Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фактора некроза опухоли альфа на индукцию сфингомиелинового цикла в мозге животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рожнова, Ульяна Александровна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им.Н.М.ЭМАНУЭЛЯ

На правах рукописи

РОЖНОВА Ульяна Александровна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА НА ИНДУКЦИЮ СФИНГОМИЕЛИНОВОГО ЦИКЛА В МОЗГЕ ЖИВОТНЫХ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00.02 - Биофизика 03.00.04 - Биохимия

Научные руководители :

доктор биологических наук, профессор Алесенко A.B.

доктор биологических наук, профессор Гуляева Н.В.

Москва 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................6

Глава 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................12

1. ФНО-а в центральной нервной системе........................................12

1.1. Биохимическая характеристика ФНО-а......................................12

1.2. Действие ФНО-а на клетки ЦНС................................................15

1.2.1. Действие ФНО-а на нейроны..................................................15

1.2.2. Действие ФНО-а на клетки глии..............................................18

1.2.2.1. Действие ФНО-а на олигодендродиты.................................18

1.2.2.2. Действие ФНО-а на астро- и микроглию.............................19

1.2.2.3. Действие ФНО-а на эпендимные клетки..............................21

1.1. Синтез ФНО-а и его рецепторов в ЦНС.....................................22

1.3.1. Рецепторы ФНО-а в клетках ЦНС...........................................22

1.3.2. Синтез ФНО-а в клетках ЦНС.................................................24

1.4. Модели, используемые для исследования действия ФНО-а в ЦНС in vivo...................................................................................26

1.5. Роль ФНО-а в демиелинизирующих заболеваниях..................28

1.6. Пострецепторные механизмы действия ФНО-а в клетках ЦНС............................................................................30

1.6.1. Роль белков, ассоциированных с рецепторами ФНО-а..........30

1.6.2. Участие протеинкиназ в передаче сигнала ФНО-а................31

1.6.3. Участие транскрипционных факторов....................................32

1.6.4. Оксид азота и NO-синтаза в проведении сигнала ФНО-а......34

1.6.5. Участие фосфолипаз в проведении сигнала ФНО-а...............35

1.7. Сфингомиелиновый цикл при действии ФНО-а в клетках

ЦНС.....................................................................................37

1.8. Апоптоз, индуцированный ФНО-а в клетках ЦНС..................44

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ................................................47

2.1. Реактивы.........................................................................................47

2.2. Модели действия ФНО-а in vivo...................................................47

2.3. Препаративные методы.................................................................48

2.4. Аналитические методы..................................................................49

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ....................................................................54

3.1. Изменение сфингомиелиназной активности при действии ФНО-а и его мутантов в мозге и печени мышей............................54

3.2. Исследование параметров сфингомиелинового цикла при действии ФНО-а в разных отделах мозга (в коре больших полушарий, гиппокампе и мозжечке) крыс....................................60

3.2.1. Изменения активности сфингомиелиназы при действии

ФНО-а в разных отделах мозга...........................................................60

3.2.2. Изменения содержания сфингомиелина и церамида при действии ФНО-а в разных отделах мозга крыс..............................62

3.3. Изменения содержания общих и индивидуальных фосфолипидов при действии ФНО-а в разных отделах мозга......65

3.4. Изменения содержания холестерина при действии ФНО-а в разных отделах мозга.......................................................................67

3.5. Изменение содержания продуктов перекисного окисления липидов в разных отделах мозга при действии ФНО-а..................75

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................................80

ВЫВОДЫ.............................................................................................94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................96

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ МАРК - митоген-активированные протеинкиназы БАРК - стресс-активированные протеинкиназы ГМ-КСФ - гранулоцит/моноцит - колониестимулирующий фактор ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ИЛ - интерлейкин ИНФ - интерферон ЛПС - липополисахарид

М-КСФ - моноцит-колониестимулирующий фактор

ОЛ - общие липиды

ПК С - протеинкиназа С

СФМ - сфингомиелин

СФМаза - сфингомиелиназа

ТФРр (ТСР-Р) - трансформирующий фактор роста бета ФИ - фосфатидилинозит ФЛ - фосфолипиды

