Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие культивируемого эндотелия аорты человека с нейтрофилами и моноцитами периферической крови: отношение к атерогенезу

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие культивируемого эндотелия аорты человека с нейтрофилами и моноцитами периферической крови: отношение к атерогенезу"

российская академия медицинских наук кардиологический научный центр

РГБ од

На правах рукописи

- 3 Ш 1594

балясникова Ир/на Вадимовна

взаимодеиствие культивируемого эндотелия аорты человека с неит.рофилами и моноцитами периферической крови: отношение к ат.ерогенезу

03.00.25. - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в отделе клеточной биологии Института Экспериментальной Кардиологии Кардиологического Научного Центра РАМН

Еаучнья руководитель: доктор медицинских наук, вед.н.сотр. Э.М. Тарарак

Официальные оппонента: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН,

профессор B.C. Репин доктор биологических наук, вед.н.сотр. Н.И. Дризе

Ведущее учреждение: Научно-йсследователъскмй Институт Морфологии человека РАМН

Защита состоится " /р...". ...... 1994 г.

- // .

в ".!.'.. час. на заседании специализированного ученого совета К 001.22.02. в Кардиологическом Научном Центре РАМН по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КНЦ РАМН

Автореферат разослан . .........1994 г.

Ученая секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Т..И. Бенг'ерова

обиая характеристика работы

Морфологические исследования зндотелиальноя выстилки сосудов человека свидетельствуют о ее существенной реорганизация в ходе тостнатального онтогенеза (Каменская, 1952, 1956; cotton et al. , 1961; Vichert et a 1-, X9S2; РеПИН И ДР., 1983). Из морфологически эднородной, состоящей из мелких одноядерных, четко ориентированных клеток, выстилка - магистральных сосуяое превращается в гетерогенную, клетки которой суяествекно различаются по площади люминальноя поверхности, числу и размеру ядер, плоидности, содержанию белка в цитоплазме (Smimov et al., 1988), кроме того появляются целые регионы или вебольшие кластеры зндотелиальных клеток (ЭК) с однотипными морфологическими признаками (Репин и др., 1983; Романов, Антонов. 1992). Имеются наблюдения, что усиление региональной неоднородности зндотелиалъной выстилки аорты человека обнаруживает хорреляцию с появлением атеросклеротических поражения в интиме. На основании этого Факта высказываются предположения о возможная роли очаговых изменения эндотелия в патогенезе атеросклероза (cotton, 1961; Antonov et al., 1986; Tokunaga et al., 1989).

Известно, что эндотелий в нормальных Физиологических условиях служит барьером для беспрепятственного проникновения клеток крови в подлежащие ткани, а в случае патологии обеспечивает их избирательную инфильтрацию в очаги поражения (Figdor, van Kooyk, 1992; Smith, 1992; Vadas et al. # 1992). Однако, до Еастояиего времени не было предпринято попыток связать региональные изменения эндотелиальной выстилки сосудов человека с возможностью очаговых нарушений взаимодействия эндотелия с пиркуяируюиими клетками крови. В настоящей работе мы исходили из предпосылки, что некоторые кластеры клеток измененного зздотелиа аорта, возникающие в постнатальном онтогенезе, могут слухигь очагами избирательной адгезии и трансэндотелиальноя миграция клеток крови, тем самым способствуя возникновепюэ лохалышх скопления лейкоцитов, нередко обнаруживаема в интиме. Так, например, на долзшидных и ранних стадиях атерогенеза в vhtkiss аорты

выявляются локальные инфильтраты различных клеток гематогенного происхождения; лимфоцитов разных субпопуляций, моноцитов-макроФагов. граиугоцитов,.плазматических, тучных. Данные о роли этих клеток в атерогеиезе неоднозначны, однако их участие в Формировании атеросклеротичесхих поражений в той или иной мере доказано (Stary, 1983; Jonasson et al,, 1986; Emeson et al., 1988; Соболева, 1989: Ross, 1993).

Иеханизи взаимодействия клеток крови с зндотелиальнои выстилкой сосудов привлекает значительное внимание исследователей в связи с важнеяией ролью эндотелия в острых и хронических воспалительных процессах (Figdor, van Xooylc, 1992; Smith,1992; vadas et al.; 1992). Основная масса этих исследования проводится на культурах эндотелия сосудов животных или пупочной веки человека, популяции которых характеризуются Оенотипичесхлм однообразием клеток, что ограничивает их использование при изучении клеточных механизмов атерогенеза. По этой причине в настоящей работе в качестве адекватной модели исследования взаимодействия эндотелия и лейкоцитов периферической крови использована полиморфная культура ЭК аорты взрослого человека.

Цель И залачя ■ ксслеттования. -

Целью настоящей работы явилось изучение характера взаимодействие 2л различного Фенотипа культивируемого полиморфного эндотелия аортм взрослого человека с неятрофилами и моноцитами периферической крови. В связи с зтим были поставлены следующие задачи:

1. Иссзшдовать особенности взаимодействия полиморфного эндотелия аорты взрослого человека и морфологически однородного эндотелия пупочкой вены человека с неятрофилами и моноцитами периферическая крови.

2. Изучить взаимодействие эндотелия с неятрофилами и моноцитами в условиях первичного клонирования ЭК аорты и пупочной вены чеховека, а также длительного субхуяьтивирования ЭК пупочной вели человека.

3. Изучить характер экспрессии молекул адгезии gmp-140 и ICAM-1, опосредующих взаимодействие эндотелия с неятрофилами и

моноцитами. ЭК первичной культуры аорты и пупочноя вены челоёека.

4. Изучить изменение характера экспрессии gmp-ho и icam-i ЭК аорты к пупочной вены человека в процессе Формирования конф-луентного монослоя и в процессе длительного субкультотирования.

5. Изучить зависимость экспрессии gmp-140 и icam-i от пролиферативного поведения ЭК аорги и пупочноя вены человека в культуре.

