Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие трансрегуляторных генов, контролирующих экспрессию МДГ4, и локуса Yellow у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие трансрегуляторных генов, контролирующих экспрессию МДГ4, и локуса Yellow у Drosophila melanogaster"

Российская академия наук Институт общей генетики пм.Н.И.Вавилова

На правах рукописи

Козищша Марина Вячеславовна

УДК 575.24 : 595.77Х.4

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСРЕГУЛЯГОРНЫХ ГЕКОВ, КОНТРОЖРУЩИХ ЭКСПРЕССИЮ ВДГ4, И ЛОКУСА yellow

У drosopkila kelahog aster

(03.00.15 - генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

/

/

Работа выполнена в Институте обшей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, г. Москва в Институте биологии гена РАН, г. Москва

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Т.И.Герасимова П.Г.Георгиев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук кандидат биологических наук

А.И.ИВАНОВ С.Д.Набирочкин

Ведущее учреждение - МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится /У Цо&др-Я. 1992г. в " /V " часов

на заседании Специализированного совета (Д 002.49.01) при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: г. Москва, ул. Губкина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН

Автореферат разослан " 15 " о/ОпиНх^о-Ь 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета: доктор биологических наук

Л.М.Фонштейн

WCC^nI . Этдзл Г

orr/л-:'-. днс-одц т

BHnj!.-.Q.c.:,v', -:-!- I -

I. ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время проблема регуляции транскрипции у эукариот является одной из центральных. Первоначальные представления о том, что регуляторные последовательности к белки, с нпш связыващиеся, могут быть либо только активаторами транскрипции, либо наоборот, на современном уровне знаний сменились другими, согласно которым в некоторых условиях типичный энхансер монет шступать в роли сайленсера, т.е. негативного регулятора транскрипции. Возникает вопрос о конкретных механизмах таких превращений. В эхом плане нарушение транскрипции генов в мутациях, вззванных инсерцией мобильного элемента МДГ4, является хорошей модельной системой. ГЙДГ4 содержит сильный энхансер, который состоит из 12 повторов октамерной . последовательности (Mazo et al, 1989). Октамерная последовательность является сайтом связывания белка, кодируемого геном супрессор Hairy wing (su(Hw)), который активирует транскрипции с промотора ЩГ4. По сЕоему стрсяшш белок su(hw) является тишгекым активаторвым белком: жеет два активирующих ацидных домена на концах, ДЖ связывающий домен и домен лейциновой молнии, ' который обычно служит для связывания двух белков-активаторов мевду собой (Parkhurst et ai, 1958). Известно большое количество мутаций, вызываемых инсерцией МДГ4 в различные лскусы (у2, cts, sc1D, sc3B, f1), в которых белок su(Hw), связываясь с энхансером МДГ4, нарушает нормальные взаимодействия энхансеров данного гена с'промотором. Недавно бклз получена мутация в .другом гене - модификаторе №4 (mod(ndg4}), лоторый по-разному влияет на фенотип мутаций, вызваных инсерцией №"4 (Георгиев П.Г., Герасимова Т.И., 1989). Показано, что белковый продукт нового гена действует через знхансер 1ЛДГ4 (Корсес В., Герасимова Т.И., личное сообщение).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение взаимодействия энхансера ВДГ4 с регуляюрными элементами гена-мипеш путем создания генетических конструкций с

использованием МутаЦИЙ В Генах su(Hw) и mod(ndg4).

В работе были поставлены следухщие задачи: I) На основе генетического анализа влияния Koítóssamffi мутаций в генах su(Hu) и mcd(ndg4) на фенотипическое проявление мутаций, связанных с инсерцией МДГ4, определить роль балка, кодируемого

геном Bod(mdg4), в регуляции транскрипции генов-мшенел.

2) На основе генетического анализа феноткпичзского проявления мутаций, связанных с инсерцией МДГ4, в комбинации с различным!! мутациями в генз su(Hw), затрагивакщпх тот или иной функциональный домен белка, оценить роль доменов белка su(Hw) в регуляции транскрипции гевов-мишений.

3) Изучить влияние мутаций В генах -su(Hw) И mod{ndg4) на-фенотипическое проявление сунернестабильных в локусе yellow аллелей.

4) Изучить влияние мутаций в генах su(Hw) и t.iod(mdg4) на эффект положительной и отрицательной трансвекции между аллелями локуса

yellow.

5) Получить новае мутации в гене mod(mdg4) с целью его дальнейшего генетического и молекулярного изучения.

Научная новизна работы. В данной работе проведен генетический анализ НОВОГО реГулЯТОрНОГО гена Drosophila melanogaster -модификатора 1ЩГ4, исследовано взаимодействие этого гена с другим геном-регулятором транскрипции 1ЩГ4, супрессором Hairy wing. Установлено, что действие гена ir.od(radg4) осуществляется опосредовано в результате его взаимодействия с геном su(hw).

Показано, что существует два механизма ингибирукщего действия энхансера ВДГ4 на транскрипцию гена-мишени. Для ингибирования первого типа необходим функционально полноценный ген mod(mdg4). в белке, кодируемом геном su(Hw), может быть делетирован один активирующий домен. Дополнительное удаление домена лейциновой молнии белка, кодируемого геном su(Hw), резко сникает ингибирование.

Для проявления ингибирования второго типа необходимы мутации в гене jood(mdg4), приводящие к снижению концентрации белка, кодируемого этил геном. При этом нужны два активирующих домена в белке, кодируемом геном su(Hw). Показано, что в этом случае удаление одного из ацидных доменов может приводить к активации транскрипции И ДЛЯ ЭТОГО не нужен белок mod(mdg4) и домен лейциновой молнии белка su(Hw).

Показано,что энхансер МДГ4 может активировать или инактивироватъ транскрипцию гена-мишени в зависимости от регуляторных элементов гена-мишени; набора энхансеров других

мобильных элементов, влияющих на транскрипцию генз-мишени.

В данной работе впервые описан случай негативного влияния знхансера ЩГ4 на транскрипцию гена, расположенного в гомологичной хромосоме.

Практическая ценность работы. В диссертации разработаны модели для изучения механизмов взаимодействия мевду энхансерами в регуляции транскрипции еысших зукариох. Изучение нового регуляторного гена mod(mdg4) и получение ряда мутаций в нем является основой для молекулярного исследования этого гена.

Апробация работы. Основные научные результаты были доложены на российско-американском ' научном семинаре (1991) ИЕР РАН, межлабораторном научном семинаре (1992) ИБГ РАН.

Структура и объем работы. Диссертация излэкена на ш стр., включая 10 таблиц, рисунков и состоит из введения,

обзора литературы, экспериментальной части, обсуядения результатов и выводов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Генетический анализ взаимодействия нутаций в двух генах, контролирующих экспрессию МДГ4.

