Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение авенацина из овса посевного (Avena sativa L.) и изучение его физиолого-биохимических аспектов действия

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение авенацина из овса посевного (Avena sativa L.) и изучение его физиолого-биохимических аспектов действия"

На правах рукописи

Солохина Ирина Юрьевна

ВЫДЕЛЕНИЕ АВЕНАЦИНА ИЗ ОВСА ПОСЕВНОГО (Avena sativa L.) И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ

ДЕЙСТВИЯ

Специальность 03.01.05 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 НОЯ 2013 005541095

Воронеж —2013

005541095

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Официальные оппоненты: Грабович Маргарита Юрьевна

доктор биологических наук, доцент Воронежский государственный университет, кафедра биохимии и физиологии клетки, профессор

Соколенко Галина Григорьевна

кандидат биологических наук, доцент Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I, кафедра ботаники, защиты растений, биохимии и микробиологии, доцент

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт растениеводства им. Н. И. Вавилова Россельхозакадемии

Защита состоится «20» декабря 2013 года в 16:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан «19» ноября 2013 г.

Ученый секретарь л .

диссертационного совета Брехова Любовь Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Овес посевной {Avena sativa L.) - одна из важнейших сельскохозяйственных культур. Зерно овса характеризуется повышенным содержанием в белке незаменимых аминокислот, витаминов и других биологически активных соединений. Овес обладает такими полезными свойствами, как устойчивость к неблагоприятным факторам среды и болезням, высоким содержанием белка и масла в зерне [Родионова, Солдатов, 1994].

Установлено, что в зерне овса содержатся водорастворимые антибиотические вещества, выделяющиеся в окружающую среду при увлажнении зерна, и тем самым защищающие его от патогенных микроорганизмов [Ежов, Новотельное, 1957]. Также из корней овса было выделено антибиотическое вещество - авенацин [Maizel, Burkhardt [et al.], 1963]. Авенацин по химической природе относится к тритерпеновым гликозидам (сапонинам). Установлена эмпирическая формула авенацина-C55H83N02i и вычислена его молекулярная масса - 1100,33. В дальнейшем была показана его бактериостатическая и фунгицидная активность. Авенацин отличается широким спектром действия и низкой токсичностью. Авенацин эффективен в борьбе против корневых гнилей пшеницы и ячменя, вызываемых грибным патогеном Ophiobohts graminis [Bryan, Labourdette, 1999; Osbourn, Goss, 2011].

На сегодняшний день вопросом изучения авенацина занимаются OsbournA. (Великобритания), Kemal М. (Турция). Но их работы посвящены генетическим исследованиям пути синтеза авенацина из мевалоновой кислоты. Данные о воздействии антибиотика на растительные объекты отсутствуют. Известно, что антибиотики природного происхождения представляют собой альтернативное средство защиты растений от болезней. В тканях растений их биологическая активность проявляется значительно сильнее, чем в животных тканях. Антибиотики обладают избирательным действием, снижая тем самым уровень вредного воздействия на растение [Павловская, 2012].

Реакция растений на обработку авенацином остается слабо изученной. Таким образом, исследование физиологического действия авенацина по отношению к растениям, не содержащим антибактериальные вещества, является актуальным и важным. Представляет интерес накопление авенацина в различных сортах овса посевного и выявление источников с высоким содержанием данного вещества.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы выделить авенацин из корней овса посевного и исследовать его физиолого-биохимические аспекты действия.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести количественное выделение авенацина из различных по устойчивости сортов овса посевного методом экстракционного извлечения с применением системы растворителей.

2. Идентифицировать полученный авенацин с помощью качественных реакций, метода тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3.Исследовать действие различных концентраций авенацина на интенсивность ростовых процессов гороха.

4. Изучить активность ферментов антиоксидантной системы: пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы и содержание малонового диальдегида в проростках гороха.

5. Исследовать биологическую активность авенацина: фунгитоксичность в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum', антимикробную активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.coli; общую токсичность авенацина как кормовой биологически активной добавки для животных.

Научная новизна работы. Впервые проведен анализ генотипов овса на содержание авенацина и выявлены образцы с наибольшим выходом этого антибактериального вещества. Определены оптимальные параметры растворителей для максимального извлечения авенацина из малой навески биомассы. Получены результаты влияния авенацина на рост и развитие здоровых и инфицированных Fusarium oxysporum корней гороха. Установлены ростостимулирующие свойства авенацина, при заражении проростков гороха Fusarium oxysporum. Подтверждены бактериостатические свойства авенацина. Изучена активность ферментов антиоксидантной системы в проростках гороха, обработанных авенацином в концентрациях 10" М, 10" ШМ - 10"12М. Показана возможность использования авенацина в качестве нетоксичной кормовой биологически активной добавки для животных.

Практическая и теоретическая значимость. Расширены и углублены знания о действии авенацина на физиологические процессы в растительных объектах. Данные, свидетельствующие о бактериостатических свойствах авенацина, а также о стимулирующем влиянии на физиологические процессы растений, зараженные Fusarium oxysporum, открывают перспективы его использования в растениеводстве в качестве безопасного средства защиты растений от патогенов, а также в ветеринарии в качестве нетоксичной кормовой биологически активной добавки. Разработан патент «Способ получения стимулятора корнеобразования гороха» (решение о выдачи патента на изобретение от 25.07.13 г.).

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Орловского государственного аграрного

университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выноснмые на защиту

Выделение авенацина из корней овса посевного по модифицированной методике.

- Идентификация авенацина качественными методами.

-Авенацин в концентрациях стимулирует

корнеобразование гороха в норме и при заражении Fusarium oxysporitm.

- Воздействие авенацина в концентрации 10"6М на горох в норме и при инфицировании Fusarium oxysporum вызывает выраженный окислительный стресс. Однако влияние авенацина в более низких концентрациях (10"10-10"12 М) вызывает стимулирующее действие.

- Авенацин обладает бактериостатическими характеристиками в отношении Staphylococcus aureus, E.coli и фунгитоксичными свойствами в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональных конференциях. Они были представлены на региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства» (Орел, 2009), региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященный 35-летию Орловского государственного аграрного университета «Инновационный потенциал молодых ученых — АПК Орловской области» (Орел, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства» (Орел, 2010), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010), «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи» (Орел, 2011), международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации.Диссертация изложена на 120 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 180 источников. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 40 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Экспериментальная работа ироводиласьна базе «Орловского регионального биотехнологического центра сельскохозяйственных растений» ФГБОУ ВПО «Орловский

государственный аграрный Университет». Материалом для исследования послужили 8 образцов овса посевного «Тюменский голозерный», «Гунтер»,

«Левша», «Кречет», «Пушкинский голозерный», «CI 1580», «Borrus», «PI 186270», предоставленные д.б.н., профессором Лоскутовым И.Г., заведующим отделом генетических ресурсов овса, ржи, ячменя ГНУ ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН, за что выражаю глубокую признательность.