ФЛ С, ФЛ А2, ФЛ Б - фосфолипазы С, А2, Б

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ФРН - фактор роста нейронов

ХЛ - холестерин

цер - церамид

ЦНС - центральная нервная система

ВВЕДЕНИЕ

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а) - полипептид с молекулярной массой 17 Ша, один из провоспалительных цитокинов с ярко выраженным цитотоксическим действием, играет значительную роль в развитии воспалительных и иммунных заболеваний (62), в том числе и заболеваний ЦНС (болезни Альцгеймера, Паркинсона, рассеянный склероз и др.) (147). В ЦНС при действии ФНО-а происходит активация и пролиферация астро- и микроглии, приводящая к глиозу и расширению цитокинового каскада (72). ФНО-а оказывает также и токсическое действие на олигодендроциты, вызывая гибель этих клеток путем апоптоза, что может приводить к процессам демиелинизации (164). При действии ФНО-а на нервные клетки, в зависимости от условий эксперимента, может оказывать как защитное, так и цитотоксическое влияние (96, 210). Т.о. характер действия ФНО-а определяется типом клетки ЦНС.

Передача сигнала ФНО-а в клетках ЦНС реализуется через активацию каскада протеинкиназ (19), активацию транскрипционного фактора ЫР-кВ, экспрессию ]ЧО-синтазы и генерацию N0 (143) и активацию фосфолипаз С, А2 и сфингомиелиназы (СФМазы) (116, 192). Особый интерес исследователей обращен к сфингомиелиновому циклу, поскольку сфингомиелин и продукты его гидролиза - церамид и сфингозин - являются не только существенными компонентами мембран клеток ЦНС, но и играют большую роль в развитии и жизнедеятельности нервных клеток (9).

Ключевым ферментом сфингомиелинового цикла является СФМаза, гидролизующая сфингомиелин с образованием церамида, который, в свою очередь, может превращаться в сфингозин при участии церамидазы. Было показано, что, с одной стороны, активация нейтральной СФМазы, наблюдаемая при действии ФНО-а на культуры клеток олигодендроглии и астроцитов, приводит к накоплению церамида (192), а с другой стороны, церамид способен индуцировать апоптическую гибель нейронов и олигодендроцитов взрослых организмов и астроцитов эмбрионов (66). Сфингозин, продукт гидролиза церамида, также оказывает негативное влияние на морфологию и функции нейритов культивируемых симпатических нейронов крыс (9).

В литературе имеются сведения о взаимосвязи сфингомиелинового цикла и метаболизма холестерина (XJI). Так, обработка фибробластов сфингомиелиназой приводит к увеличению образования эфиров XJI, уменьшению биосинтеза XJI, снижает чувствительность клеточного ХЛ к окислению холестерин оксидазой, а также влияет на стероидогенез (44, 170). ХЛ, в свою очередь, влияет на различные элементы сфингомиелинового цикла: активность СФМазы, а также скорость синтеза сфингомиелина повышаются при увеличении содержания ХЛ в мембране (78, 127). При этом очень мало данных о взаимосвязи сфингомиелинового цикла и метаболизма холестерина при действии ФНО-а в клетках ЦНС.

Одним из механизмов токсического действия ФНО-а является генерация активных форм кислорода (62). С другой стороны, было показано, что сфингомиелиновый цикл взаимосвязан с регуляцией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Например, известно, церамид, генерируемый при действии ФНО-а на нейроны, индуцирует экспрессию Mn-зависимой супероксиддисмутазы (144). С другой

стороны, изменения содержания глутатиона, вызванные ФНО-а, влияют на активность СФМазы (192). В связи с этим перспективным является направление исследований взаимосвязи окислительных процессов, вызванных ФНО-а, и активации сфингомиелинового цикла.

В последние годы значительно увеличилось число работ, посвященных исследованиям действия ФНО-а в ЦНС, однако в литературе фактически отсутствуют данные о роли продуктов сфингомиелинового цикла в рализации действия ФНО-а в мозге животных in vivo, хотя исследования этого вопроса могут быть актуальными для понимания развития заболеваний ЦНС, связанных с экспрессией ФНО-а в клетках мозга. До сих пор не изучена комплексная проблема взаимосвязи сфингомиелинового цикла с метаболизмом XJI и окислительными процессами при действии ФНО-а не только в клетках ЦНС, но и в других типах клеток. Исследования, проведенные в этом направлении, позволят определить новый тип терапевтических агентов, действующих на эти три метаболические пути одновременно.

