Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение мутантных форм фоторецепторного белка рековерина по его Ca2+-связывающим доменам методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза и исследование их функциональных свойств

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеев, Андрей Михайлович, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФИЛИАЛ ИНСТИТУТА БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М.ШЕМЯКИНА И Ю А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВ АНДРЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ ФОТОРЕЦЕПТОРНОГО БЕЖА РЕКОВЕРИНА ПО ЕГО Са 2+-СВЯЗЫВАЮЩИМ ДОМЕНАМ МЕТОДОМ ОЛИГОНУКЛЕОТИД-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ

СВОЙСТВ

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., профессор Филиппов П.П. д.х.н., профессор Липкин В.М.

Пущино 1999

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Оптимизация экспрессии эукариотических полипептидов в E.coli...................................................7

1.1. Конфигурация векторов для эффективной экспрессии гетерологических белков......................................................................7

1.2.Факторы, оказывающие влияние на уровне транскрипции при экспрессии рекомбинантных генов...................................................10

1.2.1. Промоторы.......................................................................................10

1.2.2.Терминаторы транскрипции............................................................14

1.2.3. Антитерминаторы транскрипции..................................................16

1.2.4. Строго регулируемые системы экспрессии..................................17

1.3. Регуляция на уровне трансляции......................................................18

1.3.1. Инициация трансляции мРНК........................................................18

1.3.2. Энхансеры трансляции...................................................................21

1.3.3. Стабильность мРНК........................................................................23

1.3.4. Терминация трансляции.................................................................25

1.4. Пространственная локализация экспрессированного белка в E.coli. ...............................................................................................................26

1.4.1. Цитоплазматическая экспрессия....................................................27

1.4.2. Экспрессия в периплазму...............................................................32

1.5. Гибридные белки................................................................................35

1.6. Молекулярные шапероны..................................................................37

1.7. Синонимические замены аминокислотных остатков.....................39

1.8. Протеолиз белка в процессе экспрессии белка...............................42

1.9. Выбор питательных сред и условий ферментации.........................45

1.10. Заключение........................................................................................47

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................48

2.1. Материалы и реактивы.......................................................................48

2.2. Ферменты............................................................................................48

2.3. Методы................................................................................................49

2.3.1. Выделение ДНК плазмид из бактериальных клеток...................49

2.3.1.1. Выращивание ночной культуры Е. coli.......................................49

2.3.1.2. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli...........................49

2.3.2. Выделение одноцепочечной формы фагаМ13шр19...................51

2.3.3. Олигонуклеотид-направленный мутагенез рековерина..............52

2.3.4. Мутагенез с помощью ПЦР, метод мегапраймера.......................54

2.3.5. Получение компетентных клеток E.coli........................................55

2.3.6. Трансформация клеток Е.coli.........................................................56

2.3.6.1. Трансформация клеток E.coli штамма XL-1 вектором М13шр19, несущим мутантную кДНК рековерина.................56

2.3.6.2. Трансформация клеток Е.coli плазмидной ДНК.......................57

2.3.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК..............57

2.3.8. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках Е.соН.............59

2.3.9. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа...............60

2.3.10. Выделение мутантных форм рекомбинантного рековерина. ...61,

2.3.11. Аналитические процедуры...........................................................62

2.3.11.1. Определение концентрации белков..........................................62

2.3.11.2. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)..................62

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................64

3.1. Конструирование и экспрессия гена рековерина.....................64

3.1.1. Выделение и идентификация полноразмерного гена рековерина.

.......................................................................................................64

3.1.2. Клонирование и экспрессия гена рековерина..............................67

3.1.2.1. Клонирование гена рековерина...................................................67

3.1.2.2. Экспрессия гена рековерина и характеристика полученного рекомбинантного препарата рековерина..................................68

3.1.3. Получение миристоилированного рекомбинантного рековерина.

