Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и изучение экспрессии в E.Coli генов мутантных и гибридных цитокинов человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и изучение экспрессии в E.Coli генов мутантных и гибридных цитокинов человека"

91

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М.М. ШЕМЯКИНА

На правах рукописи

Дзеыдов Илья Владимирович

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ В Е.СОЫ ГЕНОВ ШТШПШ И ПВРШ ШГОКШОВ ЧЕЛОВЕКА

03.00.03 -' Молекулярная биология

Автореферат диссертация на соискание учбной степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Институте Биоорганической химии им. М. Ы. Шемякина АН СССР.

Научный руководитель -кандидат химических наук В. Р. Коробко

Официальные оппоненты -доктор химических наук Ю. А. Берлин доктор медицинских наук Б. Б. Фукс

Ведущая организация - Институт иммунологии НПО "Биосинтез" госконцерна "Биопрепарат"

Защита состоится с Рё^^^/^Я/ 1992 г. в £^час.

на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической; химии им.М.М.Шэмякина АН СССР по адресу: 117871, Москва, В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией: можно ознакомиться в библиотеке Института Оиооргашгческой химии им.М.М.Шемякина АН СССР.

дСГсгрЛ 199 /г.

Автореферат разослан.

Учёный секретарь Специализированного совета ИБХ АН СССР

кандидат химических наук В. А. Несмеянов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ -Г. - Актуальность проблемы. Фактор некроза опухоли (ФНО), лшфотоксин (JIT) и интерферон-7 (ИФН7) - это белки-цитокины, обладавдив иммуномодуляторными, противоопухолевыми, противовирусными и другими Оиологическими свойствами. Повышенный интерес к этим факторам во многом связан с изучением механизмов противоопухолевого иммунитета и с поиском эндогенных противоопухолевых агентов, которые можно было бы использовать в терапевтической практике. .Противоопухолевые свойства ФНО и ЛТ характеризуются высокой избирательностью. Так, ФНО ■ вызывает геморрагический некроз ряда экспериментальных опухолей животных, оказывает прямое антипролиферативное и цито-лктическое действие на многие трансформированные линии клеток In vitro. В то же время ОНО не токсичен для нормальных тканей и культивируемых клеток. С другой стороны, изучение свойств ИФН7. показало, что он обладает антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток в культуре, а также стимулирует клеточный противоопухолевый иммунитет организма.

При одновременной обработке опухолевых клеток In vitro ФНО и ИФН7 наблюдается сивергичное цктотоксическоз действие этих ©акторов. Обнаружено также, что некоторые опухолевые клеточные линии, устойчквыз к цитотоксичвости ФНО, оказываются чувствительны к совместной синергичной цитотоксичности обоих факторов. Имеется и другие подтверждения функциональной взаимосвязи этих факторов в организме. Так, они синергично усиливает экспрессии антигенов гистосовмеотимости II класса на поверхности макрофагов. Кроме того, МШу является эффективным индуктором мембранной формы ФНО, являвдейся основным .цитотоксическим фактором активированных макрофагов.

В настоящее время механизмы противоопухолевой активности ФНО, ЛТ и ИФН7 остаются неясными. Неясно также, с какими особенностями структуры этих факторов связан их противоопухолевый эффект. Проблема соотношения структуры и функции особенно интересна з случае ФНО и ЛТ, которые, будучи гомологичными белками, конкурируют за связывание с двумя типэми рецепторов на поверхности клеток. Помимо этого, не удалось пока

- г -

добиться чёткой корреляции мевду данными по цитотоксической активности ФНО, ЛТ и Wfflr¡ In vitro и результатами их клинических испытаний. Поэтому значительный интерес представляет дальнейшее изучение биологических свойств этих факторов, изучение взаимосвязи мевду их структурой к функцией методами белковой инженерии, а также установление оптимальных условий для взаимного усиления их противоопухолевых свойств.

Цель работы. Настоящая работа проводилась в рамках комплексной программы по генетической и белковой инженерии фактора некроза опухоли и лимфотоксина. Работа состоит из двух частей. В первой части описывается получение с помощью на- . правленного мутагенеза укороченного на 21 кодон с 5 '-конца гена ЛТ и оптимизация экспрессии этого гена в E.colí. Вторая часть посвящена получению гибридных генов ИФН7-ФНО и ИФН7-ЛТ, их делеционному мутагенезу и экспрессии в E.colí с целью получения гибридных белков, объединящих биологические активности обоих составляющих их цитокинов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы получен штамм E.colí, эффективно продуцирующий ЛТ человека, укороченный на 21 аминокислотный остаток с Н-конца. Этот белок был в дальнейшем очищен, и было показано, что он обладает высокой вдтотоксической активностью в тостах на мышиных клетках L929. Штамм-суперпродуцент передан в НПО "Вектор" (т.Бердск, Новосибирская обл.) и ШО "Фермент" (г.Вильнюс) для разработки метода промышленного выделения белка с целью дальнейшего изучения его биологических свойств и проведения доклинических испытаний.

