Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль бактерицидного тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) в инфекционной патологии и гомеостазе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Роль бактерицидного тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) в инфекционной патологии и гомеостазе"

\"' пРавах РУкописи

Сулейманов Камиль Гильмиарович

РОЛЬ БАКТЕРИЦИДНОГО ТРОМБОЦИТАРНОГО КАТИОННОГО БЕЛКА (ТКБ) В ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И ГОМЕОСТАЗЕ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск,1998

Работа выполнена в Оренбургской государственной медицинской академии и Оренбургском государственном аграрном университете.

Научные консультанты : Член-корреспондент РАМН, Заслуженный

деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор О.В. Бухарин. Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор В.А. Черешнев.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Э.С. Горовнц З.Г. Габидуллнн В.В. Юшков

Ведущая организация - НПО «БИОМЕД». г.Пермь.

Защита состоится "_" _1998г. на

заседании диссертационного совета Д.084.04.02 при Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан " С^^с^с^ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

А.В. Зурочка

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тромбоцитарный бактерицидный кати-онный белок (ТКБ), ранее известный под названием бета-лизин, был открыт J.Fodor (1887), G.Nuttal (1888) и E.Behring (I 889), которые продемонстрировали в опытах in vitro и in vivo наличие в сыворотке крови некоторых животных термостабильного бактерицидного фактора к грамположителышм спорообразующим бактериям.

Фактор был назван бета-лизином для того, чтобы подчеркнуть его отличие от альфа-лизина (комплемента), характеризующегося термолабильностью.

Несмотря на давнюю историю вопроса, успехи в изучении природы и биологической роли бета-лизина до последних лет были незначительными. Это объясняется рядом причин. Во-первых, большим разнообразием различных антибактериальных факторов в крови и других тканях животных, среди которых бактерицидная активность, приходящаяся на долю бета-лизина, казалась незначительной. Во-вторых, постоянно существовала трудность дифференциации бета-литического действия от действия других антибактериальных факторов сыворотки и тканей, таких как лизоцим, гистоны, лизосомаль-ные катионные белки и другие.

Можно выделить следующие этапы истории исследований бактерицидного белка:

1. 1888-1920 гг. Обнаружение в крови различных животных и человека бактерицидного фактора против бактерий групп subtilis - anthrax (J.Fodor, 1887; G.Nuttal, 1 888; E.Behring, 1889; E.Hahn, 1895, A.Schattenfron, 1897; M.Gruber, R.Futaki, 1907; M.KIing, 1910, 1916).

2. 1920-1960 гг. Изучение антибактериального спектра ТКБ, распространение его в сыворотке крови различных животных, происхождение и свойства (Н.В.Васильев, 1956, 1959, 1960; О.В. Бухарин с соавт., 1970, 1972, 1977; A.Pettereson, 1924, 1926, 1932, 1935; T.Mackie, M.Finkeletein a Van Royen, 1932; V.Wulff, 1934; W.Tilett, 1936; A.Tobler a M.Pinner, 1943; R.Jacox, 1950; Q.Myrvik a. All, 1951, 1953, 1955, 1956, 1960; D.Donaldson a.all, 1955, 1956, 1958, I960).

3. С 1960 г. Очистка ТКБ из сыворотки крови, изучение некоторых молекулярных свойств, установление связи между его уровнем в :ыворотке крови и некоторыми патологическими состояниями, оценка диагностического и прогностического значения ТКБ теста в кличке (О.В.Бухарин с соавт., 1970, 1971, 1972, 1973, 1978; О.В.Бухарин,

Н.В.Васильев, 1977; О.В.Бухарин с соавт., 1980, 1982; D.Donaldson a.all, 1960, 1964, 1968, 1971).

Работы последних лет, связанные с изучением молекулярных свойств ТКБ и клиническими наблюдениями позволили отказаться от представления о нем лишь как о бактерицидном факторе тканей. Возникло понимание того, что биологическая роль ТКБ шире и должна выходить на уровень регуляторных молекул.

Гуморальные бактерицидные факторы клеток и тканей выполняют решающую функцию в защите макроорганизма, особенно в начальных фазах развития инфекции (П.Н.Бургасов, С.Н.Румянцев, 1985; О.В.Бухарин с соавт., 1996; В.Н.Кокряков, 1991; A.S.Bayer a.al., 1995; й др.). Среди них особое место занимают низкомолекулярные белки (пептиды) с выраженными катионными свойствами - гисто-ны, лизосомальные катионные белки нейтрофильных гранулоцитов (дефенсины), тромбоцитарный бактерицидный белок, значение которых определяется высокой микробоцидной активностью и способностью влиять на развитие патогенетических процессов (О.В.Бухарин с соавт., 1977; В.Н.Кокряков, 1988, 1990; R.I.Lehrer a. al., 1993 и др.).

Отдельные белки этого семейства получены в США синтетическим путем, прошли широкие клинические испытания и успешно применяются в практике здравоохранения (T.Ganz a. al., 1993).

Возрастает интерес к бактерицидному катионному белку тромбоцитов (Н.В.Васильев, 1968, 1979; О.В.Бухарин, Н.В.Васильев, 1977; О.В.Бухарин с соавт., 1979, 1984, 1991, 1997; M.R.Yeaman a. al., 1994 и др.). Известно, что его активность определяет защиту от стрептококковых и стафилококковых поражений, кандидозных и других инфекций (T.Wu a. al., 1994 и др.). Показано, что уровень тромбоцитар-ного катионного белка (ТКБ) повышается не только при инфекционной, но и при неинфекционной патологии, аллергических реакциях, травме и стрессе, что позволило отнести его к группе сигнальных острофазных белков (О.В.Бухарин с соавт., 1977; D.M.Donaldson a. al., 1974 и др.).

В серии авторских разработок установлено, что количество ТКБ в биологических объектах отражает состояние иммунного и общего гомеостаза- повышение содержания свидетельствует о напряженности гомеостазирующих реакций, понижение по сравнению с нормой - об истощении их потенциала. Внедренный в клиническую практику ТКБ (бета-лизиновый) тест позволяет оценивать тяжесть патологии,

диагностировать и прогнозировать характер течения ряда заболеваний (О.В.Бухарин с соавт., 1982-1986).

Эти исследования доказывают, что биологическая активность ТКБ не ограничивается его бактерицидной функцией, но проявляется вовлечением его в широкий спектр защитно-приспособительных реакций, до настоящего времени не изученных.

Особенностью ТКБ является связь его продукции с тромбин-сти-мулированной агрегацией тромбоцитов и свертыванием кропи (О.М.Оопа1(Ьоп а. а!., 1974; Б.Р.Коо а. а1„ 1996 и др.), т.е. ТКБ является звеном сопряжения двух важнейших биологических процессов -гемостаза и гомеостаза, определяемых кооперацией эндотелиоцитов, тромбоцитов, нейтрофилов и других клеток. Таким образом, любое нарушение микроциркуляции, связанное с патологией ткани, ведет к повышению антибактериальной защиты в очаге, а антибактериальная и гомеостазирующая активность тромбоцитарного белка является авангардной при развитии патологического процесса, определяя первые этапы взаимодействия патогена и макроорганизма.

Между тем, до настоящего времени недостаточно изучены молекулярные свойства ТКБ, условия проявления биологической активности, антибактериальный спектр, механизм бактерицидного действия и конкретные пути участия его в гомеостазирующих реакциях. Все это и определило цель планируемого исследования.

Цель исследования. Определить роль бактерицидного тромбоцитарного катионного белка в противоинфекционной защите и гомео-стазе организма.

Задачи исследования.

1. Разработать способ очистки бактерицидного катионного белка из тромбоцитов человека, получить ТКБ в высокоочищенном виде и изучить его молекулярные свойства.

2. Определить антибактериальный спектр ТКБ, механизм его бактерицидного действия и влияние на перспстентные характеристики микроорганизмов.

3. Исследовать влияние ТКБ на экспериментальную инфекцию и механизм его иммуномодулирующей и гомеостазнрующей активности.

Научная новизна. Разработан новый способ очистки, выделен в

гомогенном виде бактерицидный катионный белок из сыворотки и тромбоцитов крови человека и изучены его молекулярные свойства (A.C. № 1095493, 1984).- Показано, что это - низкомолекулярный белок (5,6 кД) с изоэлектрической точкой pl > 10,5, характеризуется высоким содержанием аминокислот лизина, гистидина, глютамата. Определены ингибиторы и активаторы ТКБ. Впервые изучены и установлены МБК очищенного катионного белка из тромбоцитов человека относительно разнообразных представителей кокковых, а также палочковидных грамположительных и грамотрицательных форм бактерий.

Впервые установлено, что тропность ТКБ к мембранам определяется не только его катионными свойствами, но и избирательным взаимодействием (лиганд-рецептор) его с фосфолипидами, а литический эффект на клетки бактерий обусловлен ингибицией ферментов антиокислительной защиты - пероксидазы и каталазы.

Впервые показана связь противоинфекционной активности тром-боцитарного белка не только с его бактерицидным действием, но и изменением функциональной активности клеток иммуногенеза, в частности путем "кондиционирования" нейтрофилов. Такая роль ТКБ в противоинфекционной защите в очаге воспаления подтверждена экспериментальными и клиническими наблюдениями. Показано, что ТКБ в условиях эксперимента повышает устойчивость организма к инфекции, стимулирует фагоцитоз, подавляет агрегацию тромбоцитов, изменяет степень РБТЛ.

Впервые установлено, что ТКБ включается в иммунный и общий гомеостаз, влияя на уровень ПОЛ мембран некоторых соматических клеток.