.......................................................................................................69

3.1.3.1. Коэкспрессия генов рековерина и миристоилтрансферазы.....69

3.1.3.2. Сравнение свойств природного и миристоилированного рекомбинантного рековерина....................................................71

3.2. Клонирование, экспрессия и выделение мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+-связывающим участкам.......72

3.2.1. Сайт-направленный мутагенез рековерина по его Са2+-

связывающим участкам..............................................................73

3.2.1.1. Сайт-направленный мутагенез ЕБ2 и ЕРЗ.................................73

3.2.1.2. Сайт-направленный мутагенез одновременно по ЕБ2 и ЕБЗ. .77

3.2.1.3. Сайт-направленный мутагенез ЕР4............................................77

3.2.2. Экспрессия, выделение и очистка мутантов рековерина с

измененными Са - связывающими участками........................79

3.3. Характеристика и функциональные свойства мутантов рековерина, модифицированных по его Са2+ - связывающим участкам..............................................................................................83

3.3.1. Связывание Са2+ мутантными формами рековерина...................84

3.3.2. Связывание мутантных форм рековерина с.................................85

фоторецепторными мембранами.............................................................85

3.3.3. Функциональная активность мутантов рековерина.....................87

ВЫВОДЫ..................................................................................................90

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 91

Список принятых сокращений

кДНК комплементарная ДНК

ДСН додецилсульфат натрия

ИПТГ изопропил-/?-тиогалактозид

НСП наружный сегмент палочек

ПААГ полиакриламидный гель

ПЦР полимеразная цепная реакция

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА этиленгликоль-бис/|3-аминоэтиловый эфир

тетрауксусной кислоты

O-i- о I

[Са ]f свободная концентрация ионов Са

EFl, EF2, EF3 и EF4 соответственно, первый - четвертый Са -

связывающие участки рековерина -EF2, -EF3, -EF2,3 соответственно, мутантные формы рековерина

с "испорченными" участками EF2, EF3 и одновременно EF2 и EF3 +EF4 мутантная форма с "восстановленным"

участком EF4

nRc и mRc соответственно, рекомбинантный

немиристоилированный и миристоилированный рековерин Rh родопсин

RK родопсинкиназа

SspA фрагмент белка А из Staphylococcus aureus

ВВЕДЕНИЕ

Ионы Са2+ и процессы фосфорилирования дефосфорилирования белков используются клетками всех типов для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими фундаментальными биологическими функциями, как клеточная рецепция, пролиферация и дифференцировка, иммунитет, транспорт. Благодаря методическому удобству работы с фоторецепторными клетками (исключительно высокое содержание сигнальных белков, возможность "запуска" передачи сигнала светом), зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с О-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдуцин - свМР-фосфодиэстераза послужили прототипами для огромного числа работ по системам рецептор - О-белок - эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов.

Многие эффекты Са на системы клеточной сигнализации опосредованы Са2+-связывающими белками, мишенями для которых часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Одним из таких белков в фоторецепторном каскаде является рековерин, роль которого состоит в кальцийзависимом ингибировании фосфорилирования фотовозбужденного родопсина родопсинкиназой, находящейся в активированном состоянии.

Рековерин представляет собой белок состоящий из единственной полипептидной цепи длинной в 201 аминокислотных остатков и его расчетная масса составляет 23 кД, ТчГ-конец рековерина миристоилирован.

К настоящему времени определены аминокислотные последовательности рековерина из палочек сетчатки быка, человека и его гомолога из сетчатки лягушки 8-модулина. Сравнение первичных структур рековеринов из выше перечисленных источников показало высокую степень гомологии и выявило наличие четырех потенциальных Са -связывающих доменов типа ЕБ-Иапс!, первый и последний из которых не способны связывать ионы кальция.

Одним из наиболее эффективных приемов, позволяющих исследовать механизмы функционирования белков, является метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Важнейшим моментом в осуществлении этого подхода является получение функционально активного рекомбинантного белка, то есть выбор адекватной системы экспрессии. Экспрессия в Е.соН является наиболее разработанным и экономичным способом получения некоторых эукариотических белков, включая и рековерин.

Настоящая работа посвящена оптимизации метода получения рекомбинантного рековерина и созданию его мутантных форм, с целью выяснения роли кальцийсвязывающих участков в формировании пространственной структуры и функции этого белка.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Оптимизация экспрессии эукариотических полипептидов в Е.соИ.

1.1. Конфигурация векторов для эффективной экспрессии гетерологических белков.

Конструирование плазмиды для экспрессии требует нескольких элементов, сочетание которых обязательно для эффективной экспрессии. Каноническая последовательность вектора экспрессии приведена на рис. 1.

