Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование, анализ экспрессии и геномная структура гена новой нерецепторной тирозиновой протеинкиназы Bhk

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование, анализ экспрессии и геномная структура гена новой нерецепторной тирозиновой протеинкиназы Bhk"

1 ; На правах рукописи

7 Ч дпо

ЭРШЛЕР Максим Александрович

Клонирование, анализ экспрессии и геномная структура гена новой нерецепторной тирозиновой протеинкиназы ВЬк

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических тук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в KIIK "Молекулярные основы дифференцирован и развития" Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук A.B. Белявский

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В.Л. Карпов

кандидат химических наук Ю.Б. Лебедев

Ведущая организация Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится -АЗ- . 1996 г.

в часов на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 в Институте молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН по адресу 117984, Москва В-334. ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан 1996 г.

ог.щая характеристика работы

Актуальность темы

Все многообразие клеток крови является потомством плюрипотеитпых гемопоэтнческих стволовых клеток. Постулировано, что эти примитивные клетки обладают способностью как. к делению с образованием более зрелых клеток, так и к. воспроизведению себе подобных клеток. Попытки морфологически описать стволовые клетки не увенчались успехом, и реальный прогресс в развитии концепции стволовых клеток был достигнут после обнаружения феномена колониеобразующих единиц (КОЕ). Изучение дифференцировки и самополдержанш КОЕ in vitro выявило широкий спектр факторов роста и рецепторов, модулирующих рост колоний, состоящих из клеток одной или нескольких клеточных линий. Тем не менее, молекулярные медиаторы поведения наиболее примитивных стволовых клеток in vivo, в основном, неизвестны.

Значительная часть тирозиновых прогешшшаз (TI7K) играет важную роль в гемопоэзе, участвуя в переносе внутриклеточных и межклеточных сишалов, регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. Рецеторные-ТИТС (Р-'ГПК) являются рецепторами факторов роста и, таким образом, участвуют в контроле пролиферации. Нерецепторные-ТПК (НР-ТПК) не обладают внеклеточной частью. Тем не менее, ряд протеинкиназ этого подсемейства ассоциирован с другими белками клеточной поверхности, которые обычно не обладают собственной ферментативной активностью, и участвуют в переносе сигначов с поверхности клетки так же, как и рецепторные-

тпк.

Клонирование новых тирозиновых. иротеинкиназ, экспрессирующихся на ранних стадиях гемопоэза, - это первый шаг на пути изучения процессов, управляющих дифференнировкой стволовых клеток крови.

Цель работы

Целью настоящей работы являлись поиск и изучение генов тирозиновых протеинкиназ, экспрессирующихся в стволовых кроветворных клетках мыши. Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Идентификация генов новых тирозиновых Л}рсггеинюшаз, экспрессирующихся в стволовых клетках крови мыши.

2. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности полноразмерных кДНК полученных генов.

3. Клонирование геномных копий и определение экзон-интронной структуры полученных генов.

4. Изучение тканевого распространения траискриптов полученных генов.

Научная новизна и практическое значение работы

Клонирована кДНК повой тирозиновой протеинкиназы ВИк и определена ее иуклеотвдяая последовательность. Производная аминокислотная последовательность ВЬк обладает рядом черт, позволяющих отнести проклонированную протеипшназу к ТНК семейства Сек. Обнаружено три альтернативно сплайсируемых типа мРНК Ькк. Клонирована геномная копия, получена ресгриктная карта и устаноалена экзон-шггронная структура гена Ыгк. Выяснен механизм образования альтернативно сплайсируемых мРНК. Изучение тканевого распространения траискриптов гена показало, что мРНК Ыгк экспрессируется в головном мозге и гемопоэтической системе.

Открытие гена ново» тирозиновой протеинишазы, относящейся к классу ингибиторов активности ТПК семейства Src, многие из которых яшшотся онкогенами, позволяет более детально изучать пути активации, в том числе и патологические, ТПК семейства Src па молекулярном уровне, что может быть использовано в поисках рациональных путей терапии некоторых форм злокачественных заболеваний.

Апробация работы

Результаты данной диссертации были представлены на 24-тон ежегодной конференции международного общества экспериментальной гематологии (Дюссельдорф, Германия, Август 1995).

Публикации

По материалам данной диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 100 страницах машинописного текста. Она включает введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, выводы и список литераторы (всего 250 названий). Диссертация содержит рисунков и 4 таблицы.

Содержание работы

Клонирование гена новой тирозиновой протеинкиназы, экспрессирующейся в стволовых клетках крови мыши.

