Характер изменения активности сфингомиелиназы в условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов в печени животных

Цюпко, Алла Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характер изменения активности сфингомиелиназы в условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов в печени животных
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Характер изменения активности сфингомиелиназы в условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов в печени животных"

На правах рукописи

Цюпко Алла Николаевна

ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТИ СФИНГОМИЕЛИНАЗЫ В УСЛОВИЯХ ИНГИБИРОВАНИЯ И АКТИВАЦИИ ПЕРОКСИДНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ В ПЕЧЕНИ ЖИВОТНЫХ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Алесенко Алиса Владимировна

доктор медицинских наук Ахаладзе Гурам Германович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Дятловицкая Элла Вольфовна

доктор биологических наук Каламкаров Григорий Рафаэлевич

Ведущая организация НИИ физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского МГУ

Заплта состоится «1С » СРеЬрол.х 2006 года в */•/ часов на заседании Диссертационного совета Д 002.639.01 при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Косыгина, д.4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова РАН.

Автореферат разослан «Д» декабря 2005 г.

Учечый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

М.А.Смотряева

goo£fl Ш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAIïOTbl

Актуальность работы. Сфингомиелиназа (СФМаза) является ключе е ым ферментом сфингомиелинового цикла. Она гидролизу ет фосфоэфирную се язь сфингомиелина с образованием церамида и фосфохолиьа.

Существующая в настоящее время гипотеза о сфингомиелиновом цикле как пути передачи сигнала с помощью липидных вторичных мессенджеро î заключается в том, что внеклеточные агенты, связывая« со своими рецепторами на поверхности мембран, активируют СФМазу, которая катализирует гидролиз сфингомиелина и накопление церамида и сфингозина. Последние, воздействуя на внутриклеточные мишени, вызывают клеточный ответ.

В последние годы появляется все больше фактов, свидетельствующих о пересечении сигнальных систем сфингомиелинового (СФМ) цикла и окислительных процессов, происходящих в клетке при развитии окислительного стресса. Обе эти системы являются генераторами вторичны* посредников, передающих внеклеточные сигналы с цитоплазматической мембраны в ядро, модулирующих физиологическое состояние клеток и влияющих на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Ряд факторов, способных индуцировать окислительный стресс, в то же время активируют СФМ цикл. Многие антиоксидаиты ингибируюг производство активных форм кислорода (АФК) в клетках, и некоторые из них проявляют инактивирующее действие в отношении сфингомисли-назы.

Высокие концентрации продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) и активных форм кислорода в клетке обладают выраженным повреждающим действием и вызывают не только нарушение структуры биологических мембран, ю и изменение активности мембраносвязанных ферментов. Однако данных о связи активности мембраносвязанной изоформы СФМазы с уровнем реакций ПОЛ мембран in vivo в литературе нами не обнаружено.

Участие таких природных антиоксидантов как гпутатион (ГЛ) и билирубин (БР) в процессах пероксидного окисления липидон в настоящее время /же является вполне определенным, а вот сведения о том, что глутатион способен оказывать влияние на активность СФМазы были получены in vitro сравнительно недавно [Liu В., Hannun Y.A., 1997; Lui В. et al, 1998; Lui В. et al, 1998b], Однако in vivo связи между содержанием глутатиона и активностью СФМазы жнут быть значительно более сложными. Влияние природного антиоксиданта билирубина на активность сфингомиелиназы вообще не исследовалось, а между тем, имеются данные, что он способен при взаимодействии с клеточной поверно-стью избирательно связываться со сфинголипидами мембран, в частности со сфингомиепином - субстратом СФМазы [Nagaoka, Cowger, 1978; Vazquez et al., 1988; Yang et al., 1991]. Вполне вероятно, что такое взаимодействие может оказывать влитие на активность данного фермента.

В настоящей работе активность сфингомиелиназы была изучена нами в условиях ингибирования процесса пероксидного окисления липидов природными антиоксидантами: глутатионом и билиру

В то же время уровень пероксидного окисления липидов возможно также регулировать воздействием на организм животного различными токсическими агентами и моделированием заболеваний, связанных с интенсификацией ПОЛ. В качестве моделей, при которых происходит активация процессов ПОЛ, мы использовали модель токсического поражения печени гепатотоксином а-нафтилизотиоцианатом и модель нарушения желчетока, создаваемую путем перевязки общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи у животных.

Гибель клеток печени при действии а-нафтилизотиоцианата и при нарушении желчетока преимущественно происходит по механизму апоптоза, индуцированному продуктами пероксидного окисления липидов. Однако изменение активности СФМазы под влиянием данных факторов до настоящего времени не изучалось.

Также в настоящей работе было исследовано влияние природного церами-да - продукта гидролиза сфингомиелина - на интенсивность процесса ПОЛ in vivo. В литературе имеются сведения об экспериментах, выполненных на клеточных культурах с использованием синтетического аналога церамида с укороченной жирнокислотной цепью, который может быть для клетки гораздо более токсичным, чем природный аналог.

Таким образом, данное исследование дает представление об изменении активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла - СФМазы в результате ингибирования пероксидного окисления липидов природными антиоксидан-тами и интенсификации данных процессов вследствие токсического поражения печени и нарушения желчетока, и может указывать на пересечение сигнальных систем СФМ цикла и окислительно-восстановительной системы при развитии различных патологий. Результаты работы могут быть полезными для понимания патогенеза и разработки новых метод эв терапии ряда распространенных заболеваний, а также способствовать создан яю новых лекарственных средств из класса антиоксидантов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение характера изменения активности нейтральной сфингомиелиназы в печени животных в условиях ингибирования процесса пероксидного окисления липидов природными антиоксидантами и в условиях повышения содержания продуктов ПОЛ при развитии в печени процессов, сопровождающихся гибелью гепатоци-тов.

Для достижения намеченной цели исследования в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определение изменения активности СФМазы в печени животных при действии восстановленного и окисленного глутатиона и билирубина. Сравнение характера изменений активности СФМазы и интенсивности процесса пероксидного окисления липидов (уровня диеновых конъюгатов и диенкетонов) in vivo при действии глутатиона и билирубин а.

2. Исследование влияния церамида - продукта гидролиза сфингомиелина

сфингомиелиназой - на интенсивность процгсса ПОЛ в печени мышей.

3. Определение изменения активности СФМазы в печени животных при действии гепатотоксина а-нафтилизотиоцианата (АНИТ). Сравнение характера изменений активности СФМазы и содержания диеновых конъюгатов и диенке-тонов in vivo при действии АНИТ.

4. Определение изменения активности СФМазы, уровня ФНО-а и продуктов пероксидного окисления липидов в печени животных при перевязке общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи и сравнение характера изменений исследуемых параметров.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В условиях ингибирования пероксидного окисления липидов природными антиоксидантами: восстановленным гпутатионом и билирубином - активность сфингомиелиназы снижается.

2. При действии окисленного глутатиона и гепатотоксина а-нафтилизотиоцианата происходит увеличение активности исследуемого фермента и интенсивности процесса ПОЛ.

3. При перевязке общего желчного протока изменение активности сфингомиелиназы носит двухфазный характер: уменьшается на ранних сроках нарушения желчетока и увеличивается на более поздних сроках развития заболевания. Изменения уровня ФНО-а и содержания продуктов пероксидного окисления липидов (диеновых конъюгатов и диенкетонов) повторяют характер изменения активности СФМазы.

4. При действии церамида - продукт« гидролиза сфингомиелина сфинго-миелиназой - происходит интенсификация процесса пероксидного окисления липидов.

5. В условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов изменения активности сфингомиелиназы и интенсивности ПОЛ происходят однонаправленно. Природные антиоксиданты глутатион и билирубин могут не только защищать липиды клеточных мембран от пероксидного окисления, но и, воздействуя на активность СФМазы, оказы вать влияние на важнейшие клеточные процессы, находящиеся под влиянием сфингомиелинового цикла.

Научная новизна. Впервые проведено исследование изменения активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла нейтральной СФМазы in vivo в условиях активации и ингибирования процесса пероксидного окисления липидов.

Изучен характер влияния глутатионг; в окисленной и восстановленной форме и билирубина на активность СФМазы при внутрибрюшинном введении их подопытным животным. Установлено, что восстановленный глутатион и билирубин обладают ингибирующим действием на фермент, а окисленный глутатион - активирующим.

Исследовано влияние гепатотоксина а-нафтилизотиоцианата (АНИТ) на активность сфингомиелиназы in vivo. Установлено, что АНИТ активирует СФМазу.

Впервые проведено исследование изменения активности СФМазы, уровня ФНО-а и продуктов ПОЛ при перевязке общего желчного протока с последующим восстановлением отгока желчи у подопытных животных. Обнаружен двухфазный характер изменения исследованных показателей: снижение на ранних сроках перевязки и повышение на более поздних сроках развития заболевания.

Впервые исследовано действие природного церамида in vivo. Установлено, что ЦЕР способен активировать процесс пероксидного окисления лшщцов.

Установлена однонаправленность изменения активности СФМазы и содержания продуктов ПОЛ, выявлена коррелятивная взаимосвязь между данными параметрами.

Научно-практическая значимость. Результаты исследования имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания механизмов регуляции дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток с помощью сигнал з той системы сфингомиелинового цикла. Выявленная нами коррелятивная взаимосвязь между активностью сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов может свидетельствовать о возможности вли?ния на клеточные процессы, находящиеся под влиянием системы СФМ цикла, путем воздействия на процесс пероксидного окисления липидов. В частности, активаторы и ингибиторы процесса ПОЛ могут оказывать существенное влитие на эффективность противораковой терапии (направленной на индукцию ano тгоза клеток опухоли).

Полученные данные при действии а-нафтилизотиоцианата свидетельствуют с возможности использования ингибиторов активности СФМазы и ПОЛ в качестве протекторов от действия ряда токсикантов, вызывающих гибель клеток печгни.

Предложен новый механизм развития желчно-каменной болезни, заключающийся в активации проапоптотической системы сфингомиелинового цикла и экспрессии провоспалительного цитокина ФНО-а. Полученные данные позволяют предположить новую диагностическую систему для определения тяжести заболевания, заключающуюся в детекции активности СФМазы и накопления ФНС>-а в крови больных, и применения для лечения ряда заболеваний препаратов нового поколения из класса ингибиторов сфингомиелиназы.

Таким образом, полученные нами данные могут быть использованы в медицине при разработке тактики лечения ряда заболеваний.

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских рабог Института в рамках гранта РФФИ № 02-04-48228, программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 13 печатных работах.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различны t Международных, Всесоюзных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: III Съезде биохимического общества, С.-Петербург, 2002; VI Межд. конф. «Биоантиоксидант», Москва, 2002г; II Ежегодн молод, конф. ИБХФ - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 2002г.; XTI Менделеевском съезде по обпей и прикладной химии, Казань, 2003; Intl. Congr. "Fortschritte in Gastroenterologie und Hepatologie 2001", Hannover, Germany, 2001; 42-44 ICBL Conf., Bergen, Norway, 2001, Vin Interl. Congr. on Phospholipids, Vienna, Austria, 2002; 25th World ISF Congr.; 3rd Euro Fed Lipid Congr., Edinburgh, Scotland, 2004.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 165 стр., вклэчая 35 рисунков, 16 таблиц и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», заключения, выводов, списка аббревиатур и библиографического указателя [305 источников, из них 289 опубликованы в зарубежных изданиях).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Объекты, материалы и методы исследования

Основным предметом исследования являлись фермент сфингомиелиназа и липиды, выделенные из органов животных.

Биофизические и биохимические методы. Сфингомиелиназную агтив-ность определяли в гомогенатах печени и сердца по методике [Hostetier, Yazaki, 1979] с использованием 12 мкМ [Ы-метил-иС] сфингомиелина. Радиоактивность определяли на счетчике «Delta» (Нидерланды).

Количественное определение белка проводили по методу [Lowry et al., 1951].

Липиды та гомогенатов органов животных, экстрагировали по методу [Bligh, Dyer, 1959], их количество определяли гравиметрически.

Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгапюв и диенкетонов. Спектры растворов липидов регистрировали в смеси метанол -гексан на спектрофотометре фирмы «Beckman» (США) [Стальная, Гаришнили, 1979].

Липидный состав изучали методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках фирмы «Merck» (Германия), с последующим ден-ситометрированием. Разделение фосфолипидов проводили в системе расп.ори-телей хлороформ-метанол-муравьиная кислота (65:25:4. v/v/v).

Идентификацию ФНО-а в печени проводили с помощью ECL-иммуноблсттинга, используя поликлональные антитела производства фирмы «Santa Cruz» (США). Белки гомогената печени разделяли электрофорезом в 13% ПААГ по методу [Laemmli, 1970]. В качестве контроля использовали рекои^би-

нантный ФНО-а мыши, полученный в лаборатории В.Г. Коробко в Институте биоорганической химии РАН.

Работа с животными. В рабе те использовали мышей линии Balb/c и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.

Мышам линии Balb/c вводили внутрибрюшинно глутатион в окисленной и восстановленной формах в дозе 18 мг/мышь (720 мг/кг) и билирубин в дозе 1,25 мг/мышь (50 мг/кг). Контрольным животным вводили Tris-HCl буфер. Це-рамид растворяли в 5% растворе этанола и вводили животным внутрибрюшинно в дозах 50 мкг/мышь (2 мг/кг веса) и 100 мкг/мышь (4 мг/кг веса), в качестве контроля использовали 5% раствор этанола. а-Нафтилизотиоцианат, растворенный в 1% водном растворе твин-80, вводили внутрибрюшинно в дозе 3 мг/мышь (120 мг/кг), в качестве контроля использовали 1% водный раствор твин-80. Исследования проводили на печени мышей.

Нарушение желчетока вызывали у крыс линии Wistar с помощью перевязки участка общего желчного протока с предварительным введением в него полиэтиленового катетера с запаяным концом. Время холестаза составляло 3-18 суток. Последующее восстановление оттока желчи осуществляли дренированием (декомпрессией) желчевыводяхцях путей путём отсечения кончика катетера. Исследования проводили на печени крыс, в качестве контроля использовали печень интактных и ложнооперированных животных.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при Р й 0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеарифметические ошибки.

2. Исследование изменения активности нейтральной сфингомиелиназы и интенсивности процесса пероксидного окисления липидов в печени мышей при действии глутатиона в окисленной и восстановленной формах

2.1. Влияние восстановленного и окисленного глутатиона на активность нейтральной сфингомиелиназы и содержание сфингомиелина в печени мышей

В экспериментах in vitro было установлено ингибирующее действие восстановленного глутатиона на активность нейтральной сфингомиелиназы, однако в литературе нет данных о том, сохраняется ли его влияние на активность данного фермента в организме животного, где пути метаболизма глутатиона могут быть гораздо более сложными.

В результате проведенного исследования нами было установлено, что через 15 мин после внутрибрюшинног'о введения восстановленного глутатиона активность сфингомиелиназы в печени мышей резко падала, уменьшаясь в 1,7 раза по сравнению с контролем (рис.1 А). Через 30 мин уровень активности СФМазы б

был все еще сильно снижен, и только через 1 ч его значение достигало контрольных показателей и сохранялось на этчж уровне в течение последующих 2 ч эксперимента.

Изменение содержания сфингомиели» а - прямого субстрата сфингомие-линазы - под влиянием восстановленного глутатиона носило противоположный характер. В периоды резкого снижения активности сфингомиелиназы содержание сфингомиелина в печени мышей возраст ало в 1,8 раза, а к моменту нормализации активности фермента, уровень сфингомиелина снижался, достигая контрольных значений (рис.1 А, кривая 2).

При внутрибрюшинном введении мышам окисленного глутатиона наблюдалось кратковременное снижение активности сфингомиелиназы на 30% через 30 мин после инъекции (рис.1Б, кривая 1). В отличие от восстановленной формы, окисленный глутатион не оказывал действия на фермент через 15 мин и активировал его в 1,8 раза через 1 ч и в 1,6 раза после 2 ч воздействия.

Содержание сфингомиелина в результате действия окисленного глутатиона менялось в соответствии с изменением активности сфингомиелиназы, т.е. увеличивалось в тот момент, когда активность фермента падала (через 30 мин) и затем уменьшалось параллельно активации фермента (через 1 и 2 ч) (рисДБ, кривая 2).

А Б

60 90 120 150 180 ato Ю 80 120 150 16»

Время, мин Время, млн

Рис.1. Изменение активности сфингомиелиназы (имп/мин/мг белка, опыт/контроль) и содержания сфингомиелина (мг/мг липидов, опыт/контроль) в печени мышей при действии восстановленного глутатиона (А) и отделенного глутатиона (Б) в дозе 720 мг/кг: 1 - активность сфингомиелиназы, 2 - содержание сфингомиелина.

