Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное и генетическое исследование двух систем нестабильности, индуцированных инсерциями Р и новотранспозонов у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное и генетическое исследование двух систем нестабильности, индуцированных инсерциями Р и новотранспозонов у Drosophila melanogaster"

' ^ ■ДдУ1 На правах рукописи

\ УДК 575.22:595.773.4

Грачёва Елена Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ И ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДВУХ СИСТЕМ НЕСТАБИЛЬНОСТИ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ИНСЕРЦИЯМИ Р И НОВО ТРАНСПОЗОНОВ У ОПОЗОРИЛА MELANOGASTER,

Специальность- 03.00.26- молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1998

Работа выполнена в лаборатории генетических процессов Института биологии гена РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук П.Г. Георгиев

Оффициальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор медицинскох наук, профессор Л.И. Корочкин, доктор биологических наук Б.А. Кузин

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

'Защита диссертации состоится ¿О ноября 1998 года в // час. на заседании Диссертационного совета Д 200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 34/5.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова 32.

Автореферат разослан октября 1998 года

Ученый секретарь

Диссертационного совета _

канд.фарм.наук ГрабовскаяЛ.С.

Характеристика работы.

Актуальность задачи.

В настоящее время проблема регуляции транскрипции у эукариот является одной из центральных. Важную роль в формировании генотипического и фенотипического разнообразия играют транспозиции мобильных элементов. У Drosophila melanogaster хорошо описаны два мобильных элемента с короткими инвертироваными повторами и кодирующие транспозазу: Р элемент, индукция перемещений которого вызывает Р-М гибридный дисгенез, и hobo элемент, для которого известна система нестабильности Н-Е гибридный дисгенез. В настоящее время много известно о молекулярных механизмах транспозиций мобильных элементов, в то же время природа мутаций, индуцированных мобильными элементами, и механизм их возникновения изучены недостаточно. Настоящая работа посвящена изучению молекулярной природы полученных в лаборатории или выделенных из природных популяций дрозофилы мутаций, индуцированных Р и hobo мобильными элементами.

Ранее в нашей лаборатории в результате Р-М гибридного дисгенеза были получены супернестабильные мутации в локусах yellow, white, singed и ocelliless (Георгиев, 1990; Георгиев и Елагин, 1992). Супернестабильные мутации с высокой частотой давали производные мутации, которые сохраняли нестабильность. Локус yellow был выбран для дальнейшего изучения вследствие лёгкости его генетического и молекулярного анализа. Было показано, что супернестабильные мутации в yellow индуцированы инсерцией химерного элемента, содержащего уникальные фрагменты генома из одного или нескольких разных мест X хромосомы, с обеих сторон ограниченных делетированными копиями Р элемента, расположенными в одной или противоположной ориентации. Для супренестабильных мутаций характерны высокая нестабильность и широкий спектр фенотипического проявления аллельных вариантов, от полной инактивации гена до его суперэкспрессии. Такого рода мутации могут помогать в быстром подборе наиболее сбалансированной регуляторной системы для гена, что может играть роль в эволюции регуляторных систем уже существующих и вновь возникших в результате дупликации генов. Поэтому исследование механизмов

распространения супернестабильных химерных элементов по геному и разнообразия аллельных вариантов являются актуальными проблемами для понимания роли мобильных элементов в процессах эволюции.

Другая система нестабильности в локусе yellow была выделена из природных линий дрозофилы. Ранее в лаборатории проф. Голубовского было показано, что начиная с 1981 произошло локальное возвращение высокой мутабияьности и концентрации yellow аллелей в природной популяции Умань. Проведенный генетический анализ серии у аллелей (Захаров и Голубовский, 1985; Голубовский и др., 1987; Захаров и Скрибицкий, 1995) одназначно показал, что мутации индуцированы мобильным элементом. Целью данного исследования было выяснение молекулярного механизма, лежащего в основе моды на определенные мутации в природных популяциях дрозофилы.

Цель и задачи исследования.

Основная цель данной работы состояла в генетической и молекулярной •характеристике ранее полученных систем нестабильности.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) провести генетический и молекулярный анализ производных аллелей, полученных после мобилизации Р элемента в линиях, содержащих супернестабильные у мутации с известной структурой;

2) проанализировать природу двойной мутации в соседних локусах yellow и scute;

3) определить на молекулярном уровне причину вспышки мутабильности в природной популяции Умань.

