы стерляди и севрюги группируются в 2 типа с разными структурами. У осетровых обнаружена субъединица с ММ 19.5-24 кД, у леща с ММ 19.5-22 кД и цепь с ММ 41-45 кД. Возможно, они являются структурными аналогами а.т и р - цепей Нр высших позвоночных. Если субъединицы осетровых и костистых гомологичны, то представляется вероятным, что

начальные этапы формирования гагттогпобиновой системы у позвоночных в структурном плане следует связывать с осетровыми рыбами.

2. Разнокачествеиностъ функциональных характеристик белков крови у видов разных систематических категорий.

Гемоглобин. В ряду хрящевые хрящевые ганоиды костистые ослабевает способность НЬ к полимеризации. Исключение - НЬ судака. В том же ряду наблюдается ослабление связи гема с глобином.

Альбумин. Способность связывать произвольно выбранные лиганды (БКП, БФС, СЭ, гемин, НЬ, Ре3*) растет от хрящевых к костистым. Все альбумины образуют гликопротеидные и липопротеидные (кроме стерляди) комплексы и дииеры (кроме альбумина А леща).

Гапгоглобин и гем-содержащие пероксидазы. Способность связывать лиганды (НЬ, СЭ, БКП, гемины рыб и человека) растет в ряду пероксидазы осетровых пероксидазы хрящевых Нр костистых: так, пероксидазы осетровых не связывают лиганды, а Нр леща связывает все лиганды. У костистых функцию связывания Ре-содержащих лигандов выполняют практически все сывороточные белки. Эта адаптация для предотвращения потери Ре*3 характерна для костистых, вероятно, ло причине повышенной склонности к гемолизу их эритроцитов.

Трансферрин. ТГ костистых проявляет разнообразие в функциональном отношении (неспецифическое связывание БКП, пероксидазная активность).

3. Анализ согласованности структурных и функциональных преобразований белков крови.

Гемоглобин. Стабилизация тетрамера сопровождается уменьшением 1)склонности х полимеризации и 2) прочности связи гема с глобином. Однако свойство приметной кооперативное™, каким является полимеризация, может проявлять не только НЬ катрана, но и НЬ судака. Рассмотрим согласованность структурных и функциональных преобразований в каждом таксоне. У хрящевых по структурным параметрам (^ ММ) НЬ делится на группы: 1- катран и морская лисица, 2- морской кот; по функциональным (полимеризация) - на 2 другие группы: катран и скаты. У осетровых отмечается согласованность структурных и функциональных изменений - по структуре (размеры кристаллов) и функциям (устойчивость к хранению, замораживанию-оттаиванию, высаливанию) они

и

образуют 2 группы: 1 - севрюга, белуга; 2 - стерлядь и осетр. У костистых различий в структуре не выявлено. Имеются элементы функциональной разнокачественности: по устойчивости к сульфату аммония и способности к полимеризации (2 группы: 1 - лещ, 2 - судак).

Апьбумин. В структурном отношении, в каждой группе есть белки, различающиеся степенью дифференциации по заряду и ММ. Они по-разному организованы (могут иметь или не иметь в составе субъединицы), могут содержать (катран, костистые) или не содержать (осетровые) ковалентно связанный с белком углевод и поверхностную БН-группу (у осетровых есть, у костистых - нет). В функциональном отношении при том, что все они транспортные белки, в ряду хрящевые - хрящевые ганоиды - костистые происходит увеличение центров связывания лигандов на поверхности альбумина. При структурном единстве альбуминов осетровых в отношении функций есть разнокачественность: по времени связывания БКП и прочности липопротеидных комплексов они делятся на 2 группы: стерлядь и русский осетр - с одной стороны и севрюга с белугой - с другой. Структурная разнокачественность альбуминов костистых (!*(, ММ, наличие или отсутствие субь единиц) сопровождается функциональной (у судака больше центров связывания лигандов, различия в способности к полимеризации).