Результатом работы является также получение штаммов Е. coll - продуцентов гибридных белков ИФН7-ФНО и ИФНу-JIT, а также ряда их делэционных вариантов. Показано, что все гибридные белки, а также их делеционные варианты сохраняют биологические активности обоих составляющих цитокинов. Эти наблюдения открывают дополнительные возможности для направленного манипулирования структурой белков методами белковой инженерии. Полученные штаммы-продуценты переданы в Институт иммунологии (г.Чехов, Московская обл.) для разработки метода очистки гибридных белков. Исследование биологических свойств

- з -

гибридных белков может быть полезши для изучения функциональной взаимосвязи цитокинов в противоопухолевом иммунитете организма.

Апробация работы. Материалы диссертация, были доложены на Всесоюзной конференции "НоЕые направления биотехнологии" (г.Пущино, 1988), на 2-й Международной конференции по фактору некроза опухоли (г.Нала, Калифорния, США, 1989) и на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (г.Самарканд, 19Э1).

СОДЕКШИЕ РАБОТЫ

I. Направленный мутагенез 5'-концевой части гена ллмфо-токсина человека.

Ранее С.А.Недоспасовым и др. (Шгститут монокулярной биологии АН СССР) в совместной работа с группой химии генов был клонировал локус генсма человека, содержащий гены ФКО и ЛТ. Затем на основе этих кодирукадх последовательностей в груше химии генов Сыж полутени плазмадные векторы p2HF33A и рМ19 для экспрессии в клетках E.colt соотвэтствэнта ШО и ЛТ человека. В этих плазмидах полусиптетическиэ гены СЙК> и ЛТ находятся под контролем двух сильных конститутивных промоторов А2 и A3 бактериофага Т7 и синтетических рибосомсвязывагащих участков.

Задачей настоящего эксперимента являлось получение плаз-мидного вектора, экспрессируяцего мутаяттй ген ЛТ, соответ-ствукщий укороченному на 21 аминоконцевой аминокислотный остаток белку. A priort предполагалось, что полученный таким образок мутантный белок сохранит свою биологическую (цито-токсическую) активность. Это следовало из структурно-функциональной гомологии ЛТ и ФЕО. Известно, что процент гомологии оказывается'наибольшим, если ре иго ловить первичные структуры ®10 и. ЛТ одну сод другой, соотнеся первый гнинокислотный остаток ФИО с 18-м аминокислотным остатком ЛТ- Поскольку удаление четырбх акинокснцевых аминокислотных остатков ФНО увеличивает его цятстокскческуи активность, то можно надеяться получить такое хэ увелячение цитотоксичности и при удалении

Рис Л. Схема плаз-миды рЫ18.

ЕсоН! г- г,г

ЭФо!

рИ18 • цРзП ТпЮ

Стг ^^/НЫШ ЕсоИ!

21 аминокислотного остатка с И-конца ЛТ. С другой стороны, при выделении ЛТ человека из люл£юбластоидной клеточной линии 1788 обнаружен Онологически активный вариант этого белка, у которого отсутствуют 23 И-концевнх аминокислотных остатка. Таким образом, получение рэкомбинантного варианта ЛТ человека с делацией в Л-концевой части и изучение биологических свойств этого продукта представляют несомненный интерес.

В настоящей работе для направленного мутагенеза использована плазмида р1ДМ8, которая получена при клонировании гена ЛТ в плазмиду рйСЗЗД на место гена ФНО (эта процедура описана в диссертационной работе А.Ы.Чумакова). Плазмида р!Т18, (рис Л) не является экспрессирувдей, так как инициаторный АТС-кодон, оставшийся из гена ФНО, находится в иной рамке трансляции по отношению к последовательности гена ЛТ (рис. 2). Плазмида.рЬГ18 удобна для предполагаемого мутагенеза, поскольку в деле тируемой последовательности имеется сайт

Kpnl __Met

5 * -GGTACCrAATrTAATrTÁAÜGATTATCGTTÍTíJGTT-З'-ТААГАССААТАС--

Xhol

AGATCCTCGAGCTGCCCAGACTGCCCGICAGCACCCC-

LeuAlaIIÍESerA3nXeu • AAGATGCATCTTGCCCACAGCAACCTT-S• '--GAACGGGTGFCG-5'

Рис.2. Участок нуклеотвдной последовательности плазмиды р1ЛМ8.. с делетируемым районом. Структура мутагонизирущего олгонуклеотида приведена под комплементарными участками ДНК.

узнавания рестриктазы Xhol, что значительно облегчает поиск мутантных клонов. В результате направленного мутагенеза делегирована последовательность мевду нншдеаторным ATG-кодоном и СИ-кодоном, соответствующим leu22 ЛГ (49 н.п., рис.2).