Научная новизна. При исследовании взаимодействия морфологически неоднородного эндотелия аорты взрослого человека и "стареющего" эндотелия пупочной вены человека с лейкоцитами периферической крови in vitro впервые установлено, что в полиморФних культурах эндотелия часть ЭК увеличенного размера, предположительно полиплоидних, обладает в неактивированком состоянии высокоадгезивными свойствами в отношении нейтрофилов и моноцитов.

Установленоно, что культивируемый эндотелия аорты взрослого человека и "стареюяего" эндотелия пупочноя вена характеризуется неоднородной экспрессией молекул адгезии gmp-140 и icam-i для лейкоцитов, разними морфологическими типами ЭК.

Показано, что преимущественная миграция лейкоцитов под ЭК увеличенного размера из морфологически полиморфных культур аорты взрослого человека и "стареющего" эндотелия пупочной вены человека обусловлена базальной экспрессией молекулы icam-i этими ЭК.

Впервые показано, что экспрессия gmp-i-»o и icam-i зависит от пролиферативного поведения ЭК in vitro.

изучение особенностей взаимодействия клеток крови и эндотелия продемонстрировало преимущество использования культуры ЭК аорты взрослого человека для изучении клеточных механизмов атерогенеза у человека. Выявленные особенности взаимодействия негггрофилов и моноцитов с полиморфным эндотелием аорты человека in vitro и "стареющим" эндотелием пупочной вены человеха когут найти применение в нальнейшкк исследованиях механизмов атерогенеза, а также при моделировании действия медиаторов воспаления,

атерогешшс Оакторов к антиатерогенных препаратов на эндотелий и его взаимодействие с лейкоцитами периферической крови.

Существование одно- и многоядерных гигантских ЭК в культурах задотелия аорты человека, наиболее активно взаимодевствующих с лейкоцитами периферической крови, расширяет представления о функциональной гетерогенности морфологически неоднородного эндотелия аорты взрослого человека и предполагает их возмогное участие в возникновении локальных субэндотелиальных скопления хеакоцитов, предшествующих развитию атеросклеротических поражения.

Аггообапия сзботн. Диссертация апробирована на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии КНД РАМН ( Москва, 199-4). Материалы работы были доложены на V Всероссийской конференция по патологии клетки (Москва,1993), на 3-ей Международной конференции по атеросклерозу (Саратога, Япония, 1993), на 62-ом конгрессе Европейского атеросклеротического общества (Иерусалим. Израиль, 1993) , на 2-ом Международном симпозиуме по заболеванию« коронарных артерий (Бейинг, Китай, 1993). Материала диссертации изложены в 8 публикациях.

Структура ' работы. Рукопись диссертации состоит из

разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы" и "Список литературы". Обший обьем работы .составляет ... страниц машинописного текста, включая .. рисунков, 6 таблиц и список цитируемой литературы из___названия.

МАТЕРИАЛЫ И ИЕГОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Аутпгтг-тгттн« матерная: использовали грудные отделы аорт человека, полученные не' позднее 3 часов после смерти лиц, погибших в результате различных причин в возрасте от 30 до 60 лет. Кроме того, использовали вены пуповины человека.

Культура 2к- эк из аорты человека изолировали по методу Антонова с сотр. (1984). Отмытую аорту помещали в 0,15* раствор диспаэы в

среде 199 и инкубировали 1.5-2 часа при 37°С. Полученную суспензию клеток отмывали, ресуспендировали в среде 199, содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки, переносили клетки в предварительно покрытые 0,2* раствором желатина чашки Петри. В среду культивирования добавляли Фактор роста эк (200 мкг/мл), выделенный иэ мозга человека, и гепарин (100 мкг/мл) (Sadovniko-va et al, 1990). Первичную культуру ЭК пупочной вены получали по методу Джимброне с соавт. (1976) в модификации, описанной Антоновым с соавт. (1981).

Для получения дискретных клонов ЭК высевали с плотностью 52

10 клеток на см и культивировали 14-1& дней s условиях, описаннных выше.

Идентификация ЭК 3 хулътупе. Полученные культуры ЭК аорты и пупочной вены человека тестировали на наличие основная маркеров: антигемофилического viii фактора с помопью метода июсунофлуорес-ценциии и ангиотензин-превращаюшего фермента с гажошью ПАП-метода (с 4-5 кратным "усилением"). Чистота подугяции ЭК в первичной культуре составляла 94 - 98

Способность культур формировать конфлуентянз монослоя определяли с помощью импрегнации межклеточных гранвц нитратом серебра по методу Запд с соавт. (1982).

Фрактгионттоопаеттр лейешшюз крови. Для получения лолззюрфноядер-ной и мононуклеарной фракций лейкоцитов периферической крови гепариниэированную кровь здоровых доноров подвергали градиентному центрифугированию на фкколя-гипак по стандартноа. - методике (Boyume et al., 1969). Для получения фракции, обогащенной моноцитами, субпопудяцио мононуклеарных лейкоцитов после градиентного центрифугирования подвергали злптриапия в камере Сэндер-сона с помощью -злютриаторного ротора "Beckman JE6B" по методу Стевенсона (1984). Жизнеспособность клеток определяли по включению трипанового- синего. Чистоту' популяция моноцитов определяли с использованием МоАТ., распознавали CD14.

HccjffiiWRamg астгпзик лейюпитав к ЗК*. Конфлуентную культуру Ж отмывали дважды раствором Хенхса, добавляли 2 млн лейкоцитов/мл среды 199 ж инкубировали 30 мин при 37° С (5» со2). Неадгезирова-вшие лейковюты удаляли, культуру фиксировали 2,5* раствором глутаральдвпща, границы клеток импрегнировали нитратом серебра. Препараты огсавивали гематоксилин-эозином. Количественный анализ данных проводили с покощьо полуавтоматического анализатора изображения ЮР-3: на проекциях фотоизображений случайных полей зрения этапе лиально го монослоя определялили площадь каждой отдельно взатов ЭК (п=Ю00) и число взаимодействующих с ней нейтрофилов. Для статистической обработки данных использовали корреляциоваай анализ.