Проведенные исследования создают основу для производства, внедрения в биологию и медицину нового препарата, обладающего широким спектром бактерицидной, иммуномодулирующей и гомео-стазирующей активности.

Научная новизна прикладных аспектов проблемы заключается в том, что впервые ТКБ обнаружен в молоке, и на основании его количественного определения разработан способ ранней диагностики маститов (A.C. № 1389045, 1987).

В опытах на сельскохозяйственных животных впервые показано, что уровень ТКБ в молоке отражает также физиологическое состояние молочной железы в период формирования лактации у коров. Авторским свидетельством № 1139416 от 1984 г. Защищен способ

оценки физиологичности течения послеродового периода, сроков становления лактации и длительности содержания коров в родильном отделении.

Теоретическое и практическое значение работы. В результате исследований обнаружены новые свойства низкомолекулярного кати-онного бактерицидного белка из тромбоцитов человека, которые позволяют рассматривать ТКБ как регуляторный фактор.

Выделение катионного белка из тромбоцитов связано с экстремальным явлением - их агрегацией и свёртыванием крови, процессами как обусловленными, так и предопределяющими множественную кооперацию клеток в защитных реакциях на повреждения. Экспериментально доказано, что при инфекционной патологии ТКБ стимулирует фагоцитоз бактерий не только через механизм опсонизации, но и "модуляции" нейтрофилов. Таким образом, наряду с известными механизмами активации тромбоцитов нейтрофилами через ФАТ (фактор активирующий тромбоциты), обнаруживается звено обратной связи - стимуляции нейтрофилов тромбоцитарным катионным белком. Иммуномодулирующая активность ТКБ проявляется также в подавлении РБТЛ (реакции бластной трансформации лейкоцитов) человека, вызываемой ФГА, в изменении проницаемости мембран спленоцитов, влиянии на уровень агрегации тромбоцитов, что может определять уровень продукции медиаторов иммунокомпетент-ными клетками. Показано, что регулирующая проницаемость мембран функция ТКБ обусловлена его тропностыо к фосфолипидам и способностью изменять уровень их перекиснаго метаболизма. Бактерицидная активность ТКБ неодинакова относительно различных групп микроорганизмов, но его микробоцидное действие всегда сопровождается накоплением продуктов ПОЛ. Следовательно, ТКБ обладает определённой универсальностью регуляторной функции, осуществляемой через тропизм к мембранным фосфолипидам бактерий и соматических клеток.

Разработанный способ выделения и очистки ТКБ (бета-лизина) внедрён в научно-исследовательской работе Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН и кафедре микробиологии Оренбургской государственной медицинской академии. Способ диагностики субклинических форм маститов внедрен в ветеринарную практику хозяйств области, клиническую практику детского здравоохранения для контроля качества молока, используемого в

комбинатах детского молочного питания области.

Способ оценки физиологичности течения послеродового периода и сроков становления лактации включён в методические рекомендации республиканского уровня, а также внедрён в ветеринарно-ме-дицинскую практику хозяйств области.

Внедрены в практику научно-исследовательской работы в кафедрах и лабораториях Оренбургской медицинской академии, Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, Аграрного университета, НПП " Экобиос " разработанные методы расчёта абсолютного содержания ТКБ в биологическом материале, нефеломет-рического варианта определения тромбоцитарной бактерицидной активности в молоке, дифференциации в биологических объектах тромбоцитарной бактерицидной активности от других бактерицидных факторов, стабилизации растворов ТКБ при хранении, получения порошковых препаратов ТКБ на носителе окиси алюминия для применения в качестве аппликаций в экспериментально-клинических исследованиях (рац.пр.Ш2-12, 1990, г. Оренбург; Ил. ЦНТИ № 14386, №62-88, № 287-88).

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на проблемной комиссии по иммунологии, Оренбург, 1979; IV Всесоюзном биохимическом съезде, Ленинград, 1980; Всесоюзном симпозиуме "Физиологические основы машинного доения", Таллин, 1983; Межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", Ленинград, 1989; V Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействие нервной и иммунной систем", Ростов-на-Дону, 1990; Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы", Оренбург, 1991; Межвузовской конференции молодых учёных и преподавателей ВУЗов, Оренбург, 1993; VI Межгосударственной межвузовской научно-практической конференции "Новые фармакологические средства в ветеринарии", С.-Петербург, 1994; Международном симпозиуме "Гомеостаз и инфекционный процесс", Саратов, 1996; объединённых заседаниях обществ микробиологов, физиологов, биохимиков, Оренбург, 1980,1992; Ростов-на-Дон, 1994; итоговых научных конференциях, Оренбург, 1994, 1995, 1996.

Фрагменты работы экспонировались во Всероссийском Выставочном Центре (ВДНХ), 1986 г. (золотая медаль), участвовали в конкурсах научных работ республиканского и областного уровней в 1988, 1990,1993 гг.

По теме диссертации опубликовано 23 научных работ, получено 4 авторских свидетельства, оформлено и внедрено 14 рационализаторских предложений, издано 3 информационных бюллетеня.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 89 работ отечественных и 116 работ иностранных авторов. Работа иллюстрирована 59 таблицами, 33 рисунками.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выделенный из тромбоцитов крови человека низкомолекулярный катионный белок (ТКБ) обладает широким спектром микробо-цидной активности. Бактерицидное действие ТКБ определяется его способностью ингибировать ферменты антиокислительной защиты пероксидазу и каталазу,' что вызывает накопление токсичных для клетки перекисных соединений.

2. Способность ТКБ стимулировать фагоцитоз, влиять на функциональное состояние лимфоцитов, тромбоцитов и других клеток определяет его иммуномодулирующие свойства, которые совместно с бактерицидной активностью обеспечивают его протективное и лечебное действие на ранних этапах инфекционного процесса.

3. Гомеостазирующие функции тромбоцитарного катионного белка обусовлены его способностью стабилизировать мембраны нормальных соматических клеток и стимулировать распад и элиминацию дефектных клеток так же, как и микробных патогенов в патологическом очаге. Увеличение концентрации ТКБ в тканях, биологических жидкостях является информативным прогностическим и диагностическим тестом, свидетельствующим об острофазном характере развития патогенетических механизмов при различных заболеваниях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Бактерицидную активность ТКБ определяли микробиологическим чашечным (D.M.Donaldson, 1964) или нефелометрическими методами (О.В.Бухарин ссоавт., 1972) с тест-культурой B.subtilis 83. Для расчета абсолютного содержания ТКБ в исследуемом материале использовали разработанную таблицу и формулу, основанную на том, что 8 мкг ТКБ составляла МБК для I млн взвеси тест-культуры (Рац. предл., 1990 № 8). Дифференциацию бета-литической и лизоцимной активности в необходимых случаях проводили путём блокады ТКБ ионами иода (Рац. предл., 1990 № 6), низкие концентрации ТКБ определяли с высокочувствительной тест-культурой B.cereus 569 (Рац. предл., 1990 № 7).

Выделение и очистку белка проводили из тромбоцитов или сыворотки крови доноров. Из цитратной крови (0,013 М) удаляли лейкоциты и эритроциты центрифугированием 100 gxl5 мин. Из обогащенной тромбоцитами плазмы пластинки осаждали центрифугированием при 550 gxl5 минут, отмывали трижды 0,9% раствором хлорида натрия в объеме 1/10 от исходного объема крови. Агрегацию тромбоцитов вызывали добавлением тромбина ("Reanal") в концентрации 0,2 ед/1 мл тромбоцитарной взвеси (B.B.Weksler a al., 1971). Белки экстрагировали 10% ацетатом. Гомогенный препарат ТКБ получали применением сочетания методов очистки белков в соответствии с разработанным способом (А.С., 1984 № 1095493). Стабилизацию очищенного белка осуществляли добавлением глицерина или альбумина (Рац. предл., 1990 № 4). Аминокислотный состав ТКБ определяли методом восходящей хроматографии гидролизата белка в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота - вода в соотношениях 4:1:5 и 40:15:5 (Т.С.Пасхина, 1964). Электрофоретическую подвижность и гомогенность выделенного препарата ТКБ изучали с использованием прибора и набора реактивов фирмы "Reanal" для электрофореза в ПААГ. Применяли кислый (рН 4,3) и основной (рН 8,3) гели (Г.Маурер, 1971), а для выявления возможных субъединичных структур гели, содержащие 4 и 8М мочевину. Молекулярную массу расчитывали после экстраполяции величин объемов выхода ТКБ, а также стандартных белков - РНКазы, ингибитора трипсина из сои и инсулина при гель-хроматографии на колонке с сефадексом Г-75 (Детер-ман, 1970). Для определения значения аминокислотных остатков и их групп в проявлении биологической активности (бактерицидности)

ТБК, а также ингибиторов и активаторов проводили модификацию белка известными методами (Д.Бейли, 1965). Восстановительное расщепление доступных дисульфидных связей осуществляли бета-мер-каптоэтиламином или тиогликолятом натрия (2х10"3М) при рН 6,0. Блокирование свободных сульфгидрильных групп проводили моной-одацетатом (2x10^ М) при рН 6,8 (Л.Гамильтон, 1963). Иодирование белка проводили по методу, рекомендованному Л.А-.Остерман (1983). После обработки тромбоцитарного белка (124-248 мкг) соответствующими реактивами определяли его бактерицидную активность в сравнении с контрольными пробами.