Для проведения мутагенеза плазмиду р1Я18 подвергли действию рестрнктаз EcoRI и fllndlll. Фрагмент ок. 820 н.п., содержащий основнуи часть гена JET, был клонирован в фаговом вектора И13шрЮ (Атегзйат, Великобритания) - В результате получен рекомбинантный фаг Н13-ЪТ.

Для мутагенеза использовали синтетический 24-звенвый оли-гонуклеотид (рис.2), левое плечо которого было комплементарно последовательности слева от делегируемого района, включая ATG, а правое плэчо - последовательности справа, начиная с СТТ. После стккга олигонуклеотида с одноцепочечной ДНК фага M13-LT его использовали как затравку для синтеза второй цепи ДНК с помощью фрагмента КлЗнова ДЕК-полиморазн I Е. coli, • четырех дбБрксЕнуклеозидтрифосфатов и ДНК-лигазы фага Т4. Реакционнув смесь без обогащения деухцепочечной ковалэнтно-замкнутой ДНК использовали для трансформации компетентных клеток S.colt WK-5 mats. Поиск бляшек, содержащих мутантные фаги, осуществляли гибридизацией о тем яз 24-звенным олиго-нуклеотидом, радиоактивно меченым с 5'-конца. ДНК из зсех гнбридизующихся клонов проверяли на наличие сайта рестрикта-

Рис.3. Электрофорез б SDS ^ ^ 3 ^

лизагов клеток E.coli, экс-

прессирующп ген лимфэток-сина человека. Клетки трансформированы плазмядами: 1,2 - рЪГ21,

3 - рЪТ19,

4 - рЫ18.

f't

зы Xhol. Среди анализируемых клонов Сыл обнаружен желаемый мутант, структура которого была подтверждена сиквенированием по метода- Сэнгера. Этот мутантный фаг •был обозначен M13-LTm.

Для того, чтобы реклонировать мутантный ген ЛТ обратно в плазмиду р1Т18, из репликативной формы ДНК (РФ-ДНК) фага Ы13-ITm был вырезан фрагмент Kpnl-fftndlll. В то ке время, из ■ плазмиды р1Т18 был выщеплен аналогичный фрагмент, и на его место в результате лигазной реакции помещён фрагмент из му-тантного фага. Таким образом получили плазмиду р!Я21. .

Чтобы оценить уровень экспрессии мугантного гена ЛТ в плазмиде рЪТ21 и сравнить его с уровнем экспрессии гена ЛТ в плазмиде р1Т19, данные плазмиды использовались для трансформации компетентных клеток Е. coll SG20050 lon~. На рис.3 приведен электрофорез лизатов Е. coll с данными плазмидами. Можно видеть, что количество мутантного белка в бактериальных клетках с плазмидой pLT21 существенно выше, чем количество рекомбинантного ЛТ в клетках с плазмидой pLTI 9.

Мутантный ЛГ накашивается в бактериальных клетках в виде нерастворимых включений. Для его Еыделения (которое было впоследствии осуществлено в группе химии генов) клетки Е. coll с нлазмидой р!Г21 выращивались при температуре 25°С (при такой температуре выращивания количество растворимого ЛТ достигало 50S от его общего количества). Белок бал очищен до гомогенности. Цитртокскческая активность мутантного ЛГ на мышиных клетках L929 составляет ок. IG3 ед/мг.

В литературе имеются сообщения о том, что некоторые N-конвдвые делеционные мутанта ЛТ обладают повышенной цитсток-сичэсхой активностью in vitro, ко сниженной общей токсичностью в экспериментах на мышах. Это да5т основание для дальнейшего изучения биологических свойств мутантных вариантов ЛТ.

2. Конструирование генов гибридных белков ИФНт-ФНО. ИФНт-ЛТ и их дэлециошых вариантов. Экспрессия гибридных генов в В.calí.

Гибридные гены было решено сконструировать таким образом, чтобы в кодируемых ими белках последовательность ИФН7 была расположена с N-конца, а последовательность ФНО или ЛТ - с С-конца (риц.4). Такой порядок объединения последовательностей был выбран исходя из данных по дала иконному мутагенезу N- и С-коицввых аминокислотных остатков ЖШу и Ш) (данные приводятся в обзоре литературы). Из этих данных следует, что целостность С-коицевых аминокислотных остатков ÍHO и ЛТ и Н-концевых аминокислотных остаткоз ИФК7 важна для сохранения биологической активности этих белков, поскольку эти остатки, возможно, вовлечены в поддержание пространственной структуры белков или формируют сайт связывания с рецептором. В то время, Н-ковцэтэ амшохислотвыв остатки 0Ю и ЛТ и С-концв-вые аминокислотные остатки ИФН7 могут быть удалены без ущерба-для биологических свойств этих белков.

Планировалось слить полную последовательность ИФН7 с последовательностью ФНО (без двух аминоконцевых аминокислотных остатков) или с полной последовательностью ЛГ в гибридном

ИФН7

мутагенез

ИФН7 Бас!