Гаптоглобин и гем-содержащие пероксидазы. У катрана в отличие от скатов обнаружены гем-содержащие пероксидазы, отличающиеся от пероксидаз осетровых, которые, в свою очередь, в структурном отношении делятся на 2 группы: 1 - аг пероксидазы и 2 - у- и и~ пероксидазы. Переход от хрящевых к хрящевым ганоидам сопровождается появлением в области аз-глобулинов субъединицы с ММ 19.5-24 кД. Дополнительных функций при этом не выявлено. У костистых к этой субъединице добавляется еще одна с ММ 41-45 кД. Возможно, эти события представляют собой этапы формирования гаптоглобинов высших позвоночных. Однако, как функциональная единица, гаптоглобин появляется только у костистых. У костистых структурная дифференциация по и числу компонентов Нр согласуется с определенным функциональным разнообразием. Так, у леща (1-2 компонента) Нр может связывать гемины рыб и человека, в отличие от Нр судака (1 компонент), имеющего только основную функцию по связыванию НЬ. При этом у обоих видов Нр имеет на своей поверхности центры связывания БКП и СЭ.

Трансферрин. В ряду хрящевые - хрящевые ганонды - костистые рыбы структурные преобразования (в количестве сиаловых кислот, разной степени прочности их связи с ТГ) сопровождаются появлением дополнительных функций при сохранении основной. Внутри же каждой из групп разнокачественность есть у костистых: Tfсудака проявляет пероксидазную активность.

В целом у рыб наблюдается отчетливая тенденция эволюционных преобразований белков в соответствии с филогенией таксонов, выражающуюся в усложнении структурной организации, появлении новых белков, функциональной дивергенции гомологичных белков. Однако и в пределах отдельных таксонов (например у хрящевых) наблюдаются весьма существенные трансформации, затрагивающие и структурные особенности, что в других классах позвоночных, как правило, выявляется только при межклассовых сравнениях.

4.Роль экологической дифференциации видов в формировании структурной и функциональной разнокачественное™ белков.

Белковая система крови играет значительную роль в формировании адаптивного ответа организмов на изменения внешней среды. Изменения физико-химических параметров белхов крови, по мнению ряда исследователей, носят, как правило, адаптивный характер и определяются влиянием среды (Шварц, 1980). Среди рассматриваемых нами видов рыб имеются как чисто морские (хрящевые рыбы), так и чисто пресноводные (лещ и судак). Промежуточной является группа хрящевых ганоидов, включающая проходные (белуга, севрюга), полупроходные (русский осетр) и пресноводные (стерлядь) виды. Исследованные нами хрящевые подразделяются на представителей специализированной фуппы (скаты) и неспециализированной (акулы). Исследованные костистые также представляют 2 экологические группы - хищные рыбы пелагофилы (судак) и бентофаги, мезобентофилы (лещ). Существенная структурная дифференциация на внутриотрядном уровне у исследованных видов слаба, исключением являются гемоглобины хрящевых и альбумины костистых.

Согласно структурным преобразованиям НЬ хрящевых распадаются на 2 группы: катран и морская лисица - с одной стороны, и морской кот - с другой; согласно функциональным преобразованиям - на группы, включающие 1 -катрана и 2 - скатов. В группе пероксидаз у хрящевых структурные и функциональные преобразования согласованы: катран - с одной стороны и скаты - с другой У осетровых структурные и функциональные преобразования

согласованы по НЬ и альбумину. В обоих случаях происходит деление на 2 группы: "пресноводную"- стерлядь, осетр; и 'морскую'- севрюга, белуга, си -пероксидазы отчетливо разделяются на 2 группы: стерлядь и другие виды. У костистых рыб при структурном единстве появляется разнокачественность функциональных характеристик для НЬ, Нр и К. В случае альбуминов согласованы и структурные и функциональные преобразования. Полученные данные позволяют предположить, что выявляемые внутриотрядные различия обусловлены соответствующей экологической дифференциацией исследованных видов.

б.Значение небелковых компонентов в формировании общего разнообразия белковой системы по функциональным свойствам.

