Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение конверсии и рекомбинации на основе двойной супернестабильной системы в локусах yellow и scute у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение конверсии и рекомбинации на основе двойной супернестабильной системы в локусах yellow и scute у Drosophila melanogaster"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

РГ6 ОД

На правах рукописи УДК 575:595.773.4

Медведева Наталья Павловна

ИЗУЧЕНИЕ КОНВЕРСИИ И РЕКОМБИНАЦИИ НА ОСНОВЕ ДВОЙНОЙ СУПЕРНЕСТАБИЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В ЛОКУСАХ YELLOW И SCUTE У DROSOPHILA MELAHOGASTER

Молекулярная генетика (03.00.26)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена з Институте биологии гена РАН

Научный руководитель:

академик РАН, доктор биологических наук Г.П.Георгиев Официальные оппоненты:

член-кор. РАН, доктор медицинских наук Л.К.Корочкин

кандидат биологических наук Н.В. Любсмирская

Ведущее учреждение: Институт биологии развития РАН

Занята диссертации состоится " V"" Ии> МЯ 1994 г. в__час.

на заседании Специализированного совета Д 200.30.01

при Институте биологии гена РАН

по адресу: 117334. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологик РАН.

Автореферат разослан " О.Пр <Г4Л 1954 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат фармацевтических наук / ,

"ЗубОЛ Р® с-гРабовская

Актуальность проблемы

Процессы рекомбинации и конверсии свойственны всем живым организмам - от простейших до самых сложных. Рекомбинация и конверсия выполняют разнообразные функции, играющие важную роль, как на клеточном .уровне, так и в эволюции целого генома. Поэтому изучение молекулярных механизмов этих процессов является на сегодняшний день одной из актуальных задач. Трудности исследования процессоз рекомбинации и конверсии связаны с отсутствием удобных систем для их изучения. В основном такие системы сконструированы на низших эукариотах, т.к. у них возможно встраивание различных искусственных конструкций в определенные места генома и облегчен анализ всех продуктов индивидуального рекомбинационного события [ Fincham and Oliver, 1989; Cao et al., 1990; Sun et al., 19911. У высших эукариот набор удобных систем крайне ограничен. В настоящее время у D. melanogaster описана система, позволяющая исследовать процессы межхромосомной генной конверсии, однако для этого требуется сложный молекулярно-генетический анализ [Gloor et al., 1991]. В связи с вышесказанным становится очевидна актуальность проблемы поиска удобных систем для изучения процессов рекомбинации и конверсии.

Известно, что для реализации процессов рекомбинации и конверсии необходимы контакты между соответственными участками гомологичных ДНК. Поэтому представляет научный интерес выяснение роли генов, определяющих дальние взаимодействия в хромосомах и компактизацию хроматина, в контроле рекомбинационных процессов.

Цели и задачи исследования

Цель данной работы - создание на основе

супернестабильных мутаций в локусах yellow и scute систем

для изучения процессов межхромосомной рекомбинации и

конверсии, а также исследование влияния мутаций в генах,

отвечающих за хромосомные взаимодействия на процессы

2ns ие

внутрихромосомной рекомбинации и конверсии в у se системе.

Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Получить системы на основе супернестабильных мутаций

в локусах yellow и scute, в которых возможно активизировать процессы межхромосомной генной конверсии й рекомбинации.

2... С помощью генетических методов определить частоты и характер протекания мекхромосомной генной конверсии и рекомбинации.

3. Изучить влияние мутаций в генах, ответственных за компактизацию хронатина/на процессы внутрихромосомной рекомбинации и конверсии.

4. Изучить влияние на рекомбинационные процессы мутаций в генах, определяющих дальние взаимодействия в хромосомах.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проведенной работы получены новые системы, которые с успехом могут использоваться для изучения межхромосомной рекомбинации и генной конверсии у Drosophila melanogaster.

Преимуществами созданных систем является то, что рекомбинация и конверсия индуцируются в заданном месте с помощью транспозазы, экспрессию которой можно искусственно контролировать; для легкого генетического и молекулярного анализа доступны оба элемента, которые вступают между собой во взаимодействие; изменения на уровне ДНК сразу же фиксируются на фенотипическом уровне, что необходимо для быстрого анализа большого числа независимых событий с помощью простого генетического анализа.

В работе показано различие в механизмах индукции рекомбинации и конверсии, считающихся сопряженными процессами.

В данном исследовании впервые продемонстрировано участие генов, ответственных за организацию хромосом, в контроле процессов рекомбинации и генной конверсии у высших эукариот.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на межлабораторном семинаре в Институте биологии гена РАН (Москва, 1993).

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы две работы.

Объем диссертации.

Диссертация изложена на /03 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы: материалы и методы, результаты), обсуждения полученных результатов, выводов и включает в себя 10 таблиц и 2 рисунка.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕЖХРОМОСОШЮЙ КОНВЕРСИИ У DROSOPHILA MELANOGASTER.

