Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение кальций-зависимой регуляции передачи сигнала в фоторецепторной клетке

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение кальций-зависимой регуляции передачи сигнала в фоторецепторной клетке"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ля имени М. В. ЛОЛЮНОСОВА

РГё--------------------------------------

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

£. о II V.. ----

На правах рукописи

ГИМЕЛЬБРАНТ Александр Александрович

ИЗУЧЕНИЕ КАЛЬЦИЙ-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ

ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА В Ф0Т0РЕЦЕПТ0РН0Й КЛЕТКЕ

03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1995 г.

Работа выполнена в отделе энзимологии НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор П. П. Филиппов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Н. Б. Гусев

кандидат химических наук, старший научный сотрудник

И. Д. Артамонов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН

Защита состоится « » 199 г. в часов на за-

седании Диссертационного совета Д.053.05.32 при Московском государственном университете, по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан « » 199 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

М. В. Иванов

____________.____ _ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В фоторецепторной клетке позвоночных - лалочке сетчатки - передача сигнала от световоз-Сужденного родопсина к ионным каналам цитоплазматической мембраны осуществляется путем светозависимой активации системы гидролиза цГМФ. т.н. фосфодиэстеразного каскада (см. обзор Филиппов и др., 1987). Последовательность событий в этом каскаде такова: поглощение света родопсином и активация этого белка - катализ светоактивированным родопсином (Rh*) ГДФ/ГТФ-оОмена на трансдуцине - активация трансдуцином фос-. фэдиэстеразы ЦГМФ (ФДЭ) - гидролиз цГМФ активированной ФДЭ (ФДЭ*). Компоненты каскада локализованы в наружном сегменте палочки (НСП).

Установлено, что кроме падения уровня цГМФ возбуждение палочки сетчатки светом приводит к снижению концентрации свободного са2* в НСП от 500-700 до 100-200 нМ (см. обзор каирр, Koch, 1992). На физиологическом уровне показано, что изменение концентрации са2* в НСП служит главным посредником СЕетовой адаптации, которая обеспечивает чувствительность палочки к чрезвычайно широкому диапазону уровней освещенности (см. обзор McNaughton, 1990). Вместе с тем, достоверные данные о молекулярных механизмах действия са2* на фосфодиэс-теразный каскад к моменту начала нашей работы практически отсутствовали (см. каирр, Koch, 1992); было известно только о факте регуляции синтеза цГМФ в НСП неустановленным са2*-связывающим белком (Koch, Stryer, 1986 ).

В связи с зтим возникает вопрос, воздействует ли са2' в субмикромолярных концентрациях на фосфэдиэстеразнкй каскад, и если да, то на какие этапы. Решение этих вопросов позволи-

ло оы глубже понять механизмы зрительной адаптации, а также причины патологических нарушений зрения. Значительный интерес представляет также установление роли недавно открытого фоторецепторного саг,-связывающего белка рековеринз (ОйгЬоог et а1., 1991), который в последние несколько лет является предметом активного изучения в ряде лабораторий мира.

Цель работы. Целью исследования было изучение влияния . са2* в субмикромолярных концентрациях на активность фосфэди-эстеразного каскада, и установление этапов каскада, на которые воздействует" са2*.

Научная новизна. Обнаружено действие Са2* на первый этап фосфодиэстеразного каскада - активацию трансдуцша родопсином.

Показана ключевая роль рековерина в обнаруженном эффекте Са2* на первом этапе каскада, причем полученные данные указывают на. родопсинкиназу как на клеточную мишень для рековерина; и-концевое ацилирование рековерина' нз является абсолютно необходимым для его функции, хотя и увеличивает эффективность рековерина как регулятора первого этапа фосфо-диэстеразного каскада,- концентрация са2*, в которой он оказывает полумаксимальный эффект на первый этап фосфодиэсте-разного каскада, изменяется в зависимости от рН.

Впервые продемонстрирован эффект са2* на второй этап фосфодиэстеразного каскада (взаимодействие трансдуцина и фэсфодиэстеразы), который проявляется в изменении начальной скорости гидролиза цГМФ фосфодиэстеразой и зависит от АТФ.

Практическая ценность работы. Полученные результаты по выяснению молекулярных механизмов передачи сигнала в фоторецепторной клетке важны для понимания молекулярных

^эснов ¡Уо^Г'И..,:^ патологий _зрения, - что.необходимо- для рззрг>-----------------------------

ботки методов их диагностики и лечения. Кроме того, механизм передачи зрительного возбуждения слушт моделью для других систем обработки сигнала, зависящих от в-белков, которые функционируют в различных типах клеток и активируются в ответ на гормоны и нейротрансмиттеры. Нарушение регуляции этих путей является причиной разнообразных "болезней регуляции", и обнаруживается в некоторых видах опухолей, а также при ряде инфекционных болезней (холера, дифтерит, коклюш).

Апробация работы состоялась на семинаре отдела энзимо-. логии НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ 6 октября 1995 г. и на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ 9 октября 1995 г.

Материалы работы докладывались на конференции ФЕБО по

биологическим мембранам (Хельсинки, 1994 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3

работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, оСзорз литература, экспериментальной, части, результатов исследования и их обсуждения, выеодов и списка цитируемой литературы ( названия). Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и таблицами.

з

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Получение НСП. НСП получали в соответствии с работой (Schpetkamp et ai., 1982) на холоду при инфракрасном освещении из свежеиссечекных или замороженных сетчаток Оыка.

Получение препаратов белков. Рековерин выделяли из Сетчатки быка В СООТВеТСТВИИ С (Dizhoor et al., 1991) с

модификациями. Рекомбинантые формы рековерина были любезно предоставлены А.Заргаровым (ИБХ РАН).

Регистрация активности ФДЭ. Активность ФДЭ регистрировали ПО высвобождению Н+ при гидролизе ЦГМФ (Liebman, Evan-czuk, 1982 ). Фосфодиэстеразный каскад в суспензии НСП акти-■ вировали вспышками различной интенсивности. Обесцвечивание родопсина, приводившее к активации всей ФДЭ, далее обозначается как "насыщающее"; обесцвечивание, активировавшее менее 100% ФЛЭ, - как "ненасыщающее".

Определение концентрации свободного кальция (fCa2*]f). Е отсутствие добавок Са2+, но в присутствии I мМ ЗГТА прини-мэли. что [Ca2+]fíl нМ. Правильность рассчитанных соотношений с^'/ЭГТА при tca2,]f менее I мкМ проверяли методот Флюоресцентного анализа с помощью индикатора квин-2 (Tsien, 19S2), г при |Саг+)г вше I мкМ - с иомош Сz2*-селективного электрода (Orion Research).

Методики теоретического анализа структуры белков Выравнивание первичных последовательностей белков проводил] Б пакете программ GeneBee (Brodsky et al., 1992). ПрОфИЛ! распределения зарядов на белке строились в пакете DNAStar Для визуализации третичных структур белков использовал ткет программ RasMol, разработанный R.Sayle (Glaxo, ик).

_______________________________РЕЗУЛЬТАТЫ К _СБСЩЕККЕ__

Изучение действия кальция и рековерина на первом этапе фосфодизстеразного каскада Зависимость врелени жизни активной форды ФДЭ от Со2*. Мы установили, что концентрация свободного Са2* (Г-Саг"Iг) влияет на процесс АГФ-зависимой инактивации ФДЭ после вспышки света. Как видно на рис. I, в отсутствие добавленного с а'* (кривая "+АТФ, -Са") инактивация происходит нз!.иого быстрее, чем в присутствии 400 нМ са2* (кривая "+АТФ, +Са").

Весьма существенно, что для проявления такого действия са2* необходим АТФ: влияние са2* на выключение ФДЭ* практически исчезает в отсутствие АТФ (ср. • кривее "-АТФ, +Са" и "-АТФ, -Са").

Рис.1. Влияние Саг+ и АТФ на выключение фосфодизстеразного каскада в НСП быка. Приведены записи хода реакции гидролиза.. цГМФ.

Обозначения: " 1" - момент ненасыщающего обесцвечивания Р.Ь (НЬ'/Ш^КГ4; максимальная скорость гидролиза после вспышки составляет 45-50% скорости после насыщающего обесцвечивания); "+Са" - [Са]г=400 нМ; Н-Са" - нМ, "+АТФ" - а среде присутствует 20 мкМ АТФ, "-АТФ" - АТФ отсутствует.

Для количественной оценки влияния [Саг*]г на процесс _ * »

инактивации ФдЭ мы использовали параметр т - характеристическое время жизни активированной формы ФДЭ, т.е. время, за которое скорость гидролиза цГМФ после вспышки уменьшается в е раз. На рис. 2 видно, что при увеличении [Са2+]г от I до 400 нМ и выше в присутствии АТФ происходит увеличение т, при атом полумаксимальный эффект приходится на [Саг*]ге1б0 нМ. Величина эффекта саг* в присутствии- АТФ (отношение т при [Са2*]^ I мкМ к таковому в отсутствие са2*), в среднем составляла 1,9±0,35." Необходимо отметить, что эффект са2' на т является АТФ-зависимым: в отсутствие АТФ -инактивация кас-

када практически не зависит от саг медленнее, чем в присутствии АТФ.

и происходит намного

40

5 35

30

25

20

15

10

#

*—Ф

*

1 Ю'7 10-" 10 [Са2+к, М

-6

Рис. 2. Зависимость характеристического времени жизни активированной ФДЭ от [Саг+]х.

Обозначения: • - 20 мкМ АТФ; о - АТФ отсутствует . Даны средние значения (п=3-4)± стандартное отклонение.

5

-5

Известно, что иззктивация_ 5осфодиэ_с1еразното _каскада происходит благодаря двум реакциям: I) АТФ-независимому гидролизу связанного с трансдуцином ГТФ, что приводит к инактивации трансдуцина и ФДЭ, и 2) АТФ-зависимому фосфори-лированию световозбужденного родопсина родопсинкиназой (РК), что приводит к блокированию активации трансдуцина родопсином (см. обзор Филиппов и др., 1987); т.е. фосфорилирование родопсина является единственной известной АТФ-зависимой реакцией, отвечащей за инактивацию фосфодиэстеразного каскада. Следовательно, тот факт, что в описанных выше экспериментах действие са2' на т зависит от АТФ, предполагает, что эффект са2* направлен на активность РК, которая модулирует передачу сигнала на первом -этапе фосфодиэстеразного каскада, снижая эффективность родопсина как активатора трансдуцина. В результате, в присутствии са2* активность РК снижается, и инэкти":-з1я каскада происходит медленнее; и напротив, снижение [Саг~] приводит к активации РК и, следовательно, к уменьшению т. Этот вывод прямо подтверждается проведенными в нашей лаборатории исследованиями светсзавиашого включения фосфата в Rh* в суспензии НСП, которое зависит от са2* с тем же ЧТО И В описанных опытах (Gorodovikova et al.,

19 9 4).

Таким образом, характеристическое время жизни ФДЭ*

зависит от са2*, возрастая g увеличением концентрации катиона; атФ-ззеесш&сть этого эффекта указывает на РК как мишень для действия Саг*.

¿eàc't&ue рекоберинс. на бре.кя. жизни активной форм ФЛЭ. Имевшиеся данные указывал! на возможность связывания рекове-рина с РК (Gorodovikova, piiiiippov, 1993). Для выяснения

вопроса ос участии рековерина в саг*-зависимой регуляции выключения фэсофодпэсте'разного каскада мы изучили воздействие этого белка на характеристическое время жизни ФДЭ*.

На рис. 3 приведены типичные записи хода гидролиза цГМФ в суспензии НСП, содернащей АТФ. Видно, что в отсутствие са2' добавленный извне рековерин влияния на реакцию не оказывает (ср. кривые 5 и 6). в присутствии I мкЫ са2* рековерин значительно увеличивает характеристическое время жизни ФДЭ (кривая 1); в среднем г увеличивалось от 32±4 с в отсутствие добавленного ^рековерина до 44±2 с в присутствии 2,5 мкМ бежа. Тот факт, что и без добавок рековерина са2* замедлял инактиваций ФДЭ* (кривые 2, 3), может быть объяснен наличием эндогенного рековерина в суспензии НСП.

Рис.З, Влияние экзогенного рековерина, выделенного из НСЕ быка, на выключение фософодиэстеразногс каскада. Приведена записи хода гидролиза ЦГМФ в присутствии 20 мкМ АТФ. обозначения: 1- в среде присутствует 2,5 мкМ рековерин и 1 кхМ Са'" {далее "-гСа">; 2- 5 мкМ БСА, "+Са"; 3- без добавок, "+Са"; 4-5 мкК БСА, без Са2*, 5-2,5 ккМ рековерин, без Са2*, 6 - Без добавок, бег Са'*; V- момент ненасыщающего обесцвечивания ЛЬ.

___________-Таким- образом,-добавление- рековеринэ к - суспензшг НС1Гв~ ~

присутствии АТФ приводит к увеличению т в присутствии, но не в отсутствие Са2*.

Для прямой проверки гипотезы о роли рековерина как модулятора характеристического времени жизни ФДЭ мы изучили влияние [Саг*]г на г в присутствии АТФ. после инкубации суспензии ШШ'без добавок рековеринэ, но в присутствии антирё-коЕериновых антител (АТ). В качестве контроля использовали препарат иммуноглобулинов от неиммунизированных животных.

Как оказалось, зависимость характеристического времени, жизни ФДЭ* от са2* полностью подавляется в результате инкубации с антирековериновыми АТ (рис. 4). Следовательно, можно сделать вывод, что АТФ-зависимое влияние са2* на т опосредуется в НСП именно рековерином.

20 п

О «

е

к

£ 15 к

ш а

о Щ

о а о ш

9" 3

ы

о я а ш ь а

ЯЗ

Л «

X

10 -

X

антнрековернновые АТ

контроль

Рис.4. Влияние ан-тирековериновых антител на время жизни активированной ФДЭ в препарате НСП быка.

Алнквоты НСП инкубировали в темноте в течение 10 мин в темноте в присутствии 1 мг АТ при 0°с, затем в течение 1 мин при 30°С, после чего начинали реакцию ненасыщающим обеспвечиваннем. Обозначения: заштрихованные колонки I Са2* ]« =400 нМ; неза-штрихованные - [ Са2* ] £ <1 нМ; даны средние значения (п=2-4) ± стандартное отклонение.

Поскольку антирековериновые АТ приводят к уменьшению характеристического времени жизни ФДЭ* в присутствии саг* и не действуют на этот параметр в отсутствие катиона, можно также заключить, что эффект рековерина состоит в увеличении х в присутствии Са2* (а не в уменьшении т в отсутствие катиона). Это означает, что рековерин ингибирует РК в присутствии са2\ но не в его отсутствие. Этот вывод согласуется с данными экспериментов, проведенных в нашей лаборатории, в

которых было показано, что рековерин уменьшает степень вклю-* ?+

чения фосфата в ьь в присутствии Са (согоаоуИсоуа et а1.,

1994). • -

Известно, что рековерин ацилирован по ы-концу остатком миристата, который участвует во взаимодействии рековерина с мембраной (О1гьоог et а1.( 1992). Высказывалось предположение , что связывание жирнокислотного "якоря" с мембраной необходимо для выполнения рековерином его биологической функции (го2и1уа, Б^уег, 1992). '

Мы сравнили воздействие на характеристическое время жизни ФДЭ* трех препаратов рековерина: бежа из НСП и двух форм рекомбинантного белка - миристоилированной и немиристо-ияированной. На рис. 5 видно, что все три препарата рековерина оказывают сходное действие, увеличивая характеристическое время жизни ФДЭ* в присутствии, но не в отсутствие Са2+. При этом немиристоилированная рекомбинантная фор-'.а Менее эффективна, чем миристоилированная форма и природный рековерин.

Таким образом, гг-концевое ацилирование рековерине не является абсолютно необходимым для проявления его действия

40 35 30 i 25 1

20 J

15 10 5 0

452920-

БСА ХТГА Рек мРек нРек

Рек нРек мРек

Рис.5. Влияние экзогенного- рековерина._ на характеристическое время жизни ФДЭ*.

(а) t в присутствии Са2+ ( [ Са2+ ] £=1 мкМ; заштрихованные . колонки) и в отсутствие катиона ( [ Са2+ ] £<1 нМ; незаштрихованнне колонки) . Обозначения: "-"

- суспензия НСП без' добавок белка, ЕСА - присутствует 5 НКМ БСА, ХТГА - 5 мкМ химотрипсиноген А, Рек

- 2,5 мкМ рековерин из НСП быка, мРек -*2,5 мкМ ре-комбинантный миристоипиро-ванный рековерин, нРек -2,5 мкМ рекомбинантный немиристоилированный рековерин. Даны средние значения (n-4-8) ± стандартное отклонение.

(б) электрофорегракма использовавшихся препаратов рековерина: из

НСП (Рек) и рекомбинантных форм - миристоилированного (мРек) и немиристоилиро-в»нного (нРек). Кг маркеров даны в кЦа.

на т, однако делает рековерин более эффективным модулятором передачи сигнала на первом этапе фосфодиэстеразного каскада.

Модель Са?*-зависимой регуляции РК рековеринол. В связи с тем, что в присутствии саг* рековерин связывается с родоп-синкиназой и при этом ингибирует ее, возникает вопрос о механизме взаимодействия рековерина и РК.

Проведенный нами теоретический анализ структур рековерина и родопсина предполагает, что весьма вероятным механиз-

мом модуляции рековерином активности РК является конкуренция мзящу рековерином и Rh*' за связывание с РК.

Действительно, на рис. 6 видно, что в первичных последовательностях рековерина и родопсина имеется по одному участку с достаточно высокой степенью идентичности (до 50%). Такой участок в родопсине (рстатки 327-348) перекрывается с известным сайтом фосфорилирования родопсина родопсинкиназой (см. обзор Филиппов и др., 1987). • Подобный участок в реко-верине (107-128) перекрывается с его Са2*-связывапцим центром С ВЫСОКИМ сродством К катиону (Flaherty et al., 1993). Основываясь на нашем анализе первичной и третичной структур рековерина, а также на литературных данных о субстратной специфичности РК, можно предположить, что структурные детер-

Rh -----------------------------------------ynpviyimmrikqf rncmvttlccg

Rec psgritrqefgtiyskffpeadpkayaqhvfrsfdanBdgtldfkeyvialhmteagktnqklew P

327* * ++ «+«*--» ++ »348

Rh knPLGDDEASTTVEKTETSQVAPA-----------------------------------------

Rec afSLYDVDSNGTISKNEVLEIVTAifkmispedtkhlpedentpekraekiwgffgkkdddklte 107 — "" 128

Rec kefiegtlankeilrliqfepgkvkeklkekkl

Рис.6. Первичная структура предполагаемого псевдосубстратного участка рековерина.

Обозначения: заглавными буквами выделено выравнивание последовательностей родопсина и рековерина, Rec-рековерин, и штриховка - идентичные остатки, "+"-сходные остатки; Р-главный сайт фосфорилирования Rh; сплошная линия - главный участок фосфорили-рования Rh; пунктирная линия - Са2*-связывающий участок типа EF-hand в рековерине.

шканта рекоъулша, которые обусловливают его связывание с -рКг"вкличают"пару"остатков" Сер-П9Г"Лиз-120".~ Вероятно, ~Тре-116 и Асп-121, идентичные остаткам в соответствующих позициях в Rh, также участвуют во взаимодействии рековерина и РК. В то же время, более длинные, чем в Rh, боковые цепи .остатков с С-концевой стороны от Лиз-120 способны препятствовать окончательному принятию кинаэой "рабочей конформации" по отнояенго к рековерпну. Другими словами, предполагается,, что участок II4-123 в рековерине служит псевдосубстратом для родопсинкиназы.

Наша гипотеза прямо предсказывает, что путем замены определенных остатков в последовательности между 107 и 128 остатками в рековерине, можно получить два типа его мутантов: с "приобретением функции" - мутантный рековерин, служащий субстратом для РК - и с "утерей функции" - мутантный белок, связывающий са2*, но не взаимодействующий с РК.

Изучение влияния рН на функцию рековерина. В литературе по функции рековерина приводятся противоречивые данные о величине ЕС50 по [Ca2*]f при исследовании связывания рековерина с РК или влияния |са2*) на фосфорилирование Rh*. Мы обратили внимание, что в работе, в которой сообщается о величине полуэффекта, равной 3 мкМ (Chen et ai., 1995), измерения проводили в более кислой среде, чем в статье, в которой ECcjq наблюдали в диапазоне 300-800 нМ (sanada et ai., 1995). Эти различия величины ECgg имеют принципиальное значение, т.к. in vivo [ca2']f не превышает I мкМ и, следовательно, эффекты с ЕС50 при |Ca2*)f » I мкМ не имеют физиологического значения.

По этой причине мы, не ставя перед собой задачи

т"3

провести детальное количественное описание рН-зависимости эффекта са2* на характеристическое время жизни ФДЭ*, определили величины полумаксимального эффекта (ЕСБ0) са2* на т при двух достаточно удаленных друг от друга значениях рН - 7,0 и 7,6 (рис. 7а). Оказалось, что обе кривые имеют одинаковый характер, однако если при _рН 7,6 полумаксимальный эффект наблюдается при [Са2* 1^150 нМ, то при рН 7,0 величина ЕС50 составляет около 4 мкМ.

Таким образом, величина ЕС50 для эффекта са2* на характеристическое время жизни ФДЭ* действительно меньше в более щелочной среде'.

Кроме того," обращает на себя внимание тот Еесьма интересный факт, что в отсутствие С а2* рН практически не влиял на т, тогда как в присутствии са2* г зависело от рН, достигая максимума при рН 7,0 (рис. 76).

Поскольку действие са2* на характеристическое время жизни ФДЭ* опосредуется рековерином, можно полагать, что рН-зависимость эффекта Са2* на т по крайней мере отчасти отражает влияние рН на са2*-связывающие свойства этого бежа.

Для выявления особенностей структуры рековерина, которые могли бы определять рН-зависимоеть связывания с ним Са2*, мы использовали следующий .теоретический подход. На основе первичной и вторичной структур бежа в пакете программ оыАБ1аг строили профиль распределения заряда на белке при каждом из выбранных значений рН; затем отыскивали те структуры, заряд на которых изменялся в зависимости от рН. .

90

80

70

а>

а

«

о *

и о к а а> я к а

о. «

х

60 ■

50 ■

40 -

30 ■

20

10 -

0,-0 а

Рис.7а.------Завися—

мссть характеристического времени жизни ФДЭ' от [Са2+], при рН 7,0 и 7,6.

Обозначения: О-рН 7,6, □- рН 7,0; даны средние значения (п=6) ± стандартное отклонение. За 100% принято значение при наибольшей

[Са рН.

2+

] £ при данном

10"

10"

10"

10"

[Са2+]£, м

10"

о 50

сч

и. ©

£ 40 £ Р1 5

X «

5 зо

а

я

20

10

м.

0 1

1

9о

Рис.76. Зависимость от рН характеристического времени жизни ФДЭ* в присутствии и в отсутствие Са2+. Обозначения: тпри высокой [Са2+], о- х при [ Саг+ ] £ < 1 нМ. Даны средние значения (п=5-8) ± стандартное отклонение.

6.4 6.0 6.К

• рн

7.4 7.6 7.Х

На рис. 8 видно, что в рековерине имеются 4 участка, предсказанный заряд на" которых зависит от рН в диапазоне 6,5-7,9: это последовательности, включающие остатки 34-42, 63-71, 86-94, 135-143. Следует отметить, что две таких последовательности (остатки 63-71 и 86-94) входят в состав 2-го са2*-связывающего участка, типа "EF-hand" (EF2), который характеризуется сравнительно низким сродством к са2* (Flaherty et ai., 1993). Известно, что эти рН-чувствительные последовательности образуют характерные для "EF-hand"

в. Q1 в

-в. в!

BS2.

6,5

6,8 О

7,2

7,5 7,9

Зв10В 138

No.аминокислотного остатка

2 da

(а)

gnsksgalsk eilealqlnf kfteeeleBW yqaFLKECPS GRItrqefqt iyekffpead

pkAV.-.QHVFR Sf iansdgtl df kt yVIALH MTSAgktnqk lewaf sly iv dgngtlekne

£3 EF2 *94 EF3

vleivtaifk mispEDTKHL PEDentpakr aekiwgffgk kdddklteke fiegtlanke

ilrliqfepq kvkeklkekk 1

(6)

Рис.8. Участки в рековерине, заряд на которых изменяется в

зависимости от рН.

(а) Распределение заряда по аминокислотном остаткам рековерина. профиль заряда при рН 7,0 принят за 0 и вычтен из всех профилей.

(б) Расположение участков с рН-чувствитеяьным зарядом в первичной последовательности рековерина.

Обозначения: заштрихованные прямугольники, ЕЕ2, ЕЕЗ - Са2+-евяэываюаие петли центров связывания Са2+ типа ЕГ-Иапс!; на (б) рН-чувствительные участки выделены заглавными литерами и сплошными линиями.

__ ос-спирали,_____:,вз;ду_______которыми_____помещается— упомянутая---------------------

са^'-связывающая петля,- с другой стороны к этой петле близок рН-чувствительккй участок, образованный остатками 34-42. На основании сказанного можно предположить, что в зависимости от рН мсгут изменяться Саг*-связьшакние свойства участка ер2 в рековер;ше.

Кроме того, можно видеть, что спираль, образуемая последовательностью между остатками 63-71, расположена в непосредственной близости к саг*-связывавдей петле в структуре "ЕР-ЬапсГ С ВЫСОКИМ СРОДСТВОМ К Саг* (ЕРЗ; ОСТЗТКИ 109-120). При зэщелачивании среды заряд на этом участке -становится более отрицательным, что может способствовать лучшему связыванию иона са2* с Егз. Отметим также, что рассматриваемые рН-чувствительные участки в молекуле рековерина расположены поблизости от аминокислотных остатков в последовательности егз, которые, как мк предположили выше, участвуют в связывании с родопсинкиназой, и тем самым могут оказывать влияние на ее взаимодействие с рековерином.

Обнаружение влияния Са2+ на втором этапе фосфодиэстеразного каскада Как уже было сказано выше, АТФ-завксиыое фгсфорнлнрова-ние 1111* родопсинкиназой приводит к - уменьшению времени жизни ФДЗ*, что не должно сказываться на начальной скорости гидролиза. цГ:>5 под действием ФДЭ*. Однако при исследован:::: Ау5-зависимого эффекта са2* нэ кинетику инактивации ФДЭ* :«ы обратил: Ек:а:зш!е нэ тот факт, что начальная скорость гидролиза цГМФ в суспензии КСП, содержащей АТФ, тем не менее, зависит от |Са"*]г. Этот не описанный в литературе факт

послужил отправной точкой для исследования, результаты которого представлены ниже.

На рис. 9 представлены типичные записи хода гидролиза ЦГМФ в суспензии НСП, содержащей АТФ. Видно, что в присутствии са2* начальная скорость гидролиза цГМФ ниже, чем в отсутствие катиона. (Заметим при этом, что способ создания насыщающего обесцвечивания - вспышка или постоянное освещение - не имеет значения).

На рис. 10 приведена зависимость начальной скорости гидролиза ЦГМФ от [Ca2*]f; полумаксимальный эффект наблюдался при [са2*]{ а 200 нМ как при насыщающем, так и при ненасыщающем обесцвечивании Rh. Хотя абсолютная разность между начальными скоростями гидролиза цГМФ в присутствии и в отсутствие са2* была больше при активации каскада насыщающим обесцвечиванием, нормализованные кривые, описывающие зависимость начальной скорости от [Ca2*]f, практически совпадают (рис. 10,6).

В описанных экспериментах (рис. 9 и 10) в реакционной среде присутствовал АТФ, однако оставалось неясным, является ли обнаруженный эффект са2* на начальную скорость гидролиза цГМФ строго АТФ-зависимым.

На рис. II видно, что в отсутствие АТФ в среде начальная скорость гидролиза ЦГМФ практически не чувствительна к изменения fCa=*]r, т.е. действие са2* является АТФ-зависимым.

Важно отметить также, что величина эффекта АТФ возрастает со временем темновой преинкубации: эффект саг* более

Рис.9. Зависимость скорости гидролиза цГМФ после насыщающего обесцвечивания НЬ от [Са.2*]±. Приведены типичные записи хода реакции.

Пробы инкубировали в течение 3 мин в темноте при 30°С и рВ 7,6 в присутствия 100 мкМ АГФ. Реакцию начинали насыщающий обеспечиванием - при помощи

вспышки ("__") или при помощи постоянного освещения ("---").

Обозначения* | - момент вспышки или начала освещения; "+Са" - [Са2*);«1 мкМг "-Са" - [Са!*],-1 вИ. . _____

700

и 600

500

400

. 300

200

100

(а)

Ю-9 10-® 10"' ю-[сл2+]£, к

100

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

(б)

10"' 10"° 10"

[Са1*]!, М

10"

о

Рис.10. Зависимость скорости гидролиза цГМФ от [Саг*]£. (а) Начальная скорость гидролиза нГМФ после насыщающего (Д) и нена-скааюшего (♦) обесцвечивания ИЬ в присутствии 100 мкм АТ4>. При расчете активности ФДЭ принимали, что молярное соотношение ЕЬ:ФДЭ составляет 1:1'00.

(61 Тс же, но значения выражены в процентах (за 100% принято значение окЬрости гидролиза в отсутствие Са2*). Паны Средние значения (п-3-5) ± стандартное отклонение.

выражен после 3 мин, чем после 45 с преийкубации в присутствии АТФ. Т.к. известно, что активность родопсинкиназы строго СЕетозависима, можно заключить, что наблюдаемое усиление эффекта в результате темновой преинкубации в присутствии АТФ не связано с РК.

Более того, можно утверждать, что АТФ-зависимый эффект са2' на начальную скорость гидролиза цГМФ вообще не связан с первым этапом фосфодиэстеразного каскада, т.е. с процессом активации трансдуцина светоактивированным родопсином. Дело в том," что в экспериментах, где использовался высокий уровень обесцвечивания родопсина (см., например," рис. 9 ,и II), количество иь* в' реакционной среде на несколько порядков превосходило его минимальное количество, необходимое для активации всего присутствовавшего трансдуцина, и, тем самым, всей ФДЭ. Это означает что первый этап каскада в описанных

40 -

50

Рис.11. Влияние АТФ, АТФуБ и ГТФуБ на эффект Са2+ на начальную скорость гидролиза цГМФ.