2.2. Влияние восстановленного и окисленного глутатиона на содержание диеновых конъюгатов и диенкетонов в печени мышей

Обладая аитиоксидантными свойствами, восстановленный глутатион вызывал снижение уровня продуктов пероксидного окисления липидов в печени мышей (рис.2А). В течение 2 ч содержание диеновых конъюгатов и диенкетонов изменялось синхронно, и их уровень за весь изученный период сохранялся ниже нормы, т.е. восстановленный глутатион подавлял интенсивность процесса ПОЛ, протекающего в нормальных клетках печени. Эти результаты находятся в пол-

ном согласии с данными, полученными для клеточных культур [Lui В.et al, 1998b].

При действии окисленного глутатиона снижение содержания диеновых контюгатов и диенкетонов в печени мышей в 1,2 и 1,3 раза соответственно по сравнению с контрольными показателями было отмечено только через 30 мин. после инъекции (рис.2Б), то есть в тот момент, когда наблюдалось снижение активно сти сфингомиелиназы.

А Б

60 90 120 150 180 Время, мин

Й 90 120 150 180

КЬ^мла ****** *

DpOHVT| МЛП

° л

"г

120 100 80 60 40 20

Y=23.4+1.0*X

• R=0.74, Р=0.0004 *

i-O-i у

s ....

Рис.!! Изменение содержания продуктов ПОЛ (нмоль/мг липидов, опыт/контроль) в печени мышей при действии восстановленного глутатиона (А) и окисленного глутатиона (Б): 1 - диеновые конъюгаты, 2 - диенкетоны.

Содержание диеновых конъюга-тов через 15 мин, 1 и 2 ч после введения окисленного глутатиона повышалось в ~1,5 раза по сравнению с контролем. Содержание диенкетонов в эти промежутки времени практически не отличалось от контрольных значений.

Следует отметить, что характер изменения содержания продуктов ПОЛ повторял характер изменения активности нейтральной сфингомиелиназы при действии как восстановленного, так и окисленного глутатиона. На рис. 3 продемонстрирована взаимосвязь между этими двумя параметрами с высокими коэффициентами линейной корреляции. 3. 10 сследование изменения активности нейтральной сфингомиелиназы и интенсивности процесса пероксидного окисления липидов в нечети и сердце мплшей при действии билирубина

20 40 60 80 Содержание д.конъюгатов, нмоль/мг пипидов

Рис.3. Взаимосвязь изменения активности СФМазы (имп/мин/мг белка) и содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъюга-тов, 1\голь/мг липидов) в печени мышей при действии восстановленного и окисленного глутатиона в дозе 720 мг/кг.

3.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени и серд-

це мышей при внутрибрюшинном введении билирубина Билирубин (БР), обладая антиоксидантными свойствами, возможно, подобно глутатиону, ингибирующему нейтральную сфингомиелиназу [Liu В , Han-nun Y.A., 1997], способен оказывать влияние на активность данного фермента. Однако воздействие БР может отличаться от действия других антиоксидантов, поскольку он способен образовывать комплексные соединения со сфингомиели-ном - субстратом сфингомиелиназы [Nagaoka S., Cowger M.L., 1978; Vazquez J. et al., 1988; Yang B.et al., 1991]. Вполне вероятно, что такое взаимодействиг может оказывать влияние на активность СФМазы. Однако данных о влиянии билирубина на интенсивность СФМ цикла в литературе нами обнаружено не бы j о.

В настоящей работе был изучен характер влияния билирубина на астив-ность нейтральной СФМазы в сердце и печени животных.

При внутрибрюшинном введении БР через 15 мин после инъекции активность СФМазы в сердце мышей пацала, уменьшаясь в 1,2 раза по сравнению с контролем (рис.4, кривая 1). Через ЗС мин уровень активности фермента снижался еще больше, в 1,4 раза, и только через 1 ч наблюдалась тенденция к его нормшиза-ции, однако и к этому времени даяные показатели не достигали контро.тьных значений.

В печени животных (рис.4, кривая 2) снижение активности СФМазы и 1,3 раза было отмечено через 30 мин г;осле введения БР. В остальное время эксперимента (в течение 1 ч) активность фермента находилась в пределах контрольных показателей.

3.2. Влияние билирубина на содержание продуктов пероксидного окисления

липидов в печени и сердце мышей При внутрибрюшинном введении мышам билирубина содержание продуктов пероксидного окисления липидов в сердце у животных резко снижалось: через 15 минут после инъекции БР в 1,7 раза по сравнению с контрольными животными для диеновых конъюгатов и в 1,4 раза для диенкетонов, а через 30 минут эксперимента в 1,7 и 1,5 раза соответственно (рис.5А). В дальнейшем юли-чество обоих продуктов ПОЛ увеличивалось, но, тем не менее, даже через 1 ч после начала эксперимента было ниже контрольных показателей в 1,3 раза.

Существенно иные закономерности изменения исследованных велччин выявлены в печени подопытных животных (рис.5Б). Через 15 мин после пиеде-ния билирубина в изменении уровня продуктов ПОЛ наблюдалась тенденция к повышению по сравнению с контрольными животными, а через 30 мин. отиоси-

15 30 45 Время, мин

Рис.4. Изменение активности СФМазы (имп/мин/мг белка, опыт/контроль) 1 -в сердце и 2 - в печени мышей при

тельное содержание диеновых коньюгатов и диенкетонов в печени (в отличие от сердца) превышало контрольные показатели в 1,2 раза. Увеличение уровня продуктов ПОЛ в данном случае может быть связано с непосредственным участием клеток печени в процессах выведения БР из организма. При нормальном его содержании в сыворотке крови печень переводит его в водорастворимую форму путем глюкуронизации, и далее с желчью он попадает в кишечник. Избыток билирубина может подвергаться окислению с помощью системы цитохрома Р-450. В работах [Cuypers et al., 1983; Josiii et al, 1995; Laer S. et al., 1997], посвященных исследованию микросомального окисления и конъюгации БР, было показано, что БР эффективно окисляется в системе НАДФН-зависимого ПОЛ. Таким образом, усиление пероксидного ошсления липидов при избыточном поступлении билирубина в печень может являться реакцией, направленной на снижение его уровня.

Через 1 ч после введения БР происходила нормализация содержания продуктов ПОЛ в печени мышей.

А Б

20 40 Время, мин

20 40 Время, МИН

Рис.5. Изменение содержания продуктов пероксидного окисления липидов (нмоль/мг липидов, опыт/контроль) в сердце (А) и печени (Б) мышей при действии билирубина в дозе 50 мг/кг. Кривая 1 - диеновые коныогаты; кривая 2 - диенкетоны.

В наших исследованиях характер изменения активности нейтральной СФМазы в сердце мышей при введении билирубина повторял характер изменения содержания продуктов ПОЛ. В печени животных подобная однонаправленность была отмечена через 15 и 60 мин. после инъекции, однако через 30 мин. после введения БР активность сфингомиелиназы снижалась в 1,3 раза по сравнению с контрольными значениями, а уровень продуктов ПОЛ, напротив, превышал эти показатели в 1,2 раза.

В данном случае снижение амивности СФМазы под действием билирубина может быть связано, помимо его антиоксидантных свойств, со способностью БР образовывать комплексные соединения со сфингомиелином - субстратом сфинго миелин азы, что может снижать доступность сфингомиелина для фермента и, таким образом, ингибировать активность СФМазы.

Повышение содержания продуктов ПОЛ в печени животных при внутри-брюшинном введении билирубина, как уже упоминалось, связано с непосредст-

венным участием клеток печени в процессах выведения билирубина из организма, в связи с чем усиление пероксидного окисления липидов при избыточном поступлении БР в печень может являться реакцией, направленной на снижение его уровня.

На рис.6 продемонстрирована корреляционная взаимосвязь между активностью СФМазы и содержанием продуктов ТОЛ в сердце и печени мышей при действии билирубина.

А Б

120

2 §100 0 о

1! во г! во

Печень

' Т'Г4 У= 17.1 + 1,14*

1 о-л о Л П—П м

_1_

Я=0,в1, Р=0,02

Диен.конъюгаты,нмоль/мг липидов

Рис.6, гатов,

(А1. и печени (Б) мышей пои действии БР в дозе 50 мг/ кг.

40 50 60 70 80 Диен.конъюгаты,нмоль/мг липидов

». Взаимосвязь изменения содержания продуктов ПОЛ (диеновых конъю-нмоль/мг липидов) и активности СФМазы (имп/мин/м

[/мг белка) в Сердце

4. Влияние церамвда на интенсивность пероксидного окисления липидов в

печени мышей.

Продукт гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой — церамид (ЦЕР) способен индуцировать гибель клеток по апоптотическому типу, вызывая меж-нуклеосомную деградацию ДНК и характерные морфологические изменения в структуре клетки. Изучение свойств церамица показало, что он способен активировать отдельные ферменты или быть участником каскадных ферментативных реакций, характерных для апоптоза. Кроме того, в ряде работ продемонстрировано, что ЦЕР активирует образование активных форм кислорода. Однако в большинстве экспериментов, выполненных на клеточных культурах, использовался синтетический аналог церамида, имеющий укороченную жирнокислотную цепь (С-2- или С-6- церамид), который может быть для клетки значительно более токсичным, чем природный аналог.

В наших экспериментах использовала природный церамид, который вводился мышам внутрибрюшинно. Было установлено, что при введении ЦЕР в дозе 50 мкг/мышь (2 мг/кг веса) уровень диеновых конъюгатов и диенкетонов в печени животных через 8 часов после инъекции находился в пределах контрольных значений, а через 18 часов содержание продуктов ПОЛ превышало показатели интактного контроля в 1,3 и 1,4 раза пдя диеновых конъюгатов (рис.7А, кривая 1) и диенкетонов (рис.7Б, кривая 1) сс ответственно.

Церамид в дозе 100 мкг/мышь (4 мг/кг веса) вызывал повышение содержания продуктов ПОЛ в печени животных, которое через 8 часов после введения

препарата превышало показатели интактного контроля в 1,3 раза и продолжало возрастать, достигая через 18 часов значений, превышающих контрольные в 1,6 и 1,4 раза для диеновых конъюгатов (рис.7А, кривая 2) и диенкетонов (рис.7Б, криная 2) соответственно.

Таким образом, в нашей работе продемонстрировано, что церамид способен самостоятельно индуцировать пероксидное окисление липидов.

А Б

4 8 12 16 20 ° и 4Bd(JL J.2

Время, час. время, час.

Рис.7. Изменение содержания продуктов ПОЛ (нмоль/мг липидов, опыт/контроль): диеновых конъюгатов (А) и диенкетонов (Б) при действии церамида: 1 - в дозе 50 мкг/мышь (2 мг/кг веса), 2 - в дозе 100 мкг/мышь (4 мг/кг веса).

5. Исследование изменения активности нейтральной сфингомиелиназы и интенсивности процесса пероксидного окисления липидов в печени мышей при действии гепатотоксина а-нафтилизотиоцианата

а-Нафтилизотиоцианат (АНИТ) в экспериментальных условиях широко используется для моделирования токсического поражения печени у подопытных животных. Однократное применение АНИТ вызывает холангиолитический гепатит Plaa G.L., Priestly B.G., 1977; Zimmerman H.J., 1978; Kossor D.C, 1993]. Рядом исследователей показаны повышение уровня продуктов ПОЛ и снижение активности антиоксидантных ферментов в печени и сыворотке крови животных при цействии а-нафтилизотиоцианата.

В настоящей работе было изучено изменение активности сфингомиелиназы и содержания подуктои пероксидного окисления липидов в гомогенате печени iv ышей при токсическом поражении печени, вызванном введением АНИТ. В резупьтате эксперимента было установлено, что активность сфингомиелиназы возрастала, превышая контрольные значения в 3 раза на 3 день эксперимента и в 4 раза на 5 день после инъекции АНИТ (рис 8). Поскольку нейтрально сфинго-миелнназа является ферментом, регулируемым окислительно-восстановительными процессами в клетке, на наш взгляд, наиболее вероятно, что активирующее действие АНИТ в отношении данного фермента мэжет быть связано с интенсификацией процессов ПОЛ и действием кислородных радикалов, производимых нейтрофилами, инфильтруемыми в ткань печени крыс, ин-токсицированных АНИТ, и происходящим в результате этого повреждением печени и уменьшением содержания антиоксидантов.

5,0

3 X X 1| 4,0

I § и 3,0

II £ 1 2,0

о ° X 1,0

£ < 0,0

контрбль 3 5

Время, сутки

контроль 3

Время, сутки

Рис.8. Изменение активности сфинго- Рис.9. Изменение содержания диеновых

миелиназы (имл/мин/мг белка, конъюгатов и диенкетонов (нмоль/мг липи-

опыт/контроль) в печени мышей при дов, опыт/контроль): в печени мышей при

действии АНИТ в дозе 120 мг/кг. действии АНИТ в дозе 120 мг/кг.

Содержание диеновых конъюгатов на 3 сутки после введения а-нафтилизотиоциа-ната превышало контрольные значения в 1,2 раза и в дальнейшем продолжало увеличиваться, достигая на 5 сутки величин, в 1,7 раза больших, чем в контроле. Уровень диенкетонов также постепенно возрастал, превышая контрольные показатели в 1,6 на 5 день эксперимента (рис.9).

В наших исследованиях характер изменения активности нейтральной СФМазы повторял характер изменения содержания диеновых конъюгатов и диенкетонов в печени мышей при действии АНИТ. На рис.10 продемонстрирована коррелятивная взаимосвязь между этими параметрами с высокими коэффициентами линейной корреляции, б. Исследование изменения активности нейтральной сфингомиелииазы, уровня ФНО-а и интенсивности процесса пероксидного окисления липидов в печени крыс при перевязке общего желчного протока с последующей декомпрессией желчевы водящих путей Апоптотическая гибель клеток органов и тканей лежит в основе патогенеза ряда патологических состояний. В частности, по механизму апоптоза гибнут гепатоциты при заболеваниях печени и желчевыводящих путей Що\ М. й а1., 2001]. Одной из наиболее распространенны* причин поражения печени является нарушение оттока желчи, обусловленное механическим препятствием желчетоку

40 50 60 70 80 Содержание д. конъюгатов, нмоль/мг липидов Рис.10. Взаимосвязь между активностью СФМазы (имп/мин/мг белка) и содержанием диеновых конъюгатов (нмоль/мг липидов) в печени мышеи при действии АНИТ в дозе 120 мг/кг.

при желчнокаменной болезни или опухолях гепатопанкреадуоденальной области (холестаз).

Несмотря на то, что ведущая роль в гибели гепатоцитов при холестазе отводе тся процессам апоптоза [Rodrigues С.М., Steer С.J., 2000], причины апопто-тической гибели клеток пгчени при холестазе исследованы недостаточно Пути, по которым проходят сигналы апоптоза, наряду с другими возможностями, вклм тают активацию сфи нгомиелинового цикла.

Важнейшую роль в индукции апоптоза посредством активации сфингомиелинового цикла играет провоспалительный цитокин фактор некроза опухо-ли-а (ФНО-а), который, взаимодействуя с цитоплазматической мембраной, активирует сфингомиелиназу, приводя тем самым к накоплению церамидов, индуцирующих апоптотическую гибель клеток [Liu B.et al., 1998Ь]. Другой стороной цитстоксического действия ФНО-о является окислительный стресс [Li J. et al., 2001]. Это взаимодействие может приводить к усилению действия на клетки тех повреждающих факторов, основным звеном цитотоксического действия которых является окислительный стресс. Сведений о роли активации сфингоми елиназы и экспрессии ФНО-а в повреждении печени при холестазе в доступной литературе нами не обнаружено.

Адекватной экспериментальной моделью холестаза, приводящего к нарушению функций и гибели клеток печеночной паренхимы, служит перевязка общего желчного протока у животных. Для определения патогенетической роли активации СФМазы, экспрессии ФНО-а и интенсификации процессов ПОЛ исследования проводились )з динамике развития поражения печени при холестазе на ранних стадиях процесса (3-6 дней после перевязки) и на стадии сформировавшейся патологии (12-16 дней после перевязки), б. i'. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени крыс при перевязке общего желчного протока

Нарушение оттока желчи вызывало монотонное снижение активности СФМазы в печени крыс на сроках от 3 до 9 дней эксперимента. Через 9 суток этот показатель достигал значений в 1,3 раза более низких, чем у контрольных животных (рис.11). Однако на более поздних сроках холестаза активность СФМазы начинала быстро увеличиваться и через 12 суток после начала экспе-рим гита уже превышала контрольные показатели в 1,2 раза, а по сравнению с величиной активности фермента на 9 день эксперимента возрастала в 1,6 раза. Еще большим было это повышение через 16 суток - в 1,4 раза и в 2 раза соответственно.