Фагоциты получали из перитонеальной жидкости группы беспородных белых мышей, клетки- отмывали средой 199 и использовали для изучения показателей фагоцитоза и влияния на них ТКБ. Результаты оценивали по индексу Гамбургера и числу Райта после предварительного контакта фагоцитов (1x106) или бактерий (3x10s) с 50 мкг препарата ТБК. Экспериментальную инфекцию воспроизводили ин-траперитонеальным заражением беспородных белых мышей ЛД-100 суточной культуры S. typhimurium 2568 или P. aeruginosa 123. Каждая опытная и контрольная группа в отдельных сериях экспериментов состояла из 10-15 животных. Протективные и лечебные свойства ТКБ оценивали по учету сроков и количества летальных исходов мышей в группах, а также выраженности клинических признаков на протяжении 10 дней наблюдения. Протективную и лечебную дозу (86 мкг ТКБ) вводили внутрибрюшинно дважды в день, в первом случае - начиная с двух дней до заражения.

Значение фосфолипидов в связывании ТКБ изучали в реакции ингибиции бактерицидного действия белка фосфатидилхолином, а также взвесью клеток и мембран (эритроциты, бактерии) до и после обработки их фосфолипазой (взвеси клеток в пробах - 5х 109, панкреатической фосфолипазы-лецитиназы 25 ед., тромбоцитарного белка -34-132 мкг).

Влияние ТКБ на функциональное состояние клеточных мембран изучали путем определения проницаемости их для цитоплазматиче-ских и лизосомальных ферментов. На изменение проницаемости указывали уровни активности ферментов в супернатантах клеточных суспензий, инкубированных с ТКБ. В суспензии эритроцитов определяли глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу (Гл-6-ФДГ, КФ: 1.1.1.49), по методу H.Y.Bergmeyer a.al. (1965). В суспензии спленоцитов, полученных из селезенки крыс по Ю.Бурмейстер (1979) определяли активность

лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ: 1.1.1.27) с лактатом и коферментом НАД спектрофотометрически (Г.А.Кочетов,1980), кислой фосфата-зы (Ф, КФ: 3.1.3.2) по А.Боданскому (А.А.Покровский, 1969). Исходные инкубаты содержали 5x109 клеток и 32-146 мкг тромбоцитарного белка. Фосфолипазную активность (ФЛ, КФ: 3.1.1.7) определяли по K.Ischikava (1971). Влияние ТКБ на жизнеспособность лимфоцитов оценивали путем подсчета трипанпозитивных и трепаннегативных клеток в опытных и контрольных образцах.

При изучении механизма бактерицидного и цитолитического действия ТКБ определяли влияние тромбоцитарного белка на уровень ПОЛ и состояние ферментов антиокислительной защиты - перокси-дазу (П, КФ: 1.11.1.7) и каталазу (К, КФ: 1.11.1.6). Об интенсивности реакций ПОЛ судили по концентрации в экстрактах клеток диеновых конъюгатов (ДК), которые определяли спектрофотометрически при 232 нм (О.Г.Архипова, 1988), а также малонового диальдегида (МДА) по интенсивности флюоресценции продуктов его конденсации с 2-тиобарбитуровой кислотой (K.Jagi,1976). Пероксидазу определяли колориметрически по изменению экстинции при 460 нм продуктов окисления бензидина (Г.Г.Березов, 1967). Каталазную активность оценивали по убыли перекиси водорода в реакционной смеси, которую определяли перманганатным методом (А.Н.Бах, С.З.Зуб-кова, 1963; модификация С.С.Строева, 1965). Осмотическую резистентность эритроцитов определяли по И.И.Гительзону (1965), белок - по Лоури (1956). Агрегацию тромбоцитов оценивали турбидиметриче-ским методом (D.M.Donaldson a.al., 1974). Антилизоцимную активность определяли чашечным методом (О.В.Бухарйн, Б.Я.Усвяцов, 1987). Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием критерия Стьюдента в соответствии с общепринят-вми рекомендациями (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962; А.С.Каминский, 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика бактерицидного низкомолекулярного катион-ного белка из тромбоцитов человека (выделение и молекулярные свойства).

Испытаны различные методы препаративной химии белков для очистки ТКБ. Установлено, что на начальных этапах очистки для

удаления балластных белков эффективны методы рН- и 1°' преципитации. При 65° и рН 5,8 преципитирует значительное количество белков и полученный супернатант может быть успешно использован в дальнейших процедурах очистки. Удовлетворительные результаты получены при кислотной экстракции (10% ацетат) тромбоцитарной массы или сыворотки.

Адсорбенты - каолин, бензойнокислый натрий, гель фосфата кальция (по Гертри), окись алюминия показали различную стеиеиь связывания ТКБ, наиболее высокой она была у геля фосфата кальция и окиси алюминия. Использование окиси алюминия позволяло добиться около 70% выхода исходной активности при показателе очистки равном в среднем 20.

Преципитация 20-40% объемами спирта или ацетона повышала удельную активность тромбоцитарного белка в 8-10 раз.

Высаливание сернокислым аммонием при 0,4-0,8 насыщения позволяет выделять около 40% ТКБ из больших объёмов исходного раствора с показателем очистки 2,4 - 3,9.

Гель-фильтрацией на сефадексах Г-50 и Г-75 удаётся добиться 25 кратной очистки ТКБ, в то время как сефадексы Г-100 и Г-200 оказались менее эффективными. Если проводить предварительную очистку тромбоцитарного белка адсорбцией на окиси алюминия целесообразна гель-фильтрация на сефадексе Г-15.

Испытаны методы ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонках с КМ-целлюлозой и Амберлитом СГ-50. Оптимальные результаты получены при ИОХ на Амберлите - полная адсорбция наблюдалась при рН 5,2 из 0,1М ацетат-аммонийного буфера, а элюция -0,5М раствором буфера при рП 5,9.

Исследована эффективность различных сочетаний и последовательностей приемов очистки для выделения ТКБ. Следующая схема очистки была наиболее эффективной и воспроизводимой (рис. 1).

Метод позволяет получить препарат бактерицидина со степенью очистки 2900, при среднем выходе на конечном этапе около 40% ТКБ с удельной активностью 2581 ед / мг(А.С., 1984, № 1095493). Таблица 1 иллюстрирует эффективность способа на этапах очистки.

При электрофорезе в системе 7,5% ПААГ рН 4,3 выделенный препарат выявлялся в виде одной полосы. Количество фракций не изменялось при электрофорезе в геле, содержащем 4М мочевину. Результаты электрофоретических исследований в кислых и щелочных гелях указывали на катионный характер белка, очевидное отсутствие гете-

рогенных субъединичных структур и гомогенность полученного ТКБ. О гомогенности свидетельствовали также профиль элюции выделенного белка при рехроматографии на Амберлите и обнаружение в ди-нитрофторбензольном (ДНФ) производном белка единственной аминокислоты - тирозина (ДНФ-тирозин). Это указывало также на то, что белок представлен одной полипептидной цепью. Молекулярная масса, определенная методом гель-фильтрации на сефадексах, была равной 5,6±0,4 кД, ИЭТ выше, чем у лизоцима и по данным электро-форетической подвижности составляла более 10,5.

Рис. 1. Последовательность этапов очистки бактерицидного тромбоцитарного белка

В кислотном гидролизате ТКБ обнаружены следующие аминокислоты: гистидин, лизин, цистеин, аспарагиновая и глютаминовая кислота, серин, глицин, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, фе-нилаланин, лейцин. Содержание лизина, гистидина, треонина, глю-таминовой кислоты было высоким. Учитывая выраженный катион-ный характер ТКБ следует предположить, что глютаминовая и аспа-

рагиновая кислота представлены в белке их амидами. Значительным было содержание в белке также пролина (6,08%) и гистидина (9,9%).

Таблица 1

Эффективность этапов разработанного способа очистки ТКБ

Этапы очистки Общий объем препарата Активность одного мл раствора Мг белка в 1 мл Удельная активность Показатель очистки Всего ед. Выход, %

Исходный препарат 150 24 27,6 0,89 - 3600

Адсорбционная хроматография на окиси алюминия 140 18 0,85 21,2 23,8 2520 70

Высаливание и гель-фильтрация на сефадексе 85 20 0,32 62,5 70,3 1720 47,7 !

ИОХ на Амберлите СГ-50 180 8 0,03 2581 2900 1440 40

Выделенный препарат ТКБ был использован для изучения некоторых его физико-химических свойств. Установлено, что бактерицидную активность ТКБ блокировали моноиодацетат (МИА) и парахлор-меркурибензоат (п-ХМБ), но не тиогликолят натрия или бета-мер-каптоэтиламин. Иодирование белка уничтожало бактерицидность, значительную ингибицию вызывали также ионы двухвалентного железа (1 х 10 3М/50 мкг). Полианионы - ДНК, гепарин, протаминсуль-фат в разной степени подавляли активность в концентрациях > 100 мкг/50 мкг ТКБ. Ингибирующее действие также проявляли додецил-сульфат натрия (ДДС), мочевина и дезоксихолат натрия. Высокие концентрации солей (гО,2М) хлорида натрия, сульфата аммония бактерицидную активность ТКБ уменьшали, но её можно было восстановить после диализа. В таблице 2 представлены некоторые свойства бактерицидного тромбоцитарного белка. Очевидно, что катионные свойства молекулы обусловлены не только высоким содержанием

лизина, но также глютамином и аспарагином, дезаминирование которых может приводить к снижению указанного свойства. Известно, что высокое содержание в белке пролина обусловливает нарушение упорядоченности альфа-спирали, создает гидрофобные участки (наряду с некоторыми другими аминокислотами), определяя амфипати-ческие свойства и стабилизируя его пространственную структуру, что и наблюдается относительно ТКБ в экспериментах. Так как в белках легко иодируются остатки пролина, гистидина, тирозина, а также сульфгидрильные.группы (Д.Бейли, 1968), то обнаруженное явление блокады активности ТКБ при проведении иодирования указывало на участие названных аминокислот (групп) в бактерицидном действии.