Методы исследований. Для определения активности каталазы (КФ

1.11.1.6) в растениях была использована методика А.И. Ермакова (1987) с модификациями Л.Е. Иваченко (1997). Активность пероксидазы (КФ

1.11.1.7) растений определяли колориметрическим методом Бояркина с модификациями [Плешков, 1985]. Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) (КФ 1.15.1.1) была использована модифицированная методика [Giannopolities and Ries, 1977] с использованием фотореактора [Гринблат, 2007]. Количество малонового диальдегида определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой при высокой температуре в кислой среде [Орехович, 1997]. Получение авенацина проводили по методу предложенному [Maizel, Burkhardt, 1963], с разработанными в нашей лаборатории модификациями. Определение фунгитоксичности авенацина определяли по ингибированию спор гриба Fusarium oxysporum [Попкова, 1984]. Общую токсичность авенацина в составе кормовой биологической активной добавки определяли по ГОСТу28178-89. Качественное определение тритерпеновых сапонинов в исследуемых образцах овса определяли по Н.И. Гринкевич, Л.А. Сафронич (1986). Для хроматографического определения авенацина использован Миллихром-5 с обращенно-фазной колонкой Ultrasphere Cl8(250><4,6мм; 5 мкм) элюент 100% метанол и вода (80:20). Смесь в количестве 100 мкл наносилась в элюенте.

Статистические методы обработки данных. Лабораторные опыты проводили в 3-х кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы — в трех повторностях. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с привлечением современных программных средств. Расчеты, построение графиков и их описание осуществляли с помощью приложений Microsoft Office Word 7 и Excel 7 для Windows ХР и пакета прикладных программ «Statistica. 7,0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выделение и очистка антибиотика авенацина

Получение авенацина проводили методом, предложенным Майзелем (Maizel) и Буркхардом (Burkhardt) (1963 г). Однако в ходе проведения эксперимента были внесены некоторые корректирующие методические операции, обусловленные необходимостью получать авенацин из малой навески порошка из корней овса. Проведя некоторые изменения в ходе выделения, мы получали авенацин по следующей схеме (рис.1).

Рис. 1 — Схема выделения авенацина из корней овса

Выделение авенацина осуществляли двухступенчатой экстракцией различными растворителями. В отличие от оригинальной методики нами была исключена трехступенчатая экстракция токсичным метиловым спиртом и заменена двукратной экстракцией 70%-м этиловым спиртом при 1°80 °С в течение 60 минут. Кроме того, для лучшей очистки авенацина от сопутствующих примесей помимо активированного угля, нами был предложен дополнительный способ очистки перекристаллизацией из раствора, с последующим отделением выпавшего осадка центрифугированием. На основании проведенных исследований было установлено, что сортообразцы овса содержат различное количество авенацина, которое варьирует от 0,29 до 0,45 мг%.

Таблица 1

Скрининг сортов овса на содержание авенацина_

№ по каталогу ВИР Генотипы овса Выход авенацина, в мг %

14784 Тюменский голозерный» (Тюменская область) A. sativaL. var. inermis 0,36

14957 «Гунтер» (Кировская область) А. sativaL. var. aurea 0,38

15014 «Левша» (Кемеровская область) А. sativaL. var. inermis 0,32

14857 «Кречет» (Кировская область) А. sativaL. var.imitica 0,38

14717 «Пушкинский голозерный» (Ленинградская область) А. sativaL. var. inermis 0,29

13901 «CI 1580» (США) A. sativa L. var. aristata, obtusata 0,41

11840 «Borrus» (Германия) A. sativa L. var. aurea 0,45

13903 PI 186270 (Аргентина) A. byzantinaC. Koch 0,39

Среднее(в мг %) 0,37

В среднем выход авенацина составляет 0,37 мг% от сухой массы вещества. Наибольшее количество авенацина отмечено в сортах «Вогшб» (Германия), «С1 1580» (США), Р1 186270 (Аргентина), «Гунтер» (Кировская область), «Кречет» (Кировская область). Наименьшее количество авенацина содержится всортах овса «Левша» (Кемеровская область) — 0,32 мг%, «Пушкинский голозерный» - 0,29 мг%.

2. Качественный анализ авенацина

Хроматографическое определение тритерпеновых сапонинов проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинках «8огЬЯ1» (РФ), ТУ 2611-17-89: 0,01 мл спиртового извлечения из исследуемых материалов хроматографировали в системах хлороформ - этиловый спирт -вода (13 : 6 : 1); н. бутанол - уксусная кислота - вода (10 : 3 : 5); н.пропанол -1% аммоний (3 : 1).Хроматограмму высушивали на воздухе и рассматривали при дневном свете после обработки 20%-м раствором Н2804 и после нагревания в сушильном шкафу при 1°=115°С в течение 15 минут. Идентификацию тритерпеновых сапонинов, выделенных из корней овса, проводили по характеру окраски и флуоресценции пятен, согласно литературным данным [Гринкевич, Сафронович, 1983].

Таблица 2

Идентификация тритерпеновых сапонинов овса методом тонкослойной

хроматографии

Образец Система растворителей для хроматограф иров ания Хроматограмма после проявления 20%-м раствором H2S04 Rf

цвет пятен в видимом свете цвет пятен после нагревания

Спиртовой раствор авенацина из сорта «Тюменский голозерный» хлороформ -этиловый спирт -вода (13:6:1) бесцветный фиолетовый 0,48

н.бутанол -уксусная кислота - вода (10:3:5) бесцветный розово-фиолетовый 0,67

н.пропанол - 1% аммоний (3:1) бесцветный темно-фиолетовый 0,75

Спиртовой раствор авенацина из сорта «CI1580» хлороформ -этиловый спирт -вода (13:6:1) бесцветный фиолетовый 0,48

н.бутанол -уксусная кислота - вода (10:3:5) бесцветный розово-фиолетовый 0,67

н.пропанол - 1% аммоний (3:1) бесцветный темно-фиолетовый 0,75

При анализе исследуемых образцов методом тонкослойной хроматографии было подтверждено наличие тритерпеновых сапонинов, полученных из корней овса посевного в представленных сортах. Авенацин

по химической структуре относится к тритерпеновым гликозидам (сапонинам).

