Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени

Шупик, Мария Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени"

На правах рукописи

005046789

Шупик Мария Александровна

ВЗАИМОДЕИСТВИЕ СИГНАЛЬНОИ СИСТЕМЫ ОКСИДА АЗОТА СО СФИНГОМИЕЛИНОВЫМ ЦИКЛОМ И ПЕРОКСИДНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ТОКСИЧЕСКОГО СИГНАЛА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА В УСЛОВИЯХ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ПЕЧЕНИ

03.01.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

З о А 5 Г Ш1

Москва, 2012

005046789

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор, Алесенко Алиса Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

Куроптева Зоя Вениаминовна

доктор биологических наук, профессор, Манухина Евгения Борисовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский кардиологический научно-

производственный комплекс» (ФГБУ РКНПК) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, г. Москва

Защита состоится 26 сентября 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук (ИБХФ РАН) по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук (ИХФ РАН).

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ИБХФ РАН www.ibcp.chph.ras.ru.

Автореферат разослан «' » августа 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Оксид азота (N0) проявляет исключительное многообразие биологических функций, проникая через плазматические мембраны, и участвует в передаче межклеточных сигналов как вторичный посредник в составе внутриклеточных эффекторных систем, например, при проведении сигнала запрограммированной клеточной гибели — апоптоза. В зависимости от ряда условий N0 проявляет двойственные свойства в отношении процесса апоптоза. Критической детерминантой про- либо антиапоптотической роли N0 являются его концентрация, источник и тип клеток. Биохимический механизм, лежащий в основе про- и антиапоптотических свойств N0, определяется пересечением многих сигнальных систем, участвующих в проведении сигнала апоптоза с поверхности клеточной мембраны в ядро. Особое значение при реализации программы апоптоза играет взаимодействие сигнальной системы N0 и сфингомиелинового цикла (СФМ-цикл).

СФМ-цикл, а именно изменение активности его ферментов - сфингомиелиназ (СФМаз) и последующая генерация плейотропного медиатора - церамида являются ключевыми событиями ряда патофизиологических процессов в клетке, таких как клеточная гибель, пролиферация и дифференцировка. Функциональная взаимосвязь между сигнальными системами NO и СФМ-цикла определяется также общей субклеточной локализацией ферментов синтеза N0, NO-синтаз (NOS), и присутствием церамида и СФМаз в структурных элементах плазматической мембраны - кавеолах и рафтах. Полная характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия сигнальных путей NO/NOS и церамид/СФМазы, могла бы способствовать пониманию их места в сложной сети других сигнальных систем и способов контроля процессов апоптоза, дифференцировки и воспаления.

Активность сигнальных систем NO/NOS и церамид/СФМаза модулируется окислительным статусом клетки. В условиях окислительного стресса N0 и 02'~ образуют пероксинитрит, который является очень сильным оксидантом. Активность СФМаз также находится под контролем про- и антиоксидантных систем. Известно, что N-СФМаза активируется Н2О2 и ингибируется глутатионом. Церамид вызывает дисфункцию митохондрий и индуцируют окислительный стресс. Взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, существующая в живых клетках, вносит существенный вклад в развитие апоптоза при кислород-зависимых патологиях, включая ишемические повреждения.

Поскольку сигнальные системы NO и СФМ-цикла активируются провоспалительными цитокинами, в первую очередь фактором некроза опухоли альфа (TNF-a), что сопровождается индукцией окислительного стресса, то естественным представляется изучение не только двух систем, NO и СФМ-цикла, но и их зависимости от активации окислительных процессов и экспрессии TNF-a. Наиболее адекватной моделью для изучения последовательности активации и взаимосвязи этих двух сигнальных систем с уровнем продуктов ПОЛ и накоплением TNF-a является экспериментальная ишемия и последующая реперфузия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было показать наличие взаимосвязи сигнальной системы N0 со СФМ-циклом и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала ЮТ-а в условиях ишемии-реперфузии печени.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние соединений-доноров N0: динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), нитрозоглутатиона (ОЗМО) и нитрита натрия (ЫаМ02) на изменения параметров СФМ-цикла (активность СФМаз, уровень сфингомиелина (СФМ) и церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов.

2. На модели ишемии-реперфузии печени определить изменения в содержании N0 в зависимости от сроков ишемии и последующей реоксигенации.

3. Исследовать характер активности СФМаз и параметры ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от длительности периодов ишемии и реперфузии.

4. Изучить изменения содержания ЮТ-а в зависимости от сроков ишемии-реперфузии.

5. Изучить влияние "ШР-а на параметры СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы и концентрацию церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

6. Изучить влияние церамида на уровень ЮТ-а и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

7. Исследовать состояние ДНК в ишемизированной печени и при реперфузии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей) существует взаимосвязь: соединения-доноры N0: ДНКЖ, С8>ГО и ЫаИОг влияют на параметры СФМ-цикла (активность К-СФМазы, уровень СФМ и церамида) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов, при этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла от механизма освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и 08>Ю, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние сроки после их введения животным, а №1Ч02, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через несколько часов после инъекции.

2. Существует корреляция между изменением активности 1Ч-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введения доноров N0, что подтверждает свойства Ы-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания N0 в печени, наиболее выраженного при реперфузии.

4. В процессе ишемии-реперфузии наблюдается образование провоспалительного цитокина Т№-а, которое опережает изменения уровня содержания N0 в печени.

5. Существует взаимное влияние ТОТ-а и параметров СФМ-цикла: ТОТ-а модулирует активность Ы-СФМазы и приводит к образованию церамида и продуктов

ПОЛ, а продукт СФМ-цикла, церамид, вызывает накопление TNF-a и продуктов ПОЛ в печени мышей.

6. При реперфузии наблюдается активация СФМ-цикла и ПОЛ и высокое содержание TNF-a и N0. В этих условиях развивается апоптоз, что подчёркивает взаимосвязь сигнальных систем NO, TNF-a и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.

Научная новизна. Впервые проведено исследование in vivo влияния доноров N0: ДНКЖ, GSNO и NaN02 на СФМ-цикл. Показано, что введение животным доноров N0 приводит к изменениям параметров СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. Обнаружена корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

Впервые методом ЭПР-спектроскопии с использованием спиновой ловушки показано, что ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания NO, наиболее выраженного при реперфузии. При этом показано, что накопление провоспалительного цитокина TNF-a опережает изменения уровня содержания N0 в печени.

Показано наличие взаимного влияния TNF-a и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей).

На фоне резкого повышения уровня N0 и TNF-a при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла, сопровождающаяся развитием окислительного стресса и апоптоза.

Научно-практическая значимость. Результаты исследования имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания механизмов регуляции дифференцировки, пролиферации, апоптоза клеток в норме и при кислород-зависимых патологиях при участии сигнальных систем NO, СФМ-цикла и ПОЛ.

Обнаруженная нами взаимосвязь этих сигнальных систем свидетельствует о возможности влияния на клеточные процессы, находящиеся под контролем N0, путем воздействия на СФМ-цикл и ПОЛ. Например, активаторы и ингибиторы ключевых ферментов СФМ-цикла - кислой и нейтральной СФМаз - могут оказывать существенное влияние на эффективность терапии, направленной на восстановление печени, подвергнутой ишемии-реперфузии.

Предложен механизм проведения апоптотического сигнала при ишемии-реперфузии печени, заключающийся в накоплении TNF-a и последующей активации СФМ-цикла и повышении концентрации N0, которые совместно индуцируют апоптоз в клетках печени. Таким образом, полученные нами данные могут быть использованы в медицине при разработке тактики лечения ряда заболеваний, связанных с патологией ишемии-реперфузии, таких как инсульт, инфаркт, атеросклероз, а также при трансплантации органов с использованием препаратов нового поколения на основе ингибиторов СФМ-цикла.

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им Н.М.Эмануэля РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ института, а также поддержана грантами "Фундаментальные науки - медицине" и РФФИ № 02-04 48228.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 3 статьях и 13 тезисах.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 121 стр., включая 32 рисунка и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав "Обзор литературы", "Результаты и обсуждение" и "Заключение", выводов, списка сокращений и библиографического указателя (203 источника, из них 189 опубликованы в зарубежных изданиях).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Объекты, материалы и методы исследования

Основным предметом исследования являлись оксид азота, фактор некроза опухоли альфа, сфингомиелиназа и липиды, выделенные из печени животных.

Активность СФМаз измеряли по методу (Hostetier et al., 1979) с использованием М-метил-[иС]-сфингомиелина. Радиоактивность определяли на счетчике «Delta» (Нидерланды).

Содержание белка в гомогенате определяли по методу (Lowry et al., 1951).

Низкомолекулярную ДНК выделяли и анализировали методом горизонтального электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле по методу (Herrmann et al., 1994).

Липиды экстрагировали из печени по методу (Bligh and Dyer, 1959), их количество определяли гравиметрически.

Липидный состав изучали методом ВЭТСХ на пластинках фирмы «Merck» (Германия) с последующим денситометрированием.

Идентификацию TNF-a проводили с помощью ECL-иммуноблоттинга, используя поликлональные антитела производства фирмы «Santa Cruz» (США), специфически связывающиеся с TNF-a крысы и мыши.

Идентификацию NO проводили на ЭПР-спектрометре Е-109Е фирмы «Varian» (США) при СВЧ мощности 10 мВт, СВ частоте 9.32 ГГц, амплитуде высокочастотной модуляции магнитного поля 0.2 мТл при частоте 100 кГц. Уровень NO в ткани печени определяли с использованием спиновой ловушки, компоненты которой вводили животным путем инъекций диэтилдитиокарбамата натрия (ДЭТК-Na) (620 мг/кг в 1 мл физраствора интраперитонеально) и FeS04-7H20 с цитратом Na (25 и 125 мг/кг соответственно, в 1 мл физраствора подкожно в область левого бедра).

Работа с животными. В работе использовали мышей линии С57 black и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.

Ишемию печени, захватывающую 40% органа, проводили на крысах. Срединная лапаратомия была проведена под наркозом (внутривенное введение бриетала в дозе 50 мг/кг). В качестве контроля использовали печень ложнооперированных животных.

ДНКЖ, GSNO и NaN02 в 15 мМ Hepes буфере рН 7.4 вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг. Контрольным животным вводили 15 мМ Hepes буфер рН 7.4.

Сг-церамид («Biomol», США) растворяли в 5% растворе этанола и вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 2.5 и 5.0 мг/кг. Контрольным животным вводили 5% раствор этанола.

Рекомбинантный TNF-a растворяли в изотоническом растворе NaCl и вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 5.0 мг/кг. Контрольным животным вводили изотонический раствор NaCl.

Обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при *рП0.05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.

2. Результаты исследования 2.1. Изучение влияния соединений-доноров NO на показатели СФМ-цикла (активность N-СФМазы, содержание СФМ и церамида) и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

NO является важным посредником в ряде физиологических и патологических процессов, таких как апоптоз, вазорелаксация, воспаление. Действие NO в клетке происходит при взаимодействии с другими внуктриклеточными мессенджерными молекулами и их генерирующими ферментами, в том числе, со СФМ-циклом.

На культурах клеток, в том числе гепатоцитов, показано, что соединения-доноры NO могут оказывать влияние на СФМ-цикл. В зависимости от типа клеток и концентрации N0 способен как активировать СФМ-цикл (активировать N-СФМазу, вызывать накопление церамида, понижать содержание СФМ), так и ингибировать СФМ-цикл (ингибировать N-СФМазу, понижать содержание церамида, повышать концентрацию СФМ). Также, в зависимости от чувствительности клеток к N0 и/или их функционального состояния, N0 способен как вызывать окислительный стресс, так и проявлять антиоксидантные свойства. На момент выхода наших работ данных литературы о воздействии N0 в организме животных на СФМ-цикл представлено не было. В качестве соединений-доноров могут выступать S-нитрозотиолы (RS-NO) и динитрозильные комплексы негемового железа ((RS)2Fe(NO)2), образование которых непосредственно в живых клетках и тканях подтверждено рядом научных работ. Поэтому в своей работе мы использовали источники NO экзогенной природы -ДНКЖ, GSNO и NaN02.

Влияние ДНКЖ на СФМ-цикл. ДНКЖ вводили мышам внутрибрюшинно в дозах 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг. При введении ДНКЖ в дозе 1.5 мг/кг показатели СФМ-цикла не меняются (рис.1А-С, кривые 1). При введении ДНКЖ в дозах 7.5 и 15.0 мг/кг обнаружено дозозависимое обратимое ингибирование параметров СФМ-цикла -

снижение активности Ы-СФМазы, увеличение содержания СФМ и понижение содержания церамида в печени мышей.

ДНКЖ в дозе 7.5 мг/кг снижает активность К-СФМазы на 20% через 15-30 мин после инъекции. Спустя 60 мин активность фермента повышается до уровня близкого к показателям нормы, а через 120-240 мин - совпадает с контрольными значениями (рис.1 А, кривая 2). При введении этой дозы ДНКЖ содержание СФМ в ходе эксперимента повышается на 20-25% в течение 15-30 мин, а затем постепенно снижается на сроки 60-120 мин и через 240 мин достигает параметров контроля (рис.1 В, кривая 2). Количество церамида в клетках печени после введения ДНКЖ в дозе 7.5 мг/кг уменьшается через 30-60 мин и нормализуется спустя 120-240 мин (рис. 1С, кривая 2).

ДНКЖ в дозе 15.0 мг/кг снижает активность ТЯ-СФМазы на 30% через 15-30 мин после введения препарата. Через 60-120 мин активность фермента на 20% ниже нормы, а спустя 240 мин соответствует показателям контроля (рис.1 А, кривая 3). Уровень СФМ при этом повышен в течение 15-60 мин, достигает наибольшего увеличения - на 40% спустя 30 мин и через 120-240 мин стремится к контрольным значениям (рисЛВ, кривая 3). Содержание церамида уменьшается на 20-25% в течение 15-60 мин, максимально - на 25% через 30 мин после инъекции ДНКЖ, и нормализуется спустя 120-240 мин (рис. 1С, кривая 3).