Двухфазный характер изменения активности сфингомиелиназы при нарушении оттока желчи может объясняться разнонаправленным действием накапливающихся в печени при холестазе основных компонентов желчи: желчных кислот и билирубина. На начальных сроках холестаза накопление желчных кислот в печени, в связи с особенностями их метаболизма, происходит более низкими темпами, чем прирост содержания БР, который образуется с постоянной скорость! л при распаде гемоглобина стареющих эритроцитов [Parola М. Et al., 1996].

Я а 1 4

d 2 g 1,2

о g

§ § 1,0

Ш 5

а о 0.8

10 15 20

Время, сутки Рис.11. Изменение активности СФМазы (имп/мин/мг белка, опыт/контроль) в печени крыс при перевязке сбщ. желчного протока.

Поэтому наиболее вероятно, что снижение активности сфингомиелнлазы на сроках до 9 дней эксперимента связано именно с действием природного анти-оксиданта билирубина.

С другой стороны, детергенты (к числу которых относятся желчные кислоты), оказывают на нейтральную СФМазу активирующее действие [Liu В. et al., 1998b; Tomiuk S. Et al., 2000]. В связи с этим на более поздних сроках эксперимента увеличение активности фермента может быть обусловлено прооксидантным или непосредственно детергентным влиянием накапливающихся желчных кислот.

Таким образом, можно предположить, что изменение активности СФМазы прр хо-лестазе, опосредуется модулированием интенсивности ПОЛ и обусловлено в оснс е.ном влиянием БР и желчных кислот. 6.2. Изменение содержания ФНО-а в печени крыс при перевязке общего

желчного протока Важ ную роль в индукции гибели клеток по механизму апоптоза играм ци-токин ФНО-а. В печени ФНО-а производят купферовские клетки и холангиэци-ты. Опосредованная ФНО-а генерация активных форм кислорода, так же как и активация им сфингомиелинового цикла, может приводить клетки к апопточу [Li J. Et al., 2001]. Однако в литературе нет сведений о роли экспрессии ФНС-а в повреждении печени при холестазе.

В печени у подопытных крыс в течение первых дней после перевязки об него желчного протока содержание ФНО-и интенсивно снижалось, достигая на 9 <гпжи величин на 40% меньших, чем в контроле (рис.12). Однако в дальнейшем происходил значительный рост содержания ФНО-а, уровень которого к 16-м суткам превысил контрольные значения в 2 раза.

Подобный характер измененш содержания ФНО-а при перевязке об него желчного протока может являться отражением воспалительных процессов в печени и желчных протока), в условиях развившийся патологии.

Желчные кислоты обладают свойством стимулировать выработку ФНО-а печеночными макрофагами [Puntis М.С., Jiang W.G., 1996], а также, в свии с

е S

а. ¡3 U

Время, сутки Рис.12. Изменение содержания ФНО-а (мкг/мг белка, опыт/контроль) в печени крыс при перевязке общ. желчн. протока.

присущими им детергентными свойствами, желчные кислоты могут менять ли-ганд-рецепторные взаимодействия. С другой стороны, способность билирубина снижать экспрессию провоспалительных цитокинов, в том числе ФНО-а, показана в ряде работ [Lee T.S., Chau L.Y., 2002; Pileggi A. et al., 2001; Tobiasch E. et al., 2001]. Таким образом, желчные кислоты и билирубин обладают разнонаправленным действием на экспрессию ФНО-а.

6.3. Изменение содержания продуктов пероксидного окисления липидов в печени крыс при перевязке общего желчного протока

Известно, что процессы ПОЛ могут стимулировать гибель гепатоцитов. В ряде работ основная роль в развитии патологии печени при обструкции желчных путей отводится процессам пероксидного окисления липидов [Leonarduzzi G. et al., 1995; Tsai L.Y. et al., 1998; Alptekin N. et al., 1997; Orellana M. et al., 2000]. Установлено, что в крови больных холестазом увеличено содержание продуктов пероксидного окисления липидов [Tsai L.Y.et al., 1992, 1993], а при длительном холестазе у животных повышается генерация *ОН, способного индуцировать ПОЛ [Tsai L.Y.et al., 1998].

В наших экспериментах было изучено изменение содержания продуктов пероксидного окисления липидов в печени крыс при перевязке общего желчного протока продолжительностью от 3 до 16 дней. Уровень продуктов ПОЛ в печени крыс интенсивно снижался, достигая к 9 дню эксперимента значений на 30% меньших, чем у контрольных животных (рис. 13). Затем наблюдалось значительное повышение содержания диеяовых конъюгатов и диенкетонов, количество которых к 16 дням эксперимента превышало контрольные показатели в 2 раза. Таким образом, изменения интенсивности ПОЛ в печени имели ярко выраженный фазовый характер.

3 36

ж 24

0 5 10 15 Время, сутки

Рис.13. Изменение содержания продуктов ПОЛ (нмоль/мг липидов, опыт/контроль): 1-диеновых конъюгатов, 2-диенкетонов в печени крыс при перевязке общ. желч. протока.

«Г

14,7+0,44*Х R=0.94, Р<0.001

20 30 40 50 60 Содержание д. конъюгатов,

нмоль/мг липидов Рис.14. Взаимосвязь изменения активности СФМазы (имп/мин/мг белка) и содержания продуктов ПОЛ (нмоль/мг липидов) в печени крыс при перевязке общего желчного протока

По всей видимости, на ранних этапах развития холестатического повреждения печени при перевязке общего желчного протока именно с антиоксидант-ными свойствами накапливающегося в печени билирубина связано снижение интенсивности процесса ПОЛ у подопытных животных на сроках до 9 дней эксперимента. При более продолжительном нарушении оттока желчи повышение уровня билирубина замедляется (вероятно, в связи с расходованием в реакциях со свободными радикалами, образование которых индуцируют желчные кислоты), и начинают доминировать деструктивные процессы, что находит отражение в повышении содержания продуктов ПОЛ на поздних сроках эксперимента.

Таким образом, перевязка общего желчного протока приводила к однонаправленным изменениям всех изученных параметров. На рис.14 продемонстрирована коррелятивная взаимосвязь между активностью сфингомиелиназы и содержанием продуктов пероксидного окисления липидов.

6.4. Изменение активности сфингомиелиназы, уровня ФНО-а и продуктов ПОЛ в печени крыс при декомпрессии желчевыводящих путей после перевязки общего желчного протока Для того чтобы определить критерий обратимости изменений, происходящих при развитии заболеваний печени, вызванных нарушением желчетока, была использована модель подпеченочного холестаза с последующей декомпрессией желчевыводящих путей. Животным была сделана перевязка участка общего желчного протока с предварительным введением в него полиэтиленового катетера с запаяным концом с последующим дренированием (декомпрессией) желчевыводящих путей путём отсечения кончика катетера для оттока желчи. А Б

Время, сутки Время, сутки

Рис.15. Изменение активности СФМазы (имп/мин/мг белка, опыт/контроль) при декомпрессии желчевыводящих путей после 9 днгй (А) и 12 дней (Б) перевязки общего желчного протока.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что при декомпрессии желчных путей после 9-дневной перевязки общего желчного протока у крыс активность СФМазы, содержание ФНО-а и уровень продуктов ПОЛ возрастали, достигая показателей интактного контроля уже через 3 дня после декомпрессии, и оставались в пределах контрольных значений в течение всего

срока эксперимента (рис, 15А, 16А, 17А, на рисунках стрелками указан срок, в который была произведена декомпрессия - через 9 суток после перевязки общего желтого протока). Таким образом, декомпрессия после 9-дневного нарушения отто ка желчи приводила к нормализации исследуемых параметров.

При восстановлении оттока желчи после 12-дневной перевязки общего желчного протока у крыс наблюдалось повышение активности СФМззы, уровня ФНО-а и продуктов ПОЛ по сравнению с показателями интактного контро ля, котоэое сохранялось в течение всего времени эксперимента - от 3 до 18 дней после декомпрессии (рис.15Б, 16Б, 17Б на рисунках стрелками указан срок, в который была произведена декомпрессия - через 12 суток после перевязки общего желчного протока).

Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что при нарушении оттока желчи в течение 9 дней последующая декомпрессия приводила к нормшгазации всех исследуемых параметров: активности СФМазы, содержания ФНО-а и уровня диеновых конъюгатов и диенкетонов.

А Б

С*

1.0

0,5

Ю 20 30 ' 0 Ю 20

Время, сутки Время, сутки

Рис, 16. Изменение содержания ФНО-а (мкг/мг белка, опыт/контроль) при декомпрессии желчных путей после 9 дней ГА) и 12 дней (Б) перевязки общего желчн протока.

А Б

восстановление

2,0 I

1.5 - Г

1.0 щшшЬ 1 I

10 20 Время, сутки

Рис.17. Изменение содержания диеновых конъюгатов (нмоль/мг липидов, опыт/контроль) при декомпрессии желчевыводящих путей после 9 дней (А) и 12 дней (Б) перевязки тощего желчного протока.

При более длительной обструкции общего желчного протока - в течение 12 дней - последующее восстановление оттока желчи, не приводило к нормализации изучаемых показатетей: активность СФМазы, содержгние ФНО-а и проектов ПОЛ сохранялись на уровне, превышающем контрольные значения.

В наших экспериментах установлена прямая корреляция между характером изменения исследуемых шра-метров: активности СФМазы, содержания ФНО-а и продуктов пероксид-ного окисления липидов (рис.18).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза, протекают не в каждой живой клетке, регулируются различными системами, действие котоэых взаимосвязано и дополняет друг друга. Система сфингомиелинового цикла поддерживает в клетке баланс между апоптотическими и митогенными сигналг.ми, поскольку продукты гидролиза сфингомиелина участвуют в проведении сигналов апоптоза и митогенеза. Изменение активности СФМазы, которая гидролпзу-ет сфингомиелин, запуская каскад СФМ цикла, в результате которого образуются соединения, обладающие столь разнообразной биологической активностью, способно определять дальнейшую судьбу клетки: жизнь или гибель по апонто-тическому типу.

Действие многих факторов, индуцирующих апоптоз, опосредуется через состояние окислительного стресса. Пусковым моментом часто являются повреждения клеточных мембран в результате пероксидного окисления их липидов. При этом может происходить изменение активности мембраносвязанных ферментов, в частности, мембраносвязанной изоформы нейтральной СФМазы, с помощью которой и осуществляется передача сигнала апоптоза. Это подтверждается еще и тем фактом, что сфингомиелиназа является ферментом, регулируемым окислительно-восстановительным состоянием клетки [Garcia-Ruiz С. е al, 2000b; Denisova N. et al, 1999; Levade T., Jaffrezou J. P., 1999; Liu B. et al., 1998; Marchesini N., Hannun Y.A., 2004].

В настоящей работе мы впервые показали, что природный антиоксид ант глутатион в восстановленной форме при внутрибрюшиином введении животным ингибирует нейтральную СФМазу, что находится в соответствии с литературными данными, полученными для клеточных культу]). [Liu В., Hannun Y.A., 1997; Lui В. et al, 1998; Lui В. et al, 1998b]. Окисленный глутатион, напротиЕ., активировал фермент. Однако в работах, выполненных in vitro, было показано, что

нмоль/мг липидов Рис.18. Коррелятивная взаимосвязь между активностью СФМазы (имп/мин/мг белка) и содержанием диеновых коныо-гатов (кмоль/мг липидов) в печени крыс при декомпрессии желчных путей после перевязки оощего желчного протока.

ингибирующим действием на СФМазу обладали и восстановленный, и окисленный глутатион, причем данный эффект был обусловлен у-глутамилцистеиновой составляющей глутатиона, и для ингибирования сфингомиелиназы не требовалось даже наличия свободных сульфшдрильных групп. Но, по-видимому, in vivo влияние глутатиона на фермент является гораздо более сложным, связанным, в первую очередь, именно с его антиоксидантными свойствами, и осуществляется путем изменения окислительно-восстановительного состояния клетки, в частности, изменения интенсивности процесса пероксидного окисления липидов клеточных мембран. Это подтверждается результатами нашего эксперимента, в результате которого было установлено, что характер изменения активности СФМазы повторял характер изменения интенсивности процесса пероксидного окисления липидов в печени животных: уровень продуктов ПОЛ также снижался под действием восстановленного г лутатиона и повышался под влиянием глутатиона в окисленной форме. Эта закономерность может свидетельствовать о наличии взаимосвязи между двумя сигнальными системами клетки: СФМ циклом и окислительной системой.

Природный антиоксидант билирубин также эффективно снижал уровень продуктов ПОЛ в сердце животных, одновременно ингибируя сфингомиелиназу. Действие билирубина на данный фермент может отличаться от действия других антиоксидантов, поскольку БР способен избирательно связываться со сфинголи-пидами мембран [Nagaoka S., Cowger M.L., 1978; Vazquez J. et al., 1988; Yang B.et al., 1991], преимущественно со сфингомиелином, субстратом СФМазы [Eriksen E.F.et al., 1981]. Эта способность может рассматриваться как дополнительный механизм воздействия на активность фермента.

Как и при использовании глутатиона, были обнаружены совпадающие по времени однонаправленные изменения в уровнях продуктов ШЖи активности сфингомиелиназы в сердце мышей при внутрибрюшинном введении билирубина. В печени животных подобная однонаправленность была отмечена через 15 и 60 мин. после инъекции, однако через 30 мин. после введения БР активность СФМазы, как и в сердце мышей, снижалась, в то время как уровень продуктов ПОЛ в печени животных, в отличие от сердца, напротив, возрастал.

Повышение содержания диеновых конъюгатов и диенкетонов в печени животных при внутрибрюшинном введении билирубина связано с непосредственным участием клеток печени в процессах выведения билирубина из организма, в связи с чем усиление ПОЛ при избыточном поступлении БР в печень может являться реакцией, направленной на снижение его уровня.

Таким образом, в условиях ингибирования процесса ПОЛ природными ан-тиоксидантами глутатионом и билирубином происходит уменьшение активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла - СФМазы. Этот факт зафиксирован для двух различных ашиоксидантов, которые, обладая антиоксидантными свойствами, способны оказывать влияние на активность фермента с помощью у-глутамилцистеиновой составляющей ГЛ и путем взаимодействия с субстратом - сфингомиелином - в случае БР. Однако однонаправленность харак-

тера изменения активности фермента и уровня продуктов ПОЛ может свидетельствовать о дополнительном и, возможно, самостоятельном участии процесса пероксидного окисления липидов в регуляции активности СФМазы. Это воздействие может выражаться в модификации липидного бислоя мембраны, с которой связан изучаемый фермент. При окислении липидного окружения может изменяться доступность субстрата - сфингомиелина - и происходить структурная модификация СФМазы.

Полученные нами данные о способности церамида самостоятельно индуцировать процесс ПОЛ свидетельствуют о ьаличии двусторонней регуляции исследуемых систем: с одной стороны, активность СФМазы зависит от интенсивности окислительных процессов в клетке, а с другой стороны, продукты гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой, в частности, церамид, сами способны индуцировать ПОЛ.

В таком случае, вероятно, различные активаторы процесса ПОЛ и заболевания, сопровождающиеся усилением генерации продуктов пероксидного окисления липидов, могут оказывать активирующее действие и на СФМазу. В настоящей работе показано, что гепатотоксин а-нафтилизотиоцианат вызывал интенсификацию процесса ПОЛ в печени животных и одновременно резко активировал исследуемый фермент.

При ряде заболеваний печени и желчевыводящих путей гепатоциты гибнут преимущественно по механизму апоптоза, причем многими исследователями основная роль в этом процессе отводигся именно интенсифицирующимся процессам ПОЛ [ЬеопагАиггх в. е! а1., 1995; ОгеИапа М. е1 а1., 2000]. В данной работе при использовании перевязки общего желчного протока у животных, которая является экспериментальной моделью подпеченочного холестаза, мы показали, что, действительно, наблюдается повышение содержания продуктов ПОЛ в печени животных, но это происходит только на стадии уже развившейся патологии, также как активация СФМазы и увеличение уровня провоспалитель-ного цитокина ФНО-а. На на ранних сроках перевязки, напротив, отмечается снижение интенсивности ПОЛ и активности фермента, а также содержания ФНО-а. Такой характер изменений исследуе мых параметров может объясняться тем, что при перевязке общего желчного протока наряду с другими изменениями метаболизма снижается скорость выведения с желчью различных веществ, в частности БР, обладающего антиоксидантными и антиапоптотическими свойствами, что приводит к росту его содержания в ткани печени и сыворотке крови. В связи с этим, на ранних сроках перевязки накапливающийся билирубин приводит к снижению интенсивности ПОЛ, ингибированию сфингомиелиназы и уменьшению темпа гибели гепатоцитов. Однако на более поздних сроках перевязки общего желчного протока, по-видимо му, количество апоптотических клеток достигает некоторой критической величины, а количество накапливающегося БР становится недостаточным для защиты клеток. При этом происходит увеличение активности СФМазы и содержания продуктов ПОЛ, а также повышение уровня провоспалительного цитокина ФНО-а. Причем восстановление оттока

желчи после перевязки общего желчного протока небольшой продолжительность к> (до 9 дней) способна приводить к нормализации исследуемых параметров, а при восстановлении после более длительной перевязки (12 дней) нормализации не присходит, и данные показатели сохраняются на уровне превышающем контрольные значения.

