Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулы клеточной адгезии в культуре эндотелиальных клеток аорты человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулы клеточной адгезии в культуре эндотелиальных клеток аорты человека"

РГ6 ОД 2 9 МАЙ 1395

академия мдашнских наук россии кардиологический научный центр

На правах рукописи ВЫЗОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

МОЛЕШЫ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ В КУЛЬТУРЕ ЭНДОтаИАЛЬНЫХ КЛЕТОК АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА. 03. 00.25 - клеточная .биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ЛАБОРАТОРИИ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ ИНСТИТУТА ЭКСПЕРИМИГГАЛЬЮЙ КАРДИОЛОГИИ КНЦ РАЖ

научный руководитель

кандидат биологических наук А. Е Мазуров

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ кандидат биологических наук Т. Н Власик, кандидат мздицинских наук Ю. А. Вэманов

Ведущая организация - Гематологический научный центр РАЖ

Защита состоится " 21" июля 1995 г. в " часов на заседании специализированного совета К 001.22.02 при Институте Экспериментальной Кардиологии КНЦ РАМН • -по адресу : Москва, ул.- 3-я Черепковская, д. 15а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Экспериментальной Кардиологии КНЦ РАМН.

Автореферат разослан мая 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических на

Й Венгерова

ошя ХАРАкштетт ршт.'

Актуальность исследования.

Взаимодействие клеток между собой, с шкклеточным матриксом и белками крови опосредуется расположенными на поверхности клеток молекулами клеточной адгезии ( МКА). Исследования, проведенные в последние годы показали, что взаимодействия этих молекул с соответствующими лигандами лежат в основе многих физиологических и патологических процессов, таких как воспаление, развитие иммунного ответа, заживление ран, остановка кровотечения, тромбогенез, атерогенез и других (H.ynes and Lander, 1992) . Центральная роль в этих процессах часто принадлежит клеткам крови и сосудистой стенки. Эндотелиальные клетки (ЭК) монослоем покрывают внутреннюю поверхность кровеносных и лимфатических сосудов и способны экспрессировать мембранные рецепторы клеточной адгезии, связывающие лиганды на поверхности лейкоцитов (McEver, 1991). Регулируемая локальная экспрессия МКА, последующее взаимодействие белых клеток крови с эндотелием и..миграция в. места . воспаления или повреждения, это начальные и, возможно, ключевые стадии в развитии клеточного ответа на действие разнообразных повреждающих факторов (Albelda i Buck, 1990; РоЬег & Cotran, 1990b). Таким образом, детальное изучение рецепторов клеточной адгезии, особенностей их экспрессии и распределения в эндотелиальных клетках, позволит сделать очередной шаг к пониманию механизмов и регуляции таких важных процессов, как воспаление, иммунный ответ, атерогенез и др. В настоящее время известны 5 основных молекул адгезии ЭК : р- и е-селектины (семейство селектинов), vcam-i, icam-i и ресам-i (суперсеызйство иммуноглобулинов). Появление селектинов, сначала Р-селектина, а

затем Е-селектина, на поверхности эндотелия приводит к замедлению тока белых клеток крови вдоль сосудистой стенки. Прочная адгезия обеспечивается взаишдействием ICAM-I и VCAM-I с интегринами на поверхности лейкоцитов ( HcEver, 1989; Bevilacqua, 1989; Rice, 1989). Еще одна молекула сеюйства иммуноглобулинов, PECAM-I, по-видимому, участвует в процессе миграции клеток крови в субэндотелий С Albelda, 1991).

Для исследования молекул адгезии ЭК и взаимодействия лейкоцитов с эндотелием в качестве стандартной модели широко используют культуру ЭК пупочной вены,. Однако, многие авторы отмечает важные функциональные отличия эндотелиальных клеток, полученных из разных сосудов (Fawcett, 1991; Hauser et al. ,1993). Эндотелиальньв клетки аорты человека представляют собой уникальный объект. Во-первых, это клетки не венозного, а артериального происхождения, во-вторых, это клетки подвергаются в организме воздействию жвдсоствого потока с высокими скоростями сдвига, в-третъих, они выделены.из сосуда, где часто возникают атеросклеротическиа поражения. Исследования ЭК аорты в культуре и in situ, проведенные в Институте экспериментальной кардиологии КШ РАМН, показали, что эти клетки характеризуется высокой гетерогенностью, обладают уникальными морфологическими и функциональными особенностями (Antonоv et al., 1Э86; Романов й Антонов, 1991). Тем не менее, исследования юлекул клеточной адгезии в этих клетках до настоящего времэни практически не проводились.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось . изучение экспрессии и распределения юлекул клеточной адгезии в культуре эндотелиальных клеток аорты человека.

В связи с этим были поставлены следующие' задачи:

1) Получить и охарактеризовать юноклональное антитело против Р-селектина - белка клеточной адгезии эндотелиальных клеток и тромбоцитов."

2) Изучить особенности распределения р-селектина в культуре эндотелиальных клеток аорты человека в .различных условиях (активация ЭК действие надкостного потока, возраст культуры).