Научная новизна и практическое значение работы.

В данной работе впервые проведен подробный молекулярный анализ супернестабильных мутаций в локусах у и sc. Показано, что двойные y-sc события возникают за счет инверсии, которая происходит между Р элементами, находящимися в соседних локусах yellow и scute. Таким образом, супернестабильные мутации могут появляться в новых локусах за счет инверсии, которая объединяет данный ген с геном, в котором уже есть химерный элемент.

Показано, что экспрессия гена yellow и scute в супернестабильных мутациях зависят от количества Р элементов, границ инверсии и структуры химерного элемента. На молекулярном уровне описаны основные варианты производных, полученных после мобилизации Р элемента. Ранее (Елагин и др., 1993) было показано, что характер нестабильности в двойной супернестабильной системе y-sc зависит от мутаций во многих генах, кодирующих регуляторные белки. Полученная новая информация о структуре производных мутантов даст возможность понять механизм влияния мутаций в регуляторных генах на процессы рекомбинации и конверсии, лежащие в основе мутационных изменений в двойной супернестабильной системе. Таким образом, могут быть созданы тест-системы для анализа роли различных белков в процессах рекомбинации и конверсии.

Наконец, в результате выполненной работы показана роль другого мобильного элемента, hobo, в индукции мутагенеза в природных популяциях. Этот результат дополняет и подтверждает полученные в лаборатории проф. Захарова результаты о роли мобильного элемента в индукции мутагенеза в природной популяции дрозофилы. Таким образом, полученная закономерность дает основание для более целенаправленного поиска причин мутагенеза в других выделенных из природы мутациях.

Апробация работы.

Работа апробирована на 38 Ежегодной конференции дрозофилистов в Чикаго, 1997 г., на 2ой отчетной конференции по программе Ховарда Хьюза в Варшаве, 1997 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликованы две печатные работы.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста,

включая таблиц, Y/рисунков и состоит из разделов: введение, обзор

литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, включающий источников.

Результаты и обсуждение.

1. Генетический анализ мутагенеза линии у*1".

Первой задачей данного исследования был генетический анализ спектра и частоты мутагенеза одного из ранее исследованных супернестабильных аллелей у+ш в локусе yellow. Молекулярный анализ показал, что у+т аллель индуцирован внедрением последовательности ДНК длиной 22.1 тпн, состоящей из трех уникальных районов, расположенных в разных участках Х-хромосомы, н фланкированной двумя идентичными копиями Р элемента, находящимися в одинаковой ориентации, противоположной направлению транскрипции гена yellow (Georgiev, 1997).

Мутагенез у+и индуцировался путем скрещивания с линией Р[Д2-3](99В), содержащей ген транспозазы Р элемента (Robertson et al. 1988). Мутагенез аллеля y+ns (Табл.1) имеет две особенности: 1) около 50% производных составляют стабильные производные аллели класса y+ws (y+mws) y+lws), в которых пигментация крыльев сильнее, чем тела; 2) нестабильные производные аллели не мутируют обратно в аллель y+ns, т.е. у4™ не имеет парного аллеля, что не характерно для большинства супернестабильных аллелей.

Стабильные y+ns производные были изучены (Georgiev et al. 1997) и было показано, что они связаны с делецией Р элемента. Наиболее представительным классом среди нестабильных производных были у2s аллели (табл.1), которые в свою очередь образовывали пару с аллелем у+ав (у25 О y+ms), т.е. наблюдались обратимые переходы между данными аллелями.

С помощью последовательных рекомбинаций была сконструирована линия y+as*, в которой заменена вся Х-хромосома. Был проведен анализ мутагенза полученного рекомбинанта (табл.1). Из таблицы видно, что спектр и частота мутагенеза изменились: появились новые производные- класс аллелей y+s, уменьшилась в восемь раз частота появления класса аллелей у25. Анализ мутагенеза производных у25* аляелей показал, что они имеют другой спектр

Таблица 1. Анализ мутагенеза y+ns и y+ns* аллелей и их производных.