Целью настоящей работы являлось исследование роли сфингомиелинового пути передачи сигнала ФНО-а в мозге животных in vivo. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить влияние ФНО-а и его мутантов на активность ключевого фермента сфингомиелинового цикла - СФМазы - в мозге и печени животных в течение 24 ч после внутрибрюшинного введения ФНО-а.

2. Исследовать активность сфингомиелинового цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) ФНО-а в разных отделах мозга животных (коры больших полушарий, мозжечка и гиппокампа) на ранних сроках (до 5 ч) действия ФНО-а.

3. Выявить возможную взаимосвязь между действием ФНО-а на состав липидов (содержание ХЛ, общих и индивидуальных фосфолипидов) и активацией сфингомиелинового цикла в разных отделах мозга (коры больших полушарий, мозжечка и гиппокампа) животных на протяжении 5 ч после внутрибрюшинного введения ФНО-а.

4. Исследовать взаимосвязь образования продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов) с активацией СФМазы в разных отделах мозга (коры больших полушарий, мозжечка и гиппокампа) при действии ФНО-а.

В данной работе впервые исследовано влияние ФНО-а на активность сфингомиелинового цикла в мозге животных in vivo.

Впервые проведено сравнение активность нейтральной СФМазы, ключевого фермента сфингомиелинового цикла, в мозге и печени животных при действии ФНО-а. Показано, что ФНО-а в мозге вызывает активацию СФМазы более интенсивную и на более ранних сроках, чем в печени.

Впервые показано, что разные отделы мозга (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) обладают специфичностью по отношению к активации сфингомиелинового цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) на ранних сроках (до 5 ч) действия ФНО-а, причем максимальная активация сфингомиелинового цикла при действии ФНО-а проявляется в гиппокампе.

Показано, что при действии ФНО-а во всех исследуемых структурах мозга происходит накопление ХЛ через 1 ч после введения ФНО-а. В течение первого часа после введения ФНО-а наблюдается синхронное изменение содержания сфингомиелина и ХЛ, затем

содержание ХЛ изменяется на фоне стабильного содержания сфингомиелина.

Впервые показано, что введение животным ФНО-а индуцирует в мозге процессы ПОЛ, интесивность которых различается в исследованных отделах мозга. Максимальное накопление продуктов ПОЛ наблюдается в мозжечке в течение 2 часов после инъекции ФНО-а. В начальный период действия ФНО-а увеличение продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в гиппокампе и мозжечке.

Результаты проведенных исследований имеют важное значение для понимания роли сфингомиелинового цикла в механизме передачи сигнала ФНО-а в клетках мозга. Данные об участии ФНО-а в заболеваниях ЦНС ставят вопрос о роли этого цитокина в развитии патологических процессов и механизмах его действия в ЦНС, а также о новых способах создания лекарственных препаратов. Знание индуцируемых ФНО-а механизмов передачи внутриклеточных сигналов и роли в этих процессах продуктов сфингомиелинового цикла, позволит применять новые стратегии лечения таких заболеваний как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и др.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Введение рекомбинантного ФНО-а и его мутантов вызывает в мозге более интенсивную активацию СФМазы и на более ранних сроках, чем в печени.

2. Кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп животных обладают разной чувствительностью к действию ФНО-а в отношении активации сфингомиелинового цикла. Наиболее выраженная активация сфингомиелинового цикла при действии ФНО-а проявляется в гиппокампе.

3. ФНО-а инициирует накопление в мозге ХЛ, изменения содержания которого на ранних сроках ответа происходят синхронно с изменением содержания сфингомиелина.

4. ФНО-а инициирует в мозге накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов), наиболее интенсивно происходящее в мозжечке. В начальный период действия ФНО-а увеличение содержание продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в гиппокампе и мозжечке.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Фактор некроза опухоли альфа в центральной нервной системе. 1.1. Биохимическая характеристика ФНО-а.

Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а) - полипептид, относящийся к семейству цитокинов, который продуцируется в организме, главным образом, макрофагами и моноцитами, и в меньшей степени многими другими типами клеток, включая Т-, B-лимфоциты и фибробласты (26, 62, 157, 185). Кроме нормальных клеток ФНО-а может продуцироваться некоторыми линиями опухолевых клеток.

ФНО-а экспрессируется в виде предшественника с молекулярной массой 26 kDa, который является трансмембранным интегральным белком. В результате его протеолитического расщепления образуется зрелый белок массой 17 kDa. Функционально активный белок образует тример, который может оставаться либо мембраносвязанным, либо свободным. Каждая субъединица тримера имеет специфические места связывания друг с другом, что позволяет нативному тримеру иметь форму, характерную для вирусных белков (104, 194).

Синтез ФНО-а регулируется большим количеством внешних факторов, среди которых - эндотоксин грамотрицательных бактерий, липополисахариды грам-положительных и грамотрицательных бактерий, грибы, вирусы, цитокины, митогены, активаторы протеинкиназы С и другие (11, 81, 128).

Ингибиторы синтеза ФНО-а также представлены широким классом соединений. К ним относятся циклоспорин А, эстрадиол и прогестерон, пентоксифиллин, интерлейкины 4 и 6, простагландин Ег, гистамин, этанол, некоторые ганглиозиды и др. (116, 209).

Первоначально интерес к изучению свойств ФНО-а был вызван его способностью вызывать геморрагический некроз некоторых типов опухолей in vivo, а также токсическим действием на опухолевые клетки in vitro (12, 112). В настоящее время показано, что ФНО-а участвует в проведении иммунного клеточного ответа, влияет на пролиферацию, рост и дифференцировку клеток, а также способен индуцировать клеточную гибель путем как некроза, так и апоптоза (11, 27, 62, 74, 208).

Действие ФНО-а на любой вид клеток осуществляется через активацию рецепторов двух типов: рецептор типа 1 - 55kDa, р55 или ФНО-Rl, и рецептор типа 2 - 75kDa, р75 или ФНО-112, которые обнаружены на поверхности фактически всех типов клеток, за исключением эритроцитов и стволовых клеток (177), при этом считается, что большинство из известных форм клеточного ответа на действие ФНО-а осуществляется через рецептор типа 1 (р55). Рецепторы связаны с мультиэффекторной системой, в которую входят сфингомиелиновый путь (113) и путь, включающий комплекс связанных с рецептором белков (37, 191). Связывание ФНО-а с рецептором приводит в клетке к активации фосфолипаз, протеинкиназ, сфингомиелиназ, индукции фактора транскрипции NF-kB, а также активации NO-синтазы (NOS) (195) и развитию окислительного стресса, в результате чего клетки могут пролиферировать, дифференцировать или, наоборот, прекращать рост и/или входить в апоптоз в зависимости от типа и статуса клетки.

В последнее время большое внимание исследователей направлено на действие ФНО-а и других цитокинов в центральной нервной системе, где им отводят решающую роль как в нормальном развитии мозга, так и при патологических процессах (147).

Долгое время считалось, что гематоэнцефалический барьер непроницаем для таких крупных полипептидов, какими являются

цитокины. Однако оказалось, что при некоторых патологических состояниях через гематоэнцефалический барьер могут проникать не только полипептиды, но и даже целые, клетки - макрофаги и лимфоциты. Для ФНО-а, как и для некоторых других цитокинов (ИЛ-1 и ИЛ-2) с помощью радиоактивной метки было показано, что они способны проникать через гематоэнцефалический барьер даже в норме. Более значительным источником цитокинов в ЦНС являются периферические клетки крови, которые проникают в мозг после какого-либо воздействия (начала воспалительного процесса, повреждения гематоэнцефалического барьера и др.). Моноциты, активированные макрофаги и Т-клетки, инфильтрировавшие в ЦНС, являются источником ФНО-а и других цитокинов и могут активно существовать в мозге достаточно долго: макрофаги могут составлять около 10% от общей глиальной популяции, активированные Т-клетки, специфически реагируя с системными антигенами ЦНС, остаются в мозге в течение нескольких дней. Эти клетки продуцируют цитокины, такие как ФНО-а, ИЛ-1 и ИЛ-6 (208), которые могут стимулировать гли