Для подтверждения принадлежности полученного препарата к авенацину была осуществлена идентификация его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Миллихром -5 с обращенно-фазной колонкой икгазрЬеге С18(250x4,6мм; 5 мкм) элюент 100% метанол и вода (80:20). Смесь в количестве 100 мкл наносилась в элюенте. Хроматографический анализ показал, что время удерживания авенацина на колонке составляет 17 минут (рис.2).

D, е.о.п. 110

80 50 20 101

0 2 4 6 8 Ш ¡1 14 Гб 18 20 22

"Г, мин

Рис.2 - Хроматограмма экстракта, содержащего препарат авенацина

Согласно проведенных качественных реакций, метода ТСХ и ВЭЖХ подтверждено наличие в исследуемых образцах тритерпеновых сапонинов — это действующее начало авенацина.

3. Влияние авенацина на ростовые процессы гороха в норме и при заражении Fusarium oxysporum

Семена гороха в испытуемых растворах авенацина замачивались на 2 часа. Для выявления влияния авенацина на рост и развитие корней гороха в течение 10 суток проводились исследования изменения скорости роста корней. Наблюдалась вариабельная изменчивость длины в зависимости от концентрации авенацина. Обработка авенацином растений в концентрации приводила к полному ингибированию ростовых процессов. Выявлено, что длина корней здоровых проростков гороха, обработанных авенацином, увеличивается по сравнению с контролем в 2-3,9 раза. В случае зараженных Fusarium oxysporum проростков, длина корней, обработанных авенацином, по сравнению с контролем, выше в 2,3 - 5 раза (рис. 3-4).

П Контроль —

вода нав. 1(Г10М

нав. 10М

иав. 10~12М

2 сутки 4 сутки 6 сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

Рис.3 — Изменение длины корней гороха, обработанного авенацином (n=3; Р <0,05)

и Fusarium oxysporum

нав. 10 "10 М нав. 10 "п М Иав. 10 42 М

2 сутки 4 сутки б сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

Рис. 4 - Изменение длины корней гороха, зараженного Fusarium oxysporum и обработанного авенацином (n=3; Р <0,05)

Механизм стимулирующего действия растительных антибиотических веществ до конца не выяснен. Действие авенацина наблюдается только при совместном действии с Fusarium oxysporum, что проявляется в ускорении процесса накопления биомассы корней. Возможно, при заражении патогеном авенацин способствует усилению иммунобиологических свойств опытного растения. В отсутствие патогена взаимодействие авенацина с тканями растения приводит к замедлению роста корней.

4. Бактериостатические свойства авенацнна

Для исследования бактериостатической способности авенацина были проведены исследования на микроорганизмах: Е. Coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Эти исследования проводились в микробиологической лаборатории больницы им. С.П. Боткина г. Орла диффузионно-дисковым методом (МУК 4.2.1890-04). Были выявлены очаги подавления грамотрииательных палочковидных бактерий Е. Coli в диаметре от 2,2 до 8 мм и шаровидных грамположительных бактерий Staphylococcus aureus в диаметре 12 мм, что позволяет судить о возможности создания новых типов растительных антибиотиков и ветеринарных препаратов с использованием авенацина.

к

х

к

ÜJ

ч

СС

а <=( О с

I

о

со ОН 0) S св

S «

Staphylococcus aureus

~ E.coli

Pseudomonas aeruginosa

0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

Концентрация г/мг

Рис. 5 — Бактериостатическая активность авенацина

5.Исследование антибиотика на фунгитоксичность

Для определения биологической активности авенацина проводили тест на фунгитоксичность: на поверхность покровного стекла помещали 1 мл спиртового раствора авенацина (300 мкг/мл). Стекло с нанесенным раствором высушивали, так как недостаточное удаление растворителя повышает токсичность испытуемого раствора авенацина. Затем на поверхность предметного стекла помещали каплю тест-объекта - водной споровой суспензии Fusarium oxysporum объемом 100 мкл. Каплю накрывали покровным стеклом. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Стекла помещали в увлажненные чашки Петри и инкубировали в термостате при t°=15°C. Через 18 часов под микроскопом подсчитывают число проросших спор.

При проведении микроскопического исследования на третьи сутки наблюдали под микроскопом (*40) ингибирование авенацином (ЗООмкг/мл) спор тест-объекта Fusarium oxysporum по сравнению с контролем (дистиллированная вода) - проросшие споры (рис.6-7).

Рис.6 -- Контроль — дистиллированная вода: проросшие споры Fusarium oxysporum

Рис. 7 — Ингибирование авенацином (ЗООмкг/мл), спор Fusarium oxysporum

Следовательно, авенацин является перспективным источником для создания средства защиты растений от фитопатогена Fusarium oxysporum.

6. Определение общей токсичности авенацина как кормовой биологически активной добавки для животных

Тритерпеновые гликозиды овса посевного являются одним из классов соединений, обладающих антибиотическими свойствами Staphylococcus aureus, Candida albicans. К тритерпеновым гликозидам относится биологически активное соединение - авенацин, который обладает выраженными антимикробными свойствами в отношении условно-патогенных микроорганизмов E.Coli, Pseudomonas aeruginosa и т.д. Авенацин стимулирует иммунитет для профилактики заражения инфекционными (и неинфекционными заболеваниями).

Введение в рационы растительных антибиотических веществ в малых дозах подавляет рост патогенной микрофлоры ЖКТ (желудочно-кишечный тракт), конкурирующей с организмом за потребление питательных веществ (витаминов, жизненно важных аминокислот и др.) и создает благоприятные условия для размножения полезных микроорганизмов, синтезирующих тиамин, рибофлавин, витамин К и В|2, фолиевую кислоту и т.д.

Для 1 группы лабораторных животных авенациносодержащий продукт добавляли в готовый корм в концентрации - 20 мкг/г и кормовых

дрожжей - 20 мг/г, для 2 группы - 50 мкг/г и 50 мг/г, для 3 группы - 100 мкг/г и 100 мг/г соответственно. Контрольная группа животных получала по нормам расхода полнорационного гранулированного корма для взрослых подопытных животных - 100 г корма на группу из 5 половозрелых самцов (24±2 г).