Наши эксперименты позволили проследить закономерность изменения урсгня ФНО-а и активности сфиномиелиназы в динамике развития заболевания печени, связанного с повышением интенсивности пероксидного окисления ли-пидов. Полученные даниые показали прямолинейную зависимость изменения исследуемых параметров, являющихся важнейшими факторами апоптоза, на урсвне живого организма. Это является дополнительным подтверждением участия ФНО-а в активации СФМазы и его роли в развитии патологии печени, протекающей на фоне интенсификации ПОЛ.

Весь комплекс проведенных исследований наглядно продемонстрировал однонаправленность изменений активности сфиномиелиназы и интенсивности пероксидного окисления липидов, независимо от условий активации или инги-бирювания процесса ПОЛ. Пересечение двух рассматриваемых сигнальных сис-те& - сфиномиелинового цикла и окислительно-восстановительной системы происходит, вероятно, в результате регуляции активности фермента СФМазы продуктами пероксидного окисления липидов, с одной стороны, и способности церг мида - продукта гидролиза сфингомиелина СФМазой генерировать новую волну пероксидного окисления - с другой.

Обнаруженная коррелятивная взаимосвязь между сфингомиелиновым циклом и процессом ПОЛ дает основания для использования двух объектов воздействия в клетке: ферментов СФМ цикла и антиоксидантов - с целью коррекции её функций в условиях развития патологии.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. Р.П. Евстигнеевой, проф. A.B. Алесенко, д б.н. Л.Б. Дудник и д.м.н Г.Г. Ахаладзе за постоянное внимание и поддержку при проведении настоящей работы, а также н.с. М.А. Шуиик за помощь в проведении экспериментов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• АНИТ - а-нафтилизотиоцианат;

• БР - билирубин;

• ВГ - восстановленный глутатион;

• ГЛ - глутатион;

• ОГ - окисленный глутатион;

• ПОЛ - пероксидное окисление липидов;

• СФМ - сфингомиелин; СФМаза - сфингомиелиназа

• ФНО-а - фактор некроза опухсли-альфа;

• ЦБР - церамид;

выводы

Впервые выполнено исследование изменения активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла нейтральной СФМазы in vivo в условиях активации и ингибирования процесса ПОЛ.

1. Определен характер изменения активности нейтральной сфингомиели-назы под действием глутатиона в окисленной и восстановленной форме в пемни мышей. Установлено, что восстановленный глутатион обладает ингибируюшим действием на фермент, а окисленный глутатион - активирует СФМазу. Выя в пена прямая корреляция между изменением активности СФМазы и изменением содержания продуктов ПОЛ в печени животных при действии как окисленного, так и восстановленного глутатиона.

2. Исследовано влияние билирубина на активность СФМазы в органах животных. Показано, что в сердце и печени мышей билирубин проявляет ингибируюцее действие на фермент. Установлена коррелятивная взаимосшзь между изменением активности СФМазы и изменением содержания продутгов ПОЛ в сердце и печени мышей при действии билирубина.

3. Впервые показано, что природный церамид самостоятельно способен индуцировать пероксидное окисление липидов.

4. Исследовано влияние а-нафтилизотиоцианата (АНИТ) на активношъ нейтральной СФМазы in vivo. Установлено активирующее действие АНИТ на СФМазу. Выявлена прямая корреляция между изменением активности СФМезы и изменением содержания продуктов ПОЛ в печени мышей при действии а-нафтилизотиоцианата.

5. Впервые проведено исследование изменения активности СФМазы, :о-держания продуктов ПОЛ и уровня провоспалительного и прооксидантного ци-токияа ФНО-а при перевязке общего желчного протока с последующей декомпрессией жеотчевыводящих путей у животных. Обнаружен двухфазный характер изменения исследуемых параметров: снижение на ранних сроках холестаза (.5-9 суток перевгеки) и повышение на более поздних сроках развития патологии (1216 суток перевязки). Декомпрессия желчевыводящих путей после перевязки продолжительностью 9 дней способна приводить к нормализации активности СФМазы, содержания продуктов ПОЛ и уровня ФНО-а, a при декомпрессии после перевязки общего желчного протока длительностью 12 дней нормализации не происходит, и данные показатели сохраняются на уровне, превышающем контрольные значения. Выявлена прямая корреляция между активностью сфин-гомиелиназы, уровнем ФНО-а и содержанием продуктов ПОЛ.

6. Установлено, что изменение активности СФМазы и уровня продувов пероксидного окисления липидов имеют однонаправленный характер как в условиях ингибирования, так и в условиях активации процесса ПОЛ. Выявлена коррелятивная взаимосвязь между данными параметрами, что подтверждает возможность непосредственного влияния продуктов пероксидного окисления липидов на активность сфингомиелиназы.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цюпко А.Н., Дудник Л.Б., Евстигнеева Р.П., Алесенко А.В. «Влияние восстановленной и окисленной форм глутатиона на активность сфингомиелиназы и содержание сфингомиелина и продуктов перекисного окисления липидов в печени мышей» // Биохимия. 2001. Т. 66. № 9. С. 1263-1270.

2. Дудник Л.Б., Цюпко А.Н., Хренов А.В. Алесенко А.В. «Влияние билирубина на интенсивность пероксидного окисления липидов, активность сфингомиелиназы и апоптоз, индуцированный сфингозином и УФ-облучением» // Биохимия. 2001.Т. 66. №9. С. 1252-1262.

3. Дудник Л.Б., Цюпко А.Н., Шингарова Л.Н., Шупик М.А., Ахаладзе Г.Г., Гальперин Э.И., Платонова, Л.В., Шоно Н.И., Яснецов В.В., Алесенко А.В. «Изменение активности сфингомиелиназы, содержания фактора некроза опухоли-альфа и интенсивности пероксидного окисления липидов в динамике развития холестатического повреждения печени» //Известия РАН, Сери? биол. 2005. №6. С. 1-9.

4. Dudnik L.B., Zyupko A.N., Khrenov A.V., Alessenko A.V. «Effect of bilirubin on lipid peroxidation, sphingomyelinase activity and apoptosis induced by sphingosine and UV irradiation» // Chem. Phys. Lipids. 2001. V. 112. № 2. P. 74-75.

5. Dudnik L.B., Zyupko A.N., Khreiov A.V., Alessenko A.V. «Bilirubin may protect cells from injury via influence on lipid peroxidatioin and sphingomyelin cycle». // Abs. of Intl. Congr. "Fortschritte in Gastroenterologie und Hepatologie 2001". Hannover, Germany, 2001. P. 45.

6. Dudnik L.B., Zyupko A.N., Khrenov A.V., Alessenko A.V. «Effect of bilirubin on lipid peroxidation, sphingomyelinase activity and apoptosis induced by sphingosine and uv irradiation» // Abs. of Conf. ICBL. Bergen, Norway, 2001. P. 38.

7. Цюпко A.H., Дудник Л.Б., Евсгп- гнеева Р.П., Алесенко А.В. «Влияние глутатиона на активность сфингомиелиназы и продуктов пероксидного окисления липидов в печени мышей» // Тез. VI Межд. конф. «Биоантиоксидант». Москва, 2002г. С. 609.

8. Дудник Л.Б., Цюпко А.Н., Бальцассини М.В., Алесенко А.В. «Механизм влияния природного антиоксиданта билирубина на апоптоз, индуцированный сфингозином и УФ-облучением» // VI Межд. конф. «Биоантиоксидант». Москва, 2002г. С. 174.

9. Цюпко А.Н., Дудник Л.Б., Евстигнеева Р.П., Алесенко А.В. «Исследование ан-тиапоптотических свойств билирубина» // Тез. II Ежег. молод, конф. ИБХФ - ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 2002г. С. 245.

10. Цюпко А.Н., Дудник Л.Б., Евстигнеева Р.П., Алесенко А.В. «Влияние природных антиоксидантов глутатиона и билирубина на индукцию сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов» // Тез. Ш Съезда Биохим. Общества. Санкт-Петербург, 2002г. С. 618.

11. Dudnik L.B., Tsupko A.N., Alessenko A.V. «Cytoprotektive properties of bilirubin may be attributed to its influence on apoptosis via modulation of sphingomyelinase activity and lipid peroxidation» // Abs. of 8th Intl Cong, on Phospholipids. Vienna, Austria 2002. P. 40.

12. Дудник Л.Б., Храпова Н.Г., Цюпко A.H. «Механизм антиокислительного действия билирубина» // Тез. XVII Менделегвского съезда по общ. и прикл. химии. Казань, 2003г. С. 267.

13. Dudnik L.B., Tsupko A.N., Alessenko A.V. «Relationship between lipid peroxidation and sphingomyelinase activity in liver after injection of glutathione and bilirubin» // Abs. of 3rd Euro Fed Lipid Cong. Edinburgh, Scotland, 2004. P. 306.

гООбА.

ухгГ 121

Подписано в печать 2005г. _

Формат 60x84/16. :>аказ ЕЬ/йуТираж Пл. 1,6 .

Отпечатано в РИИС ФИАН с оригинал-макета заказчика. 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 132 5128

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цюпко, Алла Николаевна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Общие сведения о сфингомиелиновом цикле

2.1.1. Метаболизм сфингомиелина.

2.1.2. Изоформы сфингомиелиназ.

2.1.3. Механизмы регуляции сфингомиелиназ в клетке

2.1.3.1. Регуляция липидами.

2.1.3.2. Регуляция протеинкиназой С.

2.1.3.3. Регуляция протеазами.

2.1.3.4. Регуляция Вс12.

2.1.3.5. Регуляция р53.

2.1.3.6. Регуляция другими белками.

2.1.3.7. Регуляция глутатионом.

2.2. Сфингомиелиновый цикл как сигнальная система.

2.2.1. Участие сфингомиелиназы в передаче внеклеточных сигналов.

2.2.2. Участие церамида в передаче внеклеточных сигналов.

2.2.3. Участие сфингозина в передаче внеклеточных сигналов. 2.2.4. Участие сфингозин-1-фосфата в передаче внеклеточных сигналов.

2.3. Сигнальные системы окислительного стресса.

2.3.1. Пути генерации активных форм кислорода в ^ клетках.

2.3.2. Оксиданты регулируют клеточные сигнальные системы

2.3.2.1. Протеинтирозинкиназы и фосфатазы.

2.3.2.2. Серин/треонинкиназы и фосфатазы.

2.3.2.3. Липидный метаболизм.

2.3.2.4. Транскрипционные факторы

2.3.2.4.1. АР-1.

• 2.3.2.4.2. NFkB.

2.3.2.4.3. Myb.

2.4. Взаимосвязь сигнальных систем сфингомиелинового цик* ла и окислительного стресса

2.4.1. Общие активаторы и ингибиторы.

2.4.2. АФК активируют образование церамида.

2.4.3. Митохондриальная электронная транспортная ф цепь - мишень церамида.

2.4.4. Церамид и N0 при проведении сигнала апоптоза

2.4.5. Роль антиоксидантов в регуляции образования церамида.

2.4.6. Церамид, другие сфинголипиды и окислительный стресс.

3. Объекты, материалы и методы исследования

3.1. Биофизические и биохимические методы.

3.2. Работа с животными.

3.3. Статистическая обработка результатов.

4. Результаты исследования

4.1. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени мышей при действии глутатиона в восстановленной и окисленной формах.

4.1.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы и содержания сфингомиелина в печени мышей при внутрибрюшинном введении восстановленного и окисленного глутатиона.

4.1.2 Влияние восстановленного и окисленного глутатиона на содержание продуктов пероксидного окисления липидов в печени мышей.

4.2. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени и сердце мышей при действии билирубина.

4.2.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени и сердце мышей при внутрибрюшинном введении билирубина.

4.2.2. Влияние билирубина на содержание продуктов пероксидного окисления липидов в печени и сердце мышей.

4.3. Влияние церамида на интенсивность пероксидного окисления липидов в печени мышей.

4.4. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени мышей при действии гепатотоксина а-нафтилизотиоцианата.

4.4.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени мышей при внутрибрюшинном введении а-нафтилизотиоцианата.

4.4.2. Влияние а-нафтилизотиоцианата на содержание продуктов пероксидного окисления липидов в печени мышей.

4.5. Изучение взаимосвязи между активностью нейтральной ( сфингомиелиназы, уровнем ФНО-а и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов в печени крыс при перевязке общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи.

4.5.1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени крыс при перевязке общего желчного протока.

4.5.2. Изменение содержания ФНО-а в печени крыс при перевязке общего желчного протока.

4.5.3. Влияние перевязки общего желчного протока на интенсивность пероксидного окисления липидов в печени крыс.

4.5.4. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени крыс при восстановлении оттока желчи после перевязки общего желчного протока.

4.5.5. Изменение содержания ФНО-а в печени крыс при восстановлении оттока желчи после перевязки общего желчного протока.

4.5.6. Влияние восстановления оттока желчи после перевязки общего желчного протока на интенсивность пероксидного окисления липидов в печени крыс.

5. Обсуждение результатов исследования. 1Ю

6. Выводы.

7. Список аббревиатур.

I 8. Литература.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характер изменения активности сфингомиелиназы в условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов в печени животных"

Актуальность работы. Сфингомиелиназа (ЕС 3.1.4.12. сфингомие-лингидролаза) является ключевым ферментом сфингомиелинового (СФМ) цикла — источника липидных вторичных мессенджеров, участвующих в проведении сигналов от различных внешних агентов внутрь клетки. Она гидролизует фосфоэфирную связь сфингомиелина с образованием цера-мида (ЦЕР) и фосфохолина. Из церамида затем последовательно образуются сфингозин и сфингозин-1-фосфат.

Активация сфингомиелиназы может являться начальной точкой ферментного каскада, который приводит к образованию целого ряда биоактивных липидов и представляет собой один из ключевых моментов в передаче сигнала от множества факторов, реализующих свое действие через рецепторы, расположенные на плазматической мембране. Существующая в настоящее время гипотеза о сфингомиелиновом цикле как пути передачи сигнала с помощью липидных вторичных мессенджеров заключается в том, что внеклеточные агенты, связываясь со своими рецепторами на поверхности мембран, активируют сфингомиелиназу, которая катализирует гидролиз сфингомиелина и накопление церамида и сфингозина (СФЗ). Последние, воздействуя на внутриклеточные мишени, вызывают клеточный ответ. Сфингомиелиновый цикл завершается ресинтезом сфингомиелина и восстановлением прежнего уровня ЦЕР и СФЗ.

Сфингомиелиназа (СФМаза) обнаружена практически во всех клетках, но наибольшее ее количество содержится в клетках мозга (миелине). На данный момент известно по меньшей мере 5 различных изоформ сфингомиелиназ, отличающихся внутриклеточной локализацией, оптимальным рН, зависимостью от катионов и ролью в клеточной регуляции: лизосомальная кислая, нейтральная М§2+-зависимая, Zn 2+-зависимая ли-зосомальная кислая, Mg2+ -независимая нейтральная и щелочная СФМазы. Большинство литературных сведений показывают, что наиболее значимыми в процессах передачи внеклеточных сигналов являются две изо-формы фермента - Mg -зависимая нейтральная мембраносвязанная СФМаза и кислая лизосомальная сфингомиелиназа.

Механизм, контролирующий активацию сфингомиелиназ в клетке, на настоящий момент до конца не изучен. На основании литературных данных наиболее вероятной, на наш взгляд, представляется гипотеза о регуляции активности СФМазы окислительно-восстановительным состоянием клетки.

В последние годы появляется все больше фактов, свидетельствующих о пересечении двух сигнальных систем - сфингомиелинового цикла и окислительных процессов, происходящих в клетке при развитии окислительного стресса. Обе эти системы являются генераторами вторичных посредников, передающих внеклеточные сигналы с цитоплазматической мембраны в ядро, модулирующих физиологическое состояние клеток и влияющих на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Ряд факторов, способных индуцировать окислительный стресс, в то же время активируют СФМ цикл. Такие воспалительные цитокины как ФНО-а способствуют генерации активных форм кислорода в клетках [Li J. et al., 2001] и также являются индукторами образования продуктов СФМ-цикла [Liu B.et al., 1998Ь]. Многие аптиоксиданты (АО) ингибируют производство активных форм кислорода (АФК) в клетках, и некоторые из них проявляют инакти-вирующее действие в отношении сфингомиелиназы.