3) Изучить базальную и стимулированную цитокинаш экспрессию индуцируемых молекул клеточной адгезии (Е-селэктина, УСАМ—2, 1САМ-1) в культуре, эндотелиальных клеток аорты человека.

4) йзучить особенности распределения молекулы клеточной адгезии РЕСАМ-1 в культуре ЭК аорты человека.

Научная новизна работы Получено и охарактеризовано новое уникальное шноклональное антитело (монАТ) СЯС81, направленное против Р-селектина, рецептора клеточной адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток. СЯС81 способно избирательно связываться с активированными. ЭК и тромбоцитами. Впервые было исследовано • распределение Р-селектина в культуре ЭК аорты человека и были выявлены клетки, - не содержащие р-селектин. Количество таких клеток резко возрастает в результате пассирования культуры эндотелия. Воздействие жидкостного потока на культивируемые ЭК аорты человека приводило к появлению р-селэктина на поверхности и увеличению числа р-селектин-отрицательных клеток.

йюрвыэ обнаружено, что индуцируемая молекула адгезии усан-1 выявляется в культуре ЭК аорты человека не только после обработки цзтокинами, но и в отсутствие стимуляции. Показано, что ЭК аорты человека способны экспрессироватъ чсам-1 под действием различных цитокинов (фактдра некроза опухолей (ТИР-альфа) и интерлейкина I

чл»>

(iL-I)), причем эта способность ослабляется в результате пассирования культуры Было выяснено, что присутствие в культуре эндотелия гладкомышечных клеток (ШО, усиливает способность ЭК

экспрессировать vcam-i в ответ на воздействие цитокинов з низкой

>

концентрации. В отличие от vcam-I, Е-селектин выявляется только на поверхности стимулированных ЭК аорты человека, как при действии tn F-альфа, так и il-l Показано, что icam-i постоянно присутствует в ЭК аорты, но уровень экспрессии возрастает под действием индукторов (как THF-альфа, так и IL —I). В культуре эндотелия аорты впервые обнаружены ЭК, неэкспрессирующие РЕСАМ-I, молекулу клеточной адгезии, ранее считавшуюся дополнительным маркером ЭК Наши данные по экспресии молекул клеточной адгезии ЭК выделенньаш из аорты человека, являются оригинальными, так как до сих пор большинство исследователей ограничиваются более доступным материалом, таким как ЭК пупочной вены. ....

Научно-практическая значимость работы Полученное в работе шнАТ CRC8I направлено против Р-селектина и способно избирательно связываться с активированными ЭК и тромбоцитами человека и животных. Таким образом, это антитело южет быгь в перспективе использовано не только в экспериментах in vitro, но и in vivo, например, при моделировании тромбоза, сопровождающегося локальной активацией тромбоцитов, или процессов, связанных с активацией эндотелия (воспаление, атеросклероз и др.)- Антитело мокет применяться как для визуализации этих процессов с помощью

радиоизотопных методов, так и для направленного транспорта

\ ' -

лекарственных препаратов.

Исследования различных МКА в культуре ЭК аорты человека

*

выявили ряд характеристик, специфических для этих" клеток, главная го которых - высокая гетерогенность экспрессии молекул адгезии. В отличие от ЭК пупочной вены, часть ЭК аорты не содержит такие МКА, как Р-селектин, а часть клеток экспрессирует индуцируемую молекулу УсАН—I в-отсутствие стимуляции. Эти результаты свидетельствуют о специфичности ЭК аорты в отношение экспрессии МКА и их отличии от ЭК, вьщеленных из других сосудов. В работе бьшо выявлено, что длительное пассирование приводит к резкому изменению экспрессии молекул адгезии ЭК аорты человека: (I) увеличивается количество Р-селектин-отрицатбльных клеток; (2) исчезают V с А м -1-го ло жите ль нш клетки; (3) снижается чувствительность клеток к стимуляции экспрессии индуцируемых МКА при действии цитокинов. Эти данные указывают на то, что адекватные исследования МКА в культуре ЭК крупных артериальных сосудов необходима проводить, используя первичную культуру или культуру 1-2 пассажей.

. Апробация работа Результаты работы бьши представлены на 3 международной конференции по атеросклерозу (1993, "Саратога, Япония), на 15 Европейском симпозиуме по исследованию сердца (1994, Копенгаген, Дания), на 10 Международном симпозиуме по атеросклерозу (1994, Монреаль, Канада). По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания материалов и методов (глава 2), изложения результатов собственных исследований (глава 3) и их обсуждения (глава 4), выводов и списка литературы из 215 наименований. В диссертации. /ЗО страниц, включая рисунков и -3

таблиц.

материалы и ыетода исследования.