Таблица 2

Молекулярные свойства бактерицидного белка из тромбоцитов человека

1 2

Молекулярная масса 5,6+0,4 кД

Изоэлектрическая точка (р!) > Ю,5

Аминокислотный состав Цистеин, гистидин, лизин, аланин, пролин, аспарагиновая<ЫН2), глюта-миновая (>Ш2), серин, глицин, тирозин, валин, фенилаланин, лейцины

Ы-концевая аминокислота Тирозин (?)

Количество пептидных цепей Одна

Наличие углеводных, липидных компонентов и нуклеиновых кислот Не обнаружены

Дисульфидные связи ?

продолжение табл. 2

I 2

Свободные сульфгидрильные группы (БН) Имеются |

Группы и аминокислоты, существенные для биологической активности Сульфгидрильная, гистидип, пролин,тирозин 1 1 1

Активаторы 1 Са2+, НСО,', ацетат, аммоний |

Ингибиторы Ре2+, Си2+, Г, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, гемоглобин, ДНК, РНК, гепарин, МИА, п-ХМБ, высокие концентрации солей, трипсин

Оптимальный ионный состав Ыа+, ацетат, аммоний, Са2+, НС03'

Термостабильность 90°- 5 мин

Оптимальная рН 4,5-6,5

Адсорбенты окись алюминия, каолин, асбестовый фильтр, агар-агар

Инактивация тромбоцитарного белка МИА и п-ХМБ свидетельствовало об участии в бактерицидном действии сульфгидрильных групп, а подавление биологической активности ТКБ полианионами указывало на то, что сохранение катионного свойства определяет мембранотропность белка, которая является необходимым условием для проявления бактерицидности.

При рассмотрении в сравнительном аспекте молекулярных свойств бактерицидного белка из тромбоцитов крови человека и ли-зосомальных катионных белков нейтрофильных гранулоцитов - де-фенсинов (В.Н.Кокряков, 1995; R.I.Lehrer, 1993 и др.) обпаружпна-

ются как их сходство, так и различия. Обе группы белков характеризуются низкой молекулярной массой, катионными и амфипати-

ческими свойствами, мембранотропностыо и бактерицидной активностью. Однако, белки различаются по происхождению, величине молекулярной массы, аминокислотному составу, ингибиторам (реактивы на свободные сульфгидрильные группы не блокируют активность дефенсинов), а также антибактериальному спектру. Тем не менее представляется возможным рассматривать эти вещества как представители одного семейства белков, характеризующихся определенной общностью молекулярных свойств и механизмов антибактериальных функций.

2. Антибактериальный спектр ТКБ и механизм бактерицидной активности.

Бактерицидная активность ТКБ исследована на 34 штаммах грамположительных и грамотрицательных бактерий, представителей кокковых и палочковидных форм. Результаты определения МБК тромбоцитарного белка представлены в таблице 3, из которой видно, что ТКБ обладал высокой бактерицидной активностью против спорообразующих грамположительных бактерий - В. subtilis и В. cereus, в меньшей степени - против исследованных представителей кокковой группы.

Стафилококки, стрептококки, энтерококки были устойчивы к концентрациям ТКБ до 75 мкг. Большие дозы препарата (75-150 мкг) задерживали рост микроорганизмов этих групп. Эшерихии оказались устойчивыми к дозам ТКБ до 150 мкг.

При изучении механизма бактерицидного действия ТКБ было принято во внимание то, что согласно результатам исследований ряда авторов (J.G.Hirsch, 1958; J.Tew et al., 1971 и др.) катионные белки различной природы - гистоны, дефенсины - при действии на бактерии вызывают повреждения мембран, обнаруживаемые электронно-микроскопическим методом. Такие повреждения могли быть результатом перекисного окисления ее липидов. Для выяснения возможного воздействия ТКБ на состояние мембранных липидов исследовали:

- степень связывания ТКБ взвесью бактериальных клеток различного уровня чувствительности к нему,

- влияние воздействия фосфолипаз на бактериальные клетки в связи с их способностью связывать ТКБ,

- влияние фосфолипидов на бактерицидную активность тромбоцитарного белка.

Таблица 3

Бактерицидный спектр и МБК тромбоцитарного катионного белка

№№ Название Штамм Откуда МБК

п/п микроорганизмов получен

1 М. luteus 490 ГИСК им. 40-60 мкг

2 М. luteus 110 Л.А.Тарасевича

3 М. luteus 486

4 М. luteus 1314

5 М. luteus 2665

6 М. luteus 109

1 S. aureus 727 Клинические 40-60 мкг

8 S. aureus 571 изоляты

9 S. aureus 503

10 S. aureus 594

11 S. epidermidis "К" ГИСК им. 40-60 мкг

12 S. aureus 3239 Л.А.Тарасевича

13 S. aureus 209P

14 Str. pyogenes A-221 Клинические 75-150 мкг

15 S. pyogenes A-38 изоляты 1

16 S. pyogenes A-17

17 S. pyogenes A-32

18 Enterococcus faecalis 871

19 E. faecalis 602

20 E. faecalis 6

21 B. subtilis 83 ГИСК им. 10-25 мкг

22 B. subtilis 8236 Л.А.Тарасевича

23 В subtilis 6633

24 В subtilis 6346

25 B. subtilis 501

26 В subtilis 428

27 В cereus 57B

28 В cereus 569

29 E. coli 0-24 ГИСК им. > 150 мкг

30 E. coli 0-11 1 Л .А.Тарасовичи

31 E. coli 0-26

32 E. coli 0-27

33 E. coli 0-22

34 Salmonella spp.

Эти работы должны были определить роль фосфолипидов бактериальных мембран, чувствительных и легко метаболизируемых его компонентов во взаимодействии клеток с ТКБ.

В результате исследований установлено, что т'ромбоцитарный белок связывается взвесью интактных бактерий независимо от их видового происхождения (в пределах опыта). 1 мрд взвесь испытанных культур В. subtilis 83, M.luteus 2665, E.coli 0-111 через 10 минут контакта с 32 мкг тромбоцитарного белка связывало соответственно 82,4% ± 7,6%; 69,5% ±11,2; 56,7% ± 14,4 (Р < 0,05). Сопоставление полученных результатов с величинами МБК (табл. 3) микроорганизмов указывали на отсутствие корреляции между степенью рецепции бактериями тромбоцитарного белка и величиной МБК.

При определении поверхностно-клеточных структур, ответственных за взаимодействие с ТКБ, основное внимание было уделено фос-фолипидам.

Исследования показали, что разрушение фосфолипидов (ФЛ) поверхности бактериальных клеток и мембранных фракций в результате инкубации их с панкреатической фосфолипазой снижало последующую адсорбцию ТКБ во взвеси E.coli 0-111 на 17,3% ± 6,2 (Р < 0,05), а на мембранной фракции микрококков до 68,1% ± 7,8 (Р < 0,01). Не исключая возможной роли других мембранных компонентов в рецепции ТКБ, полученные результаты указывали на участие в процессе его связывания фосфолипидов. Эти данные подтверждены в следующей серии опытов, где изучали взаимодействие тромбоцитарного белка в растворе с фосфатидилсерином (ФС) или фосфатидилхоли-ном(ФХ). ФХ блокировал бактерицидную активность тромбоцитарного белка, степень ингибиции бактерицидной функции зависела от концентрации ФХ. Высокой ингибирующей активностью обладал ФХ, который в концентрациях, превышающих 20 мкг блокировал бактерицидное действие 32 мкг ТКБ (рис. 2). Одновременно обнаружено, что в комбинации ФХ-ТКБ фосфолипид исключался как субстрат для фермента панкреатической фосфолипазы, т.к. при добавлении к такой смеси (ФХ-ТКБ) фермента не удавалось обнаружить продуктов реакции гидролиза ФХ.

Таким образом, представленные результаты свидетельствовали о высокой мембранотропности тромбоцитарного белка. Тропность проявлялась к мембранам (стенкам) бактерий представителей как грамположительных, так и грамотрицательных форм. О различиях качественного и количественного состава фосфолипидов биомембран

различных бактерий хорошо известно. Так, по сводным данным Я. Кагава (1985), мембраны эшерихий в отличии от грамположитель-ных бацилл (высоко-чувствительных к ТКБ) характеризуются более чем двукратным содержанием фосфатидилэтаноламина, но на столько же более низким - фосфатидилсерина.

Концентрация ФХ (мкг)

Рис. 2. ТКБ-ингпбирующая способность фосфатидилхолина (ФХ) (в пробе - 32 мкг бактерицидного белка)

Возможно, имеется определенная корреляция между фосфолипид-ным составом мембран бактерий и их чувствительностью к ТКБ, однако, учитывая сложность и изменчивость молекулярной архитектоники мембран (и клеточных оболочек) отдельных представителей бактерий, решение этого вопроса требует специальных исследований.

В то же время было очевидным, что в связывании ТКБ бактериальными клетками участвуют фосфолипиды, а образование фосфо-липид мембран-ТКБ лиганд-рецепторной связи могло, экранируя ФЛ, регулировать их метаболизм и, главным образом, реакции ПОЛ.