Высокие концентрации АФК и продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в клетке обладают выраженным повреждающим действием и вызывают не только нарушение структуры биологических мембран, но и изменение активности мембраносвязанных ферментов. В связи с этим через регуляцию пероксидного окисления липидов представляется вероятным оказывать влияние на активность сфингомиелиназы и интенсивность сфингомиелинового цикла, а значит, воздействовать на важнейшие клеточные процессы в организме - дифференцировку, пролиферацию и апоптоз. В настоящее время в этом аспекте активно исследуется роль природных и синтетических соединений, обладающих антиокислительными свойствами.

Участие таких природных антиоксидантов как глутатион (ГЛ) и билирубин (БР) в процессах пероксидного окисления липидов в настоящее время уже является вполне определенным, а вот сведения о том, что глутатион способен оказывать влияние на активность ключевого фермента сфингомиелинового цикла - сфингомиелиназы были получены in vitro сравнительно недавно [Liu В., Hannun Y.A., 1997; Lui В. et al, 1998; Lui В. et al, 1998b], Ho in vivo связи между содержанием глутатиона и активностью сфингомиелинового цикла в клетке могут быть значительно более сложными. Влияние природного антиоксиданта билирубина на активность сфингомиелиназы вообще не исследовалось, а между тем, имеются данные, что он способен при взаимодействии с клеточной поверхностью избирательно связываться со сфинголипидами мембран [Nagaoka, Cowger, 1978; Vazquez et al., 1988; Yang et al., 1991], причем константа его связывания со сфингомиелином, субстратом сфингомиелиназы, в 5-25 раз выше, чем с другими фосфолипидами [Eriksen et al., 1981]. Вполне вероятно, что такое взаимодействие может оказывать влияние на активность данного фермента. Кроме того, данные о влиянии на активность сфингомиелиназы иных (помимо глутатиона) антиоксидантов, полученные in vitro, весьма противоречивы [Mansat-de Mas V., et al., 1999; Lopez-Lluch G. et al., 1999; Yoshimura S. et al., 1999], а сведения об экспериментах in vivo отсутствуют. Связь активности сфингомиелиназы с уровнем реакций пероксидного окисления липидов (ПОЛ) мембран in vivo в литературе нами также не обнаружена.

Исследование активности СФМазы в условиях изменения интенсивности ПОЛ в организме животных при действии антиоксидантов глу-татиона и билирубина, представляется нам весьма актуальным, поскольку позволяет определить влияние природных АО и продуктов пероксидного окисления липидов на активность сфингомиелиназы и характер изменения активности данного фермента в условиях ингибирования ПОЛ.

Гибель клеток печени при действии а-нафтилизотиоцианата и при нарушении желчетока преимущественно происходит по механизму апоп-тоза, индуцированному продуктами пероксидного окисления липидов. Однако изменение активности СФМазы под влиянием данных факторов до настоящего времени не изучалось.

Также в нашей работе было исследовано влияние природного цера-мида - продукта гидролиза сфингомиелина - на интенсивность процесса ПОЛ in vivo. В литературе имеются сведения об экспериментах, выполненных на клеточных культурах с использованием синтетического аналога церамида с укороченной жирнокислотной цепью, который может быть для клетки гораздо более токсичным, чем природный аналог.

Таким образом, данное исследование дает представление об изменении активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла —

СФМазы в результате ингибирования пероксидного окисления липидов природными антиоксидантами и интенсификации данных процессов вследствие токсического поражения печени и нарушения желчетока, и может указывать на пересечение сигнальных систем СФМ цикла и окислительно-восстановительной системы при развитии различных патологий. Результаты работы могут быть полезными для понимания патогенеза и разработки новых методов терапии ряда распространенных заболеваний, а также способствовать созданию новых лекарственных средств из класса антиоксидантов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение характера изменения активности нейтральной сфингомиелиназы в печени животных в условиях ингибирования процесса ПОЛ природными антиоксидантами и в условиях повышения содержания продуктов ПОЛ при развитии в печени процессов, сопровождающихся гибелью гепатоцитов.

Для достижения намеченной цели исследования в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определение изменения активности сфингомиелиназы в печени мышей при действии глутатиона в окисленной и восстановленной формах. Сравнение характера изменений активности сфингомиелиназы и интенсивности процесса пероксидного окисления липидов (уровня диеновых конъюгатов и диенкетонов) in vivo при действии глутатиона.

2. Определение изменения активности сфингомиелиназы в печени и сердце мышей при действии билирубина. Сравнение характера изменений активности сфингомиелиназы и содержания диеновых конъюгатов и диенкетонов in vivo при действии билирубина.

3. Исследование влияния церамида - продукта гидролиза сфинго-миелина сфингомиелиназой - на интенсивность процесса ПОЛ в печени мышей.

4. Определение изменения активности сфингомиелиназы в печени животных при действии гепатотоксина а-нафтилизотиоцианата (АНИТ). Сравнение характера изменений активности сфингомиелиназы и содержания диеновых конъюгатов и диенкетонов in vivo при действии АНИТ.

5. Определение изменения активности сфингомиелиназы, уровня ФНО-а и продуктов пероксидного окисления липидов в печени животных при перевязке общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи и сравнение характера изменений исследуемых параметров.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В условиях ингибирования пероксидного окисления липидов природными антиоксидантами: восстановленным глутатионом и билирубином - активность сфингомиелиназы снижается.

4. При действии церамида - продукта гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой - происходит интенсификация процесса пероксидного окисления липидов.

5. В условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов изменения активности сфингомиелиназы и интенсивности ПОЛ происходят однонаправленно. Природные антиоксиданты глутатион и билирубин могут не только защищать липиды клеточных мембран от пероксидного окисления, но и, воздействуя на активность СФМазы, оказывать влияние на важнейшие клеточные процессы, находящиеся под влиянием сфингомиелинового цикла.

Изучен характер влияния глутатиона в окисленной и восстановленной форме и билирубина на активность СФМазы при внутрибрюшинном введении их подопытным животным. Установлено, что восстановленный глутатион и билирубин обладают ингибирующим действием на фермент, а окисленный глутатион — активирующим.

Впервые проведено исследование изменения активности СФМазы, уровня ФНО-а и продуктов ПОЛ при перевязке общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи у подопытных животных. Обнаружен двухфазный характер изменения исследованных показателей: снижение на ранних сроках перевязки и повышение на более поздних сроках развития заболевания.

Впервые исследовано действие природного церамида in vivo. Установлено, что ЦЕР способен активировать процесс пероксидного окисления липидов.

Научно-практическая значимость. Результаты исследования имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания механизмов регуляции дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток с помощью сигнальной системы сфингомиелинового цикла. Выявленная нами коррелятивная взаимосвязь между активностью сфингомиелиназы и интенсивностью процесса пероксидного окисления липидов может свидетельствовать о возможности влияния на клеточные процессы, находящиеся под влиянием системы СФМ цикла, путем воздействия на процесс пероксидного окисления липидов. В частности, активаторы и ингибиторы процесса ПОЛ могут оказывать существенное влияние на эффективность противораковой терапии (направленной на индукцию апоптоза клеток опухоли).

Полученные данные при действии а-нафтилизотиоцианата свидетельствуют о возможности использования ингибиторов активности СФМазы и ПОЛ в качестве протекторов от действия ряда токсикантов, вызывающих гибель клеток печени.

Предложен новый механизм развития желчнокаменной болезни, заключающийся в активации проапоптотической системы сфингомиелинового цикла и экспрессии провоспалительного цитокина ФНО-а. Полученные данные позволяют предположить новую диагностическую систему для определения тяжести заболевания, заключающуюся в детекции активности СФМазы и накопления ФНО-а в крови больных, и применения для лечения ряда заболеваний препаратов нового поколения из класса ингибиторов сфингомиелиназы.

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ Института в рамках гранта РФФИ № 02-0448228, программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине»: «Разработка новых диагностико-прогностических критериев заболеваний печени, поджелудочной железы и желчевыводя-щих путей и методов терапии, направленных на предупреждение апопто-тической гибели клеток (гепатоцитов, панкреатоцитов)».

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных, Всесоюзных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: III Съезде биохимического общества, С.-Петербург, 2002; VI Межд. конф. «Биоантиоксидант», Москва, 2002г; II Ежегодн молод. конф. ИБХФ - ВУЗы «Биохимическая физика», Москва, 2002г.; XII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Казань, 2003; Intl. Congr. "Fortschritte in Gastroenterologie und Hepatologie 2001", Hannover, Germany, 2001; 42-44 ICBL Conf., Bergen, Norway, 2001, VIII Interl. Congr. on Phospholipids, Vienna, Austria, 2002; 25th World ISF Congr.; 3rd Euro Fed Lipid Congr., Edinburgh, Scotland, 2004.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 156 стр., включая 36 рисунков, 16 таблиц и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», выводов, списка аббревиатур и библиографического указателя (305 источников, из них 289 опубликованы в зарубежных изданиях).

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Цюпко, Алла Николаевна

6. В ы В О д ы

Впервые выполнено исследование изменения активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла - нейтральной СФМазы - in vivo в условиях активации и ингибирования процесса ПОЛ.

1. Определен характер изменения активности сфингомиелиназы под действием глутатиона в окисленной и восстановленной форме в печени мышей. Установлено, что восстановленный глутатион обладает ингиби-рующим действием на фермент, а окисленный глутатион - активирует СФМазу. Выявлена прямая корреляция между изменением активности сфингомиелиназы и изменением содержания продуктов ПОЛ в печени животных при действии окисленного и восстановленного глутатиона.

2. Исследовано влияние билирубина на активность сфингомиелиназы в органах животных. Показано, что в сердце и печени мышей билирубин проявляет ингибирующее действие на фермент. Установлена коррелятивная взаимосвязь между изменением активности сфингомиелиназы и изменением содержания продуктов ПОЛ в сердце и печени мышей при действии билирубина.

3. Впервые показано, что природный церамид самостоятельно способен индуцировать пероксидное окисление липидов в печени мышей.

4. Исследовано влияние а-нафтилизотиоцианата (АНИТ) на активность нейтральной СФМазы in vivo. Установлено активирующее действие АНИТ на СФМазу. Выявлена прямая корреляция между изменением активности сфингомиелиназы и изменением содержания продуктов ПОЛ в печени мышей при действии а-нафтилизотиоцианата.

5. Впервые проведено исследование изменения активности СФМазы, содержания продуктов пероксидпого окисления липидов и уровня провоспалителыюго и прооксидантного цитокина ФНО-а при перевязке общего желчного протока с последующим восстановлением оттока желчи у животных. Обнаружен двухфазный характер изменения исследуемых параметров: снижение на ранних сроках перевязки (3-9 суток) и повышение на более поздних сроках развития патологии (12-16 суток). Восстановление оттока желчи после перевязки продолжительностью 9 дней способно приводить к нормализации активности СФМазы, содержания продуктов ПОЛ и уровня ФНО-а, а при восстановлении оттока желчи после перевязки общего желчного протока длительностью 12 дней нормализации не происходит, и данные показатели сохраняются на уровне, превышающем контрольные значения. Выявлена прямая корреляция между активностью сфингомиелиназы, уровнем ФНО-а и содержанием продуктов ПОЛ.

6. Установлено, что изменение активности СФМазы и уровня продуктов пероксидного окисления липидов имеют однонаправленный характер как в условиях ингибирования, так и в условиях активации процесса ПОЛ. Выявлена коррелятивная взаимосвязь между данными параметрами, что свидетельствует о возможности влияния продуктов пероксидного окисления липидов на активность сфингомиелиназы.

7 С П И С О К АББРЕВИАТУР

АНИТ - а-нафтилизотиоцианат; СФМ - сфингомиелин

АФК - активные формы кислоро- СФМаза - сфингомиелиназа; да;

БР - билирубин; СФЗ - сфингозин;

ГЛ - глутатион;

ВГ - восстановленный глутатион; ОГ - окисленный глутатион; ДАГ - диацилглицерин;

ПКС - протеинкиназа С;

СФЗ-1-Ф - сфингозин-1-фосфат;

ФНО-а- фактор некроза опухоли-альфа;

ЦЕР - церамид;

ПОЛ — пероксидное окисление липидов;

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цюпко, Алла Николаевна, Москва

1. Алесенко А.В, Роль метаболитов сфингомиелинового цикла в проведении сигналов пролиферации, дифференцировки и смерти клеток // Биол. мембраны. 1999. Т. 16. №2. С.242-255.

2. Алесенко А.В. Функциональная роль сфингозина в индукции пролиферации и гибели клеток // Биохимия. 1998. Т.63. №1. С.75-82.

3. Алесенко А.В., Пантаз Э.А., Пушкарева М.Ю., Русаков С.А., Филиппова Г.Н. «Изменение уровня эндогенного сфингозина в ядрах клеток регенерирующей печени крыс» //Биохимия. 1993. Т.58. С.461-470.

4. Блюгер А.Ф., Дудник Л.Б., Майоре А .Я., Миезе И.Е. Роль билирубина как природного антиоксиданта в регуляции интенсивности перекисного окисления липидов при остром вирусном гепатите // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1985. Т.99. №2. С. 166-169.

5. Бурлакова Е.Б., Терехова С.Ф. Холестерин в реакциях свободноради-кального окисления // Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии. М.: Наука, 1976.С.22-23.

6. Дудник Л.Б., Цюпко А.Н., Хренов А.В. Алесенко А.В. Влияние билирубина на интенсивность пероксидного окисления липидов, активность сфингомиелиназы, и апоптоз, индуцированный сфингозином и УФ-облучением // Биохимия. 2001. Т.66. №9. С.1252-1262.

7. Жижина Г.П., Коробко В.Г., Алесенко А.В. «Корреляция деградации ДНК, индуцированной фактором некроза опухоли-а, с содержанием сфингозина в ядре и перекисей в ДНК» // Биохимия. 1994. Т.59. С. 13071313.

8. Пальмина Н.П., Мальцева E.JL, Бурлакова Е.Б. Протеникиназа С пе-роксилипидзависимый фермент // Химическая физика. 1995 Т. 14. №11. С.47-60.

9. Ю.Плохинский Н.А. Математические методы в биологии // М.: Изд-во МГУ, 1978. 362с.

10. ЬРешетняк В.И. Механизмы желчеобразования и первичный билиарный цирроз // М.: Изд-во Красная площадь, 2003. С.3-142

11. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот // Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С.63-64.

12. Дудник Л.Б., Цюпко А.Н., Хренов А.В. Алесенко А.В. «Влияние билирубина на интенсивность пероксидного окисления липидов, активность сфингомиелиназы и апоптоз, индуцированный сфингозином и УФ-облучением» // Биохимия. 2001.Т. 66. №9. С. 1252-1262.

13. Abate С, Patel L, Rauscher F.J. III,Curran Т. Redox regulation of Fos and Jun DNA-binding activity in vitro // Science. 1990. V.249. P. 1157-1164.

14. Abe J, Kusuhara M, Ulevitch R.J, Berk B.C., Lee J.D. Big mitogen-activated protein kinase 1 (BMK1) is a redox-sensitive kinase // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P. 16586-90.

15. Abe J, Takahashi M., Ishida M, Lee J.D, Berk B.C. c-Src is required for oxidative stress-mediated activation of big mitogen-activated protein kinase 1 // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.20389-94.

16. Adam-Klages S, Adam D, Wiegmann K, Struve S, Kolanus W, Schnei-der-Mergener J, Kronke M. FAN, a novel WD-repeat protein, couples the p55 TNF-receptor to neutral sphingomyelinase // Cell. 1996. V.86. P.937-947.

17. Albina J.E, Cui S, Mateo R.B, Reichner J.S. Nitric oxide-mediated apop-tosis in murine peritoneal macrophages // J. Immunol. 1993. V.150. P.5080-5085.

18. Alessenko A, Chatterjee S. Neutral sphingomyelinase: localization in rat liver nuclei and involvement in regeneration/proliferation // Mol. Cell. Bio-chem. 1995. V. 143. P. 169-74.

19. Alptekin N, Mehmetcik G, Uysal M, Aykac-Toker G. Evidence for oxidative stress in the hepatic mitochondria of bile duct ligated rats // Pharmacol. Res. 1997. V.36. №3. P.243-247.

20. Andrieu-Abadie N., Gouaze V., Salvayre R., Levade T. Ceramide in apop-tosis signaling: relationship with oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. 2001. V.31.P.717-728.

21. Arai Т., Bhunia A.K., Chatterjee S., Bulkley G.B. Lactosylceramide stimulates human neutrophils to upregulate Mac-1, adhere to endothelium, and generate reactive oxygen metabolites in vitro // Circ. Res. 1998. V.82. P.540-547.

22. Arnold R.S., Newton A.C. Inhibition of the insulin receptor tyrosine kinase by sphingosine // Biochemistry. 1991. V.30. P.7747-54.