Для идентификации ТПК, экспрессмрующихся в стволовых клетках крови, мы использовали полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с вырожденными праймерами [Wilks, 1989], соответствующими аминокислотным последовательностям, которые консервативны для субдоменов VI и IX каталитического домена ТПК [Hanks et al.,

1988; Hardie & Hanks, 1995]. Фрагменты кДНК были клонированы и секвснироианы. Всего было отсеквенировано 95 клонов, из них 68 содержали фрагменты генов ТПК, поскольку в них присутствовал высококонсерватявный аминокислотный мотив DFG, характерный для подавляющего большинства лротеинкиназ [Ilanks et al., 1988; Hardie & Hanks, 1995], В общей сложности обнаружены фрагменты 10 генов, включая рецепторные ТПК: flk2, tie] и ген рецептора инсулиноподобного фактора роста, а также гены нерецепторных ТПК: jakl, jak2, Jes, етк, cdk4 и csk. Один из клонов (tykl3) не был описан ранее и был взят для более подробного исследования. Впоследствии, на основании картины тканевой экспрессии, проклонировашшй ген получил название bhk (brain and hematopoietic kinase).

Клонирование полноразмерной кДНК гена bhk и анализ ее нуклеотиднай последовательности.

Для получения полноразмерной копии кДНК гена была сконструирована библиотека кДНК из костного мозга мыши. В результате скрининга 1.2x10^ бляшек были обнаружены три независимых клопа, содержащих перекрывающиеся кДНК копии bhk. Нуклеотидная последовательность наиболее протяженного из этих клонов - 311 (длина вставки - 1656 пуклеотидных пар ) содержит альтернативный сайт полиаденилирования CATAAA на расстоянии 27 п.п. от 3' конца и обладает открытой рамкой считывания размером 465 аминокислот. Производная аминокислотная последовательность обладает на N-конце метионином, подходящим на роль инициирующего [Kozak, 1987], и содержит SH2. SH3 и каталитический домены. Подобная структура аналогична структуре НР-ТПК Csk [Nada et al., 1991; Partanen et

Регистрационный номер в байке данных EMBL S77473

внк

CSK ABL HCK SRC

BUK C3K ABL HCK SRC

-MARRlgRV^ílgFljKESRDlgRVBl

i---------------------mleiclklvgckskkglHSÍS^YLEB^QRFVASDFER

i ------------------------MGCVKSRFLRDGSK^KTEPlfjNQKGPVYVPDPTlp

1 MGSNKSKPKDASQKpíSLEPSEblVIlGAGGAFPA3QTPSKPASADGHRGPSAAFV:{jAMB |—э ***** , **» SH3 ломен *»***•»**»

27 F^gAKHPAPAAARM-PTQPBJl^Q-BnfCENSRPKPGE;

1 ------------«SA-IQA£§PfaE-BlPiniFHGTAEQt

4 0 QGLSEAARWKSKENL-LAGPSENDPNLFVALYDFVASGDNT 37 SKlj|pt'fNSMS-M-P?Ci:VEGSEDri-V-VALYDYEAIHREt: 61 KggGFKSSDTVTSPQRAGAlgGg'/TTFVALYDYESRTETC

