Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие энханстеров, промоторов и инсуляторов в модельных системах на основе мобильных элементов Drozophila melanuguster.

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие энханстеров, промоторов и инсуляторов в модельных системах на основе мобильных элементов Drozophila melanuguster."

' На правах рукописи

л " УДК 575.22:595.773.4

с ^

ГАУЗЕ Мария Георгиевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭКХАНСЕРОВ, ПРОМОТОРОВ И ИНСУЛЯТОРОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ Пго-оркИа тс1атц>и*1сг.

Специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1998

Работа выполнена в лаборатории регуляхдаи генетических процессов Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук П.Г.Георгиев.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Л.ИЛСорочкин, доктор биологических наук, профессор В.Г.Мнтрофанов.

Ведущая организация:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «.У;...» ...(Х^Ш&ЖМг...... 1998 года в «. часов на заседании

Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул.Вавилова 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117334, Москва, ул.Вавилова 32

Автореферат разослан «,

.1.» ....МО/Ш&.

1998 года

Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук

Грабовская Л.С.

Общая характеристика работы.

Лкчуальносгь проблемы. Гетш оукариот имеют сложно устроенные регуляторные области, содержащие большое количество регудяторпых элементов. Энхансер и промотор юна взалмолеГгсгвукп между собой, находясь иногда на больших расстояниях друг от друга, часто превышающих сотни тысяч пар нуклеотидов. Нссмо1ря на такие дистанции, энхансер специфически активирует промотор только «своего» гена и не взаимодействует с близлежащими промоторами других генов. Существенным фактором, обеспечивающим правильное взаимодействие между энхансером и промотором, является взаимная специфичность белков, которые с ними связываются. Кроме того, способствовать изоляции промотора от чужеродных эпхансерев может наличие в геноме з\кариот инсуляторных элементов,

Писулятор - это цис-регуляторный элемент. к-oiopuíí блокирует взаимодействие мевду энхансером и промотором, если он расположен между ними. При этом ни энхансер, ни промотор сами по себе не теряют своей функциоанльной активности. Характерным свойством инсуляторныг последовательностей является их способность делан, экспрессию iena в конструкции, фланкированной инсуляторами, независимой от места инсерции конструкции в геном.

В настоящее время наиболее изученным инсулятором является su(Hw)-связываюншй район, который входит в состав ретротранегюзона мдг-4 DrosnphUa melanogaster. su(IIw)-círei>maioi4iiii район состоит из 12 октамериых сайтов связывания для белка su(Hw); уменьшение числа сайтов связывания приводит к ослаблению ипсуляторной функции. Было показано, что введение мутации su(Hw) приводит к супрессии мутантного фенотипа, из чего следует, что белек su(Hw) ответствен за мутантный фенотип, возникающий вследствие внедрения

инсулятора. Другим белком, участвующим в работе иисулятора, является mod(mdg4). Хотя оба белка клонированы и определена их структура, не существует единого мнения о возможном механизме действия su(Hw)-HHcynaTopa. Поэтому создание удобных генетических моделей для изучения свойств инсулятора in vivo является актуальной задачей.

В данной работе были получены адекватные генетические модели, позволившие выявить новые аспекты взаимодействия энхансеров с промотором, а также уточнить механизм действия инсуляторных элементов.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования являлось изучение взаимодействия между регуляторными элементами, находящимися на больших расстояниях друг от друга с помощью модельных систем на основе мобильных генетических элементов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) изучить взаимодействие между энхансером и промотором в системе, где энхансер удален от промотора и между ними находятся два других гена;

2) показать участие регулягорных белков zeste и е(у)2 в организации взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях;

3) изучить влияние мутаций в генах zeste, е(у)1 и е(у)3 на инсуляторные свойства ;ш(Н\у)-связыБающего района;

4) молекулярно и генетически охарактеризовать систему нестабильности в локусе yellow на основе мобильного элемента hobo;

5) изучить влияние мутаций в генах su(Hw) и tnod(mdg4) на фенотипическое Проявление производных, полученных в системе hobo нестабильности.

Научная новизна п практическое значение работы. Впервые показано, что знхансер локуса scute D.melanogaster может активировать промотор своею юна. даже находясь в локусе yellow, т.е. когда между «своими» энхансером и промотором оказываются промоторы двух других генов.

Показано участие белков zeste и е(у)2 в организации взаимодействии между здхансерсм гена жеиге и промотором гена seufe. Па примере базового аллеля se0' мы продемонстрировали, что мутации в генах zeste, е(у)1 и е(у)3 частично супрессируют инсуляторные свойства 8и(Н\у)-связывающего района, что позволило предположить вероятную зависимость инсуляции от присутствия этих белков.

Кыли изучены мутации в гене yellow, индуцированные micepuueií мобильного элемента hobo. Впервые показано, что частым собьпнем при .чем являйся дупликация района, расположенною между двумя однонаправленными kobo элементами.

Показано, что взаимодействие между 5и(11уу)-связыкагопшми районами можег приводить к нарушению инсуляции. Изучение производных позволило сделать новые выводы о механизмах действия белков su(Hw) и mod(mdg4].