Ранее в нашей лаборатории были описаны

супернестабильные системы в различных локусах Х-хромосомы у

Drosophila melanogaster (Georgiev and Yelagin, 1992;

б

Георгиев и Елагин, 1990 ; 1990 ]. Одна из супернестабильных мутаций возникла в локусе yellow [Георгиев и др., 19901. Она вызвана внедрением за 146 п.н. перед промотором гена yellow инсерции неизвестной природы (X), на концах которой находятся неполноценные копии Р-элемента, не способные к автономной транспозиции. Введение гена транспозазы Р-элемента А2-3, который находится в третьей хромосоме, приводит к разрывам по Р-элементу и активации мутагенеза. Кроме того, из генетических и предварительных молекулярных данных следует, что во встроившемся элементе (X) находится ряд регуляторных элементов, различное сочетание которых может приводить к усиленно или ослаблении экспрессии генов и, следовательно, к видимым изменениям фенотипа в некоторых случаях. Таким образом была получена система, в которой с помощью транспозазы Р-элёмента можно индуцировать разрывы в определенном месте и обо всех изменениях в структуре хромосомы судить по фенотипическим изменениям аллеля.

Целью настоящей работы было получение на базе супернестабильных мутаций в локусе yellow системы, где с высокой частотой проходили бы процессы межхромосомной генной конверсии, легко определяемые по характеру изменений фенотипа.

Для этого в качестве исходной мутации использовался супернестабильный аллель y+ns. Инсерция (X) в этом аллеле по данным блот анализа имеет наибольшую длину, около 18 т.п.н. [Грачева, личное сообщение]. На ее концах расположены дефектные копии Р-элемента, не способные к автономной транспозиции. Производные этой линии содержат также другую супернестабильную мутации в локусе scute, возникшую в результате частичной транспозиции элемента (X) в локус scute.. В работе использовались полностью стабилизированные линии y+ns в сочетании с различными scute-аллелями. Индукция нестабильности вызывалась введением гена транспозазы Р-элемента Д2-3. Поскольку гены yellow и scute расположены в одном районе генетической карты на расстоянии всего 40 т.п.н. и вероятность рекомбинации между ними ничтожно мала, мутация в гене scute служила также в качестве хромосомного маркера. Кроме того, для маркирования хромосом мы использовали мутации по локусу white.

В первой серии опытов был исследован мутагенез у самцов

fnc

у аллеля в комбинациях с различными sc-аллелями, а также

у гетерозиготных по этим мутациям самок, где вторая

хромосома принадлежала к дикому типу (у+). Цель этих опытов

- получить исходный уровень мутагенеза и одновременно

выявить, насколько сильно влияет размер и структура инсерции

в локусе scute на характер мутагенеза в локусе yellow. Из

+ns

таблицы 1 (экспер. N 1) видно, что при расцеплении у аллеля, не имеющего инсерции в локусе scute, около 60% производных являются полностью стабильными - аллели у , у+ииз, y+lws, и yls. Эти производные возникают в результате вырезания Р-элемента и участков различной длины прилегающей к нему инсерции (X). В экспериментах NN2-5, где существует инсерция в локусе scute, процент стабильных событий у самцов и самок снижается в зависимости от мутантного sc-фенотипа. Такое изменение мутагенеза y+ns аллеля может возникать из-за влияния инсерта, находящегося в области scute. Это влияние вставки легко объяснить внутрихромосомной конверсией или рекомбинацией между двумя инсерциями. Дополнительным подтверждением является тот факт, что в опытах NN 2, 3 и -5 с частотой до 70% возникают производные с 'одновременными изменениями в обоих локусах yellow и scute, и именно в этих опытах частота возникновения стабильных аллелей заметно

NN Фенотипы родительских аллелей Производив основных фенотипических классов, частота возникновения аллей х Ю-"3 Частота нестаб. х Ю"2 Кол-во проанал, хромосом

Изменения идут только в yellow Одновременно меняется у и эс*

Стабильные производные Другие события

y+ws У+mws y+lws У1*

а 1 б 2(1,4)*» 3(1,3) 2(1,4) 3(1,3) 6(1,3) — 1,6 8470

9 у+П5/У+ 2(1,4) 2(1,4) 1(1.2) 2(1,4) 5(1,4) — 1,2 3248

а 2 б 1(1.7) 1(1.6) 1(1,6) 2(1.4) - 8(1,6) 1,3 2790

9 У+П55С*/У+ 2(1.8) 2(1,6) 2(1,7) 2(1.8) - 8(1,5) 1,6 2246

а 3 б сГу+пз=стР 1(1) 2(1.3) 2(1.2) 1(1) - 11(1.7) 1,7 2573

9 у+п55стР/у+ - - 41) - - 21(1,7) 2,2 2362

а 4 б 3(1,6) 2(1.5) 3(1.5) 5(1.7) 4(1,5) 1(1) 1,8 4455

9 У+П55Сеа/У+ - - - 1(1) 1(1) — 0,2 2981

а 5 б сГу+лз*с+ 1(1.3) •2(1.5) 2(1,4) 1(1,3) - 10(1,7) 1,6 2679

9 У+П55С+/у+ - — - - - 2(1,5) 0,2 2628

* — Не учитывались события, происходящие только в локусе scute.

** — Первая цифра — частота независимых событии; а скобках — среднее количество мутантных особей в пучке.

снижена. •

Как видно из таблицы 1, частота мутагенеза у самцов примерно одинакова для всех опытов. Снижение на порядок частоты мутагенеза у самок в опытах 46 и 56 можно объяснить возникновением летальных мутаций или событий, которые фенотипически не отличимы от родительского аллеля, либо залечиванием с высокой эффективностью всех разрывов, образованных транспозазой.

В любом случае для всех экспериментов существует одна важная особенность - другая копия инсерта, удаленная на расстояние более 40 т.п.н.? влияет на частоту и спектр мутагенеза в локусе уе11он.