RES

последовательность Устойчивость

R -35 -10 SD гена TT к антибиотику

Ori

-35 -Ю

' TTGACA (N)17TATAAT

mRNA 5' UAAGGAGG(N)8 16S rRNA AUUCCUCC

STOP ко дон UAAU UGA AUG

START ко дон AUG (91%) GUG (8%) UUG (1%)

Рис. 1. Схематическое представление элементов прокариотического вектора экспрессии. Представлен lac промотор (Р), в состав которого входят последовательности -35 и -10. Стрелкой указана последовательность транскрипции.

Для того, чтобы в клетках E.coli произошла экспрессия любого гена, этот ген должен быть транскрибирован РНК-полимеразой.

Транскрипция генов РНК-полимеразой начинается с её взаимодействия с промотором, определенной последовательностью нуклеотидов, расположенных перед структурной частью гена. На рис. 2 представлена каноническая последовательность нуклеотидов промотора Е. соН, в которой обобщены данные о первичной структуре 170 промоторов известных генов.

Рис. 2. Усредненная (каноническая) последовательность нуклеотидов промотора Е. coli с регуляторными сайтами. Обозначены нуклеотиды, встречающиеся в 39 % из 168 исследованных промоторов. Прописными буквами отмечены нуклеотиды, встречающиеся более чем у 54 % всех промоторов.

На схеме показаны нуклеотиды, которые с высокой частотой встречаются в этих положениях рассмотренных промоторов. Отсюда следует, что в любом промоторе E.coli присутствуют два консервативных участка, необходимых для эффективной работы промотора [1]. Первый из них расположен приблизительно за 10 нуклеотидов перед точкой инициации транскрипции, имеет обобщенную структуру ТАТААТ. Каноническую структуру второго участка, расположеного приблизительно за 35 нуклеотидов перед точкой инициации транскрипции (область -35), можно представить в виде последовательности TTGACT [2, 3].

Эффективность трансляции мРНК зависит от наличия на 5' конце этой РНК участка связывания рибосом, включающего инициирующей кодон AUG и последовательность длиной 3-9

-35

-10

1 . iy . Tat.Vnt

+1

а

tcTTGACat..t

нуклеотидов, комплементарных 3' концу 16S рибосомальной РНК и расположенной перед инициирующим кодоном. Этот комплементарный рРНК участок называют последовательностью Шайн-Дальгано (SD).

Терминатор транскрипции (TT) распологается вслед за кодирующей последовательностью и содержит сигналы как для терминации транскрипции [4] так и сигналы для предохранения мРНК от экзонуклеаз [5, 6, 7].

Помимо выше перечисленных элементов, для эффективной экспрессии вектор должен содержать ген, кодирующий устойчивость к антибиотику. Для этих целей широко используется ген ß-лактамазы (маркер, позволяющий проводить положительную селекцию).Однако при получении фармацевтических белков для человека, предпочитают использовать другие антибиотики для уменьшения возможного аллергического ответа [8].

Важно также и количество копий плазмиды на клетку, которое определяется областью начала репликации (ori). В большинстве случаях наблюдается корреляция между большим количеством плазмид на клетку и повышенным уровнем экспрессии целевого белка[9,10]. В других случаях увеличение количества копий плазмиды не приводит к увеличению уровня экспрессии чужеродного гена. Более того Васкварез [11] представил данные, что увеличение копий плазмиды на клетку привело к уменьшению экспрессии трипсина в E.coli. Также есть данные, что присутствие сильного промотора в высоко-копийных плазмидах снижает жизнеспособность клеток [12].

Анализ литературы по компьютерной сети "Internet" показывает, что наиболее используемым вектором экспрессии является серия векторов рЕТ, предложенная Студиером в 1991 году. В этих векторах сбалансированы сильный промотор и жесткая

регуляция этого промотора, повышен уровень синтеза мРНК. Штамм для экспрессии содержит мутации по генам протеаз. Более того, фирма "Invitrogen" добавила в эти вектора дополнительные сайты для клонирования и средства для более упрощенного выделения целевого белка.

1.2.Факторы, оказывающие влияние на уровне транскрипции при экспрессии рекомбинантных генов. 1.2.1. Промоторы.