Для исследования участия молекулы адгезии icam-i в трансэндотеягальной миграции нейтрофилов монослой ЭК отмывали раствором Хенкса и инкубировали 5-10 минут при 37°С с 10® ней-трофилов/mi среды 199. После удаления неадгезиривавших нейтро-Филов контрольные HoAT: 1С5 ( любезно предоставлены Т..Н.Власик, ИЭК КНЦ РАН2) и 10F3, распознающие icam-i (любезно предоставлены О.К) Принцевой, ИЭК КНЦ РАМН), добавляли к эндотелиальному монослою в концентрации 50 мкг/мл на 20 минут при 37° С. Б коше инкубации жяетки отмывали буфером и фиксировали метанолом. Препараты окргиивали гематоксилин-эозином, обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Процент нейтрофилов, мигрирующих под монослоя ЭК в присутствии контрольных и опытных МоАТ., определяли, используя критерий описанный ранее (Beesley et ai., 1979). Ддя статистической обработки данных использовали t-критерий Стъодеыта.

Имнунпшгг»цничи.,кве выявление экспрессии молекул адгезии.. опчостелушЕ взаимодействие Э1 с лейгопитани г icam-i ц gmp-1*о. ЭК аорты и пупочной вены человека проводили с помощью окрашивания НоАТ: - 10f3, распознающими icam-i, и s12, распознающий GHP-140 (любезно предоставлены Dr. R. P. McEver. University of Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma, USA). Для визуализации связанных антител использовали стандартный метод пероксидаза-антипероксидаза (ПАП-метод; Полак, Ван Норден, 1987)

Контрольные препараты не обрабатывали первыми антителами или заменяли их неспецифическими иммуноглобулинами g мыле.

Имнуноиктокинкческое определение шиа тттунп^рптоуюших ЭК проводили путем выявления ядерного антигена пршгиферируюших

клеток, ОДНОГО ИЗ ЦИХЛ1ШОВ - pcna (Hall et al., 1990: Waseem et al., 1990). Культуру ЭК фиксировали при -20°С метановом в течение 5 минут, отмывали раствором Хенкса и инкубировали в течение 45 минут с МоАТ. Рею, распознающими pcna (разведение 1:1000) при комнатной температуре. Визуализацию связанных антитее проводили с помощью биотинилированных IgS и Vectastain ABC Kit (Sector Laboratories, usa) или ПАБ-метода. Контрольные препараты не обрабатывали первыми антителами или заменяли их неагепифическими иммуноглобулинами о мши .

В некоторых экспериментах проводили одновременное окрашивание ядерных и цитоплазматических антигенов МоАТ., распознавании pcna, и МоАТ., распознающими gmp-140 или icam-i, . с помощью биотинилированных IgG и Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories, usa) или ПАП-метода.

Выявление щща пгюлийррируотпга 2S £ помпвгыо ^-тимшгиновоЯ патгкоаитогоасьэтг; меченый предшественник вводили в культуру в момент смены среды из расчета 1 мкКи/мл среды за 48 часов до Фиксации препарата. Лля выявления пула клеток, находящихся в s-фазе- клеточного цикла", 3Н-тимидин вводили- импульсно за 30 минут до фиксации. В зависимости от задачи зксперисента часть препаратов окрашивали ' МоАТ., выявляющими pcna ют молекулы адгезии с помощью указанных выше методов. После обезвоживания препараты покрывали ядерной фотоэмульсией типа "М" (НИИХИМФ0Т0) и экспонировали в течение 3 суток при +4°С. После -стандартной Фотообработки препараты заключали в канадский бальзам. В некоторых случаях для выявления немеченных ядер препараты докрашивали гематоксилином. Подсчитывали меченые ядра на 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения.

результаты и обсуждение.

йздимсщрясхдар. морфологически однородного знгтотеякя пуггрянрй аеыы и аашл .человека £ нейтоодидами и моноцитами певишепичесгой ы2йш1. Морфологический анализ характера взаимодействия неятрофи-лов и монодапов с эндотелием на примере хорошо изученной однородной популяши ЭК пупочной вены человека (Pawiowsici et ai., 1985) показал, что лейкоциты слабо и однообразно взаимодействуют с интактной популяцией таких ЭК. В зависимости от эксперимента на одну ЭК кпнослоя приходилось соответственно 0,3 - 0,9 нейтро-Филов или 2,4 - 3.6 моноцитов.

Важно отметить, что аналогичные результаты были получены в экспериментах по исследованию адгезивных способностей ЭК морфологически однородного монослоя эндотелия аорты человека молодого возраста.

ЙПЗИЮЛРЯГТТТГГ ДО ДИМОРФНОГО. эндотелия шшхы взмсдогя зеловека £ •веятроатвии и моноцитами - периферической тонн. Морфологическое исследование характера взаимодействия нейтрофилов и моноцитов с полиморфным эндотелием ранних пассажей (0-3) из аорт людя среднего и пожилого возраста позволило выявить некоторые гзрактерные • особенности этого взаимодействия. Наблюдения показали, что уже в течение первых 2-5 минут лейкоциты связываются с поверхностью не всех, а только некоторых, преимущественно крупных и гигантских ЭК. При этом взаимодействие лейкоцитов с эндотелием сопровождалось характерной динамикой, неоднократно описанной многими авторами (см. Smith, 1992): в момент адгезии лейкоциты имели вид мелких плотных шарообразных клеток, в последующие 5-15 минут они приобретли вытянутую форму и перемеиашись к границам этих же ЭК, затем мигрировали" в субэндотелиаяьное пространство и распластывались в проекции их эндоплазмы. Миграция завершалась, как правило за 30 минут. Следует отметить, что в течение этого времени практически все лейкоциты, адгезировавпие на крупных ЭК, завершали миграцию. В го же время взаимодействие лейкоцитов с мелкими ЭК', как правило, ограничивалось только адгезией, т.к. на протяжении 1-2

s

часов наблюдения лейкоциты обычно продолжали оставаться на их поверхности и не мигрировали.