разрыв

инсерция (X) | ген уе11он

+ns

у

y+lws

Р-эл.

инсерция (X) ген yellow

Рисунок Аллель у+пэ содержит полноразмерную копию инсерта (X)со: встроенным Р-элементом, по которому происходит образование разрывов. Аллель у+*МБ содержит уменьшенную копию инсерта (X) без Р-элемента.

Во второй, главной серии опытов, проводившейся на самках,вместо гомологичной Х-хромосомы с у+ аллелем вводили Х-хромосому с одним из стабильных производных y+ns аллеля -y+lws или y+mvs (см. рис.1).

Из табл. 2 видно, что активация мутагенеза в таких линиях сопровождается образованием только одного класса стабильных yellow аллелей, по фенотипическому проявлению полностью аналогичных аллелю гомологичной хромосомы. Полученный спектр стабильных производных y+ns аллеля не зависит от вставки, находящейся в локусе scute. Частота

NN Фенотипы родительских аллелей Производные основных фенотипических классов частота возникновения аллелей х 10'^ Частота нестаВ. х 10 2 Кол-во про а-нал. хромосом

y+ws y+mws y+lws y,s Другие события Изменение у И SC*

1 y+nsscea/y+lvvs - — 8(1,3)** - - 2(1,2) 1.0 3167

2 y+nsscea/y+mws - 8(1,4) — - - 2(1,3) 1,0 2985

3 y+nsscw/y+mws - 8(1.3) —. — - 1(1) 0,9 2365

4 y+ns/y+mwsscea - 6(1,5) - - - 1(1) 0,7 1984

5 y+nssc+/y+mwsscea — 6(1,9) — - - 5(2,2) 1.1 2144

6 y+ns/y+mv»sscw - 9(1,9) — — 3(5,2) 1(1) 1,3 2372

7 y+ns/y+mwsscmp — 4(1.3) — — - — 0.4 2458

8 v+ns/v+ 2(1,4) 2(1,4) 1(1.2) 2(1.4) 5(1,4) — 1.2 3248

* — Не учитыоэлисть события, происходящие только а локусе scute.

** — Первая цифра — частота независимых событий; в скобках — среднее количество мутантных особей в пучке.

возникновения стабильного y+Blws (y+*ws) аллеля совпадает с частотой образования всех стабильных аллелей в экспериментах, где в качестве Х-хромосомы вводилась хромосома дикого (у+) типа (ср. табл. 1 и 2).

Следует также отметить, что размеры получаемых в этой серии пучков, т.е. однотипных изменений в потомстве одной самки, стабильных y+nws (или y+^ws> аллелей совпадает с размерами пучков стабильных производных при расщеплении y+ns аллеля из контроля (табл. 2). Это можно объяснить тем, что во всех сериях экспериментов стабильные аллели возникают либо на поздней премейотической стадии, либо непосредственно на стадии мейоза.

Другие события, например/ образование нестабильных у-производных (табл.2 N6), могут идти и на других, более ранних стадиях.

При введении гомологичной хромосомы с мутацией в локусе yellow сохраняется влияние мутаций в локусе scute на события, происходящие в локусе yellow. Однако возникает

только один класс стабильных производных, хотя и с разной

частотой, а именно образуются переходы к yellow аллелю,

идентичному yellow аллелю гомологичной хромосомы. Такое

явление может быть. объяснено только межхромосомной генной

..............+ns

конверсией. Транспозазный разрыв вызывается в составе у +mws +lv4

аллеля, но не в у и у 13 аллелях, что видимо и определяет однонаправленный характер конверсии (см. рис.1).

Таким образом, -нам удалось создать систему, где по фенотипическим проявлениям легко наблюдать за протеканием процессов межхромосомной генной конверсии. Система является .удобной для изучения действия различных факторов, в том . числе различных мутаций на генную конверсию, позволяет: исследовать генетические и молекулярные механизмы последней у эукариот.

СИСТЕМА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХХР0М0С0МН0И РЕКОМБИНАЦИИ У DROSOPHILA MELANOGASTER.

Другой частью работы явилось создание на основе уже имеющихся супернестабильных мутаций в локусе yellow системы, где при помощи транспозазных разрывов можно индуцировать бреши в обеих гомологичных хромосомах.. Было высказано предположение, что в такой системе помимо протекания процессов межхромосомной генной конверсии будут

индуцироваться и другие события и, в частности, межхромосомная рекомбинация.

Для подтверждения этого предположения был проведен

ряд экспериментов;! где в качестве, исходной. ,, мутации

использовался описанный выше супернестабильный аллель +ns

у в сочетании с супернестабильными производными этого аллеля и аллелями, полученными из других подсистем.._[ Георгиев и др., 19901. В каждом случае, при введении гена транспозазц Р-элемента А2-3, находящегося в третьей хромосоме, разрывы, могли образовываться не только во вставке, (X) аллеля y+ns, но и в гомологичной хромосоме, имеющей измененный инсерт (X) и неполноценную копию Р-элемента (Рисунок 2).

Как ив случае создания модели межхромосомной генной конверсии, мутация в локусе scute служила в.. качестве хромосомного маркера и указывала,, что между генами yellow и scute произошло событие обмена двух гомологичных хромосом.

разрыв

,,+ns

инсерция (X)

eSEIS-

Р-эл.

разрыв инсерция (К)

ген yellow

ген yellow

Р-эл.