23. Arora A.S., Jones B.J., Patel T.C., Bronk S.F., Gores G.J. Ceramide induces hepatocyte cell death through disruption of mitochondrial function in the rat // Hepatology. 1997. V.25. P.958-963.

24. Aykac G., Ozdemirler G. Inhibition of NADPH-induced microsomal lipid peroxidation in the livers of cholestatic rats // Pharmacol. Res. 1989. V.21. №1. P.39-42.

25. Baron V., Muriel P. Role of glutathione, lipid peroxidation and antioxidants on acute bile-duct obstruction in the rat // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V.1472. №1-2. P. 173-180.

26. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and calcium signalling // Nature. 1993. V.361. P.315-25.

27. Bhunia A.K., Han H., Snowden A., Chatterjee S. Redoxregulated signaling by lactosylceramide in the proliferation of human aortic smooth muscle cells // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 15642-15649.

28. Bianchini L., Todderud G., Grinstein S. Cytosolic Ca2+. homeostasis and tyrosine phosphorylation of phospholipase С gamma 2 in HL60 granulocytes // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.3357-63.

29. Bibel D.J., Aly R., Shinefield H.R. Topical sphingolipids in antisepsis and antifungal therapy//Clin. Exp. Dermatol. 1995. V.20. P.395-400.

30. Blake R.A., Walker T.R., Watson S.P. Activation of human platelets by peroxovanadate is associated with tyrosine phosphorylation of phospholipase С gamma and formation of inositol phosphates // Biochem. J. 1993. V.290. P.471-5.

31. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. 1959. V.37. P.911-923.

32. Boesen-de-Cock J.G.R. et al. CD95 (Fas/APO-1) induces ceramide formation and apoptosis in the absence of a functional acid sphingomyelinase // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.7560-7565.

33. Brawn M.K., Chiou W.J., Leach K.L. Oxidant-induced activation of protein kinase С in UC1 IMG cells // Free Radic. Res. 1995. V.22. P.23-37.

34. Brenner В., Ferlinz K., Grassme H., Weller M., Koppenhoefer U., Dichgans J., Sandhoff K., Lang F., and Gulbins E. Fas/CD95/Apo-I activates the acidic sphingomyelinase via caspases // Cell Death Differ. 1998. V.5. P.29-37.

35. Brumell J.H., Burkhardt A.L., Bolen J.B., Grinstein S. Endogenous reactive oxygen intermediates activate tyrosine kinases in human neutrophils // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.1455-61.

36. Bruno A.P., Laurent G., Averbeck D., Demur C., Bonnet J., Bettaieb A., Levade Т., Jaffrezou J.P. Lack of ceramide generation in TF-1 human myeloid leucemic cells resistant to ionizing radiation // Cell Death Differ. 1998. V.5. P.172-182.

37. Cadenas E., Davies K.J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging // Free Radic. Biol. Med. 2000. V.29. P.222-230.

38. Cao L.C., Honeyman Т., Jonassen J., Scheid C. Oxalateinduced ceramide accumulation in Madin-Darby canine kidney and LLC-PK1 cells // Kidney Int. 2000. V.57 P.2403-2411.

39. Chakraborti S., Michael J.R. Role of protein kinase С in oxidant-mediated activation of phospholipase A2 in rabbit pulmonary arterial smooth muscle cells//Mol. Cell. Biochem. 1993. V.122. P.9-15.

40. Chandra J., Samali A., Orrenius S. Triggering and modulation of apoptosis by oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. 2000. V.29. №3/4. P.323-333.

41. Chen Q., Olashaw N., Wu J. Participation of reactive oxygen species in the lysophosphatidic acid-stimulated mitogen-activated pr otein kinase activation pathway //J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.28499-28502.

42. Chiu S.M., Davis T.W., Meyers M., Ahmad N., Mukhtar H., Separovic D. Phthalocyanine 4-photodynamic therapy induces ceramide generation and apoptosis in acid sphingomyelinase-deficient mouse embryonic fibroblasts // Int. J. Oncol. 2000. V.16. P.423-427.

43. Chmura S.J., Nodzenski E., Crane M.A., Virudachalam S., Hallahan D.E., Weichselbaum R.R., and Quintans J. Cross-talk between ceramide and PKC activity in the control of apoptosis in WEHI-231 // Adv. Exp. Med. Biol. 1996. V.406. P.39-55.

44. Chmura S.J., Nodzenski E., Weichselbaum R.R., and Quintans J. Protein kinase С inhibition induces apoptosis and ceramide production through activation of a neutral sphingomyelinase // Cancer Res. 1996. V.56. P.2711-2714.

45. Choi A.M.K. Heme oxygenase-1 protects the heart // Circ. Res. 2001. V.89. P.105-107.

46. Conkling P.R., Patton K.L., Hannun Y.A., Greenberg C.S., Weinberg J.B. Sphingosine inhibits monocyte tissue factor-initiated coagulation by altering factor VII binding//! Biol. Chem. 1989. V.264. P. 18440-4.

47. Coroneos E., Wang Y., Panuska J.R., Templeton D.J., Kester M. Sphingol-ipid metabolites differentially regulate extracellular signal-regulated kinase and stress-activated protein kinase cascades // Biochem. J. 1996. V.316. P. 13-7.

48. Csonka C., Varga E., Kovacs P., Ferdinandy P., Blasig I.E., Szilvassy Z., Tosaki A. Heme oxygenase and cardiac function in ischemic/reperfiised rat hearts // Free Radic. Biol. Med. 1999. V.27. №1/2. P. 119-126.

49. Cuvillier O., Pirianov G., Kleuser В., Vanek P.G., Coso O.A., Gutkind S., Spiegel S. Suppression of ceramide-mediated programmed cell death by sphingosine-1-phosphate//Nature. 1996. V.381. P.800-3.

50. Cutler R.G., Mattson M.P. Sphingomyelin and ceramide as regulators of development and lifespan // Mechanisms of Ageing and Development. 2001. V. 122. P.895-908.

51. Dahm L.J., Roth R.A. Protection against alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injuiy by decreased hepatic non-protein sulfhydiyl content // Biochem. Pharmacol. 1991. V.42. №6. P. 1181 -1188.

52. Dahm L.J., Schultze A.E., Roth R.A. An antibody of neutrophils attenuates a-naphthylisothiocyanate-induced liver injury// J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. V.256. P.412-420.

53. Dbaibo G.S., Pushkareva M.Y., Rachid R.A., Alter N., Smyth M.J., Obeid L.M., Hannun Y.A. P53-dependent ceramide response to genotoxic stress // J. Clin. Invest. 1998. V.102. P.329-339.

54. Decaudin D., Geley S., Hirsch Т., Castedo M., Marchetti P., Macho A., Kofler R., Kroemer G. Bcl-2 and Bcl-XL antagonize the mitochondrial dysfunction preceding nuclear apoptosis induced by chemotherapeutic agents // Cancer Res. 1997. V.57. P.62-67.

55. Degli Esposti M., McLennan H. Mitochondria and cells produce reactive oxygen species in virtual anaerobiosis: relevance to ceramide-induced apoptosis // FEBS Lett. 1998. V.430. P.338-342.

56. De Maria R., Rippo M.R., Schuchman E.H., Testi R. Acidic sphingomyelinase (ASM) is necessary for fas-induced GD3 ganglioside accumulation and efficient apoptosis of lymphoid cells // J. Exp. Med. 1998. V.187. P.897-902.

57. Denisova N., Fisher D., Provost M. The role of glutathione, membrane sphingomyelin and its metabolites in oxidative stress induced calcium «dysregulation» in PC 12 cells. // Free Radikal Biology and Medicine. 1999. V.27. N11/12. P.1292-1301.

58. Desai N.N., Zhang H., Olivera A., Mattie M.E., Spiegel S. Sphingosine-1-phosphate, a metabolite of sphingosine, increases phosphatidic acid levels by phospholipase D activation // J. Biol. Chem. 1992. V.267. P.23122-8.

59. Devary Y., Gottlieb R.A., Lau L.F., Karin M. Rapid and preferential activation of the c-jun gene during the mammalian UV response // Mol. Cell. Biol. 1991. V.ll.P.2804-11.

60. Devary Y., Gottlieb R.A., Smeal Т., Karin M. The mammalian ultraviolet response is triggered by activation of Src tyrosine kinases // Cell. 1992. V.71. P.1081-1091.

61. Di Paola M., Cocco Т., Lorusso M. Ceramide interaction with the respiratory chain of heart mitochondria // Biochemistry. 2000. V.39. P.6660-6668.

62. Dobrowsky R.T., Kamibayashi C., Mumby M.C., Hannun Y.A. Ceramide activates heterotrimeric protein phosphatase 2A // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.15 523-15 530.

63. Dressier K.A., Mathias S., Kolesnick R.N. Tumor necrosis factor-alpha activates the sphingomyelin signal transduction pathway in a cell-free system // Science. 1992. V.255. P. 1715-8.

64. Dudnik L.B., Zyupko A.N., Khrenov A.V., Alessenko A.V. «Effect of bilirubin on lipid peroxidation, sphingomyelinase activity and apoptosis induced by sphingosine and UV irradiation» // Chem. Phys. Lipids. 2001. V. 112. № 2. P. 74-75.

65. Dutton M.F. Fumonisins, mycotoxins of increasing importance: their nature and their effects // Pharmacol. Ther. 1996. V.70. P. 137-161.

66. Eriksen E.F., Danielsen H., Brodersen R. Bilirubin-liposome interaction. Binding of bilirubin dianion, protonization, and aggregation of bilirubin acid // J. Biol. Chem. 1981. V.256. №9. P.4269-4274.

67. Esposti M.D, Hatzinisiriou I, McLennan H, Ralph S. Bcl-2 and mitochondrial oxygen radicals. New approaches with reactive oxygen species-sensitive probes //J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.29831-29837.

68. Favero T.G, Zable A.C, Abramson J.J. Hydrogen peroxide stimulates the Ca2+ release channel from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.25557-63.

69. Fehsel K, Kroncke K.D, Meyer K.L, Huber H, Wahn V, Kolb-Bachofen V. Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes // J. Immunol. 1995. V.155. P.2858-2865.

70. Fialkow L, Chan C.K, Grinstein S, Downey G.P. Regulation of tyrosine phosphorylation in neutrophils by the NADPH oxidase. Role of reactive oxygen intermediates//J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 17131-7.

71. Fialkow L, Chan C.K, Rotin D, Grinstein S, Downey G.P. Activation of the mitogen-activated protein kinase signaling pathway in neutrophils // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.31234-31242.

72. Fischer E.H, Charbonneau H, Tonks N.K. Protein tyrosine phosphatases: a diverse family of intracellular and transmembrane enzymes // Science. 1991. V.253. P.401-6.

73. Fornace A.J. Jr. Mammalian genes induced by radiation; activation of genes associated with growth control // Annu. Rev. Genet. 1992. V.26. P.507-26.

74. Fox E.S, Kim J.C, Tracy T.F. NF-kB activation and modulation in hepatic macrophages during cholestatic injury // J. Surg. Res. 1997. V.72. P. 129-134.

75. France-Lanord V., Brugg В., Michel P. P., Agid Y., Ruberg M. Mitochondrial free radical signal in ceramide-dependent apoptosis: a putative mechanism for neuronal death in Parkinson's disease // J. Neurochem. 1997. V.69. P. 16121621.

76. Frei В., Stocker R., Ames B.N. Antioxidant defenses and lipid peroxidation in human blood plasma // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1988. V.85. №24. P.9748-9752.

77. Furuke K., Bloom E.T. Redox-sensitive events in Fas-induced apoptosis in human NK cells include ceramide generation and protein tyrosine dephos-phorylation // Int. Immunol. 1998. V.10. P.1261-1272.

78. Gallenkamp H., Richter E. Influence of alpha-naphthylisothiocyanate (ANIT) on microsomal cytochrome P-450, protein and phospholipid content in rat liver//Biochem. Pharmacol. 1974. V.23. №17. P.2431-2435.

79. Ghafourifar P., Klein S.D., Schucht O., Schenk U., Pruschy M.; Rocha S., Richter C. Ceramide induces cytochrome с release from isolated mitochondria.1.portance of mitochondrial redox state III. Biol. Chem. 1999. V.274. P.6080-6084.

80. Ghosh Т.К., Bian J., Gill D.L. Sphingosine 1-phosphate generated in the endoplasmic reticulum membrane activates release of stored calcium // J. Biol, Chem. 1994. V.269. P.22628-35.

81. Goldfarb S., Singer E.J., Popper H Experimental cholestasis due to a -napthylisothiocyanate (ANIT) // Am. J. Pathol. 1962. V.40. P.685-695.

82. Goldman R., Ferber E., Zort U. Reactive oxygen species are involved in the activation of cellular phospholipase A2 // FEBS Lett. 1992. V.309. P. 190-2.

83. Gomez-Munoz A., Waggoner D.W., O'Brien L., Brindley D.N. Interaction of ceramides, sphingosine, and sphingosine 1-phosphate in regulating DNA synthesis and phospholipase D activity // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.26318-25.

84. Goodemote K.A., Mattie M.E., Berger A., Spiegel S. Involvement of a pertussis toxin-sensitive G protein in the mitogenic signaling pathways of sphingosine 1-phosphate//J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.10272-7.

85. Gopalakrishna R., Anderson W.B. Reversible oxidative activation and inactivation of protein kinase С by the mitogen/tumor promoter periodate // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V.285. P.382-7.

86. Grasser F.A., LaMontagne К., Whittaker L., Stohr S., Lipsick J.S. A highly conserved cysteine in the v-Myb DNA-binding domain is essential for transformation and transcriptional trans-activation // Oncogene. 1992. V.7. P. 1005-9.

87. Grether-Beck S., Bonizzi G., Schmitt-Brenden H., Felsner I., Timmer A., Sies H., Johnson J.P., Piette J., Krutmann J. Nonenzymatic triggering of the ceramide signalling cascade by solar UVA radiation // EMBO J. 2000. V.19. P.5793-5800.

88. Gudz T.I., Tserng K.Y., Hoppel C.L. Direct inhibition of mitochondrial respiratory chain complex III by cell-permeable ceramide // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.24154-24158.

89. Guehmann S., Vorbrueggen G., Kalkbrenner F., Moelling K. Reduction of a conserved Cys is essential for Myb DNA-binding // Nucleic. Acids. Res. 1992. V.20. P.2279-86.

90. Guyton K.Z., Liu Y., Gorospe M., Xu Q., Holbrook N.J. Activation of mitogen-activated protein kinase by H202. Role in cell survival following oxidant injury //J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.4138-4142.

91. Haimovitz-Friedman A., Kan C.C., Ehleiter D., Persaud R.S., McLough-lin M., Fuks Z., Kolesnick R.N. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis // J. Exp. Med. 1994. V.180. P.525-535.

92. Hakomori S. Functional role of glycosphingolipids in tumor progression //J. Exp. Med. 1992. V.168. P.211-22.

93. Hannun Y.A. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress // Science (Washington, D.C.). 1996. V.274. P. 1855-1859.

94. Hannun Y.A. The sphingomyelin cycles and the second messenger function of ceramide. // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.3125-3128.

95. Hannun Y.A., Loomis C.R., Merrill A.H., Jr. and Bell R.M. Sphingosine inhibition of protein kinase С activity and of phorbol dibutyrate binding in vitro and human platelets //J. Biol. Chem. 1986. V.261. P. 12604 12609.

96. Hannun Y.A., Luberto C., Argraves K.M. Enzymes of sphingolipid metabolism: from modular to integrative signaling // Biochemistry. 2001. V.40. P.4893-4903.

97. Hannun Y.A., Obeid L.M. Ceramide: an intracellular signal for apoptosis. //TIBS. 1995. V.20. P.73-77.

98. Hannun Y.A., Obeid L.M., Wolff R.A. The novel second messenger ceramide: identification, mechanism of action and cellular activity. // Adv. Lipid Res. 1993. V.25. P.43-64.

99. Hardwick J.S., Sefton B.M. Activation of the Lck tyrosine protein kinase by hydrogen peroxide requires the phosphorylation of Tyr-369 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.4527-4531.

100. Harfield P.J., Mayne G.C., Murray A.W. Ceramide induces apoptosis in PC 12 cells//FEBS Lett. 1997. V.401. P. 148-152.

101. Heffetz D., Bushkin I., Dror R. Zick Y. The insulinomimetic agents H202 and vanadate stimulate protein tyrosine phosphorylation in intact cells // J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.2896-2902.

102. Heffetz D., Rutter W.J., Zick Y. The insulinomimetic agents H202 and vanadate stimulate tyrosien phosphotrylation of potential target proteins for the insulin receptor kinase in intact cells // Biochem. J. 1992. V.288. P.631-635.

103. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis // Nature. 2000. V.407. P.770-776.