двойные

У Е** производные аллели события Т

+S У у+ш5 У У* у*" ylbs y+mws y+lws у15 SC sn х10'3

y+ns 6722 - - 52 2 46 20 - - 18,5

у+ш* 17029 104 - 22 2 370 98 11 4 36,3

производные классы аллелей

У**(8) 4476 - 28 - 16 - 1 - - 10,3

5^(10) 5053 - - - 71 - 32 - - 27,8

y+s*(6) 4509 - - 4 - - - - - 1,3

Примечание. Е**- Общее число Х-хромосом, проанализированных в потомстве самцов с изучаемым аллелем. Т- частота мутагенеза, у*- обозначены линии у+1К и её производные после проведения рекомбинации. Цифра в скобках определяет количество проанализированных независимо полученных аллелей, имеющих одинаковую частоту и спектр нестабильности. Жирным шрифтом выделены стабильные классы производных аллелей. Жирным шрифтом с подчеркиванием выделены аллели, которые мутируют к аллелю, имеющему фенотип, сходный с родительским аллелем (такие аллели получили название парных аллелей).

производных аллелей, чем у25, и не образуют пары с y+s аллелем (табл.1). С другой стороны, в y+ns* аллеле, по сравнению с другими у-аллелями (в том числе и исходным y+ns), на порядок увеличилась частота двойных событий- аллельный переход в локусе yellow в сочетании с появлением мутаций в новом локусе. Большая часть новых мутаций возникла в ближайшем к гену yellow генном комплексе achaete-scute, отвечающем за развитие периферической нервной системы и формирование волосков и щетинок дрозофилы (Campuzano et al., 1985). Было получено пять двойных событий, в трех из которых мутационный

переход в локусе yellow сопровождался возникновением мутации в локусе scute, а в двух случаях мутация возникала в локусе achaete.

Аналогичные опыты были проведены с другими супернестабильными мутациями у2*, у05, у*"5, полученными в той же системе супернестабильных у-аллелей (Георгиев и др., 1992).

В отличие от у41" аллеля спектр и частота мутагенеза других у-аллелей после замены Х-хромосомы рекомбинацией не изменялась, были получены те же парные аллели, что возникали до рекомбинации. Не было получено двойных y-sc мутаций. Таким образом, высокая частота возникновения двойных мутаций в соседних локусах yellow и scute является характерной особенностью y+ns аллеля.

2. Генетическое и молекулярное исследование двойных супернестабильных мутацийy2msc*, y26ssc*.

Полученные независимо две двойные супернестабильные мутации (y^sc*, y2bssc*) были проанализированы на нестабильность. В таблице 2 даны результаты мутагенеза только по у аллелям. Основным отличием мутагенеза этих аллелей от родительского у+к аллеля является высокая частота появления нестабильных производных аллелей. Кроме того, оба аллеля с высокой частотой мутировали к аллелю с исходным фенотипическим проявлением y+ns, создавая тем самым пары аллелей, что является характерной особенностью супернестабильных систем (Георгиев и Елагин, 1992).

Для выяснения механизма возникновения двойных у и sc мутантов был проведен сравнительной блот-анализ по Саузерну исходного y+ns алелеля и двух его производных y^sc* и y^sc*. Структура исходной мутации y+ns показана на рис.1. Мутация у+ш вызвана инсерцией, состоящей из двух идентичных и одинаково ориентированных дефектных копий Р элемента (1,2 тпн длиной) и внутренней последовательности длиной 20 тпн, собранных как минимум из трех разных участков X хромосомы (Georgiev et al., 1997). В мутации y+ns также присутствует мобильный элемент МДГ4 на расстоянии 700 по от начала транскрипции гена yellow.

Таблица 2. Анализ мутагенеза у-аллелей в двойных супернестабильных системах y-sc.

У E** производные аллели Т

y+s У- У У y2ns y+mwbs у" х10"3

y^sc* 970 - 7 1 3 4 - - 5 19,6

y^sc* 3716 - И 3 2 - - - 8 6,4

производные аллели, полученные из y+ns sc

y^sc* 2343 4 21 1 7 - - - 1 14,5

y^sc* 3395 1 и - 2 - - - 14 9,1

Примечание. См. примечание к табл. 1.