Рисунок 2. Каждый из аллелей у* содержит измененную копию инсерта (X) и неполноценную копио Р элемента, позволяющего индуцировать хромосомные разрывы.

В каждой серии экспериментов, проводившихся на самках,

^nq ад ji

одна из гомологичных Х-хромосом содержала у sc w аллель, а другая - аллели, несущие различные супернестабильные мутации в локусе yellow с маркерами scute и white дикого типа.

Из представленных в табл. 3 результатов видно, что в каждом случае возникали производные, образующиеся вследствие обмена участками хромосом, расположенными■ между локусами yellow и scute. Поскольку локусы yellow и scute лежат в одном районе рекомбинационной карты (1 - 0,0) и вероятность акта рекомбинации в этом районе близка к нулю, можно1 сделать вывод, что такие события происходят благодаря индукции двухцепочечных разрывов транспозазой Р-элемента. Частота возникновения рекомбинационных производных различается по крайней мере на ■ порядок для каждого из приведенных экспериментов. Наиболее часто рекоибинационные события

фиксировались, когда в качестве гомолога хромосомы с

ч-ns еа Ds +

у sc аллелем вводилась хромосома, несущая у sc или

y^nssc+ мутацию (экспер. NN 1 и 2).

Причиной отличий в частоте возникновения межхромосомной рекомбинации в проведенных экспериментах являются, по-видимому, свойства самих у-ал-лелей, а не различия в частоте образования транспозазных разрывов. Из молекулярных данных известно, что длина инсерта (X) в y+ns аллеле

составляет примерно 18 т.п.и.; в производных линиях она

колеблется от 12 т. п. н. до 4,7 т. п. н. Наибольшую длину

вставки содержат аллели уСБ и у2пз, с которыми как раз и

возникает наибольшая частота рекомбинации. Таким образом,

различия в частоте рекомбинации в исследуемых сочетаниях

уе11оы-аллелей зависят от расстояния между точками разрывов

на гомологичных хромосомах. „

Таблица 3

NN Фенотипы родительских аллелей Производные основных фенотипических классов, частота возникновения аллелей х Ю""® Кол-во проана-лизир. хромосом

Рекомбинационные события Изменения у и (или) sc аллеля y+nsscea Мутации в локусе yellow гомологичной хромосомы

y+nssc+ /%сеа

1 y+nsscea/yussc* 2,4 2,2 8,4 6,2 8764

2 y+nsscea/y^nssc+ 1,3 0,9 8,7 3,1 5728

3 y+nsScea/^Phc+ 0,5 0,6 8,2 3,9 7258

4 y+nsSceVssc+ 2 0,1 20,1 9,3 6,7 8324

5 y+nsscea/y+l$sc+ 2:0,1 2 0.1 8,7 5,3 7946

* В каждом случае мутация, имеющая фенотип, аналогичный аллелю гомологичной хромосомы

В результате проведенных экспериментов нам удалось получить систему, в которой устойчиво, с большой частотой

О

(2 х 10 ) индуцируется межхромосомная рекомбинация. Полученная система может служить удобной моделью для изучения механизмов рекомбинации, а также для выяснения роли различных белковых факторов, вовлеченных в эти процессы.

НУТАЦИИ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ВНУТРИХРОМОСОМНУЮ РЕКОМБИНАЦИЮ И КОНВЕРСИЮ В ДВОЙНОЙ y2nsscme СИСТЕМЕ У DROSOPHILA MELANOGASTER.

Ранее было описано явление двойной супернестабильности y2nsscme аллеля [Окладнова и Георгиев, 1992а]. В этой системе в 146 п.н. перед сайтом кзпирования гена yellow и за геном scute находятся частично идентичные инсерции (X), на концах которых расположены неполноценные копии Р-элемента.В (X) последовательности находится, очевидно, ряд регуляторных элементов и все изменения фенотипического проявления связаны с их различной комбинацией [Крачинская и др., 19921. При введении гена транспозазы Р-элемента, расположенного в

третьей • хромосоме, наблюдается активация мутаг.енеза, причем примерно в 50% случаев происходят одновременные изменения у-и se- фенотипов (Окладнова и Георгиев, 1992й]. Более того.с большой частотой возникают только определенные сочетания мутаций. Нутационные изменения являются, очевидно, следствием контакта между (X) последовательностями в локусах yellow и scute и двойной рекомбинации и (или) конверсии, которое и приводит к возникновению новых комбинаций y-sc аллелей.

Кроме того было обнаружено, что мутации nei218 и nei41, влияющие на спаривание хромосом у самок, супрессируют у самок мутагенез в y2nsscnie системе I Окладнова и Георгиев, 1992й]. Следовательно, спектр и частота мутагенеза в y2nsscEe системе зависят от присутствия гомологичной хромосомы.

Мы предположили, что с помощью двойной супернестабильной системы можно изучать влияние различных генов, изменяющих дальние взаимодействия хромосом или участвующих в компактизации хроматина, на внутрихромосомную рекомбинацию и конверсию.