Подученные результаты предполагают, что инсулятор может действовать автономно. Это позволяет использовать а1(Нте)-инсулятор в качестве последовательности, обеспечивающей независимую экспрессию jpaucreHa в генно-инженерных конструкциях не только у дрозофилы, но и в друшч органи змах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 36-й Конференции по дрозофиле (36th Annua! Drosophila

Research Conference 1995), на межлабораторном семинаре (1996) ИБГ РАН, а также на двух конкурсах научных работ ИБГ РАН 1997 и 1998.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на ........... страницах,

включая ....V?..... таблиц, Л... рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы из............наименований.

Результаты исследовании.

л- 2 D1 aG

Обе исследованные нами системы возникли на основе линии у sc iv . Мутация у2 вызвана внедрением мобильного элемента МДГ4 перед геном yellow, отвечающим за пигментацию у дрозофилы. Инсерция МДГ4 произошла между промотором и энхансерами, отвечающими за специфическую активацию 1ранскрипции гена в кутикуле тела и крыловых пластинках. МДГ4 содержит su(Hw) инсулятор, который блокирует действие вышеуказанных энхансеров, что определяет желтую окраску тела и крыловых пластинок у2 аллеля. Мутация scD! также вызвана инсерцией МДГ4 между геном scute, отвечающим за развитие сенсорных органов, и его энхансерами.

I. Анализ йобо-швдуцированных мутаций в локусеyellow ydh' , базовый аллель системы, содержит su(Hw)-CBH3bmawim«1 район, окруженный инсерциями двух /»¿»-элементов. Базовый аллель ydh' спонтанно

2 DJ aG

возник из линии у sc w в результате дополнительной инсерции двух мобильных элементов hobo в район гена yellow (Рис. 1). По сравнению с родительским аллелем у2 у мух с фенотипом ут наблюдалась слабая

пигментация крыловых щетинок, а также мутантпая окраска грудных н ножных щетинок (Габл.1).

ТАБЛИЦА 1. Фенотипы yellow аллелей, полученных в систем hobo нестабильности!, влияние мутации su(IIw).

Пигментация

V аллели

Гели Крылья

_Щетннки

11

KP

Кр

2

У ydh*

' г h*

У

yinh32

ylh*

У1Н

2hm 2М15

1(5) 1(5) 5(5)

4 3(5) О

Kl)

1(5) 2(5) 5(5)

4 3(5) О 1(2)

Щетинки разделены на 1рудные (Гр), полотые (Ii), крыловые (Кр). и ¿рюшные (Ър) Числа в скобках показыиаюг, какое действие оказывает на фенотип у аллелей мутаптпая комбинация su-'/Hw,^/ su(//и</. Для определения фенопша \eïïov. вровень плгментащш и различных ткапях взрослых мух оцеипвалп шзуалыю на 3-5 дневных самцах, рлвипаттгхса при 25°С.

dh* , dhl dkl2 dh!9 dh21 dh?J, IhHill IhlJ lh!4 Ш15 lhl7 rh* J <y . У , У . У . У I У (i ■ У . у , У - } ), .1 , rhl rh2 rhJ rh7 rA9. О' -У •>' Л ,} ).

Классификация аллелей у представлена в paGoiax (GEORGIEV et at. 1992; GEORGIEV ¿i al. 1997). у аллели одного фенотипа обозначены одинаковым набором букв в падстрочнике. Буквы в надстрочнике обозначают: "h", аллель был получен и системе hobo нестабильности; "2".

тпмешаиия тела крыльев у мух íaKoro аллсля такая же как у му\ i" ; ",F',"!"."ni". "/" -ншменгация крыльев у мух соопитсmyer уровню 2+, 3+, 4+ и 5+, соответственно. Числа в

надстрочнике аллеля объясняют его происхождение. Например, аллель у является

mu

производным адледя^) _

В результате клонирования с последующим ссквенирсванием мы выяснили, 410 один hobo элемент, обозначенный как ' hobo-l (yellow проксимальный), встроился в интрон гена yellow в позиции +875 но отношению к сайту начала транскрипции (Geyer and Corees 1987; Martin et al. 1989). Снижение пигментации грудных и ножных щетинок может являться результатом частичной инактивации энхансерного элемента, отвечающего за экспрессию гена yellow в щетинках и находящегося в районе инсерции hobo элемента. Второй hobo

(yellow дисталъный), встроился в позиции -2464 в район энхансера, отвечающего за экспрессию в крыловых пластинках (Geyer and Corees 1987; Martin et al. 1989). В обоих случаях 2.2 тпн hobo элементы имеют одинаковую делению и фланкированы 8 пн дупликациями, СТТТАТАС и ATATCTAG соответственно. hobo элементы имеют одинаковую ориентацию, которая противоположна направлению транскрипции гена yellow (Рис. 1).

hobo 2 hobo 1

<Z wing blade enhancer

4ЯЩ» body cuticle enhancer bristle enhancer

i_i ikb

Рис. 1. Структура локуеа yellow в аллеле.)'""1'

Два экзона гена yellow показаны более жирными черными линиями. Стрелка определяет направление и место начала транскяпции. Мобильный элемент gypsy встроился в -700пн от сайта начала транскрипции. Стрелки в прямоугольниках соответствуют ДКП мобильного элемента gypsy, показано их направление. Окружности черного цвета соответствуют Su(Hw)-связывающему району. Энхансеры гена yellow обозначены при помощи овалов. Жирными стрелками показаны hobo элементы и их направление. R,fir«RI; HJIindlli] G,BgHl; X,Xhol; BJiamlll; S,Sa,1; N.NcoL Фрагмента геномной ДНК, использованные в качестве зондов, обозначены закрашенной линией.