Исходная линия y+ns и взятые в анализ две производные линии с мутациями y^sc* и y^sc* отличаются по рестриктной карте инсерции в локусе yellow (рис.2). При рестрикции по Kpnl или BamHI/Bglll видно, что происходит изменение длин рестриктных фрагментов со стороны гена yellow . В то же время длина рестриктных фрагментов при обработке рестриктазами ВатШ и Hindin (рис.2) или ВатШ и Xhol не изменяется. Рестриктазы Hindffl и Xhol находятся в делегированной копии Р-элемента и размер фрагментов ВатШ-HindHI и BamHI-XhoI служит для определения присутствия Р элемента на концах инсерта. Таким образом, в двойных производных Р элемент сохраняется на конце химерного элемента, в то же время происходят изменения в центральной части инсерта.

Далее двойные мутации были изучены более детально с помощью зондов из yellow (зонд Нш<1Ш-ВатШ) и scute (зонд Bglll-EcoRI) локусах. ДНК этих линий была обработана разными комбинациями рестриктаз и, после этого, один и тот же фильтр гибридизовался с зондами из локусов yellow и scute. Оказалось, что часть фрагментов, которые получены с помощью рестриктаз, отсутствующих в Р элементе, гибридизуются одновременно с зондами из локусов yellow и scute. Эти результаты предполагают наличие инверсии между локусами yellow и scute.

МДГ4

S R ^ G

-I—\zzzzzzzzzi—

,+ns

¿l i ¿m

I

/

Vе

Рис.1 Схематическое представление исходной мутации у+П! и производной комбинации мутаций y^sc"*. В масштабе показан только район инсерции в генах yellow и scute. R- EcoRI, Н- HindlH, G- Bglll, X- Xhol, P- PstI, В- BamHI, L-Sall, S- Sacl. Незаштрихованные прямоугольники показывают структуру и размер Р элементов. Геномные фрагменты ДНК из гена yellow и из инсерции, используемые в качестве проб для мечения, показаны чёрными прямоугольниками, а фрагменты из гена scute- заштрихованными прямоугольниками. Черными горизонтальными стрелками показаны направления транскрипции генов yellow и scute.

1 2 3 4 5 б

■t—15,0 .—7,6

4 6,5

—3,4 2,8

7 8 9

1,5

1,8

•0,3

Рис. 2. Результаты гибридизации по Саузерну ДНК, выделенной из исходной линии у4"5 (2, 5, 7) и производных линий у2 msc (3, 6, 8) и y^sc (1, 4, 9). ДНК была рестрицирована ферментами BamHL/Bgin (1-3), Kpnl (4-6), BamHL/Hindni (7-9). Полученные фильтры далее гибридизовались с меченой пробой Н/пёШ-ВатШ из локуса yellow. Стрелками указаны размеры соответствующих полос в тпн.

4. Клонирование линии y2,ascm'.

Для более детального понимания процесса возникновения двойных супернестабильных мутаций было проведено клонирование и подробный молекулярный анализ комбинации мутаций ylnsscm. С этой целью была создана фаговая библиотека из ДНК линии y^sc™ с помощью недорестрикции по Sau3A . Фрагмент HindIH-ВатШ из локуса yellow и фрагмент BglO-EcoRI из локуса scute были использованы в качестве меченных проб для скрининга библиотеки. В результате было выделено десять рекомбинантных фагов, из которых четыре фага гибридизовались с обеими пробами, два- только с пробой из локуса yellow и четыре только с пробой из локуса scute. Наличие рекомбинантных фагов, которые гибридизуются с обеими пробами позволило подтвердить предположение о существовании инверсии между генами yellow и

scute, что впоследствии было доказано детальным анализом рестрикционной карты рекомбинантных фагов и сиквенсом отдельных районов. Структура района AS-C линии y^sc™ представлена на рис.1.