5.1. Роль липидов и углеводов, нековалентно связанных с белком. У катрана есть 1 липопротеидный комплекс (ЛПК) с ^ 0.6, соответствующий альбумину, у хрящевых ганоидов 1-2 ЛПК (1 - у стерляди с 0.38 , 2 - у осетра с Иг 0.22 и 0.7 , 2 - у севрюги с 1^0.4 и 0.7, и 2 - у белуги с Яг 0.18 и 0.72). У стерляди это р-глобулин, у осетра - желтый пигмент и альбумин, у севрюги - р-глобулин и альбумин, у белуги - а.?- макроглобулин и альбумин. У леща до 5 ЛПК летом и 1 (в области о<.2-глобулинов) зимой. У судака в зимнее время сохраняется 1-2 ЛПК в аг-зоне и альбуминов. Итак, по наличию ЛПК сывороточных белков в весенне-летнее время образуется следующий ряд: хрящевые (1 ЛПК) - осетровые (1-2 ЛПК) - костистые (5 ЛПК). В зимнее время, осетровые (1-2 ЛПК) - костистые (1-2 ЛПК). Следовательно, костистые наглядно демонстрируют связь ЛПК с интенсивностью обмена липидов. Последнее хорошо согласуется с данными о том, что жир, запасенный во время летнего нагула, используется зимой в основном самцами, самки же, ведущие менее активный образ жизни, в качестве энергетического сырья используют белки (Кангур, 1979; Попов, 1979). На гликопротеиды у хрящевых рыб окрашиваются 2 компонента с Кг 0.33 и 0.6 (сс.2 - глобулины и альбумины). У осетровых от 3 компонентов (^ 0.18, 0.37 и 0.65) у стерляди, до 5 у осетра и белуги (К, 0.07 , 0.26, 0.33, 0.6 и 0.7) и 7 у севрюги 0.08, 0.12, 0.22, 0.38, 0.4, 0.62, 0.72). У костистых все сывороточные белки являются гликопротеидами. Количество гликопротеидных комплексов растет в ряду : хрящевые ( 2 ) => осетровые ( 3 - 7 ) => костистые (все бепки).

Заслуживает внимания обнаруженный нами транспортный белок, являющийся липо- и гликопротеидом. Это сч-глобулин, выполняющий функцию "челнока". Его относительное содержание сильно колеблется от 8-10% зимой до 38-40% в августе - сентябре. Колебания параметров концентрации, ММ и указывают на участие "челнока" в транспорте и обмене. Высокие значения ММ и низкая белка, вероятно, свидетельствуют о запасающей функции бепка (в виде глико- и липопротеидов), а уменьшение ММ и возрастание И/ в преднерестовый период - об использовании углеводов и липидов, адсорбированных на поверхности "челнока", в качестве энергетического сырья.

Следующий пример участия липидов и углеводов в создании общего разнообразия белковой системы крови - альбумины. Так, альбумины катрана в градиентном электрофорезе имеют до 5 компонентов. После удаления нековалентных фрагментов в ДСН-электрофорезе белок идет одной полосой с ММ около 49 кД. То же происходит у осетровых и костистых. Следовательно, представляется вероятным, что гетерогенность альбуминов обусловлена нековалентным присоединением к молекуле белка соединений, изменяющих параметры ММ и Я (.

5.2. Роль ковалентно связанных с белком углеводов. У катранэ альбумины имеют ковалентно связанный с белком углевод. У осетровых ковалентно связанный углевод содержится в составе ТТ и а?-нейраминогликопротеина в виде сиаловых кислот. У костистых практически все белки леща и большинство у судака имеют в составе ковалентно связанный углевод. Сравнительно высокое содержание сиаловых кислот в ТТ рыб (6.73 и 5.9 молей на 1 моль белка) свидетельствует о разветвленной структуре белков. Имеются различия в степени прочности их связи с белками: так, если для разрыва связи сиаловых кислот с ТТ стерляди достаточно воздействия нейроаминидазы активностью 5 единиц, то для ТТ леща этого недостаточно Для сравнения отметим, что в ТТ быка 4 моля сиаловых кислот на 1 моль белка, которые разрывает нейроаминидаза активностью 1800 единиц (Уайт и др., 1981).

5.3 Металлсвязывающие белки. У исследованных видов Ре3* связывает ТТ. У костистых практически все сывороточные белки связывают железо в той или иной форме - либо в виде Ре ^ , либо в виде НЬ или геминэ.

ФОРМИРОВАНИЕ ЕДИНОЙ БЕЛКОВОЙ СИСТЕМЫ СЫВОРОТКИ КРОВИ.

1. Конвергенция функциональных и структурных характеристик негомологичных белков.