Для уточнения роли мобильных элементов hobo в экспрессии гена yellow мы исследовали мух ydh', несущих комбинацию мутаций которая практически полностью инактивирует ген su(Hw) (Harrison et at. 1993). У мух уш,'\ su(Hw)2/s\x(Hw)' наблюдался уровень пигментации дикого типа в

кутикуле и крыловых пластинках, но сохранялась мукиппая окраска грудных и ножных щетинок (Табл. 1). Из этого следует, что в аллеле ум' 5и(Н\\')-инсулятор продолжает блокировать энхансеры тела и крыльев. Инсерция двух hobo элементов приводит к слабой активации экспрессии гена yellow в крыльях и репрессирует в 1рудных и ножных щетинках.

//оАо-индуниропанныс нсрссгройки часю ассоциированы с д>плик-ацниуш между двумя hoho элементами. Следующей задачей данного исследования был анализ перестроек, индуцированных hobo элементом. Мобилизацию hobo элемента проводили путем скрещивания ydhl самцов, содержащих много hobo элементов, с C(l)RM,yf самками, которые не имеют hobo элемента. В F2 поколении после исходного скрещивания были получены диа основных класса производных аллелей (Табл. 1 ): у"' (полная инакшпаиня гена u'How) и (нормальная окраска кутикулы и крыловых пластинок, мутантш.ш фенотип грудных и ножных щетинок).

у'1' аллели представляли собой делешно внутренних последовательностей гена yellow, в результате чего экспрессия гена yellow была полностью ннактивирована.

Шесть независимо полученных аллелей у'1' по результатам Саузерн блот анализа имели одинаковое строение. Один из аллелей, у,м, был прокяонирован. Аллель угАг тюзпнк в результате дупликации района, расположенною между ;гиумя hobo элементами (Рис. 2). Все повторяющиеся элементы в аллеле у'"' и других мутациях, связанных с дупликациями, пронумерованы в проксимально-дистальном направлении по отношению к гену yellow (hobo-1, 2 и 3; gypsy-1 и 2 и тд.).

ДНК мух линии /А7 отличалась по результатам Саузерн блот анализа от других аллелей Аллель y'h7 имеет делецшо, начинающуюся от hobo-3 и

частично захватывающую gypsy-2, оставляя 5и(Н\у)-связывающий район последнего без изменений (Рис. 2). PCR-клонирование концов делеции с использованием праймеров из hobo (hi) и gypsy (gl), сопровождавшееся секвенированием, показало, что делетированы последовательности между 5' концом hobo-З элемента и сайтом 3428 последовательности gypsy, в соответствии с картой gypsy, представленной Marlor et al. (1986).

Таким образом, дупликация района, фланкированного двумя hobo элементами, является основным мутационным событием в системе.

Потеря инсуляции в аллелях у'К Как было показано выше, в аллелях y'h дупликация, затрагивающая hobo-2, энхансеры тела и крыльев, gypsy мобильный элемент и промотор гена yellow, приводит к восстановлению нормальной экспрессии гена yellow. При введении гетерозиготы su(Hw)2ls\x(Hw)' не происходит заметного изменения фенотипа (Табл. 1). Таким образом,

дупликация позволяет каким-то образом преодолеть ьи(Ы\\)-зависимую инеуляцию гена yellow.

У мух у'" делетированы дисгалыше энхансеры гена yellow. Следовательно, при наличии только проксимальных энхансеров тела и крыловых щетинок может восстанавливаться транскрипция гена yellow т> присутствии двух !>и(Н\у)-евязывающих доменов и двух промоторов. Этот результат может быть объяснен либо потерей инсуляции в определенном структурном контексте, либо тем, что происходит инициация транскрипции с дистального промотора гена yellow (ур2) при помощи проксимальных энхансеров, которые не изолированы от промотора '5и(Н\\')-спячивагошнм районом.

Для того, чюбы выяснить, которое из объяснении более правильно, \пл проверили, насколько правильно активируется промотор гена yellow в пашен системе. Был проведен анализ мРНК гена yellow. Мы показали, что мРНК линий утН7 и Oregon, выделенная из куколок, находившихся на трех различных стадиях, имсег идентичный размер и количество, что свидетельствовало о том, что в чутаптной линии ген yellow транскрибируется с нормальною промотора и активируется своими собственными энхансерными элементами.

Другим доказательством экспрессии гена с проксимального промотора (ур!) является структура аллеля /""'(Рис. 3).

Мухи у'"'"' имели близкую к дикому типу пигментацию тела и крыльев (Табл.1). В этом аллеле эпхансер тела и часть крыловою энхансера, фланкированные двумя э^Нл^-связывающими районами, изолированы от промотора гена yellow (ypl) (Рис. 3). Таким образом, транскрипция гена yellow может начинаться только с промотора, отделенного от своих энхансеров 5и(Н\у)-связывающим

доменом. Некоторое снижение пигментации у мух у"*32 можно объяснить делецией части энхансера крыловой пластинки.

