Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности синтеза фактора некроза опухолей-альфа моноцитами крови человека in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Закономерности синтеза фактора некроза опухолей-альфа моноцитами крови человека in vitro"

ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ

На правах рукописи

МИСУНО .Наталья Ивановна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ СИНТЕЗА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-« МОНОЦИТАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1992

Работа выполнена в НИИ гематологии и переливания крови МЭ Республики Беларусь

Научный руководитель - доктор медицинских наук Н.Н. Войтенок

Официальные оппоненты: доктор.медицинских наук, профессор В.С. Татаринов

доктор медицинских наук, профессор В.К. Кухта

Ведущая организация - Институт иммунологии МЗ РФ (г.Москва)

заседании специализированного совета Д 006.30.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук ч Институте радиобиологии ЛН Беларуси по адресу: 220600, г. Минск, ул. Жодинская, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Беларуси

Автореферат разослан ^лГ/ТЗсй^Аг* 1992 года

Ученый секретарь специализированного совета

Защита состоится

1992 года в часов на

кандидат биологических наук

ОБЩ,ад ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность_П2облемы В последние годы большое внимание уделяется исследованию фактора некроза опухолей-а (ФНО-а), одного из макрсфггальных цитокинов, его роли в интеграции иммунных, биохимических и физиологических процессов..Известно, что кроне цитотоксического эффекта на клетки некоторых опухолей, ФНО-а. способен оказывать регулирующее воздействие на метаболизм нормальных клеток (Maury, 1986). Изучение механизмов регуляции синтеза этого монокина необходимо как для более глубокого понимашг1 биологической роли ФНО-а, его участия в процессах, обеспечивавших защиту организма от чужеродных агентов, так и для создания новых подходов к терапии воспалительных, инфекционных, кеоплас-тических заболеваний.

Выполненные к настоящему времёни исследования синтеза ФНО-а моноцитами/макрофагами человека и животных проведены на клетках, выделенных в условиях, способных вызвать их активацию (Beutler et al., 1936, Sariban et al., 1986). .Нами использован метод очистки моноцитов на градиентах плотности, позволяющий свести к минимуму возможность активации клеток в процессе выделения из донорской крови.

Как известно, кроме клеток моноцитаркого ряда,' ^ажную роль в воспалительном ответе играют поликорфкоядеркые лейкоциты (А.Н. Маянский, Д.Н. Маянский, 1933). Исследование влияния дефепзинов, содержащихся з гранулах нейтрофилоз, на функции моноцитов, в частности, на продукцию ими iHO-a, представляет интерес для понимания взаимодействий лейкоцитов крова при воспалительной реакции организма.

Ц§ЙЬ_в§бота - исследовать эакойсмзрноета синтеза фактора некроза опухолей-а моноцитами крови чэлонака in vitro.

3&ШШ_В5б2ХН:

1. Отработать методику- выделения моноцитов из фракции моно-нуклевров периферической крози человгка в неактипиругоих условиях на градиенте плотности перколла.

2. Исследовать условия индукции синтеза ФНО-а различными реагентами.

3. Исследовать влияние nt габолич<?ских ингибиторов на синтез

мРНН ФНО-а и на продукцию ФНО-а моноцитами крови человека in vitro.

4. Изучить возможность присутствия пула мРНК ФНО-а или зрелого белка ФНО-а'в циркулирующих неакт.шированных моноцитах крови человека.

5. Исследовать влияние естественного антибактериального полипептида нейтрофнлов человека ШР-1 на продукцию ФНО-а в культуре моноцитов.

Ыаучнад_цови2иа Исследованы закономерности синтеза ФНО-« моноцитами крови человека, вцделелкыкя в неактивирущих условиях на градиенте плотности перколла. Показано, что продукция ФН0~а активированными моноцитами относительно резистентна к действию ингибитора синтеза РНК актешжиципа D, в отличие от продукции лимфотоксина стимулировании лимфоцитами периферической крови. Впервые описан метод индукции ФНО-« и его количественное определение в цельной крови. Показано, что циркулирующие моноциты крови человека но содэряат белка ФНО-е и мРНК ФКО-а. Впервые применен метод выделения иРНК из образцов цельной крови и доказано, что в клетках крови здоровых доноров не содержится мРНК ФНО-а. Показано, что продукция ФИО-« в культуре стимулированных моноцитов крови человека усиливается под влиянием дефензина нейтрофнлов человека HNP-1 в концентрации 10~®-10-5М. Установлено, чтс ННР-1 в концентрации 10"4М оказывает цитотоксическое действие не культуры моноцитов.

ВвёнтчесайВ__2BSHHM2SIfe Полученные данные обогащают существующие представления, о механизмах'участия ФНО-а в иммунорегу-ляции и иммунопатологи:-;. Относительную резистентность индукцш ФНО-а в моноцитах человека л действию ингибиторов транскрипции необходимо принимать ес внимание при разработке методов лечени! воспалительных заболеваний, септического шока, а также болезней крови, вовлекающих клетки миеломоноцитнрного ряда. Способ выде ления мРНК из образцов цельной крови можно рекомендовать для применения в клинике с целью определения мРНК ФНО-а и других ци токинов при различных заболеваниях. Этот метод был применен для оценки содержания мРНК ФНО-а в образцах крови больных в различных фазах септического кона. На основе определения ФНО-« в обра зцах плазмы после индукции ФНО-а в нефракционирозанной крови мс йот быть создан ¡(нормативный метод оценки функционального сс

стояния лейкоцитоз крови человека в норме и при патологии.