Для того, чтобы выяснить возможное влияние лиганд-рецептор-

ного взаимодействия на реакции перекисного окисления ФЛ проведено изучение состояния ПОЛ в двух аспектах. Во-первых, определяли уровень продуктов ПОЛ-диеновых коньюгатов в бактериальных клетках, подвергнутых воздействию тромбоцитарного белка и в ин-тактных микроорганизмах. Во-вторых, исследовали состояние антиокислительной системы в тех же группах бактерий путем определения активности пероксидазы и каталазы. Опыты были поставлены на чувствительных к ТКБ микроорганизмах В.БиЫШэ 83 и относительно устойчивой Е.соН 0-111.

Установлено, что в результате действия ТКБ в бактериальных клетках накапливаются ДК. Количество их увеличивалось у В.эиЫШз в 2,3 раза (р < 0,01), у кишечной палочки в 0,3 раза (р < 0,05). ТКБ вызывал также изменение активности пероксидазы и каталазы в исследованных штаммах В.зиЫШз 83, В.сегеиз 569 и Е.соН 0-111. Значительным было снижение активности ферментов у В.зиЫШз, В.сегеиз (рис.3). Так ингибиция пероксидазы у В.зиЫШз составляла 43,2±5,2°/о (Р < 0,05), а каталазы 33,4±4,5% (Р < 0,05), в то время как у кишечной палочки ферменты ингибировались незначительно.

о

О

О

■з; о

X

с£ о

X

о £

ь о

&

о х ш

£ ГО

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 - 0

Т

Т шЩВ

т

Ш

*

Е.соН

В.сегеиэ

□ пероксидаза ш каталаза

Рис. 3. Влияние ТКБ на активность пероксидазы и каталазы

Изложенные материалы исследований давали основание считать, что мембранотоксичность ТКБ для бактерий обусловлена его способностью ингибировать ферменты антиокисилительной защиты - пероксидазу и каталазу, накоплением продуктов ПОЛ, которые и приводят к деструкции мембран. Изменение уровня ПОЛ, определяющее экспрессию бактерицидной активности ТКБ, очевидно, зависит от доступности указанных ферментов отдельных видов микроорганизмов к регулирующему влиянию тромбоцитарного белка, которое может осуществляться либо при непосредственном их взаимодействии, либо триггерным механизмом. Нельзя исключить также того, что фермент-ингибирующая функция тромбоцитарного белка ассоциирована с его способностью связываться с ионами железа, входящими в простетические группы рассматриваемых ферментов.

В то же время хорошо известно, что пероксидаза и каталаза представлены в клетке в основном в виде мембраносвязанных форм, в комплексах с липидами, которые участвуют в регуляции их активности (В.П. Скулачев, 1972; Н.С.Гельман и др., 1972; В.П.Скулачев, 1996; ^Маг^Б е! а1., 1984 и др.) Исходя из этого, можно предположить, что ТКБ, связываясь с липидами мембран, вызывает деформацию макроструктур и аллостерическим механизмом снижает активность антиокислительных ферментов и приводит к накоплению токсичных для бактериальной клетки перекисей. Косвенным подтверждением того, что ТКБ реализует бактерицидное действие через вспомогательные ферменты окислительно-восстановительной группы является факт резистентности анаэробов к тромбоцитарному белку (Н.В.Васильев, 1960; О.В.Бухарин с соавт., 1978).

3. Роль тромбоцитарного белка в инфекционной патологии.

Содержание ТКБ увеличивается в очаге воспаления независимо от того чувствителен к нему или устойчив возбудитель (О.В.Бухарин с соавт., 1979, 1985). В связи с этим существовало предположение о том, что противоинфекционная роль тромбоцитарного белка не ограничивается его бактерицидным действием, однако специально этот вопрос до настоящего времени не изучался.

Было проведено исследование влияния ТКБ на фагоцитоз бактерий, а также изучена его защитная роль при экспериментальной саль-монеллезной и синегнойной инфекции.

Установлено, что предварительное воздействие препарата тром-

боцитарного белка на фагоциты (нейтрофилы) или бактерии стимулировало фагоцитарную реакцию: фагоцитоз сальмонелл по показателям индексов Гамбургера и числа Райта увеличивался соответственно на 148% (р < 0,05) и 222% (р < 0,05) при инкубации фагоцитов с ТКБ. Предварительная инкубация бактерий с тромбоцитарным белком повышала те же показатели фагоцитоза в среднем на 186% (р < 0,05) и 250% (р < 0,05) (рис. 4).

250 200 150 100 50 0

§

■1= шшвг

Г

фагоциты + ТКБ

бактерии + ТКБ

□ индекс Гамбургера Е индекс Райта

Рис. 4. Влияние ТКБ на фагоцитоз сальмонелл

Полученные результаты указывали на то, что ТКБ способен стимулировать фагоциты, а также опсонизировать бактериальные клетки. Следовательно, противоинфекционная защитная роль тромбоци-тарного белка определяется его прямым бактерицидным действием, а также фагоцитоз-стимулирующей и опсонизирующей функциями, которые не зависят от чувствительности патогена к ТКБ.

Защитная функция тромбоцитарного белка против устойчивых к его бактерицидному действию микроорганизмов подтверждена на модели экспериментальной сальмонеллёзной и синегнойной инфекции. Лечение сальмонеллёзной инфекции путем ежедневных двукратных инъекций 86 мкг препарата снижало летальность мышей в среднем на 15,8% (р < 0,05). Протективная активность возрастала, если ТКБ дополнительно вводили профилактически в течение 2 дней до

заражения. В этом случае летальность сокращалась на 45,9% (р < 0,05). Защитное действие проявлялось и при синегнойной инфекции. Лечение тромбоцитарным белком сокращало летальность на 11,9% (р < 0,05), тогда как при одновременном профилактическом и лечебном применении препарата - в среднем на 40,7% (р < 0,05) (рис. 5). Полученные результаты легко объяснялись фагоцитоз стимулирующей (иммуномодулирующей) активностью ТКБ. Учитывая то, что изменение функционального состояния фагоцитов - кондиционирование - в значительной мере определяет иммунологический и общий гомео-стаз (А.Н.Маянский, 1989), указанную биологическую активность тромбоцитарного белка следует рассматривать как фактор реализации гомеостатических и патогенетических ресурсов клеток.

2 юо т

§ 90 -

1« 80 1 о о) 70 -

60 -

о 2 50 -

З®3 40 -

со Й 30 -

-о ? 20 I Ют 0

с л

<и С

□ контроль □ лечение ТКБ □ профилактика и лечение ТКБ

Рис. 5. Влияние ТКБ на исход (% летальности мышей) сальмонеллезной и синегнойной инфекции

Влияние ТКБ на вирулентность и персистентные характеристики бактерий определяется его мембранотропностью. В экспериментах показано, что заражение мышей сальмонеллами, предварительно инкубированными с тромбоцитарным белком (20 мкг/106 клеток) снижало вирулентность бактерий. Величина ЬО)(Ю сальмонелл, предин-кубированных с ТКБ, увеличивалась в среднем в 4,4 раза по сравнению с дозой в контрольных группах. Полученные результаты нельзя было объяснить только фагоцитоз стимулирующим свойством ТКБ, так как фагоцитарные показатели увеличивались под влиянием бел-

Т

г

■Е

¡Щй

сагьмонеллезная синегнойная

инфекция инфекция

ка не более чем в 2 -2,5 раза. Кроме того, инфекция в опытных группах протекала в менее острой форме, что также указывало на снижение вирулентности сальмонелл после инкубации с ТКБ.

Снижение вирулентных свойств бактерий могло быть обусловлено изменением заряда, гидрофобных свойств поверхности клетки, экспрессии детерминант адгезии вследствие адсорбции мембра-нотропного катионного белка и т.д. Об изменении под влиянием ТКБ биологических свойств бактерий свидетельствовали результаты исследований их персистентных характеристик. Изучено влияние тромбоцитарного белка на антилизоцимную активность бактерий (АЛА). Известна выраженная экспрессия этого признака у микроорганизмов, выделяемых от бактерионосителей и доказана его значительная роль в явлениях персистенции патогена в организме хозяина (О.В.Бухарин, Б.Я.Усвяцов,1987). Опыты были проведены с 18 штаммами S.epidermidis и 18 штаммами E.coli- клиническими изолятами. Установлено, что под влиянием ТКБ (0,1 мг/1мрд взвесь бактерий) АЛА снижается у 35,3% штаммов исследованных эшери-хий и 73,3% штаммов эпидермального стафилококка. Выраженность изменения признака АЛА была неоднозначной у различных микроорганизмов каждого вида. Исследования указывали на то, что биологические свойства микроорганизмов, определяющие взаимодействие их с макроорганизмом могут изменяться под влиянием ТКБ. О том же свидетельствуют изложенные результаты исследований, в которых показана способность ТКБ ингибировать ферменты перок-сидазу и каталазу. Эти ферменты можно рассматривать не только как факторы вирулентности, но и как факторы, определяющие способность бактерий выживать и персистировать в тканях хозяина. Так как бактериальная пероксидаза способна вызывать деструктивную окислительную трансформацию жизненно значимых соединений - белков, нуклеиновых кислот и других в клетках-мишенях (P.S. Feinstein a.al., 1969; J.D. Cherri a.al., 1970 и др.), блокирование фермента тромбоцитарным белком приведет к снижению вирулентности и персистентного потенциала у микроорганизмов, в том числе обладающих высокой устойчивостью к литическому действию ТКБ. В то же время, ТКБ, подавляя активность бактериальной перокси-дазы и каталазы, предотвращает нейтрализацию ими одного из важнейших компонентов окислительной формы защиты клетки - перекиси водорода (Т.Р. Stossel a.al., 1983). Следовательно, роль тромбоцитарного катионного белка в инфекционной патологии не может

оцениваться лишь с позиции мерь, его бактерицидной активности. Высокая мембранотропность ТКБ обеспечивает изменение поверхностно-клеточных свойств микроорганизмов, которые имеют решающее значение в механизмах взаимодействия патоген - клетка хозяина. Подавление тромбоцитарным белком активности перок-сидазы и каталазы также изменяет характер взаимоотношений патоген - клетки мишени в пользу хозяина.

Стимуляция фагоцитоза, изменение функционального состояния тромбоцитов и лимфоцитов под влиянием ТКБ являются еще одним существенным аспектом противоинфекционной активности тромбо-цитарного белка, вне зависимости от непосредственной реализации микробоцидного действия.

Все указанные проявления биологических свойств ТКБ и обеспечивают его протективный и лечебный эффект, в том числе при инфекционных заболеваниях, вызванных высокоустойчивыми к тром-боцитарному белку возбудителями, что подтверждено в опытах с экспериментальной инфекцией.

4. Роль тромбоцитарного катионпого белка в иммунном и общем гомеостазе. ТКБ - острофазный белок.

В серии экспериментов установлена тропность ТКБ также и к ряду соматических клеток, сопровождающаяся изменением их функционального состояния. Так, инкубация спленоцитов с ТКБ приводила к снижению спонтанного (при хранении в 0,9% растворе хлорида натрия) выхода из клеток ЛДГ. Если в контрольных (без ТКЬ) образцах спленоцитов активность ЛДГ составляла 26,3± 1,7 ед., то н инкубатах с тромбоцитарным белком активность ЛДГ в суперна-тантах уменьшалась до }8,1±1,0 ед., т.е. на 31%. Таким образом, тромбоцитарный белок проявлял способность стабилизировать мембраны клеток.

Иным был характер влияния ТКБ на поврежденные клетки. Тромбоцитарный белок повышал содержание перекисей в дестабилизированной путем повторных воздействий гипо- и гипертонических растворов хлорида натрия взвеси лимфоцитов и ускорял их альтерацию, о чем свидетельствовало значительное возрастание в клетках ДК и определение числа трипанпозитивных клеток (табл. 4). В то же время, ПОЛ интактных клеток под влиянием тромбоцитарпого белка уменьшалось по данным определения ДК с 0,018 до 0,012 (Р < 0,05).

Таблица 4.

Влияние ТКБ на интенсивность ПОЛ "нормальных" и дефектных взвесей лимфоцитов (в опытных и контрольных образцах Зх 108 клеток).

Содержание проб Дестабилизация Доля живых клеток (%) Содержание ДК(в оптических ед. при 232 нм) "Л, изменения от К Р

Клетки без обработки ТКБ (контроль) - 85±11 0,018±0,004 - -

Клетки, обработанные ТКБ (14,8мкг) - 85±11 0,012±0 ,002 50,0 >0,05

Клетки без ТКБ + 33±9,6 0,038±0,00б 316,6

Клетки, обработанные ТКБ + 33±9,6 0,14±0,02 1166,6 <0,001

Установлено также влияние тромбоцитарного белка на важнейшие физиологические функции лимфоцитов и тромбоцитов. РБТЛ, стимулированная ФГА, подавлялась на 28,4% 24мкг препарата (р<0,01). Достоверное снижение трансформации лимфоцитов в бла-сты отмечалось при концентрации ТКБ, равной 9,2 мкг. 4

При определении агрегации тромбоцитов, вызванной добавлением коллагена, показано, что предварительная инкубация тромбоцитов с ТКБ уменьшала степень выраженности и скорость исследованной реакции. Тромбоцитарный белок ингибировал миелопероксида-зу в экстрактах лейкоцитов крови человека.. Минимальная инги-бирующая концентрация в 0,2 мл экстракта из 5x106 клеток/мл составляла 38 мкг ТКБ, степень ингибиции нарастала от 35,8% до 66,7% при увеличении дозы тромбоцитарного белка до 304 мкг. Ингиби-рующую активность ТКБ проявлял и относительно глютатион-пероксидазы гомогената печени крыс. Изложенное свидстельстиоиало об универсальности ингибирующей функции ТКБ (относительно бак-

терий и соматических клеток), которое можно представить в виде следующей схемы (рис. 6).

ЯН Глютатион-БН

Обозначения:

R Н - Субстрат, окисляемый пероксидазой ROH - Продукт окисления ' Ингибиция фермента

Рис. 6. Роль ТКБ в регуляции ферментов антиокислительной защиты клеток

Мембранотропность тромбоцитарного белка выявлена и относительно эритроцитов. Инкубация отмытых эритроцитов с тромбоци-тарным белком (17 мкг/5х106 клеток) сопровождалась повышением показателя резистентности в солянокислом растворе, что проявлялось снижением процента гемолиза и сдвигом его максимума с 3,8 мин. до 5 мин. (рис. 7).

Максимумы гемолиза в опыте и в контроле

К

10

__III III_I

2 4 6 8 мин.

Рис. 7. Влияние ТКБ на осмотическую резистентность эритроцитов в 0,0004 н. растворе соляной кислоты

Известно, что в любой ткани имеется система обновления, которая распространяется как на макромолекулы, так и на целые клетки (L.E.Orgel, 1973). Хотя эти механизмы еще далеко не изучены, известно, что в здоровой ткани существует динамическое равновесие между процессами распада и новообразования клеток и макромолекул (A.Woldberg, A.John, 1976).

Результаты представленных исследований позволяют допустить, что тромбоцитарный белок участвует в системе обновления клеток, надзора за их физиологическим статусом и поддержания "нормального" постоянства внутренней среды организма.

Эти функции ТКБ в иммунном и общем гомеостазе проявляются через антибактериальную активность, иммуномодуляцию, стабилизацию мембран соматических клеток в экстремальных условиях патологического очага, стимуляцию перекисного распада альтерированных клеток и их элиминацию. Потребность в ТКБ возрастает при напряжении механизмов гомеостаза, т.е. при развитии патологии, что и подтверждается клиническими наблюдениями. В плазме крови здоровых людей выявляются лишь следовые количества ТКБ, в сыворотке 2-4 ед„ но при различных патологических состояниях содержание тромбоцитарного белка в сыворотке увеличивается до 32-64 ед. (О.В.Бухарин, 1982,1984; Б.А.Фролов, 1985; I.C.Foral a.al., 1976).

Таким образом, при отсутствии в организме патологических процессов уровень ТКБ в нативной крови и плазме очень низок и он, очевидно, определяется уровнем естественного распада (обновления) тромбоцитов. Это "свободная" форма ТКБ, но другая, большая его часть находится в связанном с мембранами состоянии и в виде предшественника. Он стабилизирует мембраны ряда соматических клеток, что было показано выше. Известно, что в явлениях межклеточного взаимодействия участвуют фосфолипиды мембран (R.Zwaal а. al., 1981). Подавление агрегации тромбоцитов во взвеси, содержащей ТКБ указывало на то, что тромбоцитарный белок, влияющий на метаболизм фосфолипидов, способен регулировать межклеточную кооперацию.

Экранирование фосфолипидов связанной формой ТКБ препятствует развитию их фосфолипазного этапа превращения (рис. 8).

Это предопределяет значимость ТКБ как регулятора ПОЛ, т.к. интенсивность этих реакций, в частности, метаболизм арахидоната, приводит к образованию ряда важнейших медиаторов и эффекторов функциональной активности и кооперации клеток - ФАТ, лейкотрие-нов, тромбоксанов, простагландинов, перекисей (А.И.Арчаков, 1975; А.М.Кузин, В.А.Копылов, 1983; E.Will a, al. 1966, 1971 и др.). В связи с этим становится понятным механизм гомеостазирования, осуществляемый ТКБ через стабилизацию мембран - предотвращение избыточной пероксидации липидов.

Другая сторона функционального проявления тромбоцитарного белка характерна для лабилизованной, свободной формы ТКБ. Она выражается в бактерицидном действии, стимуляции фагоцитоза и j лизиса (цитолиз) дефектных клеток. Названные эффекты опосреду-I ются через механизм ингибиции антиокислительных ферментов пе-

роксидазы и каталазы и увеличения концентрации активных форм кислорода. Пероксидаза и каталаза соматических клеток представлена преимущественно в виде внутриклеточных мембраносвязанных ферментов (А.И.Арчаков, 1973 и др.), в то время как некоторые ин-тактные бактериальные клетки продуцируют их также и в окружающую среду (Е.М.Губарев, 1961 и др.). Степень доступности ферментов для ингибитора, количество и активность, характеризующие бактериальный вид, и должны определять чувствительность микроорганизма к бактерицидному действию ТКБ.

Обозначения: ссщ^ - фосфолипиды клеточных мембран

А - тромбоцитарный катионный белок, экранирующий часть фос-

фолипидов

Показаны также некоторые продукты ПОЛ, образующиеся в этих реакциях

Рис. 8. Влияние ТКБ на состояние мембран и перекисное окисление липидов

Лейкотрш

ФАТ

Перекиси жирных кислот

Фосфолипиды мембран являются той ареной, на которой развертываются как физиологические, так и патологические реакции в ответ на различные сигналы (Г.В.Андреенко, Г.А. Суворова, 1986; G. Jonathan a.al., 1980;).