С этой целью был проведен анализ частоты и спектра

нестабильности в присутствии мутаций в гене zeste (2F),

белковый продукт которого участвует во взаимодействии между

удаленными последовательностями ДНК. Нами использовались три

zeste мутации: z^^ - делеция лидерной последовательности и

части первого экзона, приводящая к полной инактивации гена

zeste; z*. - точечные замены в значащих кодонах,

приводящие к изменению гидрофобных свойств белка zeste

[Pirrotta et al., 1987; 1990]. Исследовалось также влияние

2ns ms

на спектр и частоту мутагенеза в у wsc системе мутаций в генах Psc1 (49E-F), ScmD1 (85E-F), E(z)l (67Е-68А), Su(z) (49E-F), белковые продукты которых участвуют в компактизации хроматина [Wu et al., 1989]; и мутаций в локусах е(у) 1 (16В), е(у)2 (ЮС), е(у)Э (18D), белковые продукты которых по своим функциям вероятно сходны с белком zeste (Георгиев и Абрамова, 1992].

Влияние мутаций в локусе zeste на спектр мутагенеза в двойной супернестабильной системе ¿îlfsç^f.

Был проведен анализ влияния на частоту и спектр

мутагенеза в двойной супернестабильной системе y2nsscBe • мутаций в локусе zeste ILindsley and Zimm, 1990), белковый продукт которого 'вовлечен во взаимодействие между удаленными участками- ДНК в хромосомах [Pirrotta, 19901. В каждой серии 'опытов брались- по две независимо полученные' линии, содержащие данную комбинацию мутаций;

Из табл.4 видно,■ что при расщеплении y2nsscffie аллеля Наиболее представительными классами являются аллели:

+ nq мр +пс . Ра * Pc

у se , У se , y"sc (возникновение у аллеля в сочетании с различными se- фенотипами) и y*ssc .

Как показано в табл.5, комбинация аллеля у2пззсие с мутацией (полная инактивация гена zeste) существенно

влияет на мутационные изменения в системе. Общая частота мутагенеза снижена примерно в 3 раза. 'Снижение происходит за счет уменьшения частоты возникновения основных производных классов y+nsscme, y2ssc* и ylssche. Кроме того, как видно из табл.5, с -достаточно высокой частотой возникает новый производный класс — аллель y2nsscw Hww.

Такое уменьшение частоты мутационных изменений могло произойти из-за возникновения летальных мутаций (делеции комплекса y-ac-sc), которые в вышеописанных экспериментах не

Таблица 4

Частота мутагенеза аллеля y2nsscme у самцов (х 10"^)

Анализируемые линии Кол-во проан. хромосом y+nssc+ y+nsscme 2s' * У Se y1ssche y+'nsscme y2nsscwHww Част, мутаген, x Ю-3

y2nsscme контр. 4029 1,9 0,4 0.9 3,7 <0,1 <0,1 11,5

y2nsscm" контр. 3276 1,7 0.3 1,0 4,0 0,1 <0,1 12,1

y2nsscmeA2-3

jzv77hj** 2344 1,5' 0,2 1.8 4,2 <0,2 <0,2 11,8

[e(y)U 2567 2,0 -~о,з 0.8 4,0 "0,1 <0,2 12,2

[е(у)2] 2526 1,8 0,4 1.1 3,6 <0,2 0.1 11,3

** — Линии у2п5зсте [е (у) 1]; [е (у) 2] без соответствующих г или е (у) мутаций получены

из рекомбинации линии у^л35Сгпе с 2 или е (у) мутациями и линией СЖ.

Таблица 5

Частота мутагенеза аллеля у^пззс,1,в у самцов в присутствии различных регуляторных мутаций.

у2м5Ств Количество проанал. хромосом. У+П55С+ у+П55Ств у2л5зс* уЧсЬе у-Нг^те у2"5«» л * * . Т 9 у гс /ас Частота .мутаген. 1 х 10"3 '

контроль 7305 ' 1.8 0,35 0,95 3,85 <0,1 <0,1 — 11,8

+ 3и(г)21 2516 2,3 2,3 3,2 . 3.5 ; < 0,1 1,4 — 13,9

+ Эй (г) 2? 2258 ' 3,1 1,3 0.9 4,0 < 0,1 <0,1 <0,1 15,1

+ Е М 1 3351 2,4 0.1 3,5 : 5.9 <0,1 . < 0,1 <0,1 15,6

+ Эст^ 3071 3,9 0.7 2,9 4,6 . < 0,1 :': <0,1 <0,1 15,8

+ Рвс1 3527 3,4 0,3 2,3 2,8 0,3 1.1 12,2 .

2637 , 0,9 0,6 < 0,1 0,3 ' <0,1 1,25 <0,1 4,5

3257 1,6 2,8 1,2 7,6 3,4. 0,3 - 20,9

+ гОр6: 3726 3,8 1,0 2,1 3,8 . <0,1 0,3 - ' 16,9

+ е(у)1и1 3086 1,5 1,5 5,6 0,5 <0,1, <0,1 — 13,8

+ е(у)2и1 2542 1,5 1,5 4,3 1,5 \ <0,1 1 <0,1 - 11,8

+ в (у) 3й 1 2355 2,2 0,4 3,2 2,5 " <0,1 2,5 ' - 10,8

фиксировались. Поэтому был проведен специальный анализ возможности возникновения леталей на гетерозиготных самках çy*sc*/ac^, где вторая хромосома (ас^) имеет мутации в локусе achaete (табл. 5). Возможность возникновения летальных sc-аллелей проверяли при анализе нестабильности на самках $y*sc*/y*sc^. Мы не обнаружили ощутимого вклада летальных событий в уровень нестабильности y^nsscme системы.