Количественный анализ взаимодействия, лейкоцитов с ЭК различного размера провели для трех отдельных культур 2-го и 3-го пассажей. Лля удобства интерпретации результатов адгезии популяции ЭК условно разделяли по плошади клеток на три субпопуляции: I- мелкие. И- средние, III- крупные и гигантские клетки. Результаты одного из экспериментов представлены на рис. 1 и табл.1.

плляш аклотклкллымх клеток.

плоолдь »щртачгиьнит гляпж, мЛм

Рис.1. Зависимость адгезивных свойств культивируемых ЗК аорты от их плоюади. А - гистограмма распределения ЗК по площади. Б - зависимость степени адгезии неятрофилов от плояади ЭК.

Табл. 1. Залюоюсть адгезивных свойств ЭК от их площади. (Анализ данных морфометрии).

вся популяция ЭК

Субпо Доля ЗН Число Нф на

пуляиии ОТ ВСЕЙ------------

ЭК популж одну- ед.пло-

ляция.% ЭК щадд:

10 ню

мкм2

I 93.7

II 3.5

III 2.8 сумма 100.0

0-5+0.04 3.9+0.6 46.4+9.8

адгезирушие ЭК

Доля ЭК Число НФ на

от (#),* ---------------

одну ед.пло-ЭК щади.. 10 мккг

2.5+5.2 6.3+5.8 11.2+7.6

23.8 82.8 82.1 27.4

2.0+ 0.1 4.7+ 0.6 56.4+10.9

10.3+5.9 0.46 7.6+5.6 -0.02, 13.6+6.0 0.86

I-IH - субззпуяяции клеток; размах величин площадей :

3 5 3 3 2

I - ЗОО - 5x10 - МКМ ; II - 5x10 -10x10 мкм ;

III- IOJCIO3-iooxio3 мхм2; г - коэффициент корреляции между площадью ЭК и числом взаи-

модействующих с ними нейтрофилов; *-р< 0.05 Данные представлены как среднее значение + стандартная ошибка.

Как слеетет из приведенных данных, адгезирующие клетки составили охаю 30 * от числа всех клеток популяции и при этом занимали более 50% площади культивируемого монослоя. Из числа неадгезируюют ЭК (около 70«) подавляющее большинство составляли мелкие однсздерные клетхи (более 85*). Средняя площадь адгезирующей клетки приблизительно в 4 раза превышала площадь неадгезирующеЕ ЭК (табл.2). Прямая корреляционная зависимость между площадио ЭК и количеством провзаимодействовавших нейтрофилов наблюдалась лишь в популяции крупных и гигантских одно- и многоядерных клеток (г=о,8б; табл. 1, рис.1Б). Несмотря на относительно небольшое содержание (3-7Х) эти клетки занимали до 35-40% плавали монослоя, . а некоторые из них могли взаимодействовать с десятками и■даже сотнями нейтрофилов ("гипер-адгезивнне" 32).

Табл. 2. Сравнение средних плопадея адгеэируиаих и неадгезкруших

эндотелиалъных клеток.

__ -

номер средние площади ЭК, мкм

опыта

взаимодействующих не взаимодействующих соотношение с неатрофилами с нейтрофилами пгошадей

1. 10369.3+1155.7 2524.9+81.4 4.1

2. 5618.4+502.9 1610.6+43.0 3.5

3. 5637.9± 789.7 1431.0+32.7 3.9

Таким образом, исследование взаимодействия неактивированного полиморфного эндотелия аорты взрослого человека с нейтрофилами и моноцитами периферической крови показало, что морфологическая неоднородность эндотелия сопровождается его функциональной гетерогенностью, выражающейся, в частности, в неодинаковых способностях ЭК различного фенотипа к спонтанноа адгезии лейкоцитов. Часть наиболее крупных ЭК проявляет гиперадгезивные свойства. Последнее наблюдение открывает перспективы для дальнейшего изучения возможной преимущественной трансзадотелиаль-ноа миграции лейкоцитов через кластеры гигантских ЭК аорты. Наличие такой возможности косвенно подтверждается также нашими наблюдениями, которые были сделаны на тотальных препаратах аорт без визуальных признаков атеросклеротических изменений и с ранними поражениями (возраст 25 - 53 года). На таких препаратах (п=21; импрегнация границ ЭК нитратом серебра и окраска ядер пропидий иодидом) скопления лейкоцитов в интиме нередко обнаруживаются преимущественно под кластерами гигантских ЭК. При этом скопления лейкоцитов четко вписываются в пределы границ каждой гигантской ЭК. Мы полагаем, что подобное взаимное расположение клеток относительно друг друга, по-видгаяшу, носит неслучайный характер и может быть обусловлено, -в частности, избирательной трансэндотелиальной миграцией лейкоцитоз в интиму в области расположения гигантских клеток.

. ВзаИМОДейСТВИЙ ■ НЕаГЕШЁШШЛ Я КОНШШШВ £ кляттгест хплпнкя эадот.едня ашпы а шпозиса вены н £ ляихалыю хулыинипуешш конослоем 2К пупоччоя а£ВН. Для выяснения вопроса о причинах

появления ЭК. обладающих гиперадгезивными свойствами в интактном монослое эндотелия мы использовали два методичесхих подхода:

1) культивирование ЭК аорты и пупочной вены с низкой ПЛОТНОСТЬЮ посадки ( Rosen et al., 1981; Thornton et al.. 1983);

2) длительное субкультизирование ЭК для получения "стареющей" клеточной популншш ( Johnson et al., 1992! . В обоих случаях культивирован»« можно наблюдать явление "репликативного старения" клеток, в процессе которого происходит постепенное снижение митогичесхой активности клеток с переходом популяции на новый способ репарации - путем полиплоидизации все большего числа клетох, вследствие чего происходит значительное увеличение обьема и плзщадм самих клеток и их ядер ( Mitsui and Schneider, 1976; Rosen et al-, 1981). Этот процесс за хоротхое время как бы воспроизводит in vitro процесс онтогистогенеза и сопрвождающие его Фенотипические изменения клеток, характерные для медленно обновляющихся тканей in vivo (Epstein, 1966; Heyflick, 1976; Бродский, Урызаева, 1981).