Ою!

ФНО

ИЗНу

синтетический линкер

Ара! ХПо! ФНО

АгеАЬаБегС 1пРго\а101уРгоБег8 егАгбЖгг ИФНу .. .АСАСОИСССАСССТСТтеСС-СОСТССАССССХАСО... ФНО

АраI Шо!

ИФНу

Ара! Бта! ЛТ

".............

1ШШ

АгаА1аЗегС1пРгоУа1С1уРгоУа11еиРгоС1у7а1

ИФНу .. .АСАастасссАсссхгсгассассссгтстсссссотстт... лт

АраI Бша!

Рис.4. Схема конструирования гибридных генов ИФКу-ФНО и ИФН7-ЛТ. Приведены нуклеотидаые и аминокислотные последовательности мест сочленения.

- э -

белке через короткий пептидный линкер Pro-Val-Gly-Pro. Мы предположили, что наличие в линкере двух остатков пролина обусловит существование - полшэптидаых цепей ИФН7 и ФНО в виде отдельных доменов, сохраняя, таким образом, биологические активности обоих составляющих цитокинов.

На рис..4,5 показана схема конструирования гибридного гена КФН7-ФНО. В качестве источника кодирующей части гена КФН7 использована плазмида pIFN7, которая была предоставлена Е.Д.Свердловым и С.А.ЦарЭвым (лаборатория биотехнологии нуклеиновых кислот ИБХ АН СССР). На первом этапа работы осуще-ствлЗн направленный мутагенез G-концевой части гена ИФН7 с введеяем двух нуклеотидных замен, в результате которого в конце гена образовался С8йт расщепления рестриктазы Saal. Для мутагенеза использовали одноцепочечный плазмидный (фаг-мидный) вектор pBS(+) фарш "Stratageae" (США). Предварительно из полилинкера фагмзды.рВЗ(+) был удал5н сайт рестриктазы Saol, чтобы облегчить поиск мутантов в процесса мутагенеза. Для этого фагмяду разрезали рестриктазой SacI, и выступающие 3'-концы удалили с помощью З'-экзонуклеазной активности фрагмента Клбпоза ДНК-полимеразн I. Затем линейная фагмида бала енозь циркуляркзована. Таким образом получили фагмзэду pBS(+)Sac~. Далее ген ИФНу был вырезан из плазмида рШ?7 в составе фрагмента ШпйШ-Рзг! длиной 509 н.п. и клонирован в полилинкер фагмвды pES(+)Sac~. Полученная ре-комбинантяая фагмида названа рВ5(+)-Ш{у. Затем приступили непосредственно к мутагенезу гена ИФКу. Для этого одноце-почэчнуш форму фагмкда pBS(+)-IFK7 отоятт с синтетическим 24-звенным олигонуклеотвдом CCArTACTGCGGACraCTTCC-AOC. Мутагенез -проводили по метода' Кункеля. Авторы этого метода сообщают о средней его эффективности 65%, рекомендуя при этом использовать Т4 ДНК-полииеразу для элонгации мутагени-зкрувдего лраймэра. Мы обнаружили, что и при использовании фрагмента Клбкова выход мутантшх клонов составляет 40-45Я в штамме Е. coli 11-1. Blue и ок.555 в шгеимз S.coli ВШИ 71-18 nuts. Полученная в результате мутагенеза фагмида была Еа-ззана pBS(-i-)-IFJi7ra. Прзгильность введения нуклеотидннх затаен сйгла подтверждена определением нуклеотадной последовательно-

Pstl

£btagenized SacI

Xbal

Clol Sad

Clal HndlH

TCCCAGCCTGTTGGGCCC TCG A AG GGTCGG ACA ACCCG G G AG CT

Kpnï

,XhoI

Hind Ш

Xbal KindlII

С TA AT Г ГА AT T TA A G G AT ТАГ CATGGATTAAATTAAATTCCTAATAGATC

Kpnl Hindlll

T TiDNA ligase

a?^ <4.KpnI

^^-Xbal (in PIFT313)

pIFT311 "\xbdi' if"? pIFT313

Ifnf-Tnfi//-^1

v4^' /Atol

Hindlir

Рис.5. Конструирование плазмид, экссрессирущих ген гибридного белка ИФН7-ФГО.

«

ЕсоШ

ХЬа!

р1?Т31

...СААТТСАССАССССТСТАСАТС...

рОТЗП и рГР1311

К ~

рПТ313

ерт

.. ХСТАССГААТТтТТТААСОАТТАТСАТТТААТТТ-

ХЬа!

ХЬа!

АА СйАТТАТ С5АСАТТТААТТТАА55А^^ТСТ АС АТС...

Ряс.5. Первичная структура участков инициации трансляции. Ишщиагорнай кодон и последовательность Шайаа-Далгарно подчеркнуты.