Ё <

ю-

О Я 33 а) 123 13) 183 2Ю 2»

Время после введения ДНКЖ, мин

О ЭО ГО 90 133 та 18) 210 243

Время после введения ДНКЖ, мин

60-

0 30 60 90 120 150 180 210 2«

Время после введения ДНКЖ, мин

Рис.1. Влияние ДНКЖ на активность ТЧ-СФМазы (А), содержание СФМ (В) и церамида(С) в печени мышей.

Влияние GSNO на СФМ-цикл. В физиологических условиях в организме животных происходит образование нитрозотиолов, соединений, рассматриваемых в настоящее время как основное депо N0 в клетках млекопитающих, а ОвИО - из них наиболее стабилен. Роль С8КЮ в качестве донора N0 может быть различной. В литературе имеются данные о том, что при такой кислород-зависимой патологии как астма, в зависимости от дозы ОБИО является либо цитопротекторным агентом, либо триггером апоптоза и окислительного стресса.

В нашей работе йЗЫО вводили внутрибрюшинно в дозах 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг. Введение СвІЧО в дозе 1.5 мг/кг не влияет на показатели СФМ-цикла (рис.2А-С, кривые 1). При введении ОБШ в дозах 7.5 и 15.0 мг/кг этот донор N0, как и ДНКЖ, дозозависимо и обратимо ингибирует СФМ-цикл: снижает активность Ы-СФМазы, увеличивает содержание СФМ и понижает содержание церамида в печени мышей.

ОвИО в дозе 7.5 мг/кг снижает активность ТЧ-СФМазы на 20-25% через 15-60 мин после инъекции, а через 120-240 мин активность фермента равна контрольными значениями (рис.2А, кривая 2). Содержание СФМ в ходе эксперимента повышается на 20-30% в течение 15-30 мин, а затем постепенно снижается на сроки 120-240 мин и через 240 мин достигает параметров контроля (рис.2В, кривая 2). Количество церамида уменьшается в течение 30-60 мин, и нормализуется спустя 120-240 мин (рис.2С, кривая 2).

08>ГО в два раза большей концентрации, 15.0 мг/кг, снижает активность 14-СФМазы до 50% уже через 15 мин после введения препарата. Через 30-60 мин активность фермента на 30% ниже нормы, через 120 мин - на 20%, а спустя 240 мин соответствует показателям контроля (рис.2А, кривая 3). Уровень СФМ при этом повышен на 20-60% в течение 15-120 мин, и достигает наибольшего увеличения - на 60% через 30 мин эксперимента; через 240 мин количество СФМ близко к контрольным значениям (рис.2В, кривая 3). Содержание церамида уменьшается на 20-30% в течение 30-60 мин, максимально - на 30% через 30 мин после инъекции ОЗІЯО, и нормализуется спустя 120-240 мин (рис.ЗС, кривая 3).

0 30 €0 90 120 13) 183 210 ЭИ

Время после введения СБМО, мин

0 33 03 90 120 133 183 2Ю ЗЮ

Время после введения ОЭМО, мин

Время после введения СЭМО, мин

Рис.2. Влияние 08№Э на активность Ы-СФМазы (А), содержание СФМ (В) и церамида (С) в печени мышей.

Влияние NaN02 на СФМ-цикл. КаК02 вводили мышам в дозах 5.0 и 15.0 мг/кг. Введение в дозе 5.0 мг/кг не оказывает влияния на показатели СФМ-

цикла (рис.ЗА-С, кривые 1). Введение ЫаН02 в дозе 15.0 мг/кг, как и ДНКЖ и ОЗЫО, ингибирует СФМ-цикл, но оказывает заметное действие в концентрациях в 2 раза больших, чем ДНКЖ и ОЭНО, и на более поздние сроки - начиная с 120 мин после инъекции препарата (рис.ЗА-С, кривые 2).

Через 120-240 мин после инъекции животным в дозе 15.0 мг/кг

активность Ы-СФМазы понижается на 20% (рис.ЗА, кривая 2), концентрация СФМ увеличивается на 20 % (рис.ЗВ, кривая 2), а содержание церамида имеет тенденцию к понижению (рис.ЗС, кривая 2).

А В

О 33 ® 93 120 150 180 210 гю

Время после введения №N0 , мин

1 —5.0 мг/ кг

2 15.0 мг/ кг

Время после введения ЫаЫ02, мин

Рис.3. Влияние №N02 на активность ЖСФМазы (А), содержание СФМ (В) и церамида (С) в печени мышей.

Влияние доноров N0 на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей. Анализ содержания продуктов ПОЛ показывает дозозависимое понижение уровня содержания диеновых конъюгатов в печени мышей при введении животным соединений-доноров N0.

ДНЮК и GSNO вводили внутрибрюшинно в дозах 1.5, 7.5 и 15.0 мг/кг. Инъекция ДНКЖ (рис.4А, кривая 1) и GSNO (рис.4В, кривая 1) в дозе 1.5 мг/кг не влияет на показалели ПОЛ. Ведение ДНКЖ и GSNO в дозах 7.5 и 15.0 мг/кг вызывает понижение содержания продуктов ПОЛ в печени мышей.

ДНКЖ в дозе 7.5 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.2 раза через 15-30 мин, затем, в течение 60-240 мин показатели ПОЛ стремятся к контрольным значениям (рис. 4А, кривая 2). ДНКЖ в дозе 15.0 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.5 раза через 15-30 мин, в 1.2-1.3 раза через 60-120 мин, спустя 120-240 мин показатели ПОЛ равны контрольным значениям (рис.4А, кривая 3).

GSNO в дозе 7.5 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.2 раза через 15-30 мин, после 120-240 мин эксперимента результаты измерений близки к показателям нормы (рис.4В, кривая 2). ОБЖ) в дозе 15.0 мг/кг снижает уровень диеновых конъюгатов в 1.5 раза через 15 мин, в 1.3 раза через 30-60 мин, а спустя 120-240 мин показатели ПОЛ стремятся к уровню контрольных значений (рис.4В, кривая 3).

№Ж)2 вводили мышам в дозах 5.0 и 15.0 мг/кг. Введение №N02 в дозе 5.0 мг/кг не оказывают влияния на показатели ПОЛ (рис.4С, кривая 1). Введение №ЖЭ2 в дозе 15.0 мг/кг ингибирует процессы ПОЛ, но оказывает заметное действие в концентрациях в 2 раза больших, чем ДНКЖ и GSNO, и понижает уровень показателей ПОЛ в 1.2 раза на более поздние сроки - начиная с 120 мин после инъекции препарата (рис.4С, кривая 2).

Следует отметить однонаправленность изменений активности ^СФМазы и параметров ПОЛ при введении доноров N0, которая характеризуется высокими коэффициентами линейной корреляции и подтверждает свойства №-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

О 30 60 90 120 150 10Э 210 240

Время после введения СБМО, мин

Рис.4. Влияние ДНКЖ (А), ОБМО (В) и 02 (С) на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

2.2. Изучение влияния ТОТ-а на показатели СФМ-цикла (активность СФМазы и содержание церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в

печени мышей

В настоящее время показано, что ТЫБ-а участвует в реализации иммунного клеточного ответа, влияет на пролиферацию, рост и дифференцировку клеток и способен индуцировать гибель клеток, как путем некроза, так и апоптоза. При этом в ряде исследований было продемонстрировано как цитотоксическое, так и цитопротекторное действие ЮТ-а. Подавляющее большинство экспериментов по изучению способности химических соединений вызывать апоптоз, активировать ПОЛ и СФМ-цикл проводятся на клеточных моделях. Показано, что провоспалительные цитокины, в том числе ТОТ-а, индуцируют образование АФК, продуктов ПОЛ и церамида во многих типах клеток, а фармакологическое ингибирование АФК в некоторых случаях позволяет предотвратить активацию СФМ-цикла.

Влияние на показатели СФМ-цикла: активность IV-СФМазы и

содержание церамида в печени мышей. В нашей работе рекомбинантный ТОТ-а в дозе 5.0 мг/кг вводили мышам внутрибрюшинно. Через 120-240 мин после инъекции ТОТ-а активность И-СФМазы повышается на 40-60 % (рис.5А). На фоне повышения активности М-СФМазы уровень содержания церамида в печени

0 30 60 90 120 19Э 13Э 210 2«

Время после введения ДНКЖ,мин

ДНКЖ 1.5мг/ кг ДНКЖ 7.5 мг/ кг ДНКЖ 15.0 мг/кг

увеличивается на те же сроки, максимально эксперимента (Рис.5В).

- на 50 % через 240 мин после начала В

I о

0 а

1 X

s о

TNF- а 5.0 мг/кг

О 30 60 8) 123 1KJ 133 210 210

Время после введения TNF- а, мин

О 33 m 33 120 150 1Ш 210 ж

Время после введения TNF- а, мин

Рис.5. Влияние TNF-а на активность N-СФМазы (А) и содержание церамида (В) в

печени мышей.

Влияние TNF-a на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей. Анализ содержания продуктов ПОЛ показывает увеличение уровня диеновых конъюгатов в 1.3 раза через 30 мин и в 1.3-1.5 раз через 120-240 мин после введения TNF-a в дозе 5.0 мг/кг (рис.6), что подтверждает данные in vitro о развитии окислительного стресса под воздействием TNF-a.

Подавление первой волны ПОЛ (через 30 мин) может объясняться способностью

TNF-a активировать синтазы NO. Активация NOS приводит к образованиию NO, который может проявлять антиоксидантные свойства и, как мы показали, подавлять процессы ПОЛ. Таким образом, наши результаты показывают, что TNF-a способен активировать СФМ-цикл и окислительный стресс в печени in vivo.

2a Л s I с О s

* с ж ai i_

3 s ю

Рис.6. Влияние TNF-a на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

О 33 Ш Е0 120 1Ю 1Ю 210 2Ю

Время после введения TNF-a, мин

2.3. Изучение влияния церамида па содержание ТОТ-а и интенсивность процессов ПОЛ в печени мышей

Предполагая возможность взаимного влияния ТОТ-а, компонентов СФМ-цикла и продуктов ПОЛ, мы, помимо изучения воздействия ТОТ-а на СФМ-цикл и ПОЛ, исследовали влияние токсического продукта СФМ-цикла, церамида, на накопление в печени мышей провоспалительного цитокина ТОТ-а и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты).

Влияние церамида на содержание ТМР-а в печени мышей.

Внутрибрюшинное введениие церамида в дозе 2.5 мг/кг (50 мкг/мышь) приводит к повышению содержания Т№-а в печени животных через 8 и 16 ч после введения

препарата в 2.2 и 1.9 раза соответственно (рис.7). Через 24 ч после начала эксперимента количество ТТМР-а приближается к контрольным значениям.

Введение церамида в дозе 5.0 мг/кг (100 мкг/мышь) приводит к интенсификации образования ТОТ-а на все изученные нами сроки - 8, 16, 24 ч. Через

8 ч после введения препарата содержание Т№-а достигает значений, превышающих контрольные в 2.4 раза. Через 18 и 24 ч содержание ЮТ-а повышено в 2.0 и 1.8 раз соответственно (рис.7). Таким образом, показано, что церамид способен самостоятельно индуцировать экспрессию ЮТ-а в печени животных при внутрибрюшинном введении.

Рис.7. Влияние церамида на содержание ТОТ-а в печени мышей.

Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ в печени мышей. В

условиях, в которых было изучено изменение содержания ЮТ-а в печени мышей при введении церамида в дозе 2.5 и 5.0 мг/кг веса (50 и 100 мкг на животное), определено содержание продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) через 8, 18, 24 ч.

Введение церамида в дозе 2.5 мг/кг повышает уровень продуктов ПОЛ. Максимально - в 1.5 раза через 18 ч (рис.8). Церамид в дозе 5.0 мг/кг, вызывает достоверное повышение содержания диеновых конъюгатов в печени в 1.5 раза уже

через 8 ч. Через 18 и 24 ч уровень продуктов ПОЛ повышен в 1.8 и 1.5 раза соответственно (рис.8). Таким образом, мы показали, что церамид способен индуцировать ПОЛ и накопление ЮТ-а в печени животных. Можно предположить, что образование церамида, индуцируемое ТОТ-а, приводит к увеличению содержания самого ЮТ-а, который, в свою очередь, вызывает накопление церамида за счет активации СФМ-цикла.

Рис.8. Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ в печени мышей.

2.4. Изучение содержания TNF-a, продуктов ПОЛ, N0 и активности СФМаз при

ишемии-реперфузии печени

Ишемия или кислородное голодание тканей наблюдается при инфаркте миокарда и инсульте, при оперативных вмешательствах на печени и других органах. Поражение тканей происходит из-за гибели клеток по механизму апоптоза. Сигнальные пути, по которым ишемия и последующая реперфузия вызывают апоптоз, могут включать секрецию Т№-а, N0, инициацию ПОЛ и СФМ-цикла. Однако эти сигнальные системы в зоне ишемии изучались раздельно и

Время после введения церамида, часы

0 8 16 21 Время после введения церамида часы

преимущественно на клетках сердца, мозга и почек. Чтобы понять механизм ишемических повреждений как в процессе прекращения кровотока, так и при последующем его восстановлении, крайне актуальным является анализ изменений параметров всех сигнальных систем, участвующих в этих процессах, и последовательности их включения, что позволит, в конечном счете, проводить более грамотную и эффективную терапию ишемизированного органа.

Определение содержания TNF-a при ишемии—реперфузии. В наших экспериментах методом иммуноблоттинга с использованием поликлональных антител показано, что в печени крыс, подвергнутых ложной операции, количество ЮТ-а

практически не детектируется. Однако уже после 15 мин ишемии количество ТОТ-а возрастает и составляет 2.5 пг/мг белка, а через 60 мин ишемии его содержание практически удваивается (рис.9). Вероятно, такое быстрое накопление ТОТ-а в ишемизированной доле печени происходит в связи с тем, что он не транспортируется кровью в этих условиях в другие органы.

Время ишемии, мин

Рис.9. Изменение содержания ТОТ-а при ишемии печени.