Поскольку было не ясно, оказывает ли такое сильное влияние сама мутация или замена большей части

хромосомы при получении рекомбинантов с ней, была проведена обратная рекомбинация линии y2nsscmezv^tl с хромосомой дикого типа OR и удаление мутации. Из таблицы 4 видно,

что при этом полностью восстанавливался характер мутагенеза аллеля y2nsscme. Необходимо также отметить, что в линиях y2nsscme с zeste мутациями вся правая часть хромосомы, находящаяся за геном white (1-1,5) заменялась на хромосому линии OR.

При введении в линию мутаций z* и z^P6 (точечные замены

в гене zeste, влияющие на специфичность взаимодействий белка

zeste) также наблюдалось, хотя и в меньшей степени,

изменение частоты и спектра мутагенеза аллеля y2nsscme

(табл. 5). В линии y2nsscmez* возник новый, класс

производного аллеля - y+lnsscBe и в два раза увеличилась

частота мутационных изменений. В комбинации y2nsscme аллеля

с мутацией спектр мутагенеза почти не изменился, при

?s •

этом возрасла частота встречаемости аллеля у se , и наблюдалось некоторое увеличение общей частоты мутагенеза.

Таким образом, все три проанализированные нами zeste-мутации изменяют частоту и спектр мутагенеза аллеля y2nsscne. Мутация zv77h оказывает наибольшее воздействие, z* имеет промежуточное влияние, z^P® воздействует слабо. При этом z*h z^P® влияют на мутационные свойства системы в обратном направлении по сравнению с

Влияние мутаций в локусах e(v) 1. e(v)2. е(у)3.

Ранее было описано семейство генов - знхансеров yellow,

„ v77h

которые усиливают эффект влияния z на экспрессию локуса

white [Георгиев и Абрамова, 1992]. По-видимому энхансеры

yellow кодируют белки, имеющие сходные с zeste белком

функции. Мы проанализировали влияние аллелей e(y)llul, e(y)2lul и e(y)3lul на частоту и спектр мутагенеза локусов yellow и scute y^nsscne аллеля. Во всех трех случаях на анализ брались по два независимо полученных рекомбинанта, содержащих соответствующую мутацию в локусе е(у).

Из представленных в табл.5 результатов видно, что в каждом случае основные отличия от исходного спектра

нестабильности состоят в увеличении частоты возникновения

+ns me 2s * у "^sc и у sc производных и значительном уменьшения доли

аллеля ylssc^e. В линии y^nsscmee(y)3, как и в случае с

zv77h муТацие}{t с большой частотой возникает производный

класс у scw Hww. В целом, все три проанализированные нами

аллеля энхансеров yellow оказывают влияние на спектр

мутагенеза y2nsscae системы.

Влияние мутаций, участвующих в компактизацни хроматина.

В заключение, мы провели анализ частоты и спектра нестабильности аллеля y2nsscffie в присутствии мутаций Su(z)2*, Su(z)25, Etz)1, ScmD1, Pes1. Белковые продукты соответствующих генов участвуют в компактизации хроматина IHu at al., 19891. Они оказывают также влияние и на взаимодействие генов zeste и vhite. Поэтому мы расчитывали получить изменение в спектре мутагенеза аллеля у sscme при введении перечисленных мутаций и индукции нестабильности.

В табл. 5 приведены результаты этих экспериментов. Из нее следует, что во всех опытах произошло в основном незначительное увеличение частоты мутагенеза и соответственно увеличение частоты встречаемости основных

^nn Jf 1 q пР

фенотипических классов - у se , у sc . Главные изменения в спектре мутагенеза состоят в возрастании частоты встречаемости более редких аллелей. Так, в случае введения в супернестабильную y2nsscme систему мутантного аллеля Su(z)2* более чем в пять раз увеличилась частота возникновения аллеля y+nsscœe. Мутации E(z)l, Su(z)21, Psc1 и Sem01 в несколько раз увеличивают частоту возникновения фенотипа

В целом все проанализированные нами мутации можно разделить на три группы по степени изменения мутагенеза в y2nsscme системе: SuCz)25 и Psc1 слабо влияют на мутагенез

исследуемой системы или действуют на уровне фона; Su(z)2* и Scin^ оказывают влияние; E(z)* значительно изменяет частоту мутагенеза.

Таким образом, большинство из исследованных нами мутаций в генах, определяющих дальние взаимодействия в хромосомах и компактизацию хроматина, изменяют частоту и спектр мутагенеза в y^nsscQe системе. Следовательно, изученные нами мутации оказывают влияние и на характер контакта между двумя (X) инсертами, расположенными в локусах yellow и scute, обуславливающий процессы рекомбинации и конверсии, проходящие между гомологичными вставками (X).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время существует ряд моделей для изучения механизмов межхромосомной рекомбинации и конверсии [Fincham and Oliver, 1389; Cao et al. i 1990; Sun et al. ,19911. Они, как правило, получены на низших эукариотах - дрожжах и грибах. Их получение обусловлено возможностью легкого встраивания различных искусственных конструкций в определенные места генома по принципу гомологичной рекомбинации. В то же время моделирование удобных систем для изучения межхромосомной рекомбинации и конверсии у высших эукариот является крайне ограниченным. У Drosophila melanogaster описана система, состоящая из встроившегося в разные участки генома транспозона Plwalterl, несущего укороченный ген white с точечными заменами на протяжении 3 т.п.н. и аллеля whd80kl7^ в одном из акзонов которого находится Р-элемент, не способный к автономным транспозициям. Индукция транспозазой Р-элемента разрывов в аллеле whd80kl7 приводит к их застраиванию по гену white из транспозона Plwalterl, т.е. генной конверсии IGloor et al., 1991J. В данном случае изменения, происходящие в геноме; приходится фиксировать на молекулярном уровне.