В качестве источника гека ФНО использована плазмида рТМ"31, ранее сконструированная в группе химки гаков (рис.5). С этой плазмида под действием промоторов А2 п АЗ фага Т7 з клетках происходит синтез двуцистронноЯ мРБК, кодирующей белки дипщрофолатредуктазн и ОНО. В этой плазмиде имеются подходящие сайта рестрикции, которые позволяют клонировать в неб кодирующую часть гена КФН7 и в одну стадии получить конструкцию, экспрессируидую гибридный ген ИФК7-ФШ. Для этого рестриктный фрагмент С1аЕ-£>ас1 длиной 465 н.н. был вырезан из фагмзэды рВ5(+)-П,'чттга и клонирован вместе с синтетическим олигонуклеотидным дуплексом (рис.5) в плазвдду рТНР31, предварительно расщеплЗняую рестриктазами С1а1 к Х7ю1. Полученную таким образом плазмаду назвали рОТ31.

В плазмиде р1РТ31 трансляция мРНК, кодирующей гибридный белок МШ7-ФНО, находится под контролем участка инициации, предшествовавшего гену ИФН7 в плазмиде р1?1»7 (рис.5). Анализ методом электрофореза и иммуноблоттинга суммарного лкзата

сти фагмида рВБ (+)-1РМ7П1 в районе мутагенеза.

клеток Е. coli, содержащего плазмшг/ рП"Г31, показал присутствие белка с молекулярной массой ок. 34 кД, взаимодействующего с поликлонаяьной антисывороткой против ФНО. Однако общее его количество в лизате было незначительным, вероятно, из-за недостаточной эффективности инициации трансляции.

Для оптимизации экспрессии гибридного гена мы решили изменить участок связывания рибосомы, уменьшив содержание остатков G и С в спейсере между последовательностьы Шайна-Да-лгарно и инициаторным кодоном, а также уменьшив длину спей-сера от 9 до 8 н.п. (рис.6). Для этого фрагмент Xbal-HtnüIII длиной 1038 н.п., содержащий гибридный ген ИФН7-ФНО, из плазмиды рГРГЗ'1 был клонирован вместе с олигонуклеотидным линкером (кодирующим рибосомсвязываюций участок, рис.5) в плазмиду рТ1СР31 А, являющейся прозводной рТНР31, в которой делегирован ген детвдрофолатредуктазы. В результате получили плазмиду рПТ311 с новым участком инициации трансляции. Интересно, что наряду с клонами, содержащими плазмиды с ожидаемой последовательностью рибосомс.вязыващего участка, был обнаружен клон с плазмвдой р1ГТ313, в которой эта последовательность была трижды тацдемно повторена (рис. 6).

На рис.8 показан электрофэрез лизатов клеток Е. coli, содержащих шгазмиды рШГ311 и рЛ?Т313. В обоих случаях происходит эффективный биосинтез гибридного белка ИФН7-ФНО, имеющего молекулярную массу 34 кД. При этом в случае плазмиды рГРГ313 уровень биосинтеза немного выше.

Из 12 исследованных наш штаммов E.colt наиболее высокий уровень биосинтеза гибридного белка ЙФН7-ФНО наблюдался в штамме SG20050, являющемся мутантом то 1оп-протеазе.

При конструировании гибридного гена ИФН7-ЛТ В качестве . источника гена ЛТ была использована плазмида pLT19. В самом начале гена ЛТ имеется удобный для нашей цели сайт расщепления рестрикгазы Smäl. Схема конструирования плазмиды, экс-прессирующей гибридный ген ИФН7-ЛТ, представлена на рис.4,7. Фрагмент Smal-Sall длиной 644 н.п., содержащий кодирующую последовательность гена ЛТ, был вырезан из плазмиды pLT19 и клонирован в фагмиду pBS(+)-OTi7m по сайтам Sacl-Sall вместе с синтетическим олигонуклеотидным дуплексом, кодирую-

Soll Pstl

mutageni zcd "Saci

TCCCAGCCTGTTGGGCCCGTTCTCCC TCGAAGGGTCGGACAACCCGGGCAAGAGGG

Smal Sali .

Ti DNA ligase

.Soll

Xbal Sali

Xbal Hindlil

CTA AT T TA AT T TA AGG AT TAT C ATG G AT "A A AT TA A AT TCCTA ATAG ATC

Tfnj-Tnfji/ ^ApaI ^Smal

Kpnl Sa!I

Phc.7. KoHCTpynpoBaHKe mia3MH£H pI?L311, 3Kcnpeccnpymea reH raöpunjioro öejKa I®Hy-JIT.

а О, Ъ н 5

<А

"Í^SSSS

.„¡Мб"

gj<- 5.6 2 9

— —

fS>

<r-20

А ь Ък

Рис.8. Электрофорез суммарных лизатов E.coll SG 20050, трансформированных плазмидаш pIíT311 (1), pIFT313(2), pI?L311 (3,4). рТКР31 Л (5).

Рис.9. Икмуноблот с антителами против ИФН7 клеточных лизатов E.colt с нлазмидами рОТ311(1), pIFT313(2), рПЧЗИ (3,4).

