Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов"

На правах рукописи

Галиуллина Ленара Фаилевна

ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ

06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2013

~ 4 ИЮЛ 2013

005531163

Работа выполнена на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: Карташова Ольга Львовна

доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»

Официальные оппоненты: Андреева Альфия Васильевна

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой инфекционных болезней, зоогигиены и ветсанэкспертизы, ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»

Галиуллин Альберт Камилович

доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, декан факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ульяновская

государственная сельскохозяйственная академия»

Защита диссертации состоится «18» июня 2013 года в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» по адресу: 450001, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34/2, ауд. №325.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», с авторефератом - на сайте университета http://www.bsau.ru и Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru.

Автореферат разослан 17 мая 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, докторсельскохозяйственных наук, профессор С М.Г. Гиниятуллин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антимикробные пептиды, синтезируемые организмами различного уровня организации (от губок до человека), являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета, которая обеспечивает первую линию защиты от инфекций человека и животных и без которой невозможно выживание в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами (Кокряков В.Н., 2006). Ранее были изучены антимикробные пептиды, выделенные из нейтрофилов человека, кролика и мыши (Бухарин О.В. с соавт., 2000); а также из лейкоцитов русского осетра (Шамова О.В. с соавт., 2006).

Особое внимание исследователи уделяют низкомолекулярным катионным белкам из тромбоцитов человека и животных - тромбодефенсинам (Бухарин О.В. с оавт., 2000; Jenssen H. et al., 2006), поскольку тромбоциты адгезируются на патогенных микроорганизмах, при взаимодействии с ними in vitro высвобождают низкомолекулярные бактерицидные белки, обладают противогрибковым и антипрото-зойным действием (Jenssen H. et al., 2005).

Широко изучаются тромбоцитарные катионные белки (ТКБ), выделенные из тромбоцитов человека (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Сулейманов К.Г. с соавт., 1979, 1983; Сулейманов К.Г., 1990, 1998; Boman H., 1996), установлено, что ТКБ уменьшает адгезию бактерий на соматических клетках и изменяет перси-стентные характеристики стафилококков и эшерихий (Бухарин О.В. с соавт., 2000); ингибирует биопленкообразование S. aureus (Журлов О.С. с соавт., 2012). Литературные данные указывают на наличие тромбодефенсинов в сыворотке крови многих видов животных: крыс, кроликов, лошадей, коров, морских свинок, голубей, овец, уток, индеек, белых мышей, свиней и других (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Горюхина O.A., Ткаченко A.A., 1978; Сулейманов К.Г. с соавт., 1979; Pet-tersson А., 1935; Donaldson D.M., Marcus S., 1958). Обнаружены антимикробные пептиды в тромбоцитах кур, изучена антимикробная активность тромбодефенсинов лошадей, крупного рогатого скота, коз, свиней, собак, кур и их антиперсистентное действие (Сычева М.В. с соавт., 2009, 2010,2011).

Формирование антибиотикорезистентных форм микроорганизмов диктует необходимость поиска новых средств терапии инфекционных заболеваний (Яковлев В.П., Яковлев C.B., 2008). Альтернативой антибиотикам, к большинству которых бактерии приобрели устойчивость, могут стать тромбодефенсины (Jenssen H. et al., 2006).

В связи с вышеизложенным, интерес представляет изучение биологических свойств и поиск наиболее эффективных антимикробных белков из тромбоцитов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния антимикробных пептидов из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить влияние тромбодефенсинов, полученных из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры), на чувст-

вительность к антимикробным средствам грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida.

2. Изучить антагонистическую активность нормальной микрофлоры кишечника животных (микроорганизмы рода Lactobacillus, E.coli, Е. faecium) в отношении условно-патогенных микроорганизмов после их соинкубирования с тромбо-дефенсинами сельскохозяйственных животных.

3. Оценить влияние тромбодефенсинов на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна исследований.

Изучено влияние тромбодефенсинов (ТД), полученных от сельскохозяйственных животных, на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов.

При изучении влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры) на антибиотикочувствительность грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida установлено преимущественное повышение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антимикробным средствам. При этом наибольший эффект оказывают ТД кур и лошадей.

Достоверное повышение чувствительности к антибиотикам отмечено у E.coli и Е. faecalis после соинкубирования с ТД кур в минимальной подавляющей концентрации (МПК); у S. aureus с ТД крупного рогатого скота и лошадей в МПК; К. pneumoniae - с ТД лошадей и кур в 1А МПК; С. albicans - с ТД кур в МПК и ТД лошадей в 'А МПК. Установлено, что выраженность данного признака зависит от механизма действия антимикробного средства, к которому определяли чувствительность.

Показано, что у условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) под влиянием тромбодефенсинов повышается чувствительность к антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных. Максимальное повышение чувствительности УПМ к антагонистическому действию штаммов Е. coli и Е. faecium, выделенных из пробиотиков, зарегистрировано, преимущественно, в результате соинкубирования УПМ с тромбодефенсинами кур и лошадей, а к антагонистическому действию лактобацилл - после их соинкубирования с ТД крупного рогатого скота.

Установлено, что тромбодефенсины, выделенные из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры), однона-правлено снижают антилизоцимную активность условно-патогенных бактерий, а также С. albicans. Максимальное подавление способности микроорганизмов инак-тивировать лизоцим выявлено после их соинкубирования с тромбодефенсинами лошадей в 'А МПК.

Практическая значимость работы.

Полученные знания о том, что тромбодефенсины с одной стороны, повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антибиотикам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, а с другой, ингибируют их антилизоцимную активность, способствующую персистен-ции микроорганизмов, позволяет расширить арсенал пептидов в перспективе пригодных для лечения и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний животных. Проведенный сравнительный анализ влияния ТД разных видов сельскохозяйственных животных на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов показал, что наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

Результаты исследований используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» при преподавании дисциплин «Иммунология» и «Антибиотики» студентам специальности «Микробиология» и «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Ветеринария».

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» «Функциональные свойства антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных» (№ государственной регистрации 0120.1252048).

Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию со дня рождения профессора Ю. В. Храмова «Энтузиазм и творчество молодых учёных, студентов в развитии ветеринарной медицины» (Оренбург, 2011); Первой молодежной научной школе — конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011); Международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ (Ставрополь, 2012); II региональном молодежном инновационном конвенте Оренбургской области (Оренбург, 2012).

Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 9 от 22 января 2013 года).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Тромбодефенсины сельскохозяйственных животных модифицируют биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов — повышают их чувствительность к антимикробным средствам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, ингибируют способность к инактивиро-вать лизоцим.

2. Выраженность действия тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных в отношении биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов

определяется видом животного, являющегося источником тромбодефенсинов, при этом наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

Публикация результатов исследований. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в семи печатных работах, из них шесть - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Материалы диссертации представлены на областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2011» (Оренбург, 2011) и отмечены сертификатом победителя. Работа удостоена диплома Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук на Всероссийском фестивале науки (Ульяновск, 2011) и гранта Оренбургского ГАУ по результатам конкурса научно-технических и инновационных проектов «Прорыв» (Оренбург, 2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста; включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения результатов исследований, выводы, практические предложения и библиографический список, приложение. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками. Библиографический список включает 206 источников, в том числе - 143 иностранных авторов.

За содействие и помощь в освоении методик, а также проведении цикла экспериментов по теме диссертации, выражаем благодарность заведующей кафедрой микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет», кандидату биологических наук М.В. Сычевой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Кровь для получения ТД была взята у клинически здоровых животных хорошей упитанности (лошади - 5 голов трех-четырех летнего возраста; крупный рогатый скот - 5 голов пяти-семилетнего возраста) при убое на скотобойнях, а также на базе частных фермерских хозяйств Беляевского и Переволоцкого районов Оренбургской области; у кур-бройлеров - на заключительном этапе откорма при массовом убое на ЗАО птицефабрика «Оренбургская» Оренбургского района Оренбургской области (2000 голов).

Взятие крови проводили с соблюдением санитарно-гигиенических правил и стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия из расчета 1:10. Автотранспортировку и выделение тромбоцитарной массы проводили в течение шести часов после получения крови.