IV{SjEACE3<a V:EEavtkSfn klr\0gynhnge

2m-vv-----ie

CRLCfjVNKTRKVD

IHK-v^aiiiBJYvoiMsvFAGT^^q^^REtcEa-i •

3EKWKARSI,ATKKSCATPSHYVARVNÍ^ETEFB^C¡pRKr:№RKl í ¿GDWWLAHSLSTGQTGYIPSNYVAPSDSIQAEiraYE^rrRRBESRI.I SH2 домен

ВНК CS К AEL HCK SRC

f-H3----RD|

ARHRjfflHV ___

гиуШш^йайШ-ск----GKi

SSS^pRSISLR-YE----GR

4TTbHEa-ÍjCffl4D|DFCIÍGDT| ЕТТЖвЦЕ&ГЫЗМАКСЬК

iBSv-LiiPDfl«H

^.fcghi-myhasf; j:fmí~3''¡¡

YR?||INTAsE9üaYVSSESP|

-- l®KVKESlV/02Dg?YR.c hypißkgmkptiygvspnydk-|

svflcvs-p-Spq- KPWEgD/,

j!IADGI@HPg—TTVCPT-S

R _

KYSI

K-HI M|PGSMSVF,RÍ|7{; AÑ^?JÍ¡¡|!DKÍ

G-П LljPGTKSPE^iJijlACE^bl^EKE

************** TK домен

^LDYMECK^EQAV\|^M^QI 3SA| IL ГЩКЗ E E G S ко PL F■И« ГЩЗ AQIÄ F TlfC |LrfijKGETGKYLRLiCäf/DMSAQI®5^-'\S,.l

Ш-AERK-GI, -EASS=ycSTG-KE SlSRLMTGD'nYlTAHAGAKF IEDNnY|?AREGAKF jgJRL 1E DM ПУр ARQG AK F

|eylqaehedyft§te

BHK 486 VgAAGgOSAEGSAPTRSQD?----505

CSK 443 I.Hb---------------------450

ABL 502 I@DEVEKÜLGKRGTRGGAGS// 1123

HCK 497 SqVbQQP-----------------503

SRC 533 PQ¡Yj5F@ENL---------------541

Рисунок 1. Сравнение аминокислотной последовательности Bhk с последовательностями С&к крысы и Hck, Src и АЫ мыши. Bhk представлена 505 аминокислотным вариантом, стрелочкой покатано начало последовательности клопа 311. Для АЫ показаны первые 1123 ал. фоном выделены аминокислотные остатки, совпадающие с последовательностью Bhk. Тирозшш, соответствующие Y416 и Y527 куринош Src, заключены в рамки. Звездочками обозначены области, соответствующие S113, SH2 и каталитическому доменам.

al., 1991] и других НР-ТПК [Bolen, 1992] (см. рис. 1). Сравнение производной аминокислотной последовательности с последовательностями банка данных SWISSPROT (27 выпуск) показало наивысшую степень гомологии для Csk крысы (51.1%), затем следуют продукты мышиных генов src, abl, hck (32.1%, 30.7% и 29.5% соответственно). Степень гомологии между Bhk и Csk высока на протяжении всей последовательности и составляет 36.7% для SH3 домена, 57.3% для SH2 домена и 60.0% для каталитического домена (см. рис. 1). У производной аминокислотной последовательности bhk отсутствует сайт миристинилировапия на N-конце последовательности (глицин в положении 2), характерный для ГПК семейства Src [Towler et al., 1988]. Также отсутствуют два высококонсервативных тирозиновых остатка, а именно, сайг аутофосфоршшрования, соответствующий Y416 куриного p60c-src, который строго консервативен и для нерецепторных, и для рецепторных ТПК [Hanks et al., 1988; Hardie & Hanks, 1995], a также расположенный в С-концевой части тирозин, соответствующий Y527 куриного p60c"src, фосфорилирование которого ингибирует каталитическую активность ТПК семейства Src [Cooper & Howell, 1993]. Bhk содержит сериновые остатки (S342 и S343) в районе, соответствующем вышеупомянутому Y416. Так как подобной совокупностью структурных черт до сих пор обладала исключительно ТПК Csk, то Bhk была нами отнесена к этому семейству протеинкиназ. Друтими авторами было показано, что Bhk способна фосфоршшровать карбоксиконцевой тирозин Lck [Klages et al., 1994], то есть не только структурно, но и функционально аналогична Csk.

Обнаружение альтернативного сплайсинга 5' нетранслируемой области mPIIK ЫА.

Отсутствие стоп-кодонов в 5' нетранслируемой области (5'-НТО) кДНК bhk указывало на возможность существования дополнительных кодирующих последовательностей в неклонированной части мРНК. Для клонирования этою района была применена процедура быстрого амплифицирования концов кДНК [Harvey & Darlison, 1991]. Полученные последовательности разделились на дне группы, получившие название RACE1 и RACE2* (см. рис. 2). Пи RACE1, нн RACE2 не обладали дополнительными инициирующими (ATG) кодонаии, и, напротив, обладат стоп-кодонами в рамке с ранее полученной последовательностью. В том же году независимо от нас была опубликована последовательность кДНК гена ntk [Chow et al., 1994], которая оказалась идентична последовательности bhk за исключением вставки размером 134 п.н. в 5' области кДНК (см. рис. 2). Таким образом, существуют по крайней мере три варианта мРНК гена bhk. Две из этих трех последовательностей отличаются только в 5'-НТО. Третья последовательность кодирует белок с альтернативной N-концевой частью размером 505 аминокислот.

Несмотря на то, что мРНК некоторых ТПК, например Ick [Garvin et al., 1988] и igfr-lJ [Nielsen, 1992], обладают альтернативно сплайсированными 5'-НТО, функция этих районов до конца не выяснена. Известно, что 5'-НТО Moiyr модулировать деградацию [Roy et al., 1992; Spinn, 1994] или регулировать эффективность трансляции мРНК [Gabrielsen et al., 1995]. Таким образом, 5'-НТО мРНК bhk, возможно, принимает участие в регуляции трансляции и/или стабильности мРНК. Аминоконцевая часть НР-ТПК наиболее вариабельна, считается, что именно она

* Регистрационные номера в банке данных EMBL Х89723 и Х89724.

ntк (2-3-4) race1 (2-4) race2 (1-4)

ntk (2-3-4) race1 (2-4) race2 (1-4)

ntk (2-3-4) race1 (2-4) race2 (1-4)

ntk (2-3-4) " race1 (2-4) race2 (1-4)

ntk (2-3-4) eace1 (2-4) race2 (1-4)