щим пептидный линкер в гибридном гене'. Полученная таким образом фагмида, обозначенная рВЗ(+)-Ш>, содержит готовую кодирующую последовательность гибридного гена ИФНу-ЛТ. После этого гибридный ген был вырезан из фагмида рВЗ(+)-1РЬ в составе фрагмента Дза1-5а11 длиной 1097 н.п.- и клонирован в плазмиде рШЧ9 по сайтам КртИ-БаН вместе с синтетическим олигонуклеотидаым линкером, кодирующим такую же последовательность инициации трансляции, *тсак и пербд гибридным гоном ИФН7-ФН0. Такзы образом бала получена плэзшде рПХЗИ, экспрессирухцая гибридный ген ИФН7-.ЯТ под контролем промоторов А2 и АЗ бактериофага Т7.

Изучение лизатов клеток Е. coll штамма SG20050, содержащих плазмиду pIFL311, показывает, что биосинтез гибридного белка ШЯу-ЛТ протекает ;менее эффективно, чем биосинтез гибридного белка ИФНт-ФНО (рис.8).

На рис.9 представлен иммуноблот лизатов клеток E.coll, экспре ссирудщж. гибридные гены ИФН7-ФНО и ИФНу-ЛТ. Можно видеть, что эти гибридные белки подвергаются в клетках частичной протеолигическсй деградации. Основные продукты этой .деградации имеют в обоих случаях мол. массы ок. 30 и 27 кД. Гибридный белок ЙФН7-ЛТ подвержен в клетках более глубокому протеолизу (рис. 8,9). Мммуноблоты с антителами против ФНО и ЛТ (рис.II,12) позволяют обнаружить минорные полосн продуктов более глубокой зтрогеолигической деградации. На этих бло-тах заметны также полосн продуктов, имеющих электрофоретиче-скую подвижность близкую к подвтшости ФНО и ЛТ. Подобные полосы не обнаруживаются в иммуноблоте с антителами против МФН7, где отчЗтлюзо видны лишь продукты деградации Z7 и 30 КД. Это позволяет предположить, что в обоих гибридных белках деградации подвергается та часть молекулы, которая соответствует ИФН7.

Когда наша работа по конструированию гибридных генов находилась в начальной стадии, Фанг с соавг опубликовали статью (Soienoe, 1988, т.24-1, р.1501), где они описывают конструирование двух вариантов гибридного гена ИФЯ7-ЛТ. В одном варианте гибридннй ген содержал полную последовательность гена ИФН7, а в другом варианте ген IKHy был укорочен на 9 триплетов с З'-конца. При экспрессии этих генов в В. colt обнаружилось, что гибридный белок с полной последовательностью ИФН7 полностью деградировал в клетках, тогда как гибридный белок с укороченной последовательностью ИФН7 был стабилен. Авторы этой работы предположили, что в первом случае расщепление гибридного белка происходило по С-концевым аминокислотным остаткам IKH7, и при этом гибридный белок распадался на составляющие его цитокины. Мы пытались использовать наблюдение этих авторов, чтобы уменьшить степень протеолитической деградации наших белков. В нашем случае, однако, предположение этих авторов о деградации гибридного

белка до составляющих его цитокинов кажется маловероятным, поскольку подвижность в электрофорезе основных продуктов деградации не соответствует подвикности исходных цитокинов. С другой стороны, С-концевые аминокислотные остатки ИФНу могут влиять на конформацию молекулы, делая еЗ доступной для протеолиза. Чтобы проверить это предположение, мы сконструировала делециакнне кутантн гибридаых генов ИФН7-ФНО и КФНу-ЛТ» в которых 3*-концевая часть гена ИФН7 была укорочена на 7, 10 и 15 триплетов.

Дяя проведения делэционного мутагенеза фрагмент Крп1~ Шпй111 длиной 1104 н.е., содержащий гибридный ген МФНт-йНО и "длинный" рибссомсвязыващий участок, был вырезан из плаз-мида рТ1{Р313 и клонирован в голиливкер фагмндного вектора рВЗ(+). Таким образом была получена фагмида рВЗ(+)-П"'Т. Мутагенез проводили по методу Кункеля и использовали для этого синтетические мутагенизирупще олигонуклеотиды АСАЮСТСТТТС-стсттсассс, адассаогсасоотстгсссоо, АААрАСйсмсссжогаасасо, которые отжигали в трбх разных пробирках с одноцэпочечной формой фагмиды рВБ(+ )-Ш!. Полученные мутантные фагмида были обозначены рВЭ(+)-Ш?Л7, рБ5(+)-ГРгЛ10 и рВЗ(+ЫБТД15. Правильность мутагенеза была подтверждена сиквенированием. После мутагенеза мутантные гибридные гены были вырезаны из фагшгд рК>(+)-ХРГД7, рВБО-ЫтЮ, рШ(+)-ГРТД15 в составе фрагментов Крп1~Е1тШ.И и перенесены обратно в шгазмиду рШГ313 на место исходного немутантного гена. Таким образом были получены плазмидн рП'Т313А7, рГРТ313Д10 и рШ?313Д15; <■ экспрессирующие делэционные варианты гибридного гена 1©Й7~ФН0.

