Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая инактивация ФНО/ЛТ локуса мыши с использованием CRE/OXP системы направленного мутагенеза. Фенотипический анализ мышей, мутантных по гену лимфотоксина-бета

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая инактивация ФНО/ЛТ локуса мыши с использованием CRE/OXP системы направленного мутагенеза. Фенотипический анализ мышей, мутантных по гену лимфотоксина-бета"

На правах рукописи

АЛИМЖАНОВ Марат Бекенович

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ ФНО/ЛТ ЛОКУСА МЫШИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИЕ/тХР СИСТЕМЫ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА. ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЫШЕЙ, МУТАНТНЫХ ПО ГЕНУ ЛИМФОТОКСИНА -БЕТА.

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в группе "Молекулярная биология цитокинов" Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук (г.Москва, Россия), в лаборатории профессора К. Раевского Института генетики Кельнского Университета (Германия) и в группе доктора К. Пфеффера Института медицинской микробиологии, иммунологии и гигиены Технического Университета г. Мюнхена (Германия).

Научные руководители:

доктор биологических наук С. А. Недоспасов

доктор медицинских наук К. Пфеффер

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. С. Прасолов

доктор биологических наук Н. И. Дризе

Ведущая организация:

Центр "Биоинженерия" Российской академии наук.

Защита диссертации состоится ■ 1997 г. в 4.Р часов на

заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117 984, Москва, В-334, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан /Л 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Растворимые цитокины фактор некроза опухолей (ФНО) и лимфотоксин-альфа (ЛТ-альфа, также называемый ФНО-бета) были первоначально охарактеризованы и очищены на основании их способности убивать некоторые линии опухолевых клеток in vitro и вызывать гемморагический некроз опухолей in vivo (обзоры Beutler). После того, как были открыты мембранные рецепторы ФНО, белки массой 55 кД и 75 кД, было показано что они являются также рецепторами для ЛТ-альфа, что позволило объяснить перекрывание спектров активностей ФНО и ЛТ-альфа.

ФНО представляет собой мембранно-связанный гомотример белков с молекулярной массой мономера 26 кД, который может быть отщеплен от клеточной мембраны специфической протеазой, делающей его таким образом секретируемым (с мол. массой мономера 17 кД). В отличие от ФНО, ЛТ-альфа (мол. масса 20 кД) не имеет трансмембранного домена и в гомотримерной форме только секретируется. Тем не менее, ЛТ-альфа может быть локализован на плазматической мембране клетки в ассоциации с гомологичным белком, названным лимфотоксином-бета (ЛТ-бета), который содержит трансмембранный домен (Browning et al, 1993). Продукция ЛТ-альфа и ЛТ-бета специфична для лимфоцитов и естественных киллеров (NK-клетки), тогда как продукция ФНО отмечена для широкого спектра клеток.

К моменту постановки диссертационной задачи в 1993 году было не ясно, насколько описанные ранее биологические активности ФНО и ЛТ-альфа соответствуют их физиологической роли в организме (Ruddle, 1992). Опубликованные к тому времени первичные данные о фенотипе мышей с инактивировашшм 55 кД ФНО рецептором выявили центральную роль этого рецептора в возникновении септического шока и в защите организма от бактериальных инфекций, но не позволили определить индивидуальный вклад каждого из лигандов (т. е. ФНО и ЛТ-альфа) в этих процессах.

Сегодня уже известны фенотипические характеристики мышей с мутациями в генах ФНО, ЛТ-альфа, ФНО/ЛТ-альфа, ФНО рецептора 55 кД, а также ФНО рецептора 75 кД (Таблица 1). Наиболее неожиданным оказался фенотип мышей, мутантных по гену ЛТ-альфа: отсутствие лимфатических узлов, пейеровых бляшек и нарушение структуры селезенки; такого фенотипа не было замечено у мышей с мутациями в обоих рецепторах ФНО. В то же время было показано, что ЛТ-альфа и ЛТ-

бета могут образовывать два разных мембранных гетеротримера: JIT-альфа2бета1, узнаваемый преимущественно рецепторами ФНО, и JTT-альфа1бета2, для последнего был найден особый рецептор, названный JIT-бета рецептор (Crowe et al, 1994). Эти открытия позволили предположить, что причиной дефектов развития и функциональной организации лимфоидных органов у мутантных по гену JIT-альфа мышей является отсутствие мембранного комплекса ЛТ-альфа/ЛТ-бета.

Таблица 1. Описанные в литературе фенотипические проявления мутаций в генах ФНО/ЛТлокуса и ФНО рецепторов.

Фенотип Мутация Ссылка

(ген)

Отсутствие лимфатических узлов ЛТ-альфа De Togni et al, 1994

Banks et al, 1995

Отсутствие маргинальной зоны в ЛТ-альфа De Togni et al, 1994

селезенке Banks etal, 1995

Скопления лимфоцитов в легких и ЛТ-альфа Banks etal, 1995

печени

Отсутствие пейеровых бляшек ЛТ-альфа, De Togni et al, 1994

рецептор ФНО Banks etal, 1995

55 кД Neumann et al, 1996

Отсутствие В-клеточных ЛТ-альфа, De Togni et al, 1994

фолликулов, фолликулярных ФНО, Pasparakis et al, 1996

дендритных клеток и рецептор ФНО Matsumoto et al, 1996

герминативных центров во 55 кД

вторичных лимфоидных органах

Устойчивость к ЛПС шоку ФНО, рецептор Pfeffer et al, 1993

(в присутствии ФНО 55 кД Rothe et al, 1993

Д-галактозамина) Pasparakis et al, 1996

Пониженная чувствительность рецептор ФНО Erickson et al, 1994

к ФНО 75 кД

Восприимчивость к инфекциям ФНО, рецептор Pfeffer et al, 1993

внутриклеточными бактериями ФНО 55 кД Rothe et al, 1993

Pasparakis et al, 1996

Цель и задачи работы.

Целью данного исследования явилось изучение физиологической роли JlT-бета мыши. Были поставлены следующие задачи:

1. Проклонировать геномную копию мышиного ЛТ-бета; подтвердить сцепленность гена с ФНО/ЛТ локусом, проверить, является ли этот ген уникальным в мышином геноме.

2. Сконструировать вектор для делеционного мутагенеза генов ФНО/ЛТ локуса в эмбриональных стволовых (ЭС) клетках мыши.

3. Проверить применимость Cre-loxP системы сайт-специфической рекомбинации бактериофага Р1 для инактивации тесно сцепленных генов, поодиночке и в комбинациях. Получить клоны мышиных ЭС клеток с делециями в генах:

а) ЛТ-бета;

б) ЛТ-бета и ФНО;

в) ЛТ-бета, ФНО и ЛТ-альфа.

4. Получить линии мышей с указанными выше мутациями.

5. Сравнительным фенотипическим анализом линий мышей с

мутациями в генах ЛТ-бета и ЛТ-альфа исследовать роль мембранно-связанного ЛТ в развитии и функционировании имунной системы мыши.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Впервые проклонирована и охарактеризована хромосомная копия гена ЛТ-бета мыши, показана ее уникальность в мышином геноме. Используя модифицированный метод гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках (Cre-loxP система), впервые получены линии мышей с мутациями в генах ЛТ-бета, ЛТ-бета/ФНО, ЛТ-бета/ФНО/ЛТ-альфа, и ЛТ-бега/ЛТ-альфа. Эти животные являются уникальными модельными системами, позволяющими изучать функции генов ФНО/ЛТ локуса in vivo. Сравнительным фенотипическим анализом линий мышей с мутациями в генах ЛТ-бета и ЛТ-альфа показана роль ЛТ-альфа/бета гетеротримера в образовании пейеровых бляшек и функциональной структуры селезенки. Выявлено различие в молекулярных факторах необходимых для образования разных лимфатических узлов: в то время как для развития большинства лимфатических узлов необходим ЛТ-альфа/бета гетеротример, развитие брыжеечных и шейных лимфатических узлов может проходить в отсутствии ЛТ-бета. Кроме того, в отсутствии ЛТ-альфа/бета гетеротримера нарушена одна из центральных реакций гуморального иммунного ответа - образование герминативных центров.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: 5 Международный конгресс по Фактору Некроза Опухолей и родственным цитокинам (Родос, Греция, май 1996), Международная конференция по цитокинам (Женева, Швейцария, октябрь 1996), 13 Европейский иммунологический съезд (Амстердам, Нидерланды, июнь 1997).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественных и зарубежных журналах, а также тезисы в материалах 3 международных конференций.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Библиография включает в себя Л ¿Г источника, работа проиллюстрирована 4 таблицами рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Клонирование и характеристика хромосомной копии гена, кодирующего мышиный ЛТ-бета.

Ранее были клонированы и охарактеризованы ФНО/ЛТ локусы человека (Недоспасов и др., 1985), мыши (Nedospasov et al, 1986) и кролика (Nedospasov et al, 1988), содержащие гены ФНО и ЛТ-альфа.

Позднее было показано (Browning et al, 1993), что ген ЛТ-бета человека тесно сцеплен с ФНО/ЛТ локусом, располагаясь в 2 т.п.н. от гена ФНО со стороны центромеры (Рис. 1). Исходя из предположения, что ген ЛТ-бета мыши также располагается в ФНО/ЛТ локусе, ДНК охарактеризованного ранее клона 12 в векторе EMBL3A, содержащего ФНО/ЛТ локус мыши, анализировали методом Саузерн-гибридизации, используя в качестве пробы рестрикционный фрагмент Xhol-Hindlll из гена ЛТ-бета человека. Фрагменты клона 12, специфически сгибридизовавшиеся с этой пробой, были субклонированы для последующего физического картирования и определения нуклеотидной последовательности гена ЛТ-бета мыши. Структура гена ЛТ-бета мыши и его расположение в локусе ФНО/ЛТ мыши показаны на Рис. 1. Интересной особенностью организации гена ЛТ-бета мыши является его трех-экзонная структура, в отличие от четырех-экзонной структуры гена ЛТ-бета

Л.

Хромосома Г) человека

Хромосома 17

,ТГ-6ета ФНО JI Г-альфа

Hit—ПНК-ШЬ—

ЛТ-бега ФНО ЛТ-альфа

-HI—гЗННЖ

1 тли

ЛТ-бета

1—Н-НЗ-

Рисунок 1.Л. Структура ФНО/ЛТлокусов человека и мыши. Прямоугольниками наказаны экзоиы генов, закрашенными прямоугольниками - кодирующие последовательности. Стрелками указаны папреления транскрипции генов.

Б. Частичная рестрикционная карта ЕсоШ фрагмента, содержащего мышиный ген ЛТ-бета. Сокращения; ЕсоШ (Е), ХЬа! (X), ВатШ (В), йрН1 (Б), (Р), Нра1 (Н), Ше1 (Ы).

человека. Причиной тому служит отсутствие донорного сигнала сплайсинга в предсказанном на основании гомологии с человеческим геном втором интроне мышиного гена. Как следствие, эта последовательность ДНК оказалась включенной в состав зрелой мРНК, кодирующей мышиный белок, в котором появляются дополнительные 66 аминокислот (по сравнению с человеческим ЛТ-бета).

2. Конструирование вектора для делеционного мутагенеза генов ФНО/ЛТ локуса мыши.

Для делеционного мутагенеза генов ФНО/ЛТ локуса мыши была использована усовершенствованная технология внесения мутаций в геном эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Отличие от стандартного протокола заключается в использовании Сге-1охР системы сайт-специфической рекомбинации бактериофага Р1 (ви е1 а1, 1993; Рис. 2) и основывается на том, что любой фрагмент геномной ДНК, фланкированный 1охР сайтами в одинаковой ориентации (последовательность ДНК из 34 н.п., Рис. 2), может быть вырезан из генома ЭС клеток рекомбиназой Сге. Помимо интересующего фрагмента гена можно также удалить селекционный маркер (обычно ген неомицин

1охР

10хр . А ТА А СТТССтТА ТАЛ ТОТ А ТОСТА ТАССтАЛ вТТА Т

■ ^песг;| ВВВН к |

■ 1

1охР

Рисунок 2. Схематическая иллюстрация использования СгеДохР системы для делеционного мутагенеза. 1) - вектор, в котором выбранная последовательность и ген пео окружены 1охР сайтами вводит эти мутации в геном клетки с помощью гомологичной рекомбинации. 2) -последующая экспрессия рекомбиназы Сге приводит к делеции из хромосомы фрагмента ДНК, окруженного 1охР сайтами. Показана нуклеотидная последовательность 1охР сайта.

фосфотрансферазы), что является важным преимуществом при мутагенезе мультигенных локусов, где присутствие активно работающего чужеродного промотора может оказывать влияние на регуляцию соседтгах генов (Pham et al, 1996).

Мутагенизирующий вектор для введения четырех loxP сайтов и селекционного маркера (пео-т) в ФНО/ЛТ локус показан на Рис. 3. Следует отметить, что до настоящей работы столь сложных мутагенизирующих конструкций с множественными loxP сайтами не применялось. В качестве исходного материала для конструирования мутагенизирующего вектора были использованы имевшиеся в лаборатории плазмидные субклоны фрагментов локуса по Bamlll-HindlH (9 т.п.н.) и по HindHI-Sall (6 т.п.н.) со вставленной 1охР-пео-1охР кассетой в Kpnl сайте ЛТ-альфа гена. В процессе конструирования вектора из имевшегося Hindlll-Sall субклона со вставленной 1охР-пео-1охР кассетой в Kpnl сайте ЛТ-альфа гена был удален Xhol фрагмент, содержащий neo-loxP, оставляя, таким образом, в плазмиде один loxP сайт. Второй loxP сайт с дополнительным сайтом рестритазы Ndel был клонирован в виде олигонуклеотидного дуплекса в Hindlll сайт субклона IIindIII-SaWloxP. В Ndel сайт субклопа BamHI-Hindlll был клонирован третий loxP с дополнительным сайтом рестритазы Kpnl. Селекционный маркер (пео-т), фланкированный одним loxP сайтом, был клонирован в Mlul сайт субклона BamHI-HindIII//o.vP. Получившаяся плазмида была использована для отработки условий полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая впоследствии была использована для отбора клонов ЭС клеток, в которых произошла гомологичная рекомбинация. Для сборки мутагенизирующего вектора (pTV2) из нее был делетирован 5' концевой фрагмент ВатШ-AvrII (2.5 т.п.н.). Из полученной плазмиды вставка Notl-HindTII (10 т.п.н.) была перенесена в плазмиду Hmdffl-SaH/d/axP по сайтам NotI и Hindlll. Направления loxP сайтов, а также стыки клонирования были проверены секвенированием. Наконец, в Sail сайт вектора pTV2 была вставлена кассета с тимидинкиназным геном из вируса герпеса в виде фрагмента Sall-Xhol длиной 1,5 т.п.н., что позволило применять негативную селекцию на ЭС клоны со случайной интеграцией вектора.