При 5, 15 и 30 мин реперфузии печени, перенесшей 30 мин ишемию, содержание ЮТ-а в зоне ишемии экстремально увеличивается на все сроки реперфузии - почти в два раза по сравнению с ишемизированной печенью (рис.ЮА). Реперфузия доли печени, подвергнутой ишемии в течение 60 мин, также сопровождается ростом содержания ТЫБ-а, которое практически не отличается от показателей, наблюдаемых в процессе реперфузии печени, подвергнутой менее длительной, 30 мин ишемии (рис. 10В).

А В

Рис.10. Изменение содержания ЮТ-а при реперфузии печени после 30 (А) и 60 (В)

мин ишемии. 15

Определение содержания диеновых конъюгатов при ишемии-реперфузии.

Изменение содержания продуктов ПОЛ отражает изменения в балансе про- и антиоксидантних систем в ишемизированном органе. На все сроки ишемии-реперфузии нами показано увеличение содержания продуктов ПОЛ в 1.2-1.5 раза. Наибольших значений концентрация диеновых конъюгатов достигает через 30 мин ишемии (рис.11А). Снижение содержания продуктов ПОЛ через 60 мин ишемии печени по сравнению с 30 мин ишемией может определяться различными причинами, например, истощением субстратов окисления (полиненасыщенных жирных кислот) и недостатком кислорода.

А В

Время ишемии, мин

Время реперфузии, мин

Рис.11. Изменение содержания продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) при ишемии (А) и реперфузии (В) печени крыс.

Реперфузия печени, перенесшей 30-мин ишемию, приводит к нормализации показателей ПОЛ уже через 30 мин после восстановления кровотока. В то же время после длительной ишемии (60 мин) наблюдается стабильный рост количества диеновых конъюгатов (рис.11 В) на все сроки реперфузии.

Наиболее значительное превышение содержания продуктов ПОЛ (в 1.8-2.0 раза) отмечено через 60 мин после восстановления кровотока в доли печени, подвергнутой длительной ишемии (60 мин) (рис.11В). Следует отметить, что 60 мин ишемия печени вызывает резкие токсические явления, которые приводят к высокой смертности животных (до 80%). По-видимому, накопление продуктов ПОЛ при реперфузии длительно ишемизированного органа, в котором развиваются необратимые процессы, отражает именно это обстоятельство.

Определение содержания N0 при ишемии-реперфузии. Рядом исследователей показано изменение активности ферментов, продуцирующих N0, и повышение содержания нитритов и нитратов в клетках и органах, подвергнутых ишемии-реперфузии.

В своих опытах на модели ишемии-реперфузии печени мы детектировали образование непосредственно N0 методом ЭПР-спектроскопии. Нами показано, что

содержание N0 в печени увеличивается в течение 30-60 мин ишемии и составляет 2040 нмоль/мг ткани, что превышает показатели нормы в 1.5-2.0 раза (рис.12А).

В процессе реперфузии содержание N0 резко возрастает, в 2-5 раз при 15-30 мин реперфузии после 30 мин ишемии, и достигает семикратного увеличения через 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии (рис. 12В).

А В

л 30-

° 25. X

* 20+ О

15-

о - реперфузии после 30 М«1ШИ1

Время ишемии, мин

Время реперфузии, мин

Рис.12. Изменение содержания N0 при ишемии (А) и реперфузии (В) печени.

Изменение активности СФМаз при ишемии-реперфузии. Рядом исследователей показана роль компонентов СФМ-цикла при кислород-зависимых патологиях, в том числе при ишемии-реперфузии сердца и мозга. В наших экспериментах было изучено изменение активности А- и Ы-СФМаз в доле печени с ишемией в течение 15, 30 и 60 мин и последующей реперфузией этой доли печени от 15 до 60 мин.

Изменение активности №-СФМазы при ишемии-реперфузии. 15-ти мин ишемия не изменяет активность Ы-СФМазы, однако нарушение кровоснабжения органа на более длительные сроки - 30 и 60 мин - приводит к падению активности фермента в 1.4 раза (рис.1 ЗА). После 30 мин ишемии восстановление кровотока возвращает показатели активности Ы-СФМазы к норме уже через 15 мин, и далее - в течение 30 и 60 мин реперфузии уровень активности фермента соответствует контрольным значениям (рис. 13В).

Иная картина наблюдается после 60 мин ишемии. После 60 мин ишемии и 15 мин реперфузии активность ТЧ-СФМазы также нормализуется, или незначительно превышает показатели нормы, однако через 30 и 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии активность 14-СФМазы повышается в 1.2 раза (рис. 13В).

в »

О® е

£ I в .

о"

Время ишемии, мин

/ШШШШ

-о- реперф^ЗИЯ после 30 УШЯЛЧ —•— релерс£узия после 60 И« И1ЕМИИ контроль

Время репврфуэии, мин

Рис.13. Изменение активности Ы-СФМазы при: ишемии (А) и реперфузии печени после 30 и 60 мин ишемии (В).

Изменение активности А-СФМазы при ишемии—реперфузии. Характер зависимости активности А-СФМазы от сроков ишемии не такой как у М-СФМазы. Активность А-СФМазы в зоне ишемии снижается в два раза только в течение 30 мин, а через 60 мин ишемии превышает контрольные значения в 1.4 раза (рис.14А). После 30 мин ишемии реперфузия не вызывает нормализацию активности фермента, ее значения остаются стабильно ниже нормы, на уровне 30 мин ишемии (рис. 14В). После длительной, 60-мин ишемии, восстановление кровотока также приводит к ингибированию активности А-СФМазы уже через 15 мин, а также далее — спустя 30 и 60 мин реперфузии (рис. 14В).

А В

Время ишемии, мин

^ с; В о> 0ю

о =

-А- релерс^узия после 30 РЛ»Н НШ№ —реперфузия после 60 ТЛ« ИЦЕ)Л™ контроль

Время реперфузии, МИН

Рис.14. Изменение активности А-СФМазы при: ишемии (А) и реперфузии печени после 30 и 60 мин ишемии (В). Определение деградации ДНК при ишемии—реперфузии. Для анализа состояния ДНК, изолированной из доли печени, подвергнутой длительной ишемии (60 мин) и последующей реперфузии в течение 15, 30 и 60 мин, был проведен

электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле. Мы обнаружили, что в ишемизированном органе после 60 мин ишемии ДНК все еще стабильна, однако ее разрушение начинается сравнительно быстро после реперфузии. Спустя 60 мин реперфузии фрагменты ДНК представляют собой типичную апоптотическую рШра^Ч^МЯ^Р^ "лестницу" (рис. 15).

1 - контроль

2 - ишемия 60 мин

3 - ишемия 60 мин + репрефузия 15 мин

4 - ишемия 60 мин + репрефузия 30 мин

5 - ишемия 60 мин + репрефузия 60 мин

Рис.15. Деградация ДНК при ишемии-реперфузии печени.

1 2 3 4 5

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Механизмы, по которым ишемия и последующая реперфузия вызывают апоптоз, могут включать секрецию TNF-a, накопление продуктов ПОЛ и активацию сигнальных систем N О и СФМ-цикла. СФМ-цикл взаимодействует с другими сигнальными системами, такими, как система генерации активных форм кислорода, в том числе NO. Особое значение во взаимодействии NO со СФМ-циклом играет провоспалительный цитокин TNF-a, поскольку он способен модулировать как активность ферментов, синтезирующих NO, так и активность СФМаз, индуцирующих СФМ-цикл. В свою очередь, продукты реакции этих ферментов, NO и церамид, влияют на экспрессию TNF-a. Кроме того, окислительный стресс и накопление продуктов ПОЛ, вызываемые TNF-a, являются основным звеном его цитотоксического действия. Пересечение во времени этих событий может привести к усилению проапоптотического сигнала, индуцируемого каким-либо фактором, в нашем случае, ишемией и последующей реперфузией. В связи с этим задачей нашего исследования явилось изучение сигнальных систем NO, СФМ-цикла и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF-a при патологии ишемии-реперфузии.

В настоящее время в литературе появились доказательства зависимости активности СФМаз от уровня NO. Исследования, проведенные на клеточных культурах, показали, что NO в зависимости от концентрации и типа клеток способен как вызывать апоптоз, генерацию церамида и активировать СФМазы, так и иигибировать процесс апоптоза и блокировать синтез церамида. В свою очередь, церамид может повышать уровень экспрессии ферментов, продуцирующих N0, активировать их, приводить к накоплению нитритов и нитратов во внутриклеточной среде, или, наоборот, ингибировать NOS.

В нашей работе впервые исследовалось влияние доноров N0 на СФМ-цикл в организме животных. Соединения-доноры N0: ДНКЖ, ОБТ^О и №Ы02 в диапазоне исследованных концентраций ингибируют СФМ-цикл и ПОЛ в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. Изменения параметров СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы, уровень СФМ и церамида) определяются механизмом освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и 05>Ю, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а ЫаЫОг, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл и ПОЛ только через 2 ч после инъекции.

Ранее при ишемии параметры СФМ-цикла и содержание N0 и ЮТ-а исследовали раздельно и в фиксированные сроки, преимущественно на клетках сердца, мозга и почек. Однако ни в одном из опубликованных исследований не проводилось комплексное изучение характера поведения сигнальных систем N0, СФМ-цикла, ПОЛ и ТОТ-а при индукции апоптоза в условиях ишемии печени и последующей ее реперфузии у животных. В наших экспериментах установлено, что при ишемии печени первым значимым событием является накопление ЮТ-а уже через 15 мин после прекращения кровотока. Эти данные согласуются с данными экспериментов, проведенных на сердце и мозге, что ишемические повреждения сопровождаются повышением содержания ЮТ-а. Изменения содержания N0 и активности СФМаз в печени происходят только спустя 30 мин после начала ишемии.

При изучении изменения активности СФМаз в ишемизированной печени и после ее реперфузии мы обнаружили резкое снижение активности Ы-СФМазы на сроках ишемии 30-60 мин и ее резкий рост при реперфузии. А-СФМаза на начальные сроки ишемии (15 и 30 мин) ингибируется, а после 60 мин ишемии ее активность возрастает, превышая контрольный уровень в 1.8 раза. При последующей реперфузии активность этой изоформы фермента резко падает. То есть, при ишемии печени до 30 мин, при которой выживают все животные, снижена активность как И-СФМазы, так и А-СФМазы, а после 60 мин ишемии, когда гибнет 80% животных, А-СФМаза активирована. По-видимому, на ранних сроках ишемии возможна защитная реакция организма, способная ингибировать активность СФМаз, в результате чего не происходит накопление критического уровня церамида. Это предположение находится в соответствии с нашими данными по введению животным доноров N0, которые показывают, что в исследованных концентрациях N0 ингибирует активность М-СФМазы и снижает уровень церамида в печени. При длительной, 60 мин ишемии, когда активирована одна из изоформ СФМазы (А-СФМаза), вероятность накопления проапоптического уровня церамида резко увеличивается, особенно при реперфузии, когда наблюдается активация и другой изоформы фермента (Ы-СФМазы). В этих условиях уровень церамида является достаточным для проведения сигнала апоптоза, в ходе которого погибает часть поврежденных клеток при реперфузии после 60 мин ишемии, что мы видим в своих экспериментах, анализируя состояние ДНК.

Накопление ТЫБ-а происходит как при ишемии, так и после реперфузии, однако деградация ДНК по типу апоптотической лестницы наблюдается только при

реперфузии после 60 мин ишемии, когда активируется И-СФМаза, что приводит к накоплению проапоптотических агентов СФМ-цикла, и происходит резкое повышение содержания N0. В процессе реперфузии содержание N0 резко возрастает, в 2-5 раз при 15-30 мин реперфузии после 30 мин ишемии, и достигает семикратного увеличения через 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии.

Для понимания механизма взаимодействия ЮТ-а и СФМ-цикла при индукции апоптоза большое значение имеют наши данные о влиянии церамида на экспрессию ЮТ-а в печени. Так, мы показали, что церамид вызывает накопление ТОТ-а в печени животных. Эти данные дают возможность предположить, что образование церамида, индуцируемое эндогенным ЮТ-а в ишемизированной печени, может приводить к генерации новых порций ТЫР-а, который вновь, активируя СФМазу, приводит к накоплению церамида. Когда уровень церамида достигает критических значений, события в клетке завершаются апоптозом. Именно этот процесс возможен в ишемизированной печени после реперфузии. По такой же схеме могут взаимодействовать церамид и N0 в высоких концентрациях, который также индуцирует накопление церамида, а церамид, в свою очередь, индуцирует синтез N0. Активация при ишемии всех систем, связанных с усиленной генерацией церамида, на наш взгляд, является основным условием, при котором клетки печени входят в апоптоз в условиях ишемии-реперфузии.

Большой вклад в развитие ишемических повреждений вносят окислительные процессы в липидах. Ранее нами и другими исследователями была показана связь активности СФМ-цикла с окислительным статусом клеток. В своей работе мы обнаружили корреляцию между изменением активности Т<1-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введения соединений-доноров N0, что подтверждает свойства ФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

Наши результаты демонстрируют, что пусковым механизмом апоптоза при ишемии-реперфузии может быть накопление в ишемизированном органе ТЫБ-а, который индуцирует накопление N0. Эти события активируют СФМазу, которая расщепляет СФМ до проапоптотического агента церамида. Чтобы уровень церамида достиг критических значений, содержание N0 и ТОТ-а должно быть высоким, особенно в процессе реперфузии, когда наблюдается деградация ДНК. В свою очередь, церамид, генерируемый при ишемии, способен поддерживать, и даже увеличивать содержание N0 и ТОТ-а. То есть, в критических условиях в клетке возможен активный процесс обратной регуляции. Вероятнее всего, именно он имеет место при вхождении клеток в апоптоз. Чтобы этот лавинообразный процесс остановить, необходимо прекратить генерацию церамида, то есть, ингибировать активность СФМаз.