Результаты исследования сыворотки крови белых мышей на содержание общего билирубина при введение в рацион исследуемых продуктов в разных концентрациях представлены на рисунке 8.

Рис.8 - Уровень общего билирубина в крови мышей при кормлении кормовой добавкой, мкмоль/л

Установлено, что корм с добавлением авенациносодержащего продукта является нетоксичным для экспериментальных животных. При вскрытии не наблюдалось токсического поражения печени, отека и цитолитического процесса.

Таким образом, дополнение к основному корму антибиотического вещества позволяет поддерживать продуктивное здоровье, в том числе при нарушенияхмикробного биоценоза пищеварительного тракта сельскохозяйственного животного.

7. Влияние авенацина на антиоксидантную систему гороха

Биологическая активность авенацина проявляется в действии на различные регуляторные процессы, показатели посевных качеств семян, в том числе на рост и развитие растений. Антиоксидантная система клеток является наиболее чувствительной к действию природных и химических сенсибилизаторов. В естественных условиях процесс свободнорадикального окисления находится под строгим контролем различных систем клетки [Владимиров, 1998].

Проведенные исследования показали, что динамика активности супероксиддисмутазы в проростках гороха под действием авенацина в концентрации 10"6 М резко увеличивается на вторые и шестые сутки, и снижается на четвертые сутки, что свидетельствует о стрессовом воздействии. После этого растение увядает и гибнет.

Такая ответная реакция показывает губительность авенацина в высоких концентрациях на проростки гороха, в связи с чем нами были проведены исследования по влиянию низких концентраций авенацина на динамику активности СОД.

При снижении концентрации авенацина до Ю"10М - 10"12М пики активности выражены слабее, а к 10 суткам показатели активности фермента приближаются к контролю. Таким образом, обработка авенацином в концентрации 10"12М, а в некоторых случаях и 10"''М позволяет снизить вредное воздействие и повысить показатели активности супероксиддисмутазы к десятым суткам.

При совместном действии Fusarium oxysporum и авенацина в концентрации 10"6М имеет место выраженная стрессовая реакция проростков гороха. Так, активность СОД резко увеличивается с 825 Е\г сырой массы до 1400 Е\г сырой массы на 6-е сутки. В то же время наблюдается сильное падение этого показателя на десятый день. Снижение количества авенацина (10"1ОМ -10"12М) позволяет уменьшить негативное воздействие антибактериальных веществ.

Малоновый диальдегид рассматривают как показатель степени окислительного стресса растений и структурной целостности мембран [Posmyk, 2005].

Результаты исследований накоплення малонового диальдегида в проростках гороха, подвергнутых обработке авенацином в концентрациях 10"бМ, Ю"10М -10~12М показали постепенное его накопление со вторых — четвертых суток в течение эксперимента, что может свидетельствовать о повышении уровня перекисного окисления липидов мембран в клетках растений. На шестые-восьмые сутки наблюдается постепенное понижение уровня малонового диальдегида в проростках гороха, обработанного авенацином в исследуемых концентрациях. При обработке гороха авенацином (10"6 М) содержание малонового диальдегида увеличивается до 6,6 мкмоль/г. При снижении концентрации авенацина до Ю"|0М -10"12М наблюдается увеличение уровня малонового диальдегида. В контрольном варианте с начала прорастания до четвертых суток идет накопление малонового диальдегида до 5,9 мкмоль/г., затем наблюдается постепенное снижение его содержания до десятых суток проращивания (3,7 мкмоль/г) (рис. 9).

Контроль -вода ав. 10"6М

ав. 10",0М

п ав. 10 "п М

ав. 10 ",2М

2 сутки 4 сутки б сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

Рис.9 - Динамика изменения содержания малонового диальдегида в проростках гороха, обработанного авенацином (п=3, Р<0,05)

В инфицированных Fusarium oxysporum проростках гороха, обработанного авенацином в концентрации 10"6 М содержание малонового диальдегида со вторых по шестые сутки увеличивается с 5,9 до 8,2 мкмоль/г, а при обработке авенацином гороха в концентрации 10~'°М -10"12М содержание малонового диальдегида изменяется от 5,4-4,9 мкмоль/г до 7,66,9 мкмоль/г. На восьмые сутки происходит снижение уровня малонового диальдегида во всех вариантах, а к 10 суткам наблюдается увеличение диальдегида (рис. 10).

н Fusarium

oxysporum ■ ав. 10 "бМ

и ав. 10"10М

н ав. 10'" М

ав.

Ю",2М

2 сутки 4 сутки 6 сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

Рис.10 - Динамика изменения содержания малоновогодиальдегида в зараженных Fusarium oxysporum проростках гороха, обработанного авенацином (п=3, Р<0,05)

Пероксидаза контролирует уровень перекиси водорода и низкомолекулярных антиоксидантов в клетках растений. Свободные радикалы супероксид (02) и радикал гидроксила (НО), а также перекиси повреждают и изменяют нуклеиновые кислоты, белки-ферменты, липиды мембран [Мерзляк, 1999]. В проростках гороха отмечено значительное повышение активности пероксидазы к шестым суткам с дальнейшим плавным падением, начиная с восьмых суток проращивания. Обработка проростков гороха авенацином в концентрации!О"6 М вызывает увеличение активности пероксидазы до 560 Е/г сырой массы на шестые сутки (рис.11). Активность пероксидазы в проростках гороха, обработанных авенацином в концентрациях Ю"10М -10"12М, увеличивается на шестые сутки и плавно снижается к десятым суткам. Под влиянием авенацина в концентрации 10" М активность пероксидазы изменяется от 280 до 420 Е/г сырой массы, на шестые сутки составляет 500 Е/г сырой массы. При обработке проростков гороха авенацином в концетрации 10"ИМ, 10 12М наблюдается аналогичная тенденция увеличения активности пероксидазы на шестые сутки и постепенное её снижение к десятым суткам. В контрольном варианте наблюдается постепенное увеличение активности пероксидазы от вторых до десятых суток (110-210 Е/г).

Рис.11 — Активность пероксидазы в проростках гороха, обработанного авенацином (п=3, Р<0,05)

При совместном действии Fusarium oxysporum и авенацина в концетрации 10"6 М наблюдается скачок активности пероксидазы на шестые сутки до 640 Е/г сырой массы, что говорит о выраженной стрессовой реакции проростков гороха (рис.12). Активность пероксидазы увеличивается на шестые сутки во всех вариантах проращивания и снижается к десятым суткам. Результаты исследований показали, что авенацин в концентрации 10" '"М позволяет снизить неблагоприятное воздействие антибиотических

веществ на проростки гороха.