нтк (2-3-4) race1 (2-4) race2 (1-4)

ntk (2-3-4) race1 (2-4) race2 (1-4)

gaaggctaggattcagcggggacccgagagcacccggcacctggtactcagcactc

"tgcccggacggagtgaggcgcacgggaggaggtggcagcgcggacttagtgagaccggcg

ctaggacccgcgggggctccgagccgggtcccctccatccttgccccaaaatgaggagcc ttttgtgagcttggagttgggtccagatggagtaccgtctg

gggaccctccgag

ttgcaagttgctccgagttgagccactgggtgctcgacccgctggcaggc5accctccgag ggccgcgcagctcgctgaagccgcaaagagccgcagcatctgaccctcccgccccaagtc

2

ggtcgcgcctaagcag ccctggctgccacctgggccagatcactccattcctgactctgg

3

ggtcgcgcctaagcag--------------------------------------------

cggtccccacggggcaggagaccctgtgcaggccaactgaggccaaagcacagaactgga

marrssrvswlaf gcctcagtttcccttcccgagcaatggcaaggcgaagctcccgggtctcctggctggcct

acccaagataaggcaggaaatcagcctgsccgccagggtgctaaaggctggacccaggct

egwesrdlprv

ttgaaggctgggaatctaoggacctgcctcggc :gagccctagattgttcggagcttggc

gcggatgcaggggagcgttgctaggagacaagg ?gagccctagattgttcggagcttggc

prlfgawh

"gagccctagattgttcggagcttggc

papaaarmptr ntk (2-3-4) accccgcgcctgctgcagctaggatgccaacgcag

race1 (2-4) accccgcgcctgctgcagctaggatgccaacgcas

race2 (1 - 4) accccgcgcctgctgcagctaggatsccaacgcag

m p t r

Рисунок 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей и соответствующих им производных аминокислотных последовательностей альтернативно сплансируемого 5' района bhk. В скобках после названия указаны номера экзонов, участвующих в создании данной последовательности. Вертикальными чертами показаны границы между экзонами, а цифры рядом с чертой означают номера этих экзонов. Предполагаемые кодоны, инициирующие трансляцию (ATG), показаны жирным шрифтом, а терминирующие кодоны, расположенные "вверх по течению" в рамку с каждым из типов кДНК, подчеркнуты. Первые 228 п.н. гена ntk показаны согласно [Chow et al., 1994].

обеспечивает биологическую специфичность ТПК. Известно, что связывание Lck с цитоплазматической частью CD4 и CD8 опосредовано 32 ампноконцевыми остатками Lck [Turner et al., 1990], a аминоконцевои домен Fyn, но не Src и Lck, ассоциирован с Ç субъедннипей рецептора Т клеток [Gauen et al., 1992]. По аналогии, альтернативно сплайсированные аминокоицевые части Bhk могут участвовать в связывании с белками мембраны или обеспечивать специфичность Bhk к субстратам.

Клонирование геномной копии bhk и определение экзоп-интронпой структуры

Для выяснения механизма образования различных форм мРНК была проклонирована геномная когтя bhk из геномной библиотеки мыши (линии 129SVJ), сконструированной в векторе X FIXII (Slratagene, San Diego, CA). Среди 1x10° рекомбинантных бляшек было обнаружено 16 сигналов. Два независимых перекрывающихся клона, 4.1 и 4.2, были использованы для дальнейшего исследования.

Была получена соответствующая рестриктная карта при помощи двух методов: полного гидролиза ДПК при помощи нескольких реяриктаз (BamHI, EcoRJ, HindlII, Notl) и комбинации неполного гидролиза с непрямым мечением концов [Rackwitz et al., 1984] (см. рис. ЗА). Экзон-интронная структура была определена путем амплифицировання фрагментов геномной ДНК при помощи праймеров, специфичных к последовательности кДНК bhk (размеры и расположение получившихся фрагментов приведены на рис. ЗВ). После частичного секвенирования амплифицированных фрагментов были определены экзон-интронные сочленения (см. таблицу). Геномная структура гена состоит из 13 кодирующих и 2 некоднрующих экзонов и простирается на 10,5 т.п.н.. Кодирующие экзоны занимают 5,0 т.п.н. геномной ДНК. Размер экзонов варьирует от 60 до 355 пл., в то время как размер нитронов более гетерологлчен и варьирует от 0.08 до 4.2 т.п.н. (см. таблицу). Каталитический домен

1 т.п.и.

Л 4.1

X 4.2

В

I

N

_1_

В N RH BR N R Н BR R

_L__I.II II .. 1; I I_U_L

H

Б)

N1

чь

N4

3 4

* и

N3 С1 Р14

5 6

I

ч* *

С2 Р7 Р12 PI 5

Л

Р8 PI

Р9 Р2

10 II 12 13 14

* ♦ ♦ *

Р6 Р10 Р4 РЗ

. В-Ais *<

Р5 Р13

I—т

-II \ II

6.0-6.2 т.п.н.

0.34 т.п.н.

1.05 т.п.н.

1.85 т.п.н.

0.7 т.п.н.

1.5 т.п.н.

2.7 т.п.н.

TT

1.35 т.п.н.

0.46 т.п.н. 1.85 т.п.н.

Рисунок 3. Структура гена bhk. А) Расположение и рестриктиая карта перекрывающихся геномных клонов (B=BamHI, N=NotI, H=HindIII, R=EcoRI). Б) Определение экзон-интронной структуры гена bhk. Экзоны обозначены прямоугольниками, цифрами обозначены номера экзонов. Стрелочками обозначено расположение и направление пранмеров, использованных для секвенирования, ниже приведены названия праймеров. Полученные амплифицированные фрагменты расположены с соблюдением топографии, размеры приведены над фрагментами. Отссквенированные участки выделены фоном на схеме в центре рисунка. !

Таблица. Экзон-интронная структура ЬЬк.

Интрон э К 3 О н Интрон

сплайс акцептор N0 размер,н.п. сплайс донор размер. Т.П.Н.

шВНК МБК тВНК ьезк

1 >252 >68 дЬдад^пдд 4,2 >6.4

2 >257 - оотлласле; дЬдадсдЬд 0,6 -

ь Р И

сасасасад С сст вас ТСС 3 134 - стс ССТ ССС 0,17 -

[V Б Р) и Р т

сс^сасад С'ГС лас сст 4 60 80 лтез ССА лса дЬдадЬдЬд 0,75 0,3

а р. и А С Е

САС ссзс тов 5 114 114 исс ТОТ САС д1дададдд 0,05 0,1

О к э ь М р

ссЬдЪасад НАС ААС лас 6 116 113 стс лга сс дЬдадЬпдс 0,08 0,33

w Р н м V Е

А ТОО ТТТ САТ 7 220 220 Ата стга вАЯ 0, ЗЕ 0, 92

н т т ь А к

ссьссасад САС ТАС АСС Я 91 94 стс осс ЛАй в дЬа!дадад 0,7 0,18

А в м Е р а

^^Ьдсад сг же ТОО 9 66 66 але ттт ООА б дЬдаддздд 0,5 0, 08

л V I, V м т

сс(:ссасад сс стс СТА 10 100 1С0 ятсз Ата АС дЬдадГ.дСЬ о, оа 0,09

к ь с V э к

ассссссад а ААИ ста САС 11 85 91 ото ДОС ААО д^дьдсадд о, оа 0, 42

а N I, р А ь

с^ааасад изс ААС стс 12 74 74 ттт ЙСТ ст дЬаад!дас 0,09 0,1

н V А к к я

tgtctctag т елт атт ест 13 196 196 ААА ААС сва gtgagcagc 0, 28 0,3

й Р £ Р к м

дсссаасад саа гте тсс 14 87 87 ССС ЛАЗ АТЭ gtggtgagc 0, 09 0,25

3 г. к

tgtccacag той СТА ллв 15 >355 866

Нуклеотщшые последовательности экзонов даны заглавными буквами, последовательности нитронов строчными. Производная аминокислотная последовательность дана над нуклеотидной. Аминокислоты экзона 4 приведены в скобках, так как они транслируются только в одном из вариантов мРНК. Жирным шрифтом выделены размеры совпадающих у двух генов экзонов.

В1тк, соответствующий 657 п.н. последовательности кДНК, кодируется 7 экзонами (с 9 по 15) и простирается на 1.3 т.п.н. , в то время как БШ домен кодируется двумя экзонами (6 и 7), а БНЗ домен - одним экзоиом 5. Инициирующие кодопы расположены в экзонах 3 и 4.

внк

csk fes 3 61

тшШШШШШШМШШтШШттт-«*!

втк 2 04 pep-añapvstselkkwalydympmnakelqlrkgdeyf'iii-eksnlpwwrardk-ngb src 74 tspqragpia-ggvttfvj^ydyesrtetdlsfkkgeelqivm-t^raffs^kntlcj

csk — -------------------------------.üíxailíiííü—

fes 4 2 _______

втк 261 ijsf^f'fl^^^^j^glwyskhkrrsqaéqlbk^^t^l^^^^

src 132 "ggkitrreserllmaehgrctflvresetrkgá^al

bhk 114

csk 11s

- J >7 V » * .1* V ' V ' - : « - V, ^ ' i V. 'T í , г г г Г Г'-"»'»*"' »'-чяглл'« r»

fes 479

втк 319 ts,?|»tórgdpqgtir¡iyvvcstpqsqyyi^kilfstipebim,hqraseí.f£kgss?s

src '190 i^^síss^slsssslsssshmcfissktv

bhk 171 rkqg - aks - VAVKNIkcdv

csk 172 vmeg-tvaaqdefyi^.é^ax^^i^'^vf'^f^^^^^^^^^^^^^^^^" -vavkciknda

fes 538 vtkjcsgwlhravpk£í¿^^íj^||j^^|gnfgevfsgrxradntlvavkscretl

втк 3 78 g^^^^^^^gswe™dp103ltflkelgtgqfgvvkygkwrgqyd-vaikmikeg-

src 248 c--ptskpqtqglaiaaweipreslrlevklgqgcfgevwmc^igj2í^síí^bss

bhk 228

CSK 229 t-a-qa-fiah^vmtgw'b'^'^í?^^

fes 597 ppdlkakflqeai$p||f^«!f||\;^

s»c 3 04 ндшишшмй^шм^^

bhk 283 vstsqliefm^fes^sp1^

fes 655 uwawwgpftmswkb^^

btk 493

src 361

bhk 341

csk 344 вт-й^муяй^^

fes 715 g|^^^í^#|^|;,^||;||syssesdwsfgillwetfslgaspypnlstjqqtrefve

src 421 ggggak-fpikmtapeaalygrftiksdvwsfgilltelttkgrvpypggg^í^^lg

csk 401

FES 77Ь .....—

втк 612 qgl^yrphpvs£kottiotscbh^ -----------

bhk 458 шщщт

csk 450 --------

fes 822 --------

втк 659 --------

src 53 6 --------

Рисунок 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей Bhk, Csk, Fes, Btk и Src. Участки, кодируемые чередующимися экзонами, выделены фоном.

Сравнение экзон-интронной структуры гена bhk со структурами родственных киназ

Дтя изучения эволюции семейств НР-ТПК, мы сравнили геномную структуру bhk с известными структурами других НР-ТПК. К настоящему моменту определены структуры генов следующих семейств ТПК: fes [Brauninger et al., 1993], csk [Brauninger et al., 1993] и btk [Rohrer et al., 1994], для ТПК семейства src определена полная структура для src [Tanaka et al., 1987], fgr fPatel et al., 1990], Ick [Rouer et al., 1989] и геномная структура кататитического домена hck [Hradetzky et a!., 1992]. Лля семейства abl/arg описаны только два геномных фрагмента гена arg [Kruh et al., 1986]. Ранее было показано, что структуры геноз ТПК семейства Src практически идентичны [Hradetzky et al., 1992], а консервативность экзон-интронных границ внутри ышазного домена продемонстрирована и для двух семейств Р-ТПК: для генов инсулннового рецептора [Sieno et al., 1989] и гоч [Matsushime et al., 1986], для c-kit, csfl-r и flk2/flt3 [André et al., 1992; Vanderbark et al., 1992].

Для сравнения мы гыбрачи геномные структуры csk, src, fes и btk - представителей четырех семейств НР-ТПК. Сравнение на аминокислотном уровне показало, что границы экзонов и интронов bhk и csk идентичны (см. рис. 4). Сравнение bhk/ csk и src обнаружило три общие границы: Ш41/ csk43/ srcll7, bhk269l csk212l src347 и ЫгШИ csk390! src468. Сравнение bhk/ csk с fes обнаружило так же три общие границы: bhkl85/ «А! 86/ fes551, Ш'269/ csk272/ fes641 и Ш357/ csk360f fes735. Сравнение между bhk/ csk и btk выявило следующие общие границы: Ш80/ csk8H btk280, bhk\85/ csk!86l btk392 и bhklAOf csk24H btk450. Несмотря на то, что структура bhk/ csk обнаруживает общие границы некоторых экзонов со структурами других НР-ТПК, эти совпадения носят скорее случайный характер, никакой очевидной закономерности не прослеживается.

Идентичность геномных структур Ыгк и схк еще более очевидна при сравнении нуклеотидном уровне. Из 15 экзонов Ыгк только два экзона, 2 и 3, не имеют аналогов ср экзонов сзк (см. таблицу), причем первые три экзона Ъкк образуют три альтернатив( формы мРНК гена ЬНк, в то время как у сзк альтернативный сплайсинг не был обнаруж Из оставшихся 13 экзонов, три экзона, 1, 4 и 15, содержат иетранслируемые районы; дес экзонов имеют идентичные границы, из этих десяти - восемь экзонов имеют одинако) размер, а два, 6 и 11, отличаются от их аналогов гена свк на 3 и 6 нуклеотидов.

Все вышеперечисленное еще раз подтверждает предположение, что Ыгк и csk относятс одному семейству ТПК, и могли произойти в результате дупликации одного гена.

Изучение экспрессии мРНК гена Ыгк

Для изучения тканевого распространения транскригтгов Ыгк была предпринята нозс] гибридизация клонированного гена с препаратами тотальных РНК, выделенными различных тканей мыши. Экспрессия мРНК размером около 2.0 тысяч нуклеотидов бь обнаружена в мозге и кроветворных органах: тимусе, селезёнке и костном мозге - при'' уровень экспрессии в мозге существенно выше, чем в других органах. В плаценте, пече: сердце, почках, скелетной мышце, легком и фетадьной печени экспрессия не детектируе (см. рис. 5).

Для детализации картины экспрессии мРНК ЬНк в мозге была предпринята нозе| гибридизация гена с препаратами РНК, выделенными из различных отделов мозт (см. р 6). Экспрессия дублета 2.0-2.2 т.н. была обнаружена во всех отделах мозга, но уров( экспрессии в гиппокампс и коре в 2-3 раза выше, чем в остальных отделах.

Рисиц'К ^к'мре^си"/! мРНК hhk t. р«п.ш^иы\. тканях мыши. На tv и» н;.несены npeiup«}1 ы iñíá.íLHoü {'Ilk (20 мк, на J0p0/+-k\) с км\к'ítttí\ u-.aHctr i) fjvi:..H.H.w н^ч^иь. 2¡ ¡'o-'i/Ho. Ъ -еики, -Uk'VíHJ.iii л. ^ vep.iue. 0» симус. ") iiímmí, S) ¡i'ikiic. a.eiema:! мыиша. H). iL'iuucüTa. ! i < мои

m

a o

s

с

sT

3 а •

f -f>

2SS i ïsS

i

Phcvüok (>. '.-НсПрсчеля мРИК hhk f< (¡uuhíipm мож1. Ii;> и>ль naiítxeífb! npi'Mi-ípiUu тк'.и.ноп РНК (20 им на лорпжк}) о«.к\кж müíkj: i- npouuiobaïi.iii \¡o;i. 2'

'-■) пиичtu'LiM^/ îvLс. 4> ср^жии 5) кора. (<) птпохамл. H kíi^k'cíííc- чырг^р;:

íciin.ibU'H;,. ¡см маркер { kb <0îibc" HRL¡

0.17 -

1 а 3 4 5 6 7 а 9 10 11 12 13 14 15 16 17

18 19 20 21 22 23

внк

С8К

0.7 -0.42

Рисунок 7. Анализ экспрессия мРНК ВЬк и С$к во фракциях сортированных клеток гемопоэтнчсского происхождения, представляющих основные линии гемопоэза и различные стадии дифференцировки. Дорожки: 1) 1кЪ маркер, 2) стволовые клетки лимфоидного ряда (Т), 3) мультипотентные предшественники Т клеток (Т), 4) незрелые предшественники Т клеток (Т), 5) зрелые Т- хелперы (Т), 6) зрелые Т -супрессоры (Т), 7) про-В клетки (КМ), 8) СБ43+ пре-В клетки (КМ), 9) СТ>43" пре-В клетки (КМ), 10) незрелые В клетки (КМ), 11) зрелые В клетки (КМ), 12) зрелые В клетки (С), 13) гемопоэтические стволовые клетки (КМ), 14) мультипотентные стволовые клетки (КМ), 15) комыитированные стволовые кчеткн (КМ), 16) фанулощггы (КМ), 17) моноциты (КМ). 18) незрелые эритровдные клетки с ядром (КМ), 19) зрелые эритрощшые клетки с ядром (КМ), 20) зрелые эритроидные клетки, 21) контроль, 22) 100 Ьр маркер, 23) 1 кЬ маркер. В скобках указан орган- донор сортированных клеток (Т - тимус, КМ - костный мозг, С - селезагка). Маркер 100 Ьр (ОШсо ВЫ.) состоит из 15 фрагментов кратных 100 н.п. от 100 до 1500 н.п. н дополнительная полоска 2072 н.п. Для маркера 1 кЬ (вйсо ВКЬ) показаны полоски размером длиной 134/154, 201/220, 298, 344, 396, 506/517, 1018, 1636, 2071 н.п.

Экспрессия транскринтов bhk в сравнении с экспрессией csk в гемопоэгических клетках детектировалась при помощи саузери-гибрццизацнк с препаратами кДНК, приготовленными методом основанным па амплнфшшровашш фрагментов кДНК между сайтом затравливания и ближайшим сайтом рестриктазы Sau3AI. Бьши представлены все основные линии дифференцировки клеток крови, за исключением тучных клеток и мегакарпоцитов, а эритроидяая и лимфовдные линии предстагмены набором фракций клеток различной степени зрелости (см. рис. 7). Оказалось, что bhk и csk экспрессируются в широком спектре фракций, начиная со стволовых клеток крови и ранних стадий развития В- и Т- меток и заканчивая зрелыми клетками, но профили экспрессии этих генов не идентичны. Уровень экспрессии bhk практически одинаков во всех фракциях стволовых клеток и фракциях лимфондных линий, а уровень экспрессии csk в лимфондных фракциях в 3-5 раз выше, чем во фракциях стволовых клеток. В то время как уровень экспрессии bhk в миелоидных и эритроидных клеточных фракциях меньше, чем в любой из лимфондных или стволовых фракций, уровень экспрессии csk в миелоидных и эритроидных фракциях выше, чем в стволовых клетках, и ниже, чем в лимфондных фракциях. Оба гена практически не экспрессируются в зрелых эритроидных клетках. По-видимому, csk экспрессируется, хотя и на разном уровне, во всех основных линиях дифференцировки клеток крови, в то время как экспрессия bhk в миелсидной и эритроидной линиях значительно понижена щи же отсутствует.

Когда наша работа была завершена, появился ряд публикаций, посвященных клонированию протеинкиназ, относящихся к семейству Csk, из клеток мыши и человека [Klages et al„ 1994; Chow et al„ 1994; Sakano et al„ 1994; Bennet et al„ 1994;

Koneko et a!., 1995]. Оказалось, что эти протеннкиназы или идентичны Bhk, или латаются ее человеческими гомологами. Полученные нами данные о экспрессии мРНК bhk не противоречат данным этих групп. Все группы отмечают повышенную экспрессию bhk в мозге, а Конеко и соавторы при помощи гибридизации in situ подтвердили, что экспрессия достигает максимума в нейронах гиппокампа и коры головного мозга [Koneko et al„ 1995]. Беннст и соавторы при помощи ПЦР показали, что bhk экспресснруется в CD34+ клетках-предшественниках костного мозга человека [Bennet е! al., 1994]. bhk экспрсссируется также в линиях мегакарцоцитарного ряда [Bennet et al., 1994; Sakano et al., 1994], которые не были нами исследованы из-за невозможности получения исходного материала при помощи клеточной сортировки.

Суммируя, следует сказать, что картины тканевого распределения транскриптов csk и bhk похожи, но не одинаковы, и обладают рядом интересных отличий. Чем они похожи? Кратко напомним: csk экспресснруется повсеместно, что соответствует его роли универсального негативного регулятора ТПК семейства sre, тем не менее в селезенке, тимусе и мозге новорожденных уровень экспрессии csk наиболее значителен, bhk экспресснруется только во взрослом мозге, тимусе и селезенке, а в остальных органах не детектируется. Таким образом, основные локусы экспрессии bhk и csk совпадают: мозг, тимус и селезенка, - но в отличие от csk, bhk является скорее тканеспецифическим белком. Не исключено, что bhk и csk регулируют по крайней мере частично неперекрывающийся ряд белков-мишеней.

Обнаружение нескольких негативных регуляторов, действующих параллельно, вносит дополнительную ишригу в изучение механизма взаимодействия компонентов одной из важнейших цепей переноса сигнадов.

Выводы:

1. Идентифицирован ген новой нерецепторной гирозинкипазы bhk.

2. Клонирована полноразмерная кДНК bhk и определена ее нуклеотндная последовательность.

3. Клонирована геномная копия и определена экзон-ингронная структура гена bhk.

4. Обнаружен альтернативный сплайсинг в 5' области кДНК, выяснен механизм возникновения всех грех транскргштоп.

5. Определена картина тканевого распространения транскриптов bhk, для гемопоэтической системы в сравнении с экспрессией родственного гена csk.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.М.А. Эршлер., А.В. Кривцов, А.В. Кроткова, А.В. Белявский и Я.В.М. Фиссер (1994) ВПК - ген новой нерецепторной тирозиновой протеинкиназы, экспрессирующийся в мозге и гематопоэтической системе мыши. Докл. Акад. Наук 339, 679-683

2.М.А. Ershler, I.M. Samokhvalov, A.V. Belyavsky and J.W.M. Visser, (1995) Genomic structure and alternative splicing of the murine bhk/ctk/ntk gene. FEBS Letters 375: 50-52

3.M.A. Ershler, J.M. Samokhvalov, A.V. Krotkova, A.V. Krivtsov, A.V. Belyavsky and J.W.M. Visser (1995) cDNA cloning, genomic structure and alternative splicing of murine BHK/CTK/NTK. // 24th Annual Meeting of International Society for Experimental Hematology, Dusseklorf, Germany, Experimental Hematology 23, 749