2.1 Л. Влияшга комбинаций мутаций в локусах su(Hw) И raod(rsdg4) на фенотип мутации у?

Ранее было установленно, что для проявления действия мутаций в генах su(Hw) и i»od(ndg4) необходимо присутствие только знхансера ЬЩГ4 [Корсес и Герасимова, неопубликованные данные]. Чтобы понять, взаимодействуют ЛИ мевду собой гены su(Hw) И mod(mdg4) и, если да, то каким образом, мы исследовали влияние комбинаций мутации Tnod(mdg4)lul с РЭЗЕЫМИ МУТаЦИЯМИ ГеНЭ su(Hw) на хорош изученные мутации, обусловленных инсерцией ВДГ4.

Мутация у2 вызвана инсерцией МДГ4 в 700 пн от промотора гена yellow, который отвечает за пигментацию кутикулы. Фенотип мутации мозаичный: тело, крылья и второй членик антенн почти не пигментированы, все щетинки и волоски имеют иормальную окраску

о

(табл.1). По влиянию на фенотшшческое проявление у" аллеля и характеру ВЗаимОДеЙОТВИЯ С mod(radg4)1Ul, МУТЗЦИИ su(Hw) можно разделить на четыре группы. К первой относятся сильные su(Hw) мутации: su(Hw)2, su(Hw)691c, su(Kw)MC1, которые в максимальной степени супрессируют фенотип всех мутаций, индуцированных инсерцией

МДГ4, что связано, по-видимому, с полной инактивацией белка su(Hw)_ Эти мутации супрессируют у2-фзнотип; исключением является второй членик антенн, который обесцвечивается(таб.1). В присутствии деух доз мутаций su(Hw) эффект мутация mod(itidg4)lul не проявляется, т.е. действие бежа aod(mdg4) полностью зависит от присутствия белка

su(Hw). [sufHw^/sufHw)*1 = su(Hw)*1 nod(mdg4) lul/su(Hv)** mod(mdg4)lul]

Мутапш su(hw) рецессивны и в гетерозиготе не влияют на у2 Йенотип. Однако в Присутствии двух ДОЗ мутации mod(mdg4)1U1 ИХ действие в гетерозиготе проявляется, хотя и - в резко ослабленной степени: частичная супрессия у2-фенотипа в теле и крыльях. (su(hw)*Imod(mdg4)lul/mod(mdg4 )lul>su(iiw)*I/+].Одновременно в щетинках реализуется эф$зкт мутации mod(mdg4)lul- уменьшения их пигментации [ SU (Hw) *^mod (mdg4 ) lul/mod (iadg4) lul*mod (mdg4) 1Ul/mod (mdg4)lul ].

Мутации второй группы характеризуются или полной утратой гена-. su(Hw)v - делеция, или нарушением способности белка su(Hw) связываться с ДНК, в мутациях su(Hw)e2 и su(Hw)e8, вызванных точечными заменами в ДНК-связывавдем домене. По своим свойствам они напоминают мутации первой группы. Единственное отличие состоит в

* "У +

том, что в комбинации гетерозиготы su(hw) / su(hw) с

гомозиготой mod(mdg4)lul / mod(indg4)lul не проявляется

негативного действия мутации mod(mdg4)lul на окраску

* з *i

ЩеТИПОК [su(Hw) nod(mdg4)/mod(rodg4)>su(Hw) mod(mdg4)/mod(mdg4)].

К третьей группе можно отнести мутацию su(Hw)D неизвестной природа и мутации su(Hw)3, где происходит утрата С-концевого ацидного домена белка. Сами по себе, они вообще не влияют на фенотип у2 мутации. Дополнительное введение мутации mod(ndg4)lul лишь слегка супрессирует у-фенотип в теле и крыльях, но не влияет на окраску щетинок.

Четвертая чауша включает одну мутацию su(Hw)e7, которая представляет собой делецию С-концевого ацидного домена и лейциновой молнии. Эта мутация частично супрессирует фенотип у2 мутации в теле и крыльях (таб. I).Дополнительное введение мутации mod(mdg4)lul не влияет на эффект мутация su(Hw)®7 £su(Hv)e7 Bod(mdg4)/su(Hw)e7

mod(mdg4)=suСHw)e7/su(Hw)е7].

Существенно, что в гетерозиготе все su(Hw)-мутации третьей и

четвертой группы полностью супрессируют негативный эффект мутации nrad(acig4)lul на пигментацию щетинок и волосков (табл. I);

[ su (Hw) * 3,<nod (mdg4 ) lul/nod (;ndg4)lul > mod (mdg4) 1Ul/raod (mdg4 )1Ul ].

Вероятно, для реализации негативного эффекта мутации TOod(radg4)lul на экспрессию гена yellow в щетинках и волосках необходимо присутствие с-концевых ацидных доменов во всех молекулах белка su(Hw), связывающихся с знхэнсером МДГ4.

2.1.2. Влияние комбинат® нутаций su(Ha) - и mod(mdg4) на фенотип частичных ревертантоз мутации у2.

Ранее в лаборатории В.Корсеса (США) были описаны две

Таблица 1. Взаимодействие комбинации мутаций в локусах su(Hw) й !T!Od(ndg4) И муГЭЦИИ у2 3 ЛОКУСе yellow.

Группы Генотип Пигментация

аллелей линии , . тело 2 чл. ЩЕТИНКИ

su(hw) su(Hw) nod(mag4) крылья антенн Гр Бр Кр К

+/+ +/+ 1 1 s 5 5 5

nod/mod 0 0 0 0 0 0

1 su/su +/+ 5 0 с 5 5 5

su(Hw)2 g9k su/su Bod/nod 5 0 5 5 5 5

su(Hw),

su(Hw)2MC 3U/+ mod /raod 2 0 1-4 3 1-2 1

2 • v su/su +/+ 5 0 5 5 5 5

SU(HW) ; eg su/su mod/mod 5 0 5 5 5 5

su(Hw),

GU(Hw)e2 SU/+ mod/mod 2 0 5 5 5 5

3 su/su +/+ 1 1 5 5 5 5

sufHw)5, su/su mod/mod 2 1 5 5 5 5

su(Hw)D SU/+ mod/mod 1 1 5 5 5 5

4 EU/SU +/+ , 4 1 5 5 5 5

su(Hw)e7 su/su mod/mod 4 1-2 5 5 5 5

SU/ + nod/nod 2 0 5 5 5 5

Примечание: Щетинки: Гр - грудные, Бр - брюшные, Кр - крыловые, Н -

ножные. Цифры определяют степень пигментации данной зоны кутикулы:

5 - максимальная степень пигментации, о - отсутствие пигментации си - ОДИН ИЗ аллелей зи(Нм), люа - тоа(кад4)'и1

частичные реверсии мутации у2 (пигментация тела и крыльев увеличилась , второго члеюпса антенн не изменилась). Они связаны с

2ртз1 ррср _

инсерциями жокея (у ) или hobo (у ) в энхансер МДГ4. При введении мутации mod(ndg4)lul происходит полное обесцвечивание тела, крыльев, всех щетинок и волосков в той же степени, что и в случае у2-мутации.