2 сутки 4 сутки 6 сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

и Fusarium oxysporum В ав. 10 "6М

а ав. Ю"10М

н ав. 10 М

а ав. 10 "12М

Рис.12 - Активность пероксидазы в зараженных Fusarium oxysporum проростках гороха, обработанного авенацином (п=3, Р<0,05)

В систему тканевых биоантиокислителей, обеспечивающих разложение перекисей, образующихся как в результате патологических процессов, так и при деятельности СОД, входит каталаза, строго специфичная по отношению к перекисям. Активность катапазы в проростках гороха, обработанного авенацином в концентрациях 10~6 М, 10~'°М -10"'2М, выражается в близких значениях (рис.13-14). На рисунке 13 в контрольном варианте наблюдается плавное снижение активности каталазы со вторых по десятые сутки с 30 у.е. до 24 у.е.

60

2 сутки 4 сутки 6 сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

3 Контроль — вода

в ав. 10 "10М а ав. 10 "п М й ав. 10"12М

Рис.13 - Активность каталазы в проростках гороха, обработанного авенацином (п=3, Р<0,05)

При совместном действии Fusarium oxysponim и авенацина активность каталазы увеличивается до 2 Е/г сырой массы (рис.14). В контрольном варианте у инфицированных Fusarium oxysporum проростков гороха наблюдается незначительное увеличение активности пероксидазы к шестым суткам до 36 Е/г сырой массы и снижение к десятым суткам до 33 Е/г сырой массы.

□ Fusarium oxysporum

яав. 10 "6М

и ав. 10"10М

□ ав. 10 "ll М

и ав. 10 ",2 М

2 СУТКИ 4 СУТКИ 6 сутки 8 сутки 10 сутки Сутки проращивания

Рис.14 — Активность каталазы в зараженных Fusarium oxysporum в проростках гороха, обработанного авенацином (п=3, Р<0,05)

Динамика изменения активности каталазы показывает состояние метаболизма. При высоких показателях судят о нарушении обменных процессов, выражающихся в накоплении агрессивных для растений активных форм кислорода.

Заключение

Модификация методики выделения позволила получить авенацин из восьми сортов овса посевного. Анализ результатов выделения авенацина позволил выделить сортообразцы с наибольшим содержанием авенацина: «Borrus» (Германия), «CI 1580» (США), PI 186270 (Аргентина), «Гунтер» (Кировская область), «Кречет» (Кировская область). Особенностью нашего способа выделения этого вещества является использование небольшой навески порошка из корней овса. Были подобраны соотношения сухого порошка из растений и этанола, которые составили 10:250. Идентификация авенацина качественными методами подтвердила его высокую чистоту. В результате проведенного исследования было установлено, что количество авенацина в разных сортах овса колеблется от 0,29 до 0,45 мг%.

Изучение действия экзогенного авенацина на физиологические процессы в растительных организмах показало его биологическую активность. Исследование физиологического действия авенацина проводили, изучая его действие на проростках гороха. Исследовано действие авенацина на ростовые процессы гороха. Высокие концентрации авенацина (10~6М) действуют угнетающе на развитие растений на начальных стадиях, замедляя

рост корней. Установлено, что обработка гороха авенацином в низких концентрациях (10"IOM-10"I2M) оказывает стимулирующее действие на корнеобразование.

i Установлено, что при действии авенацина в концентрациях Ю^М, 10"

10М-Ю"12М на проростки гороха возникает окислительный стресс, о чем свидетельствует изменение таких индикаторов, как активность пероксидазы, каталазы, СОД и содержание малонового диальдегида, что указывает на повышение уровня перекисного окисления липидов мембран в клетках растений. При совместном действии Fusarium oxysporum и авенацина наблюдается резкое повышение активности на 6-е сутки, что говорит о выраженной стрессовой реакции растения. Концентрация авенацина 10"12М является наиболее эффективной, позволяющая снизить негативное воздействие антибиотического вещества на растение. Обобщение экспериментальных данных позволило предложить схему действия авенацина в концентрации 10"

М на антиоксидантную систему гороха (рис.] 5).

Действие авенацина при Действие авенацина

заражении Fusarium oxysporum в норме

Л

при конц. авенацина 10"12 М, постепенное снижение активности к 10-м суткам

при конц. авенацина 10"12 М, активность увеличивается на 6-е сутки, к 10-м снижается

Каталаза

С Л

при конц. авенацина 10"'2 М, активность увеличивается на 6-е сутки, к 10-м снижается Ч_/

Рис.15 - Схема действия авенацина (10"12М) на антиоксидантную систему гороха

Обработка авенацином инфицированных Fusarium oxysporum проростков гороха стимулировала корнеобразование у инфицированного растения.

Обнаружено, что авенацин в концентрации 10"12М способен к антимикробному действию. Это показано на условно-патогенных микроорганизмах: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa, E.coli, что открывает перспективы создания новых типов растительных антибиотиков.

Выводы:

1. Модифицирована методика выделения авенацина из небольшой навески биомассы с применением системы растворителей, обеспечивающая двухступенчатую экстракцию и очистку полученного вещества перекристаллизацией.

2. Скрининг сортообразцов овса на содержание авенацнна позволил выявить сорта овса с его наибольшим количеством. Максимальная концентрация авенацина отмечена в сортах «Borrus» (Германия) - 0,45 мг%, «С1 1580» (США) - 0,41 мг%, PI 186270 (Аргентина) - 0,39 мг%, «Гунтер» (Кировская область) - 0,39 мг%. Наименьшее количество авенацина содержится в сортах овса «Левша» (Кемеровская область) - 0,32 мг%, «Пушкинский голозерный» — 0,29 мг%.

3. Исследовано действие авенацина на ростовые процессы гороха. Высокие концентрации авенацина (10 6М) действуют угнетающе на развитие растений на начальных стадиях, замедляя рост корней. Установлено, что обработка гороха авенацином в низких концентрациях (10"1ОМ-10~12М) оказывает стимулирующее действие на корнеобразование. Кроме того, наблюдается стимулирование корнеобразования гороха, инфицированного Fusarium oxysporum.