Примером конвергентной эволюции белков в отношении функции могут служить альбумины и "челнок" леща. У них разные и ММ, но оба являются транспортными белками, тот и другой несут на поверхности адсорбированные углеводы и липиды. Другой пример - конвергенция сывороточных белков костистых в отношении функции связывания железа и его производных (гемина и НЬ). Примером структурной конвергенции можно считать наличие ковалентно связанного с белком углевода в структуре сывороточных белков костистых. Вероятно, это способ увеличения ММ для предотвращения фильтрации почками. Наличие структурно сходных доменов в белках костистых подтверждается их связыванием с БКП.

2.Полифункциональные белки.

У костистых впервые появляются полифункциональные белки. К ним можно отнести практически все сывороточные белки. Однако с наибольшей уверенностью к ним относится "челнок", как истинно полифункциональный белок. Он транспортирует углеводы и липиды, связывает гемин, Ре3*, имеет на своей поверхности центры связывания некоторых красителей (БКП, БФС). Не исключено, что полифункциональный характер "челнока" связан с его сложной структурой. В градиенте ПААГ он рападается на 3 компонента : эстеразу, альбумин Б и собственно "челнок", чьи контуры на двухмерной электрофореграмме позволяют предположить, что он может состоять, как минимум, из 2 белков с близкими значениями ММ. На двухмерных ДСН-электрофореграммах "челнох" представлен белками с ММ от 57 до 73 кД. В основном, это микрокомпоненты за исключением 1 макрокомпонента с ММ 67 кД. Из вышесказанного следует, что "челнок" может быть просто агрегатом, состоящим из нескольких индивидуальных белков, чем и обьясняется его полифункциональность. Или же он является олигомером, состоящим из нескольких нековалентно связанных субьединиц с разными физико-химическими параметрами. Факт обнаружения этого белка в интерстициальной жидкости леща (см. ниже) можно обьяснить только исходя из олигомерной структуры "челнока" или более общей модели белкового комплекса на основе процессов ассоциации-диссоциации составляющих его белков.

3.Функционирование белков в целомических жидкостях организма.

Плазма крови является связующим звеном в системе внеклеточных жидкостей организма, к числу которых относится интерстициальная жидкость, лимфа и ряд специфических жидкостей. Все они являются фильтратами крови. Гисто-гематологический барьер хрящевых ганоидов поддерживает градиент концентраций белка и липидов, но свойствами молекулярного сита не обладает (Цветненко, 1986). У костистых (Чалов, Лукьяненко, 1989), появляется избирательная проницаемость стенок капилляров для отдельных компонентов плазменных белков. Авторами показано, что наиболее подвижные в диск-электрофорезе белки имеют небольшой коэффициент отражения, в том числе и описанный нами "челнок", что является подтверждением его транспортной природы.

¿.Формирование физико-химических свойств гомологичных белков в процессе эволюции рыб.

Сходная степень дифференциации сывороточных белков на двухмерных градиентных злектрофореграммах у всех видов (26-29 компонентов) и различная - на двухмерных ДСН-электрофореграммах (84 у костистых, 43 у осетровых) говорит о более сложной субъединичной структуре белков костистых. Изучение антигенных свойств альбуминов рыб (Зорин и др., 1994) показало, что уровень антигенной идентичности снижается в ряду вид - семейство - отряд, и что альбумины рыб обнаруживают слабые черты антигенной идентичности. Отсюда возникает вопрос о корректности их объединения в рамках единого эволюционно сложившегося семейства альбуминов, что в частности предполагалось авторами вышеупомянутой работы. Сомнения в правомочности существования такого гомологичного семейства белков у рыб обусловлены еще и тем, что, по нашим данным, альбумины хрящевых, осетровых и костистых имеют значительные структурные различия. Таким образом, определенная согласованность антигенных и структурных данных позволяет предполагать негомолошчность альбуминов рыб. В случае окончательного подтверждения справедливости данного тезиса, эволюцию альбуминов рыб следует рассматривать, как независимую в каждом отдельном таксоне.

Обнаруженное по ряду параметров сходство альбуминов осетровых и высших позвоночных обьясняется, вероятно, гомологией их структур и невысоким темпом молекулярной эволюции сывороточного альбумина (Чихачев,

1982). Альбумины хрящевых и костистых рыб не обнаруживают сходства с альбуминами высших позвоночных.