При культивировании- с низкой плотностью посадхи ЭК аорты первого пассата к ЭК пупочной векн разных пассажей отдельные клетки 'формировали дискретные колонии. Результат учитывали на 14-16 сутки.

Исходя из морфологических и размерных особеннстей колония

мы выделили сред' них 3 основных типа. Первый тип - гигантские

колонии, состояние из очень большого числа ( 1- 10 тыс. и более)

3 2

мелких клетох {средний размер клетки 1,8x10 мкм ). В центре

3

таких колоний располагаются наиболее мелкие (до 0,25x10 мкм )

плотно упакованные одноядерные ЭК , ближе к периферии - клетки

увеличенного размера, а по краю колония - гигантские одно- и

двуядернье ЭК. Среднего- размера колонии ( 100-1000 клеток)

включает наряду с «едкими одноядерндаи, различное количество

3 2

больоих и гигантских ( 10x10 мкм ) одно- и многоядерных клеток, расположенных хаотически относительно центра колонии. Малого размера колонии ( 50-100 клеток) состоят преимущественно из крупных и гигантских (10-20Х103 мкм2 ) клеток.

Морфологический анализ клеточного состава индивидуальных колония показал, что in. vitro в таких колониях формируются

клетки, значительно различающиеся по фенотипу, что характерно для зндотелиального монослоя in vivo. Последнее дает возможность предполагать, что морфологически . разнообразные типы ЭК представляют собой единую клеточную линии, на разных этапах которой Фенотип ЭК меняется от мелких одноядерных до гигантских с одним очень крупным ядром ( предположительно полиплоидных, т.к. увеличение размеров ядра и цитоплазмы коррелирует с повышением пяоидиости; Mitsui and Schneider, 1976) ИЛИ многоядерных С 2 - 4-мя ядрами.

При добавлении нейтрофилов или моноцитов в культуру- с колониями эндотелия лейкоциты адгезировали только к некоторым ЭК увеличенного размера. Так, в гигантских колониях они адгезировали только к некоторым очень крупным ЭК, расположенным по периферии колония, и составляли весьма незначительный процент (о, 1-2.ояг) от числа всех клеток колонии. В этих колониях они относились к генерациям клеток, которые прошли наибольшее количество деления (10-14) от момента посадки, т.е. претерпели наиболее выраженное "реплихативное ' старение" и превратились в гигантские (полиплоидные, судя по размеру ядра) клетки. Мелкие клетки центральной части таких колоний не связывали лейкоциты. В средних и, особенно, мелких колониях с высоким содержанием гигантских клеток доля' адгезирующих ЭК возрастала приблизительно до 5-so %. Они располагались в таких колониях хаотически, но в более крупных из них -с преимущественной локализацией по периферии.

В условиях длительного субкультивирования ЭК пупочной вены (до 10 пассажа) мы наблюдали значительное усиление гетерогенности зндотелиального монослоя, что делало его более похожим на аортальный: увеличивалась вариабельность клеток - по размерам, числу и размеру ядер (Johnson et al., 1992). В таких стареющих культурах ЭК пупочной вены, так же как и в культурах ЭК аорты, часть клеток увеличенного размера связывала значительное число моноцитов или нейтрофилов. Полученные нами данные согласуются с описанным ранее Фактом усиления адгезии моноцитов к стареющему эндотелию пупочной вены 10-11 пассажа (Molenaar et al-,1989).

Таким образом, результаты экспериментов по клонированию и длительному субкулъгивированию ЭК показывают, что способность

интенсивно адгезировать лейкоциты приобретается частью наиболее крупных клеток, возникающих в процессе "репликативного старения-эндотелия.

ИмМУНОНКТОКИШПетм исследование яксггоегрги сир-но д icam-i ЭК ашгш И пупочной вены в -хонФлуентвду к^ноглор к б дйешсшых голониях-гцонау.' Известно," что ■избирательность взаимодействия эндотелия с нейтрофилами и моноцитами, циркулирующими в крови, обеспечивают такие молекулы адгезии как icam-i и gmp-140 (Harlan et al., 1992). icam-i постоянно экспрессируется на плазматической мембране эндотелия сосудов всех типов и уровень его экспрессии модулируется цитокинами. gmp-140 локализуется в цитоплазматических тельцах Бейбеля-Паладе и экспрессируется на поверхности плазмалеммы активированных ЭК (Harlan et al., 1992,-Figdor, van Kooyk, 1992). В настоящее время в связи с изучением важной роли клеток крови в формировании атероскяеротических поражений, значительное внимание уделяется исследованию динамики экспрессии молекул адгезии ЭК для лейкоцитов в процессе • атерог-енеза. В частности, показано, что роль icam-i может быть определяющей в миграции лейкоцитов в интиму на ранних стадиях атерогенеза {Poston et al., 1992; van der Wal et al., 1992).

В данной части исследования мы поставили перед собой задачу ■ выявить с помоиью ПАВ-метода особенности характера окрашивания гетерогенного конфлуентного монослоя первичной культуры и ранних пассажей ЭК аорты МоАТ.: 10F3, распознающими icam-i и МоАТ S12 - соответственно gmp-140 . Нам удалось выявить сходный гетерогенный характер окрашивания ЭК МоАТ. к обеим молекулам адгезии: наиболее мелкие одноядерные клетки оставались ПАП-отрицательньми или окрашивались слабо { 5-20 я: всех ЭК); по мере увеличения плошали клеток среди ■'них возрастала доля ПАП-положительных клеток, а также интенсивность их окрашивания. Наши данные о неоднородном характере экспрессии молекул адгезии культивируемыми ЭК согласуются с наблюдениями других авторов (Smith at al., 1988,-Varani et al. i 1992;-Kaiser et al., 1332).