4. Обнаружено, что авенацин в концентрации 10~,2М обладает антимикробным действием в отношении условно-патогенных микроорганизмов: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa, E.coli, что открывает перспективы создания новых типов растительных антибиотиков.

5. Установлено, что авенацин, выделенный из овса, обладает фунгитоксическими свойствами, что показано с использованием тест-объекта Fusarium oxysporum.

6. Установлено, что авенацин не проявляет общей биологической токсичности и поэтому может быть использован в качестве кормовой биологической добавки.

7. Установлено, что при действии авенацина в концентрациях 10" М, 10"ШМ-10"12М на проростки гороха возникает окислительный стресс, о чем свидетельствует изменение таких индикаторов, как активность пероксидазы, каталазы, СОД и содержание малонового диальдегида, что указывает на

повышение уровня перекисного окисления липидов мембран в клетках растений. При совместном действии Fusarium oxysporum и авенацина наблюдается резкое повышение активности на 6-е сутки, что говорит о выраженной стрессовой реакции растения. Концентрация авенацина 10"12М является наиболее эффективной, позволяющая снизить негативное воздействие антибиотического вещества на растение.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Перечень статей, рекомендованных ВАК.

1.Солохина ИЛО. Кормовые биологически активные добавки для промышленного животноводстваУИ.Ю. Солохина, И.А. Гнеушева, H.H. Полехина, Н.Е. Павловская// Хранение и переработка сельхозсырья. -

2012. -№3.- С. 30-32.

2. Солохина И.Ю. Исследование свойств тритерпеновых сапонинов /И.Ю. Солохина, И.А. Гнеушева, Н.Е. Павловская// Вестник Орел ГАУ -№2 (35).-2012.-С. 48-51.

3.Солохина И.Ю. Токсикологическая оценка кормовой биологически активной добавки для промышленного животноводства /И.Ю. Солохина, И.А. Гнеушева, H.H. Полехина, Н.Е. Павловская// Вестник Орел ГАУ. -

2013. -№1(40). С. 111-115.

4. Солохина И.Ю. Скрининг генотипов овса по содержанию авенацина/И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская, И.Г. Лоскутов, Е.С.Кулешова// Ученые записки ОГУ. Раздел Естественные науки,- №.3,- 2013,- С. 183-187.

Статьи и материалы конференций:

5.Акулова И.Ю. Выделение и изучение биологической активности авенацина из овса Avena sativa L. /И.Ю. Солохина // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 35-летию Орловского государственного аграрного университета «Инновационный потенциал молодых ученых - АПК Орловской области», Орел. -2010. - С.17-19.

6.Акулова И.Ю. Антибиотики растительного происхождения /И.Ю.Акулова, Н.В. Парахин, Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, И. В.Яковлева // Материалы Московскоймеждународной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов», 15-17 марта 2010 г., г. Москва. - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева.-2010. -с.114-115.

7.Солохина И.Ю. Маркеры сельскохозяйственных растений /И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская, Е.Г. Прудникова// Материалы III

Международной Интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химиисельскохозяйственному производству», Орел.- 2010. - С.24-29.

8.Солохина И.Ю. Биотехнологическое получение растительных антибиотиков /И.Ю. Солохина, И.В. Яковлева// Материалы всероссийской научно-практической конференции «Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства», Орел. - 2010.- С.193-195.

9.Солохина И.Ю. Антимикробная активность вторичных метаболитов Avena sativa и гриба рода Trichoderma /И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева// Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и биотехнология», Курск. — 2011. — С.80-83.

10.Солохина И.Ю. Выделение овса из корней овса посевного (Avena sativa L.) и изучение его биологической активности /И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская// Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «Инновации аграрной науки и производства», Орел,- 2011. — С.121-124.

11.Солохина И.Ю. Авенацин-растительный антибиотик для животноводства /И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская// Материалы Международной научно-практической конференции «Инновации аграрной науки и производству», Орел.- 2011. - С.149-152.

12.Солохина И.Ю. Оптимальные условия экстракции авенацина из овса посевного (Avena sativa L.) /И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская// Межрегиональный сборник научных работ. Выпуск №14. «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов», Воронеж. - 2012. - С.199-202.

13.Солохина И.Ю. Выделение авенацина из овса посевного (Avena sativa L.) и изучение его биологической активности /И.Ю. Солохина, Н.Е. Павловская, О.В. Дюжикова// Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых «Современный агропромышленный комплекс глазами молодых исследователей», Орел. - 2012. - С.156-158.

14.Солохина И.Ю. Способ получения авенацина из овса посевного (Avena sativa L.) /И.Ю. Солохина// Материалы V Международной Интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству», Орел. -2012.-С. 217-220.

15.Солохина И.Ю. Роль антибиотика — авенацина в защите клеток растений от окислительного стресса /И.Ю. Солохина// Материалы VI Международной заочной научно-практической Интернет-конференции «Инновационные фундаментальные и прикладные исследования в области химии сельскохозяйственному производству», Орел. — 2013. - С.55-58.

16. Патент «Способ получения стимулятора корнеобразования гороха» (решение о выдачи патента на изобретение от 25.07.13 г.).

Подписано в печать 14.11.2013 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Заказ 129. Тираж 100 экз.

Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2013, Орел, бульвар Победы, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Солохина, Ирина Юрьевна, Орел

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201454112

Солохина Ирина Юрьевна

ВЫДЕЛЕНИЕ АВЕНАЦИИА ИЗ ОВСА ПОСЕВНОГО (Avena sativa L.) И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ

ДЕЙСТВИЯ

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор

Павловская Нннэль Ефимовна

Орел - 2013

Содержание Стр.

Введение 5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Вторичные метаболиты высших растений, биологическая роль 10 1.1.1. Авенацин - растительный антибиотик из овса посевного 13

1.2. Растительные тритерпеновые гликозиды (сапонины), их значение 16

1.2.1. Методы выделения сапонинов 19

1.2.2. Химическое строение, распространение и функциональное значение тритерпеновых и стероидных гликозидов 22

1.3. Влияние структуры углеводной цепи на мембранную активность сапонинов 23

1.4. Ботаническая характеристика и биология овса 27

1.4.1. Качественный состав зерна овса 30

1.4.2. Болезни овса 32

1.5. Антиоксидантная система 35 Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 45 2.1. Биохимические методы исследования 45

2.1.1. Объекты исследования 45

2.1.2. Определение активности пероксидазы 48

2.1.3. Определение активности каталазы 48

2.1.4. Определение активности супероксиддисмутазы 49

2.1.5. Определение содержания малонового диальдегида 50

2.1.6. Определение тритерпеновых сапонинов в навеске порошка из корней овса с помощью качественных реакций 51

2.1.7. Определение тритерпеновых сапонинов методом тонкослойной хроматографии 51

2.1.8. Определение фунгитоксичности 52

2.1.9. Определение общей токсичности авенацина как кормовой биологически активной добавки для животных на белых лабораторных мышах

2.2. Приготовление растворов антибиотических препаратов для методов серийных разведений 54

2.3. Определение чувствительности авенацина к мироорганизмам 55 диско-диффузионным методом

Глава 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 57

3.1. Выделение и очистка антибиотика авенацина 57

3.2 Качественный анализ авенацина 61

3.3. Влияние авенацина на ростовые процессы гороха в норме и при инфицировании Fusarium oxysporum 67

3.4. Бактериостатические свойства авенацина 70

3.5 Исследование антибиотика на фунгитоксичность 73

3.6. Определение общей токсичности авенацина как кормовой биологически активной добавки для животных 78

3.7. Влияние авенацина на антиоксидантную систему гороха 82 Заключение 98 Выводы 101 Список литературы 102 Приложения

Список сокращений

АБП - антибактериальный препарат;

АКС - активные кислородные соединения;

АТФ - аденозинтрифосфат;

АФК - активные формы кислорода;

ТСХ - тонкослойная хроматография;

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

СОД - супероксиддисмутаза;

МДА - малоновый диальдегид;

УФ - ультрафиолет;

ИАОРН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат востановленный; ЖКТ - желудочно-кишечный тракт; ПАВ - поверхностно-активные вещества; ПОЛ - перекисное окисление липидов;

Введение

Актуальность работы. Высшие растения синтезируют широкий спектр вторичных метаболитов - фитоантисипинов, которые синтезируются растением в течение всего цикла вегетации и обладают полифункциональным типом действия: антибиотическим, фунгицидным, иммуностимулирующим. По степени изученности фитоантисипины во многом уступают индуцибельным защитным веществам растений, но именно они являются одним из первых химических барьеров на пути проникновения патогена (Лутова, Проворов, 2000).

Основные классы фитоантисипинов представлены тритерпеновыми гликозидами, стероидами, стероидными гликоалкалоидами. На сегодняшний день малоизученными остаются тритерпеновые гликозиды овса посевного.

Овес посевной (Avena sativa L.) - одна из важнейших сельскохозяйственных культур. Зерно овса характеризуется повышенным содержанием в белке незаменимых аминокислот, витаминов и других биологически активных соединений. Кроме того зерно овса обладает высоким содержанием белка и масла. Овес обладает устойчивостью к болезням и неблагоприятным факторам среды (Родионова, Солдатов, 1994).

Установлено, что в зерне овса содержатся водорастворимые антибиотические вещества, выделяющиеся в окружающую среду при увлажнении зерна и тем самым защищающие его от микроорганизмов (Ежов, Новотельнов, 1957). Так же из корней овса было выделено антибиотическое вещество -авенацин ( Maizel, Burkhardt et al., 1963).

Авенацин по химической природе относится к тритерпеновым гликозидам. Установлена эмпирическая формула авенацина- C55HB3NO21 и вычислена его молекулярная масса - 1100,33.В дальнейшем была показана его бактериостатическая и фунгицидная активность.

Авенацин отличается широким спектром действия и низкой токсичностью. Авенацин эффективен в борьбе против корневых гнилей пшеницы и ячменя,

вызываемых грибным патогеном Ophiobolus graminis (Bryan, Labourdette, 1999; Osbourn, Goss, 2011).

На сегодняшний день вопросом изучения авенацина занимаются Osbourn А. (Великобритания), Kemal М. (Турция). Их работы посвящены генетическим исследованиям пути синтеза авенацина из мевалоновой кислоты. Вместе с тем, данные о воздействии антибиотика на растительные объекты отсутствуют.

Известно, что антибиотики природного происхождения представляют собой альтернативное средство защиты растений от болезней. В тканях растений их биологическая активность, проявляется значительно сильнее, чем в животных тканях. Антибиотики обладают избирательным действием, снижая тем самым уровень вредного воздействия на растение (Павловская, 2012).

Реакция растений на обработку авенацином остается слабо изученной. В связи с этим, исследование физиологического действия авенацина по отношению к растениям, не содержащим антибактериальные вещества, является актуальным и важным.

Представляет интерес накопление авенацина в различных сортах овса посевного, изменение его содержания в зависимости от сорта, выявление источников с высоким содержанием авенацина.

В связи с этим, цель данной работы выделить авенацин из корней овса посевного и исследовать его физиолого-биохимические аспекты действия. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести количественное выделение авенацина из различных по устойчивости сортов овса посевного, методом экстракционного извлечения с применением системы растворителей.

2. Идентифицировать полученный авенацин с помощью качественных реакций, метода тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Исследовать действие различных концентраций авенацина на интенсивность ростовых процессов гороха.

4. Изучить активность ферментов антиоксидантной системы: пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы и содержание малонового диальдегида в проростках гороха.

5. Исследовать биологическую активность авенацина: фунгитоксичность в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum', антимикробную активность в отношении условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E.coli; общую токсичность авенацина как кормовой биологически активной добавки для животных.

Научная новизна работы. Впервые проведен анализ генотипов овса на содержание авенацина и выявлены образцы с наибольшим выходом этого антибактериального вещества. Определены оптимальные параметры растворителей для максимального извлечения авенацина из малой навески биомассы. Получены результаты влияния авенацина на рост и развитие здоровых и инфицированных Fusarium oxysporum корней гороха. Установлены ростостимулирующие свойства авенацина, при заражении проростков гороха Fusarium oxysporum. Подтверждены бактериостатические свойства авенацина.

Изучена активность ферментов антиоксидантной системы в проростках гороха,

6 12

обработанных авенацином в концентрациях 10"°М - КГ'М. Показана возможность использования авенацина в качестве нетоксичной кормовой биологически активной добавки для животных.

Практическая и теоретическая значимость. Расширены и углублены знания о действии авенацина на физиологические процессы в растительных объектах. Данные, свидетельствующие о бактериостатических свойствах авенацина, а также о стимулирующем влиянии на физиологические процессы растений, зараженных Fusarium oxysporum, открывают перспективы его использования в растениеводстве в качестве безопасного средства защиты растений от патогенов, а также в ветеринарии в качестве нетоксичной кормовой биологически активной добавки. Разработан способ получения стимулятора корнеобразования гороха.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Орловского государственного аграрного университета при чтении лекций по биохимии, микробиологии, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Положения, выносимые на защиту

- Выделение авенацина из корней овса посевного по модифицированной методике.

- Идентификация авенацина качественными методами.

-Авенацин в концентрациях Ю"10 - 10"12 М стимулирует корнеобразование гороха в норме и при заражении Fusarium oxysporum.

- Воздействие авенацина в концентрации на горох в норме и при инфицировании Fusarium oxysporum вызывает выраженный окислительный стресс. Однако влияние авенацина в более низких концентрациях

(Ю"10 - 10"12 М)

вызывает стимулирующее действие.

- Авенацин обладает бактериостатическими характеристиками в отношении Staphylococcus aureus, E.coli и фунгитоксичными свойствами в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональных конференциях. Они были представлены на региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства» (Орел, 2009), региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященный 35-летию Орловского государственного аграрного университета «Инновационный потенциал молодых ученых - АПК Орловской области» (Орел, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства» (Орел, 2010), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010), «АПК в современном мире: взгляд научной молодежи» (Орел, 2011),

международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК, Патент РФ №2500105.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 180 источников. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 40 рисунками.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Вторичные метаболиты высших растений, биологическая роль.

Вторичные метаболиты - это низкомолекулярные соединения, которые производятся ограниченным числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе. Они являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи - ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью (Яковлев, 2006).

М. Лукнер отметил следующие особенности вторичных веществ: «разнообразие химического строения, ограниченность распространения, а также связь этих веществ с дифференциацией клеток и тканей. Кроме того, он сделал важное заключение, что вторичные вещества важны для продуцирующего их организма как целого и не играют роли для жизни синтезирующей их клетки».

В настоящее время большое значение уделяется изучению природных веществ, обладающих антибактериальными свойствами, а также их влиянию на рост и развитие растений. Антибиотические вещества широко применяются во многих отраслях народного хозяйства, в том числе в растениеводстве в качестве средств борьбы с патогенами и профилактики грибковых и бактериальных заболеваний (Osbourn, 2010; Chu, Osbourn et al., 2011).

Антибиотики обладают рядом ценных преимуществ в борьбе с фитопатогенными микроорганизмами. Они легко проникают в органы и ткани растений, поэтому их влияние в меньшей степени зависит от неблагоприятных климатических условий; обладают антибактериальным действием в тканях растений и сравнительно медленно инактивируются в них; основные антибиотики, используемые в лечебных дозах, нетоксичны для растений (Алехина, Балнокин, 2007).

Особенно широкое распространение растительные антибиотики получили в связи с хозяйственной деятельностью человека, которая губительно воздействует на окружающую среду. Поэтому важным является получение экологически

безопасных средств защиты растений от различных патогенов. Кроме того, актуальным является получение веществ, обладающих антифунгальными свойствами. Главную роль среди этих веществ играют алкалоиды и тритерпеновые сапонины (ОзЬоигп, 2001). Этим и объясняется возросший интерес к вторичным метаболитам природного происхождения, регулирующим многие биологические процессы в биоценозах.

О существовании биологически активных веществ растительного происхождения, способных оказывать воздействие на биологические объекты, человек знал еще с давних времен. Попытки использовать эти активные вещества для борьбы с патогенами, поражающие сельскохозяйственные растения, также предпринимались очень давно. Но только во второй половине 20 века, в связи со стремительным развитием химии природных соединений и биохимии, спектр «вторичных соединений» значительно расширился. Количество известных на сегодняшний день вторичных метаболитов составляет примерно 70-80 тысяч. Однако это очень малая часть от реально существующих в живой природе (Семенов,2000).

Многие вторичные соединения принимают участие в экологических механизмах взаимосвязи между микроорганизмами, растениями и животными, и играют важную роль в защитных механизмах растений, направленных на предотвращение их повреждений вредными организмами. Наиболее известные вторичные метаболиты - антибиотики, фитоалексины, растительные токсины, регуляторы роста и поведения, контролирующие внутривидовые и межвидовые связи в биоценозах (Племенков, 2001).

Вторичные метаболиты могут выступать в роли аллелохимических агентов - веществ, способствующих взаимодействию между видами, и могут обладать активностью аттрактантов, репеллентов, антибиотиков и защитных веществ. Большинство вторичных соединений имеют несомненно важное значение для взаимоотношений между организмами, приводящих к образованию характерных сообществ, где могут существовать вместе различные виды микроорганизмов,

высших растений и животных, характерным образом, стимулируя или угнетая друг друга (Пасешниченко,1991). Вещества, которые непосредственно принимают участие в аллелохимических взаимодействиях: фенолы, алкалоиды, эфирные масла, сапонины (Volkov,1999; Oleszek et al., 1999; Wink, 2010; Zobel, 1999).

Биологически активные вещества, которые выделяют из растений, могут быть использованы как природное сырье для создания новых препаратов, получаемых химическим путем, либо быть основой синтеза новых биологически активных веществ (Balandrin, 1985; Einhellig, 1985; Strunz, Finlay, 1994).

Повышенный интерес к растительным антибиотическим веществам объясняется, в первую очередь, необходимостью найти удовлетворяющую экологическим требованиям, замену традиционным пестицидам, применяемым для борьбы с патогенами. При этом предполагается, что на основе растительных метаболитов могут быть созданы как препараты, характеризующиеся высокой избирательностью действия на биологические объекты, так и химические средства защиты растений, обладающие широким спектром действия и сочетающие в себе полифункциональную биологическую активность. Данные вещества одновременно могут обладать инсектицидной, фунгицидной, ростостимулирующей или другими типами активности (Буров, Сазонов, 1987; Sato, 1994; Sesma, Osbourn, 2004).

Таким образом, устойчивость растений к патогену обеспечивается отсутствием таких веществ, которые необходимы для роста и развития патогенов, либо выработкой антимикробных соединений. В этом аспекте, особое внимание уделяется экзогенному применению и получению веществ, которые являются аналогами веществам, синтезирующимся растением в ответ на заражение. (Запрометов, 1993; Osbourn, 2003; Theis, Lerdau, 2003).

Для обеспечения своей защиты растения синтезируют большое количество различных соединений. Научные представле