Относительно ТГ заметим, что существенных структурных трансформаций у Рыб не обнаружено. Ввиду малой изменчивости в разных таксономических подразделениях, обьясняемой постоянством основной функции белка, его первичная структура не является обьектом пристального внимания. Вероятно, в результате дупликаций и последующего расхождения функций образовывались варианты, расширяющие норму реакции белка в организме. А вариации функциональных характеристик могут осуществляться при неизменной первичной структуре (Лекявичюс, 1986). Можно предположить, что трансферрины рыб образуют единое семейство гомологичных белков.

Обнаруженные в первичных таксонах гем-содержащие пероксидазы имеют разные характеристики на меж- и внутриотрядных уровнях. Возможно, появление гем-содержащих пероксидаз у хрящевых рыб, субъединицы с ММ 19-24 кД у осетровых, субъединиц с ММ 19.6-22 кД и 41-45 кД у костистых, представляют собой этапы формирования гаптоглобиновой системы позвоночных. И если в структурном отношении начальные этапы становления Нр можно связать с хрящевыми ганоидами, то в функциональном плане возникновение Нр можно связывать только с костистыми рыбами.

Что касается данных по эволюционным преобразованиям Нр, то известно, что они описаны лишь для Нр человека. Предполагается, что обнаруженная структурная дупликация гена ои-цепи, в результате чего образовалась оц- цепь, должна была произойти недавно - у непосредственных предшественников современного человека. Если обнаруженная у стерляди, севрюги и леща субьединица с ММ около 20 кД действительно является аналогом а.?-субъединицы Нр высших позвоночных, то в вышеприведенную схему следует внести изменения относительно сроков дупликации гена «,1-субъединицы. В зтом случае следует считать, что дупликация произошла у осетровых. Далее дуплицировэнная субъединица могла дать 2 ветви: одна привела к о^-подобной цепи современных осетровых рыб, другая к сц - субъединице костистых рыб. Далее у костистых мог появиться аналог р-цепи Нр. У высших позвоночных субъединицы приобрели дополнительные свойства (полимеризации).

Вопросы эволюции НЬ разработаны практически для всех животных. Примитивные глобины возникли около 1.2 мпрд. пет назад у эукариотов из гема

в комплексе с темным карманом (Argos el al., 1979). Они не обладали кооперативными свойствами. Из них образовался дезокси-димер, обладавший кооперативностью и низким сродством к 0?. Еще 1-2 мутации могли привести к появлению дезокси-тетрамера (Coates Michael, 1975). Полученные нами данные вписываются в общую схему эволюции Hb от мономера к тетрамеру.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, в каждом таксономическом подразделении белковая система крови рыб отвечает особенностям их внешней и внутренней среды. Белки крови хрящевых рыб высокодифференцированы и специализированы, хрящевых ганоидов - высокодифференцированы и высокоспециализированы, костистых - высокодифференцированы и слабоспециализированы. Белки костистых имеют более сложную (субъединичную) структуру. У костистых формируется пластичная система белков крови с большим адаптационным потенциалом, основанном на полифункциональном характере белков, на их способности к обратимым межмолекулярным взаимодействиям с образованием функциональных комплексов. В целом эволюция белков крови согласуется с ходом организменной эволюции. По характеру структурной дифференциации отчетливо прослеживается согласованность с филогенезом Рыб на межотрядном уровне. Более того, в пределах каждого таксономического подразделения наблюдается структурное разнообразие белков на межвидовом уровне. По нашему мнению, это является результатом прохождения белками в данных таксонах ранних этапов эволюции, связанных с их возникновением. Функциональная разнокачественность белков в большей степени отражает характер стратегии адаптации различных таксономических групп рыб на биохимическом уровне.

ВЫВОДЫ.

1. На основе всестороннего физико-химического исследования идентифицированы следующие сывороточные белки крови Pisces: у хрящевых рыб - альбуминоподобные белки, трансферрины и гем-содержащая пероксидаза; у хрящевых ганоидов - альбумины, трансферрины, гем-содержащие пероксидазы, а?-нейраминоглинопротеин (у стерляди), желтый пигмент (у русского осетра); у костистых рыб - альбумины, трансферрины, гаптоглобин, транспортные белки "челнок" и "быстрый белок".