В линии y^sc™ мобильный элемент МДГ4 и химерная инсерция с двумя делегированными Р элементами (Р1 и Р2) на концах сохраняется не измененной по сравнению с исходным аллелем y+ns. Однако, непосредственно за правым Р2 элементом химерной инсерции следует копия Р-элемента (РЗ), длиной 2.9 тпн. Ориентация РЗ противоположна Р1 и Р2. Непосредственно за РЗ элементом следует последовательность из локуса scute. С другой стороны инверсия содержит дефектную копию Р элемента (Р4, 2.2 тпн длиной ), фланкированную последовательностями из yellow и scute. Размер инверсии y-sc- около 40 тпн. Таким образом, довольно короткий участок хромосомного района yellow-ahaete-scute линии y^sc™ содержит четыре копии Р-элемента (рис. 1).

5. Молекулярное исследование основных производных y^sd", полученных после мобилизации Р элемента.

Среди производных y^sc™ наиболее часто возникали три новых комбинации мутаций y+nssc+, y'sscme и y^sc™, которые были выбраны нами для дальнейшего анализа.

Структуру производных аллелей анализировали с помощью блот-гибридизации по Саузерну.

Комбинация аллелей y+nssc+ имеет фенотипическое проявление как исходный аллелель у+ш. Всего было проанализировано одиннадцать мутаций y+nssc+. Все они являлись результатом реинверсии, проходящей по концам Р элементов, что объясняет одновременное изменение фенотипа у и sc мутаций. В зависимости от того, какой Р элемент участвует в рекомбинации, в локусе scute остается одна или две копии Р элемента y+nssc+, двойные мутанты остаются высоко нестабильными и дают с частотой 1-5x10"3 производные y^sc™. Таким образом, описанные ранее парные аллели, которые являются одной из характерных черт супернестабильных мутаций, могут возникать в результате процесса инверсии-реинверсии между удаленными участками генома и опосредованной рекомбинации между последовательностями Р элемента.

Другим наиболее часто встречающимся классом производных линии fv является комбинация аллелей ylsscme. В этой комбинации аллелей меняется только у-фенотип: происходит полная инактивация гена yellow. Пять независимо полученных аллельных комбинаций ylsscme отличаются от родительской комбинации аллелей только делецией Р4, расположенного рядом с геном yellow. С помощью ПЦР был клонирован район инсерции Р4 элемента в ylsscme мутантах. Далее клоны были непосредственно секвенированы с использованием набора для прямого секвенирования продуктов ПЦР (Amersham). В результате оказалось, что у всех пяти производных на месте инсерции осталось 12-17 нуклеотидов от терминальных инвертированных повторов Р элемента. ylsscme производные отличаются высокой стабильностью -фенотипические изменения наблюдаются с частотой ниже чем 1х10"3.

Третий класс производных, y^sc", встречается несколько реже. Было проанализировано шесть независимо полученных комбинаций y^sc™. В этой комбинации аллелей изменяется у и sc фенотип одновременно. Но Саузерн блот-гибридизация показала, что все они связаны с делецией только Р2 элемента. Этот вывод был подтвержден с помощью ПЦР клонирования и прямого сиквенса. Такми образом, Р2 элемент определяет транскрипцию сразу двух генов. y*scw комбинация мутаций сравнительно стабильна, но с низкой частотой, 1х10"3, дает производные аллели y+nssc+, которые возникают в результате рекомбинации между РЗ и Р4 элементами. y+nssc+ производные, в свою очередь, с частотой 0.5x10"3 дают производные у2sscw. Таким образом, эти аллели образуют также парные аллели, которые переходят друг в друга, но с более низкой частотой.

6. Обсуждение полученных результатов.

Для объяснения существования парных супернестабильных мутаций, переходящих с высокой частотой друг в друга, высказывалось предположение о существовании рядом двух частично гомологичных химерных инсерций, одна из которых вызывает видимую мутацию, а другая- нет (Георгиев и др., 1992; Георгиев и Елагин, 1990а). Все свойства мутагенеза супернестабильных мутаций объяснялись рекомбинационными процессами, происходящими между двумя Х-инсерциями. Мутация y+ns по своим свойствам отличалась от обычных

супернестабильных мутаций: ни одна из ее производных не ревертировала к у*1* фенотипу. У производной у*™*, полученной в результате двух рекомбинаций, удаливших большую часть Х-хромосомы, изменился характер мутагенеза: производный класс у25 утратил способность образовывать пару с y+ras. Эти результаты можно объяснить тем, что в результате рекомбинации нам удалось удалить второй неидентнфицированный Х-инсерт. Отсутствие рядом другого X-инсерта также объясняет усиление на несколько порядков частоты появления двойных мутационных событий.