Рис. 3. Структура аллеля упМ-.

Стрелками показано направление транскрипции генов yellow, scute, achaele и l'scuts. Остальные обозначения как на Рис. 1.

Вышеизложенные результаты подтверждают предположение о том, что активация транскриции гена yellow в теле и крыльях действительно происходит за счет потери инсуляции в присутствии двух мобильных элементов gypsy.

Генетический и молекулярный анализ производных аллеля у'К Для получения производных аллеля y'h самцов из грех независимо полученных линий /''', у''12 и ъум скрещивали с самками C(l)RM,yf. Большая часть из полученных производных аллелей распределилась по четырем следующим классам: у'к (полная инактивация гена yellow)-, ydh (фенотип, идентичный родительскому аллелю ydh1)', у"' (желтая окраска грудных и ножных щетинок и промежуточная степень пигментации тела и крыльев) и y2h (желтая окраска кутикулы и крыловых пластинок, идентичная у2).

Аллели у"1 были связаны с делецией внутренних последовательностей гена yellow между hobo элементами, все аллели у4Н имели структуру, идентичную базовому аллелю уЛ1. В аллелях у21' произошла делеция дупликации, а также прилежащих последовательностей гена yellow. У этих аллелей существуют

небольшие стенотипические различия, ко торые завися г от размера делении. Класс мутаций у"' был изучен более подробно.

Природа мутаций ул. У мух с фенотипом у"' наблюдается желтая окраска грудных и ножных щетинок и промежуточный уровень пигментации кутикулы п крыловых пластинок (Табл. 1). Один из аллелей, }'нп, был проклошгрован. и его структура приведена на Рис. 4. Мукщия возникла путем рекомбинации между 5-ДКП gypsy-2 и i'-ДКП gypsy-1, в результате чего hobo-2 и последовательности гена yellow, находившиеся между hobo элементами, были делегированы. Согласно результатам Саузерн блот гибридизации, все аллели yth имели такую же структуру. Введение гетерозиготы su(Hw)2ls\\(H\v)v приводило к супрессии мутантного фенотипа аллелей г"' (Табл. П. Таким образом, в /' аллелях su(1Г^-связывающие районы не полностью, а лишь частично блокируют энхансеры тела и крыльев.

hobo 2 hobo 1

Рис. 4. Структура аллелей у"1", у2Н"5 и у-Н111. Стрелками показан размер делений в аллелях у"'. Остальные обозначения как на Рис. 1.

Чтобы выяснить, какой регуляторный район отвечает за активацию транскрипции гена yellow в аллелях у"1, мы получили ряд производных из аллеля

У".

В полученных нами мутантных аллелях у2Н"5 и ymil кутикула и крыловые пластинки не были пигментированы (Табл. 1). Гибридизация по Саузерну показала наличие делеций размером 7 тпн (y2h¡15) и 8 тпн (y2hl3')t затрагивающих район, прилежащий к элементу hobo-2. В делегированный район входили энхансеры, отвечающие за пигментацию в кутикуле и крыловых пластинках, а также внутренние последовательности gypsy (Рис. 4). Введение гетерозиготы su(Hw)¡lsu(Hw)v в линии y2hus и y2hnl очень слабо усиливало пигментацию только крыловых пластинок. Таким образом, в аллелях у'к именно энхансеры тела и крыльев ответственны за частичную активацию экспрессии гена yellow, несмотря на тот факт, что они отделены от промотора двумя su(Hw)-связывающими районами.

П. Мутации, индуцированные перемещением мобильного элемента jockey.

Частичная реверсия мутантаого sc фенотипа в ПНП щетинках связана с изменениями в локусе yellow. Было обнаружено, что некоторые ревертанты у*. полученные из линии y2scDJ, такие как y2p+9scD' (Geyer et al. 1988a) и y*2MCscP' (Georgiev et al. 1990), частично супрессируют мутантный scute фенотип: ПНП щетинки у таких_мух присутствуют в 70-90% случаях (табл. 2; рис. 5).

Мутантный фенотип scD1 полностью супрессируется сильной мутацией в гене su(Hw). В этом аллеле белок su(Hw) блокирует те энхансеры гена scute, которые инсерция мобильного элемента МДГ4 отделяет от промотора, в частности, энхансер ПНП щетинок. Таким образом, в ревертантах y+2UcscD¡ и ym+9scD' должно сохраняться негативное действие su(Hw)-CBR3biBaiouiero домена на экспрессию ПНП щетинок в гене scute. Возникновение у+2МС и >"'9

ревертантов связано со встраиванием мобильного элемента jockey в область sii(Hw)-CBfl3brBaiomero района, что сопровождается одновременной потерей последовательностей МДГ4 (Geyer et al. 1988; Georgiev et al. 1490: Gerasimova et cd. 1995). И линии v*"'9 была также найдена короткая 25 нуклеотнднаи последовательность из локуса scute (Geyer et al. 1988).