Предложенный нами механизм индукции апоптоза в условиях ишемии-реперфузии печени позволяет рассмотреть новые препараты для предупреждения ишемических повреждений как при пересадке донорской печени, так и при хирургических вмешательствах на печени. Такими новыми препаратами могут выступить ингибиторы СФМаз. Блокирование СФМ-цикла не позволит развиваться апоптозу даже при наличии высокого содержания ТЫР-а, который не способен

самостоятельно вызывать апоптоз клеток печени. В то время как церамид индуцирует апоптоз во многих типах клеток даже в отсутствии TNF-a. Поэтому в ишемизированном органе необходимо, в первую очередь, ингибировать активность СФМаз, которые участвуют в генерации индукторов апоптоза.

Автор выражает искреннюю благодарность проф. A.B. Алесенко, проф. А.Ф. Ванину и д.б.н. Л.Б. Дудник за постоянное внимание и поддержку при проведении настоящей работы, а также к.х.н. В.Д. Микояну и м.н.с. Е.С. Мочаловой за помощь в проведении экспериментов.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

NO - оксид азота СФМаза - сфингомиелиназа

NOS - синтаза оксида азота А-СФМаза - кислая сфингомиелиназа

ДНКЖ - динитрозильные комплексы железа N-СФМаза - нейтральная сфингомиелиназа

GSNO - нитрозоглутатион ПОЛ - пероксидное окисление липидов

СФМ-цикл - сфингомиелиновый цикл TNF-a - фактор некроза опухоли альфа

СФМ - сфингомиелин АФК - активные формы кислорода

ВЫВОДЫ

1. Показано наличие взаимосвязи между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Введение доноров N0: ДНКЖ, GSNO и NaN02 приводит к ингибированию СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени прошедшего после введения препаратов. При этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла (активность N-СФМазы, уровень СФМ и церамида) от механизма освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и GSNO, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а NaN02, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через 2 ч после инъекции.

2. Обнаружена корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания NO в печени, наиболее выраженного при реперфузии.

4. В процессе ишемии-реперфузии наблюдается образование провоспалительного цитокина TNF-a, которое опережает изменения уровня содержания N0 в печени.

5. Показано наличие взаимного влияния TNF-a и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Внутрибрюшинное введение TNF-a модулирует активность N-СФМазы, приводит к накоплению проапоптотического агента церамида и продуктов ПОЛ. В свою очередь, продукт СФМ-цикла, церамид вызывает накопление в печени TNF-a и продуктов ПОЛ.

6. На фоне резкого повышения уровня N0 и TNF-a при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла, сопровождающаяся

развитием окислительного стресса. В этих условиях развивается апоптоз, что подчёркивает взаимосвязь сигнальных систем NO, TNF-a и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алесенко A.B., Гальперин Э.И., Дудник Л.Б., Мочалова Е.С., Платонова Л.В., Шингарова Л.Н., Шоно Н.И., Шупик М.А. Роль фактора некроза опухоли альфа и активации сфингомиелинового цикла в индукции апоптоза в условиях ишемии/реперфузии печени // Биохимия. 2002. Т. 67. № 12. С. 1932-1643.

2. Alessenko A.V., Shupik М.А., Bugrova А.Е., Dudnik L.B., Shingarova L.N., Mikoyan V.D., Vanin A.F. The relation between sphingomyelinase activity, lipid peroxide oxidation and NO-releasing in mice liver and brain // FEBS Lett. 2005. Vol. 579(25). P. 5571-5576.

3. Шупик M.A., Ванин А.Ф., Алесенко A.B. Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии//Биохимия. 2011.Т.76.№ 11. С. 1489-1504.

4. Шупик М.А., Алесенко A.B., Микоян В.Д., Ванин А.Ф. Связь сигнальных систем оксида азота и сфингомиелиновго цикла в индукции апоптоза при ишемии/реперфузии печени // В сб. трудов Международной конференции "Биохимическая физика, ИБХФ РАН-ВУЗы", 9-11 ноября, 2009, Москва; Изд-во ООО "еПолиграф". С. 268-270.

5. Алесенко A.B., Шупик М.А. Взаимодействие оксида азота с сигнальной системой сфингомиелинового цикла и окислением липидов в печени мышей // В сб.: "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", 2011. С. 157-161.

6. Алесенко A.B., Дудник Л.Б., Платонова Л.В., Шупик М.А., Гальперин Э.И. Активация сигнальных систем сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в ишемизированной/реперфузированной печени // Тез. докл. III Съезда биохимического общества. С.-Петербург, 2002. С. 424.

7. Алесенко A.B., Дудник Л.Б., Мочалова Е.С., Шупик М.А., Гальперин Э.И. Взаимодействие сигнальных систем сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов, индуцируемых фактором некроза опухоли альфа, в условиях ишемии/реперфузии печени // Тез. докл. VI Международной конф. "Биоантиоксидант", Москва, 2002. С. 30.

8. Шупик М.А., Дудник Л.Б., Ванин А.Ф., Алесенко A.B. Влияние доноров NO на уровень пероксидных продуктов окисления липидов, генерируемых при апоптозе, индуцированном ЦГИ в печени крыс // Там же. С. 639-640.

9. Alessenko А.V., Dudnik L.B., Mochalova E.S., Shupik M.A., Galperin E.I. The signal transduction pathways by which ischemia-reperfusion leads to apoptosis involve TNF-a secretion, sphingomyelinase activation and initiation of lipid peroxidation // EASL Conference, Madrid, (Spain), 2002. P. 44.

10. Shupik M.A., Dudnik L.B., Vanin A.F., Alessenko A.V. Influence of nitric oxide donors on the sphingomyelinase activity, accumulation of lipid peroxidation products and DNA degradation in mice liver // EASL Conference, Madrid (Spain), 2002. P. 24.

11. Shupik M.A., Alessenko A.V. Role of lipid peroxidation, TNF-a accumulation and activation of sphingomyelin cycle in apoptosis, induced by reperfusion of ischemic liver // Physiological Society Spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress", April 3-5, 2003, Budapest (Hungary). P. 55.

12. Шупик M.A., Алесенко A.B., Микоян В.Д., Ванин А.Ф. Связь сигнальных систем оксида азота и сфингомиелиновго цикла в индукции апоптоза при ишемии/реперфузии печени // Международная молодежная конференция "Биохимическая физика, ИБХФ РАН-ВУЗы", 9-11 ноября, 2009, Москва.

13. Шупик М.А. Фактор некроза опухолей - индуктор сигнальных систем оксида азота и сфингомиелинового цикла в процессе ишемии/реперфузии печени крыс // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2010", 12-15 апреля, 2010, Москва. С. 69.

14. Shupik М.А., Alessenko A.V. Influence of NO-donors on the sphingomyelinase activity and accumulation of lipid peroxide products in mice liver // 8th International Sphingolipid Club Meeting, 30 June-4 July, 2010, Glasgow (UK). P. 46.

15. Шупик M.A., Алесенко A.B., Ванин А.Ф., Микоян В.Д. Взаимодействие сигнальных систем оксида азота и сфингомеилинвого цикла при ишемии-реперфузии // Международная конференция "Успехи химической физики", 21-23 июня, 2011, Черноголовка. С. 216.

16. Alessenko A.V., Shupik М.А. Cross-communication between nitric oxide generation, activation of sphingomyelin cycle pathway and lipid peroxidation in mice liver // XIX Intern. Conference "New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology", 31 May-9 June, 2011, Gurzuf (Ukraine).

Заказ № 10-П/08/2012 Подписано в печать 09.08.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шупик, Мария Александровна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Свойства N0 и его физиологическое действие

1.2. Двойственный эффект N0 при апоптозе

1.2.1. Апоптотические свойства N

1.2.1.1. Влияние N0 на функции митохондрий

1.2.2. Антиапоптотические свойства N

1.2.2.1. Ингибирование апоптоза сОМР-зависимым путем

1.2.2.2. Ингибирование активности каспаз Б-нитрозилированием

1.3. Про- и антиоксидантные свойства N

1.4. N0 и СФМ-цикл

1.4.1. СФМ-Цикл

1.4.2. Роль церамида в регуляции гибели клеток

1.4.2.1. Роль генерации N0 в клеточной гибели, индуцированной церамидом

1.4.2.2. N0 и ингибирование генерации церамида

1.4.2.3. Церамид и N0 при проведении сигнала апоптоза

1.4.3. Взаимосвязь сигнальных систем СФМ-цикла и окислительного стресса. Общие активаторы и ингибиторы

1.4.4. Взаимодействие N0, ТГчГР-а и СФМ-цикла при апоптозе

1.4.4.1. Функциональные свойства ТЫБ-а

1.4.4.2. ТЫБ-а и пероксидное окисление липидов

1.4.4.3. ТШ-а и СФМ-цикл

1.4.4.4. Роль N0 при передаче сигнала Т№"-а

1.5. N0 при ишемии-реперфузии

1.6. Роль ТЫБ-а при ишемии-реперфузии

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1. Экспериментальные модели

2.1.1. Ишемия печени

2.1.2. Введение доноров N0, ТЫБ-а и церамида животным

2. 2. Препаративные методы

2.2.1. Получение гомогената ткани

2.2.2. Экстракция липидов из субклеточных структур

2.2.3. Синтез нитрозотиолов и ДНКЖ

2.3. Аналитические методы

2.3.1. Определение активности СФМаз

2.3.2. Определение содержания белка в гомогенате

2.3.3. Анализ фосфолипидов и церамидов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)

2.3.4. Анализ продуктов ПОЛ

2.3.5. Электрофорез низкомолекулярной ДНК в агарозном геле

2.3.6. Идентификация ТИБ-а

2.3.7. Идентификация N

2.3.8. Статистический анализ

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Изучение влияния соединений-доноров N0 на показатели СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы, содержание СФМ и церамида) и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.1.1. Влияние ДНКЖ на СФМ-цикл

3.1.2. Влияние ОБИО на СФМ-цикл

3.1.3. Влияние №N02 на СФМ-цикл

3.1.4. Влияние доноров N0 на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.2. Изучение влияния ТЫР-а на показатели СФМ-цикла (активность 1\Г-СФМазы и содержание церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.2.1. Влияние ТЫБ-а на показатели СФМ-цикла: активность Ы-СФМазы и содержание церамида в печени мышей

3.2.2. Влияние ТЫБ-а на показатели ПОЛ в печени мышей

3.3. Изучение влияния церамида на содержание ТЫБ-а и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.3.1. Влияние церамида на содержание Т№-а в печени мышей

3.3.2. Влияние церамида на содержание продуктов ПОЛ в печени мышей

3.4. Изучение содержания ТЫБ-а, продуктов ПОЛ, N0, и активности СФМаз при ишемии-реперфузии печени

3.4.1. Определение содержания ТЫБ-а при ишемии-реперфузии

3.4.2. Определение содержания диеновых конъюгатов при ишемии-реперфузии

3.4.3. Определение содержания N0 при ишемии-реперфузии

3.4.4. Изменение активности СФМаз при ишемии-реперфузии

3.4.4.1. Изменение активности И-СФМазы при ишемии-реперфузии

3.4.4.2. Изменение активности А-СФМазы при ишемии-реперфузии

3.4.5. Определение деградации ДНК при ишемии-реперфузии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени"

Актуальность работы. Оксид азота (N0) - двухатомная молекула, обладающая исключительным многообразием биологических функций. N0 проникает через плазматические мембраны, участвуя в передаче межклеточных сигналов, а также оказывает своё действие как вторичный посредник внутри клеток в составе внутриклеточных эффекторных систем, например, при проведении сигнала запрограммированной клеточной гибели - апоптоза. В зависимости от ряда условий N0 проявляет двойственные свойства в отношении процесса апоптоза. Критической детерминантой про-либо антиапоптотической роли N0 являются его концентрация, источник и тип клеток. Биохимический механизм, лежащий в основе про- и антиапоптотических свойств N0 определяется пересечением многих сигнальных систем, участвующих в проведении сигнала апоптоза с поверхности клеточной мембраны в ядро. Особое значение при реализации программы апоптоза играет взаимодействие сигнальной системы N0 и сфингоминлинового цикла (СФМ-цикл).

Функциональная взаимосвязь между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла определяется общей субклеточной локализацией ферментов синтеза NO (Patel and Insel, 2009) и присутствием церамида и СФМаз (Zhang and Li, 2010) в структурных элементах плазматической мембраны - кавеолах и рафтах.

N0 генерируется в клетке специальными ферментами - NO-синтазами

NOS) (Moneada and Higgs, 1993). Генерация NO эндотелиальной синтазой

NO (eNOS) при низких концентрациях - один их механизмов ингибирования апоптоза, который запускается при активации рецепторов суперсемейства б фактора некроза опухоли а (TNF-а) (TNF-R1) (Liu, 1999). В высоких концентрациях N0 способен индуцировать апоптоз per se. В основе этих противоположных эффектов могут лежать разные механизмы действия N0 при низких и высоких концентрациях (Bruñe, 2003, Liu and Stamler, 1999). В этой связи представляется исключительно значимой способность N0 регулировать клеточный уровень церамида. Исследования на клетках U939 и Т-лимфоцитах показали, что N0 ингибирует апоптотический ответ, индуцированный TNF-R1, подавляя способность этих рецепторов генерировать церамид (De Nadai et al., 2000).

В организме животных и человека обнаружено несколько типов СФМаз, ферментов гидролизующих СФМ с образованием церамида и фосфохолина. Решающую роль в апоптозе играют две изоформы: кислая лизосомальная (А-СФМаза) и нейтральная Mg -зависимая (N-СФМаза). А-СФМаза и N-СФМаза - мишени действия NO (Perrotta and Clementi, 2010), однако защита от апоптоза в лимфоидных клетках происходит вследствие ингибирования именно А-СФМазы. Возможно, такой механизм защиты от апоптоза распространяется и на другие типы клеток, так как подобные результаты получены также на дендритных клетках человека и мыши, а также на некоторых раковых клетках. В частности, генерация N0 ингибировала апоптоз в дендритных клетках, подвергнутых обработке апоптогенными дозами липополисахарида (LPS) in vitro, и в модели LPS-индуцированного сепсиса in vivo (Falcone et al., 2004); кроме того, наблюдалось защитное действие NO in vitro и in vivo при воздействии химиотерапевтического агента цисплатина на модели опухолевой химиотерапии. Есть данные, что в процесс ингибирования СФМаз и защиты от апоптоза (Perrotta et al., 2007) вовлечена активация растворимой гуанилатциклазы (sGC), генерация циклогуанидинмонофосфата (cGMP) и активация cGMP-завиеимой протеинкиназы (Falcone et al., 2004, Perrotta et al., 2007).

При обработке клеток высокими дозами NO, например, в результате 7 продукции NO индуцибельной NOS (iNOS) при воспалении, наблюдается прямо противоположный эффект. На ряде клеточных линий показано, что высокие дозы N0 усиливают генерацию церамида А- и N-СФМазами, что приводит к гибели клеток по пути апоптоза (Takeda et al., 1999, Huwiler et al., 1999a, Pilane and LaBelle, 2004, Castillo et al., 2007). Механизмы, участвующие в активации СФМаз, не изучены, но явно отличны от механизма ингибирования этих ферментов, так как cGMP-независимы и для их реализации необходима активация каспазы-3 (Takeda et al., 1999, Huwiler et al., 1999a, Castillo et al., 2007), в которую, возможно, вовлечена генерация эйкозаноидов из арахидоновой кислоты (Pilane and LaBelle, 2004).

В случае N-СФМазы взаимодействие между NO и СФМ-циклом двунаправленное, так как активация eNOS может быть стимулирована продуктами, генерируемыми вследствие активации N-СФМазы, в основном, церамидом.

Церамид, активируемый либо А- либо N-СФМазой, вероятно, приводит к гибели клеток различными путями. Церамид, генерируемый А-СФМазой, обычно вовлечён в индукцию и развитие апоптоза, а церамид, генерируемый N-СФМазой в большинстве случаев не является апоптогенным. В контексте передачи сигнала NO, церамид, генерируемый N-СФМазой, метаболизируется в сфингозин, который может проявлять апоптогенные свойства или превращается в антиапоптогенный сфингозин-1-фосфат (SphlP), который, в свою очередь, способен стимулировать iNOS и генерацию NO, а NO, генерируемый таким образом, ингибирует активность и /или активацию обеих СФМаз. Таким образом может происходить ингибирование апоптоза, в соответствии с тем, что в итоге из церамида генерируемого N-СФМазой, образуется SphlP, который является важным регулятором клеточного роста, дифференцировки и ответа на индукторы воспаления (Kwon et al., 2001, De Palma et al., 2006, Perrotta and Clementi, 2010).

NO и СФМ-цикл связаны не только в передаче сигнала апоптоза. 8

Кросс-ток" между сигнальными путями NO/NOS и церамид/СФМазы с множеством обратных связей является общим для большинства систем, вовлеченных в процесс клеточной сигнализации, в том числе, контроля гомеостаза кальция, что выражается в участии этих систем во многих сложных патофизиологических клеточных процессах. Полная характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия сигнальных путей NO/NOS и церамид/СФМазы, могла бы способствовать пониманию их места в сложной сети других сигнальных систем и способов контроля процессов апоптоза, дифференцировки и воспаления.

Наглядный пример пересечения сигнальных систем N0 и СФМ-цикла -их активация при проведении токсического сигнала от TNF-a. Показано, что TNF-a влияет на рост и дифференцировку клеток, участвует в проведении иммунного ответа и в развитии многих патологических процессов, в том числе ишемии-реперфузии органов и тканей. Конкретная роль TNF-a в том или ином системном процессе определяется совокупностью биохимических и биофизических факторов, действующих параллельно с TNF-a. Активация СФМазы и изменение содержания активных форм кислорода (АФК) играют ключевую роль в механизме цитотоксического действия TNF-a. Ишемические повреждения, как правило сопровождаются повышением содержания TNF-a. В процессе реперфузии ишемизированного органа накапливается церамид, что определяется активацией СФМаз, сопровождающейся повышением содержания TNF-a в реперфузированном органе.

Однако N0 может и защищать клетки от токсического действия TNF-a. В экспериментах на iNOS-дефицитных мышах установлено, что iNOS может служить источником NO, оказывающим защитный эффект при окислительном шоке, вызванном TNF-a. Возможно, двойственное действие N0 проявляется также при ишемии-реперфузии.

Как правило, апоптоз наблюдается при реперфузии ишемизированного 9 органа. NO и TNF-a генерируются при ишемии и при реперфузии, но в разных концентрациях. Можно предположить, что в условиях ишемии N0, генерируемый iNOS, сдерживает проявление токсических свойств TNF-a, вызывающих апоптоз, а при реперфузии резкое повышение содержания TNF-a запускает программу воспалительного каскада, который не может контролироваться N0. Кроме того, значительное повышение содержания N0 при реперфузии также становится токсичным для клеток. Следует подчеркнуть, что одновременное повышение содержания цитокина и N0 может приводить к критическому накоплению апоптогенного церамида, реализующего программу клеточной гибели.

Взаимодействие сигнальных систем NO/NOS и церамид/СФМаза определяется окислительным статусом клетки. Это видно при проведении токсического сигнала TNF-a, поскольку он развивается в условиях окислительного стресса.

Показано, что NO и Ог'- в эквимолярных концентрациях образуют пероксинитрит, который является очень сильным оксидантом (Huie and Padmaja, 1993, Rubbo et al., 1994). При физиологических условиях продукция пероксинитрита минимальна и возможные отрицательные последствия его воздействия находятся под контролем системы эндогенной антиоксидантной защиты (Radi et al., 2002). Однако даже небольшое увеличение одновременной продукции N0 и О2" приводит к образованию значительных количеств пероксинитрита: 10-кратное увеличение генерации N0 и 02'~ вызывает 100-кратное повышение продукции пероксинитрита. Такая ситуация возможна в условиях разнообразных патологий (Virag et al., 2003). Образование пероксинитрита обнаруживается при диабете, кардиологических, сосудистых, нейродегенеративных, онкологических заболеваниях.

Основное свойство цитотоксичности пероксинитрита - его способность вызывать перекисное окисление в мембранах (Radi et al., 1991), липосомах и липопротеинах, что приводит к образованию гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов и альдегидов (Denicola et al., 2005). Эти радикалы в свою очередь атакуют ненасыщенные жирные кислоты, генерируя дополнительные радикалы и приводя к развитию цепи свободнорадикальных реакций и деградации липидов мембран (Radi et al., 1991, Hogg and Kalyanaraman, 1999), повышая их проницаемость и текучесть (Richter, 1987). Пероксинитрит - сильный окислитель липопротеинов низкой плотности (ЛНП) (Leeuwenburgh et al., 1997). Модифицированные пероксинитритом ЛНП с высокой аффинностью к рецепторам вызывают аккумуляцию окисленных эфиров холестерина и формирование пенистых клеток, что является ключевым маркером раннего атерогенеза (Guy et al., 2001). Взаимодействие пероксинитрита с липидами мембран приводит также к образованию ряда нитропроизводных липидов (медиаторов при передаче биологических сигналов как при физиологических условиях, так и при развитии различных патологий). Пероксинитрит также реагирует с тиольными группами ряда белков, взаимодействуя с тиолами в активном центре ферментов.

Тем не менее N0 может также защищать от окислительного стресса: нейтрализует CV- и липопероксильные радикалы, регулирует работу супероксиддисмутазы (SOD) (Frank et al., 1999), ингибирует активность NADPH-оксидазы (Muzaffar et al., 2003) и цитохрома P450 (Minamiyama et al., 1997). Следовательно, при избытке 02'~ в присутствии NO развивается перекисное окисление, а в условиях высоких концентраций NO действие 02'~ нейтрализуется и перекисное окисление ингибируется (Miles et al., 1996).

Активность СФМаз также находится под контролем про- и антиоксидантных систем. На культурах клеток и в организме млекопитающих глутатион участвует в регуляции активности N-СФМазы: показано, что апоптоз в нейронах индуцируемый при активации N-СФМазы, вызывает изменения в окислительно-восстановительном состоянии клетки и/или метаболизме глутатиона (Lee et al., 2004). Также известно, что N-СФМаза активируется Н202 и ингибируется глутатионом (Liu et al., 1998).

Ингибирование продукции церамида антиоксидантами, и индукция оксидантами и прооксидантами определяют функцию активных форм кислорода (АФК) и глутатиона в регуляции первого шага в трансдукции сигнала по СФМ-пути. Более того, пониженный уровень глутатиона и повышенный церамида коррелируют с фрагментацией ДНК при апоптозе. Церамид вызывает дисфункцию митохондрий и индуцируют окислительный стресс (Singh et al., 1998). Очевидно, взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, существующая в живых клетках, вносит существенный вклад в развитие апоптоза при кислород-зависимых патологиях, включая ишемические повреждения.

Поскольку сигнальные системы NO и СФМ-цикла активируются провоспалительными цитокинами, в первую очередь TNF-a, что сопровождается индукцией окислительного стресса, то естественным представляется изучение не только этих двух систем, N0 и СФМ-цикла, но и их зависимости от активации окислительных процессов и экспрессии TNF-a. Наиболее адекватной моделью для изучения последовательности активации и взаимосвязи двух сигнальных систем с уровнем продуктов ПОЛ и накоплением TNF-a является экспериментальная ишемия с последующей реперфузией, в нашем случае, печени.

Целью нашей работы было показать наличие взаимосвязи сигнальной системы N0 со СФМ-циклом и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF-a в условиях ишемии-реперфузии печени. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние соединений-доноров N0: динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), нитрозоглутатиона (GSNO) и нитрита натрия (NaN02) на изменения параметров СФМ-цикла (активность СФМаз, уровень сфингомиелина (СФМ) и церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов.

2. На модели ишемии-реперфузии печени изучить изменения в содержании N0 в зависимости от сроков ишемии и последующей

12 реоксигенации.

4. Изучить изменения содержания ТЫБ-а в зависимости от сроков ишемии-реперфузии.

5. Изучить влияние ТКР-а на параметры СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы и концентрацию церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

6. Изучить влияние церамида на уровень ТОР-а и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

7. Исследовать состояние ДНК в ишемизированной печени и при реперфузии.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей) существует взаимосвязь: соединения-доноры N0: ДНКЖ, ОБИО и №N02 влияют на параметры СФМ-цикла (активность N-СФМазы, уровень СФМ и церамида) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов, при этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла от механизма освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и GSNO, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние сроки после их введения животным, а №N02, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через несколько часов после инъекции.

2. Существует корреляция между изменением активности №СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства №СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия

13 приводят к повышению уровня содержания N0 в печени, наиболее выраженного при реперфузии.

4. В процессе ишемии-реперфузии наблюдается образование провоспалительного цитокина TNF-a, которое опережает изменения уровня содержания NO в печени.

5. Существует взаимное влияние TNF-a и СФМ-цикла: TNF-a модулирует активность N-СФМазы и приводит к образованию церамида и продуктов ПОЛ, а продукт СФМ-цикла, церамид, вызывает накопление TNF-a и продуктов ПОЛ в печени мышей.

Научная новизна. Впервые проведено исследование in vivo влияния доноров N0: ДНКЖ, GSNO и NaN02 на СФМ-цикл. Показано, что введение животным доноров N0 приводит к изменениям параметров СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени прошедшего после введения препаратов. Обнаружена корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

Впервые методом ЭТСР-спектроскопии с использованием спиновой ловушки показано, что ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания N0, наиболее выраженного при реперфузии. При этом показано, что накопление провоспалительного цитокина TNF-a опережает изменение уровня содержания NO в печени.

Показано наличие взаимного влияния TNF-a и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей).

На фоне резкого повышения уровня N0 и ТЫБ-а при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла, сопровождающаяся развитием окислительного стресса и апоптоза.

Обнаруженная нами взаимосвязь этих сигнальных систем свидетельствует о возможности влияния на клеточные процессы, находящиеся под контролем N0, путем воздействия на СФМ-цикл и ПОЛ. Например, активаторы и ингибиторы ключевых ферментов СФМ-цикла -кислой и нейтральной СФМаз - могут оказывать существенное влияние на эффективность терапии направленной на восстановление печени подвергнутой ишемии-реперфузии.

Предложен механизм проведения апоптотического сигнала при ишемии-реперфузии печени, заключающийся в накоплении ТКР-а и последующей активации СФМ-цикла и повышении концентрации N0, которые совместно индуцируют апоптоз в клетках печени. Таким образом, полученные нами данные могут быть использованы в медицине при разработке тактики лечения ряда заболеваний связанных с патологией ишемии-реперфузии, таких как инсульт, инфаркт, атеросклероз, а также при трансплантации органов с использованием препаратов нового поколения на основе ингибиторов СФМ-цикла.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шупик, Мария Александровна

Выводы

1. Показано наличие взаимосвязи между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Введение доноров N0: ДНКЖ, ОБЖ) и №N02 приводит к ингибированию СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. При этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла (активность И-СФМазы, уровень СФМ и церамида) от механизма освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и ОБМЭ, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а Ма1чЮ2, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через 2 ч после инъекции.

2. Обнаружена корреляция между изменением активности !Ч-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства И-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

4. В процессе ишемии-реперфузии наблюдается образование провоспалительного цитокина ПЧГР-а, которое опережает изменения уровня содержания N0 в печени.

5. Показано наличие взаимного влияния ТЫБ-а и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Внутрибрюшинное введение ТЫБ-а модулирует активность М-СФМазы, приводит к накоплению проапоптотического агента церамида и продуктов ПОЛ. В свою очередь, продукт СФМ-цикла, церамид вызывает накопление в печени ТЫБ-а и продуктов ПОЛ.

6. На фоне резкого повышения уровня N0 и ТТчГР-а при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла,

97 сопровождающаяся развитием окислительного стресса. В этих условиях развивается апоптоз, что подчёркивает взаимосвязь сигнальных систем N0, ТЫБ-а и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.

Заключение

Механизмы, по которым ишемия и последующая реперфузия вызывают апоптоз, могут включать секрецию TNF-a, накопление продуктов ПОЛ и активацию сигнальных систем N0 и СФМ-цикла. СФМ-цикл взаимодействует с другими сигнальными системами, такими, как система генерации активных форм кислорода, в том числе NO.

Особое значение во взаимодействии N0 со СФМ-циклом играет провоспалительный цитокин TNF-a, поскольку он способен модулировать как активность ферментов, синтезирующих NO, так и активность СФМаз, индуцирующих СФМ-цикл. В свою очередь, продукты реакций этих ферментов, N0 и церамид, влияют на экспрессию TNF-a. Кроме того, окислительный стресс и накопление продуктов ПОЛ, вызываемые TNF-a, являются основным звеном его цитотоксического действия. Пересечение во времени этих событий может привести к усилению проапоптотического сигнала, индуцируемого каким-либо фактором, в нашем случае, ишемией и последующей реперфузией. В связи с этим задачей нашего исследования явилось изучение сигнальных систем N0, СФМ-цикла и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF-a при патологии ишемии-реперфузии, что позволит более полно охарактеризовать механизм индукции апоптоза в клетках печени.

В настоящее время в литературе появились доказательства зависимости активности СФМаз от уровня N0. Исследования, проведенные на клеточных культурах, показали, что N0 в зависимости от концентрации и типа клеток способен как вызывать апоптоз, генерацию церамида и активировать СФМазы, так и ингибировать процесс апоптоза и блокировать синтез церамида. В свою очередь, церамид может повышать уровень экспрессии ферментов, продуцирующих N0, активировать их, приводить к накоплению нитритов и нитратов во внутриклеточной среде, или, наоборот, ингибировать NOS.

В нашей работе впервые исследовалось влияние соединений-доноров

N0 на СФМ-цикл в организме животных. Соединения-доноры N0: ДНКЖ, ОБЖ) и ЫаЖ>2 в диапазоне исследованных концентраций ингибируют СФМ-цикл и ПОЛ в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. Изменения параметров СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы, уровень СФМ и церамида) определяются механизмом освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и 08>Ю, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а №N02, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл и ПОЛ только через 2 ч после инъекции. То есть, зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла от природы донора может быть связана с тем, что №Ж)2 не является непосредственным донором N0, и на образование N0 из нитрита (N02") необходимо время, а часть №Ж)2 выводится из организма.

Восстановление N02" в N0 осуществляется в ходе нитритредуктазной реакции: N02" + е" —> N0. Эта реакция катализируется электронно-донорными системами с участием NADH, NADPH, флавопротеинов и цитохромоксидазы в митохондриях и с участием NADH, NADPH, флавопротеинов и цитохрома Р-450 в эндоплазматическом ретикулуме. В результате активации при гипоксии ферментативных и неферментативных систем, участвующих в образовании N0 из ионов N02", происходит активация цикла N0: Ь-аргининЖ)—>Ж)27М)з"—>N0. Биологический смысл

94сопряженности Са -мобилизующей и нитритредуктазной активности в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме заключается в более эффективном использовании N0 и продуктов его метаболизма (N02- и N03-) в регуляции концентрации Са . Эта способность субклеточных структур может иметь особое значение при развитии патологических процессов, протекающих на фоне ишемии и гипоксии клеток тканей человека и животных. Ранее установлено, что умеренная гипоксия является одним из факторов, которые приводят организм в состояние повышенной мобилизации. Отмечены многочисленные изменения, которые можно было бы отнести к компенсаторно-приспособительным. Так, активация цикла N0 и увеличение содержания N0 и NO2 может приводить к индукции перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние, в котором активируются многие ферментные системы, в том числе, участвующие в синтезе АТФ, а также осуществляющие передачу сигнала в клетках и активацию процессов пролиферации. Возможно, этот механизм лежит в основе компенсаторно-приспособительных изменений в ответ на гипоксию (Реутов и др., 2003).

Поскольку ишемия является широко распространенным повреждением печени при отравлениях, хирургических вмешательствах, в том числе и при трансплантации органа, знание биохимических механизмов, приводящих к гибели клеток ишемизированной печени, позволит обозначить новые пути к предупреждению или снижению повреждений органа в условиях недостатка кислорода.

Ранее при ишемии параметры СФМ-цикла и содержание N0 и TNF-a исследовали раздельно и в фиксированные сроки, преимущественно на клетках сердца, мозга и почек. Однако ни в одном из опубликованных исследований не проводилось комплексное изучение характера поведения сигнальных систем N0, СФМ-цикла, ПОЛ и TNF-a при индукции апоптоза в условиях ишемии печени и последующей ее реперфузии у животных.

В наших экспериментах установлено, что при ишемии первым значимым событием является накопление TNF уже через 15 мин после прекращения кровотока. Эти данные согласуются с данными экспериментов, проведенных на сердце и мозге, что ишемические повреждения сопровождаются повышением содержания TNF-a (Tuttolomondo et al., 2008). Изменения содержания N0 и активности СФМаз в печени происходят только спустя 30 мин после начала ишемии.

При изучении изменения активности СФМаз в ишемизированной печени и после ее реперфузии мы обнаружили резкое снижение активности

И-СОМазы на сроках ишемии 30-60 мин и повышение ее активности при реперфузии. А-СФМаза на начальные сроки ишемии (15 и 30 мин) ингибируется, а после 60 мин ишемии ее активность возрастает, превышая контрольный уровень в 1.8 раза. При последующей реперфузии активность этой изоформы фермента резко падает. То есть, при ишемии печени до 30 мин, при которой выживают все животные, снижена активность как 14-СФМазы, так и А-СФМазы, а после 60 мин ишемии, когда гибнет 80% животных, А-СФМаза активирована. По-видимому, на ранних сроках ишемии возможна защитная реакция организма, способная ингибировать активность СФМаз, в результате чего не происходит накопление критического уровня церамида. Это предположение находится в соответствии с нашими данными по введению животным доноров N0, которые показывают, что в исследованных концентрациях N0 ингибирует активность КГ-СФМазы и снижает уровень церамида в печени. При длительной, 60 мин ишемии, когда активирована одна из изоформ СФМазы (А-СФМаза), вероятность накопления проапоптического уровня церамида резко увеличивается, особенно при реперфузии, когда наблюдается активация и другой изоформы фермента (ТЧ-СФМазы). В этих условиях уровень церамида является достаточным для проведения сигнала апоптоза, в ходе которого погибает часть поврежденных клеток при реперфузии после 60 мин ишемии, что мы видим в своих экспериментах, анализируя состояние ДНК.

В статье (2Ьа1 е1 а1., 2009) методом масс-спектрометрии были изучены молекулярные виды сфингомиелинов и церамидов в процессе реперфузии ишемизированной печени. Общее количество церамидов и сфингомиелинов, в том числе и других сфинголипидов, значительно увеличивалось после 60 мин реперфузии. Через 6 ч после реперфузии содержание церамида и СФМ максимально повышалось по сравнению с контролем. Повышение содержания сфинголипидов определялось появлением новых молекулярных форм через 6 ч после реперфузии. Этот эффект авторы объясняют

93 возможным синтезом с1е поуо новых форм сфинголипидов, в то время как повышение содержания церамидов на ранних стадиях реперфузии, вероятнее всего, определяется Т№-а, который в значительных количествах накапливается в реперфузированном органе после ишемии. Таким образом, изменение количества и профиля молекулярных видов сфинголипидов, в основном СФМ и церамида, может быть определяющим звеном в ишемическом процессе с последующей реперфузией.

Накопление ТЫБ-а происходит как при ишемии, так и после реперфузии, однако деградация ДНК по типу апоптотической лестницы наблюдается только при реперфузии после 60 мин ишемии, когда активируется ЬГ-СФМаза, что приводит к накоплению проапоптотических агентов СФМ-цикла, и происходит резкое повышение содержания N0. В процессе реперфузии содержание N0 резко возрастает, в 2-5 раз при 15-30 мин реперфузии после 30 мин ишемии, и достигает семикратного увеличения через 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии.

Для понимания механизма взаимодействия ТЫБ-а и СФМ-цикла при индукции апоптоза большое значение имеют наши данные о влиянии церамида на экспрессию ТЫТ-а в печени. Так, мы показали, что церамид вызывает накопление ТМР-а в печени животных. Эти данные дают возможность предположить, что образование церамида, индуцируемое эндогенным ТТЯБ-а в ишемизированной печени, может приводить к генерации новых порций ТИТ-а, который вновь, активируя СФМазу, приводит к накоплению церамида. Когда уровень церамида достигает критических значений, события в клетке завершаются апоптозом. Именно этот процесс возможен в ишемизированной печени после реперфузии. По такой же схеме могут взаимодействовать церамид и N0 в высоких концентрациях, который также индуцирует накопление церамида, а церамид, в свою очередь, индуцирует синтез N0. Активация при ишемии всех систем, связанных с усиленной генерацией церамида, на наш взгляд, является основным условием, при котором клетки печени входят в апоптоз в условиях ишемии-реперфузии.

Большой вклад в развитие ишемических повреждений вносят окислительные процессы в липидах. Ранее нами и другими исследователями была показана связь активности СФМ-цикла с окислительным статусом клеток (Цюпко и др., 2001). В своей работе мы обнаружили корреляцию между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введения соединений-доноров N0, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

Наши результаты демонстрируют, что пусковым механизмом апоптоза при ишемии-реперфузии может быть накопление в ишемизированном органе TNF-a, который индуцирует накопление N0. Эти события активируют СФМазу, которая расщепляет СФМ до проапоптотического агента церамида. Чтобы уровень церамида достиг критических значений, содержание N0 и TNF-a должно быть высоким, особенно в процессе реперфузии, когда наблюдается деградация ДНК. В свою очередь, церамид, генерируемый при ишемии, способен поддерживать и даже увеличивать содержание NO и TNF-а. То есть, в критических условиях в клетке возможен активный процесс обратной регуляции. Вероятнее всего, именно он имеет место при вхождении клеток в апоптоз. Чтобы этот лавинообразный процесс остановить, необходимо прекратить генерацию церамида, то есть, ингибировать активность СФМаз.

Предложенный нами механизм индукции апоптоза в ишемизированной-реперфузированной печени позволяет рассмотреть новые препараты для предупреждения ишемических повреждений, как при пересадке донорской печени, так и при хирургических вмешательствах на печени. Такими новыми препаратами могут выступить ингибиторы СФМаз. На основании как представленных выше, так и полученных ранее данных об ингибировании in vivo природными антиоксидантами СФМазы, можно предположить, что широко известное противоишемическое действие различного типа антиоксидантов объясняется не только снижением интенсивности ПОЛ, но и их ингибирующим действием на СФМ-цикл. Блокирование СФМ-цикла не позволит развиваться апоптозу даже при наличии высокого содержания ТЫБ-а, который не способен самостоятельно вызывать апоптоз клеток печени. В то же время церамид и сфингозин индуцируют апоптоз во многих типах клеток даже в отсутствии ТЫБ-а. Поэтому в ишемизированном органе необходимо в первую очередь ингибировать активность СФМаз, которые участвуют в генерации индукторов апоптоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шупик, Мария Александровна, Москва

1. Алесенко A.B. Роль метаболитов сфингомиелинового цикла в проведении сигналов пролиферации, дифференцировки и смерти клеток // Биологические мембраны. 1999. Т. 16, № 2. С. 242-255.

2. Ванин А.Ф. К вопросу о стабильности динитрозильного комплекса железа с цистеином как кандидата на роль эндотелиального фактора релаксации кровеносных сосудов // Биохимия. 1995. Т. 60, № 2. С. 308-314.

3. Ванин А. Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 11. С. 7-12.

4. Гесслер H.H., Гомбоева С.Б., Шумаев К.Б., Быховский В.Я., Ланкин В.З. Механизм соокисления ß-каротина и полиеновых жирных кислот // Докл. РАН. 2001. Т.63, №3. С.402-405.

5. Горрен А. К. Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. 1998. Т. 63, № 7. С. 870-880.

6. Заббарова И.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Губкин A.A., Петрова Н.Э., Руге Э.К. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекисного окисления липидов. Роль активных форм кислорода и азота // Биофизика. 2004. Т. 49, № 4. С. 659-665.

7. Реутов В.П., Сорокина Е.Г. NO-синтазная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота // Биохимия. 1998. Т.63, №7. С. 1029-1040.

8. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С., Охотин В.Е. Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности: ретроспективный анализ идей, принципов и концепций. М.: Едиториал УРСС. 2003. 96 с.

9. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1997. С. 63-64.

10. Шпигель С., Гувилер О., Мензелеев Р.Н., Оливера А., Томас Д., Ти 3., Вонг Ф. Роль сфингозин-1-фосфатав клеточном росте, дифференциации и смерти клеток // Биохимия. 1998. Т. 63, № 1. С. 78-88.

11. Шумаев К.Б., Рууге Э.К., Ланкин В.З., Ванин А.Ф., Гомбоева С.Б., Беленков Ю.Н. Механизм ингибирования свободнорадикального окисления (3-каротина S-нитрозоглутатионом и динитрозильными комплексами железа // Докл. РАН. 2001. Т. 379, № 5. С.702-704.

12. Шумаев К.Б., Заббарова И.В., Рууге Э.К., Ванин А.Ф. Влияние активных форм кислорода и азота на высвобождение ионов железа из ферритина и синтез динитрозильных комплексов железа // Биофизика. 2003. Т.48, №1. С.5-10.

13. Adam-Clages S., Adam D., Wiegmann К., Struve S., Kolanus W., Schneider-Mergener J., and Kronke M. FAN, a novel WD-repeat protein, couples the p55 TNF-receptor to neutral sphingomyelinase // Eur. Cytokine Netw. 1996. Vol. 7. P. 93-124.

14. Albina J.E., Cui S., Mateo R.B., and Reichner J.S. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages // J. Immunol. 1993. Vol. 150. P. 5080-5085.

15. Allen D.A., Harwood S., Varagunam M., Raftery M.J., and Yaqoob M.M. High glucose-induced oxidative stress causes apoptosis in proximal tubular epithelial cells and is mediated by multiple caspases // FASEB J. 2003. Vol. 17. P. 908-910.

16. Arana L., Gangoiti P., Ouro A., Trueba M., and Gomez-Munoz A. Ceramide and ceramide 1-phosphate in health and disease // Lipids Health. Dis. 2010. Vol. 5. P. 9-15.

17. Ariga T., Jarvis W.D., and Yu R.K. Role of sphingolipid-mediated cell death in neurodegenerative diseases // J. Lipid. Res. 1998. Vol. 39, 1. P. 1-16.

18. Ballou L. R., Laulederkind S. J., Rosloniec E. F., and Raghow R. Ceramide signalling and the immune response // Biochim. Biophis. Acta. 1996. Vol. 1301. P. 273-287.

19. Bilzer M., and Gerbes A. J. Preservation injury of the liver: mechanisms and novel therapeutic strategies // J. Hepatol. 2000. Vol. 32, 3. P. 508-115.

20. Bligh E.G., and Dyer W.Y. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. 1959. Vol. 37. P. 911-923.

21. Bloodsworth A., O'Donnell V.B., Freeman B.A. Nitric oxide regulation of free radical- and enzyme-mediated lipid and lipoprotein oxidation // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. Vol. 20, 7. P. 1707-1715.

22. Boese M., Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R., and Mulsh A. S-nitrosation of serum albumin by dinitrosyl-iron complex // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, 49. P. 29244-29249.

23. Brekke O.L., Sagen E., and Bjerve K.S. Specificity of endogenous fatty acid release during tumor necrosis factor-induced apoptosis in WEHI 164 fibrosarcoma cells // J. Lipid Res. 1999. Vol. 40, 12. P. 2223-2233.

24. Brugg B., Michel P.P., Agid Y., and Ruberg M. Ceramide induces apoptosis in cultured mesencephalic neurons // J. Neurochem. 1996. Vol. 66. P. 733-739.

25. Briine B. Nitric oxide: NO apoptosis or turning it ON? // Cell Death Differ. 2003. Vol. 10, 8. P. 864-869.

26. Castillo S.S., Levy M., Thaikoottathil J.V., and Goldkorn T. Reactive nitrogen and oxygen species activate different sphingomyelinases to induce apoptosis in airway epithelial cells // Exp. Cell Res. 2007. Vol. 313. P. 26802686.

27. Cauwels A., Bultinck J., and Brouckaert P. Dual role of endogenous nitric oxide in tumor necrosis factor shock: induced NO tempers oxidative stress // Cell Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 1632-1640.

28. Cauwels A., and Brouckaert P. Survival of TNF toxicity: dependence on caspases and NO // Arch. Biochem. Biophys. 2007. Vol. 462. P. 132-139.

29. Chen T., Zamora R., Zuckerbraun B., and Billiar T.R. Role of nitric oxide in liver injury // Curr. Mol. Med. 2003. Vol. 3. P. 519-526.

30. Chun S.Y., Eisenhauer K.M., Kubo M., and Hsueh A.J. Interleukin-1 beta suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide production // Endocrinology. 1995. Vol. 136. P. 3120-3127.

31. Chung H.T, Pae H.O, Choi B.M, Billiar T.R, and Kim Y.M. Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 282, 5. P. 1075-1079.

32. Coffey M.J., Coles B. and O'Donnell V.B. Interactions of nitric oxide-derived reactive nitrogen species with peroxidases and lipoxygenases // Free Radic. Res. 2001. Vol. 35. P. 447-464.

33. Colombini M. Ceramide channels and their role in mitochondria-mediated apoptosis // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1797. P. 1239-1244.

34. Cui S., Reichner J. S., Mateo R. B., and Albina J. E. Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide-dependent or -independent mechanisms // Cancer Res. 1994.Vol. 54, 9. P. 2462-2467.

35. Degli Esposti M., and McLennan H. Mitochondria and cells produce reactive oxygen species in virtual anaerobiosis: relevance to ceramide-induced apoptosis // FEBS Lett. 1998. Vol. 430. P. 338-342.

36. Delaney C.A., Tyrberg B., Bouwens L., Vaghef H., Hellman B., and Eizirik D.L. Sensitivity of human pancreatic islets to peroxynitrite-induced cell dysfunction and death // FEBS Lett. 1996. Vol. 394. P. 300-306.

37. Denicola A., and Radi R. Peroxynitrite and drug-dependent toxicity // Toxicology. 2005. Vol. 208. P. 273-288.

38. Dobrowsky R.T., Werner M.N., Castellino A.M., Chao M.V., and Hannun Y.A. Activation of the sphingomyelin cycle through the low-affinity neurotrophin receptor// Science. 1994. Vol. 265. P. 1596-1599.

39. Drapier J. C., Wietzerbin J., and Hibbs J. B. Interferon-gamma and tumor necrosis factor induce the L-arginine-dependent cytotoxic effector mechanism in murine macrophages // Eur. J. Immunol. 1988. Vol. 18, 10. P. 1587-1592.

40. Dressier K.A., Mathias S., and Kolesnik R. Tumor necrosis factor-alpha activates the sphingomyelin signal transduction pathway in a cell-free system // Science. 1992. Vol. 255. P. 1715-1718.

41. Fehsel K., Kroncke K. D., Meyer K. L., Huber H., Wahn V., and Kolb -Bachofen V. Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes // J. Immunol. 1995. Vol. 155, 6. P. 2858-2865.

42. Festjens N., Kalai M., Smet J., Meeus A., Van Coster R., Saelens X., and Vandenabeele P. Butylated hydroxyanisole is more than a reactive oxygen species scavenger // Cell Death Differ. 2006. Vol.T3, 1. P. 166-169.

43. Fortenberry J.D., Owens M.L., Brown M.R., Atkinson D., and Brown L.A. Exogenous nitric oxide enhances neutrophil cell death and DNA fragmentation // Am. J. Respir.Cell. Mol. Biol. 1998. Vol. 18. P. 421-428.

44. France-Lanord V., Brugg B., Michel P.P., Agid Y., and Ruberg M. Mitochondrial free radical signal in ceramide-dependent apoptosis: a putative mechanism for neuronal death in Parkinson's disease // J. Neurochem. 1997. Vol. 69. P. 1612-1621.

45. Franzen R., Pfeilschifter J., and Huwiler A. Nitric oxide induces neutral ceramidase degradation by the ubiquitin/proteasome complex in renal mesangial cell cultures // FEBS Lett. 2002. Vol. 532. P. 441-444.

46. Genaro A.M., Hortelano S., Alvarez A., Martinez C., and Bosca L. Splenic B lymphocyte programmed cell death is prevented by nitric oxide release through mechanisms involving sustained Bcl-2 levels // J. Clin. Invest. 1995. Vol. 95, 4. P. 1884-1890.

47. Geng Y.-L., Petersson A.-S., Wennmalm A., and Hannson G. Cytokine-induced expression of nitric oxide synthase results in nitrosylation of heme and nonheme iron proteins in vascular smooth muscle cells // Exp. Cell Res. 1994. Vol.214, 1. P. 418-424.

48. Gill J.S., and Windebank A.J. Ceramide initiates NFkappaB-mediated caspase activation in neuronal apoptosis // Neurobiol. Dis. 2000. Vol. 4. P. 448461.

49. Goni F.M., and Alonso A. Sphingomyelinases: enzymology and membrane activity // FEBS Lett. 2002. Vol. 531. P. 38-46.

50. Grether-Beck S., Bonizzi G., Schmitt-Brenden H., Felsner I., Timmer A., Sies H., Johnson J.P., Piette J., and Krutmann J. Non-enzymatic triggering of the ceramide signalling cascade by solar UVA radiation // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 5793-5800.

51. Guy R.A., Maguire G.F., Crandall I., Connelly P.W., and Kain K.C. Characterization of peroxynitrite-oxidized low density lipoprotein binding to human CD36 // Atherosclerosis. 2001. Vol. 155. P. 19-28.

52. Han D., Ybanez M.D., Ahmadi S., Yeh K., and Kaplowitz N. Redox regulation of tumor necrosis factor signaling // Antioxid. Redox. Signal. 2009. Vol. 11. P. 2245-2263.

53. Hannun Y. The sphingomyelin cycle and the second messenger function of ceramide // J. Biol. Chem. 1994.Vol. 269, 5. P. 3125-3128.

54. Hannun Y.A., and Luberto C. Ceramide in the eukaryotic stress response // Trends Cell. Biol. 2000. Vol. 10. P. 73-80.

55. Hebestreit H., Dibbert B., Balatti I., Braun D., Schapowal A., Blaser K., and Simon H.U. Disruption of fas receptor signaling by nitric oxide in eosinophils // J. Exp. Med. 1998. Vol. 187. P. 415-425.106

56. Herrmann M., Lorenz H., Voll R., Griinke M., Woith W., and Kalden J. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments // Nucleic Acids Research. 1994. Vol. 22, 24. P. 5506-5507.

57. Higuchi M., and Aggarwal B. Modulation of two forms of tumor necrosis factor receptors and their cellular response by soluble receptors and their monoclonal antibodies // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 20892-20899.

58. Hines I.N., Harada H., Bharwani S., Pavlick K.P., Hoffman J.M., and Grisham M.B. Enhanced post-ischemic liver injury in iNOS-deficient mice: a cautionary note. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 284. P. 972976.

59. Hines I.N., Kawachi S., Harada H., Pavlik K.P., Hoffman J.M., Bharvanti S., Wolf R.E., and Grisham M.B. Role of nitric oxide in liver ischemia and reperfusion injury // Mol. Cell. Biochem. 2002. Vol. 234-235. P. 229-237.

60. Hogg N., and Kalyanaraman B. Nitric oxide and lipid peroxidation // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1411(2-3). P. 378-384.

61. Hortelano S., Dallaporta B., Zamzami N., Hirsch T., Susin S.A., Marzo I., Bosca L. and Kroemer G. Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition // FEBS Lett. 1997. Vol. 410, 2-3. P. 373377.

62. Hostetler K.Y., Yazaki P.Y. The subcellular localization of neutral sphingomyelinase in rat brain // J. Lip. Res. 1979. Vol. 20. P. 456-463.

63. Huie R.E., and Padmaja S. The reaction NO with superoxide // Free Radie. Res.Commun. 1993. Vol. 18. P. 195-199.

64. Huwiler A., Dorsch S., Briner V.A., van den Bosch H. and Pfeilschifter J. Nitric oxide stimulates chronic ceramide formation in glomerular endothelial cells // 1999a. Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 258, 1. P. 60-65.

65. Huwiler A., Pfeilschifter J., and van den Bosch H. Nitric oxide donors induce stress signaling via ceramide formation in rat renal mesangial cells // J. Biol. Chem. 1999b. Vol. 274. P. 7190-7195.

66. Igarashi J., Thatte H.S., Prabhakar P., Golan D.E. and Michel T. Calcium-independent activation of endothelial nitric oxide synthase by ceramide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 12583-12588.

67. Irie F., and Hirabayashi Y. Application of exogenous ceramide to cultured rat spinal motoneurons promotes survival or death by regulation of apoptosis depending on its concentrations // J. Neurosci. Res. 1998. Vol. 54. P. 475-485.

68. Isobe M., Katsuramaki T., Hirata K., Kimura H., Nagayama M., and Matsuno T. Beneficial effects of inducible nitric oxide synthase inhibitor on reperfusion injury in the pig liver // Transplantation. 1999. Vol. 68, 6. P. 803813.

69. Jaeschke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2003. Vol. 284. P. G15-G26.

70. Josephs M., Katan M., and Rodrigues-Lima F. Irreversible inactivation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase 1 (NSM1) by peroxynitrite, a nitric oxide-derived oxidant // FEBS Lett. 2002. Vol. 531, 2. P. 329-334.

71. Jungner M., Ohvo H., and Slott J. P. Interfacial regulation of bacterial sphingomyelinase activity // Biochim. Biophis. Acta. 1997. Vol. 1344, 3. P. 230-240.

72. Kaplowitz N. J. Mechanisms of liver cell injury // J. Hepatol. 2000. Vol. 32, l.P. 39^17.

73. Kawachi S., Hines I.N., Laroux F.S., Hoffman J., Bharwani S., Gray L., Leffer D., and Grisham M.B. Nitric oxide synthase and postischemic liver injury // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 276, 3. P. 851-854.

74. Kim Y.M., Bergonia H., and Lancaster J.R. Nitrogen oxide-induced autoprotection in isolated rat hepatocytes // FEBS Lett. 1995. Vol. 374, 2. P. 228-232.

75. Kim Y. M., de Vera M. E., Watkins S. C., and Billiar T. R. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression // J. Biol. Chem. 1997a. Vol. 272,2. P. 1402-1411.

76. Kim Y.M., Talanian R.V., and Billiar T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms // 1997b. J. Biol.Chem. Vol. 272, 49. P. 31138-31148.

77. Kim Y.M., Kim T.H., Seol D.W., Talanian R.V., and Billiar T.R. Nitric oxide suppression of apoptosis occurs in association with an inhibition of Bcl-2 cleavage and cytochrome c release // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, 47. P. 31437-31441.

78. Kim Y. M., Chung H. T., Simmons R. L., and Billiar T. R. Cellular non-heme iron content is a determinant of nitric oxide-mediated apoptosis, necrosis, and caspase inhibition // J. Biol. Chem. 2000a. Vol. 275, 15. P. 10954-10961.

79. Kolesnick R.N., and Kronke M. Regulation of ceramide production and apoptosis // Annu. Rev. Physiol. 1998. Vol . 60. P. 643-665.

80. Kronke M. Functional dichotomy of neutral and acidic sphingomyelinases in tumor necrosis factor signaling // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 267. P. 1799718001.

81. Kwon Y.G., Min J.K., Kim K.M., Lee D.J., Billiar T.R., and Kim Y.M. Sphingosine 1-phosphate protects human umbilical vein endothelial cells from serum-deprived apoptosis by nitric oxide production // J. Biol. Chem. 2001 . Vol. 276, 14. P. 10627-10633.

82. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, 259. P. 680-685.

83. Lancaster J.R., and Hibbs J.B. EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87, 3. P. 1223-1227.

84. Lee J.T., Xu J., Lee J.M., Ku G., Han X., Yang D.I., Chen S., Hsu C.Y. Amyloid-beta peptide induces oligodendrocyte death by activating the neutral sphingomyelinase-ceramide pathway // J. Cell Biol. 2004. Vol. 164, 1. P. 123131.

85. Levrand S., Vannay-Bouchiche C., Pesse B., Pacher P., Feihl F., Waeber B., and Liaudet L. Peroxynitrite is a major trigger of cardiomyocyte apoptosis in vitro and in vivo // Free Radic. Biol. Med. 2006. Vol. 41. P. 886-895.

86. Li J., Billiar T.R., Talanian R.V., and Kim Y.M. Nitric oxide reversibly inhibits seven members of the caspase family via S-nitrosylation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 240. P. 419-424.

87. Li C.Q., and Wogan G.N. Nitric oxide as a modulator of apoptosis // Cancer Lett. 2005. Vol. 226, l.P. 1-15.

88. Lin K. T., Xue J.Y., Nomen M., Spur B., and Wong P. Y. Peroxynitrite-induced apoptosis in HL-60 cells // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, 28. P. 1648716490.

89. Liu B., and Hannun Y.A. Inhibition of the neutral magnesium-dependent sphingomyelinase by glutathione // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 1628116287.

90. Liu B., Andrieu-Abadiei N., Levadei T., Zhang P., Obeid L.M., Hannun Y.A. Glutathione regulation of neutral sphingomyelinase in tumor necrosis factor-a-induced cell death // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 11313-11320.

91. Liu L., and Stamler J.S. NO: an inhibitor of cell death. // Cell Death Differ. 1999. Vol. 6, 10. P. 937-942.

92. Liu P., Xu B., Quilley J., and Wong P.Y. Peroxynitrite attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. Vol. 279. P. C1970-C1977.in

93. Lowry O.H., Rosebrogh N.G., Farr A.L. Protein measurement with folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

94. Lukivskaya O., Patsenker E., Lis R., and Buko V.U. Inhibition of inducible nitric oxide synthase activity prevents liver recovery in rat thioacetamide-induced fibrosis reversal // Eur. J. Clin. Invest. 2008. Vol. 38, 5. P. 317-325.

95. Mangoura D., and Dawson G. J. Neurochem. Programmed cell death in cortical chick embryo astrocytes is associated with activation of protein kinase PK60 and ceramide formation // 1998. Vol. 70. P. 130-138.

96. Marchesini N., and Hannun Y.A. Acid and neutral sphingomyelinases: roles and mechanisms of regulation // Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 82. P. 27-44.

97. Mathias S., Younes A., Kan C., Orlow I., Joseph C., and Kolesnik R. Activation of the sphingomyelin signaling pathway in intact EL4 cells and in a cell-free system by IL-1 beta// Science. 1993. Vol. 259. P. 519-522.

98. Matthews N., Neale M.L., Jackson S.K., and Stark J.M. Tumour cell killing by tumour necrosis factor: inhibition by anaerobic conditions, free-radical scavengers and inhibitors of arachidonate metabolism // Immunology. 1987. Vol. 62. P. 153-155.

99. Maurer B.J., Metelista L.S., Seeger R.C, Cabot M.C., and Reynolds C.P. Increase of ceramide and induction of mixed apoptosis/necrosis by N-(4hydroxyphenyl)-retinamide in neuroblastoma cell lines // J. Natl. Cancer Inst. 1999. Vol. 91. P. 1138-1146.

100. Merrill A.H. De novo sphingolipid biosynthesis: a necessary, but dangerous, pathway // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, 29. P. 25843-25846.

101. Messmer U.K., Reimer D. M., Reed J.C., and Brune B. Nitric oxide induced poly(ADP-ribose) polymerase cleavage in RAW 264.7 macrophage apoptosis is blocked by Bcl-2 // FEBS Lett. 1996. Vol. 384, 2. P. 162-166.

102. McDaniel M.L., Corbett J.A., Kwon G., and Hill J.R. A role for nitric oxide and other inflammatory mediators in cytokine-induced pancreatic beta-cell dysfunction and destruction // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. Vol. 426. P. 313-319.

103. Miles A.M., Bohle D.S., Glassbrenner P.A., Hansert B., Wink D.A., and Grisham M.B. Modulation of superoxide-dependent oxidation and hydroxylation reactions by nitric oxide // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 407.

104. Minamiyama Y., Takemura S., Imaoka S., Funae Y., Tanimoto Y., and Inoue M. Irreversible inhibition of cytochrome P450 by nitric oxide // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. Vol. 283. P. 1479-1485.

105. Mogami K., Kishi H., and Kobayashi S. Sphingomyelinase causes endothelium-dependent vasorelaxation through endothelial nitric oxide production without cytosolic Ca(2+) elevation // FEBS Lett. 2005. Vol. 579. P. 393-397.

106. Moncada S., and Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway //N. Engl. J. Med. 1993. Vol. 329. P. 2002-2012.

107. Mulsch A., Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R. Formation and release of dinitrosyl iron complexes by endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 196, 3. P. 1303-1308.

108. Nikolova-Karakashian M.N., and Rozenova K.A. Ceramide in stress response // Adv. Exp. Med. Biol. 2010. Vol. 688. P. 86-108.

109. Okazaki T., Bell R.M., and Hannun Y.A. Sphingomyelin turnover induced by vitamin D3 in HL-60 cells. Role in cell differentiation // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 19076-19080.

110. Pacher P., Beckman J.S., and Liaudet L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease // Physiol. Rev. 2007. Vol. 87. P. 315-424.

111. Pahan K., Sheikh F.G., Khan M., Namboodiri A.M., and Singh I. Sphingomyelinase and ceramide stimulate the expression of inducible nitric-oxide synthase in rat primary astrocytes // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 2591-2600.

112. Patel H.H., and Insel P.A. Lipid rafts and caveolae and their role in compartmentation of redox signaling // Antioxid. Redox. Signal. 2009. Vol. 11. P. 1357-1372.

113. Pautz A., Franzen R., Dorsch S., Boddinghaus B., Briner V.A., Pfeilschifter, J. and Huwiler, A. Cross-talk between nitric oxide and superoxide determines ceramide formation and apoptosis in glomerular cells // Kidney Int. 2002.Vol. 61. P. 790-796.

114. Perrotta C., De Palma C., and Clementi E. Nitric oxide and sphingolipids: mechanisms of interaction and role in cellular pathophysiology // Biol. Chem. 2008. Vol. 389. P. 1391-1397.

115. Perrotta C., and Clementi E. Biological roles of Acid and neutral sphingomyelinases and their regulation by nitric oxide // Physiology (Bethesda). 2010. Vol. 25. P. 64-71.

116. Pettus B.J., Chalfant C.E., and Hannun Y.A. Ceramide in apoptosis: an overview and current perspectives // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1585. P. 114-125.

117. Pilane C.M., and LaBelle E.F. NO induced apoptosis of vascular smooth muscle cells accompanied by ceramide increase // J. Cell. Physiol. 2004. Vol. 199. P. 310-315.

118. Quillet-Mary A., Jaffrezon J.P., Mansat V., Bordier C., Naval J. and Laurent G.I. Implication of mitochondrial hydrogen peroxide generation in ceramide-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 1997.Vol. 272, 34. P. 21388-21391.

119. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitriteinduced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // Arch. Biochem. Biophys. 1991. Vol. 288. P. 481-487.

120. Radi R., Cassina A., Hodara R. Nitric oxide and peroxynitrite interactions with mitochondria // Biol. Chem. 2002. Vol. J83. P. 401-409.

121. Raghuram N., Fortenberry J.D., Owens M.L., and Brown L.A. Effects of exogenous nitric oxide and hyperoxia on lung fibroblast viability and DNA fragmentation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 262. P. 685-691.

122. Raha S., and Robinson B.H. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and ageing // Trends. Biochem. Sci. 2000. Vol. 25. P. 502-508.

123. Rao B.G., and Spence M.W. Sphingomyelinase activity at pH 7.4 in human brain and a comparison to activity at pH 5.0 // J. Lipid Res. 1976. Vol. 17. P. 506-515.

124. Richter C. Biophysical consequences of lipid peroxidation in membranes // Chem. Phys. Lipids. 1987. Vol. 44. P. 175-189.

125. Salgo M.G., Squadrito G.L., and Pryor W. A. Peroxynitrite causes apoptosis in rat thymocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 215, 3. P. 1111-1118.

126. Sastry P.S., and Rao K.S. Apoptosis and the nervous system // J. Neurochem. 2000. Vol. 74. P. 1-20.

127. Schuchman E.H., Suchi M., Takahashi T., Sandhoff K., and Desnick R.J. Human acid sphingomyelinase. Isolation, nucleotide sequence and expression of the full-length and alternatively spliced cDNAs // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, 13. P. 8531-8539.

128. Schutze S., Potthoff K., Machleidt T., Dorge J., Berkovic D., Wiegmann K, and Kronke M. TNF-alfa activates NF-kappa B by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced "acidic" sphingomyelin breakdown // Cell. 1992. Vol. 71, 5. P. 765-776.

129. Shaul P.W. and Anderson R.G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 275. P. L843-L851.

130. Singh I., Pahan K., Khan M, Singh A.K. Cytokine-mediated induction of ceramide production is redox-sensitive // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 20354-20362.

131. Sosnowski J., Stetter-Neel C., Cole D., Durham J.P., and Mawhinney M.G. Protein kinase C mediated anti-proliferative glucocorticoid-sphinganine synergism in cultured Pollard III prostate tumor cells // J. Urol. 1997. Vol. 158, 1. P. 269-274.

132. Takeda Y, Tashima M, Takahashi A, Uchiyama T, Okazaki T. Ceramide generation in nitric oxide-induced apoptosis. Activation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase via caspase-3 // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, 15. P. 10654-10560.

133. Teoh N., Dela Pena A., and Farrell G. Hepatic ischemic preconditioning in mice is associated with activation of NF-kappaB, p38 kinase, and cell cycle entry // Hepatology. 2002. Vol. 36. P. 94-102.

134. Teoh N.C., and Farrell G.C. Hepatic ischemia reperfusion injury: pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection // J. Gastroenterol. Hepatol. 2003. Vol. 18. P. 891-902.

135. Teoh N., Leclercq I., Pena A.D., and Farrell G. Low-dose TNF-alpha protects against hepatic ischemia-reperfusion injury in mice: implications for preconditioning // Hepatology. 2003. Vol. 37. P. 118-128.

136. Tezel G., and Yang X. Caspase-independent component of retinal ganglion cell death, in vitro // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. Vol. 45. P. 4049-4059.

137. Tomiuk S., Hofmann K., Nix M., Zumbansen M., and Stoffel W. Cloned mammalian neutral sphingomyelinase: functions in sphingolipid signaling? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 3638-3643.

138. Tuttolomondo A., Di Raimondo D., di Sciacca R., Pinto A., and Licata G. Inflammatory cytokines in acute ischemic stroke // Curr. Pharm. Des. 2008. Vol. 14. P. 3574-3589.

139. Uchiyama T., Otani H., OkadaT., Ninomiya H., Kido M., Imamura H., Nogi S., and Kobayashi Y. J. Nitric oxide induces caspase-dependent apoptosis and necrosis in neonatal rat cardiomyocytes // Mol. Cell. Cardiol. 2002. Vol. 34. P. 1049-1061.

140. Van der Veen R.C., and Roberts L.J. Contrasting roles for nitric oxide and peroxynitrite in the peroxidation of myelin lipids // J. Neuroimmunol. 1999. Vol. 95. P. 1-7.

141. Venable M.E., Lee J.Y., Smyth M.J., Bielawska A., and Obeid L.M. Role of ceramide in cellular senescence // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 3070130708.

142. Virag L., Szabo E., Gergely P., Szabo C. Peroxynitrite-induced cytotoxicity: mechanism and opportunities for intervention // Toxicol. Lett. 2003. Vol. 140— 141. P. 113-124.

143. Wajant H., Pfizenmaier K., and Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling // Cell Death Differ. 2003. Vol. 10. P. 45-65.

144. Watanabe N., Kuriyama H., Sone H., Neda H., Yamaguchi N., Maeda M., and Niitsu Y. Continuous internalization of tumor necrosis factor receptors in a human myosarcoma cell line // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 10262-10266.

145. Won J.S., Im Y.B., Khan M., Singh A.K., and Singh I. The role of neutral sphingomyelinase produced ceramide in lipopolysaccharide-mediated expression of inducible nitric oxide synthase // J. Neurochem. 2004. Vol. 88. P. 583-593.

146. Zarkovic N. 4-hydroxynonenal as a bioactive marker of pathophysiological processes // Mol. Aspects Med. 2003. Vol. 24, 4-5. P. 281-291.120

147. Zhai S.T., Liu G.Y., Xue F^Sun G.P., Liang L., Chen W., Xu G.D., Li J.J., Yang J., and Liang T.B. Changes of sphingolipids profiles after ischemia-reperfusion injury in the rat liver // Chin. Med. J. 2009. Vol. 122. P. 302530302531.

148. Zaman K., Hanigan M.H., Smith A., Vaughan J., Macdonald T., Jones D.R., Hunt J.F., Gaston B. Endogenous S-nitrosoglutathione modifies 5-lipoxygenase expression in airway epithelial cells // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2006. Vol. 34, 4. P. 387-393.

149. Zhang Y., and Kolesnick R. Signaling through the sphingomyelin pathway // Endocrinology. 1995. Vol. 136. P. 4157-4160.

150. Zhang M., and Chen L. Status of cytokines in ischemia reperfusion induced heart injury // Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets. 2008. Vol. 8. P. 161172.

151. Zhang C., and Li P.L. Membrane raft redox signalosomes in endothelial cells // Free Radic. Res. 2010. Vol. 44. P. 831-842.

152. Zhu C., Xu F., Wang X., Shibata M., Uchiyama Y., Blomgren K., and Hagberg H. Different apoptotic mechanisms are activated in male and female brains after neonatal hypoxia-ischaemia // J. Neurochem. 2006. Vol. 96. P. 1016-1027.

Информация о работе

Шупик, Мария Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы