Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функции нерецепторной тирозиновой протеинкиназы ChK в гемопоэзе методом направленного мутагенеза с помощью гомологической рекомбинации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функции нерецепторной тирозиновой протеинкиназы ChK в гемопоэзе методом направленного мутагенеза с помощью гомологической рекомбинации"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. ВА. Энгельгардта

На правах рукописи

САМОХВАЛОВ Игорь Михайлович

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИИ НЕРЕЦЕПТОРНОЙ ТИРОЗИНОВОЙ ПРОТЕИНКИНАЗЫ СЬк В ГЕМОПОЭЗЕ МЕТОДОМ НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА С ПОМОЩЬЮ ГОМОЛОГИЧЕСКОЙ РЕКОМБИНАЦИИ.

Специальность 03.00.03. - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1997

Работа выполнена в КНК "Молекулярные основы дифференциронк развития" Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РА лаборатории иммунологии Национального Института Аллергии и Инфекцио: Болезней, Национальные Институты Здоровья, Мэрилэнд, США; и в лаборат стволовых клеток Центра Крови Нью — Йорка, США.

Научный руководитель: кандидат биологических наук А. В. Белявский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. В. Иткес, д< биологических наук В. А. Карпов.

Ведущая организация — Всероссийский Гематологический Научный I РАМН.

Диссертационного Совета 002.79.01 при Институте молекулярной биологии ] А. Энгельгардта РАН по адресу 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулз биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится

года в

СО

час. па засе;

Автореферат разослан 1997

г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ •

Актуальность темы. В настоящее время важнейшей задачей в исследовании кроветворения является выяснение молекулярных механизмов контроля гематопоэза. Поддержание и координация пролиферации и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток обеспечивается широким спектром межклеточных взаимодействий, в которых значительную роль играют как мембрано — связанные, так и свободные колоние — стимулирующие факторы и цитокины. В этой связи представляет большой интерес изучение рецепторов этих факторов, а также связанных с ними молекулярных систем модуляции сигналов межклеточных взаимодействий, и переноса их на системы ответной реакции клетки. Важнейшей составляющей частью молекулярного механизма восприятия внешних и внутренних сигналов (сигнальная трансдукция) являются тирозиновые протеинкиназы (ТПК).

Нерецепторные ТПК (HP — ТПК) семейства Csk являются универсальными негативными регуляторами ТПК семейства Src и фосфорилируют консервативный С —концевой тирозин у всех представителей этого семейства [Okada & Nakagava, 1989; Nada et al., 1991; Okada et al., 1991; Bergman et al., 1992; Ruzzene et al., 1994]. Эксперименты с индуцированным мутагенезом (генный нокаут) в гене csk продемонстрировали важнейшую роль Csk в как в раннем эмбриональном развитии, в частности на стадии нейруляции [Imamoto & Soriano, 1993; Nada et al., 1993], так и в развитии и дифференцировке лимфоидной линии гемопоэтических клеток [Gross et al., 1995].

кДНК второго представителя Csk семейства HP—ТПК, Bhk/Chk, была недавно клонирована в нашей лаборатории из фракции очищенных гемопоэтических стволовых клеток мыши [Эршлер и др. 1994]. Эта киназа обладает значительной структурной гомологией с хорошо изученной Csk, а также имеет перекрывающуюся субстратную специфичность.

В экспериментах in vitro показано, что Chk мыши, также как и Csk, может фосфорилировать регуляторный тирозин 505 протеинкиназы Lck, принадлежащей к семейству Src киназ [Klages et al., 1994; Chow et al., 1994]. Гомолог Chk человека, MATK/HYL, обладает способностью

фосфорилировать Src киназу по регуляторному тирозину m vitro [Avraham et a]., 1995].

Экспрессия гена chk в популяциях гемопоэтических стволовых клеток и коммитированых предшественников [Эршлер и др. 1994], а также важнейшая роль в лимфопоэзе ближайшего структурного гомолога Csk, предполагает возможность существования определенной функции Chk в процессе кроветворения. Chk обладает способностью регулировать активность целого ряда молекул сигнальной трансдукции in vitro, поэтому можно предположить, что эта киназа участвует либо в контроле многих процессов межклеточных взаимодействий, либо в одном определенном процессе, но в различных клеточных линиях. В связи с этим представляет собой актуальную задачу выяснение роли Chk в гематопоэзе, а также сопоставление этой роли с функцией Csk в одних и тех же клеточных популяциях гемопоэтической системы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение функциональной роли HP—ТПК Chk в гемопоэзе с помощью метода направленного индуцированного мутагенеза, или генного нокаута. = Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи: 1) "Клонирование геномной копии chk из библиотеки ДНК мыши. 1) Создание плазмидного конструкта для индукции инактивирующей мутации с помЬщью направленной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках.

3) -Получение мышей, гомозиготных по инактивирующей мутации в гене chk. Подтверждение отсутствия активной Chk в этих мышах.

4) Изучение клеточного состава крови и иммуноцитохимический анализ клеточных популяций в гемопоэтических органах и тканях мутантных и нормальных мышей.

5) Функциональное тестирование гемопоэтических клеток с генотипом chk~ /chk'.

Научная новизна и практическое значение работы. В настоящей работе был инактивирован ген нерецепторной тирозиновой протеинкиназы Chk в мышах методом направленного мутагенеза, или генного нокаута. С помощью Нозерн — гибридизации и метода обратной транскрипции —

полимеразной цепной реакции (ОТ —ПЦР) было продемонстрировано отсутствие транскрипта, кодирующего активную Chk в мышах, гомозиготных по индуцированной мутации. Показано, что делеция региона, кодирующего каталитический домен Chk, приводит к повышению уровня экспрессии chk в мозге. Анализ мутантных мышей показал отсутствие нарушений в эмбриональном развитии, а также дефектов в составе периферической крови и клеточных популяций гемопоэтических тканей и органов. Иммуноцитохимический субпопуляционный анализ на основе экспрессии специфических поверхностных антигенов продемонстрировал, что инактивирующая мутация в гене chk не приводит к заметным количественным изменениям в компартменте ранних предшественников гемопоэтических клеток.

Ряд функциональных тестов, таких как измерение клоногенной активности в среде с метилцеллюлозой (КОЕ—К тест), КОЗБ —анализ, а также анализ клеток, инициирующих долговременную культуру in vitro (LTC —I С), не выявил резких качественных отличий в популяциях гемопоэтических предшественников с генотипом chk'/chk~, что говорит о вырожденности функции Chk в гемопоэзе. Отсутствие активного фермента может компенсироваться наиболее близким структурно — функциональным гомологом Csk, который обладает также сходным тканевым спектром экспрессии.

Однако стромальная культура лимитирующих разведений мутантных клеток костного мозга позволила выявить значительные количественные изменения в популяции миелоидных коммитированных предшественников. Одним из причин наблюдаемого эффекта индуцированной мутации может являться усиление адгезии гемопоэтических клеток к клеткам стромы и/или к синтезируемому ими внеклеточному матриксу. Исчезновение компенсации инактивации Chk при культивировании лимитирующих разведений клеток костного мозга свидетельствует о существовании гуморальных взаимодействий между различными гемопоэтическими клетками в процессе кроветворения.

Данная работа вносит вклад в изучение функциональной роли HP—ТПК Chk в гематопоэзе. Исследование молекул сигнальной трансдухции может быть использовано в поисках рациональных путей терапии при нарушениях

кроветворения различной этиологии, включая ряд форм злокачественных заболеваний.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и включает следующие главы: Введение, Литературный обзор, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список литературы (155 наименований). Диссертация содержит 18 рисунков и одну таблицу.

Апробация работы: Материалы работы были представлены на 24ой ежегодной конференции Международного Общества Экспериментальной Гематологии, (Дюссельдорф, Германия, 27 — 31 августа 1995 г.), а также на межлабораторном семинаре Центра Крови Нью-Йорка, США в январе 1997 г.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Геномная структура chk. Создание генного конструкта для транфекции ЭС клеток.

Геномная копия chk была клонирована из библиотеки ДНК мыши линии 129SvJ, сконструированной в векторе XFIXII (Stratagene, San Diego, СА). После скрининга 1x10° рекомбинантных бляшек два независимых перекрывающихся клона, Х3.1 и Х4.1, были очищены, их ДНК была выделена и использована для определения геномной структуры гена. На рисунке 1 схематически изображена экзон—интронная структура и рестриктная карта этих двух клонов, включающих все кодирующие последовательности гена.

Геномная структура chk имеет значительное сходство со структурой гена csk. Положение экзон — интронных границ практически совпадает (судя по последовательности аминокислот) на протяжении регионов, кодирующих SH2, SH3 и каталитический домены [Ershler et al., 1995; Brauninger et al., 19931-

чн

В N X ГО Ж В N134 X ВЕ

I 1 I II II 1 I II I I 1

Н

/

/

1 т.п.н.

MNЗ

Р2 1к-1

1к-2

я II ид а I ини ши1

ТЯ И IIИI I ЛТП гШй

*> / -X АА 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

3 /;А

/'

/7

I I

ЭНЗ БН2

каталитическии домен

/ I

Рисунок 1. Рестриктная карта и экзон — интронная структура гена сЪк. Рестриктазы обозначены следующим образом: В = ВатН I, Е = ЕсоК I, Н = Нтс1 III, N = N01 I, Я=ЕсоЯ V, Х = ХЬа I. Первые четыре экзона участвуют в альтернативном сплайсинге, в результате которого образуются три различных транскрипта. Регионы, кодирующие консервативные домены, обозначены квадратными скобками. Расположение праймеров показано маленькими стрелками с соответствующими обозначениями.

Сборка генного конструкта осуществлялась в несколько этапов, в ходе которых регион, кодирующий каталитический домен, был фланкирован на 5' конце генной кассетой ¡oxP—neo"—¡oxP, а на 3' конце — последовательностью loxP сайта (Рис.2А). В конечном итоге был получен плазмидный конструкт, имеющий уникальный сайт рестрикции Sal I на границе векторной ДНК и ДНК вставки, что позволяет линеаризовать плазмиду для эффективной рекомбинации с ДНК хромосом ЭС клеток. Общая длина вставки составила 10,8 т.п.н., размер области геномной гомологии — 9,5 т.п.н. Длина короткого плеча гомологии равна 3.0 т.п.н.

2. Получение линий ЭС клеток, в которых произошла гомологическая рекомбинация в локусе chk.

На первом этапе направленного мутагенеза гена chk была осуществлена трансфекция 1х107 ЭС клеток генным конструктом, -в состав которого в качестве селективного маркера входила экспрессионная кассета neo'. Скрининг - 220 клонов, устойчивых к неомицину, осуществляли гибридизацией с "внешним" зондом (т.е. его последовательность расположена за. пределами последовательности конструкта), в качестве которого использовался EcoR I—Hind III фрагмент длиной около 170 п.н. (Рис.2А). В итоге были обнаружены 6 клонов ЭС клеток, в которых произошла сайт—специфическая гомологическая рекомбинация по одному из аллелей гена chk. Частота гомологической рекомбинации составила 1 гомологический рекомбинант на 37 клонов.

3. LoxP—зависимые делеции индуцированные рекомбиназой Сге.

На втором этапе мутагенеза, в отобранных клонах ЭС клеток были

индуцированы два типа 1охР—зависимых делеций [Gu et al., 1994) с

помощью индукции временной экспрессии Сге — рекомбиназы. (Рис 2А, В).

Первый тип представляет собой делецию всей последовательности между двумя крайними 1охР сайтами, второй тип — делецию только кассеты neo", что приводит к появлению структуры типа floxed (регион, кодирующий каталитический домен Chk фланкирован двумя сайтами loxP). Делеции были индуцированы в четырех из шести клонов ЭС клеток, в которых произошла гомологическая рекомбинация. Относительная частота делеций варьировала

от 8% до 16%, причем наблюдалась обратная корреляция между общей частотой делеций и частотой делеций по типу floxed.

4. Получение мышей, мутантных по гену chk.

Пять клонов, несущих оба типа делеций, были инъецированы в бластоцисты линии C57BL/6 мышей на стадии 3,5 дней после оплодотворения. Химерные животные были получены после инъекций трех вторичных клонов ЭС клеток, 25 — 41, 25 — 56 и 115—1, два из которых, 25 — 41 и 25 — 56, произошли от одного и того же первичного клона 25 и имели структуру floxed в локусе chk, а в клетках клона 115—1 произошла делеция района, кодирующего каталитический домен.

Среди химерных животных (21 в общей сложности), 10 имели степень химеризма выше 50%. У четырех из них шерсть была полностью лишена черной окраски, а два самца, наряду с тем, что окраска шерсти у них была почти полностью типа шиншилла, имели также красную окраску глаз. Последнее свидетельствует об исключительно высоком вкладе потомства шгьецированных ЭС клеток в построение тканей животного.

С целью обеспечения трансмиссии индуцированной мутации в зародышевую линию, самцов, имеющих степень химеризма выше 50%, скрещивали с самками линии C57BL/6. Клетки двух клонов ЭС клеток с разными типами делеций, 25 — 41 и 115 — 1, успешно колонизовали зародышевую линию. В дальнейшей работе использовали линию мышей с делецией района, кодирующего ТК—домен. Интербридинг полученного потомства показал, что соотношение частот генотипов соответствовало Менделевской формуле распределения генотипов во втором поколении при моногибридном скрещивании (скрещивании двух гетерозигот) 1:2:1. Обратное скрещивание гетерозигот и гомозигот с мышами линии C57BL/6 также не выявило отклонений в распределении генотипов.

5. Анализ экспрессии chk в мышах с генотипами chk / сЛк~/+ и chk+/t

Для подтверждения того, что индуцированная нами мутация приводит к экспрессии транскрипта, неспособного обеспечивать синтез активного фермента, была предпринята блот—гибридизация образцов поли (А)+РНК мозга мышей, гомозиготных по индуцированной делеции в локусе chk.

в

8 т.п.н '

7.0Т.П.Н,-

5.6 т.п.u. '

EXE

_I-1

EXE i i_i

EXE _i_i_i

EXE _i—i-1

исходным аллель

модифицированный аллель

деления I типа

делеция II типа

.0 т.п.н.

fMiiii-

_ 8.0 _ 7.0

В

1 2 3 4 т.п.н.

1 л":..... УЩ/Г-УЯКЙгТ^ФТ*

-8.0

1 * !-5"6

^ iJtA »

_2.3

f \ Й| 1 A '«¡"n. ЙЙ"1'0

Рисунок 2. Направленная инактивация гена chk. (А) Схема гомологической рекомбинации и Сге — 1охР—зависимых делеций в ЭС клетках. Показаны рестриктные карты (сверху вниз) исходного локуса chk, гомологического рекомбинанта и двух типов делеций, индуцированных Сге — рекомбиназой в модифицированном локусе chk. Сокращения названий рестрнктаз: EcoRI = Е, Xbal = X, EcoRV = R. Сайты loxP представлены в виде черных стрелок, локализация использованных в скрининге ДНК—зондов показана в виде черных прямоугольников с соответствующими обозначениями. Заштрихованный прямоугольник обозначает регион, кодирующий каталитический домен Chk. (Б) Блот — гибридизация (зонд А) мутантного клона 68 (дорожка 1) и исходного клона ЭС клеток (дорожка 2). (В) Результаты блот—гибридизации зонда В с ДНК рекомбинантных клонов ЭС клеток после индукции Сге—зависимых делеций. Дорожки: 1 — клон исходного типа; 2 — мутантный клон, в котором произошла гомологическая рекомбинация; 3-клон с делецией региона, кодирующего каталитический домен протеинкинази Chk; 4 —клон со структурой типа floxed. (Г( Генотипированис потомства, полученного от скрещивания мышей, гетерозиготных по делеции региона, кодирующего каталитический домен протеинкиназы Chk.

►

3

'исунок 3. Анализ уровня экспрессии гена сЫс в нормальных (сЛк+'+) и мутантных (сМ~'~) ■илпах. Над каждой дорожкой указаны генотипы тестированных мышей. Время экспозиции трех фсдставленных нозерн — блотов было различным. (А) Нозерн—гибридизация с ДНК —зондом, прцифичным для региона, кодирующего каталитический домен. (Б) Гибридизация того же ммого блота с пробой, включающей в себя последовательность 5' —области гена. (В) "ибридизация с р — актиновой пробой для контроля нанесения РНК на дорожки геля. (Г)' Анализ жспрессии гена сЬк с помощью метода обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции ОТ — ПЦР). Использовались праймеры 1к —1 и 1к —2, амплифицирующие только юследовательность региона кодирующего каталитический домен. (Д) Блот—гибридизация фодуктов ОТ—ПЦР с сМ—пробой. (Е) ОТ—ПЦР с праймерами, специфичными для гена р — 1ктина мыши (15 циклов амплификации).

В качестве зонда был использован фрагмент кДНК региона, кодирующего каталитический домен СЬк. Результаты нозерн — гибридизации (Рис. ЗА) показывают, что в клетках животных, гомозиготных по индуцированной делеции, полностью отсутствуют последовательности транскриптов сЛк, кодирующих каталитический домен. В гетерозиготах уровень экспрессии нативной мРНК примерно в 2 раза ниже, чем в гомозиготах сМ+/\ откуда следует, что в нормальных условиях оба аллеля с1\к экспрессируются примерно одинаково.

Результаты нозерн—гибридизации были подтверждены более чувствительным методом обратной транскрипции — цепной полимеразной реакции (ОТ —ПЦР, Рис.ЗГ и Д). Нозерн — гибридизация с зондом, соответствующим участкам кДНК, кодирующим домены БН2, БНЗ, и часть лидерного пептида, показывают, что в клетках скк'/' длина мРНК, соответствующей мутантному гену скк, несколько меньше, чем в клетках "дикого типа" (Рис. ЗБ). Более того, уровень экспрессии укороченного

транскрипта примерно в 1,5 — 2 раза выше уровня экспрессии нормального транскрипта chk. " '

Таким образом делеция 3' —концевого региона гена chk не только не нарушает нормальный процесс транскрипции и созревания мРНК, но и в определенной степени стимулирует экспрессию модифицированного гена. Делетированная последовательность по —видимому содержит контролирующие элементы, которые оказывают негативное влияние на уровень экспрессии гена.

6. Общий анализ фенотипа мышей, гомозиготных по инактивирующей мутации в гене chk.

Мыши, имеющие генотип chkразвивались нормально в условиях стерильного лабораторного содержания, и были фертильны. Не было обнаружено никаких отклонений в жизнеспособности и поведении гомозигот, а также повышенной склонности к опухолевым заболеваниям по крайней мере в течение одного года наблюдений. При скрещивании этих животных между собой получалось здоровое потомство и нормальный размер выводков. Макроскопический анализ внутренних органов, включая головной мозг, не выявил никаких отклонений от нормы. Все отделы головного мозга гомозигот развивались нормально. Результаты дифференциального клеточного анализа периферической крови представлены в Таблице 1, из которой видно, что содержание основных форменных элементов крови и гомозигот находится в пределах нормы [Payne et al., 1976].

Таблица 1. Количественный клеточный состав крови и основных opi

кроветворения нормальных мышей, и мышей, у которых был инактивирован ген

Генотип Белые клетки крови (xlOVnl) Эритроциты (xlOVtil) Тромбоциты (хМ7ц1) Селезенка х 10'cells Тимус х10' cells Костный xlO' cell

+/+ 8.3010.17* 9.80±0.15 8441206.7 12.613.1 10.8Ю.14 9.710.64

-/- 9.1510.18 10.6510.32 1057136.8 15.412.8 11.911.2 6.910.78

"-представлены средние данные и стандартные отклонения, подсчитанные при измерении образ!

от 4 — 5 животных из одного и того же выводка "-костный мозг из двух бедренных и двух берцовых костей

Сравнительный фенотипический анализ основных популяций гемопоэтических клеток был осуществлен с помощью проточной цнтофлюорометрии на клеточном сортере (FACS analysis). Во всех экспериментах использовали клеточный материал, полученный от нескольких (4 — 5) животных каждого генотипа, включая и гетерозиготы. На рисунке 4 представлены результаты типичного эксперимента по фенотипированию основных гемопоэтических популяций животных гомозиготных по индуцированной мутации.

Тимус

Селезенка

дикии тип

мутает

CD4

дикии тип

мутант

В220

Костный МОЗГ

мутант

Мас-1

«сунок 4. Сравнительный фенотипический анализ популяций зрелых гемопоэтических клеток | основных кроветворных органов нормальных (сЬк*у*) и мутантных (сМ ''} мышей.

Тимоциты анализировали на основе экспрессии маркеров CD4 и CD8. При этом наблюдалось нормальное соотношение фракций незрелых тимоцитов CD4+CD8\ зрелых Т—клеток—хэлперов CD4+CD8~, и зрелых Т—клеток—киллеров CD4- CD8+ в тимусе сЛк~/~мышей. Фенотипирование клеток костного мозга на основе экспрессии маркеров миелоидного ряда Mac—1 и Ly—6С, и клеток селезенки с помощью антител к маркеру В — клеток В220 и к маркеру Т—клеток CD3, не выявили значительных отличий между животными с генотипами сМ~/_ и chk*/+.

Таким образом, инактивация Chk не приводит к нарушениям в клеточном составе периферической крови и не сказывается на соотношении частот гемопоэтических субпопуляций в основных органах кроветворения.

7. Сравнительный анализ ранних гемопоэтических предшественников.

Известно, что chk экспрессируется на самых ранних этапах гемопоэза [Эршлер, 1996], поэтому существует возможность обнаружения нарушений в развитии ранних гемопоэтических предшественников, о которых можно судить по изменениям в соответствующих клеточных популяциях.

Использование" моноклональных антител к известным клеточным маркерам позволяет детектировать и охарактеризовать субпопуляции предшественников на различных стадиях дифференцировки. Описано раннее развитие В—лимфоцитов в виде последовательного процесса смены клеточного фенотипа (экспрессии антигенов клеточной поверхности), при этом данные цитофлюорометрии подкрепляются молекулярным анализом рекомбинации генов иммуноглобулинов, а также анализом развития сортированных популяций in vitro [Hardy et al., 1991]

Мечение мутантаых и нормальных клеток костного мозга осуществляли с помощью моноклональных антител к трем маркерам, экспрессирующимся в ходе развития В—лимфоцитов: CD43 (\ейкосиалин), В220 и HSA (heat stable antigen, или CD24). На рисунке 5 (А и Б) представлены результаты сравнительного анализа предшественников В—лимфоцитов в костном мозге мышей с генотипами chk+/+ и chk~'~. Две субфракции, CD43~B220+ (пре В — клетки, незрелые В—лимфоциты) и CD43~B220+ + (зрелые В—лимфоциты) отличаются по степени экспрессии антигена В220. Во фракции CD43+B220+ обнаруживается три субфракции (Рис. 6Б), отличающиеся по экспрессии

маркера HSA/CD24: CD43+B220+HSA~, CD43+B220+HSA+ и CD43+B220+HSA++, и соответствующие различным стадиям развития про В—клеток. Сравнительный анализ показывает, что относительная частота всех субфракций в популяциях нормальных и мутантных клеток приблизительно одинакова. Таким образом, инактивация Chk не приводит к нарушениям на ранних стадиях развития В—лимфоцитов.

Основные стадии раннего развития Т—лимфоцитов в тимусе фенотипированы по экспрессии поверхностных антигенов. При этом использовались данные по молекулярной рекомбинации генов рецепторов Т —клеток (TCR), экспрессии генов гад—1 и гад—2, а также данные, полученные в экспериментах по направленной инактивации генов TCR и гад—1 [Godfrey et al., 1994]. Во фракции ТН— тимоцитов были выделены четыре субфракции на основе экспрессии маркеров CD44 и CD25, которые отличаются по степени дифференцировки. При' этом наиболее примитивной являются CD44+CD25~ ТН—тимоциты. Сравнение четырех субфракций ТН-тимоцитов с фенотипом CD3~CD4~CD8~NK1.1~B220 показало отсутствие различий в частотах каждой субфракции между животными с генотипами chk+/+ и сМ"/_(Рис 5В). Таким образом, лимфоидная дифференцировка не затрагивается null—мутацией гена chk.

Для того, чтобы определить, вызывает ли данная мутация изменения в компартменте гемопоэтических предшественников костного мозга, мы предприняли оценку состояния субфракций Lin~c — Kit+Sca—1+ и Цп~с — Kit+Sca—1" клеток костного мозга у сЛк~/-мышей. Популяция Lin~c — Kit+Sca—1+, составляющая 0,08% всех ядерных клеток костного мозга, практически полностью состоит из ранних предшественников, включающих также и гемопоэтические стволовые клетки [Okada et al., 1992; Osawa et al., 1996J. На Рисунке 5Г показано, что относительная частота обеих популяций в костном мозге сЛк"/_ мышей не отличается от нормы. Так, например, частота популяции chk~/~Lin~c — Kit+Sca —1+ клеток во фракции Lin" костного мозга составляет 2,2±0,3% (п = 4), тогда как размер популяции cWc+/+Lin~c — Kit+Sca— 1+ клеток в наших экспериментах составил 2,0±0,5% (п=5) всех Lin" клеток костного мозга.

А

мутант

дикий тип

CD43

В

мутант

дикии тип

мутант

дикии тип

A Li

HSA

Г

мутант

дикии тип

CD25

Sca-1

Рисунок 5. Цитофлюорометрический анализ популяций ранних гемопоэтических клеток в костном мозге и тимусе мугантных (cMf'~) и нормальных (cWc+/t) мышей. Для тестирования брали животных из одного выводка. Представление данные получены в отдельных экспериментах и являются типичными для всего ряда проведенных измерений. (Л) Популяции линии В —клеток в костном мозге. Популяция CD43+B220+ выделена рамкой. (Б) Профиль экспрессии HSA в выделенной популяции CD43+B220+ костного мозга. (В) Анализ популяции трижды негативных тимоцитов (CD3~CD4 CD8~) с помощью антител к поверхностным антигенным маркерам CD44 и CD25. Тимоциты вначале обрабатывали смесью антител к линейным маркерам (CD4, CD8, CD3, NK1.1, В220, а также антитела TER119), а затем исследовали экспрессию CD44 и CD25 в линейно—негативных (не экспрессирующих линейные маркеры, Lin') тимоцитах. (Г) Фракционирование линейно — негативных клеток костного мозга на основе экспрессии с —Kit н Sea—1. В данном случае смесь антител к линейным маркерам состояла из TER119, anti-B220, anti—Mac— 1, anti-Gr-1, anti —CD4, и anti — CD8.

Таким образом, инактивация Chk не приводит к количественным изменениям в компартменте ранних гемопоэтических предшественников костного мозга.

8. Функциональный анализ клеток костного мозга chk~'~ мышей in vitra

Анализ клеточных популяций с помощью цитофлюорометрии не выявил дефектов в составе гемопоэтических популяций мышей с индуцированной мутацией в гене chk. Для того, чтобы исследовать функциональные свойства гемопоэтических клеток chk~'~ мышей, было предпринято культивирование in vitro клеток костного мозга.

Одной из предполагаемых функций Chk является участие в контроле развития мегакариоцитов человека [Avraham et al., 1995]. Индуцированная инактивация Chk с помощью генного нокаута позволяет изучить роль этого фермента в развитии мегакариоцитов мыши. С этой целью была изучена способность мутантных клеток костного мозга образовывать колонии мегакариоцитов in vitro в условиях метилцеллюлозной культуры.

На Рисунке 6А представлены результаты типичного эксперимента по культивированию клеток костного мозга chk~'~ и chk*'* мышей в среде с метилцеллюлозой. Подсчет содержания КОЕ —lyler (колоние — образующие единицы—линия мегакариоцитов) и КОЕ — ГМ (колоние — образующие единицы—смешанная линия гранулоцитов и макрофагов) в популяции костного мозга не обнаружил отклонений от нормы в количестве колоний на 105 ядерных клеток костного мозга мышей, у которых была инактивирована Chk.

Таким образом, делеция региона, кодирующего каталитический домен Chk, не приводит к нарушениям в развитии предшественников мегакариоцитов и гранулоцитов/макрофагов, судя по результатам in vitro анализа клоногенной активности в тотальной фракции клеток костного мозга.

Для оценки функционального состояния гемопоэтических предшественников на различных стадиях дифференцировки in vitro, мы предприняли совместное культивирование мутантных клеток костного мозга с нормальными стромальными клетками, или КОЗБ (клетка, образующая зону брусчатки)—анализ. Показано, что анализ частоты различных

временных фракций КОЗБ дает количественную информацию о полной иерархии субфракций ГСК на основе различий в степени примитивности [Р1оетасЬег, И. Е., 1994]. Количество КОЗБ, детектируемое на 10-ый день культивирования (КОЗБ—10), коррелирует с количеством колоний на селезенке через 12 дней после трансплантации, тогда как количество КОЗБ —28/35 соответствует числу плюрипотентных ГСК, длительно репопулирующих облученных рецепнентов.

КОЕ-Мег КОЕ-ГМ

1000,

te

!

ь

100

10

14

21 28 время (дни)

Рисунок 6. In vitro анализ мутантных гемопоэтических клеток. (А) Репрезентативный анализ частоты КОЕ —Мег и КОЕ —ГМ в тотальной популяции клеток костного мозга chk~'~ и chk*'* мышей. Каждый столбик представляет среднюю величину трех измерений (в трех чашках) вместе с соответствующими стандартными отклонениями. (Б) Усредненные данные двух независимых КОЗБ—тестов с клетками костного мозга мутантных (chic"'") и нормальных (chk+/+) мышей.

В наших экспериментах была использована чистая линия ЫВМ„Р4С преадипоцитных стромальных клеток. На рисунке 6Б показаны результаты КОЗБ—анализа способности к пролиферации сЬк~'~ клеток костного мозга. Всего было проведено четыре долгосрочных эксперимента (28 — 42 дня) по совместному культивированию стромальных клеток и клеток костного мозга. Количество КОЗБ подсчитывалось через каждые 7 дней культуры. Для каждого генотипа использовались смешанные в одинаковой пропорции

клетки по крайней мере двух аутбредных животных одного и того же возраста. Для каждого образца приготавливали 12 двухкратных разведений, при этом минимальное разведение содержало 2x104 или 4x10* клеток костного мозга. Клетки каждого разведения высевали в 15 — 36 лунок 96 — луночного планшета. На рисунке 6Б показаны усредненные данные, полученные понедельно в двух характерных экспериментах. Количество КОЗБ обоих генотипов на 10s клеток костного мозга соответствовало норме (в зависимости от линии мышей число КОЗБ — 10 может варьировать от 100 до 300, а КОЗБ-28 - от 1 до 5 [Ploemacher RE. 1994)). После 4 недель культуры подсчет КОЗБ был затруднен даже в самых низких разведениях, так как использовалась необогащенная популяция клеток костного мозга, и при этом максимальное количество клеток, вносимых в лунки со стромальными клетками, ограничено.

Несмотря на то, что содержание КОЗБ в костном мозге cWc~/_ мышей в среднем несколько выше, различия эти статистически не достоверны. Поэтому следует сделать вывод о том, что мутация гена Chk не влияет на частоту примитивных (КОЗБ —28) и коммитировакных (КОЗБ—10) гемопоэтических предшественников в костном мозге и на их способность к пролиферации in vitro.

В связи с тем, что нам не удалось с помощью КОЗБ анализа получить статистически достоверные данные о влиянии мутации на клетки, способные поддерживать гематопоэтическую активность в культуре более чем 4 недели, была предпринята попытка сделать это путем оценки клоногенной активности в пяти — и шестинедельной культуре клеток костного мозга.

В стандартном методе анализа клеток, способных инициировать длительное культивирование in vitro. (КСИДК—тест; LTC —1С, Long Term Culture — Initialing Cell assay) [Dexter et al.r 1977] не применяются лимитирующие разведения и вместо подсчета зон брусчатки измеряют количество КОЕ —К в стромальной культуре гематопоэтических клеток. Считается, что только примитивные предшественники, включая стволовые клетки, обеспечивают образование КОЕ —К после 5—6 недель культивирования, поэтому количественный анализ клоногенной активности в стромальной культуре позволяет сделать вывод (в дополнение к КОЗБ —

анализу) о содержании примитивных гематопоэтических клеток в тестируемой популяции [Dexter et al. 1977]. С этой целью неадгезивную фракцию клеток в культуральной жидкости высевают в среде с метилцеллюлозой и через 7 дней подсчитывают количество образовавшихся клонов.

В наших экспериментах количество КОЕ—К (в основном КОЕ —ГМ) в • культуральной жидкости измерялось понедельно, а после 6 недель фракцию адгезивных клеток находящихся в стромальном слое трипсинизировали, одну часть высевали непосредственно в среде с метилцеллюлозой, а другую очищали от стромальных клеток методом преадсорбции на пластике. Обладая значительно бблыпими адгезивными способностями чем большинство гематопоэтических клеток, клетки стромы быстрее адсорбируются на поверхности культурального пластика, и, таким образом, появляется возможность селективно удалить их из клеточной суспензии.

недели j

не*дге»мие клепся

ялгггивние адгезивные до селекции после

селекции

Рисунок 7. КСИДК-анализ (LTC-IC, Long Term Culture - Initiating Cell assay) мутантных (chA-/~) клеток. В экспериментах использовались аутбредные животные одного и того же возраста. Столбики с соответствующими стандартными отклонениями обозначают количество КОЕ —К на 10® клеток адгезивной фракции стромальной культуры в пересчете на 103 первоначально инокулированных клеток костного мозга. Статистический анализ (two-tailed t—test) показал, что вероятность случайного возникновения различий, обнаруженных во фракциях адгезивных клеток до селекции не превышает 0,1%, или р<0,001.

Как показано на рисунке 7, в течении пяти недель не наблюдалось статистических различий между контрольными и мутантными клетками костного мозга, однако после шестой недели частота КОЕ —К в культуре мутантных клеток несколько превышала соответствующую контрольную величину. Необходимо отметить, что содержание КОЕ —К во фракции адгезивных клеток также было выше по сравнению с контролем, но после селекции содержание КОЕ —К выравнялось, то есть не произошло обогащения клоногенной активности во фракции мутантых клеток в отличие от контроля.

На основании этих данных был сделан предварительный вывод о изменении способности к адгезии мутантных КОЕ —К, что, по —видимому, сказывается на количестве КОЕ — К в стромальной культуре клеток костного мозга и создает эффект увеличения количества клеток, способных инициировать длительное культивирование in vitro (LTC —1С). Для подтверждения полученных результатов, нами было измерено количество КОЕ —К, продуцируемое различными разведениями клеток костного мозга после длительной стромальной культуры.

Технически это было осуществлено совместно с КОЗБ — анализом гематопоэтических фракций костного мозга. После определенного периода культивирования подсчитывали зоны брусчатки, и стромальный слой различных разведений тотальной фракции костного мозга разрушали трипсином. Очищенную от стромальных клеток с помощью преадсорбции на пластике суспензию клеток высевали в среде с метилцеллюлозой, и выращивали дополнительно в течение недели. Использовали клетки только тех разведений, которые ранее содержали зоны брусчатки, но на момент анализа гематопоэтическая активность в этих разведениях практически отсутствовала.