Бри получении делеционных вариантов гибридного гена ИФН7-ЛТ (рис.10) ш воспользовались наличием в линкере гибридных генов уникального сайта.ресгрнкгазы Ара1. Из фагмид рКЗ(+)-ТТТДТ и рКИ-И-НТЛЮ были вырезаны фрагменты КрпТ-Ара!, имеющие, соответственно, длины 492 и 483 н.п., содержащие делецконные варианты "интэрфероновой" половины гибридного гена и клонированы по этил же сайтам в плазмиду р1Р1311 .• В результате бнли получены шшзмиды, экспрессирующие делецконные варитом гибридного гена ИФН7-ЧТ, которые были обозначены РГРХ313А7 и р1РЬ313А10.

xw

Kpnl ^ I ^bql

Kpní, Ара I

Apa I J

Kpn Г

Xbaf

Рис.10. Конструирование плазмид рПТ313Д7 и рШ313Д10.

i г ъ

á г ъ ч 5

Г

Г

Рис.П. Иммуноблот с антителами против ЛТ клеточных лизатов Е.соИ с шазмидами рШЗП (1), рБ?Ь313ЛТ(2) и рШ313А10(3). Верхние полосы соответствуют гибридному белку Шйу-лт и его делецион-ным вариантам. Остальные полосы соответствуют продуктам протеолигаческой деградации.

Рис. 12.йкмуноблот с антителами против ФНО клеточных лизатов E.coll с плззмидами рЕРТ313А15(1), рт.'3;ЗА10(2), рггазпгто), pm»i3(4) и рТК?31Л(5). Полоса в последней дороаке соответствует .рекомбинантному ФНО. Верхние голоси в дорожках 1-4 соответствуют гибридному белку КФН7-ФНО и его делеционным вариантам.

Анализ лизатов Е. coll, содержащих плазмиды с делеционны-ми вариантами гибридных генов показал, что степень протооли-тической деградации гибридных белков практически не изменилась, а набор продуктов протеолиза остался тем ш (рис .11, 12, 13). Пожалуй, лшвь вариант AI5 оказался немного более устойчивым. Таким образом, в нашем случаэ С-концэвые аминокислотные остатки KIHy не влияют на устойчивость гибридного

Рис.13. Электрофорез суммарных лизатов E.coli SG20050, трансформированных плазмидага Р1ГТ313 (1), pIFT313A7 (г), Р1РТ313Д10 (3), рИТ313Д15 (4). Стрелка слева указывает на полосу гибридного белка ИФН7-ФНО в первой дорожке. В последующих дорожках мол. массы вариантов этого гибридного белка уменьшаются из-за делеций в С-концевой части ИФН7.

i г з н

белка. Неясно, почему небольшие изменения конструкции гибридного гена в работе Фенг с соавт. (отсутствие линкера между генами и деления 23 кодонов в гене ЛТ) приводят к изменению вклада этих остатков в чувствительность гибридного белка к протеолизу.

Известно, что рекомбияантнне и гибридные белки часто накапливаются в цитоплазме клеток E.coll в виде нерастворимых включений. Мы решили установить, справедливо ли это и для нашего случая. Для этого клетки E.coll SG20050, содержащие плазмиду pIF!C313, были выращены при 37°С. Оказалось, что при этой температуре выращивания практически веб количество гибридного белка и его продуктов деградации локализуется в нерастворимой клеточной фракции (предположительно в тельцах

Таблица I. Биологические активности гибридных белков в лиза-тах Е.соИ. Активность ФИО измерена на клетках Ь929, обработанных актиномвдином. Антивирусная активность (ИФНу) измерена по ингибированшо цнтоггатического действия вируса везикулярного стоматита в фибробластах человека. Измерения осуществлены В.Г.Яканкиным и Л.А.Дэнисовым (Институт иммунологии, г.Чехов)

конструкция активность ИФН в ед. на I л культура активность ФНО в ед. па I л культура

рзтгслз рПТ313А7 РПЧ313А10 рГРТ31 ЗА15 рГРЬЗЯ рШ313Д7 рШ313Д10 рпдази рГРНу 1,6-б,4*10? >6,4*107 >6,4*107 1,6-3,2*107 2-4»106 4-8*10® 0,8-1,б«1О7 1,6-3,2x104 >6,4«107 >2,6*107 1,3x107 >2,б«107 >2,6«107 >2,6«1О7 >2,6*107 3,2*107 >2,6*107 нэ обнаружена

Противовирусная удельная активность ИШу в данных тестах составляет 10е ед./мг, а удельная цитотоксическая активность ФНО - 5*106ед./мг.