При анализе фенотипа комбинаций различных мутаций su(Hv) с мутацией mod(mdg4)lul можно выделить те же саше четыре группы мутаций su(hw). Не было обнаружено практически никаких отличий

2pr1 *>рк2 2

фенотипов у и у' аллелей от у во всех комбинациях типа

* * * lul * lul *

su(Hw) /su(Hw) , su(Hv) mod(mdg4) /su(Hw) mod(mdg4) , su(Hw)

mod (cdg4) 1V11/Eod (Mdg4)1Ul, mod/(ndg4)1Ul. ТЭКИМ ОбраЗОМ, Эффекты,

вызываемые мутациями su(Kw) И ir.od(ndg4), не зависят от того,

является энхансер ЫДГ4 непрерывным или в него внедрился другой

мобильный элемент.

2.1.3. Влияние комбинаций мутаций su(Bw)/mocl<iuag4) на фенотип других мутаций, связанных с инсердаей МДГ4.

Для получения более полной картины роли белков su(hw) е nod(ndg4) в действии энхансера ЫДГ4 на транскрипцию генов была проанализированнн другие хорошо изученные мутации, связанные с

__Г)1 1В £

инсерцией ВДГ4: sc , sc , ct . В комбинации с двумя дозами мутации su(hw)v (делеция гена su(hw)) фенотип всех выше перечисленных мутаций полностью супрессируется.и, следовательно, белок su(iiw) является необходимым для негативного действия энхансера МДГ4 на транскрипцию генов-мшиений.

Мутация ct6 вызвана инсерцией МДГ4 между промотором гена cut и энхансером, который отвечает за экспрессию гена в крыловом имагинальном диске. Мутация ct6 имеет фенотип сходный с мутациями, в которых крыловой энхансер гена cut делегирован (Могила В. и Герасимова 5.И., 1992). В отличие от выше описанных мутаций в локусе yellow, мутация nod(mdg4)lul частично супрессирует фенотип мутации ct6, который варьирует от небольших вырезок с внутренней стороны крыла (ctpN - "кружевные крылья") до полной нормы (табл.2). Сильные мутации su(Hw) первой и второй группы в комбинации с двумя дозами мутации mod(mdg4)lul оказывают влияние, находясь в гетерозиготном состоянии: происходит полная супрессия мутантного

фенотипа. Даже слабые мутации третьей и четвертой группы имеют

т U1

Эффект Е гетерозиготе В присутствии мутации mod(mdg4) : происходит полная (su(iiw)e7) или частичная, до гаденьких вырезок на крыле (su(Hw)2), супрессия фенотипа et6 мутации. Таким образом, для

Таблица 2. Влияние комбинаций мутаций в локусах su(hw) и mod(radg4) на фенотшпгческое проявление мутаций в локусе sente и cut Аллели Генотип et6 scD1 se38

su(Hu) ЛИНИИ scute achaete

su(Hw) nod(ffidg4)

AOR PV ОС AHP SC А0Я PV oc SC ADC PDC

su(Hw)+ +/+ +/+ 6 SO 90 90 90 1 90 90 50 0 + +

+/+- nod/nod n( ,pH 50 50 + 90 0 10 + + 0 90 90

sufHw)2 , su/su +/+ + + + + + 4 + -r + 4 + +

su/+ mod/mod -t- + 50 + 10 2,5 + + + 3 + +

su(Hw)69 ksu/+ mod/rood + + + + 50 3 + + 3 + +

su(Hw)v su/+ mod/mod + + + + 50 3 + + + 3 + +

su(Hw)5 su/su +/■)- 6 50 50 + 90 0 50 + + 0 90 50

Su(Hw)0 su/su mod/rod + /П 90 90 70 70 0 90 50 10 0,5 50 +

su/+• mod/nod + /П 50 90 50 50 0 50 50 10 0 90 10

su/su vmod/icod + ,n 70 70 90 90 0 90 90 10 0 50 +

su(Hw)e7 su/su +/+ pN 30 50 + 1С 1,5

su/su mod/mod + 90 90 + 50 1 90 10 + 0 50 5

su/i- nod/mod + 50 90 + 10 1 10 10 + 0 90 50

su/su1 mod/nod + 70 70 + 70 0,5 50 10 + 0 50 10

Примечание 90 - отсутствие данной щетинки у болзе чем 90% мух; 50 --щетинка отсутствует более чем у 50%; 10 - ззткнка отсутствует менее чем у 10% Вариации фенотипа крыла:б- крыло как у с^-мутации; рн- крыло имеет мелкие вырезки по внутреннему и наружнему хсраю крыла; п-небольпая вырезка на вершине крыла; рн п -преобладает рм-фенотип; п ри-приобладает п-фенотш. аон - передние орбитальные щзтинки, pv - поствзртикальше, ли? - нотоплевральные, ос - оцеллярные, эс - скутеллярные, а/рос - передние/задние дорзоцентральные.

Мутации su(hw)^ и su(hv/)d не меняют фенотип мутации ct6. Из этого следует, что делеция С-концевого ацидного домена не имеет значения для негативной регуляции. В то &е время одновременная деления ацидного домена и домена лзйциновой молнии (su(hw)q7j приводит к фенотипу "кружевные крылья" - вырезки по всему краю крыла, что соответствует частичной супрессии мутации ct6. Таким образом, для полного негативного действия энхзнсера МДМ в ct6 мутации нужны белок mod(mdg4), домен . лейциновой молнии и, вероятно, ынг-концевой ацидный домен белка su(hw).

Ген achaete, расположенный в 5 тпн проксимальнее локуса yellow (по отношению к центромере) , определяет развитие дорзоцентральных щетинок и волосков, а ген scute, расположенный в 40 тпн проксимальнее локуса yellow, - развитие всех остальных щетинок. В мутации sc3B МДГ4 встроился между генами yellow и achaete, а В МутаЦИИ scD1 - В 20 ТПН ПрОКСИМаЛЬНее гена scute, в обеих мутациях происходит исчезновение одних II тех пе щетинок, за развитие которых отвечает ген scute (табл.2). Изменений в экспрессии гена achaete на фэнотипическом уровне в этих мутациях не происходит. Мутация mod(mdg4) 1и1приводит к частичной супрессии мутантного фзнотипа на голове, что можно объяснить частичным восстановлением нормальной экспрессии гена scute. Одновременно, в sc3B МутаЦИИ ПРОИСХОДИТ нарушение ЭКСПреССИИ Гена achaete: полностью подавляется образование дорзоцентральных щетинок.