2. Из идентифицированных сывороточных белков впервые обнаружены гем-содержащие пероксидазы и альбуминоподобные белки хрящевых рыб, о?-нейраминогликопротеин и гем-содержащие пероксидазы хрящевых ганоидов, полифункциональный транспортный белок "челнок" и появляющийся только накануне нереста "быстрый белок" костистых рыб. Исследована структура и функции этих белков.

3. Существенные различия в структуре альбуминов и альбуминоподобных белков представителей разных таксономических подразделений позволяют предположить независимость формирования альбуминовой системы в каждом отдельном подклассе. Трансферрины Pisces, вероятно, образуют единое семейство. Можно предположить, что появление гем-содержащих пероксидаз у представителей первичных таксонов, структурных элементов гаптоглобиновой системы высших позвоночных у хрящевых ганоидов и гаптоглобинов у костистых рыб - представляют собой эволюционные этапы формирования гаптоглобиновой системы позвоночных.

4. По структурным и функциональным параметрам гемоглобина (размеры кристаллов, устойчивость к высаливанию, замораживанию-оттаиванию и хранению при 4°С) и альбумина (устойчивость к замораживанию-оттаиванию липопротеидных комплексов) выявлена дифференциация исследованных видов рыб на 2 группы: 1 - устойчивый тип (проходные осетровые) и 2 -неустойчивый тип (полупроходные и туводные осетровые и костистые).

5. Адаптивная стратегия в эволюции белковой системы крови рыб определяется тем, что в каждом таксономическом подразделении сформировалась белковая система крови, приспособленная к конкретным условиям внешней и особенностям внутренней среды. У хрящевых и хрящевых ганоидов белковая система крови является высокодифференцированной и специализированной, а у костистых рыб - высокодифференцированной и слабоспециализированной, с большим адаптационным потенциалом, основанным на полифункциональном характере белков, их сложной (субьединичной) структуре, а также на их способности к обратимым межмолекулярным взаимодействиям с образованием функциональных комплексов.

По материалам диссертации опубликовано и сдано в печать 9 работ:_

1. Андреева A.M. Идентификация сывороточного альбумина и изучение некоторых его физико - химических свойств у представителей семейств Acipenseridae и Cyprinidae.- Инф.Бюлл.ИБВВ АН СССР, 1986 А, N 69, с.36-39.

2. Андреева A.M. Физико- химические свойства сывороточных белков хрящевых рыб на примере катрана.// В кн.: Вопросы эволюционной физиологии. П., Наука, 1986 Б, с. 13-14.

3. Лукьяненко В.И., Андреева A.M., Лукьяненко В.В. Гетерогенность и некоторые физико-химические свойства гемоглобинов осетровых рыб.// В кн.: Вопросы эволюционной физиологии. Л., Наука, 1986 В, с. 159- 160.

4. Андреева A.M. О структуре гемоглобина некоторых видов семейства Acipenseridae.- Инф. Бюлл. ИБВВ АН СССР, 1987 А, N 75, с. 33 - 36.'

5. Андреева A.M. Устойчивость гемоглобина осетровых рыб к дегидратирующему действию сульфата аммония. - Инф. Бюлл. ИБВВ АН СССР, 1987Б, N76, с. 56-59.

6. Андреева A.M. Идентификация сывороточных трансферринов леща и стерлвдиУ/1 симп. по экол. биох. рыб. Ярославль, 1987 В, с. 8 -10.

7. Андреева A.M. О роли сиаловых кислот в создании гетерогенности трансферринов стерляди и леща.// I симп. по экол. биох. рыб. Ярославль, 1987 Г, с. 10-11.

8. Андреева A.M. Физико-химические свойства сывороточного альбумина крови осетрообразных и карпообразных рыб на примере стерляди и леща.// В кн.: Физиол. и биох. гидробионтов. фославль, I987 Д, с. 108-114.

9. Andreeva A.M. Ecological diversity of physiko - chemical properties of proteins blood of fishes.// 9th International Congress of European Ichthyologists (CEI 9) "Fish Biodiversity*. Trieste, 1997, Italian Gournat of Zoology" (in pub!.)