Положения,_выносимые_на_защиту

1. Продукция ФН0-<* моноцитами крови человека, активированными бактериальным липополисахаридом in vitro, относительно резистентна к действию ингибиторов • транскрипции.

2. Циркулирующие моноциты не содержат. ФНО-а, его продукция активированными моноцитами является результатом синтеза белка de novo.

3. Моноциты периферической крови человека не содержат нРНК ФНО-я, мРНК ФНО-а отсутствует в образцах нефракционированной кроэи.

4. Продукция ФНО-а стимулированными моноцитами кро-зи человека in vitro усиливается под действием полипептида нейтрофилов человека дефензина HNP-1.

Апробация_работы Результаты исследований доложены на 1У съезде гематологов и трансфузиологов Белоруссии (Минск, 1988), Всесоюзном симпозиуме "Структура иммунорегуляторных пептидов" (Москва, 1988), Всесоюзной конференции "Стресс и иммунитет" (Ростов-на Дону, 1989), Международном симпозиуме молекулярной биологии гемопоэза (Инсбрук, 1989); 2 Международном симпозиуме по цитокинам ( Хилтон Хед, 1989), Международном симпозиуме "Молекулярные факторы гемопоэза и стволовая клетка" (Мс.-ква, 1990), I Иммунологическом съезде Белоруссии (Минск, 1990), III Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 1991).

Публикации По теме диссертации опубликована 21 работа, в которых отражены основные научные результаты диссертации. Получено положительное решение на 1. заявку на изобретение.

0бъем_и_с1ВХК1УЕ§_йкссеЕтаиии Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы (включает 9 отечественных и 144 иностранных источников). Работа иллюстрирована 10 таблицами и 10 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТН

Матер и а л ц _ и _ м е тодн _ и с ел ед о в а н и й Моионуклеяры периферической крови (МПК) выделяли из сгеяей донорской крови па одноступенчатом градиенте фиколл-верографина (Воуигл, 1963)- при +4°С.

Для получения моноцитов МПК фракционировали на непрерывном пре-формированном градиенте перколла ("Pharmacia.") (Gmelíg-Kcyling, Waldmann, 19S0). Моноциты культивировали в среде RPMI 1640 ("Gibco" или "Serva"), дополненной 5% термоинактивированной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и антибиотиками (пенициллин -100 ед/мл, стрептомицин -100 мк'г/мл), в концентрации 1,5 -2 млн/мл при 37°С и 5% С02 в течение 18 часов. Для индукции ФНО-а использовали липополисахарид E.coli 0111:В4 (ЛПС) ("Sigma" в концентрации 20 мкг/мл и суспензию бактерий St. aureus Cowan 1 (САК), приготовленную по нетоду Kessler (1975), в концентрации 0,001% (v/v). В экспериментах по изучению влияния дефензина HNP-1 на продукцию ФНО-а для активации моноцитов использовали САК в, концентрации 0,00025% (v/v) и форболмиристатацетат (ФМА) ("Calbiochem") в концентрации 1-5 нг/к.л. Моноциты инкубировали 30 минут в бессывороточиой среде в присутствии реагентов, затем добавляли термоинактивированную ЭТС до концентрации 0,1%. Дефен-зин HNP-1, выделенный из нейтрофилов крови человека и очищенный, как описано Ganz и соавт. (1985), был любезно предоставлен д-ром Лерером (Калифорнийский университет, США). Содержание эндотоксина в препарате, определенное с помощью Limulus Amebocyte Lysate теста ("Sigma"), составляло 2,6 нг/мг белка.

Лимфоциты, выделенные на градиенте плотности перколла, очищали от прилипающих клеток на пластике, затем культивировали а среде HPMI 1640 + 5% ЭТС в концентрации 2-3 млн/мл 42 часа при 37°С и Ъ% СО2 ■ Для индукции ФНО-ß использовали фитогемагглюткгаш (ФГА) ("Serva") в концентрации 10 ннг/мл.

Клетки культивировали в 24- или 96-луночных культуральных платах ("Flow Lab." или "Ccjtar").

Для угнетения синтеза РНК клетки инкубировали 1 час при 37°С с актиномицином D (AkD) ("Serva", 1 мкг/мл) или о-амакити-ном (АМН) ("Serva", 10 мкг/мл), затем вносили ЛПС и далее культивировали в прлсутствии ингибиторов.. Для исследования уровня синтеза РНК дополнительные клеточные н,;льтуры метили 3Н-урид!Шсн (2 oCi/мл) в течение 1В часов, осаждали на фильтры и измеряли радиоактивность в ß-счетчике LS-1840 ("Beckman").

В некоторых экспериментах, для "раннего" угнетения синтеза РНК,-.часть донорской крови собирали во .флаконы с гепар:;нон, в которые - предварите.?;.!«) был внесен AkD в конечной концентрации 10

мкг/мл крови. Обработанную таким способом кровь наслаивали на градиент фиколл-верографина и далее выделяли клеточные фракции, как описано выше.