Мутации su{hw) первой и второй группы, находясь в гетерозиготном СОСТОЯНИИ И В комбинации С ГОМОЗИГОТОЙ ПО мутации mod(mdg4)lul почти полностью супрессируют фенотип мутаций scD1 и sc3B. Так как все мутации su(Hv) являются рецессивными, то, исходя из полученных результатов, МОЖНО предположить, ЧТО гены su(Hw) И mod(mdg4) действуют синергически, определяя негативный эффект энхансера МДГ4.

Действие слабых мутаций su(hw) , более разнообразно и отличается ПО результату ДЛЯ генов achaete И scute. Мутация su(Hw)3 (делеция ацидного домена) не изменяет экспрессии гена scute на фенотшпиеском уровне, но в то же время нарушает, хотя и слабее, чем мутация mod(ndg4)lul,экспрессию гена achaete: исчезают дорзоцентральные щетинки. Мутация su(Hw)e7 частично супрессирует мутантный фенотип обеих мутаций, который определяется нарушениями транскрипции гена scute, но на экспрессию гена achaete в мутации

sc30 :шеет обратный эффект: происходит частичная редакция дорзоцентральных ЩвТИНОК. У МУТаЦИИ mad(mdq4)lul в комбинации с этими мутациями происходит более слабое изменение экспрессии гена

achaete, Ч6М В ПРИСУТСТВИИ ТОЛЬКО ОДНОЙ ыутаЦИИ mod(mdg4).

Следовательно, для негативного влияния энхансера МДГ4 на ген scute, как И 3 случае гена cut, нужен белок mod(mdg4) и домен лейципозой молнии бзлка su(Hw). Для негативного действия энхансера МДГ4 на ген achaete ситуация обратная - нарушение экспрессии происходит только в отсутствии белка mod(mdg4) или при делении у бзлка su(kw) анидного домена и лейциновой молнии.

2.1.4. Анализ влияния мутаций su(hw) на фенотип некоторых производных у-мутаций: позитивное действие энхансера ВДГ4.

Выше уже упоминалось, что при введении мутаций su(Hw) первой и второй группы происходило полное обесцвечивание второго членика антенн. Ранее в нашей группе была описана реверсия мутации у2 -у+2йс. б которой энхансер Г4ЦГ4 был заменен последовательностью жокея (Georgiev at ai, 1990). При этом полностью восстанавливается экспрессии гена yellow во всех частях кутикулы, за исключением второго членика антенн. Можно предположить, что инсерция МДГ4 нарушает структуру энхансера, который отвечает за экспрессию гена yciiow во втором членике антенн. Тогда белок su(hw) должзе иметь слабое активирующие действие на транскрипцию в этой зоне кутикулы. Подтверждением служит тот факт, что мутации su(hv) третьей группы либо не изменяют. либо слабо усиливают пигментацию в комбинации с мутациями у2, y2PR^ y2PR2 (табл.1).

В этом плане интересны мутации: у+д-и , у которой пигментация второго членика антенн востанавливзется скорее всего за счет регуляторных элементов дополнительной инсерции, и sc3B, в которой МДГ4 находится между генами yellow и achaate, и, следовательно, не может • нарушать структуру энхансера. Введение во все выше перечисленные у-мутацки mod(!r.dg4)lul приводит к полному обесцвечивании второго членика антенн. В то же время мутации su(Hw) третьей и четвертой группы супрзссируют негативное действие мутации mod(icdg4)lul на пигментацию второго члзника антенн. В отличие от щетинок, в данном случае супрессия не происходит в присутствии ТОЛЬКО ОДНОЙ ДОЗЫ мутаЦИИ =u(Hw).

только одной дозы мутации su(iiw).

Наконец, мутация su(hv)3 (делеция одного С-кокцевого ацидного-домена) в комбинации с мутацией sc3B приводит дане к усилению пигментации второго членика антенн. Таким образом, негативное действие мутации nod(mdg4)lul связано с с-концевым активирующим доменом бежа su(Hw). Можно предположить, что белок su(Hw) является активатором транскрипции гена yeiiou во втором членике антенн, в том случае, если частично замаскированы его ацидные домены. Мутация mod(indg4)lul приводит к освобождению ацидного домена, что усиливает негативный эффект.

В системе продленной нестабильности наш были получены мутации в локусе yellow, которые возникли на фоне мутации у2 и связаны с дополнительной инсерцией (X) в регуляторпую область гена yellow. Для данной работы была использована одна из них у+гш, тело и крылья имеют нормальную пигментацию, грудные и ножные щетинки - желтые. Мутации su(hw) первой и второй группы, отдельно и в комбинации с мутацией mod(mdg4)lul, не влияют на пигментацию щетинок. Таким образом, транскрипция гена yellow в мутации y+nu нарушена в щетинках под влиянием инсерции X, а не энхансера ВДГ4. Мутации su(Hw)D и sufHw)3 восстанавливают пигментацию щетинок почти до нормы, а мутацня su(Hw)e7 - полностью. Таким образом, белок su(hw) без одного ацидного домена и лейциновой молнии может активировать транскрипцию гена yellow в щетинках. При этом белок r.od(mdg4)lul и уменьшение концентрации белка su(hw) (в гетерозиготах с мутацией' su(hw)v) не имеют значения для супрессии.

Подтверждение позитивного действия белка su(Hw), у которого делегирован один ацидный домен, на транскрипцию гена yellow в щетинках получено при анализе комбинаций мутаций у2 с е(у)1и1или е(у)3и* В другом сообщении наш было показано, что мутации e(y)lul и е(у)3и1в комбинации с мутацией у2 нарушают транскрипцию гена yellow в щетинках (Козицина и др., 1992). Введение мутаций su(hw) первой и второй группы не изменяет негативного эффекта е(у)-мутаций. Мутации su(Hw)J почти полностью, a su(Hw)e7 -полностью ьостанавливает нормзльную пигментацию щетинок. В этом случае концентрация белка su(Hw) и присутствие мутации mod(mdg4)lul не имеет значения.

2.2. Роль мутащй В генах супрессор Hairy wing и модификатор МДГ4 на трансвекцив между аллеляш! локуса yellow У Droaophila nolanogaster.

2.2.1. Генетический анализ роли мутаций в локусах модификатор МДГ4 и супрессор sairy wing в комплементации аллелей у2 и у5эь

са к о

Кутания у является производной у -мутации и связана с делецией, включакзцей часть МДГ4, в частности, его энхансер и промотор гена yellow. У гетерозиготных у2/у59Ь самок пигментация тела и крыльев почти полностью востанавливается, так как энхзнсеры тела и крыльев у59Ь аллеля активируют трашсршщкю с промотора у2

Таблица 3. Влияние мутации mod(r.dg4),и 1 ■ па комплементацию между аллеля® локуса yellow.

Комбинация Модификатор . Пигментация Щетинки у-аллелзй МДГ4 тело, крылья

у59ь/у59ь +/+ 0 0

/7у2 т_ 5

у^/у5,ь 5 5

у2/у;9ь mod/mod 0 0

y2PR1^,y2PR 1* +/+ 2 5

2 Р R 1 , 5 ? Ь у /у 5 5

у2РМ/у5?Ь mod/¡nod 0 0

* Аналогичными свойствами обладает аллель угр"г Обозначения см. тгбл. I и 2

аллеля (Geyer et al, 1990). Мы Обнаружили, ЧТО ПрК КОМбИНЭЦИИ С дзумя дозэ'Ш мутации Eod(mdg4)lul происходит полная супрессия комплементации мезду у-аллелямк (табл.4). Таким образен, в присутствии мутации mod(mdg4j1"1 происходит усиление негативного действия знхансера МДГ4.

.г 2 2РР1 2PR2

J двух частичных резертантов мутации у - у 7 у 7 прздползгагтея, чте частичное постановление экспрессии гена yciiow связано с ослаблением знхансера МДГ4 йэ-за нарушения его структуры, в результате гнеерции в него мобильных элементоз (гокея и hobo) (Geyer et al, 19S8). Однако комбинирование двух доз мутации mod(mdg4)lul с гетерозиготой у59Ь и с любым из трех частичных

ревертантов приводит к полной инактивации гена yellow (табл.З.). Таким образом, даже измененный энхансер МДГ4 может в присутствии мутации mod(ndg4)lul приводить к супрессии эффекта трансактивации.

Следующей задачей данной работы было изучение роли белка su(hw) в супрессии комплементации. Сильные мутации ыц(ни)2, su(hw)v, su(hw)mc1 и su(hw)69k связаны либо с делецией гена, либо с нарушением связывания белка su(hw) с ДНК. Поэтому в гетерозиготе выше перечисленных мутаций - и нормальной копии гена su(hw)+ происходит уменьшение по крайней мере в 2 раза концентрации активного белка su(Hw). Однако уменьшение концентрации белка su(hw) не приводит к даже частичному постановлению комплементации в присутствии мутации mod(mdg4)lul. Мутации su(hw)e7 (делеции С-концевого активирующего домена и домена лейциновой молнии) и su(hw) (делеция одного С-концевого активирующего домена) в гетерозиготе не влияют на негативное действие мутации mod(mdy4)lul. В гомозиготном состоянии все выше перечисленные мутации su(hw) полностью супрессирувт фенотип у2-мутации. Исключением является мутация su(Hv)з, которая_ не изменяет фенотипа мутации у2. В гомозиготе мутация su(hw)3 частично восстанавливает комплементацию у-аллелей, следовательно, С-концевой кислотный домен нужен для негативного действия на комплементацию.

2pr1 2 pr 2

Частичные ревертанты у , у имеют те же свойства, что и у2 мутация. Таким образом, нарушение целостности энхансера не изменяет негативного действия энахансера М1Г4 на комплементацию между у-зллелями.

2.2.2. Негативная трансвекция или трансинактивация.

Реверсия мутации у2 - у+2МС является следствием замещения энхансера МДГ4 последовательностями мобильного элемента жокея (Georgiev P.G. et al, 1990). МуТЭЦИИ su(Hw) И mod(r.dg4) не ВЛИЯЮТ

на фенотшшческое проявление этого аллеля, что является следствием делеции энхансера МДГ4. В гетерозиготных самках у+2КС/у2 в присутствии двух доз мутации mod(ir.dg4)lul происходит сильное уменьшение пигментации ножных щетинок и волосков и слабое -грудных, брюшных и крыловых щетинок (табл.5). Такой же по силе эффект наблюдается в- сочетании мутации у+2МС с частичными

5pnn + 2МС +2МС

ревертантами у и у . В гомозиготных у /у самках две

лозы мутации mod(mdg4)lul не вызывают никаких изменений. Наконец, производные мутации с фенотипом y1(y59b) , у которых делегирован промотор гена yellow и энхансер МДГ4, в гетерозиготе с ут2МС аллелем не имеют эффекта (табл.4). Таким образом, в данном случае энхансер №4 влияет трэнснегативно на экспрессию гена yellow в ГОМОЛОГИЧНОЙ хромосоме. В конструкции у самцов y+2HC/Y-y2sc+ негативный эффект мутации mcd(jr,dg4)lul не наблюдается, в отличие от позитивного эффекта трансактивации, где у самцов y59b/ï-v2sc+ пигментация востанавливается почти до нормального уровня. Таким образом, эффект трансинактивации является более слабым -л зависит от гомологичного спаривания.

В лаборатории В.Корсеса (США) было показано, что белок zeste

о ÇQh

существенен для проявления эффекта трзнсвекцки у /у . Мутация 2v77h (инактивация белка zeste) приводит к супресии комплеменатцва МбВДУ аллелями гена yellow (Geyer, et al, 1990). Нами также был проведен анализ влияния мутации zv77h, однако, в проанализированной гетерозиготе у2/у+2мс мутация zv7/h не имела эффекта (таб. 4). Другие две мутации в локусе zeste - z0p6, z1, так же не оказывали действия на эффект трансинактавации (табл.4). Таким образом, белок

Таблица 4 Роль мутаций в генах супрессор Hairy wing и модификатор МДГ4 в негативном эффекте энхансера МДГ4 на транскрипцию гена yellow в комбинации у+2КС с другими у-аллелей.

Комбинация Пигментация у+гмс/у* 2 чл. ЩЕТИНКИ Ят1 аллелей______антенн___Fp__Bp__Kg___Н_____

у2 0 3 4 3 1 1

y2PRl 1 3 4 3 2 2

2PR2 1 3 4 3 1 2

y+2,1CscD1 1 5 5 5 3 5

y2scD1 0 2 3 2 1 1

y+sc3B 1 . 5 5 4 1 1

у2* 0-1 5 5 5 5 s

y2 zv77h 0 4 5 2 1 2

y59b 0 5 5 5 5 5

Обозначения см. табл. I и 2

zeste скорее всего не имеет большого значения в этом взаимодействии. Гетерозигота мутаций у+2ис и sc3B (МДГ4 находится между генами yellow и scute) также приводит к эффекту трансизактивации. Таким образом, изменение расположения энхансера МДГ4 в одной хромосоме относительно промотора гена yellow з другой не сказывается на эффекте трансинактивации. В гетерозиготе /уу+, где ут - дикий аллель локуса yellow из линий oregcn, мутация mod(radg4)lul имеет слабо выраженный эффект: Еожные волоски и второй членик антенн желтеют, другие щетинки не меняются. Следовательно, присутствие ЩГ4 в обеих хромосомах усиливает эффект трансактивации.

Мутации su(Hw)e7, sufHw)3, su(hw)v в гетерозиготном состояннии супрессируют почти полностью негативное влияние мутации

lui 0 gov

mod ( Kdg4 ) , мутаЦИИ su(Hw) , su(Hw) , su(Hw) СупрбССИРУЮТ этот эффект только частично. Таким образом, в случае трансинэктивации транскрипции гена yellow в щетинках и волосках наблюдаются такие же закономерности, как и в случае негативного елияния энхансера МДГ4 у самцов.

2.3. Влияние мутаций В локусах supressor of Hairy wing И modifier of mdg4 на фенотипическое проявление супернестзбильных аллелей В локусе yellow Droaophila melanoçjaster.

Супернестабилькая система в локусе yellow возникла на фоне мутациии.»-у2. Предварительный молекулярный анализ показал, что супернестабильные мутации вызваны инсерцией последовательности в 150 п.н. от промотора гена yellow неизвестной природы (X), на конце которой находится делегированная копия Р-элемента (Б.Крачинска и др., 1992). При введении в линию с супернестабильными мутациями гена, кодирующего белок транспозазы, происходит иддукция нестабильности, в процессе которой аллели с частотой, достигающей распадаются с образованием аллелей с повым фзнотипическим проявлением (Георгиев П.Г. и Елагин В.А., 1990). При анализе фзнотипического проявления супернестабильных у-алделей было выделено 12 зон кутикулы, в которых ген yellow может иметь независимую экспрессию. В общей сложности было получено около ста аллелей, которые различались по фенотипическому проявлению, при этом все изменения происходят внутри инсерта X. Можно предположить, что регуляторные элементы, находящиеся з инсерте X, влияют на

Таблица 5. Влияние мутаций su(hw) и nod(radg4) на фенотипическое

проявление супернестабильных аллелей в локусе yellow

5 Индекс" Изменение степени пигментации различных зон кутикулы:** аллеля________Т___Е___Л___0_______________Ш_Е_Т_И_Н_К_И____

Н п-с т к РП гк 2А лр к ПГ -Гр Бр Кн КБ Н

, 2 I I 8 8

у II—И—II—II—II—55—55—55—55—55—55—55—55-

2.

2bs 8 8 8 8 о 8 8 о

* -11—11—01—01—01—55—35—55--01—13 — 13 — 02—13

XX Oi ОХ ОХ X # X х * |

2s

ds

-45—55—55 — 35 — 45-X РХ П8 Ох

-11—11—00—00-,0# 0}

8В 82 х ох -22 — 22—22 — 22—4 4—55—55—55--55—55—55—55—55-

4

wins

-00 — 34—00—00—00—3 4 — 23 — 34- -00—00 — 23 — 23—00-у..... §¥ 8$ §| 8? 8? 8?

У+lbs

8# 8# ох ох Шг 8й о 8 8

33 — 33—01—01—11—55—55—55- -00—22 — 45—23-12-

Примечание: Цифра определяют степень пигментации данной зоны кутикулы: 0 - отсутствие пигментации, 5 - нормальный уровень пигментации. Первая цифра определяет границу вариабельности данного класса аллелей го степени'пигментации, вторая верхнюю."О" и "х" определяют степень изменения уровня пигментации данной зоны кутикулы при введение мутаций и той(тйдл) соответственно

(езд цифрами - увеличение пигментации, под - уменьшение). Количество "О" и "х" соответствует изменению уровня пигментации всех ^-азледей' Данного класса. Количество "О" и "9" определяет яепень вгряабзльности в измбйении ушвня пигментации для данного класса у-аллелей. Остальные обозначения см. в табл.1.

экспрессию гена yellow. Другим возможным механизмом влияния инсерта X на экспрессию гена yellow является наличие промоторов в инсерте X, с которых начинается транскрипция гена yellow.

Ранее у дрозофилы были описаны мутации в ряде генов, которые модифицируют фенотип мутаций, связанных с инсерциями мобильных элементов в транскрибируемую область генов (обычно в кнтроны или лидерную последовательность). Предполагается, что эти гены регулируют созревание мРНК. Если в супернесгабилькьгх аллелях

транскрипция начинается с промотора в элементе X, то тогда мутации, влиявдяе на созревание мРНК, будут определять фенотипическое проявление таких аллелей. Для проверки этого были использованы следующие известные мутации: e(we), su(f), e(wa), su(pr)3, sufpr)4, их двойные и тройные комбинации. Для анализа было взято 17 супернестабильных у-аллелей с наиболее характерным фенотилическим. проявлением. Во всех проведенных экспериментах были получены отрицательные результаты, т.е. супернестабильные у-аллели не взаимодействуют с мутациями, влияющими на созревание мРНК. Кроме того, для трех у-аллелей было показано, что размер мРНК гена yellow не изменяется по отношению к у^-аллелю (Самарина О.П., неопубликованные данные). Гаки?-! образом, все имеющиеся данные говорят б пользу того, что экспрессия гена yellow определяется взаимодействием регуляторных элементов инсерта X с промотором гена.

Следующей задачей было изучение роли мутаций в локусах супрессор Hairy wing И МОДИфИКЭТОр ВДГ4 В ЭКСПреССИИ гена yellow Б зависимости от супернестабильного у-аллеля, который определяется структурой инсерта X. В общей сложности было проанализировано 134 у-аллеля. В табл.5 описаны наиболее характерные примеры влияния мутаций su(Hw)2 и nod(mdg4)lul на фенотипическое проявление у-аллелей.

Все у-аллели по характеру взаимодействия с мутациями su(Hw) и mod(mdg4) можно разделить на две группы. К первой относятся те аллели, на которые мутации su(hw) и mod(œdg4) не влияют. Эти ьллели могут иметь любое фенотипическое проявление: от полностью кепигментированной кутикулы до суперэкспрессии гена. Ко второй группе откосятся аллели, на фенотипическое проявление которых мутации su(Hw)2 и nod(ndg)lul могут оказывать разноообразное влияние. Можно выделить два основные варианта действия мутаций

su(Hw)2 и mod(mdg4)lul на фенотипическое проявление у-аллелей. В первом варианте мутации влияют на пигментацию у-аллелей в противоположном направлении (табл.5.1-2). Наиболее интересны аллели типа y2s (I), который по фенотипу и по взаимодействию с мутациями su(iiw)2 и ffiod(mdg4)lui не отличается от исходного у2 аллеля. Полное сходство эти аллели проявляют также в сочетании с другими мутациями su(hw) 'и их комбинациями с мутацией mod{mdg4)lul. Таким образом, инсерт X в аллелях у23 не влияет на транскрипцию гена yellow. Мутация y2bs (таб. 5.2) в комбинации с регуляторными мутациями имеет аналогичные свойства. В общем, мокло еыдэлить группу аллелей, с любым фзнотипическим проявлением, в которой, как и з случае мутации у2, мутация su(Hw) увеличивает, а мутация mod(indg4) -уменьшает пигментацию кутикулы.

Для большей части у-аллелей мутации su(hw) и mod(ndg4) действуют в одном направлении, либо увеличивая, либо уменьшая пигментацию (таб. 5.3-6). При этом наблюдается ряд общих

у

закономерностей: I) мутация su(Hw)' имеет более сильное или равное по величине действие; 2) комбинация su(Hw)2 mod(mdg4)lul по силе эффекта равна мутации su(Hw)2; 3) слабые мутации su(Hw)D и siuhw)3 почти не изменяют пигментации, мутация su(Hw)e7 имеет более сильный эффект. Таким образом, в зависимости от структуры инсерта X белковые продукты генов супрессор Hairy wing и модификатор МДГ4 могут активировать или ингибировать транскрипцию гепа yellow.

2.4. Получение новых аллелей в локусе модификатор МДГ4.

С целью приобретения новых аллелей локуса mod(mdg4) была проведена обработка самцов музейных линий y+w"ct' и y'ct'f этилметансульфонатом, которые скрещивались затем с самками музейной

ЛИНИИ y'ct'v; raod(ndg4)1u'/mod(Bdg4),u1. В Общей СЛОЖНОСТИ бЫЛО

проанализировано 34785 потомков обработанных трехдневных самцов и не было получено НИ ОДНОЙ мутации В локусе mod(mdg4). В то же время В ЛИНИИ С генотипом Уг s с Vet6 (ГОМОЗИГОТНОЙ); nod(ndg4)'"'/ mod(mdg4),u1 спонтанно возник новый аллель, обозначенный как mod (ndg4)21,1 (табл. 6). Этот аллель отличается от

исходного mod(mdg4)1ul тем, что не изменял пигментацию щетинок у^-зллзля. На другие свойства у2, а также на мутации scD1 и et6 inod (mdg 4)21,1 ВЛИЯвТ ТЭКЖе как исходная мутация raod(radg4)"". Поскольку мутация mod(ndg4)a" не уменьшает, пигментацию щетинок в

у , можно было предположить, что в этом случае ген-модификатор не влияет на фенотип щетинок. Но проведенный, нами анализ фенотипического проявления комбинаций супернестабильных аллелей с мутацией Dodinidgi)2"1 показал, что мутация mod(ndg4)2ut может, как и мутация mod(mdg4),u1, увеличивать либо уменьшать пигментацию щетинок. Но для всех изученных супернестабильных

lut

сохраняется правило, что

действие

,2и!

МУТаЦИИ mod(mdg4)

аллелей

сильнее, чем действие мутации юоа(п£д4)

Для получения новых аллелей в гене модификатор МДГ4 в качестве мутагена была использована система Р-М гибридного дисгенеза, в которой Р-элемент активно перемещается и вызывает разнообразные мутации.

Таблица 6. Анализ влияния мутации в локусе модификатор ВДГ4 на фенотипическое проявление мутации у4".

Индекс аллеля

mod(mdg4)

mod(mdg4) mod(mdg4) mod(mdg4)

I и 1 ги 1

Степень пигментации различных зон кутикулы*

Щетинки

Кн Кв H Б2 СП

5—5-3—+-

О—0—4-е-■5—5—4-е-

Т К

niod(mdg4 ) 3 и 1 mod(ndg4)1и1/2 и1

mod(mdg4) mod(mdg4)

lui/з и 1

2 U l/î U 1

-I—I-0-5-0—0-0-5-

-I—Г-0-5-0—0-0-5-

-I—I--0-5-

Обозначения см. табл. I и 2.

В общей сложности было проанализировано 53200 потомков из скрещиваний, индуцированных Р-М гибридным дисгенезом. При этом в качестве исходной линии с М- цитотипом были взяты линии, содержащий либо мутацию Tnod(mdg4)'ul, либо мутацию Eod(mdg4 j2"1. В результате Р-М гибридного дисгенеза были получены новые аллели гона mod(mdg4) и реверсии к норме - mod(mdg4)+. Один из вновь полученных аллелей -mod(iadg4)JU1 имеет промежуточный фенотип пигментации кутикулы(см. табл.6). На все другие мутации, вызванные инсерцией ЫДГ4, мутация nod(mdg4 )3U1 оказывает ТО же влияние, как Й мутация mod(n,dg4)'1''. По признаку доминирования полученные аллели располагаются следующим образом: mod (mdg4 )a">mod(nidg4 )3u'>mod(mdg4)1111

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Белковые продукта регуляторных генов su(Hw) и nod(mdg4) действуют через энхзясер МДГ4. При введении сильных мутации 5и(н«)происходит полная супрессия всех известных мутаций, связанных с иясерцией МДГ4. При этом дополнительное введение мутации nod(irdg4)J'ul не Елияет на фенотип, т.е. фекотипическое проявление МутаЦИИ I30d(mdg4)lul ПОЛНОСТЬЮ ЗЭВИСИТ ОТ ПРИСУТСТВИЯ

функционального бежа su<Hw). Можно думать, что белок mod(Edg4) контактирует не с днк, а с белком su(Hw). к такому же выводу можно прийти на основе изучения влияния комбинаций мутаций su(Hw) и Eod(n,dg4)lul на фекотипическое проявление супернестабильных аллелей в локусе yellow: сильныс мутэции su(Hw) полностью снимают все Эффекты от мутации raod(ndg4)lul.

С помощью мутаций гена su(hv), связанных с делениями различных функциональных доменов белка su(Ew) была сделана попытка определить, с каким доменом белка su(Hw) связывается белок nod (rodg4). Мы исходили из предположения, что если нарушен домен связывания белка mod(mdg4), то тогда фенотип всех исследуемых мутаций должен определяться только мутацией su(Hw) и не зависать от ее комбинации с мутацией ir.od(»dg4)lul. Полученные результаты позволяют считать, что даже удаление С-концевого ацидного домена белка su(Hw) и домена лейциновой молнии не препятствуют связыванию белка ®od(rodg4).

На основе полученных результатов можно предположить, что ингибирующие действие энхансера МДГ4 на транскрипцию гена может осуществляться по нескольким разным механизмам, зависящих от того, с каким типом энхансеров. или промоторов взаимодействует энхансер МДГ4. В одном варианте ингибирующие действие энхансера МДГ4 проявляется в присутствии мутации mod(mdg4)lul, которая ведет к резкому снижению концентрации белка nod(mdg4) в клетке, что в свою ОЧереДЬ ОСВОбОЖДаеТ беЛОК su{Hw) ИЗ КОМПЛеКСОВ С беЛКОМ mod(mdg4). Один из эффектов, ярко реализующихся в случае мутации у (действие на пигментацию щетинок) - это сильное подавление экспрессии гена-мишени (у, ас). Мутации с делецией С-концевого ащцщого домена в одной из двух копий гена su(Hw) полностью супрессирует негативный эффект мутации mod(ndg4)Поэтому можно предположить, что ингибирующие действие белка su(Hw) на соседние энхансеры зависит от

ацидных доменов, а белок nod(mdg4) маскирует эти анидные домены и снижает эффект белка su(hw). Аналогичный механизм является причиной негативного влияния энхансера НДГ4 на транскрипции гена yellow в щетинках в гомологичной хромосоме:удаление бежа mod(mdg4) открывает дополнительные кислые домены и в итоге возникает возможность для негативного действия на энхансеры на гомологичной хромосоме. Нужно отметить, что выше описанное негативное влияние энхансера МДГ4 на транскрипцию гена yellow в щетинках не фиксировано строго определенной локализацией энхансера ЬЩГ4,

2 ЗВ

который мо;кет находится перед геном (у ), после гена (sc ) или на другой хромосоме. Надо отметить, что энхансеры тала и крыльев не чувствительны к такому типу ингибирования. Интересно, что белок su(Hw) без С-концевого ацидного домена меняет свои свойства и становится позитивным регулятором, активируя транскрипцию гена yellow в щетинках, но не в теле и крыльях. Для позитивного действия белка su(Hw) не нужны домен лейциновой молнии и белок mod(mdg4). Таким образом, делеция кислого С-концевого домена превращает белок su(Hw) из ингибитора транкрипции в активатор, только для определенного типа эвхансеров.

Другой возможный механизм инактивации транкрипции энхансером ЫДГ4 проявляется в мутациях scD1, ct6 и sсзв (экспрессия гена scute). Для полного проявления негативного действия энхансера ВД'4 в этих мутациях нужен белок mod(mdg4), сохранение домена лейциновой молнии в белке su(Hw). с другой стороны делеция одного из двух активирующий доменов не играет заметной роли. При введении мутации mod(mdg4)lul происходит частичная супрессия фенотипа мутации. Следовательно, ингибирующий эффект связан с действием на транскрипцию гена самого белка mod(mdg4), а не ацидного домена бежа su(Hw).

Таким образом, энхансер МДГ4 монет активировать или инактивировать транскрипцию соседнего гена в зависимости от других регуляторнкх элементов гена. Его действие зависит от присутствия тех или иных доменов белка su(hw), который в зависимости от своего строения может выполнять роль позитивного или негативного фактора транскрипции. Подтверждение этих положений было получено при изучении влияния мутаций su(hw) и mod(mdg4) на феноткпическое проявление супернестабильных у-аллелей. Как было ранее показано, в

суперьестзбильных у-аллелях экспрессия гена yellow находится под контролем регуляторных элементов, расположенных в инсерте X. Различные по фенотшпгческому проявлению у-зллели отличаются только по набору регуляторных элементов в инсерте X. Полученные в данной работе результаты дают основания предполагать, что во всех суперкестабильных у-зллелях транскрипция начинается с промотора гена и фенотжгическое проявление аллелей является следствием взаимодействия регуляторных элементов самого гена, инсерта X и МДГ4. В зависимости от взятого в анализ у-аллеля мутации su(hw) и mod(mdg4) могут усиливать или ингибировать транскрипцию гена yellow. Таким образец, можно предположить, что регуляторные элементы инсерта X взаимодействуют непосредственно с энхансером ЩГ4, что определяет направление действия последнего. В целом полученная система с супзрнестабильными мутациями является удобной моделью для изучения in vivo взаимодействия между регуляторными элементами, расположенными па большом растоянии друг от друга.

В заключении следует подчеркнуть, что в настоящее время очень • мало известно о механизме действия энхансеров и связанных с ними регуляторных белков в активации экспрессии генов. Поэтому проблема изучения конкретных механизмов взаимодействия между энхансерами является крайне сложной. Настоящая работа является только предварительной попыткой описания возможных вариантов взаимодействия между регуляторными элементами с целью создания удобных генетических моделей для дальнейшего молекулярного анализа.

4. ВЫВОДЫ

1. Показано, что мутация mod(mdg4) не имеет самостоятельного проявления на фоне сильных мутаций в гене su(Hw).

2. Установлено, что существует несколько механизмов ингибирующего действия энхансера МДГ4 на транскрипцию гена-мишени. Чаще всего ингибирупций эффект зависит от присутствия функционально полноценного гена mod(mdg4) и не зависит от мутаций в гене su(hw), затрагивающих С-концевой-активирующий домен кодируемого белка. Для ингибирования второго типа необходимы- мутации в гене mod(mdg4), снижающие его экспрессию, и присутствие белка su(hw) с двумя ацидннми доменгми.

3. Показано, что мутация в гене su(hw), кодирующая белок с делецией С-концевого ацидного домена может активировать

транскрипцию гена yellow в щетинках.В этом случае мутации в гене

е7

nod(mdg4) и мутация su(Hw) , несущая дополнительно делецию лейциновой молнии, не имеют функционального значения.

4. Мутация mod(mdg4) супресирует'эффект комплементации между у-аллелями, зависящий от гомологичного спаривания. Делеция одного ацидного домена белка, кодируемого геном su(hw), приводит к частичному восстановлению комплементации. .

5. Открыт эф£ект негативной трансвекции, когда мутация nod(mdg4) подавляет экспрессию не только того гена, рядом с которым находится энхансер ВДГ4, но и второй копии гена yellow, расположенной на гомологичной хромосоме.

6. Для супернестабильных мутаций в локусе yellow показано, что энхансер ЬЩГ4 может либо активировать, либо инактивировать транскрипцию гена yellow в зависимости от набора энхансеров в супернестабильной вставке.

7. Получены новые регуляторвые мутации в гене модификатор МДГ4.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Георгиев П.Г., Елагин В.А., Козицина М.В., Колягин Н.П. Генетический . анализ ВЛИЯНИЯ МутаЦИЙ su(Hw) И mod(mdg4) на фзноишическое проявление супернестабильных аллелей в локусе yellow. Генетика, 1992,т.28,N8, стр.69-45 ■

2. Козицина М.В., Абрамова H.A., Георгиев П.Г. Взаимодействия генов энхансеров yellow с геном yellow У Drosophila melanogaster. Генетика, 1992, т.28, лН,стр. 9S-I03.

3. Георгиев П.Г.., Козицина М.В. Генетический анализ взаимодействия мутаций в двух генах, контролирующих экспрессию ЫДГ4. Генетика, 1993, т. 29, N3 , с тр.42-88-

4. Георгиев П.Г., Козицина М.В. Влияние мутаций в генах супрессор Hairy wing и модификатор ЦДГ4 на трансвекцию между аллелями локуса yellow У Drosophila melanogaster. Генетика, 1992,Т.23, N3 , СТр.66"?^

5. Козицина М.В., Георгиев П.Г. Получение и анализ новых мутаций в гене модификатор МДГ4 у Drosophila melanogaster. ГенеТИКЭ, 1992,т.28, N10, стр. 15-29