При продолжительном субкультивировании эндотелия пупочной вены (5-10-го пассажа) параллельно с усилением клеточного

полиморфизма неоднородность окрашивания становилась более выраженной: появлялись клетки увеличенного размера интенсивно зкспрессируюшие icam-i или gmp-140 на фоне основной масса мелких клеток, которые не экспрессировали или экспрессировали слабо эти молекулы.

Охраиивание ЭК аорты и пупочной вены в колониях позволило показать, что ПАП-положительные клетки - это также некоторые клетки увеличенного размера, располагающиеся чаще по периферии гигантских колония, а так же часть крупных клеток средних и малых колония. Мелкие клетки были в основном ПАЛ-отрицательннми.

Важно отметить, что окрашивание препаратов после взаимодействия нейтрофилов с эндотелием аорты и пупочной вены при различных способах культивирования выявило совпадение характера окрашивания ЭК МоАТ., распознавшими icam-i и характера распределения лейхоцитов я монослое, связанных с ЭК. Другими словами, нейтрофшш предпочтительно взаимодействовали с клетками, интенсивно экспрессируюяими icam-i.

Влияние 'НаДЗ^дашшагатог icam-i на нигозтто нейтрофшшв под • тргюгркянй" - эндотелия ■ ашшг и &EL_ Известно, что в - миграции нейтрофилов и лимфоцитов под ЭК принимает участие молекула адгезии icam-i (Butcher, 1991). в условиях наших экспериментов нейтрофшш и моноциты адгезировали к эндотелиаяьным клеткам-мишеням и мигрировали под них. Мы предположили, что эта миграция может быть обусловлена участием молекулы адгезии icam-i, которая, как мы наблюдали, наиболее интенсивно зкспрессируется ЭК увеличенного размера в пассируемой культуре аорты человека и "стареющего" пупочного эндотелия.

Для подтверждения этого предположения были выполнены эксперименты на гетерогенной культуре ЭК пупочной вены 8-го и 10-го пассажа ( п=3) и ЭК аорты 1 пассажа (п=3). Результаты показали, что HoAT. 10F3 ингибировали миграцию нейтрофилов под ЭК на 84,6 и 88,ох соответственно (р< 0,05). Это позволяет предположить, что icam-i обеспечивает миграцию нейтрофилов под гигантские ЭК неакгивированного эндотелия аорты к пупочной' вены.

Таким образом, полученные нами данные относительно характера

экспрессии молекулы адгезии icam-i ЭК различного Фенотипа и участия этой молекулы в миграции нейрофилов in vitro, согласуются с нашим предположением о возможности преимущественной миграции лейкоцитов в интиму в области расположения гигантских ЭК.

Кккунодктокккичестое исследование изменения кадактера элпше.сска

icam-i j£ gmp-140 в дррдессе нормирования конйнгуентного нонрсдря и бдительного субгультипиту^вания 2S- 'Следующей задачей, возникшей на основе анализа полученных данных, стало выяснение вопроса: почему определенная часть ЭК, в том числе некоторые гигантские, в условиях первичной культуры и, особенно, при субкультивировании не экспрессируют или экспрессируют на очень низком уровне молекулы адгезии, в то время как это свойство является специфическим признаком дефинитивного эндотелия.

Характер изменения экспрессии. молекул адгезии ЭК при Формировании конфлуентного монослоя исследовали на модели первичной культуры эндотелия аорты и пупочной вены 0-2-го пассажей. Результаты исследования, проведенные на культуре ЭК пупочной вены, приведены на рис. 2.

время культивировании ( сутки )

Рис.2. Изменение доли 1сам-1 и шр-ыо - положительных ЭК пупочной вены в процессе формирования конфлуентного монослоя в

первичной ' культуре и на ранних пассажах. Окрашивание МоАТ: югз, распознающими 1СЛМ-: и 512, распознающими смр-140, с помощью ПАП-метода.

1- 0 пассаж; 3- 1 пассаж;

2- 2 пассаж; 4- 0 пассаж.

Графические данные показывают, что уже на ранних пассажах, в том числе в первичной культуре ЭК по мере достижения ею конфлу-ентного состояния наблюдается постепенное снижение доли клеток, ЗКСПРеССИРУЮШИХ 1САМ-1 и СМР-140.

При длительном субкультивировании ЭК пупочной вены ( от 0 до 8 пассажа) мы наблюдали прогрессивное снижение доли Хсам-положительных клеток, сопровождающееся ростом доли юам-отрицательных клеток (рис. 3). Исследование изменения экспрессии емр-140 в процессе длительного субкультивирования ЭК пупочной вены выявило аналогичную зависимость (рис. А).

О пассаж 1 пассаж 5 пассаж а пассаж

Рис.3. Изменение соотношения числа ПАЛ - положительных и ПАП -отрицательных клеток "в хонфлуентноя культуре ЭК пупочной вены при длительном субкультивировании. Окрашивание НоАТ. югз, распознающими тсам-1 с помощью ПАП - метода. ПАП - реакция: ЁШ- отрицательная (-);

г—ч - положительная (+);

ЕЭ - сильно положительная (++).

Этот результат ■согласуется с нашими данными, полученными при первичном клонировании ЭК аорты и пупочной вены: значительная часть ЭК, возникших клоногеннык путем, то есть в результате многократного деления потомков одной клетки не экспрессировала icam-j и gmp-140. На основе всех полученных данных можно заключить, что культивирование ЭК in vitro, сопровождающееся обновлением состава клеточной популяции, приводит "к • снижению' уровня экспрессии молекул адгезии клетками эндотелиального монослоя. ' •

ЗЗШКГИМПСТЬ' экспрессии--■иолекул 'адгезии -и атггргчоттнх .ОТЗ.ЯСТБ ' СХ тгоо лийстативнстгт)-' ••'• повелянкя—-ЭК - -в ■ культурй.- В-"данной "":части исследования, опираясь на подученные выше данные о снижении доли ЭК, экспрессируюиих молекулы адгезии, в процессе культивирования. мы провели исследование влияния пролиферативного поведения ЭК in vitro • на уровень экспрессии этих белков внутри цитоплазмы (gmp-140) или на поверхности (Icam-i) клеток. При этом мы опирались "на известный фахг, • что -дифференцированные клетки (например1, зндоте.ткаяьные) ,""не могут обеспечивать 'одновременное протекание синтезов, направленных на собственное размножение (аутосинтетические процессы),-и синтезов, обеспечивающих "ввпол-" Нение их ткавеспецифических функций (гетеросинтетические процессы) (Watt, 19S7; Edeiman, 1988). К таким тканеспецифическим функциям эндотелия можно отнести, например, синтез молекул адгезии, обеспечивающих гетеротипические межклеточные взаимодействия по типу эндотелий - клетки крови.