Нами была разработана система для исследования процессов межхромосомной конверсии, в которой весь спектр происходящих событий можно легко фиксировать по фенотипическим изменениям аллеля.

Созданная нами система состоит из двух гомологичных

хромосом, одна из которых (аллель у ) содержит неполноценную копию Р-элемента и полноразмерный инсерт (X), другая (аллели" y+aws, y+lws! - делецию Р-элемента и части инсерта. Индукция разрывов по Р-элементу в одной хромосоме приводит к образованию класса аллелей по фенотипическим признакам идентичному уеПок-аллелю гомологичной хромосомы. Таким образом, в данной системе наблюдается активизация процессов генной конверсии.

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что для иницииации конверсионных процессов достаточно индуцировать двухцепочечный разрыв на одной из гомологичных хромосом.

Индукция конверсии вследствие разрывов по Р-элементу может быть объяснена в соответствии с моделью Сзостака [Szostak et al., 1983!. Согласно этой модели конверсионное событие инициируется двухцепочечный разрывом, который расширяется до бреши, затем справа и слева от бреши с помощью экзонуклеаз продуцируются 3' концы, что в свою очередь приводит к поиску гомологичной последовательности на интактной хромосоме, образованию гетеродуплексов и репарации бреши.

При этом реципиентом генетической информации является хромосома, на которой происходит инициация конверсии, а донором - гомологичная последовательность интактной хромосомы. Аналогично наблюдается и в нашем случае, т.к. транспоэазный разрыв происходит в хромосоме, содержащей у аллель, то он конвертирует к стабильному y+fflWS (у ws) аллелю.

Возможно также, что молекулярные механизмы, лежащие в основе наблюдаемой в нашей системе меххромосомной генной конверсии аналогичны тем, которые были предложены для объяснения конверсии вставок, наблюдаемой у дрожжей [Fink and Styles, 19741 и Ascobolus [Rossingo 1,19841. Согласно этому предположению, если брешь образуется в инсерции мутантной хроматиды, репарация оказывается невозможной до тех пор, пока экзонуклеазы не гидролизуют всей последовательности инсерции и концы разрыва не окажутся гомологичными хроматиде дикого типа. Последующая репарация бреши приводит к конверсии мутантной хроматады к дикому типу

[Szostak et al., 19831. .

В нашем случае после внесения транспозазой разрывов по Р-элементу также возможно разрушение части полноразмерной вставки (X) в y+ns аллеле, пока концы разрыва не окажутся гомологичными инсерции (X) в y+mws (y+lws) аллеле, последующая репарация приведет к конверсии y+ns аллеля к стабильному у+имз (y+lMS) аллели.

В задачу наших исследований входило также создание системы, в которой возможно изучение процессов межхромосомной рекомбинации. В отличие от системы для исследования межхромосомной генной конверсии в данной системе обе гомологичные хромосомы содержат супернестабильные мутации в локусе yellow. В каждом из yellow аллелей, расположенных на гомологичных хромосомах, имеется инсерция (X), на концах которой находятся копии Р-элекента, не способные к автономной транспозиции. Таким образом, введение в систему гена транспозазы Р-элемента Д2-3 может приводить к индукции разрывов по Р-элементу в обеих гомологичных хромосомах. В данной системе с высокой частотой наблюдается процессы межхромосомной рекомбинации.

Описанные нами результаты коррелируют с известными из литературы данными, полученными при исследований мутации В в локусе Ваг у дрозофилы. Мутация В в Ваг локусе связана с тандемным повтором районов 16А1-1БА7. Было предположено, что такой повтор возникает из-за неравного кроссинговера между' мобильными элементами В104, расположенными, соответственно, в районе 16А7 на одной гомологичной хромосоме и в районе 16А1 - на другой tGoldberg et al., 1983; Green, 1985].

В других работах было продемонстрировано влияние мобильного Р-элемента на частоту межхромосомной рекомбинации. , Так, Свед и соавторы показали, что два Р-элемента, расположенные в гомологичных хромосомах, активизируют возникновение двухцепочечных разрывов и тем самым увеличивают частоту рекомбинации более чем в 20 раз [Sved et al., 1991.1.

Таким образом, нами были получены системы, в которых с помощь» индукции разрывов по Р-элементу можно активизировать процессы межхромосомной генной конверсии и рекомбинации и по фенотипическим проявлениям аллелей следить за их протеканием.

При этом для анализа оказываются доступными оба элемента, вступающих во взаимодействие.

Полученные системы могут быть с успехом использованы для изучения молекулярно-генетических механизмов меххромосомной рекомбинации и конверсии, а также для выяснения функций различных генов, участвующих в контроле данных процессов.

В настоящей работе описан также феномен влияния мутаций в ряде локусов дрозофилы на частоту и спектр мутационных изменений в двойной супернестабильной системе у scme у D.melanogaster.

Как было показано ранее, высокая вариабельность фенотипов мутаций в локусах yellow и scute зависит от изменений, происходящих в инсертах (X), встроившихся перед локусом yellow и за локусом scute [Крачинска и др., 19921. Инсерт (X) несет, видимо, в своем составе ряд регуляторных цис-элементов и этим объясняется сильное влияние их структурных изменений на фенотипическое проявление аллелей (Окладнова и Георгиев, 19923; 19926; Георгиев и др., 19921.