включения). х

Чтобы исследовать биологические активности гибридных белков в лизагах клеток Е.соИ необходимо было добиться биосинтеза растворимого внутриклеточного белка. Мы исследовали влияние температура выращивания клеток на растворимость образующихся гибридных белков и обнаружили, что максимальный выход растворимого балка получается при выращивании клеток Е.соИ при 30°С (ОК.50& синтезированного гибридного белка сказывалось растворимо). Степень протеолитической деградации при этом, согласно данным иммуноблотаинга, существенно не меняется.

В табл.1 приведены биологические активности лизатов В.

coït, синтезирующих гибридные белей ИФН7-ФНО, ИЗН7-ЛТ и их делециогаые варианты. Из этих данных следует, что биологические активности в лизатах продуцентов бежов ИФН7-ФНО выше, чем в лизатах продуцентов белков ИФН7-ЛТ, вероятно, из-за большей подверженности последних протеолизу. Интересно также, что активность КФН7 наиболее высока в лизатах делеци-онных мутантов Д7 и АГО. Поскольку, судя по электрофорезу лизатов E.caZl, уровень их экспрессии существенно та отличается от уровня экспрессии двух других вариантов, то можно предположить, что конформация этих вариантов более благоприятна для проявления активности НФН7.

Штаммы-продуценты гибрадных белков ИФН7-ФШ и ИФН7-ЛГ переданы в Институт иммунологии (г.Чехов, Московской обл.) для разработки метода очистки белков с целью дальнейшего изучения их биологических свойств и проведения доклинических испытаний.

выводы.-

I.Осуществлен делэдионный мутагенез гена лимфзтокеша. Получена плазмидная конструкция, обеспечивающая еысокий уровень биосинтеза биологически активного мутантного белка в клетках E.coli под контролем промоторов А2 и A3 бактериофага Т7.

2.С помощью направленного мутагенеза и датирования соответствующих генов осуществлено конструирование гибридных генов ИФН7-ФНО и ИФН7-ЛТ. Созданы плазмиды для эффективной экспрессии данных гибридных генов под контролем промоторов .42 и A3 в клетках E.coli. Показано, что соответствующие гибридные белки подвержены частичной протеолитической деградации в E.coli.

3.Созданы варианты гибридных генов ИФН7-ФНО и ИФН7-ЛТ с де-лецией 7, 10 и 15 кодонов с 3'-конца гена ИФН7. Сконструированы системы для эффективной экспрессии данных генов в E.coli. Показано, что С-концевнв аминокислотные остатки ИФНт не влияют на степень частичной протеолитической деградации данных гибридных белков.

4.Обнаружено, что полученные гибридные белки ИФН7-ФНО и ИФН7-ЛТ, а такке вое их делеционные варианты проявляют как противовирусную активность, характерную для ИФН7, так и цитотоксическую активность на клетках L929, характерную для ФКО.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУНЩХ РАБОТАХ

Г.Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Шингарова Л.Н., Филиппов C.Á., Максимова D.H., Чумаков A.M., Турецкая Р.Л., Давыдов И.В. Белковая инженерия факторов некроза опухолей человека// Тез. докл. Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии'1.- Цущино, 1388. - C.IOO.

2.Korobko 7.G., Dobrynin Y.N., Shingarova L.N., Filippov S.A., Maksimova Yu.N. and Davyüov X.У.(1989) Protein engineering ol tumor necrosis factors. In: 2nd international Conference on Tumor Necrosis Factors and Related Cytokines. Abstracts, P.21.

3.Коробко В.Г., Добрынин B.H., Филиппов С.А., Чумаков A.M., Шингарова Л.Н., Давыдов И.В., Бумялис В.В., Янулайтис A.A. Рекомбивантная плазмидаая ДНК pLT21, кодарукщая голипептид со свойства;® лимфотоксина человека и штамм E.coll В-5279, продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека// Заявка ¡é 4834066/13, полокнт. реш. от. 13.ПЛЭ90Г.

4.Ксробко В.Г., Давыдов И.В., Шингарова Л.Н., Филиппов O.A., Есшов Д.С., Беркова Н.П., Добрынин В.Н. Гены гибридных- <. лимфогашов человека I. Конструирование рекомбинантных пла-змвд, кодЕЕруизих гибрида иммунного интерферона и факторов некроза опухолей человека// Биоорг. химия, 1991, т.17,

Л2, С.18Э-196.

Б.Давыдов И.В., Коробко В.Г., Шингарова Л.Н., Беркова Н.П., Филиппов O.A., Добрынин В.Н., Есипов Д.С. Конструирование генов, кодирущих слитные белки менду иммунным штерферо- . ' ном к факторами некроза опухали человека и их экспрессия в клетках Escherichia coli// Тез. докл. 2-го Всесоизн. симп. "Теоретические и прикладные аспекта молекулярной биологии" - г.Самарканд, 1991, - С.60.