ТАКЛИЦА 2. Влияние аллелей у и мутаций e(y)2U^ or на образование ПНП щетинок в аллеле

Генотип + Op6 z x i-,"1 e(y)2

Процент образования ПНП щетинок

2 + у sc 100 (100) 100(100) 100 (100)

2 Dl у sc 1(2) 0(0) 0(0)

•г IMC Dl ) sc 1 (1) 0(0) 0 (0 )

+3MC Dl у sc 0(1) 0(0) 0(0)

+2 MC Dl у sc 74 (90) 38 (77) 29(51)

2+9 Dl у sc 83 (92) - 20 (40)

Г! каждом случае было проанализировано от 200 до 400 самцов и самок. Числа представляю I пропет самцов и самок (значения в скобках) с ПНП щетинками [(общее число ПНП щепшок в проанализированных мухах/2 делили на число проанализированных мух) х 100%]. Фенотип мух дикого типа принимался за 100%.

+ 1МС 09ypsyUfí

i/r / т и.

У +змс

gypsy г—Or

У2

у+2МС

gyps. En-AN!

su(Hw)

su(Hw) gypsy x—(у

jockey

j3£

SC

jpta-'jockey y2#+9

sc°1

En-ANP

10 kb

Рис. 5. Структура yellow-achaete-scute генетического комплекса по данным Campuzano et al. (1985).

Толстыми стрелками показано направление транскрипции генов yellow, achaeie и scute. Кружками обозначен su(H w)-cb языв ающяи район gypsy. Вертикальные линии соответствуют сайтам инсерции мобильных элементов gypsy и jockey. Не закрашенные прямозтолышки соответствуют дуплицированному 1.8 тпн району локуса scute, который совпадает с локализациейзнхансера ПНП. щетинок._

Восстановление образования ПНП щетинок в линиях y*2MCscD1 и y2lí+slscD1 не связано с делецией 5и(Н\у)-связывающего района гена yellow, потому что два других изученных нами у* ревертанта y*mcscD1 и y*SMCscD1, в которых произошла делеция МДГ4 и осталось только по одному ДКП, имели такой же scute фенотип, что и мухи из линии y2scD1. Следовательно, восстановление мутантного se фенотипа в ПНП щетинках зависит либо от дополнительной инсерции jockey в локус yellow, либо от каких-то изменений в районе achaete-scute генетического комплекса. Для решения этого вопроса мы провели детальный молекулярный анализ мутаций y+2MCscD! и y2#*9scD!.

Молекулярный анализ аллелей y*2Mcsci>i и y2#+>scD) ПОказал, что в локуое yellow присутствует дуплицироваиный энхансер ПНП щетинок. С помощью Саузерн-блот-анализа мы сравнили ДНК из исходной линии и двух ревертантов и установили, что изменения в этом локусе происходят , но затрагивают только область, заключенную между мобильными элементами МДГ4 и жокеем. В обоих мутациях появляется по одной дополнительной полосе, при сохранении исходной, после гибридизации с ДНК фага Ase 14 или ее HindUl-EcoRl фрагментом. Этот результат позволяет предположить, что соответствующий участок локуса scute не изменяется, но подвергается дупликации.

Для того, чтобы понять природу дупликации, мы проклонировали фрагменты ДНК, соответствовавшие по молекулярной массе дополнительным полосам, появлявшимся при переваривании ДНК линии y+2McscD1 рестриктазой ЕсоШ (фрагмент длиной 14.5тпн) или ДНК линии y2U+3scD' рестриктазой ВатШ (фрагмент размером 12.9тпн). Подробные рестрикционные карты полученных клонов представлены на Рис. 5,6, (2, 3).

gypsy

XGO P X x H HH P N XGO

U. L I 1 I - II.I I

PX EHP GH P III II

SHGff H-TfiB

II I ! t t) !

yellow

En-ANP

XGO R X WSy HHP N P ^'HG^ÍhB XPc лmdXGO "I

IJ I I II I! I I II HI I I ErvANPC,, _

5'-LTR

jockey

^n-ANP^f EHP GH P

9 n /

Рис. 6. Рестрикционная карта и схематическое изображение аллеля у" sc и полученных из него ревертантовд j,

(1) Л оку«,г yellow и тпеп районе мутаций у ^ и sP^ представлены по Cainpusano ei al. 1985: Parkhurst andCorces 1986, карга ¿-i/irvno Marlorel al. 1986.

XiC

(2)i " мутация в локусс re/ton (Georgiev et al. 1990; this woik).

(3) мутация n локусе yellow (Geyer et al. 1988; this work).

Рестрикционные сайты обозначены следующим образом: В, ВатШ; О, BgüI; Н, ffindlll; N, A'ccI; Р, Ail; R, £coRI; S, Salix X, Xbal; O, Xhol. Закрашенными кружками обозначены (Hw)-связьгаающяе районы; жирной стрелкой - jockey и его направление: тонкими с грелками - ДКП мобильного элемента gypsy и их направление; стрелками в прямоугольниках - дуплтщировашше последовагелыюсги тепа Saite и их направление; районы, клотпчретатпле в этой работе, подчеркнут. Райо1Ш, ишольаованные в качестве зондов, показаны при помогай более толстой линии.

Реверсия у+2МС вызвана удалением небольшой области МДГ4, включающей сайт связьшания белка su(Hw), и встраиванием на его место jockey и всего отрезка локуса scute, заключенного между jockey и 5'ДКП мдг4 в мутации scD': длина отрезка 1,8 тпн. Ориентация фрагмента scute w мобильного элемента jockey

в локусеyellow по отношению к 5-ДКП МДГ4 противоположна их ориентации в локусе scute (Рис. 6).