Для угнетения синтеза белка в клеточных культурах использовали цнклогексимид (ЦКГ) ("ralbiochem"), который добавляли з культуральную среду в концентрации 10 мкг/мл. В некоторых экспериментах ингибитор добавляли во флаконы для сбора крови и во все растворы, используемые в процессе выделения клеток.

Диэаты моноцитов готовили, добавляя к осадкам замороженных клеток фосфатный буферный раствор, .содержащий 1% NP-40 и ингибиторы протеаз (ЗмМ фенилметилсульфонилфлюорид, 1мМ ti-этилмале-имид, 1мМ диэтилентриаминпентауксусную кислоту). Лизаты обрабг-тывали 2 раза по 10 секунд ультразвуком, центрифугировали.

Для определения ФН0-<* в лизатах моноцитов и в супернатантах моноцитарных культур моноклональные антитела (МКА) 3C7N против ФНО-а в концентрации 0,01 мг/мл в натрий-карбонатном буфере (pH 9,5) инкубировали а течение ночи при +4°С в 96~луночной плоскодонной плате. После 5-кратной отмывки фосфатным буферным раствором с 0,05% твин-20 (ФБР-твин) в лунки вносили исследуемые образцы и стандарт и инкубировали плату 40 мин при перемешивании. Плату отмывали, затем инкубировали в течение 40 мин с иммуноглобулинами из сыворотки кролика, иммунизирован!: jro рФНО-а человека. После отмывки вносили на 40 мяк козьи антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгировакные с пероксидазой. Отмывали плату ФБР-твином, добавляли субстрат (0,6 мг/мл о-фенилен-диамина-HCl и 1 мМ HgOg в 0,02 М натрий-цитратном буфера, pH 4,7 и инкубировали в течение 30 мин. После внесения 50%-ной ,'HgSO^ производили измерение оптической плотности при длине волны AJZ им. В качестве стандарта использовали рекомбинантный ФНО-к человека (НПО "Фермент", Вильнюс).

ФНО-а в супернатантах культур моноцитов и в образцах плазма крови определяли в цитотоксическом тесте на клетках мышиной фиб-робласгоидной линии L-929 (Fisch, Gifford, 1983). Для идентификации цитотоксичносги использовали асциты гибридом 3C7N и 10 FN, продуцирующих моноклональные антитела против ФНО-а, способные полностью нейтрализовать цитотокеическую активность макрофагаль-ного ФНО-а (гибридомы получены в лаборатории клеточной и молекулярной иммунологии НИИ ГОК МЗ РВ), и нейтрализующие кроличьи

аг"итела против ФНО-g ("Genenteck"), которые били любезно предоставлены д.б.н. Недоспасовым С.А. Разведения исследуемых образцов перед добавлениям к клеткам- мишеням инкубировали с антителами 30 мин при 3?°С. Активность ФНО-а (Ед/мл) определяли не основе.разведения супернатанта, при котором наблюдалось 50%-нос уменьшение оптической плотности окрашенного слоя клеток г.о сравнению с контролем (клетки, инкубированные в среде). Активное« части образцов рассчитывали в reference едкницах/мл (RU/мл), используя международный стандарт ФНО-а NBSB 86/659, который бьи любезно предоставлен Национальным институтом биологических стандартов и контролен (Англия).

мРНК из моноцитов выделяли по методу Chomczynski и Sacch: (1987). Анализ изолированной РНК проводили после электрофореза i 1,4% формальдегид-агарозном геле и переноса на нейлоновую мембрану Zeta-Probe ("Bio-Rad") (Маниатис и др., 1984). мРКК ФН0-< выявляли гибридизацией с меченой Р кДНК- пробой (Пае 111 - Haï 111 фрагмент 4 экзона гена ФНО-а человека, субклонированный i фаге М13шр18 (Недоспасов и др., 1985)).

Для выделения мРНК из нефракционированной крови 5 мл свеже; гепаринизированной донорской крови смешивали с равным объемо: горячего (60°С) лизнрующего раствора (8Ы гуанидинтиоцианат, 50м: цитрат натрия, 1% саркозил, 0,2 M 2-меркаптоэтанол). Дальнейше выделение и анализ мРНК проводили, как указано выше.

Статистическую обработку данных проводили с помощью про граммы STATGRAF на персональном компьютере "Amstrad PC 1640".

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1лиаиие_ингибиторов_син1еза_ЕНК_на_пройукцию с1ИмулйЕОваншми_моноцитами_СёваФевИНёск человекa.io_yitro Beutler г соавт. (1986) показали, что в кышиных перитоне альных макрофагах, выделенных с и пользованием тиогликолятг содержится мРНК ФНО-а, в то время как синтез зрелого белка про исходит только после стимуляции клеток ЛПС. На основании эту результатов была сформулирована гипотеза, согласно которой на h рофаги in vivo содержат пул мРНК ФНО-а, что обеспечивает быстр;, продукцию ФН0-« к. лкаки, активированными бактериальны« эапот«

синок. Однако обнаружение мРНК ФНО-а в макрофагах могло быть следствием активации клеток в процессе выделения. Кроме того, механизмы регуляции синтеза цитокинов могут быть разными у моноцитов и макрофагов. В данной работе для выделения моноцитов использован метод разделения МПК на преформированнйм непрерывном градиенте плотности перколла при -М°С. Клеточная фракция, располагающаяся в зоне плотности 1.058 - 1.065 г/мл, содержала 80,7 + 5,4 % клеток, имеющих гранулы а-нафтилацетатэстеразы - маркера, характерного для моноцитов. Моноциты, выделенные из свежей ге~ паринизированной донорской крови центрифугированием на градиенте плотности перколла и культивированные в течение 12-18 часов in vitro, как правило, не продуцировали определимого количества ФНО-а. Активация моноцитов ЛПС или САК приводила к продукции ФНО-а, о чем свидетельствовало исследование супернатантов иоко-цитарных культур в цитотоксическом .тесте на клетках L-929 с использованием моноклональных антител против ФНО-а и методом имму-ноферментного анализа. Сравнение разных режимов стимуляции моноцитов показало, что САК является индуктором, вызывающим большую продукцию ФНО-а по сравнению с ЛПС.