104. Hernandez O.M, Discher D.J, Bishopric N.H, Webster K.A. Rapid activation of neutral sphingomyelinase by hypoxiareoxygenation of cardiac myocytes // Circ. Res. 2000. V.86. P. 198-204.

105. Hill D.A, Roth R.A. Alpha-naphthylisothiocyanate causes neutrophils to release factors that are cytotoxic to hepatocytes // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1998. V.148. №1. P.169-175.

106. Horinouchi K, Erlich S, Perl D.P, Ferlinz K, Bisgaier C.L,Sandhoff K, Desnick R.J, Stewart C.L, Schuchman E.H. Acid sphingomyelinase deficient mice: a model of types A and В Niemann-Pick disease // Nat. Genet.1995. V.10. P.288-293.

107. Hostetler K.J, Yazaki P.J. The subcellular localization of neutral sphingomyelinase in rat brain // J. Lipid Res. 1979. V.20. P.456-463.126.

108. Huang W.C, Chueh S.H. Calcium mobilization from the intracellular mitochondrial and nonmitochondrial stores of the rat cerebellum // Brain Res.1996. V.718. P.151-8.

109. Huwiler A, Pfeilschifter J, van den Bosch H. Nitric oxide donors induce stress signaling via ceramide formation in rat renal mesangial cells // J. Biol. Chem. 1999a. V.274. P.7190-7195.

110. Huwiler A, Dorsch S, Briner V.A, van den Bosch H, Pfeilschifter J. Nitric oxide stimulates chronic ceramide formation in glomerular endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999b. V.258. P.60-65.

111. Ito Y., Nakashima S., Nozawa Y. Hydrogen peroxide-induced phosphol-ipase D activation in rat pheochromocytoma PC 12 cells: possible involvementof Ca2+-dependent protein tyrosine kinase // J. Neurochem. 1997. V.69. P.72936.

112. Jain J., Loh C., Rao A. Transcriptional regulation of the IL-2 gene // Curr. Opin. Immunol. 1995. V.7. P.333-42.

113. Jayadev S., Hayter H.L., Andrieu N., Gamard C.J., Liu В., Balu R., Ha-yakawa M., Ito F, Hannun, Y.A. Phospholipase A2 is necessary for tumor necrosis factor .-induced ceramide generation in L929 cells // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.17 196- 17 203.

114. Jayadev S., Linardic C.M., Hannun Y.A. Identification of arachidonic Ф acid as a mediator of sphingomyelin hydrolysis in response to tumor necrosisfactor-a // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.5757-5763.

115. Jarvis W.D., Fornari F.A. Jr., Browning J.L., Gewirtz D.A., Kolesnick R.N., and Grant S. Attenuation of ceramide-induced apoptosis by diglyceride in human myeloid leukemia cells // J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.31 685 -31692.

116. Jean P.A., Bailie M.B., Roth R.A. 1-naphthylisothiocyanate-induced elevation of biliary glutathione // Biochem. Pharmacol. 1995. V.49. №2. P.197-202.

117. Jones M.J., Murray A.W. Evidence that ceramide selectively inhibits protein kinase C-a translocation and modulates bradykinin activation of phospholipase D. // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.5007 5013.

118. Jung E.M., Griner R.D., Mann-Blakeney R., Bollag W.B. A potential role for ceramide in the regulation of mouse epidermal keratinocyte proliferation and differentiation // J. Invest. Dermatol. 1998. V.l 10. P.318-323.

119. Kamata H., Hirata H. Redox regulation of cellular signalling // Cell. Signal. 1999. V.l 1, №1. P.l-14.

120. Kan C.C., Kolesnik R. Signal trunsduction via the sphingomyelin pathway. // Trends Glycoscience Glycotechnology. 1993. V.5. P.99-106.

121. Kaplin A.I., Ferris C.D., Voglmaier S.M., Snyder S.H. Purified reconstituted inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. Thiol reagents act directly on receptor protein //J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.28972-8.

122. Keyse S.M., Emslie E.A. Oxidative stress and heat shock induce a human gene encoding a protein-tyrosine phosphatase. Nature // 1992. V.359. P.644-7.

123. Kim J.H., Kwack H.J., Choi S.E., Kim B.C., Kim Y.S., Kang I.J., Kumar C.C. Essential role of Rac GTPase in hydrogen peroxide-induced activation of c-fos serum response element // FEBS Lett. 1997. V.406. P.93-6.

124. Kiss Z., Anderson W.H. Hydrogen peroxide regulates phospholipase D-mediated hydrolysis of phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine by different mechanisms in NIH 3T3 fibroblasts // Arch. Biochem. Biophys. 1994. V.311. P.430-6.

125. Knebel A., Rahmsdorf H.J., Ullrich A., Herrlich, P. Dephosphorylation of receptor tyrosine kinases as target of regulation by radiation, oxidants, or alkylating agents // EMBO J. 1996. V. 15. P.5314-5325.

126. Kolesnick R.N. 1,2-Diacylglycerols but not phorbol esters stimulate sphingomyelin hydrolysis in GH3 pituitary cells // J. Biol. Chem. 1987. V.262. P. 16 759- 16 762.

127. Kolesnick R.N. The therapeutic potential of modulating the cera-mide/sphingomyelin pathway // J. Clin. Invest. 2002. V.l 10. P.3-8.

128. Kolesnik R.N., Golde D.W. The sphingomyelin pathway in tumor necrosis factor and interleukin-1 signaling// Cell. 1994. V.77. P.325-328.

129. Komatsu M., Takahashi Т., Abe Т., Takahashi I., Ida H., Takada G. Evidence for the association of ultraviolet-C and I^C^-induced apoptosis with acid sphingomyelinase activation // Biochim. Biophys. Acta. 2001. V.l533. P.47-54.

130. Kongo M., Ohta Y., Nishida K., Sasaki E., Harada N., Ishiguro I. An association between lipid peroxidation and alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury in rats // Toxicol. Lett. 1999. V.105. №2. P.103-110.

131. Konishi H., Tanaka M., Takemura Y., Matsuzaki H., Ono Y., Kikkawa U., Nishizuka Y. Activation of protein kinase С by tyrosine phosphorylation in response to H202 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V.94. P. 11233-7.

132. Krahenbuhl S., Talos C., Lauterburg B.H., Reichen J. Reduced antioxi-dative capacity in liver mitochondria from bile duct ligated rats // Hepatology. 1995. V.22. №2. P.607-612.

133. Kuno K., Sukegawa K., Ishikawa Y., Orii Т., Matsushima K. Acid sphingomyelinase is not essential for the IL-1 and tumor necrosis factor receptor signaling pathway leading to NFkB activation // Int. Immunol. 1994. V.6. P. 1269-72.

134. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V.227. №259. P.680-685.

135. Lander H.M., Ogiste J.S., Teng K.K., Novogrodsky A. p21ras as a common signaling target of reactive free radicals and cellular redox stress // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.21195-8.

136. Lee T.S., Chau L.Y. Heme oxygenase-mediates the anti-inflammatory effect of interleukin-10 in mice // Nat. Med. 2002. V.8. №3. P.240-246.

137. Lee Y., Chen J., Amoscato A., Bennouna J., Spitz D., Suntharalingam M., Rhee J. Protective role of Bcl2 in metabolic oxidative stress-induced cell death //J. Cell Sci. 2001. V.l 14. P.677-684.

138. Levade Т., Jaffrezou J. P. Signalling sphingomyelinases: which, where, how and why? //Biochem. Biophys. Acta. 1999. V.1438. P.l-17.

139. Li J., Zheng R., Li J., Wang Z. Mechanisms of the induction of apoptosis in human hepatoma cells by tumour necrosis factor-a // Cell Biol. Internat. 2001. V. 25. №12. P.1213-1219.

140. Liu В., Obeid L.M., Hannun Y.A. Sphingomyelinases in cell regulation // Sem. Cell Develop. Biol. 1997. V.8. P.311-322. lb 167. Liu В., Andrieu-Abadie N., Levade Т., Zhang P., Obeid L.M., Hannun

141. Y.A. Glutathione regulation of neutral sphingomyelinase in tumor necrosis factor-alpha-induced cell death//J. Biol. Chem. 1998. V.273 P. 11313 11320.

142. Liu В., Hannun Y.A. Inhibition of the neutral magnesium-dependent sphingomyelinase by glutathione // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P. 16281 -16287.

143. Lui В., Hassler D.F., Smith G.K. Purification and charakterisation of a membrane bound neutral pH optimum Mg dependent and phosphatidylserine - stimulated sphingomyelinase from rat brain. // J. Biol. Chem. 1998b. P. 34472-34479.

144. Liu J., Mathias S., Yang Z., and Kolesnick R.N. Renaturation and tumor necrosis factor-a. stimulation of a 97-kDa ceramide-activated protein kinase //

145. J. Biol. Chem. 1994. V.269. P.3047-3052.

146. Ljubuncic P., Fuhrman В., Oiknine J., Aviram M., Bomzon A. Effect of deoxycholic acid and ursodeoxycholic acid on lipid peroxidation in cultured macrophages // Gut. 1996. V.39. P.475-478.

147. Lopez-Lluch G., Barroso M.P., Martin S.F., Fernandez-Ayala D.J., Gomez-Diaz C., Villalba J.M., Navas P. Role of plasma membrane coenzyme Q on the regulation of apoptosis //Biofactors. 1999. V.9. P.171-177.

148. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.J., Randall R.J. Protein measurers ments with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275.

149. Manzoli F.A., Muchmore J.H., Bonora В., Capitani S., Bartoli S. Lipid— DNA interactions. II. Phospholipids, cholesterol, glycerophosphorylcholine, spingosine and fatty acids // Biochim. Biophys. Acta. 1974. V.340. P.1-15.

150. Marchesini N., Hannun Y.A. Acid and neutral sphingomyelinases: roles and mechanisms of regulation // Biochem. Cell Biol. 2004. V.82. P.27-44.

151. Matecki A., Pawelczyk T. Regulation of phospholipase С deltal by sphingosine // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.1325. P.287-96.

152. Mathias S., Dressier K.A., Kolesnick R.N. Characterization of a cera-mide-activated protein kinase: stimulation by tumor necrosis factor alpha // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991. V.88. P.10009-13.

153. Mathias S., Pena L.A, Kolesnick R.N. Signal transduction of stress via ceramide // Biochem. J. 1998. V.335. P.465-480.

154. Matthews J.R., Wakasugi N., Virelizier J.L., Yodoi J., Hay R.T. Thiore-doxin regulates the DNA binding activity of NF-kappa В by reduction of a di-sulphide bond involving cysteine 62 // Nucleic. Acids. Res. 1992. V.20. P.3821-30.

155. Maurer B.J, Metelitsa L.S, Seeger R.C, Cabot M.C, Reynolds C.P. Increase of ceramide and induction of mixed apoptosis/necrosis by N-(4-hydroxyphenil)-retinamide in neuroblastoma cell lines // J.Natl. Cancer Inst. 1999. V.91.P.1138-1146.

156. McDonald O.B, Hannun Y.A, Reynolds C.H, Sahyoun N. Activation of casein kinase II by sphingosine//J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.21773-6.

157. Megidish T, White T, Takio K, Titani K, Igarashi Y, Hakomori S. The signal modulator protein 14-3-3 is a target of sphingosine- or N,N-dimethylsphingosine-dependent kinase in 3T3(A31) cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. V.216. P.739-47.

158. Meister A, Anderson M. Glutathione // Ann. Rev. Biochem. 1983. V.52. P.711-760.

159. Merrill A.H. Jr., Stevens V.L. Modulation of protein kinase С and diverse cell functions by sphingosine—a pharmacologically interesting compoundlinking sphingolipids and signal transduction // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V.1010. P.131-9.

160. Meyer M., Schreck R., Baeuerle P.A. H202 and antioxidants have opposite effects on activation of NF-kappa В and AP-1 in intact cells: AP-1 as secondary antioxidant-responsive factor//EMBO J. 1993. V.l2. P.2005-15.

161. Missiaen L., Taylor C.W., Berridge M.J. Spontaneous calcium release from inositol trisphosphate-sensitive calcium stores // Nature. 1991. V.352. P.241-4.

162. Muriel P., Suarez O.R. Role of lipid peroxidation in biliary obstruction in the rat //J. Appl. Toxicol. 1994. V.14. №6. P.423-426.

163. Nagaoka S., Cowger M.L. Interaction of bilirubin with lipids studied by fluorescence quenching method // J. Biol. Chem. 1978. V.253. №6. P.2005-2011.

164. Nakamura H., Nakamura Y., Yodoi J. Redox regulation of cellular acti-vayion // Annual Review of Jmmunology. 1997. V.15. P.351-369.

165. Nakamura K., Hori Т., Sato N., Sugie K., Kawakami Т., Yodoi J. Redox regulation of a src family protein kinase p561ck in Tcells // Oncogene. 1993. V.8. P.3133-3139.

166. Nakamura K., Hori Т., Yodoi J. Alternative binding of p561ck and phos-phatidylinositol 3-kinase in T cells by sulfhydryl oxidation: implication of aberrant signaling due to oxidative stress in T lymphocytes // Mol. Immunol. 1996. V.33. P.855-65.

167. Nakamura S., Kozutsumi Y., Sun Y., Miyake Y., Fujita Т., Kawasaki T. Dual roles of sphingolipids in signaling of the escape from and onset of apoptosis in a mouse cytotoxic T-cell line, CTLL-2 // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.1255-7.

168. Natarajan V., Taher M.M., Roehm В., Parinandi N.L., Schmid H.H., Kiss Z., Garcia J.G. Activation of endothelial cell phospholipase D by hydrogen peroxide and fatty acid hydroperoxide // J. Biol. Chem. 1993. V.268 .P.930-7.

169. Natarajan V., Vepa S., Verma R.S., Scribner W.M. Role of protein tyrosine phosphorylation in H202-induced activation of endothelial cell phospholi-pase D//Am. J. Physiol. 1996. V.271. P.L400-8.

170. Needleman D.H., Aghdasi В., Seryshev A.B., Schroepfer G.J. Jr., Hamilton S.L. Modulation of skeletal muscle Ca2(+)-release channel activity by sphingosine // Am. J. Physiol. 1997. V.272. P.C 1465-74.

171. Nemani R., Lee E.Y. Reactivity of sulfhydryl groups of the catalytic subunits of rabbit skeletal muscle protein phosphatases 1 and 2A // Arch. Biochem. Biophys. 1993. V.300. P.24-9.

172. Newton A.C. Regulation of protein kinase С // Curr. Opin. Cell. Biol. 1997. V.9. P.161-7.

173. Nickels J.T., Broach J.R. A ceramide-activated protein phospholiphase mediates ceramide-induced Gi arrest of Saccharomyces cerevisiae // Genes Dev. 1996. V.10. P.382-394.

174. Obeid L.M., Venable M.E. Signal transduction in cellular senescence // J. Am. Geriatr. Soc. 1997. V.45. P.361-366.

175. Ohta H., Yatomi Y., Sweeney E.A., Hakomori S., Igarashi Y. A possible role of sphingosine in induction of apoptosis by tumor necrosis factor-alpha in human neutrophils // FEBS Lett. 1994. V.355. P.267-70.

176. Ohta Y., Kongo M., Kishikawa T. Preventive effect of melatonin on the progression of alpha-naphthylisothiocyanate-induced acute liver injury in rats // J. Pineal Res. 2003. V.34. №3. P.185-193.

177. Okazaki Т., Bell R.M., Hannun Y.A. Sphingomyelin turnover induced by vitamin D3 in HL-60 cells Role in cell differentiation // J. Biol. Chem. 1989. V.264. P. 19076-80.

178. Okuno H., Akahori A., Sato H., Xanthoudakis S., Curran Т., Iba H. Escape from redox regulation enhances the transforming activity of Fos // Oncogene. 1993. V.8. P.695-701.

179. Orellana M., Rodrigo R., Thielemann L., Guajardo V. Bile duct ligation and oxidative stress in the rat: effects in liver and kidney // Сотр. Biochem. Physiol. 2000. V.126. №2. P.105-111.

180. Orsler D.J., Ahmed-Choudhury J., Chipman J.K., Hammond Т., Coleman R. ANIT-induced disruption of biliary function in rat hepatocyte couplets //Toxicol. Sci. 1999. V.47. №2. P.203-210.

181. O'Shea J.J., McVicar D.W., Bailey T.L., Burns C., Smyth M.J. Activation of human peripheral blood T lymphocytes by pharmacological induction of protein-tyrosine phosphorylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.10306-10.

182. Otterbach В., Stoffel W. Acid sphingomyelinase deficient mice mimic the neurovisceral form of human lysosomal storage disease (Niemann-Pick disease) //Cell. 1995. V.81. P.1053-1061.