Реверсия в y2n+9sé" также связана с потерей последовательностей МДГ4, причем в этом случае теряется большая часть МДГ4, и сохраняется только 3-ДКП и примерно половина 5-ДКП. На место МДГ4 внедряется jockey и отрезок локуса scute, идентичный описанному выше. Ориентация сегмента seule и мобильного элемента jockey в этом случае совпадает с их ориентацией в локусе scute. ДКП МДГ4, 1,8 тпн фрагмент scute и jockey расположены в том же порядке и имеют одну и ту же ориентацию в y2tt+9scD1 и scD1 мутациях. Таким образом, единственное отличие обоих у ' ревертантов от линий y2scm и y*!UCscD1 состоит в том, что они содержат последовательность jockey и 1.8 тпн scute фрагмент в локусе yellow. Недавно было показано, что энхансер, отвечающий за экспрессию гена scute в ПНП щетинках, находится внутри дуплицированного 1.8 тпн фрагмента (Gomez-Skarmeta et al. 1995). Именно ПНП щетинки появляются у

2П+9 +2МС

у и у .ревертантов.

Гипоморфная мутация в локусе е(у)2 и точечная мутация (jpi6) в локусе zeste частично супрессируют образование ПНП щетинок в линиях y'**>scD' и y+2McscDi. g описанной нами системе произошла транспозиция энхансера ПНП щетинок. Энхансер оказался на расстоянии 35-40тпн от контролируемого им промотора, отделенным от промотора гена scute по крайней мере двумя промоторами других генов. Мы предположили, что гены, принимающие участие в организации дальнодействия (Pirrotta 1990; Georgiev 1994), могут влиять на работу перемещенного энхансера. Для проверки этого предположения мы изучили влияние мутаций в генах zeste, е(у)1, е(у)2 и е(у)3 на процесс формирования ПНП щетинок. Оказалось, что многие из этих мутаций также оказывают влияние на экспрессию гена scute в линии y2scD1.

-г, Г ! VJAÎC Ш i3MC ¡>1 / V ' , .

is линияху se . у se или j.' se мутации e(y)2 и A'?" ne оказынади нлияиия на scPI фенотип. С другой стороны в комбинации y'"*9scD1 или scD! с мутациями е(у)2"' или z0p6 процесс формирования ПНП щетинок был существенно супрессирован. Принимая во внимание, что мутации е(у)Т' и z"'"' не влияют на мутантный фенотип аллелей se2 и se6, связанных с делениями регуляторных последовательностей гена scute (Canipuzano et al. 1985; Gomez-Skarraeta et al. 1995), наш результат предполагает участие белков е(у)2 и zeste непосредственно в работе дуплицированного ПНП энхансера.

Мутации в генах е(у)1, е(у)3 и zeste могут влиять на процесс инсуляцни в гене scute через 8и(Н\у)-С1!язывающий домен. Мутации в локусах е(у)1 и е(у)3 супрессируют мутантный фенотип se13', 1тричем у самок лот эффект выражен значительно сильнее, чем у самцов (Табл. 3). Следует отметить, что влияние мутации е(у)3"' на scD1 фенотип не ограничено ПНП тцепшками: происходит также частичное восстановление передних орбитальных щетинок.

ТАБЛИЦА 3. Влияние мутаций /77А, е(у) f1, е(у)3 и комбинаций этих

D1

мутаций на образование щетинок и аллеле se

Генотип линии _Процент образования щетинок

AOR PV OC ANP SC HW

D1 se 0(0) 0(0) 0(0) 1(2) 12(16) -

m se / , l"1 e(y)l 0(0) 0(0) 0(0) 9 (37) 11 (17)

m se . л/7 e(y)3 8(11) 24(32) 40 (54) 12(52) 32 (64) -

D1 se j77h 12(16) 5(8) 14 (24) 27 (54) 30 (71)

D1 se v77h . , ,ul z e(y)l 11(14) 8(17) 11 (25) 31 (60) 35 (76) +

D1 se v77h , ,,ul z e(y)3 28 (56) 39 (46) 48 (82) 42 (80) 46 (89) +

Обозначения такие же как в таблице 4, HW (+) - 1-3 дополнительные щетинки появляются на нотуме гомозиготных самок. Hw (-) - отсутствие дополнительных щетинок. Передние орбитальные (AOR), поствентральные (PV), оцелярные (ОС), передние нотоплевралыше (ANP), скутелярные (SC).

Мутация z77h, являющаяся нулевой мутацией по локусу zeste, также супрессирует scD1 фенотип: частично восстанавливается образование ПНП, оцелярных, пост-вентральных и скутелярных щетинок (Табл. 3). Мутация zm также индуцирует слабый Hw фенотип: от одной до трех дополнительных щетинок появляется на нотуме мух, несущих мутацию scD1. Мутации е(у)3"' и zm оказывают аддитивный супрессирующий эффект на мутантный фенотип scD1: самки с такой комбинацией мутаций имеют близкое к норме число ПНП, скутелярных, оцелярных щетинок и около 50% поствентральные и передних орбитальных щетинок (Табл. 3). Мутации e(y)lul, е(у)3"' и z77h не влияют на фенотип аллелей se2, scs или se6, связанных с делениями регуляторной области гена scute.

Обсуждение результатов.

I. Система нестабильности с перемещением мобильного элемента hobo.

Перестройки, индуцированные hobo элементом, часто связаны с дупликацией последовательности, заключенной между hobo элементами.

Предшествующие генетические и молекулярно-биологические исследования показали, что hobo элементы часто вызывают хромосомные перестройки. (Lim 1988; Sheen et al. 1993). Lim предположил, что за такие перестройки ответственна внутрихромосомная рекомбинация между hobo элементами. Тип таких перестроек зависит от ориентации мобильного элемента (Lira and Simmons 1994; Eggleston et al. 1996). В том случае когда два hobo элемента находятся в одной ориентации, часто происходят делеции с потерей всего материала между ними, а в точке разрыва остается единичная копия hobo элемента. Lim and Simmons (1994) предложили модель, согласно которой hobo элементы вызывают хромосомные перестройки путем гомологичного спаривания с последующей рекомбинацией между элементами.

В аллеле у'"'1 обе копии hobo элементов находятся в одной и той же ориентации, и деления последовательностей между ними должна приводи и, к полной инактивации гена yellow. Неожиданна нами было обнаружено, что hobo перестройки час го приводят к появлению фенотипа у"', связанного с дупликацией геномных последовательностей, находящихся между hobo элементами. Похоже, что такое событие происходит за счет рекомбинации между сестринскими хроматидами.

Наиболее вероятно, что дупликации, вызванные hobo элементом, являются обычным событием, но в изучавшихся ранее системах hobo индуцированные перестройки, приводящие к дупликации района между hobo элементами, не оказывали влияния на фенотип и, слсдонаie.n.no. не были замсч епы.

Новые аспекты механизма действия su(Hw)-uiicy.iuropa. Мы показали, чю два мобильных элемента hobo, один из которых встроился в интрон гена yellow, а другой в его 5- регуля горную часть (аллель у'11'), позволяют частично преодолет ь инсулирующий эффект su(Hw)-CBa3breaioiuero района, разрешая энхансерам тела и крыльев частично активировать промотор гена yellow. Одно in возможных объяснений состоит в том, что эктопическое спаривание между hobo элементами нарушает su(Hw)-3aBiicnMyro инсуляцию. Роль спаривания между

гомологичными элементами хорошо просматривается на примере аллелей у"', в которых происходит частичная супрессия su(Hw)-3araci™ofi инсуляиии. В этих аллелях промотор гена yellow изолирован от энхансеров тела и крыловой пластинки двумя копиями gypsy. Согласно предыдущим исследованиям, увеличение числа 5и(Цу.')-связывающих районов приводит к более эффективной инсуляции. Однако, в случае аллеля у'и дупликация зи(1Ьу)-связывающего района оказывает противоположный эффект: энхансеры тела и крыловой пластинки

становятся способны частично активировать промотор гена yellow. Возможно, таким образом, что спаривание между гомологичными последовательностями gypsy или взаимодействие между 8и(Н\у)-связывающими районами частично нейтрализует эффект по блокировке энхансера. Вероятно, что и в случае аллеля эктопическое внутрихромосомное спаривание между двумя элементами gypsy, либо взаимодействие между белками su(Hw) может супрессировать инсуляцию, что позволяет энхансерам, расположенным между двумя gypsy элементами, активировать транскрипцию тепа, yellow.

В настоящее время наиболее распространена модель, согласно которой инсуляторы являются границами транскрипционных доменов (Schedl and Grosvrld 1995; Gerasmova and Corees 1996). Такая граница между доменами препятствует взаимодействию между регуляторными элементами путем создания хроматиновых структур высшего порядка таким образом, что повышается вероятность взаимодействия между регуляторными элементами внутри домена и снижается между доменами (Vazquez and Schedl 1994). Тот факт, что инсулированные энхансеры сохраняют всю свою активность, также позволяет представить, что белок su(Hw) воздействует на энхансерную функцию путем создания доменной границы (Scott and Geyer 1995).

Согласно другой гипотезе $и(Н\у)-связывающий район функционирует в качестве "гибкого" регуляторного элемента, модулирующего взаимодействие между энхансерами и промотором в составе сложных генетических комплексов (Cai and Levine, 1995; Georgiev and Kozycina 1996). Geyer (1997) предположила, что белки, собирающиеся на инсуляторном комплексе, способны вовлечь энхансер в непродуктивные взаимодействия, т.к. инсулятор не обладает промоторной функцией, в результате чего не происходит транскрипция (модель ловушки). Результаты, полученные в нашей работе, лучше всего объясняются с

точки зрения этой модели. Экюпическое внутрихромосомное спаривание между двумя элементами gypsy или же взаимодействие между белками su(Hw). связанными с двумя 5и(1Ы')-связывающими районами, может препятствовать организации непродуктивного комплекса между белками su(IIw) и белками, связывающимися с энхансерами, супрессируя инсуляцию и позволяя энхансерам, расположенным между двумя элементами gypsy, активирован, фннскрипцию гена yellow.

П. Система нестабильности с перемещением мобильного элемента jockey

Механизм транспозиции мобильного элемента jockey и дупликация энхансера ПНП щетинок гена scute. Мобильный элемент jockey часто встраивается в 5и(Н\у)-спязывающпй район, что в некоторых случаях приводит к потере последовательностей последнего. Ревертанты у и т произошли из алледя у' вследствие инсерции мобильного элемента jockey, сопровождавшейся одновременной потерей либо яи(Н\\)-связывающето района, либо всех внутренних последовательностей gypsy. В нашей работе мы показали, что в лок\с yellow произошла транспозиция целого сегмента из локуса scute, размером 1.8 тин, расположенного между мобильными элементами scute и jockey в аллеле scDI. Это позволяет объяснить механизм транспозиции как процесс рекомбинации с участием последовательностей jockey, 1.8 тин сегмента локуса scute, 5-ДКП или i'-ДКП мобильного элемента gypsy, находящегося в локусе yellow (у или 5-ДКП в случае аллеля ушс.

Новые последовательности, появившиеся в локусе yellow, оказывали влияние на экспрессию гена scute в аллеле scD1. В у* ревертантах произошла транспозиция энхансера, отвечающего за образование ПНП щетинок, в локус yellow, где он более не инсулирован зи(Н\у)-связывающим районом. Наиболее вероятным объяснением полученных результатов может быть то, что ПНП

энхансер, находящийся в локусе yellow, активирует промотор гена scute, находясь от него на достаточно большом расстоянии, 35-40 тпн. Напомним, что район между активным энхансером гена scute и его промотором содержит по крайней мере два промотора других генов {yellow и scute), которые могли бы помешать активации промотора гена scute.

Таким образом, либо инсуляторные элементы отсутствуют между генами yellow и scute, либо инсуляция преодолевается за счет других факторов.

Правильный выбор энхансером своего промотора может происходить за счет высокой специфичности энхансерно-промоторных взаимодействий. Было описано несколько генов, способствующих образованию более тесных контактов между энхансерами и промоторами. Среди них гены zeste , е(у)1, е(у)2 и е(у)3 (Georgiev 1994). Из всех генов е(у) только один ген е(у)2 принимает участие в организации взаимодействий между дуплицированным энхансером гена scute и промотором гена scute. Точечная мутация гена zeste, z0p6- также частично блокирует образование ПНП щетинок у мух с дуплицированным scute энхансером. Комбинация мутаций е(у)2"', z°p6 оказывает аддитивное действие.

Мутации в генах zeste, е(у) 1 и е(у)3 частично супрессируют инсуляторные свойства su(Hw)-cBH3biBaioiuero района. Мутации в генах, принимающих участие в организации дальнодействия, нарушают инсуляцию в базовом аллеле scD1. По крайней мере две из протестированных мутаций являются нулевыми аллелями, z"77h и е(у)1"'. Из этого следует, что инсуляция в системе зависит от присутствия белков zeste, е(у)1 и, возможно, е(у)3. В случае гена yellow мутации в генах zeste, е(у)1 и е(у)3 оказывают влияние на su(Hw)-onocpeflOBaHHyio инсуляцию только в одном специфическом положении 5и(Н\у)-связывающего района. Возможно, влияние мутаций е(у)1и!- е(у)3и z77h на инсуляцию, опосредованную su(Hw)-связывающим районом, зависит от расстояния между энхансером и промотором

и, таким образом. может изменяться в присутсшни чужеродных последовательностей, таких как мобильные элементы gypsy и jockey.

выводы

1. Показано, что энхансер гена scute способен активировать экспрессию

гена scutc, находясь в локусе yellow. В этом случае между энхансером и промотором гена scute присутствуют промоторы двух других генов. Таким образом, граница транскрипционного домена не блокирует взаимодействие между энхансером и промотором, которое определяется специфичностью белков, связывающихся с энхансером и промотором.

2. Показано, что мутации в icmtx zeste, efy/1 и е(\уЗ оказывают влияние на 5п(Н\\)-зависимую иисуляиию в achaetc-scute комплексе.

3. Показано, что два hobo элемента, находящихся в одной ориентации, с высокой частотой индуцируют дупликации района, расположенно! о между ними.

4. Впервые показано, что дупликация яи(1Ьл>)-инсулятора и МДГ4

последовательности позволяет изолированным энхансерам акшвировап. транскрипцию гена. Полученные результаты подтверждают модель о механизме действия инсуляторов как «ловушке энхансеров».

Список работ, опубликованных но теме /uiccepianini. 1. M.Gause, S.Georgieva, P.Georgiev, Pkeiiolipic levertiou of llie gypsy-induced mutation scm of Drosophila melanogaster by replicative transposition of a sc enhancer to the yellow gene and by mutations in the enhancer of yellow and zeste loci. MGG (1996) V. 253, p370-376.

2. Гаузе М.Г., Георгиева С.Г., Энхансер гена scute может активировать промотор, находясь в другом локусе. ДАН (1998) т.358, Msl, стр. 119-121.

3. Георгиева С.Г., Гаузе М.Г., Белковые продукты генов zeste, е(у)1 и е(у)3 могут влиять на процесс инсуляции. ДАН (1998) т.358, №2, стр. 260-262.

4. Gause М.., Hovhannisyan Н., Кап Т., Kuhfittig S., Mogila V., Georgiev P., tobo-induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melsnogaster. Genetics (in press).