Комбинация мутаций y^sc™ возникла из исходной мутации y+ns, которая связана с инсерцией в регуляторную область гена yellow химерного элемента, ограниченного делегированными копиями Р элемента. Новая комбинация мутаций возникла в результате инверсии между копиями Р элементов, расположенных в соседних локусах yellow и scute. Можно предположить, что две копии Р элемента предсуществовали в области гена scute в линии y+ns. Границы инверсии фланкированы, с одной стороны, двумя Р элементами и, с ■другой стороны, одной копией Р элемента. Большинство наблюдаемых событий связаны как с вырезанием одиночной копии Р элемента, так и с реинверсией, происходящей вследствие рекомбинации между концами Р элементов, находящимися в генах" yellow и scute. В результате инверсии- реинверсии образуются пары комбинаций аллелей: у2'"sc™ <-> y+nssc+ (высокая частота переходов) и y^sc" о y+nssc+ (низкая частота переходов), y^sc1"0 и y2nsscw различаются по наличию Р2 элемента, из этого следует, что Р2 элемент определяет не только экспрессию гена yellow и scute, но и частоту аллельных переходов.

В настоящее время большинство фактов предполагает, что при вырезании Р элемента возникает двуцепочечный разрыв, который, в большинстве случаев, репарируется на матрице сестринской хроматиды (Engels et al., 1990). Приблизительно в 15% случаев, матрицей при репарации служит гомологичная хромосома. Наличие гомологичной последовательности ДНК поблизости от Р элемента может привести к тому, что вырезание идет по другому механизму. В подавляющем большинстве случаев Р элемент вырезается не точно - на месте инсерции остается дупликация 8 по сайта-мишени и часть 31 по терминального инвертированного повтора (5-18 по). Также между остатками двух

инвертированных повторов могут находиться некоторые избыточные последовательности (Takasu-Ishikawa et al., 1992; Staveley et at., 1995). Последний факт можно объяснить с помощью модели шпилыш, по которой в точках разрыва свободные концы ДНК лигируются и репликация гетеродуплекса дает два реципрокных продукта (Takasu-Ishikawa et al., 1992). Объяснением же того, что после вырезания Р элемента на его месте остаются концы инвертированных повторов, является, что с этими последовательностями связывается белок ЩВР (Staveley et al., 1995; Rio and Rubin, 1988). Белок IRPB связывается с концами P элемента и защищает их от деградации, когда вследствие вырезания Р элемента возникает двуцепочечный разрыв. Общей особенностью двух моделей является активное взаимодействие между концами Р элемента после его вырезания.

Возникновение мутантных производных ylsscme и y2sscw связано с вырезанием единственной копии Р элемента. В двух случаях была также обнаружена избыточная последовательность между остатками двух инвертированных повторов. Таким образом, вырезание Р элемента происходит из-за взаимодействия между концами Р элемента после того, как транспозаза произведет двуцепочечные разрывы. Далее происходит процесс дотирования или IRBP опосредованная застройка бреши с использованием концов Р элемента в качестве матрицы.

B+I1S + г»

случае реинверсии у sc , число и структура Р элементов не изменяется у самцов, что трудно объяснить на основе модели застройки бреши. Было показано, что Р элементы в гомозоготных районах двух хромосом индуцируют рекомбинацию у самцов на уровне 10-20%, что на порядок выше, чем когда Р элемент присутствует только в одном из гомологов (Sved et al., 1991). Во всех описываемых случаях Р элемент неподвижно присутствует в исходном сайте (Sved et al., 1991). Таким образом, когда концы различных Р элементов находятся рядом, транспозаза может индуцировать вместо вырезания Р элемента прямую рекомбинацию между концами двух различных Р элементов. Если Р элементы локализованы на одной и той же хромосоме, рекомбинация приводит к инверсии.

6. Молекулярное исследование аллелей у2, выделенных из природной популяции дрозофилы г. Умань.