Промоторы, используемые для экспрессии в E.coli (таблица 1) должны обладать следующими характеристиками. Во-первых, промотор должен быть сильным, т.е. обеспечивать накопление целевого белка 10-30% от сумарного клеточного белка. Во-вторых, должен проявлять минимальный уровень базальной активности, т.е. до добавления индуктора. Жесткая регуляция промотора необходима для синтеза белков, которые могут нарушать клеточный цикл. Например, токсичный для E.coli VP7 белок ротаровируса эффективно разрушает клетки и должен экспрессироваться в жестких условиях регуляции [65]. Однако в некоторых случаях недостаточно строгих условий регуляции, так как даже малейшее количество рекомбинантного белка критично для существования клетки. Примером могут служить молекулы белков которые инактивируют рибосомы или разрушают мембранный потенциал клетки. Токсичность может быть вызвана сверхэкспрессией некоторых собственных белков E.coli, таких как traT гена, который кодирует мембранный липопротеин; ЕсоШ рестриктазы в отсутствии соответствующей метилазы либо/или Ion гена. Более того, неполная репрессия экспрессирующей системы может быть причиной

нестабильности плазмид, уменьшения роста клеток и потери продукции рекомбинантного белка.

Ланзер и Бугард [67] провели интенсивные исследования широко используемой системы промотор-оператор гена lac и показали, что уровень репрессии промотора различается в зависимости от того, где расположен оператор. Так, если 17-членный оператор был помещен в пространство между -35 и -10 положениями уровень репрессии возрастал от 50 до 70 раз. Если оператор был помещен за позицией -35 или перед -10, то уровень репрессии резко уменьшался.

Таблица 1. Промоторы, используемые для высоко-эффективной экспрессии генов в E.coli.___

Промотор Регуляция Индуктор Ссылки

lac (E.coli) lacl, lacl4 ИПТГ 13, 14,15,16

ZacI(Ts), laclq (Ts) Термоиндукция 17

lacl4 (Ts) Термоиндукция 18

trp (Е. coli) Индол-акриловая кислота 19, 20,21,22

lpp {E.coli) ИПТГ, лактоза 23, 24, 25

phoA (E. coli) phoB позитивная фосфат 26, 27, 28, 29

phoR негативная

recA (E. coli) lexА Налидиксовая кислота 30

araBAD (E.coli) araC Ь-арабиноза 31

proU (E.coli) Осмотический шок 32

cst-1 (E.coli) Глюкоза 33

tetA (E.coli) Тетрациклин 34,35

cadA (E.coli) cadR РН 36,37, 38

nar (E.coli) fnr (FNR, NARL) Анаэробные условия 39

tac, (гибрид) lacl, lacl4 ИПТГ 40,41

trc, (гибрид) lacl, lacl4 ИПТГ 42

7acI(Ts), lacl01 (Ts) Термоиндукция 43,44

PiA) A,clts857 Термоиндукция 45, 46, 47, 48

Pl-9G-50 Уменьшение температуры 49, 50

Промотор Регуляция Индукция Ссылки

cspA (E.coli) Уменьшение температуры до 20°С 51, 52

Pr Pl тандем (À,) Xclts857 Термоиндукция 53,54

T7 (T7) №857 Термоиндукция 55, 56

Т7-1ас оператор laclq ИПТГ 57, 58, 59

Т3-1ас оператор lad4 ИПТГ 60

Т5- lac оператор laclq lacl ИПТГ 61,62

Т4- ген 32 (Т4) Инфекция фагом Т4 63,64

Третьей важной характеристикой промотора является его способ индукции. Для большинства широко используемых промоторов в биотехнологических целях применяется тепловая индукция или химический индуктор: индол-акриловая кислота [19, 20]. Индукция промотора lac и его производных tac и trc промоторов широко используется в лабораторных исследованиях. Однако использование ИПТГ в биотехнологических маштабах для получения рекомбинантных белков человека невозможно ввиду его токсичности и дороговизны. Этот недостаток ИПТГ в настоящее время является непреодолимым.

Способность мутантного гена lacl (Ts) продуцировать термочувствительный 1ас-репрессор сейчас позволяет использовать термочувствительную индукцию промоторов lac, вместо ИПТГ [17, 18]. К тому же новые вектора осуществляют строгую регуляцию trc промотора при 30°С [9]. В работе [68] описаны два различных термочувствительных мутанта гена lac, которые также хорошо, как и ИПТГ осуществляют индукцию.

Холодо-за