Созвнетта "возможностей -дата 'методов исследования продиФеоагивного ШВ£Д£НИЯ-- ЭК S ШШШ- " Пролиферативный статус клеток исследовали, используя два разных, взаимодополняющих метода: а) метод 3В-тимидиновий радиоавтографии , который позволяет метить' в" популяции только- те клетки, которые в момент введения Зн-тимидина синтезируют "ДНК, т.е. находятся в s-фазе клеточного цикла {Епифанова и др., 1977); метод позволяет проводить количественный учет числа клеток, реплицирующих ДНК; б) •'кетод-иммунаци i охимлчесгого выявления" •пула иролшберирующих - клеток -с"

помошью МоАТ. рею, распознающих рспа - ядерный антиген пролиферируюших хлеток. Этот белок относится к группе циклинов молекул, осуществляющих регуляцию клеточного цикла у эукариотичесхих организмов. Наличие внутриклеточного пула этого белка, является качественным признаком, позволяющим иммуноцитохимически выявлять, в различных популяциях все клетки, находящиеся в клеточном цикле, в любой его фазе (Hall et ai., 1990; waseem et al., 1990). Одновременное сочетание обоих методов позволяет получать более объективную картину пролиферативного поведения клеток в популяции.

Мы провели сравнение процентного содержания клеток, меченных 3Н-тимидином и рсяа-положительных клеток, в процессе Формирования- конфяуентного монослоя. Результаты одного из экспериментов по сравнительному исследованию двух методов приведены в табя.З", они демонстрируют сходную динамику изменения процентного содержания интенсивно (+++) рсм-положительных клеток (максимальный пул pcna содержится в клетках в s-фаэе) и клеток, включающих ■ ^Н-тимидин'импульсно и после 48-часового насыщения з процессе формирования конфяуентного мокослоя.' При этом также видно, что общий пул РсяА-положительиых клеток- существенно превышает пул' клеток, меченных 'н-тимияином после 48 часового насыщения.

Табл. 3. 'Сравнение иммунопитохимического и радиоавтографического методов "выявления иролиферирующих клеток.

Время Доля рсиа-позитивных ЭК(х), Доля н-тимидин-меченньк ЭХ(*>,

культиви-------------------------.-----------------------------------

рования, интенсивность ПАЛ-реакции импульсная насыщение

(сутки) + ++ +++ метка, 30 мин. 48 часов

1 68.0 31.0 • 1.0 2.6

.3 36.8 38.0 25.2 22.6 51.6

5 77.2 18.9 3.7 8.4

7 84.6 13.5 1.9 3.3 18.2

9 - - 2.9 12.8

Сравнение иммуноцитохимического выявления , пула пролиферируюших клеток с методом "золотого стандарта" позволило проанализировать возможности применения этого метода для изучения

пролиферативного поведения ЭК in vitro. Иы можем заключить, что для популяции ЭК этот метод имеет те же преимущества и недостатки применения, которые уже ранее отмеченны другими авторами для МНОГИХ клеточных популяция (Cotrera and Gown, 1991; Zeymer et al.. 1992).

ИмнунпдитпхшитесгоЕ "исследование аавясиналги экспрессии icam-i и

gmp-140 2К в ыжйлуешсеоы НОНРСЛО.е. и "в колония*; от ттпяганепатитт-0X0. статуса- ЭК: Взаимосвязь- пролиферации И'экспрессии I сам-1—ил к gmp-140 исследовали" на примере культуры ЭК пупочкой вены и аорты человека. Для'этого проводили окрашивание ЭК с помощью МоАТ. рею. распознающих pcna,- и одним -из МоАТ., распознающих молекулы адгезии: 10f3, распознающих icam-i или s12, выявляющих gmp-140. Различная локализация антигенов (РСна - в ядре, icam-i -на поверхности клетки, gmp-140 - в цитоплазме хлетхи) позволяла проводить их совместную (PCNA-icam-i, fcna-gmp-140) визуализацию с помощью ПАЛ-иетода или биотинилировакных igG и Vectastain abc Kit (Vector Laboratories, usa).

Взаимосвязь экспрессии icam-i и pcna исследовали на модели "репликативного старения" эндотелия пупочной вены при длительном субкультивировании ЭК и при первичном клонировании ЭК. Морфологический анализ выявил* обратную зависимость между, содержанием в конфлуентном монослое (О-В-го пассажа) субпопуляции клеток с фенотипом pcna(—);" 1сам(+) - непролиферирующих клеток' экспрессирующих icam-i, и субпопуляции ЭК с фенотипом pcna(+), I сам- 1 ( - ), клетки которой находятся в пролиферативном цикле и не экспрессируют icam-i. Субпопуляция с Фенотипом pcna(-),icam(+) составляет основную" массуС примерно 60%) конфлуентного . "'монослоя первичной культуры. По-вилимому, это клетки, непосредственно находившиеся в стенке сосуда in situ. Доля этой категории -клеток слегка снижается после "первого "пассажа, затем резко (в 4-6 раз) падает к 5-8 пассажу. При этом прогрессивно возрастает (в " 10-12 раз) доля субпопуляции- ЭК, экспрессируидих pcna, т.е., по-видимому, выходящих в процессе культивирования из состояния покоя и вступающих з активный пролиферативный цикл, что сопровождается снижением экспрессии хсам-1.