183. Oude Elferink R.P., Ottenhoff R., Radominska A., Hofmann A.F., Kui-pers F., Jansen P.L. Inhibition of glutathione-conjugate secretion from isolated hepatocytes by dipolar bile acids and other organic anions // Biochem. J. 1991. V.274. №1. P.281-286.

184. Pahan K., Dobashi K., Ghosh В., Singh I. Induction of the manganese superoxide dismutase gene by sphingomyelinase and ceramide // J. Neurochem. 1999. V.73. P.513-520.

185. Pahan К., Sheikh F.G., Khan M., Namboodiri A.M., Singh I. Sphingomyelinase and ceramide stimulate the expression of inducible nitric oxide synthase in rat primary astrocytes // J. Biol.Chem. 1998. V.273. P.2591-2600.

186. Paolucci C., Rovere P., De Nadai C., Manfredi A.A., Clementi E. Nitric oxide inhibits the tumor necrosis factor-a-regulated endocytosis of human dendritic cells in a cyclic GMPdependent way // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.19638-19644.

187. Parola M., Leonarduzzi G., Robino G., Albano E., Poli G., Dianzani M.U. On the role of lipid peroxidation in the pathogenesis of liver damage induced by long standing cholestasis //Free Radic. Biol. Med. 1996. V.20. P.351-359.

188. Parola M., Robino G. Oxidative stress-related molecules and liver fibrosis // J. Hepatol. 2001. V.35. P.297-306.

189. Pillal S., Mahajan M., Carlomusto M. Ceramide potentiates, but sphingomyelin inhibits, vitamin D-induced keratinocyte differentiation: comparison between keratinocytes and HL-60 cells // Arch. Dermatol. Res. 1999. V.291. P.284-289.

190. Plaa G.L., Priestly B.G. Intrahepatic cholestasis induced by drugs and chemicals // Pharmacol. Rev. 1977. V.28. P.207-273.

191. Puntis M.C., Jiang W.G. Plasma cytokine levels and monocyte activation in patients with obstructive jaundice // J. Gastroenterol. Hepatol. 1996. V.ll. №1. P.7-13.

192. Pyne S., Pyne N.J. The differential regulation of cyclic AMP by sphin-gomyelin-derived lipids and the modulation of sphingolipid-stimulated extracellular signal regulated kinase-2 in airway smooth muscle // Biochem. J.1996. V.315. P.917-23.

193. Qin S., Inazu Т., Yamamura H. Activation and tyrosine phosphorylation of p72syk as well as calcium mobilization after hydrogen peroxide stimulation in peripheral blood lymphocytes // Biochem. J. 1995. V.308. P.347-52.

194. Qin S., Minami Y., Hibi M., Kurosaki Т., Yamamura H. Syk-dependent and -independent signaling cascades in В cells elicited by osmotic and oxidative stress // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.2098-103.

195. Quillet-Mary A., Jaffre zou J.P., Mansat V., Bordier C., Naval J., Laurent G. Implication of mitochondrial hydrogen peroxide generation in ce-ramide-induced apoptosis//J. Biol.Chem. 1997. V.272. P.21388-21395.

196. Raha S., Robinson B.H. Mitochondria oxygen free radicals, disease, and aging //Trends Biochem. Sci. 2000. V.25. P.502-508.

197. Raines M.A., Kolesnick R.N., Golde D.W. Sphingomyelinase and ceramide activate mitogen-activated protein kinase in myeloid HL-60 cells // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 14572-5.

198. Rao G.N. Hydrogen peroxide induces complex formation of SHC-Grb2-SOS with receptor tyrosien kinase and activates Ras and extracellular signalregulated protein kinases group of mitogenactivated protein kinases // Oncogene. 1996. V.13. P.713-719.

199. Rebecchi M.J, Pentyala S.N. Structure, function, and control of phos-phoinositide-specific phospholipase С // Phisiol. Rev. 2000. V.80. P. 12911335.

200. Reeves J.P, Bailey C.A, Hale C.C. Redox modification of sodium-calcium exchange activity in cardiac sarcolemmal vesicles // J. Biol. Chem. 1986. V.261. P.4948-55.

201. Renard-Rooney D.C, Joseph S.K, Seitz M.B, Thomas A.P. Effect of oxidized glutathione and temperature on inositol 1,4,5-trisphosphate binding in permeabilized hepatocytes//Biochem. J. 1995. V.310. P.l85-92.

202. Rink L, Cakman I, Kirchner H. Altered cytokine production in the elderly//Mech. Ageing Dev. 1998. V.102. P. 199-209.

203. Roberts R.J. Microsomal metabolism of the hepatotoxin a-naphthylisothiocyanate (ANIT) following phenobarbital, chlorpromazine or ac-tinomycin D treatment // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1973. V.142. №1. P.365-367.

204. Rodrigues C.M, Steer C.J. Mitochondrial membrane perturbations in cholestasis // J. Hepatol. 2000. V.32. №1. P. 135-141.

205. Rolo A.P, Palmeira C.M, Wallace K.B. Interactions of combined bile acids on hepatocyte viability: cytoprotection or synergism // Toxicol. Lett. 2002. V.126. P.197-203.

206. Rooney T.A, Renard D.C, Sass E.J, Thomas A.P. Oscillatory cytosolic calcium waves independent of stimulated inositol 1,4,5-trisphosphate formation in hepatocytes//J. Biol. Chem. 1991. V.266. P. 12272-82.

207. Roth R.A, Hewett J.A. The cholestatic agent, a-naphthylisothiocyanate stimulates superoxide release by rat neutrophils in vitro II Lab. Invest. 1990. V.62. №6. P.736-741.

208. Ruvolo P.P. Ceramide induces Bcl-2 dephosphorylation via a mechanism involving mitochondrial PP2A // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.20 296-20 300.

209. Sabala P., Wiktorek M., Czarny M., Chaban V., Baranska J. Sphingosine stimulates calcium mobilization and modulates calcium signals evoked by thapsigargin in glioma C6 cells // Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 1996. V.56. P.507-13.

210. Sawai H., Okazaki Т., Yamamoto H., Okano H., Takeda Y., Tashima M., Sawada H., Okuma M., Ishikura H., Umehara H., Domae N. Requirement of AP-1 for ceramide-induced apoptosis in human leukemia HL-60 cells // J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.27326-27331.

211. Schreck R., Rieber P., Baeuerle P.A. Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa В transcription factor and HIV-1 // EMBO J. 1991. V.l0. P.2247-2258.

212. Schutze S., Pothoff K., Machleidt Т., Berkovic D., Wiegmann K., and Kronke M. TNF activates NF-kappa В by phosphatidylcholine-specific phos-pholipase C-induced "acidic" sphingomyelin breakdown // Cell. 1992. V.71. P.765-776.

213. Sies H. Glutathione and its role in cellular functions // Free Radical Biology and Medicine. 1999. V. 22. № 9/10. P 916-921.

214. Schwandner R., Wiegmann K., Bernardo K., Kreder D., Kronke M. TNF receptor death domain-associated proteins TRADD and FADD signal activation of acid sphingomyelinase//J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.5916-5922.

215. Secrist J.P., Burns L.A., Karnitz L., Koretzky G.A., Abraham R.T. Stimulatory effects of the protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, on T-cell activation events // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.5886-5893.

216. Shasby D.M., Yorek M., Shasby S.S. Exogenous oxidants initiate hydrolysis of endothelial cell inositol phospholipids // Blood. 1988. V.72. P.491-9.

217. Shimeno H., Soeda S., Sakamoto M., Kouchi Т., Kowakame Т., Kihara T. Partial purification and characterization of sphingosine N-acyltransferase (ceramide synthase) from bovine liver mitochondrion-rich fraction // Lipids. 1998. V.33.P.601-605.

218. Singh I., Pahan K., Khan M., Singh A.K. Cytokine-mediated induction of ceramide production is redox-sensitive. Implications to proinflammatory cytokine-mediated apoptosis in demyelinating diseases // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.20354-20362.

219. Sokol R.J., Devereaux M., Khandwala R.A., O'Brien K. Evidence for involvement of oxygen free radicals in bile acid toxicity to isolated rat hepato-cytes // Hepatology. 1995. V.17. P.869-881.

220. Spiegel S., Merrill A.H. Jr. Sphingolipid metabolism and cell growth regulation // FASEB J. 1996. V.10. P. 1388-97.

221. Stocker R., Ames B.N. Potential role of conjugated bilirubin and copper in the metabolism of lipid peroxides in bile // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1987. V.84. №22. P.8130-8134.

222. Suzuki Y.J., Ford G.D. Inhibition of Ca(2+)-ATPase of vascular smooth muscle sarcoplasmic reticulum by reactive oxygen intermediates // Am. J. Physiol. 1991. V.261. P.H568-74.

223. Takeda Y., Tashima M., Takahashi A., Uchiyama Т., Okazaki T. Ceramide generation in nitric oxide-induced apoptosis. Activation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase via caspase-3 // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 10654-10660.

224. Takekoshi S., Kambayashi Y., Nagata H., Takagi Т., Yamamoto Y., Wa-tanabe K. Activation of protein kinase С by oxidized diacylglycerols // Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 1995. V.217. P.654-60.

225. Thannikal V.J., Fanburg B.L. Reactive oxygen species in cell signalling // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000. V.279. P.L1005-L1028.

226. Tobiasch E., Gunther L., Bach F.H. Heme oxygenase-1 protects pancreatic beta cells from apoptosis caused by various stimuli // J. Investig. Med. 2001. V.49. №6. P.566-571.

227. Toker A., Cantley L.C. Signalling through the lipid products of phospho-inositide-3-ОН kinase //Nature. 1997. V.387. P.673-6.

228. Tomiuk S., Zumbansen M., Stoffel W. Characterization and subcellular localization of murine and human magnesium-dependent neutral sphingomyelinase//J. Biol. Chem. 2000. V.275. 5710-5717.

229. Tsai L.Y., Lee K.T., Liu T.Z. Evidence for accelerated generation of hy-droxyl radicals in experimental obstruction jaundice of rats // Free Radic. Biol. Med. 1998. V.24. №5. P.732-737.

230. Tsai L.Y., Lee K.T., Tsai S.M., Lee S.C., Yu H.S. Changes of lipid peroxide levels in blood and liver tissue of patients with obstructive jaundice // Clin. Chim. Acta. 1993. V.215. №1. P.41-50.

231. Tsai L.Y., Tsai S.M,. Lee K.T., Yu H.S. Levels of plasma lipid peroxides before and after choledocholithotomy in patients with obstructive jaundice // Sangyo Ika Daigaku Zasshi. 1992. V.14. №4. P.261-269.

232. Van Belzen N., Spaargaren M., Verkleij A.J., Boonstra J. Interaction of epidermal growth factor receptors with the cytoskeleton is related to receptor clustering // J. Cell. Physiol. 1990. V.145. P.365-75.

233. Vanhaesebroeck В., Leevers S.J., Panayotou G., Waterfield M.D. Phos-phoinositide 3-kinases: a conserved family of signal transducers // Trends. Biochem. Sci. 1997. V.22. P.267-72.

234. Vazquez J., Garcia-Calvo M., Valdivieso F., Mayor F., Mayor F. Interaction of bilirubin with the synaptosomal plasma membrane // J. Biol. Chem. 1988. V.263. №3. P.1255-1265.

235. Venkataraman K, Futerman A.H. Ceramide as a second messenger: sticky solutions to sticky problems // Trends Cell Bioll. 2000. V.10. P.408-412.

236. Wallach D. Cell death induction by TNF: matter of self control // TIBS. 1997. V.10. P.408-412.

237. Whisler R.L., Goyette M.A., Grants I.S., Newhouse Y.G. Sublethal levels of oxidant stress stimulate multiple serine/threonine kinases and suppress protein phosphatases in Jurkat T cells // Arch. Biochem. Biophys. 1995. V.319. P.23-35.

238. Westwick J.K., Bielawska A.E., Dbaibo G., Hannun Y.A., Brenner D.A. Ceramide activates the stress-activated protein kinases // J. Biol. Chem. V.270. P.22689- 22692.

239. Wong K., Kwan-Yeung L. Sphingosine mobilizes intracellular calcium in human neutrophils // Cell. Calcium. 1993. V.14. P.493-505.

240. Wu T.W., Wu J., Li R.K., Mickle D., Carey D. Albumin-bound bilirubins protect human ventricular myocytes against oxyradical damage // Biochem. Cell Biol. 1991. V.69. №10-11. P.683-638.

241. Xia Z., Dickens M., Raingeaud J., Davis R.J., Greenberg M.E. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis // Science. 1995. V.270. P. 1326-31.

242. Xu L., Eu J.P., Meissner G., Stamler J.S. Activation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) by poly-S-nitrosylation // Science. 1998. V.279. P.234-7.

243. Yakel J.L. Calcineurin regulation of synaptic function: from ion channels to transmitter release and gene transcription // Trends Pharmacol. Sci. 1997. V.18. P. 124-34.

244. Yang В., Morris M.D., Xie M., Lightner D.A. Resonance Raman spectroscopy of bilirubins: band assignments and application to bilirubin/lipid com-plexation//Biochemistry. 1991. V.30. №3. P.688-694.

245. Yang S.D., Chang H.C., Lee S.C. Okadaic acid, sphingosine, and phor-bol ester reversibly modulate heat induction on protein kinase FA/GSK-3 alpha in A431 cells//J. Cell. Biochem. 1996. V.60. P.218-25.

246. Yoshimura S., Banno Y., Nakashima S., Hayashi K., Yamakawa H., Sa-wada M., Sakai N., Nozawa Y. Inhibition of neutral sphingomyelinase activation and ceramide formation by glutathione in hypoxic PC 12 cell death // J. Neurochem. 1999. V.73. P.675-683.

247. Yu Z.F, Nikolova-Karakashian M, Zhou D, Cheng G, Schuchman E.H, Mattson M.P. Pivotal role for acidic sphingomyelinase in cerebral ischemia-induced ceramide and cytokine production, and neuronal apoptosis // J. Mol. Neurosci. 2000. V.15. P. 85-97.

248. Yurchak L.K, Hardwick J.S, Amrein K, Pierno K, Sefton B.M. Stimulation of phosphorylation of Tyr394 by hydrogen peroxide reactivate biologically inactive, non-membrane-bound f orms of Lck // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.12549-12554.

249. Zable A.C, Favero T.G, Abramson J.J. Glutathione modulates ryanodine receptor from skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Evidence for redox regulation of the Ca2+ release mechanism // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.7069-77.

250. Zhang H, Buckley N.E, Gibson K, Spiegel S. Sphingosine stimulates cellular proliferation via a protein kinase C-independent pathway // J. Biol. Chem. 1990. V.265. P.76-81.

251. Zhang P, Liu B, Kang S.W, Seo M.S., Rhee S.G, Obeid L.M. Thiore-doxin peroxidase is a novel inhibitor of apoptosis with a mechanism distinct from that of Bcl-2 // J. Biol. Chem. 1997a. V.272. P.30615-30618.

252. Zhang P, Liu B, Jenkins G.M, Hannun Y.A, Obeid L.M. Expression of neutral sphingomyelinase identifies a distinct pool of sphingomyelin involved in apoptosis // J. Biol. Chem. 1997b. V.272. P.9609 9612.

253. Zhang H, Desai N.N, Olivera A, Seki T, Brooker G, Spiegel S. Sphingosine-1-phosphate, a novel lipid, involved in cellular proliferation // J. Cell. Biol. 1991. V.l 14. P.155-67.

254. Zhang Y.H, Yao B, Delikat S, Bayoumy S, Lin X.H, Basu S, McGinley M, Chan-Hui P.Y, Lichenstein H, Kolesnick R. Kinase suppressor of Ras is ceramideactivated protein kinase // Cell. 1997. V.89. P.63-72.

255. Zhang Y., Mattjus P., Schmid P.C., Dong Z., Zhong S., Ma W.Y., Brown R.E., Bode A.M., Schmid H.H. Involvement of the acid sphingomyelinase pathway in UVA-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.11775-11782.

256. Zick Y., Sagi-Eisenberg R. A combination of H202 and vanadate concomitantly stimulates protein tyrosine phosphorylation and polyphosphoinositide breakdown in different cell lines // Biochemistry. 1990. V.29. P. 10240-5.

257. Zimmerman H.J. Drug-induced liver disease // Drugs. 1978. V.16. P.25-45.

258. Ziol M., Tepper M., Lohez M., Arcangeli G., Ganne N., Christidis C., Trinchet J.-C., Beaugrand M., Guillet J.-G., Guettier C. Clinical and biological relevance of hepatocyte apoptosis in alcoholic hepatitis // J. Hepatol. 2001. V.34. P.254-260.

Информация о работе

Цюпко, Алла Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Характер изменения активности сфингомиелиназы в условиях ингибирования и активации пероксидного окисления липидов в печени животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы