Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Связь цитотоксической активности мутантных форм фактора некроза опухоли-альфа с накоплением сфингозина в клетках печени мышей

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Связь цитотоксической активности мутантных форм фактора некроза опухоли-альфа с накоплением сфингозина в клетках печени мышей"

СГ;

I

^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. И. М. ЭМАНУЭЛЯ

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВ Александр Сергеевич

СВЯЗЬ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МУТАНТНЫХ ФОРМ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ-АЛЬФА С НАКОПЛЕНИЕМ 'СФИНГОЗИНА В КЛЕТКАХ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ

03.00.02 - Биофизика 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Отделе кинетики химических и биологических процессов Института Биохимической Физики РАН им. Н.М. Эмануэля

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

А.В. Алесенко

доктор биологических наук ПЛ. Бойков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Л.Б. Горбачева

доктор биологических наук, профессор Э.В. Дятловицкая

Ведущая организация: Институт биофизики клетки РАН,

Пущино

Защита состоится "_"_1997 г. в ;_час. на заседании

Диссертационного Совета Д200.53.01 в Институте Биохимической Физики РАН им. Н.М. Эмануэля. Адрес: 117977, Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Объединенного Института Химической Физики РАН им. H.H. Семенова

Автореферат разослан'*"_"_____ 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д200.53.01

кандидат химических наук М А. Смотряева

г

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Возрастающая с каждым годом активность з изучении процессов функционирования клетки и целого организма, приводит к широким перспективам в борьбе с ранее неизлечимыми эолезнями, в том числе раком, СПИДом, болезнью Альцгеймера и др. Данный прорыв в области медицины стал возможен благодаря широкомасштабным фундаментальным исследованиям механизмов действия цитокинов, которые участвуют в регуляции иммунных процессов в организме. Данная область лежит на стыке химии, физики и биологии, благодаря чему обеспечивается разносторонний подход к данной проблеме. Роль липидной компоненты клетки была и остается одним из интригующих вопросов в процессе передачи клеточного сигнала, чем объясняется большое количество работ в мире, посвященных этой теме.

Фактор некроза опухоли-a (ФНО-а) - полипептид с молекулярной массой 17 кДа, принадлежащий к семейству цитокинов, продуцируется, в основном, активированными моноцитами и макрофагами (Carswell et al., 1975; Old, 19S5; Fiers, 1991; Beutler & Cerami, 1988; Aggarwal & Natarajan, 1996). Первоначально интерес к изучению свойств ФИО был вызван его способностью вызывать геморрагический некроз некоторых видов опухолей in vivo, а также токсическим действием на опухолевые клетки in vitro (Carswel! et al., 1975). В настоящее время показано, что ФНО-а участвует в проведении иммунного клеточного ответа, влияет на рост и дифференцировку клеток и обладает множеством других биологических функций (Fausher et al., 1988; Gehr et ai., 1992; Kirsheis et ai., 1992; Ohta et al., 1995,1996). Биохимический механизм передачи сигналов, реализующих разнообразные эффекты ФНО-а, а том числе, его цитотоксическое действие,

в настоящее время недостаточно изучен. В частности, известно, что начал< передачи сигнала от ФНО-а определяется его взаимодействием с двум: клеточными рецепторами с молекулярными массами 55-60 кДа (R55) и 75-81 кДа (R75) (Fiers, 1991;Vandenabeele et al., 1995;Loetsher et al., 1993;Tartagli; et al., 1992). В то время как сведения о передаче сигнала с помощью R7! рецептора довольно ограниченны, в отношении рецептора R55 показано что именно взаимодействием с этим рецептором определяете: цитотоксичность фактора некроза опухолей (Yanaga & Watson, 1992 Beyaert & Fiers, 1994). Многочисленными экспериментами установлено, чт< рецептор R55, помимо цитотоксичности, определяет и" другие свойств; ФНО-а, такие как индукция биосинтеза цитокинов, пролифераци: фибробластов, синтез простагландинов и др. (Aggarwal & Natarajan, 1996" Кроме того, взаимодействие ФНО-а с рецептором R55 приводит активации сфингомиелиназы в клетках NIH ЗТЗ и накоплению церамидг который, как полагают, могут участвовать в индукции апоптоза, вызванное фактором некроза опухолей (Kim et al.,1991; Obeid et al., 1993). Однако функциональной роли сфингозина в проведении цитотоксического сигнал ФНО сведений в литературе крайне недостаточно. Тем не менее это метаболит сфингомиелинового цикла привлекает внимание в связи высокой его токсичностью и множеством функций в передаче клеточны сигналов (регуляция активности протеинкиназ и лротеаз, мобилизаци кальция и др.) (Hannun & Bell, 1989; Sohal & Cornell, 1990; Zhang et al., 1990; Использование ФНО-а в качестве противоопухолевого агента осложняете его высокой общей токсичностью для организма опухоленосителя, котора; по-видимому, коррелирует с токсичностью для клеток. Поэтому выяснени сигнального механизма, ответственного за цитотоксичность ФНО-с позволит направленно формировать стратегию терапевтическог примененияФНО-а.

ЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось [ределение функциональной роли продуктов сфингомиелинового цикла в редаче цитотоксического сигнала мутантных форм фактора некроза ¡ухоли человека в клетках печени мышей.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи: Исследовать роль точечных и делеционных мутаций в структуре молекулы ¡комбинантного фактора некроза опухоли-альфа в его цитотоксичности и юсобности к активации сфингомиелинового цикла и накоплению зингозина.

Изучить действие сфингозина как цитотоксического, мутагенного и [тимутагенного агента.

Исследовать сходство между действием сфингозина и фактора некроза тухоли как агентов, вызывающих крупноблочную-фрагментацию ДНК в 1етках печени мышей in vivo.

i Используя видоспецифичность рецепторов ФНО, изучить путь активации :на с-шус фактором некроза опухоли через 1155-рецептор ФНО, взывающий активацию сфингомиелинового цикла.

АУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведенных экспериментов знаружена корреляция между цитотоксичностью мутантных форм жомбинантного фактора некроза опухоли-альфа и накоплением продукта гградации сфингомиелина - сфингозина - в клетках печени мышей ¡n vivo, оказано отсутствие подобной корреляции с уровнем других составляющих |)ингомиелинового цикла - сфингомиелина, церамида, активностью ермента сфингомиелиназы.

Показана роль точечных и делеционных мутаций в структуре олекулы рекомбинантного фактора некроза опухоли-альфа в его

цитотоксичности и способности к активации сфингомиелинового цикла i накоплению сфингозина.

Изучено действие сфингозина как мутагенного и антимутагенноп агента и показана его способность к избирательному антимутагенном] действию.

Установлена корреляция между действием сфингозина и фактор; некроза опухоли как агентов, вызывающих крупноблочную фрагментации ДНК в клетках печени мышей in vivo.

Используя видоспецифичность рецепторов ФНО, был изучен пут: активации гена с-тус фактором некроза опухоли. Была показана связ между действием фактора некроза опухоли-альфа, активирующеп сфингомиелиновый цикл через 1155-рецептор ФНО, и активацией ген раннего ответа с-тус, что позволяет сделать заключение об участи] продуктов сфингомиелинового цикла в активации гена с-шус.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результат! проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическо значение для понимания механизмов действия мутантных фор] рекомбинантного фактора некроза опухоли-альфа и роли продукте сфингомиелинового цикла в передаче индуцированного им сигнал« Полученные данные могут быть использованы в медицине и фармакологи для разработки стратегии терапевтического применения ФНО-с Полученные при этом результаты могут быть, с одной сторонь использованы для комбинированного лечения злокачественны новообразований, а, с другой стороны, учтены при направленном синтез новых мутантных форм ФНО-а, обладающих цитотоксическим действие природного цитокина, но проявляющих более селективное действие.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены на I Международном Симпозиуме по биохимии липидов, Санкт-стербург, 1994 г., на Всероссийской школе-конференции молодых 1сных «Современные проблемы молекулярной биологии», ерноголовка, 1995 г., на конкурсе работ молодых ученых ИХФ РАН, на > Международной конференции по биохимии липидов, 1994, Абердин Цотландия), на 6 Североамериканском симпозиуме по изучению ;енобиотиков, 1994, Ролли (США), на 4 Международном Съезде [еждународного Общества по изучению ксенобиотиков, 1995, Сиэтл !ША), на 6 Международном Конгрессе по изучению ФИО, 1996, Родос реция).

УБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных 1бот.

ТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из ¡едения, обзора литературы, описания материалов и методов ¡следования, изложения результатов исследования и их обсуждения, .(водов и списка цитированной литературы.

Текст диссертации изложен на _ страницах машинописного

:кста, иллюстрирован _ таблицами и _ рисунками. Библиография

:лючает_наименований.

ОЛОЖЕНИЯ. ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1) Мутантные формы рекомбинантного фактора некроза опухоли-1ьфа вызывают накопление сфингозина в клетках печени мышей и эти (менсния коррелируют с цитотоксичностью мутантных форм ФНО.

2) Сфингозин обладает избирательной антимутагенной стивностью, предотвращая мутации типа сдвига рамки считывания.

3) Мутантные формы рекомбинантного фактора, некроза опухоли-альфа и сфингозин вызывают аналогичные картины крупноблочной фрагментации ДНК в клетках печени мышей in vivo.

4) Активация генов раннего ответа (на примере онкогена с-тус), продукты которых участвуют в проведении сигнала апоптоза, индуцируется через 1155-рецептор ФНО, связанный с индукцией сфингомиелиновогс цикла.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперименты по изучению изменений в содержании компоненте! сфингомиелинового цикла, активности сфингомиелиназы, а также крупноблочной фрагментации ДНК после действия мутантных форм ФНО i сфингозина проводили на мышах линий Balb весом 18-20 г. ФНО и егс мутантные формы растворялись в физрастворе (0.14 М NaCl), а сфингозш предварительно в этаноле и затем в физрастворе, так что конечна: концентрация этанола в растворе не превышала 1%. Свежеприготовленны' растворы вводились животным внутрибрюшинно в концентрации Ü мкг/мышь. Животных содержали на общевиварном рационе. Дл: исключения влияния суточных ритмов декапитацию животных проводили одно и то же время суток (13-15 ч дня).

Активность сфингомиелиназы определяли по методу Хостетлер (Hostetler & Yazaki, 1979). В качестве субстрата использовался [N-мети иС]сфингомиелин (Amersham, Англия). Об активности фермента судили п образованию водорастворимого [14С]холинфосфата. .

Экстракцию липидов из ткани и ядер проводили по методу Блайя Дайера (Bligh & Dyer, 1959) в модификации Кейтца (Кейтц, 1980

зделение фосфолипидов и церамидов проводили методом тонкослойной юматографии на стеклянных пластинках размером 20x20 см с крепленным слоем (толщиной 250 мкм) силикагеля (средний размер стиц 2-25 мкм, диаметр пор 60 A, Sigma, ФРГ), Хроматографию >сфолипидов проводили в системе растворителей хлороформ-метанол-дяная уксусная кислота-вода (25:15:4:2, v/v/v/v). Для определения держания церамидов использовали две системы растворителей: 1 -иловый эфир, 2 - хлороформ-метанол-вода (40:10:1, v/v/v). Липидгше !тна идентифицировали в виде комплекса с медью, полученного после [рыскивания хроматограмм 10% раствором CuS04 в 8% фосфорной [слоте и нагревания при 160 °С в течение 10 мин. Сканирование юматограмм проводили на денситометре Chromoscan 3 (Joyce-Loeble,

1ГЛИЯ).

Анализ содержания азотистых оснований с длинной жирной цепью -ободных сфингозинов - проводили методом обращеннофазовой гсокоэффективной жидкостной хроматографии, разработанным для печени >ыс Меррилом и соавторами (Merrill et al., 1988). В работе использовали PLC-хроматограф Beckman 334, колонку RP18 «Элсико» (Москва).

Концентрацию белка в растворе и аликвотах гомогената определяли по ¡году Лоури (Lowry et а!., 1951). Количество РНК определяли [ектрофотометрически (спектрофотометр СФ-20). Радиоактивность [ределяли в жидкостном сцинтиляционном счетчике SL-4000 tertechnique, Франция.

Цитотоксичность ФНО проверяли на клетках мышиных фибробластов )29 на 96-луночном планшете в присутствии актиномицина Д. Конечная щцентрация того и другого вещества в культуральной среде составляла 1 сг/мл. Инкубация продолжалась при 37 °С в течение 22-24 часов. Мертвые етки удаляли промывкой инкубационной средой. Оставшиеся клетки

фиксировали 3% глутаровым альдегидом и промывали. Иммобилизованные клетки прокрашивали метиленовым синим, добавляли 0.3 М HCl измеряли адсорбцию при 665 нм используя Titertec Multiscan plate reader (Flow Laboratories, США).

Цитотоксичность сфингозина определялась на штамме клеток E.coli К-12 ABl 157. Клетки выращивали в культуральной среде LB до титра 1-5x108 клеток/мл. При определении токсичности клетки инкубировали в течение 30 минут со сфингозином в концентрации 1.2x10'4 М, после чего клетки отмывали от препарата, центрифугировали и высевали суспензию на полноценную агаризованную среду LB. Подсчет выживших клеток проводили методом последовательных разведений.

Мутагенную активность сфингозина определяли на штаммах клеток Salmonella typhimurium в соответствии с общепринятой методикой Эймса (Ames et al., 1973). В качестве позитивных контролей использовались водные растворы мутагенов азида натрия и 2-нитрофлуорена.

Антимутагенную активность сфингозина изучали в сравнительны* экспериментах с предобработкой клеток сфингозином и последующей т обработкой мутагенами. Сфингозин фирмы «Serva» растворяли в ДМСО i затем доводили до нужного объема дистиллированной водой (ДМС0:Н20 • 1:9).Сфингозин использовался в сублетальной концентрации 0.5x10-5 М. Е качестве мутагенов использовались азид натрия и карминомицин i концентрации 10"4М (Schwartz et al., 1980).

При изучении активации гена с-тус нами были выделены гепатоциты и: печени беспородных крыс. Гепатоциты (106 клеток/мл) инкубировались i культуральной среде (RPMI 1640), в которую добавлялся ФНО - 3000 U/мл.

РНК из гепатоцитов крыс и печени мышей. выделяли с помощьк гуанидинизотиоцианатного метода (Chirgwin et al., 1979) с последующим! модификациями (Krieg et al., 1983; Спитковский и соавт., 1986). Тотальны'

зепараты РНК (20 мкг) фракционировали в 1% агарозном геле в сатурирующих условиях, переносили на нитроцеллголозные фильтры и |бридизовали с мечеными в реакции ник-трансляции плазмидами, »держащими вставки онкогена с-шус (Gazin et al., 1984).

Анализ фрагментации тотальных препаратов ДНК проводили с змощью нейтрального электрофореза в горизонтальном слое 2.0 или 2.5 %-зй агарозы, приготовленной на буфере ТАЕ (0.04 мМ трис-HCl, рН 8.0, 2.4 VI уксусная кислота, 1 мМ ЭДГА) в том же буфере при комнатной :мпературе и напряженности электрического поля 5 В/см2. В каждую лунку шосили по 4-6 мкг ДНК. В качестве маркера использовали Hind-III рагменты фага X.

После электрофореза ДНК в геле окрашивали раствором бромистого идия (0.5 мкг/мл). Гель освещали ультрафиолетовой лампой через фильтр ФС-2 и фотографировали на пленку «Свема 64» или «Тасма 64» через эасный светофильтр.

Опыты проводили 2-3 раза. На каждую опытную точку брали 3 мыши, гзультаты опытов подвергали вариационно-статистическому анализу. В 1боте представлены средние значения величин и етандартгые ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В наших экспериментах использовались мутантные формы ФНО, штезированные в лаборатории В.Г. Коробко в Институте биоорганической 1мии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Известно, что дологически активный фактор некроза опухоли-а (ФНО-а) существует в атворе в виде тримера (Smith & Baglioni,1987), причем С-концевые шстки мономеров сближены и находятся в нижней части тримера. Ранее

было показано, что С-концевые аминокислоты играют критическую роль в проявлении биологической (циготоксической) активности ФНО-а (Gase e.a., 90). Исходя из этого, для изучения участия сфингозина - продукта сфингомиелинового цикла в проявлении токсических свойств ФНО мы использовали наряду с рекомбинантным белком, аналогичным по активности белку дикого типа (ФНОЗЭ1), и мутантные белки, имеющие аминокислотные замены в С-концевой части молекулы, а также мутант, содержащий" делецию четырех аминокислотных остатков в петлевом участке молекулы ФНО-а (Gase et al., 1990). Так, в мутанте ФН0332 произведена замена Ile в положении 155 на Leu, тогда как ФН0338 представляет собой двойной мутант с заменами Ile на Leu в положении 155 и Val на Ile в положении 150. ФНОЗ11 имеет делецию 4 аминокислотных остатков (67-70).

1. Определение цитотоксичности мутантов ФНО-а.

' i

Для изучения, биологической активности рекомбинантного ФНО-а г его мутантов (табл.1) использовали цитопатический тест на клетка> мышиных фибробластов линии L929. Цитотоксичность представлена Kai отношение специфической активности мутантов к активности ФНОЗЗ1.

Наиболее активными в этом отношении оказались полипептидь ФНОЗЗ 1 и ФНОЗ 11, тогда как мутант ФН0338 был практичесм нетоксичным для этой линии клеток (табл.1). Большая разница i цитопатической активности мутантов предполагает наличие активны) сайтов в молекуле полипептида и открывает возможность изменени! биологической активности ФНО-а путем точечных мутаций. Подобны! путь может быть весьма перспективным для использования

абл. I. Сравнение цитотоксической активности мутантных форм ФНО-а зловека, определенной на клетках L929 в присутствии актиномицина Д сонцентрации ФНО и актиномицина Д - 1 мкг/мл).

ФНО-мутаит Тип мутаций Относительная цитотоксичность

ФНО 331 делеция 1-2 1.0

ФНО 311 деления 67-70 1.0

ФНО 332 Ile 155 Leu 0.3

ФНО 336 Glu 127 Gin 0.4

ФНО 338 Val 15011e, Ile 155 Leu 0.02

утантных форм ФНО-а в качестве лекарственных препаратов.

Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в клетках печени ышей после действия мутантных форм ФНО.

В наших экспериментах изучались изменения в активности нейтральной [зингомиелиназы в гомогенате клеток печени после инъецирования мышам утантных форм фактора некроза опухоли. Анализ действия ФНО на ггивность фермента проводился относительно контрольных мышей на юки 15 и 30 минут, I, 2, 3, 5, 8, и 24 часа. На рисунке 1 видно, что мутанты минимальной цитотоксической. активностью (ФН0336 и ФН0338) ¡еличивагот активность сфингомиелиназы в 1.7 - 1.8 раз в течение первых ) минут после инъекции и между 2 и 3 часами. Более токсичные формы -Н0331, имеющий наиболее схожую структуру с диким типом ФНО, и Н0332 с точечной заменой лейцина на изолейцин в положении 155 ->актически

; вносили резких изменений в активность фермента в течение первых >сьми часов. Однако все рассмотренные мутантные формы ФНО

Время после инъекции ФНО, часы

Рис. 1. Изменение активности нейтральной сфингомиелиназы в печени мышей после введения мутантных форм ФНО-а.

повышали активность сфингомиелиназы к 24 часам после инъекции.

3. Изменение содержания сфингомиелина в клетках печени мышей после действия мутантных форм ФНО.

Нами были изучены изменения в содержании сфингомиелина мембран е клетках печени мышей после действия мутантных форм ФНО. В наши> экспериментах не было показано значительных изменений в содержанш сфингомиелина на всем изученном временном интервале после инъекцш цитокина (Рис. 2). Таким образом нами было показано отсутствие прямо? корреляции между активацией сфингомиелиназы и содержание?, сфингомиелина после действия ФНО и его мутантных форм in vivo.

Время после инъекции ФНО, часы ;. 2. Изменение содержания сфингомиелина в печени мышей после дения мутантных форм ФНО-а.

ьяснением данного феномена может служить наличие компенсаторных >цессов, протекающих в целом организме более быстро и слаженно, чем ¡п о.

Изменение содержания церамида в клетках печени мышей после действия гантных форм ФНО.

В этих экспериментах нами были также изучены изменения в уровне замида - продукта деградации сфингомиелина сфингомиелиназой - после }ствия фактора некроза опухоли и его мутантов на печень мышей. Было казано, что только некоторые из мутантов в незначительной степени вышают уровень церамида. ФН0336 и ФН0311 в течение первых 30 нут и к 24 часам незначительно увеличивают концентрацию церамида к. 3).

Время после инъекции ФНО, часы Рис. 3. Изменение содержания церамида в печени мышей после введени ФНО-а и его мутантов.

При этом так же, как и в случае со сфингомиелином, отсутствует корреляци между активацией сфингомиелиназы, уровнем сфингомиелина цитотоксичностью ФНО и его мутантных форм на протяжении все изученных временных отрезков.

5. Изменение содержания сфингозина в клетках печени мышей поел действия мутантных форм ФНО.

Как показали наши эксперименты, при действии мутантов ФНО-наблюдается повышение уровня сфингозина в гомогенате клеток печени течение первых двух часов (Рис. 4). При этом изменения могут носить ка резкий (ФНОЗЗ1 и мутант ФНОЗ111), превышающий контрольный уровень 5,5 раз, так и меньший по амплитуде эффект (выше контроля от 1,8 до 3 рг для мутантов ФН0332, ФНОЗЗб и ФН0338). Через три часа после введени

1вотным рассматриваемых полипептидов уровень сфингозина в печени актически нормализуется.

Время после инъекции ФНО, часы

1С. 4. Изменение содержания сфингозина в печени мышей после введения 'тантных форм ФНО-а.

1кая динамика изменения количества сфингозина в клетках печени хорошо ррелирует с цитотоксичностью белков на клетках Ь929, полученной в ших экспериментах. Более того, из всех рассмотренных нами ставляющих сфингомиелинового цикла уровень сфингозина оказался инственным параметром, претендующим на непосредственную связь с гготоксичностью ФНО. Это не отрицает возможности участия в процессах 1тотоксичности других внутриклеточных посредников, а лишь щтверждает важность данного вещества.

Определение цитотоксичности, мутагенной и антимутагенной активности >ингозина.

В наших экспериментах установлено, что сфингозин в дозе 1,2x10"4 IV вызывает гибель более 95% клеток Е. coli через 30 мин контакта. В работе Леви и Лисковича (Lavie & Liscovitch, 1990) показано, что сфингозин в доз< 0,5x10"4 М также вызывает гибель клеток млекопитающих NG 108-15.

Во всех проведенных экспериментах с использованием как Salmonell; typhimurium, так и Е. coli не выявлена мутагенная активность сфингозина независимо от его концентрации - от токсической до сублетальной, а такж! генотипа тестерных клеток и наличия в них плазмиды pKMIOl.

Однако в опытах на E.coli зарегистрирована избирательна: антимутагенная активность сфингозина. Она проявляется в опытах, когд: сфингозин использован для предобработки бактерий в сублетально: концентрации 0,5x10"6 М, а в качестве мутагенного фактора применялс карминомицин в концентрации 1x10"4 М. В сравнительных эксперимента: при уровне выживаемости клеток в 10% - в контроле и в опыте - частот мутаций (Arg ) в экспериментах с карминомицином (контроль) составила 5,' на 106 выживших клеток, а в клетках с предобработкой сфингозином (опыт лишь 0,23 на Ю6 выживших клеток. Таким образом, сфингози препятствует образованию мутаций тина сдвига рамки считывания, ко торы характерны для карминомицина. Согласно общепринятой гипотезе генотоксическая и мутагенная активность карминомицина, типичног представителя антрациклинов -моносахаридов, являются следствие интеркаляции его молекулы в спираль ДНК. Последняя, в свою очеред! опосредована аминогруппой его сахарного остатка (Schwartz et al., 1980 Сфингозин также имеет в своей структуре аминогруппу, что може определять его способность связываться с ДНК, которая была обнаружен ранее (Алесенко и др., 1993). Вероятно, сфингозин может препятствоват взаимодействию антибиотика с ДНК, что и приводит к снижению чист мутаций в геноме клеток Е. coli, индуцированных карминомицином. Следу«

метить, что это свойство сфингозин проявляет в довольно низких дозах, торые, как было показано в работе Жанга с соавторами (Zhang et al., 90), вызывают активацию синтеза ДНК в покоящихся Swiss ЗТЗ клетках, знаруженный нами антимутагенный эффект сфингозина можно ссматривать как еще одно его свойство, наряду с уже известной ролью в честве сигнальной молекулы.

В экспериментах с азидом натрия антимутагенная активность шнгозина не установлена, что подчеркивает его избирательную [тимутагенную активность.

Фрагментация ДНК в клетках печени мышей после действия сфингозина и НО.'

По имеющимся в ' литературе данным, ФНО может вызывать эагментацию ДНК с последующей апоптотической гибелью клетки (Takeda al., 1993, Ohta et al., 1995,1996). Известно, что межнуклеосомная ¡градация ДНК является одной из характерных черт апоптоза, однако in vo ФНО может вызывать деградацию ДНК в печени мышей лишь в >четании с ингибиторами транскрипции. В связи с этим мы предполагали, :о сфингозин, накопление которого в клетках печени мышей было нами знаружено после действия ФНО, не будет вызывать глубоких изменений в руктуре ДНК, заметных на тотальных препаратах.

Целью наших исследований было сравнение способности сфингозина и НО вызывать фрагментацию ДНК. На рисунке 5 представлена шктрофореграмма фрагментированной ДНК через 2.5 часа после действия зух мутантных форм ФНО, обладающих, наиболее ярко выраженной ятотоксической активностью, и сфингозина в дозе 20 мкг на мышь. Видно, го картины фрагментации ДНК в том и другом случаях совпадают, тсутствие характерной для апоптоза «лестницы.» не является

определяющим условием для процесса апоптоза, поскольку в настояще( время широко дискутируется вопрос о роли крупноблочной фрагментадт ДНК в апоптозе. Ряд исследователей полагает, что при апоптозе можс наблюдаться три типа фрагментации: межнуклеосомная высокомолекулярная (на 50-300 тысяч пар оснований), и однонитевая

ф ф Ст К Сф 33] "зл

Рис. 5. Нейтральный электрофорез ДНК, изолированной из 'гомогенат печени мышей через 2.5 часа после инъекции ФН0331, ФНОЗП / сфингозина в дозе 10 мкг/мышь.

деградация (ВоПпег е1 а1., 1995). В нашем случае мы, по всей видимости наблюдали второй тип. При дальнейшем развитии апоптотического процесс эти крупноблочные фрагменты ДНК могут расщепляться на более мелкие, том числе межнуклеосомные, что проявляется в появлении "лестницы" н электрофореграммах.

Таким образом, на основании этих фактов мы предполагаем, чт сфингозин является непосредственным участником передач цитотоксического сигнала ФНО, который выражается в повреждении Д№ Учитывая способность сфингозина связываться с ДНК, можно представит

янгозин инициатором ее фрагментации и последующего процесса >пто за.

Анализ механизма проведения клеточного сигнала, приводящего к 'ивации онкогенов фактором некроза опухли.

Из литературных данных известно, что определяющим цитотоксическое ¡стоне ФИО из двух его рецепторов считается R55-рецептор (Beayert & :rs, 1994, Vandenabeele et al., 1995). Цитотоксический сигнал, дуцируемый ФИО, приводит к фрагментации ДНК, которая при :утствии репаративных процессов приводит к гибели клетки через некроз и апоптоз. Во всех процессах, происходящих в ядре принимают участие ш раннего ответа - с-шус, c-fos и другие, кодирующие ядерные белки, зетственные за инициацию большинства жизненно важных процессов в гтке - пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и т.п. В связи с этим ми была поставлена задача проследить за функционированием одного из чых известных генов раннего ответа с-тус в процессе передачи тотоксического сигнала ФНО в клетках печени крыс in vitro. Нами была едложена модель, в которой изолированные клетки печени крыс рабатывались рекомбинантными ФНО-а человека и мыши, что приводит к гивации только Я55-рецептора ФНО ( Wolvers et al., 1993). Поскольку нный рецептор ответственен за активацию сфингомиелинового цикла ggarwal & Natarajan, 1996; Yanaga & Watson, 1992, Schutze et al., 1993), вводящего к накоплению сфингозина в клетке, было интересно проверить личие связи между накоплением сфингозина и активацией гена с-шус.

В наших экспериментах было показано, что активация Я55-рецептора в етках печени крыс фактором некроза опухоли человека и мыши приводит активации экспрессии гена с-шус, которая проявляется через час после здействия цитокина (рис. 6). Поскольку R-55 рецептор связан с

активацией сфингомиелинового цикла, то можно предположить, чт продукты этого цикла могут участвовать в индукции экспрессии гена с-тус вызываемой ФНО.

Ранее Филипповой с соавторами (1991) была показана корреляци между накоплением сфингозина в ярах клеток печени мышей и экспрессие генов с-шус,

КТт

I 2 М ; ( 9 и«

Рис. 6. Блот-гибридизация [ 32Р]-у-тус с тотальными препаратами РШ выделенными из гепатоцитов печени крыс через различные интервал; времени после действия рекомбинантного ФНО человека и мыши в доз 3000 едениц препарата на 106 гепатоцитов.

с-Гоб, с-]ап после действия ЦГИ. Это подтверждает на и предположение о роли сфингозина в функционировании генов раннег токсического продукта сфингомиелинового цикла в переда1 цитотоксического сигнала ФНО.

Таким образом, анализ литературных и собственных данны: позволяет сделать заключение о существовании как положительных, так

ФНО

осфолипаза Л2

иги-

"1—1.

ЛФЛ ФЛ

и

г®1

т

Фосфолипаза Г)

рецептор ФНО /

ГШ

Ф-Хол*

(-Г

Фосфолипаза С ОХ 1

/ I ХТ

- Ф-Хол I _)

-ФК

ЙПВ '

ф>Ы 1-ФИФ]

■ сор-длг

1

•ИФ,

♦ длг-

Сфингомислнназа

V.

-^

| Церамия Сфинго-миелин

I

Ф-Хол

Цсрамидаза

Сфингозин __/

сунок 7. Взаимодействие систем вторичных мессенджеров липидной ироды в передаче сигнала ФНО (АК - арахидоновая кислота, ДАГ -ацилглицерол, ИФ3 - инозит-трифосфат, ЛФЛ - лизофосфолипиды, ФК -1сфатидная кислота, ФХ - фосфатидилхолин, Ф-Хол - фосфохолин, ФИФ2 -(сфатидилинозит-дифосфат, Хол - холин, СОР-ДАГ - цнтидил-дифосфат -ацилглицерин - трансфераза).

отрицательных связей между системами вторичных мессенджеров ицерофосфолипидной и сфинголипидной природы. Взаимодействие гнал-активируемых фосфолипаз и протеинкиназ в клетке в ответ на фактор кроза опухоли и другие цитокины позволяет говорить о сложной системе зимосвязанных регуляторных каскадов (рис. 7), приводящих к экспрессии х или иных генов в каждом случае. Можно также отметить, что связь ксического действия ФНО-ос с активацией липолитических ферментов

легко сводится к активации ферментов сфингомиелинового цикла, продую которого - сфингозин, являясь сам по себе высокотоксичным, может бьгп причиной цитотоксичности ФНО-а. Обнаруженная связь междч цитотоксичностью мутантов ФНО-а, цитотоксичностью сфингозина i уровнем его накопления в органах животных дает основание высказат] предположение о том, что именно этот клеточный метаболит вызывае-повреждение клетки и ее гибель в результате действия ФНО-а. Анали: литературных данных позволяет сделать заключение, что ни один и: продуктов гидролиза фосфолипидов различными фосфолипазами № обладают таким выраженным цитотоксическим действием, как сфингозин. I дальнейшем предстоит выяснить механизм его цитотоксического действия и возможно, что это природное вещество найдет достойное место современной фармакологии наряду с ФНО-а.

ВЫВОДЫ

1. Изучена взаимосвязь между цитотоксичностью мутантных фор; фактора некроза опухоли-альфа и изменением параметро сфингомиелинового цикла - активностью сфингомиелиназы, уровне] содержания сфингомиелина, церамида и сфингозина - в клетках печен мышей in vivo. Показано, что мутантные формы ФНО с делеционным мутациями 1-2 и 67-70 (ФНОЗЗ! и ФНОЗИ соответственно), обладающи максимальной цитотоксичностью, вызывают наибольшее увеличение уровн сфингозина в клетках печени мышей in vivo. Показано также отсутстви подобной связи с другими параметрами сфингомиелинового цикла.

2. Показано цитотоксическое действие сфингозина на клетках E.coli обнаружены его свойства как избирательного антимутагенного агента i клетках Salmonenella typhimurium в случае с интеркалирующи

тибиотиком карминомицином, вызывающим мутации типа сдвига мки считывания.

3. Установлено сходство между действием сфингозина и мутантиых >рм фактора некроза опухоли как агентов, вызывающих угтоблочную фрагментацию ДНК клеток печени in vivo.

4. Используя видоспецифическую способность ФНО человека язываться только с Я55-рсцептором ФНО гепатоцитов крысы, было 1казано, что этот процесс приводит к активации с-гпус гена, аствующего в проведении цитотоксического сигнала. Поскольку тивация R55-pcncnTopa ФНО связана с индукцией сфингомислинового [кла, высказывается предположение о том, что продукты этого цикла рагот функциональную роль в регуляции экспрессии гена с-шус.

ГШСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО АТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

. Соловьев A.C., Коробко В.Г., Шингарова Л.Н., Васильева C.B., ахова Е.В., Алесенко A.B. Корреляция цитотоксической активности ггантных форм фактора некроза опухоли-a с изменением уровня ободпого сфингозина в печени мышей.// Биохимия. 1995. т.60, 8. 1283-1292.

2. Алесенко А. В., Соловьев A.C., Тсрснтьев A.A., Хренов A.B. Роль юдуктов сфингомислинового цикла в развитии апоптоза, купированного через рецепторы Fas и фактора некроза опухоли гьфа.// Известия Академии Наук, серия Биологическая. 1997. N4. (в :чати).

3. Соловьев A.C., Шингарова Л.Н., Хренов A.B., Коробко В.Г., лссснко A.B. Связь типа мутаций в структуре фактора некроза опухоли-с его влиянием на изменение уровня продуктов сфингомислинового тля в печени мышей.// VI Симпозиум по биохимии липидов. С,-етербург, 3-6 октября 1994 г. Тезисы докладов. Москва, 1995. с. 98-99.

4. A.V. Alessenko, V.G. Korobko, A.V. Khrenov, U.A. Rozhnova, A.S Soloviev and L.N. Shingarova. Relation of biological activity of mutant forms of recombinant human tumor necrosis factor alpha and accumulation o sphingosine in murine liver.// Biochemystry and Molecular Biologj International (in press)

5. Alessenko A.V., Korobko V.G., Shingarova L.N., Soloviov A.S Correlation between accumulation of sphingosine in liver cells and cellulai cytotoxicity of TNF-a mutants.// 35th International Conference on th< Biochemistry of Lipids. Sept. 6-9 1994. Programme and Abstracts. Aberdeen Scotland. p.IVPl.

6. Alessenko A.V., Martinova E.A., Soloviev A.S., Khrenov A.V. Korobko V.G. Identification of Sphingomyelin Cycle Products in Liver ant Spleen after Action of TNF-a and its Mutant Form.// 6th North Americai ISSX Meeting. - Oct. 23-27 1994. Abstracts. Raleigh, NC, USA.

7. Alessenko A., Korobko V., Khrenov A., Rozhnova U., Solov'ev A Correlation between toxic activity of recombinant HuTNF-a and activatioi of sphingomyelinase in mice brain.//4th Int. ISSX Meeting. Aug. 27-31, 1995 Seattle, USA. Abstracts, p.422.

8. Soloviov A.S., Korobko V.G., Shingarova L.N., Vasilieva S.V., Makhova E. V., Alessenko A.V. Correlation of free sphingosine level in murim liver with cytotoxic activity of tumor necrosis factor-a mutants.//European Cytokine Research. (6th International TNF Congress. Abstracts.) 1996. v.7, n.2. p.219.