Начиная с 1981 произошло локальное возвращение высокой мутабильности и концентрации yellow аллелей в природной популяции Умань. Детальный генетический анализ серии аллелей показал следующее (Захаров и Голубовский, 1985; Голубовский и др., 1987; Захаров и Скрибицкий, 1995): 1) во время вспышки преобладали гипоморфные аллели у2 (желтое тело, чёрные щетинки); 2) мутирование носило строго аллелоспецифичный характер и проходило только в двух направлениях- от у2 к у+, и от у+ к у2; 3) аллели у2 из природы, будучи сходными по направлению мутирования, отличались по степени нестабильности мутантных и нормальных производных, степени выраженности мутантного фенотипа и по комплементационным свойствам; это указывает на неидентичность аллелей в смысле их происхождения и на высокое мутационное давление в отношении локуса yellow.

На первом этапе работы было проведено картирование места инсерции мобильного элемента, который вызывал появление нестабильных у аллелей. Для этого ДНК мутантных мух линий 700, 715, 717, 720, 735, 754, 769 была обработана рестриктазами Hindin, Xhol, EcoRI, ВатШ+BgUI, перенесена на фильтры и сгибридизована с радиоактивными зондами, полученными на основе фрагментов ДНК из разных зон локуса yellow (рис.3).

В результате проведенного анализа оказалось, что в линиях 715 ,717, 769 все изменения находятся между рестриктными сайтами Hindlll-BamHI в районе слева от промотора гена yellow. В линиях 700, 735, 754 произошла делеция всей регуляторной области гена yellow.

Дальнейший анализ у2 мутаций в линиях 715, 717, 769 показал, что на обоих концах инсерции во всех трех линиях находятся сайты узнавания для рестриктаз Xhol и Pstl. При анализе рестриктных карт известных мобильных элементов оказалось, что такая комбинация рестриктных сайтов характерна для мобильного элемента hobo. Для проверки этого предположения была поставлена пробная амплификация ДНК с использованием уникальных

hobo

yellow

SH

GHP

H BU

R

U^lll Q-JJJl

r

a

1 тпн 6

в

Рис.3. Схема строения локуса yellow. Заглавными буквами обозначены: В-ВатШ, G-Bgin, H-Hiniffll, P-PstI, R-EcoRI, S-Sall, U-PvuII. Фрагменты, с которыми проводилась гибридизация: a- Sall-BglH, 6-Hindl3I -HindQI, B-HindHI-ВашШ, • г-BamHI-EcoRI. Стрелка показьшает начало и направление транскрипции. Треугольник- место инсерции. Белый овал- энхансер тела, тёмный- энхансер крыльев.

праймеров из hobo (№105 и №106) и из локуса yellow (№34 и №28). В результате ПЦР с праймерами 105+34 и 106+28 были получены продукты ПЦР ожидаемого размера. Затем амплифицированные фрагменты ДНК были просеквенированы. Обнаружено, что hobo встроился во всех трех у2 мутациях в одно и то же место- 2744 по карте yellow (Geyer et al., 1986), при этом произошла дупликация восьми нуклеотидов CACTGAAA. Результаты гибридизации проб ДНК, рестрицированной по ВашШ-BglII свидетельствуют о наличии инверсии, на границе которой находятся hobo элементы. Существование инверсии в линиях 715, 717, 769 легко объясняет проявление фенотипа у2 (желтое тело и крылья). Энхансеры, активизирующие проявление гена yellow в теле и крыльях, находятся на другом конце инверсии и, следовательно, не могут уже активировать транскрипцию гена yellow. По полученным радиоавтографам мы определили, что у всех трех линий hobo имеет идентичную структуру и у них отсутствуют сайты для рестриктаз EcoRI, HindHI, Sali, но присутствуют для PvuII. Таким образом, все у2 мутации вызваны инсерциями в одну и ту же позицию одинаковых по рестриктной карте hobo

элементов. При этом, на концах инверсии hobo элементы находятся в противоположной ориентации по отношению друг к другу.

hobo

hobo

yellow

i i# и О—г

s н

GH

H В

р о

UOP

j/j^b.