Кислоторастворимые белки тромбоцитов сельскохозяйственных животных выделяли методом кислотной экстракции. Содержание белка в полученных кислотных экстрактах определяли по методу М.М. Брэдфорда (1976) с использованием красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 («SIGMA», Германия).

Исследования по изучению влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов проводили в период с 2010 по 2013 гг. на базе кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет». С целью определения влияния ТД на микроорганизмы взвесь суточных агаровых культур в стериль-

ном изотоническом растворе NaCl оптической плотностью 0,270 при 650 нм, разведенную 1:1000 стерильным физиологическим раствором с бычьим сывороточным альбумином, соинкубировали с кислотными экстрактами из тромбоцитов, после чего высевали на плотные питательные среды и через сутки инкубирования у выросших культур изучали биологические свойства. В качестве контроля использовали те же культуры микроорганизмов, которые инкубировали с 10%-ным раствором ацетата, нейтрализованного до рН 5,5-5,8. В экспериментах использовали клоны условно-патогенных микроорганизмов, которые получали путем рассева суточной культуры на плотную питательную среду в соответствии с указаниями Дж. Миллера (1976). Штаммы условно-патогенных микроорганизмов (S. aureus, Е. coli гем+, К. pneumoniae, С. albicans, Е. faecalis) получены из коллекции лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистентных свойств бактерий ИКВС УрО РАН.

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли с помощью диско-диффузионного метода (Методические указания 4.2.1890-04,2004).

В эксперимент по изучению влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам нормальной микрофлоры экспериментально отобрали антагонистически активные культуры рода Lactobacillus (L 364 и L 370) среди штаммов, выделенных из толстого кишечника крупного рогатого скота, а также использовали штамм E.coli S5/98, выделенный из пробиотика «Микроци-кол» (ООО «БИО БЭК» г. Ефремов Тульской области) и Е. faecium DSM 106663 NCIMB 10415, выделенный из пробиотика «Оралин 35 G» (Chevita GmbH, Германия). Культуры идентифицировали по морфологическим, тинкториальным, культу-ральным и биохимическим свойствам.

Чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам нормальной микрофлоры определяли с помощью чашечного метода (принцип отсроченного антагонизма) (Кудлай Д.Г., Лиходед В.Г., 1966). Степень чувствительности к антагонистическим факторам выражали с помощью коэффициента, который рассчитывали как отношение диаметра зоны задержки роста условно-патогенного микроорганизма к диаметру зоны роста представителей нормальной микрофлоры.

Определение антилизоцимной активности (АЛА) микроорганизмов осуществляли с помощью фотометрического метода (Бухарин О.В., 1999).

Полученные численные материалы обработаны статистически с определением средних значений, среднего квадратического отклонения и средней ошибки средней. Достоверность различий сравниваемых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05 (Ла-кин В.Г., 1990). Схема исследования представлена на рис.1.

Рис.1. Общая схема исследования

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антибиоти-кочувствительность условно-патогенных микроорганизмов

Нами было изучено влияние ТД, выделенных от сельскохозяйственных животных, на чувствительность (устойчивость) микроорганизмов разных видов к антимикробным средствам. Основой для выбора соответствующих антибактериальных препаратов явились данные о природной чувствительности к ним использованных в данном исследовании видов микроорганизмов.

Вначале мы определили влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных в МПК и 'А МПК на чувствительность клонов Е. coli к левомицетину, канамицину, ломефлоксацину. Максимальная зона задержки роста кишечной палочки отмечена после ее соинкубирования с кислотным экстрактом из тромбоцитов кур в МПК и V* МПК под действием ломефлоксацина (24,7±1,5 мм, р<0,05 и 23,7±1,4 мм, соответственно, против 20,7±0,8 мм в контроле). Зоны задержки роста Е. coli после соинкубирования с ТД лошади в МПК были равны 21,7±1,2 мм, в 'А МПК 22,3±0,6 мм; с ТД крупного рогатого скота - 21,8±1,5 мм в МПК и 21,5±1,7 мм в '/< МПК (табл.1).

Зоны задержки роста Е. coli к канамицину в контроле составляли 15,2±2,5 мм и увеличились после ее соинкубирования с ТД лошади и крупного рогатого скота в МПК до 18,8±1,2 мм и 19,0±1,8 мм, соответственно; в % МПК до 16,0±2,0 мм и 16,5±1,6 мм. ТД кур в 'А МПК повышали чувствительность клонов Е. coli к данному антибиотику до 17,2±1,7 мм, тогда как в МПК не изменяли (15,2±0,5 мм).

Таблица 1

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антибиотикочувствительность Е. coli

Тромбодефенсины Зоны задержки роста Е.соИ (п=6) под воздействием антибиотиков (мм)

левомицетин канамицин ломефлоксацин

Лошади МПК 20,3±0,8 18,8±1,2 21,7±1,20

1/4 МПК 19,3±0,9 16,0±2,0 22,3±0,6

Куры МПК 20,5±0,9 15,2±0,5 24,7±1,5*

1/4 МПК 19,0±0,6 17,2±1,7 23,7±1,4

Крупный рогатый скот МПК 20,7± 1,20 19,0±1,8 21,8±1,5

1/4 МПК 19,8±1,40 16,5±1,6 21,5±1,7

Контроль 19Д±0,8 15,2±2,5 20,7±0,8

Примечание: *-р<0,05

После соинкубирования кишечной палочки с ТД кур, лошадей и крупного рогатого скота в МПК зарегистрировано повышение чувствительности к левомицетину (зоны задержки роста Е. coli составили 20,5±0,9 мм; 20,3±0,8 мм; 20,7±1,2 мм) и отсутствие изменений по сравнению с контролем, равным 19,2±0,8 мм; при со-инкубировании с ТД в 'А МПК - 19,0±0,6 мм, 19,3±0,9 мм, 19,8±1,4 мм, соответственно.

Далее мы изучили влияние ТД сельскохозяйственных животных на чувствительность к антибиотикам клонов S. aureus (табл.2).

После их соинкубирования с ТД в МПК зоны задержки роста микроорганизмов под влиянием гентамицина составляли 20,0±0,5 мм (ТД лошади); 19,5±0,7 мм (ТД кур); 20,7±0,8 мм (ТД крупного рогатого скота); в % МПК - 19,7±0,8 мм; 20,7±0,6 мм; 19,8±0,6 мм, соответственно (контроль равен 18,2±1,4 мм). У клонов S. aureus в контроле зоны задержки роста под воздействием левомицетина составляли в среднем 21,3±0,6 мм и практически не изменялись после соинкубирования микроорганизмов с ТД лошади в % МПК (21,8±0,7 мм); ТД кур в МПК (20,8±2,3 мм) и 'Л МПК (21,8±0,7 мм); ТД крупного рогатого скота в МПК (21,8±0,8 мм) и % МПК (21,0±0,7 мм), незначительно увеличиваясь после соинкубирования с ТД лошади в МПК до 22,3±0,7 мм. Наиболее эффективно повышали чувствительность золотистых стафилококков к канамицину ТД лошади в 'Л МПК (до 25,0±2,3 мм), при со-инкубировании S. aureus с ТД в МПК, зоны задержки роста составляли 23,0±1,0 мм. При воздействии ТД кур в МПК зоны задержки роста S. aureus под влиянием канамицина увеличивались до 22,0±0,3 мм, в % МПК до 23,8±2,1 мм; ТД крупного рогатого скота до 24,3±1,3 мм (р<0,05) и 22,5±0,7 мм, соответственно.

Зоны задержки роста S. aureus к оксациллину после соинкубирования с ТД лошадей, кур, крупного рогатого скота в МПК практически не изменялись (19,2±1,1мм, 19,8±0,9 мм, 19,7±0,7 мм) в сравнении с контролем (19,5±0,6 мм); с ТД лошадей в % МПК незначительно увеличивались (до 20,5±0,9 мм); а с ТД кур и крупного рогатого скота в V* МПК даже уменьшались и составляли 18,2±0,7 мм и 18,5±0,7 мм.