Действительно, наряду с тем, что в необходимых случаях мембранные структуры служат источниками образования вышеупомянутых медиаторов и эффекторов межклеточной кооперации, они же могут быть объектом некомпенсированного перекисного окисления жирных кислот, продукты которых повреждают те же мембраны и вызывают альтерацию клеток. В организме существуют два альтернативных пути обмена мембранных липидов: первый, приводящий к образованию медиаторов и эффекторов клеточной кооперации, и второй - перекисный распад, спонтанный свободнорадикальный путь метаболизма. Вторая цепь реакций, ПОЛ, в норме должна быть подавлена, так как некомпенсированность этих реакций чревата гибелью клетки. Реализация каждого из альтернативных путей зависит, вероятно, от многих факторов, но ясно одно - доступность фосфолипп-дов для фосфолипаз обусловливает начало процессов превращений (В.А.Барабой, 1991; В.А.Извекова, 1991 и др.).

Исходя из этого, становится интересным обнаруженный нами феномен ингибиции тромбоцитарным белком каталазной и перок-сидазной активности бактерий и дефектных соматических клеток. Если тромбоцитарный белок in vivo в свободном виде функционирует как ингибитор пероксидазы и каталазы, он должен препятствовать метаболизму перекиси водорода и приводить к накоплению его в клетке, что вызвало бы деструкцию мембран и клеточный распад, что и наблюдается в бактериях. Избыток перекиси водорода повреждает клеточные мембраны, атакуя двойные связи ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов и превращая их в гидроперекиси (А.П.Арчаков, 1976).

На первый взгляд это положение вступает в противоречие с вышеуказанным утверждением о том, что ТКБ, связываясь с мембранами, препятствует вовлечению фосфолипидов в реакции свободнора-дикального превращения. Однако нужно учитывать то, что ТКБ в организме находится в основном, в связанном с мембранами состоянии. Следовательно, в нормальной клетке он разобщен с ферментами и может оказывать на них лишь аллостерический эффект.

В случае же, когда ТКБ лабилизирует, освобождается под влиянием регуляторных факторов или повреждения мембран, гибели клет-

ки, его.ингибиторное действие на пероксидазу и каталазу проявляется в полной мере, то есть можно говорить о статической и динамической функции ТКБ. Первая связана со стабилизацией мембран и "консервированием" фосфолипидов, вторая - со стимуляцией ПОЛ. Преждевременно считать эту вторую функцию ТКБ патогенетическим звеном альтерации тканей, так как, на наш взгляд, существует и другой аспект оценки реакций ПОЛ. В рассматриваемом случае ингибитор-ная активность ТКБ (к пероксидазе и каталазе) оживится только после его лабилизации из мембран. Если исключить возможные регуля-торные причины этого, то способствовать лабилизации будут патологические изменения обмена веществ и структуры мембран. Они могут быть вызваны эндогенными и экзогенными токсинами, микроорганизмами, физическими и химическими факторами (Habayashi Gohnosuke, Usui Tomofusa,1982). Освобождение ТКБ приведет, в первую очередь, к стимуляции ПОЛ в данной клетке, что повлечет за собой такую дезинтеграцию клетки, которая облегчит ее распад и фагоцитарную утилизацию. Стимуляция фагоцитоза при таком ходе событий будет обеспечена наличием ТКБ и большого количества пе-рекисных соединений (L.Ingraham a.al., 1982; А.П.Ястребов и др., 1985).

Из изложенного возникает представление еще об одной стороне участия ТКБ в гомеостазе.

Катнонный белок освобождается из мембран дефектных клеток и запускаются реакции ПОЛ, приводящие к элиминации бактерий и патологически измененных клеток. Возможно, с помощью такого механизма осуществляется "выбраковка", селекция клеток и в популяции поддерживается функционально и структурно полноценная линия.

На рис. 9 представлены биологические эффекты ТКБ, определяющие его активность при иммунном и общем гомеостазе.

ТКБ - острофазный белок. Клинической значение ТКБ-теста.

ТКБ (бета-лизин), наряду с С-реактивным белком был в числе первых признанных сигнальных, так называемых острофазных белков (Q.Myrvik, 1956). Повышение его содержания в сыворотке крови по наблюдениям многих исследователей (О.В.Бухарин с соавт. 1973-1981; Н.В.Васильев с соавт., 1968, 1979 и др.) указывало на существование остро развивающегося патологического процесса. Однако, уровень ТКБ в сыворотке является интегральным показателем и, очевидно, определение локального изменения содержания ТКБ в патологическом очаге представляло бы большую диагностическую ценность.

Рис. 9. Биологические эффекты ТКБ, определяющие его противоинфекционную и гомеостазирующую функцию

С этой целью было исследовано диагностическое значение ТКБ-теста в молоке для выявления скрытых, субклинических форм маститов, при которых количественные изменения ТКБ в сыворотке не обнаруживались.

Первая серия опытов была проведена на животных (коровах), в последующем диагностическая эффективность метода была подтверждена в медицинской акушерско-гинекологической практике.

Для сравнительной оценки значения ТКБ-теста одновременно диагностику проводили с помощью препаратов мастидина и дима-стина, широко используемых в ветеринарной практике для выявления маститов. Диагноз подтверждался также бактериологическими исследованиями (О.Л.Чернова, 1991). Выборочное исследование молока здоровых животных показало, что его бактерицидная активность низка. Разная степень активности термостабильного и кислотоустой-

чивого бактерицидина была выявлена у животных в молоке с положительными реакциями на димастин. Показано, что уровень ТКБ коррелировал с выраженностью указанной реакции (табл. 5).

Таблица 5

Среднее содержание ТКБ в молоке в зависимости от степени заболевания маститом

Всего проб Степень заболевания Содержание ТКБ (%/мл)

17 молоко от здоровых 0

10 реакция с димастином на 1 + 3,8±0,9

15 то же 2 + 9,8±2,7

16 то же 3 + 35,0±2,8

Также были проведены динамические исследования молока 11 коров тремя указанными выше методами трехкратно на протяжении 3-х месяцев. Молоко одних животных этой группы не реагировало с димастином, у других давало реакцию на 1 + или 2+. -Бактериологическое исследование свидетельствовало об инфицированности отдельных долей молочной железы у 5 коров, в то время как проба с димастином была во всех случаях отрицательной. В тех же порциях молока у 4 из 5 животных обнаруживался бактерицидин. Повторные исследования через 1 и 2 месяца у указанных 4-х животных показали положительную (на 2+ или 3+) реакцию с димастином.

Установлено, что повышение содержания ТКБ в молоке в 1,3 - 1,8 раза по сравнению с нормой (р < 0,05) свидетельствует о существовании бессимптомной формы мастита. Диагноз подтверждался бактериологическими и цитологическими исследованиями. Уровень ТКБ в молоке возрастал еще более при клинически выраженных серозных и гнойных формах мастита, при этом изменение его концентрации в

сыворотке было не существенным. Результаты экспериментов позволили разработать метод ранней диагностики маститов (а.с. № 1389045, 1984), который успешно используется в практической работе.

Следующая серия опытов также была проведена на сельскохозяйственных животных. Это определялось особенностью формирования у них постнатального иммунитета. В отличие от человека у коров плацентарный механизм передачи иммунных факторов (в частности, иммуноглобулинов) не развит (В.А.Каснов, 1984). Формирование постнатального иммунитета определяется иммуногенной активностью молозива и своевременной, ранней его выпойкой новорожденным телятам, у которых в первые часы жизни блокированы протео-литическе ферменты желудочно-кишечного тракта, а его стенка проницаема для иммуноглобулинов и других белков.

Было исследовано содержание ТКБ в молозиве и молоке новотельных коров с первого по 15 дни лактации. Установлено, что количество бактерицидного тромбоцитарного белка являлось максимальным в 1-ый день лактации (68% лизиса), постепенно убывало в последующие дни и у здоровых животных достигало следовых количеств к 10-15 дню. При наличии у животных мастита уровень ТКБ оставался высоким. Результаты исследований позволили разработать способ оценки бактерицидных свойств молока и физиологич-ности формирования лактации в послеродовый период (а.с. № 1139416, 1987).

Таким образом, определение уровня тромбоцитарного бактерицидного белка в молоке позволяло не только диагностировать патологию молочной железы, но оценивать динамику и характер изменений в организме в период физиологического напряжения, связанного с формированием лактации, определяющей постнатальную про-тивоинфекционную резистентность.

Приведенные результаты подтверждают представление о ТКБ как острофазном белке. Информативность ТКБ-теста становится ясной, если принять во внимание механизмы и условия продукции тромбоцитарного белка. Выделение ТКБ происходит лишь при свертывании крови, а также агрегации тромбоцитов, например, индуцированной тромбином или коллагеном.

Незначительная бактерицидная активность тромбоцитарного экстракта (человека) возрастает в 10-15 раз при агрегации, т.е. в результате агрегации или свертывания крови стимулируется процессинг, вероятно, путем ограниченного протеолиза и из предшественника

выщепляется бактерицидный пептид. Механизмы процессинга ТКБ не изучены, знания в этой области открыли бы возможность влиять на инфекционный процесс, интенсивность иммуномодулирующих и гомеастазирующих реакций, зависящих от тромбоцитарного белка. Однако, доказано то, что имеется, по крайней мере, два вида сигналов на выделение бактерицидного катионного белка тромбоцитами, представленные тромбином и коллагеном. Если первый является продуктом каскадных реакций коагуляции крови, то коллаген, как индуктор ТКБ, может проявляться в случае повреждения эндотелия, обнажения и разрушения соединительно-тканных структур, богатых этим белком. Как явления микрокоагуляции, так и альтерация эндо-телиоцитов характерны для начальных этапов воспалительных и аллергических реакций на действие бактериальных токсинов, а также других этиопатогенов. Этим и объясняется высокая чувствительность и универсальность ТКБ-теста для диагностики и прогнозирования течения патологических состояний.