Обработка культур моноцитов акгяюмицином D (1 мкг/мл) приводила к значительному подавлению (на 98,0+0,4%, п=10) включения °Н-уридина клетками. Вместе с тем, продукция ФК.>-в моноцитами, стимулированными ЛПС, не блокировалась AhD в концентрации 1 мкг/мл. Количество жизнеспособных клеток в культурах моноцитов, в которые был добавлен Ак1), уменьшалось на 56,0+6,6% (п=10) по сравнению с культурами, не обработанными ингибитором. а-Ама-тин (10 мкг/мл) подавлял включение 3Н-уридина в культурах моноцитов в меньшей степени, чем AkD (на 84,7+0,9%, п=7). АНН тек*е не блокировал индукцию синтеза ФНО-а в культурах моноцитов, стимулированных ЛПС. Активность цнтотокскка, присутствовавшего в супернатантах стимулированных моноцитов, культивированных как с ингибиторами транскрипции, так и в их отсутствие, полностью нейтрализовалась МКА 3C7N против Ф1Ю~а.

Таким образом, результаты исследований показали, что индукция синтеза ФНО-а под действием ЛПС может происходить в моноцитах, обработанных ингибиторами транскрипции AkD (1 мкг/мл) или АМН (10 мкг/мл).

В отличие от моноцитов, обработка культур лимфоцитов, очи-

щеяных от прилипающих клеток, ингибиторами транскрипции, приводила к отмене продукции лимфотоксина (ЛТ), стимулированной ФГА.

В нескольких экспериментах использовали модель "раннего" угнетения синтеза РНК: непосредственно перед взятием крови у донора добавляли во флакон для сбора крови АкБ в концентрации 10 мкг/мл. "Раннее" воздействие ингибитора приводило к значительно-

О

му подавлению включения Н-уридина (на 95,1+0,9%, п=10) в свежих и в стимулированных ЛПС моноцитах. Вместе с тем, в культуральной среде моноцитов, выделенных из крови, обработанной АкВ, и стимулированных бактериальным эндотоксином, определялась цитотокси-ческая активность, полностью нейтрализуемая МКА ЗС7Н против ФН0-а (табл. 1). Таким образом, "ранняя" обработка моноцитов ингибитором транскрипции , также как и добавление АкБ с начала культивирования, не блокировала продукцию ФНО-а, индуцированную ЛПС.

Более того, продукция ФИО-« (как правило, незначительная) наблюдалась в культурах моноцитов, обработанных АкО в крови или в начале культивирования даже в отсутствие стимуляции ЛПС (табл. 1). Активность цитотоксина, индуцированного в результате обработки клеток АкО, нейтрализовалась МКА ЗС7И против ФНО-а.

Таблица 1

Продукция ФНО-а моноцитами крови человека в условиях "раннего" подавления синтеза РНК

: Культура : Кол-во N:моноцитов :жизнеспособных : :клеток, тыс/мл

Активность ФНО-а, Ед/мл +МКА ЗС7К

1 . инт 2210,0+11,6 9802,7+1447, е 10,4+ 1,8 и .в

2. Мо + ЛПС 1556,7+28,5 7514,0+ 567,3 93,3+13,0 н • в

3. Мо+АкО 580,0+15,3 164,7, 39,3 42,6+ 8,3 1!. б

4. Мо+ЛкОШС 510,0+20,8 288,7+ 19,2 68,4+37,3 н

5.(АкО+кр)"Мо 7^,7+20,3 476,7+ 49,8 35,5+ 1,2 н .в

б.(АкОНф) Мо+ЛПС 953,3+41,8 551,3+ 16,4 61,7+10,9 н ■ в

Примечание: н.с. - не вдавлена; Но - моноцита; *- моноциты выделяли из кроеи, обработанной АкО.

Обработка крови AkD приводила К подавлению включения

•а

Н~уридина в культурах лимфоцитов. Как и при добавлении ингибитора транскрипции в культуральную среду, "раннее" угнетение синтеза РНК сопровождалось отменой продукции ЛТ в культурах лимфоцитов, стимулированных ФГА. '

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что лимфоциты, очищенные от прилипающих клеток на пластике, отличаются от моноцитов по чувствительности продукции их цитотокскнов к действию ингибиторов транскрипции.

Аналогичные данные по устойчивости продукции ФНО-а к обработке ингибиторами транскрипции одновременно с нами получени Hofsli и соавт. (1988). Механизмы, обусловливающие относятельнув устойчивость продукции ФНО-а стимулированными моноцитами к действию ингибиторов транскрипции, неясны, Возможно, имеет место избирательное действие ингибиторов на транскрипцию разных РНК, и транскрипция гена ФНО-а может протекать при использованных неми концентрациях AkD на фоне общего подавления синтеза РНК. Имеются данные, что AkD обладает высоким сродством к определенной скта-мерной последовательности ДНК (Snyder et al., 1989). Кроме того, мсино предположить, что ингибитор может частично удаляться из моноцитов в результате экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости (MDR). Нельзя исключить и участи- в регуляции экспрессии гена ФНО-а природных антнсмнсловых ггРНК, которые, как известно, могут участвовать в регуляции гкспресспи генов (Krochbin, Lawrence, 1989, Strickland et al., 1983).

рлиярие иирцбцтора синтеза бедка на продукция ФНОга в

куяьтурах моноииуов.„Исследование__солервания__$iQr«_

Н_Я32319Х ИQSQUUXQB Для изучения возможности депонирования с циркулирующих моноцитах крови преформ!!рэзанкого белка ФНО-а исследовали продукцию ФНО-а в условиях подавления синтеза балка. Эксперименты по-кезчли, что внесений ингибитора синтеза белка в культуры моноцитов одновременно с ЛПС привадит к подавления продукции ФНО-а. В культурах моноцитов, рано обработанных AkD, ЦКГ, добавленный э начале культивирования клеток, отменял как индуцированную ЛПС, тл;; и индуцированную AkD продукцию ФНО-а. Ингибирозяние синтеза бзгяа г. моноцитах с помощью ЦКГ приводило к подавлению продукции

ФЯО-а, индуцированной САК. ФНО-а в супернатантах из культур моноцитов , обработанных ингибитором, не определялся методом имму-ноферментного анализа и в цитотоксическом тесте на клетках L-929. При исследовании продукции ФНО-а в цельной крови, обработанной. САК, показано, что добавление ЦКГ в кровь в начале инкубации приводит к подавлению продукции ФНО-а.

Таким образом, продукция ФНО-а стимулированными моноцитами крови человека блокируется в присутствии ингибитора синтеза белка ЦКГ и, следовательно, является результатом синтеза белка de novo.

Исследование лизатов интактных и стимулированных моноцитов методом иммуноферментного анализа с моноклональными антителами против ФНО-о человека позволило заключить, что циркулирующие моноциты крови человека не содержат преформированного белка ФНО-Так, моноцита, выделенные из свежей донорской крови в "неак-тивирующих" условиях, не содержали белка ФНО-а (чувствительность тест- системы - 20 пкг/мл). Аналогичные результаты получены с использованием в ИФА поликлональной сыворотки против ФНО-а (данные не представлена). Моноциты, стимулированные САК в течение 2 часов, секретировали в культуральную среду СНО-а, выявляемый методом ИФА и в биологическом тесте. Высокий уровень ФНО-а определялся в супернатантах моноцитарных культур, стимулировании/ САК.в течение 18 часов, активность ФНО-а в цитотоксическом тесте полностью нейтрализовалась МКА против ФНО-а. Стимуляция моноцитов САН приводила к нарастанию внутриклеточного ФНО-а, но значительного накопления белка, сопоставимого с уровнем секреции в культуральную среду, в ионоцитах не наблюдалось. В моноцитах, обработанных ЦКГ в начале культивирования, продукция ФНО-а (внутриклеточного и секретируемого), индуцированная САК, была подавлена

йе5ледование_соаешаайа_м£Н^_ФЙ0гй_е_свешх_ц £1ИНУЛиро§аншх_моцрии1ах_КЕОви_неловека

.Ранее показано, что моноциты, выделенные методом адгезии на пластике, не содержат мРНК ФНО-а (Sariban et el., 1988). Нельзя исключить, что гипотетическая преформнрованная иРНК может деградировать в процессе прилипания моноцитов. Анализ мРНК, выделенной из моноцитов, полученных методом фракционирования на градиенте плотности перголла, показал, что моноциты, выделенную вз

свежей'донорской крови, не содержат мРНК ФИО-« (рис. 1). мРНК ФНО-а отсутствовала и в моноцитах, выделенных из крови, обработанной АкО или ЦКГ. Обработка моноцитов САК в течение 3 часов при 37°С приводила к накоплению мРНК ФНО-а (рис. 1).

I 2 3 4' 5 6

Рис.1. Содержание мРНК ФНО-а в моноцитах, выделенных иэ крови человека на градиенте перколла. 1 - свежие моноциты; 2- выделенные из крови, обработанной АкО, и культивированные 3 часа; 3 - выделенные из крови с ЦКГ и культивированные в присутствии ингибитора 3 часа; 4 - стимулированные САК 3 часа; 5 - выделенные из крови с АкР и стимулированные САК 3 часа; 6 - выделенные иэ крови с ЦКГ и стимулированные САК 3 чеса в присутствии ингибитора.

Чтобы исключить возможность разрушения гипотетической мРИН ФНО-а во время выделения моноцитов на градиенте, использоггли метод выделения мРНК из нефракционированной крови. В образцах РНК, выделенных непосредственно из крови, мРНК ФНО-а отсутствовала (рис. 2).

I

'-...У,>- /

12 3 4

Рис. 2. Содержание мРНК ФНО-а в лиэатах цельной крови.

1 - свежая крозь; 2 - кровь, инкубированная 3 чпев;

3 - кровь, инкубированная 3 часа в присутствии. САК;

4 - кровь, инкубированная 3 часа с САК и ЦКГ.

Из оснозянии полученных результатов сделан вывод о том, что циркулируюдае моноциты крови человека не содержат пула мРНК

а, и индукция синтеза ФНО-а в моноцитах крови является результатом активации транскрипции гена ФНО-а.

Учитывая полученные'ранее данные (ВеиЬ1ег еЬ а1., 1986, иНсЬ еЬ а1., 1989, Заг1Ьап е^а!.. 1988), мокшо предположить, что пул мРНК ФНО-а содержится именно в тканевых макрофагах, а не е циркулирующих моноцитах крови.- Тогда наличие мРНК ФНО-а в не-стимулированных клетках можно считать признаком дифференцировки моноцитов в макрофаги.

Небольшие количества мРНК ФНО-а были обнаружены в моноцитах, инкубированных 3 часа на пластике без дополнительной стимуляции, о также в крови, инкубированной 3 часа при 37°С. Нами также показано, что инкубация на пластике в течение 3 часов приводит к значительному увеличению продукции ФНО-а моноцитами при последующей стимуляции ЛПС. Таким образом, полученные результаты подтверждают, что процесс адгезии является активирующим сигналом для моноцитов и фактором, усиливающим ответ ыоноциюв на другие стимулы (Реппураскег еЬ а1., 1979, НаекШ еЬ а1.„ 1963).

Обработка крови АкВ (10 миг/мл) к& препятствовала индукции синтеза мРНК ФНО-с в м.лоцитах в результате стимуляции САК, хотя копе дгтк, выделенные из крови, обработанной АкО, содержали меньшее количество мРНК ФНО-а по сравнении с клетками, не контактировавшими с ингибитором (рис.1).

Эксперименты показали, что з моноцитах, культивированных на пластике 3 часа в среде, содержащей ЦКГ, в отсутствие дополнительной стимуляция, содержится мРНК ФИО-« (рис.1), причем ее количество в моноцитах с угнетенным синтезом белка в несколько раз. больше, чей в интактных клетках. Обработка моноцитов ЦКГ кс блокировала индукцию мРНК ФНО-а под'действием САК, хотя и вызывала незначительное снижение уровня кРНК ФИО-« (рис. 1). Обработка моноцитов ингибитором синтеза белка после 3 часов стимуляции САК вызывала "супериндукцик" мРНК ФНУ-«. Значительное увеличение уровня мРНК" ФНО-а спустя 2 часа инкубации моноцитов с ингибитором мелю объяснить, по меньшей мере, двум: процессами: увеличением времени жизни мРНК ФНО-а в результате шгибирования ЦКГ синтеза рибонуклеаз (ЯЬав, Кг.яеп, 1986) и участием в положите ятой регуляции экспрессии пеня ФНО-а йелкоьнх фагторов, синтез когг>|1«« происходит под действием активирудхдого сигнлла (САК).

Таким образом, полученные результату позволяв? сделать бы-

вод о том, что, кроме регуляции экспрессии гена ФНО-а в моноцитах на уровне транскрипции, существует посттранскрипционнып уровень регуляции.

Влияние_£ефензинОЫРг1_И§йтвофилов_ч^

ФНО^з ^ондштами_квови_человека_1П_у1£го

Показано, что макрофагальные цитокины, в том числе и ФНО-а, способны оказывать разностороннее воздействие на полиморфнолдер-ные лейкоциты, вовлекая их в процесс воспаления (Shalaby et al., 1985, Weisbart et al., 1987, Durum,Oppenheim, 1989). Вместе с тем, мало известно о влиянии гранулоцитарных факторов на моноциты/макрофаги. Мы исследовали влияние дефензина HNP-1, выделенного из гранул нейтрофилов, на продукцию ФНО-а з культуре моноци-тоь. крови человека.

Изучение влияния дефензина HNP-1 на количество жизнеспособных клеток в культуре свежих и стимулированных САК моноцитов показало, что дефензин в концентрации Ю'^М, или 333 мкг/мл вызывает тотальную гибель моноцитов в культура. Ранее показано, что некоторые полипептиды, относящиеся к семейству дефензиноз, оказывают цитотоксический аффект на культуры клчток млекопитающих (Lichtenstein, 1988, Sheu, 1985). Таким образом, можно предположить, что опосредованное дефензином цитотоксическое действие нейтрофилов против моноцитов/макрофагов моиет иметь мес о in vivo при высокой концентрации дефензина в зоне воспаления.

Эксперименты показали, что HNP-1 в отсутствие дополнительной стимуляции ке способен индуцировать продукцию ФНО-а моноцитами человека in vitro.

Исследовали влияние HNP-1 в концентрации 10~'"-10-1 нэ продукцию ФНО-а моноцитами, стимулированными САК. Дефензин в концентрации 10 5-10 6М оказывал ингибирущее действие на продукцию ФНО-а, индуцированную САК. При добавлении в культуры моноцитов HNP-1 в более низких концентрациях (10~8- 10~9М), наблюдалось усиление способности коноцитов продуцировать ФНО-а о orat-r на активацию САК. Цитотоксическая активность культуральной соедн коноцитов, стинулировзшшх САК в присутствии Hí.'p-l, полное.'}..!) нейтрализовалась МКЛ 10FN против ФНО-a. Таким об; алом, ты исследований позволили предположить, что дефеиэииы, нисагЛом-деемы* из гранул нейтрофилов, могут усиливать локальную прщяг-

щю ФНО-а моноцитами " зоне воспаления. Ранее показано (Territo et al., 1989), что в концентрации 10-8-10-9М дефензины HNP-1 и ШР-2 обладают максимальной хемотаксической активностью по отношению к макрофагам.

Эксперименты показали, что способность HNP-1 ( 10~S~10~9'M) усиливать продукцию ФНО-а моноцитами, стимулированными САК, модулируется количеством сыворотки в кулътуральной среде и последовательностью добавления ЭТС, САК и дефензина в культуру моноцитов. Максимальное увеличение продукции ФНО-а, индуцированной СаК, наблюдалось при добавлении 0,1% ЭТС в культуральную среду после, получасовой бессывороточной инкубации моноцитов с САК и UNP-1. Вероятно, сывороточные белки, связываясь с HNP-1, могут ослаблять его действие на моноциты. Можно предположить та^же, что присутствие какого-то сывороточного фактора необходимо для стимуляции дефензином продукции ФНО-а.

Учитывая то, что дефензины могут связываться с клетками бактерий и выступать в качестве опсонинов (Fleisçhmarm et al., 1985), в нескольких экспериментах использовали для стимуляции моноцитов вместо суспензии САК растворимый активатор - ФМА. Как и в случае стимуляции моноцитов САК, продукция ФНО-а в культуре моноцитов, активированных ФМА (1 нг/мл), усиливалась под влиянием HNP-1 в концентрации 10-вМ.

Результаты проведенных исследований позволили сделать вывод о том, что дефензины могут не только участвовать в регуляции количества мононуклеарных фагоцитов в области воспаления, но и способны модулировать продукцию важнейшего воспалительного моно-кина - ФНО-а и, следовательно, могут служить медиаторами воспалительного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Продукция ФНО-а моноцитами крови человека, стимулированными in vitro бактериальным липополисахаридом, относительно резистентна к действию ингибиторов транскрипции, в то время как продукция лимфотоксина лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными ФГА, более чувствительна к действию ингибиторов транскрипции.

?.. Циркулирующие моноциты крови человека не содержат белка ФИО-«, продукция его активированными моноцитами является розуль-

ir>

татом синтеза белка de novo.

3. Моноциты, выдсленше из крови здоровых доноров методом фракционирования на градиенте плотности перколла, а также образцы цельной крови не содержат мРНК ФНО-а".

4. Продукция ФНО-а стимулированными моноцитами крови человека in vitro усиливается под действием дефензина нейтрофилсв человека HNP-1 в концентрации 10~8-10~9М. В концентрации

HNP-1 оказывает цитотоксическое действие на культуры моноцитов.

5. Метод разделения мононуклеаров периферической крови человека на преформированном градиенте плотности перколла позволяет получить неактивированные моноциты крови, которые можно использовать в качестве модели для изучения закономерностей синтеза мснокинов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Войтенок Н.Н., Мисуно Н.И. Закономерности синтеза фактора некроза опухолей макрофагами человека in vitro // Тез. докл. 4 съезда гематологов и трансфузиологов Белоруссии. - Минск,

1988. - С. 24-25.

2. Войтенок Н.Н., Мисуно Н.И., Колесникова Т.С., Нвнютнч А.В., Турецкая Р.Л. Регуляция синтеза фактора некроза опухолей в культуре моноцитов человека // ¡¡тоги науки и техники, Тем 26. Структура и функции иммунорегуляторных пептидов: Докл. a :п. Москва, 1988. - С. 129-135.

3. Voitenok 1J.N., Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Panyutich А.У. Studies on lymphotoxin and monokines synthesis by human peripheral blood mononuclear cells // Plzen. Lec. Sbcrn.

1989,- Suppl.57.- P. 79-31.

A. Voitenok N.N., Misuno N.I., Panyutich A.V., Xo2esnikova T.S. Induction of tumor necrosis factor synthesis in human вопо-cytes treated by transcriptional inhibitors // Immunology Letters.- 1939,- Vol. 20,- ?. 77-82.

5. Войтенок Н.Н., Мисуно H.И., Колесникова Т.С., Пакюгич А.В., Идельсон Г.Л. Молекулярные механизмы быстрого синтеза фактора некроза опухолей моноцитами человека под действие« Рл 1-термальных эндотонсиноа // Стресс и иммунитет: ''ез. дскл. Ись~ союзн. нонфер.- Ленинград, 1989,- с. 112-113.

6. Voitenok N.H. , Misuno N.I.. Panyutich A.V., 'ЛоШ.'-'Л^я

T.S., Idelson G.L., Sudarikov A.B. Endotoxin induced production of tumor necrosis-factor (TNF) by huaan monocytes is the result of de novo TNF synthesis // Abstr. Intern. Symp. Molec. Biol. Hematopoiesis. Leukemia Research.-'1989,- Vol. 13,- P. 17.

7. Voitenok N.N., Misuno N.I., Kolesnikova T.S. , PanyuUch A.V., Idelson G.L., Sudarikov A.B. Mechanism of tumour necrosis factor (TNF) production expression by human monocytes // Abstr. 7 Intern. Congr. Immunol.- 1939.- P. 306.

8. Войтенок H.H., Мисуно H,И., Колесникова Т.С., Турецкая Р.Л. Регуляция синтеза фактора некроза опухолей в культуре моноцитов человека // Тез. докл. I Всес. иммунол. съезда,- Москва, 1989.- С. 28.

9. Voitenok N.. Misuno N.. Kolesnikova Т., Panyutich А., Sudarikov A., Idelson G., Osipovich 0. The synthesis of tumor necrosis factor by human monocytes in vitro // Abstr. Second Intern. Workshop on Cytokines. Cytokine.- 1989,- Vol.1.- P. 79.

10. Voitenok N.N., Misuno M.I,, Kolesnikova»T.S., Osipovich O.A., Sudarikov A.B., Idelson G.L., Panyutich A.V. Induction of tumor necrosis factor' synthesis by hu.nan blood monocytes in vitro // Molecular Factors of Hematopoiesis and Stem Cell: Abstr. Symp.- Moscow, 1990,- P. 40.

11. Voitenok N., Misuno N., Kolesnikova Т., Panyutich A., Sudarikov A., Idelson G., Osipovich 0. Tumor Necrosis Factor Synthesis by Human Monocytes in vitro // Abstr. Eur. Federat. Inraun.Societi.es 10th Meeting.- Edinburg, 1990,- 3-45.

12. Misuno N.I'., Kolesnikova T.S., Voitenok N.N., Ganz Т., Selsted M.E., Lehrer R.I. Enhanced production of tumor necrosis factor (TNF) by human monocytes exposed to human defensin HNP-1 // Abstr. Eur. Federat. Immun. Societies 10th Meeting.- Edinburg, 1990.- 10-11.

13. Misuno N.I., Osipovich O.A., Sudarikov A.B., Idelson G.L. , Kolesnikova T.S., Panyutich A.V., Voitenok N.N. TNF-or indu ction in Human monocytes // Cytokine.- 1990,- Vol. 2.- P.464-470

14. Мнсуно Н.И., Колесникова Т.С., Войтенок H.H., Ганц Т., Сслс'гед W-.E., J!epcp Р.И. Влияние дефензина НМР-1 на продукцию фактора некроза опухолей в культуре менонитов человека // Тез. докл. I Иммунологического съезда Белоруссии,- Минск,1990,- С.15.

15. Осипович O.A., Мисуно Н.И., Колесникова Т.С., Судариков

A.B., Идельссн ГЛ., Пойтенок H.H. Циркулирующие моноциты не содержат префс-рмировашшх мРНК и белка фактора некроза опухолей // Тез. докл. I Иммунологического съезда Белоруссии,- Минск,

1990.- С. 17.

16. Мисуно Н.И., Осипович O.A., Идельсон Г.Л., Судариков А.Б., Колесникова Т.С., Панвтич А.З., Войтенок H.H. Синтез фактора некроза опухолей-а (ФНО-а) моноцитами человека in vitro // Бюлл. эксп. биол. мед.- 1991,- N9,- С. 287-289.

17. Войтенок H.H., Колесникова Т.С., Мисуно H.H., Осипович O.A., Панютич A.B., Судариков А.Б. Регуляция фактора некроза опу холей-а в моноцитах крови человека //Тез. докл. III Всес. съезда гематологов и транс^/зиологов.- Москва, 1991.- С. 359-360.

13. Мисуно Н.И., Колесникова Т.С., Войтенок H.H., Ганц Т., Селстед М.Е., Лерер Р.И. Влияние дефензина HNP-1 на продукцию фактора некроза опухолей моноцитами человека in vitro // Тез. докл. III Всес. съезда гематологов и трансфузиологоа.- Москва,

1991,- С. 367.

19. Misuno N.I., Kolesnikova T.S., Ganz Т., Lehrer R.I., Voitenok N.N. Stimulation of tumour necrosis factor synthesis in human monocyte culture by granulocyte defensin HNP-l // AbJtr. Intern. Confer. Med. Biotachnol. imnunizat. AIDS.- Leningrad, 1991,- S8-10.

20. Osipovich O.A., Misuno N.T., Kolesnikova T.S., receding K.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. The influence of cycloheximide on TNF-a gene transcription in human blood monocytes activated in vitro // Ab3tr. Intern. Confer. Med. Bio technol. Imraunizat. AIDS.- Leningrad, 1у91.~ P5-12. .

21. Osipovich O.A., Misuno N.I., Kolesnikova T.3., receding S.V., Savostin I.K., Sudarikov A.B., Voitenok N.N. Cyclohexinida dependence of TN'F-a gene transcription in activated яишап шопо eytes // Absfcr. Second Intern. Symp. Molerul. Biol. Hematopoi-esis. Intern. J. Cell Cloning.- 1991 - Vol. 9,- No 4,- P. 330.

22. Положительное решение Госком. изобр. о выдаче A.C. по заявке N4914619/13(008663) от 30 мая 1991г. Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus Musculus L., используемый для получения моноклональшх антител к рекомбинактному я-фь'итору некроза опухолей человека, авт. Ивдловскгя Е.А., Панютич A.B., Лкх Л.Д., Петевка Н.В... Войтинок H.H., Мисуно H.H., Колесникова Т.С,