Моноклональные антитела. Мышей самок линии в alb/с иммунизировали отмытыми тромбоцитами. Слияние й клонирование клеток проводок, как описано ранее ( Бшова, 1994). На первой стадии скрининга отбирали клоны-продуценты монАТ по способности к связыванию с тромбоцитами. Связывание монАТ с тромбоцитами регистрировали методом иммуноферментного анализа (Mazurov, 1991). Гибридные клетки, синтезирующие монАТ против тромбоцитов выращивали в брлшой полости мышей линии balb/c. Очистку монАТ из асцитной жидкости проводили с пошщью солевого осаждения и.хроматографии на DEАЕ-целлюлозе. Чистоту антител контролировали с помощью sds-электрофореза в полиакриламидном геле.

Тромбоциты. Обогащенную троьйоцитамя плазму ( ОТП) и отмытые тромбоциты (ОТ) получали из крови здоровых доноров, как описано ранее (Mazurov et'al'., 1991). Связывание -меченных монАТ "с тромбоцитами в суспензии исследовали, как описано ранее (Khaspe-kova et al., 1993) . Определение антигена монАТ проводили с помощькг (I) иымунопрецишггации, используя в качестве исходного материала лизат -поверхностношченых тромбоцитов, полученный после их обработки Тритоном X-IOO (Berndt, 1983) и (2) иммуко-блоттинга (Hazurov et al., 1991).

Эндотелиадьные клетки. Культура экдотелиальных клеток аорты человека бьша получена с пошщью обработки фрагментов сосуда диспазой, как описано ранее ( Романов, 1991). В некоторых экспериментах для активации ЭК использовали индукторы: тромбин (Signa, США), Il-I и THF-альфа в различных концентрациях ( Brit-

Ish Bio-technology Products Ltd, Великобритания). В присутствии

i

тромбина клетки инкубировали 15 минут, а в присутствии IL-I и TNF-альфа - 4'или 20 часов.

Моделирование кидкосткого потока. Конфлуэнтны? культуры ЭК отмывали раствором'Эрла и пассировали на покрытые желатиной покровные стекла (Corning, США). Часть стекол предварительно закрепляли каплей клея по периферии IOO-ш чапвк Петри. Клеточные культуры на стеклах помещали в ССЬ-кнкубатор и выращивали до состояния конфликтного монослоя. Для мэделирования жидкостного потока часть чашек ставили на платформу лабораторного встряхивателя-качажи (Tek-Tator V, Tekpro, США) и инкубировали 24-72 ч при 70-90 об/мин. Культура взятые- на тех жв сроках,- но выращенные з статических условиях, служили контрольными.

Совместное культивирование зндотелизльных и гладкомышечных клеток. Первичные культуры ЭК аорты взрослого человека получали и культивировали, как было описано ранее (Романов, Антонов, 1992). Культуры- гладкомышечных клеток получали, - как- описано ранее ( Бабаев и др., 1984). Конфлуэнтные культуры 1Ж отмывали раствором Эрла и пассировали на покровные стекла (Corning, США). ЭК пассировали на покрытые желатиной чашки для совместного культивирования ( Nunc, Дания) и выращивали до состояния конфлуэнтного монослоя. За 12 часов до начала эксперимента покровные стекла с ГМК пошщали в центр чашки таким образом, что контакт клеток осуществлялся через культуральную среду. Для индукции vcah-i использовали il—i в различных концентрациях, который добавляли в среду культивирования. По окончанию инкубации клетки окрашивали, как описано в разделе " Питофлкюриыетрия'.': Культуры, выращенные в тех же условиях, но

без ГМК служили контрольными.

Иммуногистохимия. Клетки эндотелия были выращены на покровных стеклах или в пластиковых планшетах. Культуры ЭК

отмывали раствором Эрла и фиксировали в течение 15 минут 3. 8%

\

параформальдегидом с добавлением 0.2% Тритона t-IOO на фэсфатном буфере Дульбекко для изучения внутриклеточных и 1% раствором параформальдегида для изучения поверхностных антигенов. Для выявления Р-селектина использовали изьоклональные антитела CRC8I в концентрации 10 мкг/мл или поликлональные кроличьи антитела против этого бежа, любезно предоставленные д-ром Е С. Берндгом (Бейкеровский институт медицинских исследований, Австралия) в концентрации 5 мкг/мл, биотиншшрованные козьи антитела против иммуноглобулинов мыши или кролика и коньюгат стрептавидин-Texas Red (Amersham, Великобритания). Для выявления фактора Виллебранда использовали поликлональные овечьи антитела против фактора Виллебранда и ослиные антитела против иммуноглобулинов овцы, -коныогированные с ,ФИЩ (Anershara, Великобритания). В ряде экспериментов использовали одновременное двойное окрашивание фактора Виллебранда и Р-селектина. Р-селектин на поверхности ЭК выявляли с помощью моноклональных антител CRC8I и набора антител для пероксидазного окрашивания белков Peroxidase standart ABC kit (Vector, США). PECAM-I, VCAM-I и Е-селектин выявляли с использованием моноклональных или поликлональньк антител, козьих биотинилированиых антител против иммуноглобулинов мыши или кролика, и набора антител Peroxidase standart ABC kit (Vector, США), без предварительной фиксации (Gamble et al., 1993). Все реагенты использовались в концентрациях, рекомендованных

изготовителем:

Питофлюориметрия. Эндотелиальные клетки выращивали в покрытых желатиной (0.1%) 12-луночных планшетах (Nunc, Дания). К клеткам добавляли контрольные антитела (невзаимодействузоцие с ЭК) или антитела против I с AM—X, VCAM-I, PECAM-I и Е-селектина, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, отмывали и добавляли среду для культивирования со вторыми антителами ( козьи антитела против иммуноглобулинов мьш в концентрации 5 мкг/мл). После о татки клетки собирали, обрабатывая 0.2 % раствором ЭДТА, и ресуспендировали в равном объеме 2% раствора свежеприготовленного парафоршльдэгида на фосфатном буфере. Клетки содержали на льду в течение нескольких часов или фиксировали. Экспрессия молекул адгезии была проанализирована на facsstar plus (Becton Dickinson, Sunnyvile, CA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЖСЕЕДОВШЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Характеристика моноклонзльного антитела CRC8I- Определение антигена мэйАТ CRC8I (1 дСГ, к)' проводили с помощью идауно-преципигации и иммуноблотинга. МонАТ CRC8I преципитирует белок с молекулярной массой 140 кДа, не изменяющий свою электрофоретиче-скузо подвижность после восстановления, что соответствует характеристикам белка р-селектнна. Этот результат был подтвержден с помощью иммуноблотинга. Антитело выявляло одну полосу с молекулярной массой 140 кДа только в невосстановленных условиях. Таким образов результаты иммунопреципитации и иммуноблотинга позволили предположить, что антигеном CRC8I является белок Р-селектин (GMP-I40), имеющий молекулярную массу 140 кДа и одинаковую электро^оретическую подвижность в невосстановленных и восстановленных условиях (Belman et аТ., 1986).

2. Исследование связывания мэноклонального антитела СЯС81 с тромбоцитами человека и животных. Связывание сяс81 с тромбоцитами исследовали, используя тромбоциты, активированные различными агонистами. Уровень связывания СНС81 с неактрвированными тромбоцитами был очень низок (500-700 молекул на тромбоцит), но в результате активации тром5оцитов различными агонистами повышался до 2000-4000 ( таблица I).

Таблица I. Связывание СЯС81 с неактивированныш и активированными тромбоцитами человека.

Условия Специфическое связывание

С1?С81 (число молекул на тромбоцит)

ОТ, (10 мкг/мл) 520

'ОТ, тромбин (I ед. /мл) 3740

ОТП, ПГЕГ (10 мкг/мл) , 360

ОТП, коллаген (20 ыкг/кл) 2390

от АДФ (20 мкЬЙ 1816

От ФМА (10 мкМ) 2780

В экспериментах использовали отмытые тромбоциты (ОТ) или о.богадр" еннув тромбоцитами плазму. (ОТП). Простагландин Е1 (ПГЕ1) добавляли в контрольные пробы для предотвращения спонтанной активации тромбоцитов.

Полученные результаты свидетельствуют, что антиген сйс81 появляется на поверхности тромбоцитов в результате их активации различными агонистами. Это свойство является характерной особенностьв Р-селектина, который в неактивированных тромбоцитах содержится в мембранах альфа-гранул, но после активации, в результате экзоцитоза гранул появляется на поверхности тромбоцитов. Количество мест связывания СЙС81 на поверхности активированных тромбоцитов согласуется с данными, полученным ранее с использованием других монАТ против Р-селектина ( НсЕуег &

Martin, 1984).

• Мы исследовали также связывание CRC8I с тромбоцитами кролика и собаки. При активации тромбоцитов экспериментальных животных тромбином были получены результату сходаьз с данными для троьзЗоцитов человека.

Способность антитела CRC8I селективно реагировать с активированными тромбоцита;® позволяет предложить его в качестве реагента для регистрации активированного состояния этих клеток. Полученное монАТ CRC8I способно избирательно связываться с активированными тромбоцитами не только человека, но и животных. Поэтому, это антитело может быть использовано не только в экспериментах in vitro, но и in vivo, например, при моделировании тромбозов.

3. Распределение Р-селектина в ЭК аорты человека и пупочной вены. Используя полученное наш монАТ CRC8I и полихлональные антитела против Р-селектина, мы исследовали распределение этого белка -в культуре ЭК' аорты- человека. Для сравнения использовали стандартную культуру ЭК пупочной вены. Внутриклеточное распределение Р-селектиЕа исследовали в фиксированных клетках, обработанных детергентом (Тритоном X-I0Q). В качестве контроля клетки одновременно окрашивали на фактор Виллебранда, маркер эндотелиальнкх клеток, содержащийся в тельцах Вейбеля-Паладе. С помощью метода двойного окрашивания было установлено, что в ЭК аорты человека Р-селектин, как и фактор Виллебранда, локализован в тельцах Вэйбеля-Паладе. Однако, культура ЭК аорты человека, в отличие от культуры ЭК пупочной вены, была гетерогенна пс содержанию-Р-селектина: не во всех клетках, содержащих фактор Виллебранда был ..обнаружен р-селектин. Нам не удалось найти

il

корреляции вежду разшром ЭК числом ядер в них и содержанием Р-селектина.

Используя метод иымунофлюоресценции, мы выяснили, что количество неокрашенных го Р-селектину клеток резко возрастает в многократно пассируемой культуре (таблица 2).чЕсли в первичной культуре и ва первом пассаже Р-селектин выявляется в 80-90% клеток, то на 6 пассаже - в 5-10%.

Таблица 2. Соотношение клеток с различной степенью внутриклеточной окраски на Р-селектин в культуре ЭК аорты человека на различных пассажах. -

Степень окраски на р-селектин Пассаж (-) (+/-) (+)

% от общего числа клеток

0 4+ 3 12+ 7 84+ 9

1 16+ 4 15+ 7 69+ П

2 19+ 10 24+ 8 67+ 10

3 21+ 9 26+ 10 53+ 12 6 64+ 9 30+ 4 6+5

Иммунофлюоресценция, микроскопия. По степени окраски клетки разделяли на неокранвнньв(-), слабо, окрашенныз (+/-) и интенсивно, положительно окрашеннье (+).

Приведены средние + ошибки среднего для 3-4 культур.

Выявление Р-селектина на поверхности ЭК проводила с помощью иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного окрашивания фиксированных клеток, необработанных Тритоном Х-100. В отсутствие стимула р-селоктнн практически не выявлялся на поверхности эндотелия. Однако активация ЭК тромбином приводила к перераспределении р-селектина и появлению его на поверхности. При подобном окрашивании выявляются поверхностно располоазенньЕ кру-•пные гранулярные.структура содержащие р-селектин, что.скорее всего указывает на экзоцитоз телец Вейбеля-Паладе. Под действием

тром5ина Р-селетин выявлялся на поверхности ограниченного числа клеток, обычно 10-20%. Такой низкий процент может быть обусловлен: во-первых, отсутствием Р-селектина в части клеток, во-вторых, различной кинетикой появления на поверхности и реинтерналгаации р-селектина (мы проводили фиксацию и последующее окрашивание только в одной временной точке - через 15 мин после добавления тромбина).

Таким образом, в работе впервые было изучено распределение Р-селектина в культуре ЭК аорты человека и показано, что уже в первичной культуре встречается в среднем до 15% клеток, очень слабо или вообще не окрашивающихся на р-селектин. При этом эти' клетки содержат фактор Виллебранда, что свидетельствует, во-первых, об их эндотелиальном происхождении и, во-вторых, о наличии в них неэкзоптированных телец Вейбеля-Паладе. Количество клеток, отрицательных по р-селектину увеличивалось по мере' пассирования ЭК аортьг и к шестому пассажу достигало* боле'ё 60%. Гетерогенность экспрессии Р-селек.тина означает, что при наличии соответствующего стимула эндотелиальные клетки обладают неодинаковыми возможностями транслоцировать этот белок на поверхность. Возможно, что часть ЭК, содержащая в тельцах Вейбеля-Паладе крайне малые количества как фактора Виллебранда , так й р-селектина, экзоцнтировала их в результате предествуицзй активации (например, в процессе выделения иди пассирования) и-не успела восстановить за счет синтеза. Однако, в других клетках фактор Виллебранда соде риале я в нормальных количествах, го практически не было р-селектина, что скорее всего говорит об нарушения синтеза р-селектина. Из наших результатов следует, что

поведение Р-селектина в ЭК необходиш изучать либо на первичной культуре, либо на культуре I пассажа эндотелиальных клеток. Нельзя исключить, что наличие жидкостной динамики, -специфичной для артериальных сосудов, присутствие гладкомышечных клеток или клеток крови, или других неизвестных в настоящее время факторов, отсутствующих при культивировании клеток, является необходимым условием полноценной экспрессии Р-селектина^ а, возможно, к других молекул, клеточной адгезии в ЭК аорты. (

4. Влияние жидкостного потока на распределение р-селектина в эндотелиальных клетках. Мы исследовали распределение р-селектина в ЭК аорты человека под действием жидкостного потока, физиологического фактора, постоянно действующего на ЭК аорты в сосуде. После 24 часов воздействия жидкостного потока клетки приобретали вытянутую веретеновидную форму и ориентировались вдоль направления потока среды При окрашивании актинового цитоскелета РЙЩ-фаллоидином были выявлены характерные изменения Р-актина. Активация ЭК жидкостным, потоком приводила не .только к морфологическим изменениям клеток, но и в значительной степени влияла на распределение?-селектина, как внутриклеточного, так и поверхностного (рис.1). Через 24-48 часов после начала воздействия жидкостного потока количество клеток, не содержащих р-селектин, увеличивалось от 20 до 50-80% с некоторыми отклонениями в культурах, полученных от разных доноров. Одновременно происходит увеличение числа поверхностно-окрашенных клеток. Это указывает" на то, что поток жидкости влияет и на процесс транслохации р-селектина из телец Вейбеля-Паладе на поверхность ЭК. Через 24 после начала воздействия гегодинаыическим потоком количество ЭК, экспрессирувдих на поверхности Р-селектин, резко возрастало и в

культурах от некоторых доноров достигало 15%.

95%

88%

27%

15% 1

2%

К"

А

Б

В

Ркс. I. Изменения в культуре ЭК аорты под действием потока жидкости..

I - культура ЭК аорты человека в статических условиях, 2 - культура ЭК под воздействием потока жидкости ( 24 часа). А - % клеток, содержащих VIII фактор/Виллебранда; Б - % клеток, содержащих Р-селектин внутри; В - % клеток, содержащих Р-селектин на поверхности. Зезде приведен % окрашнных клеток от числа просчитанных. Иммунофлшресценция, микроскопия. Представлены средние и ошибки среднего (п=4).

Таким образом, ш показали, что воздействие газодинамического потока вызывает увеличение числа клеток, не содержащих Р-селектин внутри. Можно предположить, что часть клеток перестает синтезировать Р-селектин, однако механизм этого процесса

остается не вполне ясным. Второй причиной может быть экзоцитоз телец Вейбеля-Паладе, что подтверждается данными по исследованию р-селектина на поверхности клеток.

Полученнш результаты указывают на то, что активация ЭК аорты и транслокация Р-селектина на поверхность может быть вызвана не толькб агонисташ (как тромбин или форболовьв эфиры), но и таким физическим фактором, как жидкостной поток. Известно, что р-селектин - первая шлекула адгезии, экспрессируемая ЭК при активации и способная запускать цепь, дальнейших событий - адгезию клеток крови к эндбтелиальному монослою и их миграцию в субэндотелиальное пространство (Lawrence, 1993) . Бозмсето, что именно жидкостной поток является необходимым фактором, активирующим ЭК, вызывавшим появление Р-селэктина на поверхность и обеспечивалщш взаидадействие ЭК с клетками крови.

5. Экспрессия VCAM-I ЭК аорты человека. Исследования культуры ЭК пупочной вены и гистологических препаратов, проведенные различными авторами, показали, что некоторые МКА, такие как vcam-I и Е-селектин, отсутствуют на поверхности неактивированного эндотелия, но экспрессирувгся (в результате синтеза de novo) при актизации клеток цитокинами воспаления (tnf-альфа, il-I и др.). fiiu исследовали экспрессии и распределения этих молекул в культуре ЭК аорты с помощью иммуногистохимических методов и.поточной щггсфлюориметрии. ""

Используя метод иммуиопероксидазного окрашивания, мы показали, что vcam-I экспрессируется в части ЭК аорты человека в отсутствии экзогенных индукторов. vcak-I выявлялся в 6-15% клеток 1-го пассажа, причем после очередного пассирования ЭК из той же аорты теряли способность экспрессировать vcah-I в отсутствие

индуктора. При анализе результатов цитофлуоримзтрии, нам удалось подтвердить изложенные выше результаты и также обнаружить окрашенные на усан-1 клетки в культуре ЭК аорты в отсутствие стимуляции (рис. 2а).

Интенсивность флюоресценции, каналы 0-256

Рис.2. Экспрессия усаи-1 (а). е-селектина (б). 1сан-1 (в) и ре с ан—I (г) в ЭК аорты человека. -

Представлены гистограммы: фоновой флюоресценции контрольных ЭК (контроль), нестимулирован-ных клеток (0), клеток, обработанных индуктором в течении 4 часов (4) и 20 часов (20). Для стимуляции были использованы индукторы: 11.-1 в концентрации 10 ед/мл (а), в ТИР-альфа в концентрации 100 ед/мл (б ив). Клетки были окрашены с помощью антител против исследуемых белков по стандартной изтодике (см. Материалы и Метода). Поточная цитофотхляпЕтрия.

Из работ последних лет известно, что в сосуде, в зоне

атеросклеротического поражения, даже на ранних стадиях, наблюдается экспрессия в ЭК VCAM-I (wood, 1993). Вполне вероятно, что & культуре на ранних пассажах часть 'эндотелиальных клеток аорты сохранила способность экспрессировать vcam-I, которая терялась при многократном пассировании.

Мы исследовали экспрессию VCAM-I после обработки ЭК аорты индукторами воспаления - TNF-альфа и IL-I. Для сравнения использовали ЭК пупочной вены, культивируемые в тех же условиях. В ЭК аорты I пассажа iL—I стимулирует экспрессию VCAM-I а дозе 10 ед/мл (рис. 2а). Однако после после 3 пассажа для эффективной индукции экспрессии VCAM-I требовались дозы iL—I выше 50 ед/мл. Максимум экспрессии VCAM-I, как в ЭК аорты, так и пупочной вены, прюсодится на 20 часов после добавления IL—X, хотя стимуляция была заметной и через 4 часа после воздействия индуктора (ри£. 2а).

В последние годы появилось несколько публикаций, в которых авторы описывают экспрессию молекул клеточной адгезии эндотелиал-ьными клетками различного происхождения. Чаще всего эти исследования проводились в культуре ЭК пупочной вены, в которых vcam-I и Е-селектин экспрессируюгся только в ответ на обработку цитокинами, то есть являются индуцируемыми. В некоторых работах авторы утверждают неспособность ЭК артериального происхождения экспрессировать vcak-I даже в ответ на стимуляцию цитокинами (Hauser, 1993). В нашей работе было показано, что ЭК артериального происхождения способны экспрессировать vcam-I в отсутствии индукторов и отвечают усилением экспрессии vcah-I на обработку цитокинами даже в очень низких концентрациях. Однако в результате пассирования ЭК могут теряют эти свойства. По-видишму, именно

is

этим обусловлены различия между'результатами" нашей работы и работы Hauser и соавторов (1993), использовавших культуру ЭК 520 пассажей.

6. Влияние ГМК на экспрессию усдн-1 ЭК асрты человека. Гладкомышечные клетки (ГМК) находятся в сосудистой стенке в субэндотелиальном пространстве и практически всегда присутствуют в качестве примесных клеток в первичной культуре ЭК и на первых пассажах.

Мы исследовали экспрессию vcam-I ЭК при совместном культивировани с ГМК, выделенными из того же сосуда. ЭК и ПЖ .контактировали только через культуральную среду. Как видно из таблицы 3, присутствие ГМК стимулировало как базальную, так и индуцированную экспрессию vcam-i аортальным эндотелием.

Таблица 3. Влияние гладко мыгпэчных клеток на экспрессию vcaü-I ЭК аорты человека.

концентрация в. присутствии ГШ-' ~-в. отсутствии ГЖ

IL-I _;_

% окрашенных клеток от числа просчитанных

_1773 ?Т9

2 ед/мл 22.8 9.0

10 ед/мд 33.5 П.0

20 едДш 52.1 25.0

100 ед/мл 50.3 65.0

Представлены результаты одного из трех экспериментов, метод -поточная цитофлюоримзтрия, 10 ООО ЭК аорты 2 пассажа в каждой пробе.

Очевидно эта стимуляция связана с секрецией ПЖ каких-то растворимых факторов в среду культивирования. Возможно, что уменьшение количества примесных П5К в процессе культивирования ЭК снижает концентрацию этих факторов и способность ЭХ к экспрессии усам-1, а, возможно, и других МКА. Таким образом, из нших

экспериментов следует, что ГМК могут оказывать существенное влияние на экспрессию МКА эндотелием-крупных артериальных сосудов.

7. Исследование экспрессии Е-селектина ЭК аорты человека.

В отличие от . VCAM-I, , нестимулированные ЭК аорты человека не эспрессировали-Е-селектин. Нами было показано, что только обработка цитокинами (TNF-альфа и IL-I) ведет к появлению Е-селектина на поверхности ЭК аорты. Максимум экспрессии приходится на 4 часа после добавления индуктора, а потом уровень экспрессии уменьшается (рис. 26). Эти результаты соответствуют данные полученным нами и другими исследователями в культуре ЭК пупочной вены. Таким образов нам не удалось обнаружить существенной разницы в способности экспрессировать Е-селектин между ЭК аорты и пупочной вены

8. Исследование экспрессии icam-i клетками аортального эндотелия. Используя метод поточной цитофлюориметрии, мы показали, что ЭК аорты конститутивно экспрессируюг icam-I и эта экспрессия возрастает после обработки ЭК цитокинами (рис. 2в). Индукция ICAH-I наблюдалась уже через 4 часа после добавления цитокина и возрастала к 18-20 часам. Эти результаты согласуются с данными других исследователей, полученными при исследовании ЭК различного происхождения (Hauser, 1993; Swerlick, 1993)

9.Экспрессия PECÄH-I клетками аортального эндотелия. Молекула PECAH-I выявляется в больших количествах в ЭК различных

сосудов и ее экспрессия не индуцируется при стимуляции клеток

j

цитокинами. Используя метод иммунопероксидазного окрашивания, мы •обнаружили, что .значительная часть ЭК (5-15 % в различных культурах) остается неокрашенной (при использовании как юно-,

так и поликлональных антител к РЕСАМ-1). Аналогичный результат был получен при анализе экспрессии РЕСАМ-1 с помощью метода поточной цитофлуориштряи-(ркс. 2г). Таким образом, при работе с культурой эндотелия аорты нами впервые обнаружены ЭК, не содержащие РЕСАИ-1. Наличия таких клеток в культуре ЭК аорты человека позволяет утверждать, что эту молекулу не всегда можно использовать в качестве маркера эндотелия, как это предложено вл некоторых .работах. •

ЗАЮПЯЕНИЕ.

Таким образом, наши исследования показали, что в морфологически полиморфной культуре ЭК аорты человека наблюдается гетерогенность экспрессии молекул адгезии. Было обнаружено, что экспрессия и распределение МКА изменяется не только под действием экзогенно добавленных цитокинов, но также при действии физических факторов (таких как жидкостной .поток) и в присутствии других клеток (ГМК). Можно предположить, что некоторые из этих факторов определяют особенности экспрессии этих молекул и в сосудистой стенке. Возможно, что различия ЭК го содержанию молекул клеточной адгезии коррелируют с различной способностью ЭК взаимодействовать с белыми клетками крови. В этом случае, при экстраполяции ситуации в культуре эндотелиальных клеток на реальную ситуацию в стенке сосуда, гетерогенность экспрессии МКА может отражать неоднородность различных участков сосудистого русла для инфильтрации шноцитами и лимфоцитами, и, возможно, развития зтеросклеро-тических повреждений.

у

вывода.

1. Получено и охарактеризовано моноклональное антитело СйС81, направленное против Р-селектина. СЯС81 способно избирательно связываться с активированными ЭК и тромбоцитами человека и экспериментальных животных.

2. В культуре ЭК аорты человека обнаружены клетки, не содержащие р-селектин. Количество таких клеток резко возрастает в результате пассирования культуры эндотелия.

3. Воздействие жидкостного потока на культивируемые эндотеетал-ьньв клетки аорты человека приводит к появлению Р-селактина на их поверхности и увеличению числа р-селектин - отрицательных клеток.

4. Обнаружено, что УСАМ-1-положительные клетки выявляются в культуре эндотелиальных клеток аорты человека в отсутствие стимуляции. Количество таких клеток резко уменьшается в результате пассирования культуры.

5. - Обнаружено, что андотелиальные клетки- аорты человека способны экспрессировать усам-1 под действием различных цитокинов (тнр-альйа, 11-1), причем эта способность ослабляется в результате пассирования культуры.

6. Было выяснено, что присутствие в культуре эндотелия гладко-мышечных клеток способствует усилению базальной и стимулированной цитокиаами экспрессии \fcah-L

7. Показано, что Е-селектин не выявляется на поверхности нестк-мулированных эндотелиальных клеток аорты человека. Экспрессия Е -селектина индуцируется как ТНР-аль$аь так и 11-1.

8. Показано, что 1САМ-1 постоянно экспрэссирован в эндотелиальных клетках аорты человека. Уровень экспрессии 1САМ-1 возрастает под

действием индукторов (как tnf-альфа, так ип-1).

9. В культуре эндотелия аорты человека впервые обнаружены ЭК, не

содержащие молекулу клеточной адгезии PECAM-I. •

Результаты, полученные в диссертации отражены в следующих печатных работах:

L Romanov Y. А., Ва"! yasni Kova I.V., Bystrevskaya V.B., Bviova Т. V.. Ilyinskaya O.P., Krushinsky A. V., Latsis R. V., -Soboleva Е.1., Tararak E.M. and Smirnov V.N. "Endothelial heterogeneity and intimal blood born cells : relation to human atherosclerosis." Annals New York Academy of Science, 1994, p. 12-37.

2. Smirnov V.N, Balyasnikava I.V., Bystrevskaya V. 8., Bvzova Т. V.. Ilyinskaya O.P., Krushinsky A. V., Latsis R.V., Roraanov Y.A., Soboleva Е.1., Tararak E.M. "Endothelial heterogenei ty and intimal blood born cells : relation to human atherosclerosis. "

"The Third Saratoga' International Conference dn athef-o'sclerosis, 1993, p. 25.

3. Baliasnikova I. V.'. Bvzova Т. V.. Bystrevskaya V.B., Ilyinskaya O.P., Krushinsky A.V., Popkova V.M., Romanov Yu.A., Soboleva E.L., Tararak E. H. and Smirnov V.N. "Endothel i urn, blood-born cells and intimal colony forming units in human atherogenesi s." European section meeting of EAS, 1994, pp. 327-330.

4. Вызова Т. В., Власик Т. Н., Мазуров А. Е "Ингибиро ванне агрегации тромбоцитов моноклональныыи антителами к комплексу гликопротеинов ПЬ-Ша." Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1994, МЩ стр. 402-405.

5. Baliasnikova I. V.. Bvzova Т. У.'. Bystrevskaya V.B., Ilyinskaya О.Р., Krushinsky A. V., Popkova V. M. , Roraanov Yu.A., Soboleva

E.L., Tararak E.H. and Smirnov V.N. "Endothelium, blood-born cells and intimal colony forming units in human atherogenesi s." Journal of molecular and cellular Cardiology, 1994, 26 (6), XIVI.

6. Вызова Т. В., Романов Ю. А., Власик' Т. Н., Мазуров А. В. "Взаимодействие моноклонального антитела к Р-селектину с активированными тром5оцитами и эндотелиальными клетками. Гетерогенность экспрессии Р-селектина в эндотелиальных клетках аорты человека" Биохимия, N 8, 1995 ( принято к печати).

7. В vzova Т. У.. Romanov Yu. F.f Mazurov A. V. " Distribution of cell adhesion molecules in cultured endothelial cells from human aorta" Abstract of 64th Congres of EAS, "Atherosclerosis", (принято к печати).