3. Делецнонпый мутагенез генов ФНО/ЛТ локуса в эмбриональных стволовых клетках мыши.

После расщепления плазмиды по рестрикционному сайту NotI мутагенизирующий вектор в линейной форме был введен в ЭС клетки

(линия Е14.1) методом элсктропорации. Для обогащения клонами ЭС клеток с правильно происшедшей гомологичной рекомбинацией в

К N £ Б Б Н N ЕВ X Е

I неявна Ш н?ф|

4h--П--

Ш

JIT-бега

N Е Е В Н

ш-^п и ' тш у i

ФИО

ЛТ-альфа

KN £ Е Е Н N

ттфшш } шт\i|I ta ьф в

j

Рисунок 3. Мутагенизирующий вектор, структура ФНО/ЛТ локуса мыши, и ожидаемая структура мутантного локуса с интеграцией всех loxP сайтов (обозначены черными треугольниками). Объяснения в тексте.

Сокращения: BamHI (В), EcoRI (Е), Hindlll (Н), Kpnl (К), Ndel (N), ген неомицин фосфотрансферазы (neo), ген тимидинкиназы вируса герпеса (ТК), pBlueScript плазмидный вектор (pBSKS+), тысяча пар нуклеотидов (тпн).

4.5 тпн

7.6 тап

к

Е

2.4 тпн

в

Е

ФНО/ЛТ локусе, клетки растили в среде с добавлением 0418 (позитивная селекция) и ганцикловира (негативная селекция) начиная со второго дня после транфекции. На восьмой-девятый день селекции 400 ЭС клонов были отобраны и проверены на гомологичную рекомбинацию с помощью ПЦР. Для этого клоны сначала объединяли в группы по 3, и затем клоны из позитивных групп проверяли индивидуально. 50 клонов дали ПЦР продукт ожидаемого размера, эти клоны были отобраны для дальнейшей характеризации ФНО/ЛТ локуса методом Саузерн-гибридизации геномной ДНК. В случае гомологичной рекомбинации пео-1охР кассета привносила в ФНО/ЛТ локус дополнительный сайт рестриктазы ЕсоМ, который выявлялся гибридизацией с 5' фланкирующей пробой БрЫ-РБЙ (проба А, Рис. 3). В 43 клонах из 50 был обнаружен ожидаемый 4,6 т.п.н. ЕсоШ фрагмент, отличающийся от 7,6 т.п.н. фрагмента из ФНО/ЛТ локуса дикого типа. Коинтеграция второго 1охР приводила к появлению дополнительного сайта Крп1, в результате чего 14 т.п.н. Крп1 фрагмент, детектируемый гибридизацией с пробой ХЬа1-ХЬа1 из гена ЛТ-альфа (проба В, Рис. 3), уменьшался до 5,6 т.п.н. (Рис. 3). Аналогичным образом, коинтеграция третьего 1охР идентифицировалась по присутствию дополнительного сайта

Ndel (расщеплением геномной ДНК рестриктазами Ndel и ВатШ и гибридизацией с пробой EcoRI-Hindlll из гена ФНО, проба С, 4,5 т.п.н. -аллель дикого типа, 2,4 т.п.н. - мутантный алеллъ, Рис. 3), а коинтеграция четвертого loxP сайта - по наличию дополнительного сайта EcoRI в JIT-альфа гене (расщеплением геномной ДИК рестриктазой EcoRI и гибридизацией с пробой В, 3,6 т.п.н. - аллель дикого типа и и 1,5 т.п.н. -мутантный аллель, Рис. 3). Результаты этого анализа приведены в Таблице 2. Оказалось, что только в единственном клоне, из 43 проанализированных, все четыре loxP сайта интегрировали в ФНО/ЛТ локус, тогда как в 14 клонах произошла коинтеграция первого, второго и третьего loxP сайтов, а еще в 15 клонах - кошггеграция только первого и второго loxP сайтов. Эти группы клонов были позднее использованы для получения делеций в ФНО/ЛТ локусе мыши.

На следующем этапе, для получения искомых делеций в ФНО/ЛТ локусе in vitro , описанный выше единственный ЭС клон №129 с коинтеграцией всех четырех loxP сайтов был трансфецирован плазмидой, экспрессируюшей Сге рекомбиназу (рМС-Сге). Через 2 дня после трансфекции ЭС клетки были рассеяны в сильном разведении, чтобы получить клоны из индивидуальных ЭС клеток. Спустя еще 10 дней клоны были собраны и индивидуально проверены на чувствительность к антибиотику G418, что явилось селекцией на клоны с делениями,

проба

12.3 inn

ЛТ-бета

Сге

1

ФНО 8.1 тпн

ЛТ-альфа

G«S(s),)4

И Н} ч

5.7 тпп

4.6 тип в

юш

7 тпн

тгт

ъМ

Рисунок 4. Получение набора делеций в ФНО/ЛТ локусе ЭС клеток мыши. Показаны размеры характеристических фрагментов ВатШ (е тысячах пар нукпеотидов (тпн)) по которым идентифицировали делеции разных типов. Объяснения в тексте.

)лиц<

усе,

кло

17

20

22

40

41

43

52

53

55

60

62

65

69

72

75

78

79

84

87

90

92

96

98

102

109

112

113

117

119

121

124

129

131

135

137

144

145

150

152

155

157

158

162

¡сегс

Результаты анализа ЭС клонов с гомологичной рекомбинацией в ФНО/ЛТ оинтеграцию 1охР сайтов (ид - нет данных).

5'фланк 2ой1охР Зий1охР 4ый1охР пеоген

проба

+ - нд - +

+ + - - +

+ + - - +

+ + + нд - + +

+ - нд - +

+ - нд - +

+ + + - +

+ + - - +

+ - нд - +

+ + + - +

+ + + - +

+ + + - +

+ + + - +

+ + + +

+ + + +

+ + - - +

+ -- - - +

+ - нд - +

+ + - - +

+ - +

+ + - +

+ + - +

+ + - ■ +

+ + - - +

+ + - - +

+ + + - +

+ + + - +

+ + - - +

+ + + - +

+ - - - +

+ + + +

+ + - - +

+ + + - +

+ + - - +

+ - нд - +

+ + - - +

+ + + - +

+ - НД - +

+ + + - +

+ + + +

+ - нд - +

+ + - - +

43 31 15 1

захватывающими пео кассету. Из 14 проанализированных клонов в 7 клонах рекомбинация произошла между первым и четвертым 1охР (полная делеция ФНО/ЛТ локуса), в 5 клонах - между первым и третьим 1охР (делеция в ЛТ-бета и ФНО генах), а в 2 клонах - между первым и вторым 1охР (делеция в гене ЛТ-бета, Рис. 4). Интересно, что клонов с двойной делецией - между первым и вторым 1охР плюс между третьим и четвертым 1охР не было найдено; это, впрочем, может объясняться малым количеством проанализированных образцов.

Таким образом, на этом этапе была показана применимость Сге-1охР системы для инактивации тесно сцепленных генов, а также возможность получения набора делеционных мутаций используя один мутагенизирующий вектор.

4. Получение линий мышей с делениями в генах: ЛТ-бета;

ЛТ-бета+ФНО; ЛТ-бета+ФНО+ЛТ-альфа.

Полученные клоны ЭС клеток с делениями в генах ФНО/ЛТ локуса инъецировали в полость бластоцисты (ранняя стадия развития эмбриона) мышей линии С57/Б1аскб, либо агрегировали с морулами мышей линии СВ1. Такие химерные эмбрионы затем имплантировали псевдобеременным самкам, выполнявшим роль приемных матерей. Рождавшихся в результате этих манипуляций химерных мышей скрещивали с мышами донорного типа (С57/В1аск6 или СБ1); наследование генома ЭС клеток отслеживали по окраске меха у потомства. Это было возможным, поскольку использовавшаяся линия ЭС клеток берет свое начало от линии мышей 129Бу, имеющих доминантный аллель гена агути (буро-коричневый окраска меха), в то время как линии мышей С57/В1аскб и СО I, использовавшиеся как доноры бластоцистов и морул, имеют рецессивный аллель этого гена (черная окраска меха у С57/В1аск6 и белая окраска у С01). Унаследование мутации в ФНО/ЛТ локусе проверяли методом Саузерн-гибридизации геномной ДНК, выделенной из хвостов животных. Гетерозиготных мышей скрещивали, чтобы получить мышей, гомозиготных по желаемой мутации. Таким способом были получены мыши с делецией в генах ЛТ-бетаУФНО/ЛТ-альфа и мыши с делецией в гене ЛТ-бета. Однако, как было выяснено уже после получения мутантных животных, последовательность 1охР сайта, вставленная на стыке 3-го интрона и 4-го экзона гена ЛТ-альфа, нарушала нормальный сплайсинг мРНК этого гена. Поэтому, чтобы получить мышей с делецией в гене ЛТ-бета, но без дополнительных 1охР сайтов в генах ФНО и ЛТ-альфа, были

щоба М 10.5 тпн N

В К вв

ФНО локус

Мут. вектор в

§ М?

рм Уг -и » I ч

лтс

ФНС

м м

ЛТа

пео 1ахР

^ШШШПЖ

в КМ ввн к

1охР

М М М 12 тпн КИ

1охР

1ахР В К ВВ

№У-ТК

Мут. аллель (М)

в 8 тпн

С

Мут. аллель (Л)

лт£д

ж

в к вв

'шЫ И

1 тпн

ФНО

ЛТа

Б |-Р0 х Сге-Т

ЭС ^ ¥г

+/+ +/М +/м +/Д +/Д +/+ +/Д д/д

в

ЛТР

188

4 * **

Тимус КонА сплен-ты

_/_ +/_ +/+ -/- +/- +/+

§§§

КопА спленоциты

-/- +/- +/+ -/- +/- +/+

ЛТа

ФНО

Рисунок 5. Получение линии мышей с делециеЯ е гене ЛТ-бета.

A. ФНО локус мыши дикого типа, мутантный локус с коинтеграцией двух 1охР сайтов, мутантный локус после Сге-!охР делеции.

Б. Анализ геномной ДНК методом Саузерн-блот гибридизации.

B. Анализ экспрессии генов ФНО локуса в клетках, полученных от ЛТ-бета +/+, +/- и -/- мышей методом Норзерн-блот гибридизации. В качестве контроля нанесения показана рибосомная 28 £ РНК

взяты ЭС клоны с интеграцией только двух 1охР, окаймляющих третий экзон ЛТ-бета гена (№ 55 и 96, см. Таблицу 2). Из этих клонов были получены мыши, которых скрещивали с трансгенными мытами "deleter", экспрессирующими Сге рекомбиназу начиная с ранних стадий эмбриогенеза (Рис. 5). Таким способом удалось получить делешпо в гене JIT-бета in vivo (Рис. 5). Аналогичным путем, из клонов с интеграцией трех 1охР сайтов была получена линия мышей с делецией в генах ЛТ-бета и ФИО.

Чтобы подтвердить инактивацию ЛТ-бета гена у полученных мышей с делецией в гене ЛТ-бета (ЛТ-бета-/-), использовали метод Нозерн-гибридизации тотальной РНК, выделенной из тимоцитов п активированных Конканавалином А спленоцитов. В клетках, полученных от ЛТ-бета-/- мышей, мРНК ЛТ-бета не была обнаружена (Рис. 5), тогда как мРНК и ФНО и ЛТ-альфа присутствовали в количествах, неотличимых от контролей (РНК из клеток от ЛТ-бета+/- или ЛТ-бета+/+ мышей). Полученные результаты дают основание предполагать, что делеция в гене ЛТ-бета не влияет на экспрессию близлежащих генов ФНО и ЛТ-альфа.

5. Сравнительный феногипический анализ мышей с мутациями в генах ЛТ-бета п ЛТ-альфа: схожесть но не идентичность.

5а. Лимфоидные ткани.

В виду отсутствия лимфатических узлов (ЛУ), пейеровых бляшек и значительных нарушений в организации селезенки у мышей с инактивированным геном ЛТ-альфа (ЛТ-альфа-/-), мы детально проанализировали наличие и строение этих органов у полученных нами ЛТ-бета-/- мышей. При анатомическом анализе, у ЛТ-бета-/- мышей не было обнаружено пейеровых бляшек и периферических ЛУ, в то время как брыжеечный ЛУ присутствовал у 12 из 16 проанализированных мышей. После скрупулезного гистологического анализа четырех ЛТ-бета-/- мышей, проведенного доктором А. Люцем (ГСФ, Мюнхен), у двух мышей были обнаружены структуры, похожие на лимфатические узлы, на месте, где у нормальных мышей расположены шейные ЛУ.

Строение брыжеечного ЛУ у ЛТ-бета-/- мышей анализировали методом иммуногистохимии на замороженных срезах. Хотя сегрегация лимфоцитов в Т- и В-клеточные области сохранилась (это было показано двойным окрашиванием антителами на Т-клеточный антиген CD3 и В-клеточный антиген В220), отдельные В-клеТйчные фолликулы были плохо

различимы и не имели кластеров фолликулярных дендритных клеток (ФДК, окрашивание антителами на антиген FDC-M1). Несмотря на это различие, процентное соотношение Т- и В- клеток в брыжеечном ЛУ ЛТ-бета-/- осталось таким же как у нормальных мышей, что было определено цитофлюорометрическим анализом. Отличительным свойством брыжеечного ЛУ от переферийных ЛУ является экспрессия адгезионной молекулы MAdCAM-1 на эндотелии посткапиллярных венул, которая может служить маркером наличия этих венул. Окрашивание срезов брыжеечного ЛУ ЛТ-бета-/- мышей антителами на MAdCAM-1 дало положительный результат, однако, эпителий посткапиллярных венул выглядел уплощенным, по сравнению с контролем.

Аналогичному иммуногистохимическому анализу была подвергнута селезенка ЛТ-бета-/- мышей, но при этом в опыты брали также селезенки ЛТ-альфа-/- мышей, что позволило проводить прямое сравнение фенотипов. Результаты этого анализа показаны в Таблице 3. Обобщая полученые данные, можно сказать, что весь спектр нарушений в структуре селезенки, описанных для ЛТ-альфа-/- мышей, был найден и в селезенке ЛТ-бета-/- мышей. Тем самым, с помощью генетического подхода была показана роль ЛТ-альфа/бета комплекса (мембранно-связанного ЛТ) в формировании структуры селезенки, пейеровых бляшек, и ЛУ (за исключением брыжеечных и, возможно, шейных).

Ранее, в экспериментах по анализу экспрессии ЛТ-бета и ЛТ-альфа в тканях мышиных эмбрионов и взрослых животных методом in situ гибридизации, транскрипция этих генов была обнаружена в белой пульпе селезенки и в тимусе (Pokholok et al, 1995). Однако, несмотря на ярко выраженные дефекты структурной организации селезенки у мутантных по ЛТ-бета (или ЛТ-альфа) мышей, общая структура тимуса в этих мышах, а также развитие тимоцитов (на основании данных цитофлюорометрического анализа) не отличались от нормы. Не исключено, что тонкие функциональные нарушения будут выявлены при дальнейшем анализе. Также не было обнаружено дефектов в развитии В-клеток в костном мозге. Созревающие в тимусе и костном мозге лимфоциты выходят в кровяной поток и начинают свою циркуляцию по системе вторичных лимфоидных органов. Логично предположить, что оставшиеся у мутантных мышей вторичные лимфоидные органы должны быть перенаселены лимфоцитами. В действительности же, количество лимфоцитов в брыжеечном ЛУ ЛТ-бета-/- мышей уменьшено примерно в 2 раза по сравнению с контролем, тогда как лимфоцитарный состав

селезенки остался без изменений в отсутствие ЛТ-бета или ЛТ-альфа, Вместо того, чтобы заселять имеющиеся вторичные лимфодные органы, лимфоциты у мутантных мышей накапливались в крови и перитонеальной полости (Таблица 3). Вдобавок, инфильтрации лимфоцитов (преимущественно В-клеток и СВ4+ Т-клеток) были обнаружены в легких и печени мутантных мышей. Причины и механизм этого явления остаются пока не выяснеными.

Таблица 3. Сравнение фенотипов мышей с мутациями в ЛТ-бета и JIT-алъфа генах. * Структуры, подобные брыжеечным ЛУ, были описаны у ЛТ-шъфа-/- Mbiiuefi (Banks et al., 1995).

Фенотип ЛТ-альфа-/- ЛТ-бета-/-

_мыши_мыши

Брыжеечный, шейный ЛУ -* +

Плечевой, поясничный, паховый,

подколенный и др. ЛУ Пейеровы бляшки

Структура селезенки а) маргиначьная зона (МОМА-1-% MAdC AM-1 + клетки)

б) В-клеточные фолликулы

в) кластеры ФДК

Количество лимфоцитов в крови и перитонеальной полости Инфильтрации лимфоцитов в легкие

и печень

Герминативные центры в селезенке

увел, в 2-4 раза увел, в 2-4 раза увел, в 2-4 раза увел, в 2-4 раза

г/-

56. Нарушение образования герминативных центров в селезенке ЛТ-бета-/- мышей.

Клеточное окружение во вторичных лимфоидных органах благоприятствует созреванию быстрого и эффективного специфического

иммунного ответа. В частности, именно здесь образуются герминативные центры, - клеточные конгломераты, в которых происходит клональная экспансия специфичных к чужеродному антигену В-клеток с последующим отбором клонов с повышеной аффинностью к антигену, а также дифференцировка "клеток памяти". В формирование герминативных центров помимо В-клеток вовлечены антиген-специфические Т-клетки "хэлперы" и кластеры ФДК. Ранее было показано, что у JIT-альфа-/-мышей, иммунизованных эритроцитами барана, герминативные центры в селезенке не образуются (Matsumoto et al, 1996). С одной стороны, это наблюдение может быть объяснено дефектами структуры органа, но с другой стороны, нельзя исключить прямую роль ЛТ-альфа, экспрессирующегося активированными лимфоцитами, в коммуникации между клетками герминативного центра. Поскольку дефекты структуры селезенки у ЛТ-бета-/- мышей почти неотличимы от таковых у ЛТ-альфа-/-мышей, мы решили проверить будут ли образовываться герминативные центры в селезенке ЛТ-бета мышей, где лимфоциты по прежнему могут продуцировать ЛТ-альфа. Мышей иммунизировали эритроцитами барана и через 10 дней анализировали формирование герминативных центров в селезенке методом иммунофлюоресцентного окрашивания замороженных срезов. В-клетки герминативного центра идентифицировали окрашиванием PNA (peanut agglutinin). В селезенке ЛТ-альфа-/- мышей, взятых для сравнения, герминативных центров обнаружено не было, хотя редкие PNA-позитивные клетки были найдены вокруг центральных артериолей. В отличие от этого, на срезах селезенки ЛТ-бета-/- мышей были найдены небольшие скопления В-клеток, окрашивающихся PNA, хотя их количество (2-3 на срез селезенки) явно уступало количеству герминативных центров в селезенке нормальной мыши (40-60 на срез). Окрашивание серийных срезов селезенок мутантных мышей антителами на FDC-M1 (наиболее распространенный маркер ФДК) дало негативный результат, однако, используя антитела на FDC-M2 (другой маркер ФДК) было получено слабое окрашивание ретикулярного типа, что может свидетельствовать в пользу присутствия отдельных ФДК или их предшественников.

Таким образом, хотя после иммунизации эритроцитами барана в селезенке ЛТ-бета-/- мышей были обнаружены редкие скопления В-клеток, похожие на герминативные центры, для формирования полноценного герминативного центра необходима целостная организация селезенки, зависящая от присутствия ЛТ-альфа/бета гетеротримера.

выводы.

1. Впервые проклонирована и охарактеризована хромосомная копия гена ЛТ-бета мыши, показана ее сцепленность с ФНО/ЛТ локусом и уникальность в мышином геноме.

2. На примере генов ФНО/ЛТ локуса мыши показана применимость Cre-IoxP системы для инактивации тесно сцепленных генов, а также возможность получения набора делеционных мутаций в геноме используя один мутагенизирующпй вектор.

3. Впервые получены линии мышей с мутациями в генах ЛТ-бета, ЛТ-бета/ФНО, ЛТ-бета/ФНО/ЛТ-альфа, и ЛТ-бета/ЛТ-альфа. Эти животные являются уникальными модельными системами, позволяющими изучать физиологические функции генов ФНО/ЛТ локуса ш vivo.

4. Сравнительным фенотипическим анализом линий мышей с мутациями в генах ЛТ-бета и ЛТ-альфа показана роль ЛТ-альфа/бета гетеротримера в образовании пейеровых бляшек, лимфатических узлов и упорядоченной структуры селезенки.

5. Выявлено отличие в молекулярных факторах, необходимых для образования разных лимфатических узлов: для развития большинства лимфатических узлов необходим ЛТ-альфа/бета гетеротример, развитие брыжеечных и шейных лимфатических узлов может проходить в отсутствии ЛТ-бета.

6. Показана роль ЛТ-альфа/бета гетеротримера в развитии и/или поддержании кластеров фолликулярных дендритных клеток и формировании полноценных герминативных центров.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Купраш Д.В., Алимжанов М.Б., Похолок Д.К., Козлов С.В., Новобранцева Т. И., Турецкая Р.Л. и С.А. Недоспасов. 1994. Характеристика локуса хромосомы 17 мыши, содержащего три гена семейства фактора некроза опухолей, включая ген трансмембранной субъединицы лимфотоксина (ЛТ-бета). ДАН СССР, т. 337, 658-661.

2. Pokholok, D.K., Maroulakou, I.G., Kuprash, D.V., Alimzhanov, M.B., Kozlov, S.V., Novobrantseva, T.I., Turetskaya, R.L., Green, J.E., and S.A. Nedospasov. 1995. Cloning and expression analysis of the murine lymphotoxin-b gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:674.

3. Alimzhanov, M.B., Kuprash, D.V., Tarakhovsky, A., Rajewsky, K., Nedospasov, S.A., and K. Pfeffer. Initial characterization of LTa/LTb double deficient mice. In: The 6th International TNF congress (Rhodos, Greece, May 812, 1996). European Cytokine Network. April-June 1996. Vol. 7. Number 2: 228.

4. Alimzhanov, M.B., Kuprash, D.V., Kosco-Vilbois, M.H., Luz, A., Turetskaya, R.L., Tarakhovsky, A., Rajewsky, K., Nedospasov, S.A., and K. Pfeffer. 1997. Abnormal development of secondary lymphoid tissues in lymphotoxinb-deficient mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(m-press). £*f : SZt?Z"3i

5. Alimzhanov, M.B., Kosco-Vilbois, M.H., Kuprash, D.V., Turetskaya, R.L., Tarakhovsky, A., Rajewsky, K., Nedospasov, S.A., and K. Pfeffer. Lymphotoxinb-deficient mice: requirement of the LTa/b heterotrimers for the development of peripheral lymphoid organs, except the mesenteric lymph node. In: Abstracts of the 13th European Immunology meeting. Immunology letters 1997, Vol. 56, N 1-3, Page 16.