Были также получены данные, позволяющие предположить, что мутационные изменения в обоих локусах прежде всего связаны с процессами внутрихромосомной рекомбинации и генной конверсии,происходящими между иксерциями в локусах yellow и scute, находящимися на относительно близком расстоянии -около 40 т. п.н..

Для реализации процессов рекомбинации и конверсии необходимы контакты между соответствующими участками гомологичных ДНК. Именно поэтому мы ожидали, что мутации в генах, влияющих на организацию хромосом, будут одновременно влиять и на мутагенез в исследуемой системе.

Это предположение подтвердилось. Наиболее сильный эффект получен с мутациями в локусе zeste. Как известно, белок zeste . обладает способностью.- связываться с определенными последовательностями ДНК, а также образовывать мультимерныа комплексы [Pirrota et al., 19881. Благодаря этому он может стягивать друг с другом отдаленные участки ДНК, в частности образовывать контакты между энхансером и промотором [Pirrota, 19901.

В данной работе мы показали, что полная инактивация локуса zeste (мутация z777*1) сильно подавляет частоту мутагенеза в y2nsscme системе. Это указывает на роль белка zeste в обуславливающих процессы рекомбинации контактах между инсерциями (X), находящимися в локусах yellow и scute.

Мутации в локусах е(у11-3 оказывают значительно меньшее влияние на характер мутагенеза. Ранее показано, что эти гены кооперируются с геном zeste в контроле локуса white. Мутации в генах е С у)1—3 не нарушают z-w взаимодействий, если гены zeste и white не повреждены. Однако, они резко усиливают эффект zv77h мутации. Т. к. группа генов е(у)1—3 по-видимому кодирует белки, имеющие функции сходные с таковой у z белка, продукты этих генов' могут компенсировать утрату z белка в случае zv77^ мутации.

Возможно, что белки zeste и е(у) действуют на конкурентной основе, или же продукты генов е(у) выполняют роль альтернативной системы регуляции при нарушении z системы. Этим может объясняться меньший эффект мутаций в локусах е(у)1-3 по сравнению с zeste мутациями.

Наконец, некоторые мутации в генах, белковые продукты которых влияют на компактизацию хроматина - супрессорах и энхансерах z-w взаимодействия, также оказывают влияние на частоту и спектр мутагенеза, хотя опять-таки менее сильное, чем в случае zv7 аллеля. Как видно из проведенных нами экспериментов, наибольшее влияние оказывает мутация E(z)l, которая, как было показано, играет определенную роль в мейотических делениях клеток [Gatti and Baker, 19891. Мутации Su(z)2* и Scm^ также обладают свойством изменять спектр мутагенеза и поэтому естественно предположить, что уровень компактизации хроматина должен, хотя и неспецифически, сказываться на организации контактов между отдаленными участками хроматина. Более того, недавние исследования показали, что белковые продукты генов Psc и Su(z) имеют по крайней мере по одному сайту связывания в районе 1А политенной хромосомы, т.е. в районе yellow - scute [Rastelli et al., 19931.

В заключение следует отметить, что в данной работе впервые показано участие генов, определяющих дальние

взаимодействия в хромосомах и компактизацию хроматина, в контроле процессов рекомбинации и генной конверсии у высших эукариот.

ВЫВОДЫ

1. Получены системы на основе супернестабильных мутаций в локусе yellow у Drospphila nelanogaster, позволяющие изучать процессы межхромосомной рекомбинации и конверсии.

2. Показано, что в данных системах при индукции

—3

разрывов на одной хромосоме с частотой 7 х 10 наблюдается только конверсия, в случае индукции двухромосомных разрывов с частотой 2 х 10 наблюдается межхрсмосомная рекомбинация.

3. Установлено, что мутации в локусе zeste, белковый продукт которого отзечает за дальние взаимодействия в хромосоме, влияют на мутагенез в двойной еупернестабилькой системе y2nsscffie, являющийся следствием внутрихромосомной рекомбинации и конверсии. Наиболее сильное злияние сказывает мутация zv77h (полная инактивация гека zeste).

4. Показано, что мутации в семействе новых регуляторных генов enhanser of yellow - е(у)1; е(у)2; е(у)3 оказывают аналогичное z-мутациям влияние ка мутагенез в y2nsscœe системе, что доказывает участке этих генов в организации хромосом.

5. Обнаружено, что нутации в генах E(z)l, Su(z), Sem, Psc, продукты которых участвуют в кокпактизации хроматина, оказывают действие на вкутрихромэсомную рекомбинацию и конверсию в исследованной y^nsscme системе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Елагин В. А., Медведева Н. П., Георгиев П. Г. Система для изучения межхромосомной конверсии у Drosophila melanogaster. // Доклады РАЯ, 1993. Т. 332, N 4, С. 529-531.

2. Елагин В. А., Медведева Н. П., Георгиев П. Г. Мутации, влияющие на внутрихромоссмную рекомбинацию и конверсию в двойной y^n3sc4ie системе у Drosophila nelanogaster. // Генетика, 1S34. Т. 30, N 3, С. 330-335.

Подписано к печати

Отпечатано ка ротапринте в Свято-Тихоновском Богословском институте

1994 г.

Формат бумаги 30x4274

Объем 3 п. л.

Заказ 142 Тир. 100