Исследование взаимосвязи экспрессии рсна и смр-ио также проведено на модели первичного клонирования ЭК и длительно субкультивируемого эндотелия пупочной вена (0 - 8-ой пассажи), а также ранних пассажей ЗК аорты. Гистограмма на рис 4. демонстрирует обратную зависимость между содержанием клеток, экспрессируюших чмр-140 и рсиа на разных пассажах ЭК пупочной вены.

Рис.4. Гистограмма распределения ЭК, экспрессируюших смр-140 и рска в конфлуентном монослое ЭК пупочной вены. Окрашивание МоАТ.: рсю, распознающими рсиа и э12, распознающими смр-140 с помощью ПАЛ - метода.

А - 1 пассаж ПАП - реакция: (-) - отрицательная; Б - 8 пассаж (+) - положительная;

(++) - сильно положительная.

Таким образом, результаты иммуноцигохимического анализа

продемонстрировали зависимость экспрессии юам-1 и вмр-140 от

пролифератианого поведения ЭК. Эти данные были подтверждены с 3

помощью метода Н-гимидиновой радиоавгографии при совместном выявлении пула пролиферирующих клеток и ЭК, экспрессируюших молекулы адгезии. Полученные данные согласуются с нашим предположением о том, что в клетках, находящихся в активной пролиферации, постепенно снижается уровень экспрессии этих молекул адгезии. Следует отметить, что иммуноцитохимическое выявление- рска после взаимодействия нейтрофилов с эндотелием аорты 1-го пассажа показало, что около 70 X ЭК, взаимодействующих с нейтрофилами находятся вне пролиферативного цикла.

выводы

1. Ha ранних пассажах (0-3) в культуре неактивированного

эндотелия аорты взрослого человека выявлена субпопуляция ЭК 3 2

( площадью свыше 10x10 мкм ), которая в отличие от более мелких . ЭК обладает повышенной способностью адгеэировать на своей поверхности нейтрофюш и моноциты периферической крови и осуществлять их трансэндотелиальную миграцию. - Средняя площадь адгезирующих ЭК превышает среднюю площадь неадгеэирующих ЭК приблизительно в 4 раза.

2. Еа моделях: первичного клонирования ЭК аорты и пупочной вены человека и длительного субкультивировании ЭК пупочной вены показано, что в процессе "репликативного старения" ЭК приобретают повышенную способность к адгезии лейкоцитов.

3. Иммуноцитохимическия анализ распределения молекул адгезии icam-i и gmp-140 в монослое ЭК аорты человека первичной культуры и ранних пассажей выявляет гетерогенный характер экспрессии этих молекул ЭК. Нейтрофилы предпочтительно взаимодействуют с ЭК увеличенного размера, интенсивно экспрессируюшики icam-i.

4. При культивировании ЭК аорты и пупочной вены наблюдается прогрессивное снижение содержания клеток, экспрессируюиих icam-i и gmp-140, как в процессе Формирования конфлуентного монослоя, так и в процессе длительного субкультивировакия эндотелия.

5. Сопоставление пролиферативного поведения ЭК в культуре и экспрессии эндотелием молекул адгезии icam-i и gmp-140 показало, " что среди клеток, находящихся в пролиферативном цикле, доля клеток, зкспрессируюдих молехулы адгезии, существенно ниже, чем среди клеток, находящихся вне пролиферативного цикла.

СПИСОК РАБОТ., ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Balyasnikova X., Danilov S., Krotov K. Constant magnetic -field stimulates angiogenesis of human' endothelial ceils in vitro. World Congr. on Cell and Tissue culture, Washington,

D.C., USA, 1992.

2. Балясникова И.В., Ильинская О.П., Тарарак Э.М.Взаимодействие нейтрофилов с гетерогенным эндотелием аорты человека в культуре. Тез.докл., v Всеросс.хонф. по патологии клетки, Москва, 1993, с.26.

3. Tararak Е.М. , Kondakov I.K., Bannon Р, Balyasnikova I.V., Ilyinskaya O.P.. Tkachuk V.A. , Dean R.T., Bard D.K. Effects of blood monocyte interaction with human carotid artery injured by adrenoreceptor agonists. J. Heart Failure, 1993,. v.l, publ. 110.

4. Balyasnikova "I;V., Ilyinskaya O.P., Tararak E.M.. Printseva O.Yu. Neutrophils interactions with heterogeneous cultured endothelial cells from human aorta. 62th Eur. Ather. Society Congr., Jerusalem, Israel, 1993, p.138.

5. Smirnov V., Balyasnikova I., Bystrevskaya V., Bizova Т., Ilyinskaya Q. Krushinsky A., Latsis R., Romanov Yu. , Soboleva E., Tararak E. Endothelial Heterogeneity and Inti-nal Blood Born Cells: Relation to Human Atherosclerosis, The Third Saratoga Int. Conf. on Atherosclerosis., Saratoga, Japan, 1993, p.29, publ. S 1-4.

6. Tararak E., Kondakov I., Bannon P., Balyasnikova I., Ilyinskaya 0., Tkachuk V., Dean R. , Dawes J., Bard D. Monocyte interaction with human carotid artery injured by adrenorecep tor agonists. The Second Int. Symp. on Coronary Artery Disease, 1993, Beijing,-R.P. of China.

7. Балясникова И.В., Кротов К.А., Данилов С.М. Влияние"П0СТ0ян-ного . магнитного- "полл •-на' скорость роста и ангиогенез эндотелиальных клеток in vitro, Бюял. эксп. биол. мед.,1994, f .1, с. 106-108.

8. Romanov Yu. -," Balyasnikova I., Bystrevskaya v.. Bizova Т.. Ilyinskaya 0., Krushinsky A., Latsis R., Soboleva E., Tararak E. and V. Smirnov. Endothelial Heterogeneity and Intimal Blood Born Cells: Relation to Human Atherosclerosis. Ann. N-Y Acad. Sci., 1994. In press.

Подписано к печати «/б- оГ 1994 г. Отпечатано на ротапринте в Формат бумаги 30x42/4

Производственном комбинате Объем^~ п. д.

Литературного фонда России Тир. 100