Подсчет образующихся КОЕ — К в тотальной фракции стромальной культуры, содержащей как клетки, не прикрепленные к стромальному слою, так и клетки, тесно с ним ассоциированные, выявил значительное увеличение клоногенной активности в chk~'~ клетках по сравнению с нормальными клетками даже после обогащения методом преадсорбции. Измерение клоногенной активности только в неадгезивной фракции было проблематичным, так как в большинстве случаев в используемых

разведениях содержалось очень незначительное количество неадгезивных клеток. Соотношение содержания КОЕ —К в стромальной культуре мутантных и нормальных клеток после 4 недель достигало 6,7 раза. Более значительные отличия наблюдались после двух и трех недель культивирования (Рис. 8).

с 5

о

и

Ы

О и

4 МАела

время после качала стромальной культуры

Рисунок 8. Увеличение клоногенной активности мутантных по гену сЛА клеток костного мозга после их культивирования в присутствии нормальных стромальных клеток. Столбики обозначают среднюю величину трех измерений, соответствующие стандартные отклонения изображены сверху столбиков. По оси ординат отложено количество колоние — образующих единиц (величина колоний—не менее 100 клеток) в препаратах суммарных клеток стромальной культуры, предварительно обогащенных неадгезивными клетками методом преадсорбции на пластике.

Повторный анализ клоногенной активности в разведениях стромальной культуры показал, что наблюдаемые различия исчезают при измерении количества КОЕ —К в тех разведениях тотальной фракции костного мозга, которые содержат определенный уровень гематопоэтической активности (зоны брусчатки), и появляются в разведениях с пониженным образованием зон брусчатки (Рис. 9). В этом эксперименте подсчитывали содержание КОЕ —К (в основном КОЕ—ГМ) в различных разведениях двухнедельной

:тромалыюй культуры мутантных клеток. При этом в адгезивной фракции тблюдаемые различия были гораздо выше, чем во фракции неадгезивных слеток. Это подтверждает результаты, полученнные в КСИДК—тесте, и ■оворит в пользу того, что мутантные КОЕ —К обладают повышенной [дгезивной способностью.

I

ш О Ж

(-)лунка

клеток ия лунку

адгезивные после селекции

неадгезнвные клетки

унок 9. Тестирование клоногенной активности в различных разведениях двухнедельной омальной культуры мутантных клеток костного мозга. В экспериментах использовались Вредные животные одного и того же возраста. Ниже оси абсцисс указано количество лунок, содержащих зоны брусчатки (негативные лунки) для каждого разведения, по 36 лунок на ведение. Во второй строчке показано количество первично инокулированных клеток альной фракции костного мозга в соответствующем разведении. Столбиками обозначены дние трех измерений с соответствующими стандарными отклонениями.

В итоге следует заключить, что индуцированная мутация в гене СЬк в эпределенных условиях может существенно стимулировать КОЕ—К — продуктивность мутантных гемопоэтических клеток костного мозга после

продолжительного культивирования в присутствии нормальных стромальных клеток.

Таким образом, цель настоящего исследования достигнута — исследована роль НР—ТПК СЬк в гемопоэзе с помощью метода индуцированного мутагенеза, и обнаружено, что эта киназа по—видимому вовлечена в контроль дифференцировки коммитированных гемопоэтических предшественников.

выводы

1) Получены мыши, у которых ген нерецепторной тирозиновой протеинкиназы Chk был инактивирован методом генного нокаута,

2) Делеция региона, кодирующего каталитический домен Chk приводит к повышению уровня экспрессии гена chk.

3) Инактивация Chk не приводит к нарушениям эмбрионального развития. Мыши с генотипом chk'/chk~ фертильны и имеют нормально развитый головной мозг.

4) Инактивация Chk не вызывает ярко выраженных фенотипических дефектов в гемопоэтических популяциях костного мозга, селезенки и тимуса.

5) Функциональное тестирование in vitro не выявило значительных отклонений в процессах пролиферации и дифференцировки мутантных гематопоэтических клеток.

6) В лимитирующих разведениях стромальной культуры мутантных клеток костного мозга происходит значительное увеличение содержания КОЕ—К, что по —видимому указывает на определенную роль Chk в процессе дифференцировки комитированных предшественников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Ershler, М.А., Samokhvalov, I.M., Belyavsky, A.V., and Visser, J.W.M. (1995). Genomic structure and alternative splicing of the murine bhk/ctk/ntk gene. FEBS Letters 375, pp. 50-52.

2. Ershler, M.A., Samokhvalov, I.M., Krotkova A.V., Krivtsov A.V., Belyavsky, A.V., and Visser, J.W.M. (1995). cDNA cloning, genomic structure and alternative splicing of murine bhk/ctk/ntk gene. Exp. Hematology 23, p. 749 (Abstract).

3. Samokhvalov, I., Hendrikx, J., Visser J., Belyavsky, A., Sotiropolous, D., and Gu H. (1997). Mice lacking a functional chk gene have no apparent defects in the hematopoietic system. Biochem. and Mol. Biol. Int., 43, pp. 115— 122.