Таблица 2

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антибиотикочувствнтельность S. aureus

Тромбодефенсины Зоны задержки роста S. aureus (п-6) под воздействием антибиотиков (мм)

гентами-цин левоми-цетин кана-мицин оксацил-лин эритромицин

Лошадь МПК 20,0±0,5 22,3±0,7 23,0±1,0 19,2±1,1 24,3±0,9*

1/4 МПК 19,7±0,8 21,8±0,7 25,0±2,3 20,5±0,9 23,8±1,1

Куры МПК 19,5±0,7 20,8±2,3 22,0±0,3 19,8±0,9 23,3±0,9

1/4 МПК 20,7±0,6 21,8±0,7 23,8±2,1 18,2±0,7 19,7±1,3

Крупный рогатый скот МПК 20,7±0,8 21,8±0,8 24,3±1,3* 19,7±0,7 24,0±0,6

1/4 МПК 19,8±0,6 21,0±0,7 22,5±0,7 18,5±0,7 23,3±0,5

Контроль 18,2±1,4 21 ¿±0,6 21,8±0,6 19,5±0,6 22,5±0,4

Примечание: * - р<0,05

В результате соинкубирования с ТД лошадей, крупного рогатого скота и кур в МПК чувствительность S. aureus к эритромицину также повышалась (контроль 22,5±0,4 мм): зоны задержки роста золотистых стафилококков составляли 24,3±0,9 мм (р<0,05), 24,0±0,6 мм, 23,3±0,9 мм, соответственно, в V* МПК 23,8±1,1 мм (ТД

лошадей) и 23,3±0,5 мм (ТД крупного рогатого скота); тогда как после соинкуби-рования с ТД кур % МПК уменьшались по сравнению с контролем и составляли 19,7±1,3 мм.

Зоны задержки роста клонов К. pneumoniae после предварительного их соин-кубирования с ТД лошади в МПК, кур в % МПК и крупного рогатого скота в обеих изученных концентрациях под влиянием полимиксина увеличивались в 1,6-1,7 раза и составляли 7,2±0,8 мм; 7,3±0,9 мм; 7,5±0,8 мм; 7,3±0,9 мм, соответственно, в сравнении с контролем, равным 4,4±1,8 мм. После соинкубирования с ТД кур в МПК зоны задержки роста микроорганизма составляли в среднем 8,6±3,3 мм; достоверное увеличение зон задержки роста клебсиелл к полимиксину до 10,3±1,2 мм (р<0,05) было отмечено после их соинкубирования с ТД лошади в 14 МПК.

К гентамицину зоны задержки роста К. pneumoniae после соинкубирования с ТД лошадей в Ул МПК и ТД кур в обеих концентрациях увеличивались до 20,1±0,5 мм, 20,3±0,8 мм, 20,4±0,7 мм (р<0,05); тогда как с ТД лошадей в МПК и % МПК ТД крупного рогатого скота до 21,8±2,1 мм и 22,5±2,01 мм, соответственно. Чувствительность К. pneumoniae к гентамицину увеличивалась после соинкубирования с ТД крупного рогатого скота в МПК, зона задержки роста составила 19,4±1,1 мм против 18,3±2,0 мм в контроле.

В результате соинкубирования клебсиелл с ТД, чувствительность отобранных клонов к левомицетину увеличивалась под воздействием антимикробных пептидов из тромбоцитов крупного рогатого скота в МПК до 19,5±0,7 мм, лошадей в МПК до 19,9±1,4 мм, кур в V* МПК до 20,4±1,3 мм и МПК до 21,4±1,5 мм, ТД крупного рогатого скота в V* МПК до 21,6±1,0 мм; тогда как под воздействием ТД лошади в V* МПК, наоборот, даже незначительно снижалась и средние зоны задержки роста данных микроорганизмов были ниже контрольных значений и составляли 18,7±2,6 мм (табл. 3).

Таблица 3

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на анти-

бнотнкочувствительность К. pneumoniae

Тромбодефен- Зоны задержки роста К. pneumoniae (п=6) под воздействием антибиотиков (мм)

сины поли- гентами- левоми- олеандо- ломефло-

миксин цин цетин мицин ксацин

МПК 7,2±0,8 21,8±2,1 19,9±1,4 19,7±1,4 21,6±0,9

Лошадь '/4 МПК 10,3±1,2* 20,1±0,5 18,7±2,6 19,3±2,6 21,9±0,7

МПК 8,6±3,3 20,3±0,8 21,4±1,5 20,7±2,5 22,9±1,4

Куры '/4 МПК 7,3±0,9 20,4±0,7* 20,4±1,3 18,6±0,6 21,4±0,6

Крупный МПК 7,5±0,8 19,4±1,1 19,5±0,7 20,7±1,8 23,5±1,8

рогатый •л 7,3±0,9 22,5±2,0 21,6±1,0 18,1±0,6 22,0±1,3

скот МПК

Контроль 4,4±1,8 18,3±2,0 18,9±1,7 18,6±1,3 21,1 ±0,6

Примечание: *-р<0,05

Изучение влияния ТД сельскохозяйственных животных на чувствительность К. pneumoniae к олеандомицину показало отсутствие эффекта после предварительного соинкубирования клебсиелл с ТД кур и крупного рогатого скота в концентрации 1А МПК (18,6±0,6 мм и 18,1±0,6 мм), увеличение зон задержки роста клонов после их предварительного соинкубирования с ТД лошадей в обеих изученных концентрациях до 19,7±1,4 мм и 19,3±2,6 мм и с ТД кур и крупного рогатого скота в МПК до 20,7±2,5 и 20,7±1,8 мм.

Зоны задержки роста клонов клебсиелл под воздействием ломефлоксацина после их соинкубирования с ТД кур в МПК составили 22,9±1,4 мм и с ТД крупного рогатого скота в обеих изученных концентрациях - 23,5±1,8 мм и 22,0±1,3 мм, со-инкубирование с ТД лошадей в обеих концентрациях и ТД кур в 'Л МПК не оказывало заметного действия на их чувствительность к ломефлоксацину (21,6±0,9 мм, 21,9±0,7 мм, 21,4±0,6 мм) по сравнению с контролем (21,1±0,6 мм).

Оценка влияния ТД сельскохозяйственных животных на чувствительность Е. faecalis к антибиотикам позволила установить увеличение зон задержки роста клонов под воздействием стрептомицина после соинкубирования Е. faecalis со всеми изученными ТД, при этом наиболее эффективными оказались тромбодефенсины кур в МПК (13,0±0,7 мм, р<0,05) и лошадей в МПК (11,2±1,9 мм) (табл.4).

Таблица 4

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на антибиотикочувствительность Е. faecalis

Тромбодефенсины Зоны задержки роста Е. faecalis (п=6) под воздействием антибиотиков (мм)

стрептомицин левомице-тин канамицин ампициллин эритромицин

Лошадь МПК 11,2±1,9 21,3±0,9 24,2±0,9 7,8±1,9 24,5±1,2

■/4 МПК 9,3±0,6 21,3±1,6 25,0±0,7 8,0±1,7 23,8±1,1

Куры МПК 13,0 ±0,7* 19,0 ±0,8 22,2 ±1,1 10,0 ±0,6 23,5 ±0,8

% МПК 9,1±0,4 20,3±1,9 24,8±0,7 11,8±2,7 24,9±1,1

Крупный рогатый скот МПК 9,1±0,1 21,8±0,8 27,5±1,8 10,5±0,5 23,3±1,5

■Л МПК 9,9±0,4 22,5±2,0 24,7±1,9 10,6±0,8 23,8±0,8

Контроль 7,0±1,8 17,3±1,1 24,1±1,2 8,1±1,7 22,9±1,1

Примечание: *-р<0,05

Чувствительность клонов Е. faecalis к левомицетину и канамицину максимально возрастала после предварительного их соинкубирования с ТД крупного рогатого скота в МПК под воздействием канамицина до 27,5±1,8 мм, в V* МПК под воздействием левомицетина до 22,5±2,0 мм. ТД лошади в обеих концентрациях увеличивали зоны задержки роста энтерококков под влиянием левомицетина до 21,3±0,9 мм и 21,3±1,6 мм; зоны задержки роста энтерококков после предварительного соинкубирования с ТД кур в МПК составляли 19,0±0,8 мм и % МПК 20,3±1,9

мм. Чувствительность к канамицину у энтерококков после предварительного соин-кубирования с ТД лошадей в МПК, кур и крупного рогатого скота в 'Л МПК не изменялась (24,2±0,9 мм, 24,8±0,7 мм, 24,7±1,9 мм) в сравнении с контролем (24,1±1,2 мм), а ТД кур в МПК снижали чувствительность E.faecalis к канамицину до 22,2±1,1мм.

При изучении чувствительности клонов E.faecalis к ампициллину после их соинкубирования с ТД разных видов животных установлено максимальное увеличение зон задержки роста микроорганизма под влиянием ТД кур в V* МПК до11,8±2,7 мм; после соинкубирования энтерококков с ТД кур в МПК - до 10±0,6 мм, ТД крупного рогатого скота в обеих концентрациях увеличивали зоны задержки роста до10,5±0,5 мм и 10,6±0,8 мм, а ТД лошадей не оказывали влияния на чувствительность клонов энтерококков к ампициллину (в МПК 7,8±1,9 мм и в 'А МПК 8,0±1,7мм) по сравнению с контролем, равным 8,1±1,7 мм.

Зоны задержки роста E.faecalis под воздействием эритромицина увеличивались после соинкубирования с ТД кур в 'А МПК и лошадей в МПК до 24,9±1,1 мм и 24,5±1,2 мм, соответственно, после соинкубирования с тромбодефенсинами других животных в среднем в 1,03 раза (контроль 22,9±1,1).

Изучение влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность С. albicans к антимикотикам показало, что зоны задержки роста грибов под воздействием кетоконазола увеличивались после соинкубирования с ТД кур: в МПК до 29,0±1,4 мм и 1А МПК 28,9±1,4 мм, с ТД крупного рогатого скота в '/4 МПК (до 27,2±0,8мм) и МПК (до 25,3±1,1 мм); и ТД лошадей в % МПК (до 25,8±1,3 мм). Тогда как после соинкубирования с ТД лошадей в МПК зоны задержки роста С. albicans уменьшались и их средние значения составляли 23,0±2,3 мм (контроль 24,6±1,5 мм) (табл. 5).

Таблица 5

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на _ чувствительность к антимикотикам С. albicans_

Тромбодефен-сины Зоны задержки роста С. albicans (п=6) под воздействием антимикотиков (мм)

кетоко- итрако- ниста- флукона- амфотери-

назол назол тин зол цин

МПК 23,0±2,3 14,0±0,5 15,8±0,5 24,4±1,6 13,3±0,3

Лошадь '/4 МПК 25,8±1,3 14,9±0,9 16,0±0,8 26,6±1,7* 13,6±0,5*

МПК 29,0±0 15,2±0,2 16,0±1,5 25,5±1,0 * 13,6±1,9

Куры Va МПК 28,9±1,4 15,6±0,7 15,8±0,3 23,8±1,3 13,2±0,3

Крупный МПК 25,3±1,1 14,3±0,7 16,3±0,7 25,1±0,9 13,8±0,9

рогатый ■л 27,2±0,8 14,3±0,5 15,3±0,5 23,1±1,6 12,8±0,3

скот МПК

Контроль 24,6±1,5 13,4±0,7 14,7±0,4 22,3±2,3 12,0±0,6

Примечание: *-р<0,05

ТД кур наиболее эффективно повышали чувствительность С. albicans к итра-коназолу (в МПК до 15,2±0,2 мм и в % МПК до 15,6±0,7 мм, контроль 13,4 ±0,7). ТД лошадей в МПК, а также ТД кур и крупного рогатого скота в Уа МПК повышали чувствительность грибов к нистатину, при этом зоны задержки роста составили 15,8±0,5 мм, 15,8±0,3 мм, 15,3±0,5 мм, соответственно; зоны задержки роста грибов после соинкубирования с ТД лошадей в 'Л МПК, ТД кур и крупного рогатого скота в МПК составляли 16,0±0,8 мм, 16,0±1,5 мм, 16,3±0,7 мм, соответственно (контроль 14,7±0,4 мм).

Наиболее чувствительными к флуконазолу оказались грибы после соинкубирования с ТД лошадей в V* МПК (26,6±1,7 мм, р<0,05); до 25,5±1,0 мм (р<0,05) и 25,1±0,9 мм увеличились зоны задержки роста С. albicans после их соинкубирования с ТД кур и крупного рогатого скота в МПК; до 24,4±1,6 мм после соинкубирования с ТД лошади в МПК; до 23,8±1,3 мм и 23,1±1,6 мм - с ТД кур и крупного рогатого скота в V* МПК (контроль 22,3±2,3 мм).

Все изученные ТД повышали чувствительность к амфотерицину С. albicans (средние значения составляли от 12,8±0,3 мм до 13,8±0,9 мм) по сравнению с контролем, равным 12,0±0,6 мм.

Таким образом, при изучении влияния ТД сельскохозяйственных животных на антибиотикочувствительность грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida установлено, что у изученных условно-патогенных микроорганизмов повышается чувствительность к антимикробным средствам.

Так, достоверное повышение отмечено у E.coli и E.faecalis после соинкубирования с ТД кур; у S. aureus и К. pneumoniae - с ТД лошадей; С. albicans - с ТД кур и лошадей. Причем наиболее эффективно повышали чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к действию антимикробных средств ТД кур и лошадей. Степень выраженности данного признака зависит от механизма действия антибиотика/антимикотика, в отношении которого определяли чувствительность. Достоверно повышалась чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, механизм действия которых связан с нарушением синтеза белка бактериальной клеткой (мономицин, канамицин, эритромицин, гентамицин), а также синтеза цито-плазматической мембраны бактерий (полимиксин).

Сопоставляя полученные нами данные с известной способностью антимикробных пептидов эндогенного происхождения, в том числе и тромбодефенсинов, нарушать целостность цитоплазматической мембраны (ЦПМ) бактерий (Бухарин О.В. с соавт., 2000), можно предположить, что увеличение проницаемости ЦПМ микроорганизмов создает благоприятные условия для проникновения антибиотиков в бактериальную клетку, усиливая их влияние. При этом действие тромбодефенсинов, повышающее чувствительность микроорганизмов к полимиксину, вероятно, связано с одинаковыми мишенями действия изучаемых пептидов и антибиотика. Усиление тромбодефенсинами чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, угнетающим синтез бактериальных пептидов, мы объясняем повышением их концентрации в бактериальной клетке вследствие увеличения проницаемости ЦПМ.

Что же касается грибов С. albicans, то под воздействием тромбодефенсинов |

достоверно повышается их чувствительность к амфотерицину и флуконазолу, механизм действия которых связан с нарушением структуры клеточной мембраны.

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам нормальной микрофлоры i

1

В опытах по изучению влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам представителей нормальной микрофлоры были использованы штаммы бактерий рода Lactobacillus (L 364, L 370), выделенные из кишечника крупного рогатого скота, а также Е. coli S 5/98 и Е. faecium, выделенные из пробиотиков.

Проведенные исследования позволили установить преимущественно стимулирующее действие антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к анта- i гонистически активным веществам бактерий рода Lactobacillus, штаммов Е. coli S 5/98, Е. faecium (рис. 2). Наиболее выраженное изменение признака было отмечено у клонов S. aureus к антагонистическим факторам бактерий Lactobacillus sp. (штамм L 370) под влиянием тромбодефенсинов крупного рогатого скота в МПК. При этом коэффициент антагонистической активности (КАА) достоверно увеличивался в 3,3 раза (15,2±6,5 против 4,6±1,4 в контроле). Несколько в меньшей степени повышался и КАА лактобацилл в отношении S. aureus после их соинкубирования с тромбодефенсинами лошадей в % МПК и составлял 12,1 ±0,9, тогда как в МПК значение признака в сравнении с контролем достоверно не изменялось. Кислотный экстракт из тромбоцитов кур в обеих изученных концентрациях повышал КАА лактобацилл в 1,6-1,9 раза.

При изучении чувствительности золотистых стафилококков к антагонистически активным веществам штамма Lactobacillus sp. (штамм L 364) были получены следующие результаты: наиболее выраженный эффект в отношении чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл оказывали тромбодефенсины кур в МПК и крупного рогатого скота в Ул МПК (8,2±2,0 и 8,4±2,3, соответственно), увеличивая его в 2,2 раза; несколько меньшее влияние оказывали тромбодефенсины кур в 'Л МПК, среднее значение коэффициента составляло 6,2±1,3.

Тромбодефенсины лошадей в обеих изученных концентрациях и ТД крупного рогатого скота в МПК повышали КАА в среднем в 1,2-1,6 раза до 4,3±1,0; 4,9±0,9; 4,8±1,0, соответственно.

Наряду с золотистыми стафилококками, мы изучили также динамику антагонистической активности бактерий рода Lactobacillus sp. по отношению к С. albicans после их предварительного соинкубирования с антимикробными пептидами из тромбоцитов сельскохозяйственных животных. В ходе проведенных исследований было установлено, что наиболее эффективным влиянием характеризовались ТД кур.

Б аигеив к антагонистически активным веществам ЬааоЬасШиз (Ь364)

З аигсиБ к антагонистически активным веществам Ьа^оЬасШиз (Ь 370)

Б аиге^ к антагонистически акшвным веществам ЕсоИ 55/98

в.аигеив к антагонистически аюивным веществам Е^аесшт

Е.соИ (гем+) к антагонистически акшвным веществам Есои 85/98

ЕсоИ(гем+)к антагонистически акшвным веществам Е^аесшш

□ ТД лошади МПК 0 ТДлошади 1/4МПК ИТДкурМПК ПТДкур 1/4МПК ИТДкр.рог. скота МПК 1ТД кр.рог. скота 1/4МПК

....... КОНГрОЛЬ

Рис.2 Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам нормальной микрофлоры.

*- (р <0,05); ** - (р <0,01) - достоверность

Так, под действием ТД кур в МПК чувствительность С. albicans к антагонистически активным веществам Lactobacillus sp. L 370 увеличивалась в 2,3 раза и КАА составлял 14,9±1,7 против 6,6±1,5 в контроле (р<0,01), к Lactobacillus sp. L 364 в 1А МПК - в 2,5 раза и коэффициент был равен 14,0±2,8, тогда как в контроле 5,5±1,2.

При этом КАА Lactobacillus sp. штамм L 370 после соинкубирования клонов С. albicans с 'А МПК тромбодефенсинов кур увеличивался не столь значительно и составлял 8,8±2,8.

Высокие значения КАА отмечены также у Lactobacillus L 370 в отношении С. albicans после их соинкубирования с тромбодефенсинами лошади в концентрации Ул МПК (12,7±2,2); у Lactobacillus sp. L 364 после соинкубирования клонов С. albicans с ТД кур в МПК и ТД крупного рогатого скота в концентрации У* МПК (12,8±1,3 и 12,1±1,7, соответственно р<0,01).

После соинкубирования С. albicans с ТД лошади в МПК коэффициент антагонистической активности для Lactobacillus sp. 364 составил 8,4±1,7 (р<0,01), для Lactobacillus sp. L 370 - 7,8±1,4; в V* МПК для Lactobacillus sp. L 364 11,7±2,0.

В меньшей степени повышалась чувствительность С. albicans к антагонистически активным веществам Lactobacillus sp. L 364 под действием кислотного экстракта из тромбоцитов крупного рогатого скота в МПК - до 7,5±1,2, Lactobacillus sp. L 370 в % МПК до 8,6±1,2. Тогда как после соинкубирования С. albicans с ТД крупного рогатого скота в МПК коэффициент антагонистической активности Lactobacillus sp.L 370 даже уменьшался до 5,4±0,6.

Далее мы изучили отношение к медиаторам антагонизма Е. faecium, выделенного из пробиотика, штаммов S. aureus после их предварительного соинкубирования с тромбодефенсинами сельскохозяйственных животных.

Полученные результаты показали, что максимальное увеличение коэффициента антагонистической активности энтерококков в 1,54 раза (3,7±0,4 против 2,4±0,2 в контроле, р<0,05) отмечено в результате предварительного соинкубирования S. aureus с антимикробными пептидами из тромбоцитов лошади в МПК и % минимальной подавляющей концентрации. После соинкубирования S. aureus с антимикробными пептидами из тромбоцитов кур коэффициент антагонистической активности энтерококков также увеличился и составил 3,6±0,3 (р<0,01) при воздействии препарата в МПК и 3,5±0,4 (р<0,05) в % МПК. При изучении влияния ТД крупного рогатого скота на чувствительность S. aureus к антагонистически активным веществам Е. faecium были получены следующие результаты: увеличение КАА Е. faecium после соинкубирования золотистых стафилококков с ТД в МПК до 3,3±0,4 и незначительное уменьшение по сравнению с контролем после соинкубирования с ТД в 'А МПК до 2,9±0,2.

Наиболее эффективно повышали чувствительность клонов Е. coli (гем+) к антагонистически активным веществам Е. faecium антимикробные пептиды из тромбоцитов кур.

Кислотный экстракт из тромбоцитов кур в МПК увеличивал КАА Е. faecium в 1,5 раза до 5,3±0,8; в 'А МПК в 1,4 раза и был равен 4,8±0,3 (р<0,05). Кислотный экстракт из тромбоцитов лошади как в МПК, так ив 'А МПК повышал чувствительность Е. coli (гем+) к антагонистически активным веществам Е. faecium

в 1,3 раза (4,6±0,4; 4,5±0,4, соответственно). Такое же значение КАА было зарегистрировано после соинкубирования клонов кишечной палочки с ТД крупного рогатого скота в 'А МПК - 4,6±0,3; а после соинкубирования кислотного экстракта из тромбоцитов крупного рогатого скота в МПК с Е. coli (гем+) КАА составлял 4,0±0,7.

Далее нами было изучено влияние ТД сельскохозяйственных животных на чувствительность S. aureus к антагонистически активным веществам E.coli S 5/98, выделенной из пробиотика.

КАА E.coli S 5/98 в контроле составлял 2,5±0,2, под влиянием антимикробных пептидов из тромбоцитов лошади в 'А МПК он увеличивался в 1,9 раза до 4,8±0,8 (р<0,05), а в МПК до 3,3±0,6 (р<0,05). Кислотный экстракт из тромбоцитов крупного рогатого скота одинаково выражено изменял чувствительность S. aureus к антагонистически активным веществам пробиотического штамма Е. coli S 5/98, повышая КАА в МПК и '/4 МПК в 1, 7 раза до 4,3±0,4 (р<0,01).

Тромбодефенсины кур наибольший стимулирующий эффект проявляли в МПК, увеличивая КАА Е. coli S 5/98 в 1,8 раза (р<0,05), тогда как в % МПК среднее значение признака было равно 4,0±0,4 (р<0,01).

В ходе изучения влияния ТД сельскохозяйственных животных на чувствительность Е. coli (гем+) к антагонистически активным веществам пробиотического штамма Е. coli S 5/98 было установлено повышение КАА после соинкубирования патогенной кишечной палочки со всеми изученными ТД. Так, кислотный экстракт из тромбоцитов лошадей в обеих изученных концентрациях повышал чувствительность клонов Е. coli (гем+) в 1,3-1,4 раза (в МПК до 3,0±0,6; в 'А МПК до 3,4±0,5 соответственно), а ТД крупного рогатого скота в 1,2 раза до 2,9±0,5 и 3,0±0,4.

Максимально выраженное изменение чувствительности клонов Е. coli (гем+) к антагонистически активным веществам Е. coli S 5/98 отмечено в результате воздействия ТД кур в МПК, при этом КАА Е. coli S 5/98 составлял 3,6±0,4; кислотный экстракт из тромбоцитов птицы в 'А МПК в меньшей степени изменял КАА, он был равен 3,2±0,5.

Таким образом, тромбодефенсины сельскохозяйственных животных, преимущественно, повышали чувствительность УПМ к факторам межмикробного воздействия нормальной микрофлоры макроорганизма.

Максимальный стимулирующий эффект отмечен в отношении чувствительности С. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл и чувствительности S. aureus и Е. coli (гем+) к антагонистически активным веществам Е. coli S 5/98 и Е. faecium под действием кислотного экстракта из тромбоцитов кур. Полученные данные позволяют предположить, что известная способность антимикробных пептидов эндогенного происхождения, в том числе и тромбодефенсинов, к изменению структуры мембран (Бухарин О. В. с соавт., 1997), способствует проникновению в микробную клетку факторов межмикробного взаимодействия, обуславливающих антагонистическую активность нормальной микрофлоры в отношении условно-патогенных микроорганизмов.

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на

антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов

Одним из механизмов, направленных на выживание микроорганизмов в условиях макроорганизма, путем преодоления факторов неспецифической защиты

хозяина, является антилизоцимная активность (АЛА). ТД сельскохозяйственных животных в данном случае могут рассматриваться как вещества, обладающие регулирующим потенциалом в отношении некоторых персистентных характеристик микроорганизмов, включая антилизоцимную активность.

В результате проведенных исследований было установлено, что все использованные в исследовании ТД подавляли способность изученных УПМ микроорганизмов инактивировать лизоцим.

Так, средние значения АЛА клонов К. pneumoniae были равны 1,3±0,1 мкг/мл, после соинкубирования с ТД лошадей в МПК и 1А МПК способность к инактивации лизоцима снизилась и средние значения признака составляли 0,35±0,07 мкг/мл (р<0,01) и 0,36±0,1 мкг/мл (р< 0,001). После соинкубирования с ТД кур в МПК АЛА клонов снизилась до 0,8±0,04 мкг/мл, максимальное снижение признака (до 0,26±0,09 мкг/мл, р< 0,001) отмечено у клонов клебсиелл под действием ТД кур в % МПК. После соинкубирования К. pneumoniae с ТД крупного рогатого скота в МПК антилизоцимная активность снижалась до 0,6±0,06 мкг/мл (р< 0,001), в % МПК до 0,4±0,1 мкг/мл (р<0,01).

Далее мы изучили модификацию АЛА клонов S. aureus после их соинкубирования с ТД сельскохозяйственных животных. Было установлено что наиболее значимые изменения признака происходили при воздействии МПК: так, АЛА клонов S. aureus после соинкубирования с ТД лошади в МПК снижалась с 1,3±0,2 мкг/мл до 0,5±0,3 мкг/мл (р<0,05); с ТД крупного рогатого скота в МПК - до 0,6±0,2 мкг/мл; с ТД кур в МПК - до 0,6±0,1 мкг/мл. Средние значения способности золотистых стафилококков инактивировать лизоцим после их соинкубирования с ТД в '/4 МПК были следующими: 0,6±0,08 мкг/мл; 0,8±0,1 мкг/мл; 0,7±0,1 мкг/мл, соответственно.

Способность кишечных палочек к инактивации лизоцима снижалась после их соинкубирования с ТД сельскохозяйственных животных в обеих изученных концентрациях, при этом минимальные изменения признака вызывали ТД лошади и крупного рогатого скота в МПК, снижая АЛА E.coli (гем+) с 0,9±0,5 мкг/мл до 0,7±0,2 мкг/мл и 0,7±0,1 мкг/мл. Тромбодефенсины крупного рогатого скота в 1V* МПК уменьшали признак у данного микроорганизма в 1,5 раза до 0,6±0,2 мкг/мл. ТД кур в МПК и 'А МПК достоверно ингибировали способность кишечной палочки к инактивации лизоцима в 3,0 и 2,3 раза, средние значения признака составляли 0,3±0,1 мкг/мл (р<0,01) и 0,4±0,2 мкг/мл (р<0,05), соответственно. Самыми эффективными оказались ТД лошадей в V* МПК, они снижали АЛА E.coli (гем+) на 0,7 мкг/мл (средние значения признака составляли 0,2±0,08 мкг/мл, р<0,001).

При изучении влияния тромбодефенсинов на АЛА клонов С. albicans было установлено, что средний уровень признака грибов в контроле составлял 0,9±0,05 мкг/мл. Наиболее эффективное ингибирующее влияние на признак оказывали ТД

кур в МПК, снижая АЛА до 0,4±0,1 мкг/мл (р<0,01) и ТД крупного рогатого скота в МПК - до 0,4±0,06 мкг/мл. ТД лошадей в обеих концентрациях уменьшали АЛА

клонов С. albicans в 1,8 раза (до 0,5±0,1 мкг/мл, р<0,05), а ТД кур и крупного рогатого скота в V* МПК - в 1,5 раза (0,6±0,08 мкг/мл и 0,6±0,1 мкг/мл).

Таким образом, полученные результаты показали подавляющее влияние всех изученных тромбодефенсинов на антилизоцимную активность условно-патогенных

микроорганизмов. Для определения наиболее эффективно подавляющих способность к инактивации лизоцима, тромбодефенсинов, мы обозначили уровень снижения АЛА после соинкубирования с ТД следующим образом: 0 - снижение АЛА на 0-20%, 1- на 20-40%, 2- на 40-60%, 3- на 60% и более (табл. 6).

Полученные в опытах in vitro данные о влиянии ТД сельскохозяйственных животных на АЛА УПМ свидетельствуют, что наибольший подавляющий эффект (60% и более) на АЛА К. pneumoniae оказывали ТД лошади в обеих изученных концентрациях; ТД кур и крупного рогатого скота в 'А МПК; S. aureus - ТД лошади в МПК; E.coli - ТД лошади в !V* МПК и кур в МПК; причем изученные ТД не оказывали такого подавляющего эффекта на способность к инактивации лизоцима С. albicans.

Таблица 6

Подавление антилизоцимной активности условно-патогенных

микроорганизмов ТД сельскохозяйственных животных_

Вид животного Концентрация тромбодефенсинов Антилизоцимная активность (мкг/мл)

К. pneumoniae (1,28±0,1) S. aureus (1,27±0,2) E.coli (0,94±0,5) С. albicans (0,88±0,05)

Лошади МПК -3 -3 -1 -2

% МПК -3 -2 -3 -2

Куры МПК -1 -2 -3 -2

% МПК -3 -2 -2 -1

Крупный рогатый скот МПК -2 -2 0 -2

'/4 МПК -3 -2 -1 -1

Примечание: 0 - снижение АЛА на 0-20%, 1- на 20-40%, 2- на 40-60%, 3- на 60% и более.

Проведенный сравнительный анализ эффективности изученных ТД в отношении способности условно-патогенных микроорганизмов инактивировать лизо-цим, показал выраженный подавляющий АЛА эффект у ТД лошади, причем наиболее эффективно в 'А МПК, ингибируя признак у К. pneumoniae и E.coli на 60% и более, S. aureus и C.albicans - на 40-60%.

Подводя итог проделанной работе, следует заключить, что тромбодефенси-ны сельскохозяйственных животных модифицируют биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов: повышают их чувствительность к антимикробным средствам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, ингибируют их антилизоцимную активность. Выраженность

действия тромбодефеисинов сельскохозяйственных животных в отношении биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов определяется видом животного, являющегося источником тромбодефеисинов, при этом наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

ВЫВОДЫ

1. Тромбодефенсины крови сельскохозяйственных животных повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антимикробным средствам. Степень выраженности данного признака зависит от механизма действия антибиотика, в отношении которого определяли чувствительность. Наиболее выраженный эффект оказывают ТД лошадей и кур.

2. Экспериментально в условиях in vitro выявлено, что антимикробные пептиды из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных модифицируют биологические свойства микроорганизмов, определяющие их взаимоотношения с другими участниками микробной популяции.

3. Установлено, что тромбодефенсины сельскохозяйственных животных преимущественно, повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к факторам межмикробного воздействия нормальной микрофлоры макроорганизма, при этом чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистическому действию штаммов лактобацилл максимально повышалась после их предварительного соинкубирования с ТД крупного рогатого скота, а к антагонистическому действию штаммов Е. coli и Е. faecium - после соинкубирования с тромбодефенсинами кур и лошадей.