Особенностью бактерицидного белка тромбоцитов является то, что его активирование сопровождается дегрануляцией и выделением ТКБ в сыворотку, где они и могут быть определены, в то время как лизосомальные катионные белки нейтрофильных гранулоцитов выделяются и первоначально функционируют в фагосомах (В.Н.Кок-ряков, 1991 и др.) при стимуляции фагоцитов. Указанная особенность (продукция, выделение бактерицидного катионного белка из тромбоцитов) и обусловливает то, что микробоцидная активность сыворотки, биологических жидкостей при развитии воспаления определяется в значительной мере ТКБ, который включается в патогенетические механизмы на ранних стадиях его развития.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Катионный белок с молекулярной массой 5,6 кД из тромбоцитов крови человека характеризуется широким спектром бактерицидной активности. Антибактериальное действие определяется способностью ТКБ, подавляя ферменты антиокислительной защиты - пероксидазу и каталазу, вызывать накопление токсичных для клетки продуктов ПОЛ.

Роль ТКБ в противоинфекционной защите связана также с его способностью снижать персистентные характеристики микроорга-

низмов и их вирулентность. В то же время, тромбоцитарный белок обладает фагоцитозстимулирующей и опсонизирующей активностью.

ТКБ изменяет функциональное состояние лимфоцитов, тромбоцитов, что является, так же, как и стимуляция фагоцитоза, проявлением его иммуномодулирующих свойств и участия в иммунном го-меостазе. Биологическая активность тромбоцитарного белка определяется его мембранотропностьго и способностью связываться с мембранными фосфолипидами. Это свойство ТКБ связано с его более широким участием в общем гомеостазе, которое реализуется путем стабилизации мембран нормальных и стимуляции перекисного распада дефектных соматических клеток.

Количественное определение ТКБ-острофазного белка в биологических объектах, имеющее прогностическое и диагностическое значение, нашло широкое применение в клинической практике.

Таким образом, тромбоцитарный катионный белок следует рассматривать как высокоактивный биологический регулятор с бактерицидной, иммуномодулируюшей и гомеостазирующеи функциями.

Выводы:

1. Бактерицидный катионный белок из тромбоцитов крови человека с молекулярной массой 5,6 кД характеризуется высоким содержанием лизина, гистидина, глютамина, пролина. Для проявления биологической активности существенны свободные сульфгидрильные группы и сохранение катионных свойств.

2. ТКБ характеризуется мембранотропностыо, которая определяется его избирательным связыванием с фосфолипидами мембран бактерий и соматических клеток.

3. Антибактериальный спектр ТКБ относительно различных видов бактерий различается в 2-10 раз. Наиболее чувствительными являются представители грамположительных спорообразующих видов В.бцЫШб и В.сегеиз.

4. Бактерицидная активность ТКБ реализуется путем ингибиции пероксидазы, катализы и накоплением перекисей, вызывающих дефекты мембран.

5. Протективная и лечебная роль ТКБ в инфекционной патологии определяется, наряду с его бактерицидной активностью, опсони-

зирующей функцией, стимуляцией фагоцитоза, снижением вирулентности бактерий, изменением персистентных характеристик микроорганизмов.

6. ТКБ повышает иммунный и общий гомеостаз путем стабилизации мембран лимфоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, а также стимулируя реакции перекисного распада мембран дефектных клеток.

7. Определение бактерицидного белка в патологическом очаге или секретах повышает чувствительность ТКБ-теста и позволяет диагностировать состояния физиологического напряжения и латентные формы болезни.

Сппсок работ, опубликованных по теме диссертации

1. Факторы естественного иммунитета у населения Оренбургской области // Сб. научи, трудов ВУЗов и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета при различных патологических и физиологических состояниях". - Челябинск, 1978. - С.39-42. (соавт. О.В. Бухарин, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов, Л.А. Гущина, А.И. Смолягин, А.Г. Луда, И.Н. Матияш).

2. Показатели иммунологического статуса в процессе адаптации к климато-географическим условиям Оренбуржья // Сб. научн. трудов ВУЗов и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета при различных патологических и физиологических состояниях". -Челябинск, 1978. - С.71-78. (соавт. Л.А. Гущина, И.Н. Матияш, А.И. Смолягин, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов).

3. Динамические изменения факторов иммунитета на фоне адаптации человека к условиям Оренбурга // Сб. научн. трудов ВУЗов и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета". - Оренбург, 1979. - С.29-33. (соавт. Н.М.Быкова, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов, А.И. Смолягин, Н.М. Матияш, Л.А. Гущина).

4. Характер взаимосвязи гелио-геофизических и метеорологических факторов с показателями естественного иммунитета // Сб. научн. трудов ВУЗов и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета". - Оренбург, 1979. - С.60-64. (соавт. Н.М. Быкова, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов, А.И. Смолягин, И.Н. Матияш, Л.А. Гущина).

5. Исследование биоритмов факторов естественного иммунитета // Сб. научн. трудов ВУЗов и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета". - Оренбург, 1979. - С. 88-94. (соавт. И.Н. Матияш,

H.M. Быкова, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов, А.И. Смолягин, JI.A. Гущина).

6. Суточные колебания показателей естественной резистентности и влияние гелио-геофизических, климато-метеорологических факторов на естественный иммунитет жителей Оренбурга // Сб. научн. трудов ВУЗов и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета при различных патологических и физиологических состояниях". -Челябинск, 1979. - С.75-80. (соавт.О.В. Бухарин, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов, Л. А. Гущина, А.И. Смолягин, И.Н..Матияш).

7. Бета-лизин из сыворотки крови человека // Тез. докл.. IV Всесо-юзн. биохим. съезда. - Ленинград, 1979. - Т.З. - С. 143. (соавт. О.В. Бухарин, Г.Т. Сухих, Б.А. Фролов).

8. О связи механизмов естественного иммунитета с генотипически-ми маркерами организма // Сб. научн. трудов ВУЗоа и НИИ МЗ РСФСР "Факторы естественного иммунитета при различных патологических и физиологических состояниях". - Челябинск, 1980. - С.5-7. (соавт. О.В. Бухарин, Г.Т. Сухих, А.Г. Луда, Б.А. Фролов, Л.К. Бысгрикина, А.И. Смолягин, Л.А. Гущина, И.Н. Матияш, Н.М. Быкова).

9. Использование лизоцимного и бета-лизинового тестов для диагностики мастита у коров // Тез. докл. IV Всесоюзн. симпоз. по машинному доению с.-х. животных. - Таллин,- M., 1983. - С. 113-114. (соавт. О.В. Бухарин, О.Л. Карташова).

10. Разработка метода очистки бета-лизина из тканей и некоторые его физико-химические свойства // Деп. ВИНИТИ. - 1987. -№01 18600 81271. - 11 с.

1 1. Динамика белкового состава молозива и молока в послеродовый период у коров // Сб. научн. трудов ВУЗов и НИИ "Методы и средства диагностики, профилактики и лечения болезней животных". - Ульяновск, 1988. - С.40-42. (соавт. В. Каланда, И. Жигун).

12. Некоторые свойства острофазного белка бета-лизина // Тез. докл. I межвуз. научн.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии". - Ленинград, 1989. - С. 125-126.

13. Свойства и иммунорегуляторная роль катионного белка (бета-лизина) из сыворотки крови человека // Тез. докл. V Всесоюзн. симпоз. "Взаимодействие нервной и иммунной систем". - Оренбург, Ленинград, 1990. - С. 185-186.

14. Влияние низкомолекулярного катионного белка (бета-лизина) на активность ферментов антиокислительной защиты и фагоцитоз // Тез. докл. V Всесоюзн. симпоз. "Взаимодействие нервной и иммун-

ной систем". - Оренбург, Ленинград, 1990. - С.175. (соавт. А.М. Герасимов).

15. Бета-лизин, катионные пептиды и белки как регуляторы микробных биоценозов // Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия". - Оренбург, 1991. - С. 18-19. (соавт. Н.В. Васильев, О.В. Бухарин, A.M. Герасимов).

16. Иммунохимический анализ бета-лизинов различного происхождения // Тез. докл. XII научн.-практ. конф. молодых ученых и специалистов ВУЗов и НИИ. - Оренбург, 1993. - С.111-112. (соавт. C.B. Селин, О.В. Бухарин, Н.В. Васильев).

17.Протективные свойства низкомолекулярного катионного белка (бета-лизина) при инфекционной патологии // Тез. докл. XII научн.-практ. конф. молодых ученых и специалистов ВУЗов и НИИ. - Оренбург, 1993. - С. 112-113. (соавт. C.B. Селин).

18.Бактерицидная активность катионного белка бета-лизина в связи с функцией бактериальной пероксидазы и каталазы // Тез. докл. VI межгос. межвуз. научн.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии". - С.-Петербург, . 1994. - С.94.

19.Мембранотропные свойства острофазного катионного белка бета-лизина // Тез. докл. межгос. межвуз. научн.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии". - С.-Петербург, 1994. -С.94-95. (соавт. О.В. Бухарин, Н.В. Васильев).

20.Гомеостазирующие функции катионного бактерицидного белка из тромбоцитов человека // Тез докл. межвуз. симпоз. "Гомеостаз и инфекционный процесс". - Саратов, 1996. - С.147. (соавт. О.В. Бухарин).

21.Роль тромбоцитарного катионного белка (ТКБ) - бета-лизина в противоинфекционной защите // Ж. микробиол., эпидем. и иммуно-биол. - 1997. - №1. - С.3-7. (соавт. О.В. Бухарин).

22. Свойства и функции тромбоцитарного катионного белка/Лепехи современной биологии.-1998.-Т. 118; В.2.-С.63-72. (соавт. О.В. Бухарин).