н

HG

Н S

Рис.4. Схема строения инверсии (линии 715,717, 769). Сплошная линия показывает локус yellow, пунктирная- неизвестный район X хромосомы. Выделенный участок-фрагмент, который использовался для гибридизации. Треугольники со стрелками отмечают места встраивания hobo и их ориентацию. Также см. обозначения к рис.3. Верхняя часть схемы показывает предполагаемую структуру аллеля перед тем, как произошла инверсия. Нижняя-изменения в локусе yellow после инверсии.

Результаты блот-гибридизации по Саузерну показали, что линии 700, 735 и 754 имеют идентичные по рестриктной карте и ориентации hobo в том же районе гена и делецию регуляторной области, дистальнее от места инсерции. Для выяснения места инсерции была проведена амплификация ДНК с использованием праймеров №34 и №105. Полученные фрагменты ДНК ожидаемых размеров были просеквенированы. Во всех трех линиях место инсерции hobo идентично с линиями 715, 717, 769. Для определения размера

делеций была проведена гибридизация с зондами, полученными из ДНК фрагментов расположенных дистальнее гена yellow. Все три линии имеют разный размер делеций, но во всех случаях она захватывает район энхансеров тела и крыльев (рис 5).

Н R

hobo

S Р GHP

754 735 700

Рис.5. Размеры делеций в линиях 700, 735, 754. Обозначения как на рис.3, 4. Толстые линии внизу схемы показывают размеры делеций.

Проведенный молекулярный анализ позволяет сделать предварительный вывод о пусковых механизмах локальной вспышки мутаций yellow в популяции Умани, которая привела к повышению их популяциокной концентрации. Эта вспышка обусловлена, несомненно, активацией hobo-транспозона.

Важным свойством hobo элементов является их способность к локальным транспозициям на близкие расстояния. Было показано, что когда hobo элементы находятся в разной ориентации, то они с высокой частотой индуцируют инверсии участка ДНК, заключенного между ними.

Если hobo элементы находятся в одинаковой ориентации, то происходит делеция фрагмента ДНК, заключенного между ними (Lim, 1988; Sheen et al., 1993). Аналогичная ситуация, видимо, обнаружена и для серии аллелей yellow из природы, вызванных внедрением hobo. Переходы мутант- норма в линиях 715, 717 и 769 связаны с инверсиями и реинверсиями по концам локализации двух усеченных копий hobo. А в случае линий 700, 735 и 754 инсерция hobo

сопровождалась делецией дистального участка локуса, в пределах которого

локализован энхансер.

Выводы:

1. Показано, что парные аллели, основная черта полученных супернестабильных систем, образуются вследствие инверсии- реинверсии между Р элементами, расположенными в разных локусах X хромосомы. Стабилизация (низкая частота дальнейших аллельных переходов) супернестабильных у аллелей в данной супернестабильной системе связана с делецией Р элемента.

2. Клонирована и изучена структура y^sc™ и ее основных производных, что дает возможность использовать данную систему для тестирования роли различных генов в процессах рекомбинации и конверсии.

3. В настоящей работе впервые дано молекулярное подтверждение, что все нестабильные аллели у2 из природной популяции Умань вызваны инсерциями мобильного элемента hobo в одно и тоже место в регуляторном районе гена yellow. Это дает основание предполагать, что в популяции происходит распространение одного аллеля имеющего инсерцию hobo элемента, а не повторные инсерции hobo элемента в локус yellow.

4. Показано, что ранее наблюдаемые аллельные переходы /оу связаны с инверсией и реинверсией между двумя hobo элементами имеющими разную ориентацию и расположенными в гене yellow и теломере X хромосомы. Стабильные у2 аллели возникают в результате делеции энхансеров гена yellow, расположенных между одинаково ориентированными hobo элементами в локусе yellow и дистальной части X хромосомы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Е.М. Грачева, М.Г. Гаузе, В.А. Могила, П.Г. Георгиев. Молекулярный анализ двойной супернестабильной системы y^sc™ // Генетика, 1998. Т. 34, № 3, С 343- 348.

2. Е.М. Грачева, И.К. Захаров, М.А. Волошина, П.Г. Георгиев, М.Д. Голубовский. Вспышки мутаций гена yellow в природной популяции Drosophila melanogaster связаны с инсерцией транспозона hobo //Генетика, 1998. Т. 34, № 4, С 462-468.