4. При изучении влияния тромбодефеисинов сельскохозяйственных животных на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов установлено их ингибирующее действие на способность микроорганизмов к инактивации лизоцима. Отмечен выраженный подавляющий АЛА бактерий эффект у ТД лошадей в 'А МПК.

5. Проведенными исследованиями установлено, что наибольший подавляющий эффект в отношении изученных биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов проявляли ТД кур и лошадей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Тромбодефенсины, повышающие чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к факторам межмикробного воздействия нормальной микрофлоры макроорганизма, антимикробным средствам и подавляющие антилизоцимную активность УПМ, могут быть использованы для лечения и профилактики инфекци-онно-воспалительных заболеваний животных и являться альтернативой существующим антимикробным препаратам: антибиотикам, пробиотикам.

2. Полученные результаты могут быть использованы при составлении научной и информационной литературы, в учебном процессе, при проведении лекционных и лабораторно-пракгических занятий по микробиологии,

иммунологии, фармакологии, а также при проведении научных исследований по изучению тромбодефенсинов на кафедрах высших учебных заведений или лабораториях научно-исследовательских институтов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сычева, М.В. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на антибиотикочувствительность микроорганизмов / М.В. Сычева, Л.Ф. Галиуллина, О.Л. Карташова // Вестник Мичуринского государственного аграрного университета. - 2011. - №1.- Ч.2.- С. 41-44.

2. Сычева, М.В. К вопросу о некоторых функциональных свойствах тромбодефенсинов / М.В. Сычева, Л.Ф. Галиуллина, О.Л. Карташова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2. -Т.2. - С. 69.

3. Сычева, М.В. Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антибиотикам / М.В. Сычева, Л.Ф. Галиуллина, О.Л. Карташова // Вестник ветеринарии. - 2011. -№4,- С. 86-87.

4. Сычева, М.В. Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на некоторые биологические свойства микроорганизмов / М.В. Сычева, Л.Ф. Галиуллина, О.Л. Карташова // Материалы международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути решения».-Ульяновск.-2011.-Т. 1,- С. 177-181.

5. Сычева, М.В. Влияние тромбодефенсинов на чувствительность микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл / М.В. Сычева, Л.Ф. Галиуллина, О.Л. Карташова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2012. - №1(33). - С. 96-98.

6. Сычева, М.В. Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность микроорганизмов к антагонистически активным веществам представителей нормальной микрофлоры / М.В. Сычева, Л.Ф. Галиуллина, О.Л. Карташова// Вестник Оренбургского государственного университета. - 2012. -№ 10. - С. 78-82.

7. Галиуллина, Л.Ф. Динамика антилизоцимной активности микроорганизмов под влиянием антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных / Л.Ф. Галиуллина, М.В. Сычева, О.Л. Карташова // Вестник ветеринарии. - 2013. - №1. - С. 15-17.

Галиуллина Ленара Фаилевна

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на некоторые биологические свойства микроорганизмов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Отпечатано в типографии «ОренПечать» О.Г.Р.Н. 312565810300101 Формат 60x84 1/16. Бумага офисная. Усл. печ. л. 1.4 Тираж 100 экз. Заказ 082 г. Оренбург, ул. Советская, 27, офис 214

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Галиуллина, Ленара Фаилевна, Уфа

ФГБОУ ВПО «ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

П4?Ш 44905? На иРавах рукописи

Галиуллина Ленара Фаилевна

Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на биологические свойства микроорганизмов

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Карташова Ольга Львовна

Уфа-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ............................................................ 5

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................. 11

2.1 Антимикробные пептиды: краткая история вопроса.......................................................................................................... И

2.2 Естественное распределение катионных антимикробных пептидов в природе и их структурные особенности..................... 13

2.3 Антимикробные свойства катионных антимикробных пептидов........................................................................... 20

2.4 Характеристика и свойства тромбоцитарного катионного белка...................................................................................... 25

2.5 Перспективы практического применения антимикробных пептидов.......................................................................... 31

III СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1Материалы и методы исследований.............................. 36

3.2 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА АНТИБИОТИКОЧУВСТВИ-ТЕЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ.......................................................................................................... 43

3.3 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫМ ВЕЩЕСТВАМ НОРМАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ.................................................................................................. 58

3.4 ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НА АНТИЛИЗОЦИМНУЮ АКТИВНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ......................................................................................................... 74

IV ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВА-

НИЙ....................................................................................................................................................................................................................83

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................92

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..............................................................93

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК..............................................................94

ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................116

Список сокращений

АЛА - антилизоцимная активность

АМП - антимикробные пептиды

КАМП - катионные антимикробные пептиды

КОЕ - колониеобразующая единица

МПК - минимальная подавляющая концентрация

ОП - оптическая плотность

ТД - тромбодефенсины

ТКБ - тромбоцитарный катионный белок

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Антимикробные пептиды, синтезируемые организмами различного уровня организации (от губок до человека), являются одними из ключевых эффекторных молекул системы врожденного иммунитета, которая обеспечивает первую линию защиты от инфекций человека и животных и без которой невозможно выживание в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами (Кокряков В.Н., 2006). Ранее были изучены антимикробные пептиды, выделенные из нейтрофилов человека, кролика и мыши (Бухарин О.В. с соавт., 2000); а также из лейкоцитов русского осетра (Шамова О.В. с соавт., 2006).

Особое внимание исследователи уделяют низкомолекулярным катион-ным белкам из тромбоцитов человека и животных - тромбодефенсинам (Бухарин О.В. с оавт., 2000; Jenssen Н. et al., 2006), поскольку тромбоциты адге-зируются на патогенных микроорганизмах, при взаимодействии с ними in vitro высвобождают низкомолекулярные бактерицидные белки, обладают противогрибковым и антипротозойным действием (Jenssen Н. et al., 2005).

Широко изучаются тромбоцитарные катионные белки (ТКБ), выделенные из тромбоцитов человека (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Сулейма-нов К.Г. с соавт., 1979, 1983; Сулейманов К.Г., 1990, 1998; Boman Н., 1996), установлено, что ТКБ уменьшает адгезию бактерий на соматических клетках и изменяет персистентные характеристики стафилококков и эшерихий (Бухарин О.В. с соавт., 2000); ингибирует биопленкообразование S. aureus (Жур-лов О.С. с соавт., 2012). Литературные данные указывают на наличие тром-бодефенсинов в сыворотке крови многих видов животных: крыс, кроликов, лошадей, коров, морских свинок, голубей, овец, уток, индеек, белых мышей, свиней и других (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977; Горюхина O.A., Тка-ченко A.A., 1978; Сулейманов К.Г. с соавт., 1979; Pettersson А., 1935; Donaldson D.M., Marcus S., 1958). Обнаружены антимикробные пептиды в тромбоцитах кур, изучена антимикробная активность тромбодефенсинов лошадей,

крупного рогатого скота, коз, свиней, собак, кур и их антиперсистентное действие (Сычева М.В. с соавт., 2009, 2010, 2011).

Формирование антибиотикорезистентных форм микроорганизмов диктует необходимость поиска новых средств терапии инфекционных заболеваний (Яковлев В.П., Яковлев С.В., 2008). Альтернативой антибиотикам, к большинству которых бактерии приобрели устойчивость, могут стать тром-бодефенсины (Jenssen Н. et al., 2006).

В связи с вышеизложенным, интерес представляет изучение биологических свойств и поиск наиболее эффективных антимикробных белков из тромбоцитов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния антимикробных пептидов из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить влияние тромбодефенсинов, полученных из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры), на чувствительность к антимикробным средствам грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida.

2. Изучить антагонистическую активность нормальной микрофлоры кишечника животных (микроорганизмы рода Lactobacillus, E.coli, Е. faecium) в отношении условно-патогенных микроорганизмов после их соинкубиро-вания с тромбодефенсинами сельскохозяйственных животных.

3. Оценить влияние тромбодефенсинов на антилизоцимную активность условно-патогенных микроорганизмов.

Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки).

Научная новизна исследований.

Изучено влияние тромбодефенсинов (ТД), полученных от сельскохозяйственных животных, на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов.

При изучении влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры) на антибиотикочувствитель-ность грамположительных, грамотрицательных бактерий, а также грибов рода Candida установлено преимущественное повышение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антимикробным средствам. При этом наибольший эффект оказывают ТД кур и лошадей.

Достоверное повышение чувствительности к антибиотикам отмечено у E.coli и Е. faecalis после соинкубирования с ТД кур в минимальной подавляющей концентрации (МПК); у S. aureus с ТД крупного рогатого скота и лошадей в МПК; К. pneumoniae - с ТД лошадей и кур в 1А МПК; С. albicans - с ТД кур в МПК и ТД лошадей в V* МПК. Установлено, что выраженность данного признака зависит от механизма действия антимикробного средства, к которому определяли чувствительность.

Показано, что у условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) под влиянием тромбодефенсинов повышается чувствительность к антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных. Максимальное повышение чувствительности УПМ к антагонистическому действию штаммов Е. coli и Е. faecium, выделенных из пробиотиков, зарегистрировано, преимущественно, в результате соинкубирования УПМ с тромбодефен-синами кур и лошадей, а к антагонистическому действию лактобацилл - после их соинкубирования с ТД крупного рогатого скота.

Установлено, что тромбодефенсины, выделенные из тромбоцитов крови сельскохозяйственных животных (лошади, крупный рогатый скот, куры), однонаправлено снижают антилизоцимную активность условно-патогенных бактерий, а также С. albicans. Максимальное подавление способности микро-

организмов инакгивировать лизоцим выявлено после их соинкубирования с тромбодефенсинами лошадей в % МГЖ.

Практическая значимость работы.

Полученные знания о том, что тромбодефенсины с одной стороны, повышают чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антибиотикам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, а с другой, ингибируют их антилизоцимную активность, способствующую персистенции микроорганизмов, позволяет расширить арсенал пептидов в перспективе пригодных для лечения и профилактики инфекцион-но-воспалительных заболеваний животных. Проведенный сравнительный анализ влияния ТД разных видов сельскохозяйственных животных на биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов показал, что наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

Результаты исследований используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» при преподавании дисциплин «Иммунология» и «Антибиотики» студентам специальности «Микробиология» и «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Ветеринария».

Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет» «Функциональные свойства антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных» (№ государственной регистрации 0120.1252048).

Апробация работы. Результаты научных исследований доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в условиях становления инновационной экономики» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию со дня рождения профессора Ю. В. Храмова «Энтузиазм и творчество молодых учёных, студентов в развитии ветеринарной меди-

цины» (Оренбург, 2011); Первой молодежной научной школе - конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 21 века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011); Международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ (Ставрополь, 2012); II региональном молодежном инновационном конвенте Оренбургской области (Оренбург, 2012).

Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский ГАУ» (протокол № 9 от 22 января 2013 года).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Тромбодефенсины сельскохозяйственных животных модифицируют биологические свойства условно-патогенных микроорганизмов - повышают их чувствительность к антимикробным средствам, антагонистическому действию нормальной микрофлоры кишечника животных, ингибируют способность к инактивировать лизоцим.

2. Выраженность действия тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных в отношении биологических свойств условно-патогенных микроорганизмов определяется видом животного, являющегося источником тромбодефенсинов, при этом наибольшую активность проявляют ТД кур и лошадей.

Публикация результатов исследований. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в семи печатных работах, из них шесть - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования РФ.

Материалы диссертации представлены на областной выставке научно-технического творчества молодежи «НТТМ-2011» (Оренбург, 2011) и отмечены сертификатом победителя. Работа удостоена диплома Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области

биологических наук на Всероссийском фестивале науки (Ульяновск, 2011) и гранта Оренбургского ГАУ по результатам конкурса научно-технических и инновационных проектов «Прорыв» (Оренбург, 2011).

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста; включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения результатов исследований, выводы, практические предложения и библиографический список, приложение. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками. Библиографический список включает 206 источников, в том числе - 143 иностранных авторов.

За содействие и помощь в освоении методик, а также проведении цикла экспериментов по теме диссертации, выражаем благодарность заведующей кафедрой микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет», кандидату биологических наук М.В. Сычевой.

и

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2Л Антимикробные пептиды: краткая история вопроса

История изучения клеточно-молекулярных механизмов резистентности человека и животных к инфекции восходит к работам Л. Пастера, который обосновал микробную теорию инфекционных заболеваний (Омелянский В. Л., 1917), И. И. Мечникова, описавшего явление фагоцитоза микробов, проникших через повреждённый эпителий, подвижными клетками, и выдвинувшего фагоцитарную теорию иммунитета. Им же была сформулирована концепция о цигазах — бактерицидных соединениях лейкоцитарного происхождения, обеспечивающих инактивацию и переваривание фагоцитированных микроорганизмов.

Антибиотические пептиды впервые были обнаружены в азурофильных гранулах нейтрофилов морской свинки (Zhang L. et al., 2001), тогда их обозначили как группу лизосомных катионных белков, позднее они были секве-нированы и названы дефенсинами (англ. defence-защита) (Nikawa Н. et al., 2004).

Изучение молекулярных основ врождённого иммунитета у насекомых привело к открытию в гемолимфе куколок Hyalophora cecropia (гигантского шелкопряда) катионных антимикробных пептидов (КАМП), которым позднее было дано название цекропинов (Friedrich С. L. et al., 2001).

Дефенсин-подобные молекулы были найдены у насекомых: в 1989 году французские исследователи выделили из гемолимфы личинки падальной мухи Phormia terranovae два антимикробных пептида (АМП) - формицины А и В, которые имели частичное структурное сходство с дефенсином NP-1 из альвеолярных макрофагов кролика (Bachere Е. et al., 2004). Дальнейшие исследования подтвердили, что АМП широко распространены в природе и присутствуют практически у всех изученных видов организмов, включая бактерий, простейших, грибы, растения, кишечно-полостных, моллюсков, иглокожих, оболочечников, ракообразных, насекомых, амфибий, птиц и млекопитающих.

При этом в одном организме может содержаться от одного до нескольких десятков (38 у крупного рогатого скота) различных антимикробных пептидов, принадлежащих как к разным структурным классам, так и являющихся вариациями одной структуры (Hancock R.E.W., Lehrer R.I., 1998).

В 1987 году М. Zasloff выделил из кожи лягушки Xenopus laevis магей-нины, которые активны in vitro против грамположительных, грам-отрицательных бактерий, грибов и простейших (Zasloff М., 1987).

В 1990 году из лейкоцитов свиньи были выделены протегрины (PG-1,2,3). Они состоят всего из 16-18 аминокислотных остатков, с двумя внутримолекулярными дисульфидными мостиками (Кокряков В.Н., 1990). В условиях in vitro протегрины проявляют активность против широкого спектра микроорганизмов. В начале 90-х годов было открыто семейство каталециди-нов. Ключевым моментом в истории их открытия послужило клонирование кДНК Вас5 (пептида, ранее выделенного из нейтрофилов быка). Причем вместе с кДНК для этого пептида амплифицировались другие кДНК последовательности, каждая из которых содержала одинаковый консервативный участок, кодирующий N-конец пептида и вариабельный участок соответствующий ранее описанным бычьим АМП. В дальнейшем, с помощью метода RACE (быстрой амплификации концов кДНК) множество подобных пептидов было обнаружено у разных видов млекопитающих. Очевидно, что все эти пептиды эволюционно родственны, несмотря на огромное разнообразие эф-фекторных доменов. Консервативный участок оказался на 70% гомологичен белку из лейкоцитов свиньи «кателину», ингибитору катепсина L. Для обозначения этого семейства АМП был введён термин кателицидины (Yamasaki К., Galo R.L., 2008).

В 1997 году в лаборатории Р. Лерера (США) были выделены цекро-пин-подобные пептиды стиелины из гемоцитов асцидии Styela clava (Lee I.H. et al., 1997).

Дана характеристика более 1000 АМП (Bowdish D. М. et al., 2005) (и эта цифра постоянно увеличивается), выделенных из различных видов позво-

ночных и беспозвоночных животных, растений, простейших и даже бактерий (хотя в последнем случае они содержат в своём составе много неканонических и модифицированных аминокислот). Следует отметить, ч