30 ■

с.

л

-AT* 3' 45* 3*

п

ATt^a 3'

U

ГТФуВ 45" 45"

I

В реакционной среда присутствовали 100 мкМ АТФ и 500 мкМ ГТФ, если не ухазано иначе. Обозначения: V- активность ФДЭ при [Са2'*],= 1 нМ; V'- то же при [Ca2't]£= 1 мкМ; "-АТФ" - в среяе инкубации отсутствовал АТФ; ATfcvS - вместо АТФ в среде 100 мкМ ATfcyS; ГТФу5 - вместо ГТФ в среде 100 «КМ ГТФ-/Ё; ниже обозначено вреия преинкубации перед ненасыяавдим обесцвечиванием Rh в мин (') и с ("). Показаны средние значения (п=3-10) г стандартное отклонение.

условиях- не -является лимитирующим.-Следовательно, обнаружен- -ный АТФ-зависимый эффект са2* на начальную скорость гидролиза цГМФ никак не связан с изменением эффективности активации трансдуцинз родопсином (в том числе за счет активности РК).

На рис. II видно также, что при замене ГТФ на его не-гидролизуемый аналог, ГТФ-тгз (т.е. в условиях, когда не происходит выключения трансдуцина, а значит, и ФДЭ, в результате гидролиза.связанного с трансдуцином нуклеотида ), АТФ-зависимого уменьшения начальной скорости гидролиза цГМФ в присутствии са2\ по сравнению со скоростью в отсутствие, катиона, не происходит. Это означает, что АТФ-зависимый эффект са2* на начальную скорость гидролиза цГМФ не связан с изменением каталитической эффективности ФДЭ* как таковой, а направлен на процесс взаимодействия трансдуцина с ФДЭ.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что описанный нами АТФ-зависимый эффект са2* на начальную скорость гидролиза цГМФ реализуется на втором этапе фосфодиэстераз-кого каскада.

Следует подчеркнуть, что для проявления обнаруженного нами эффекта необходим гидролиз г-фосфатной связи в АТФ, т.к. в присутствии негидролизуемого аналога АТФ, АТФ-зг-б, практически не наблюдается различия между скоростями гидролиза цП.'Ф в присутствии и в отсутствие Са2+ (рис. II). Это указывает на то,что данный•эффект опосредован киназой, активность которой зависит от (са2" ]г. Какая именно киназа опосредует действие са2* на второй этап фософодиэстеразного каскада, а также определение деталей этого регуляторного механизма, - предмет отдельного исследования. Но уже сейчас

АТФ-зависимыи 2+

5 . 10 15 20 107 п.о Интенсивность вспышки

Рис.12.

эффект Са" на начальную скорость гидролиза цГМФ при различных интенсивностях вспышки.

За единицу интенсивности вспышки принимали

1/(4,3*107) от интенсивности неаттенюированной вспышки; вспышка интенсивностью 5 условных единиц обесцвечивала

0,01% Мк Обозначения: V" - начальная скорость гидролиза цГМФ при [Са2*]=1 мкМ; V - то ге при [СгР+]=1 ,нМ; п.о. -постоянное освещение. Даны средние значения (п=2-5) ± стандартное отклонение.

мы можем исключить протеинкиназу С, так как, по нашим данным, присутствие форболового эфира не влияет на начальную скорость гидролиза цГМФ.

Обнаруженный АТФ-зависимый эффект са2* на начальную скорость гидрожза цГМФ мы изучали при уровне обесцвечивания p.h, . существенно превышавшем физиологические значения, в связи с этим, вопрос о "физиологичности" обнаруженного эффекта са2* остается, строго говоря, открытым. Однако, как следует из рис. 12, величина эффекта остается постоянной вне зависимости от уровня освещения, в том числе и при обесцвечивании всего 0,01% родопсина, что близко к физиологическим условиям. Это дает основания полагать, что обнаруженное нами действие са2* на второй этап фосфодиэстеразного каскада может реализовываться и in vivo.

ВЫЗОЛУ

1. Характеристическое время жизни активированной формы фэс-фод;эстеразы увеличивается при возрастании концентрации Са2+,- этот эффект са2* реализуется на первом этапе фосфоди-

эстеразного каскада (активация трансдущша родопсином).

2. Эффект Са2"*" на характеристическое время жизни активированной формы ФДЗ опосредуется рековерином. и-концевое мири-стоилирование рековерина увеличивает его эффективность как. модулятора инактивации первого этапа фосфодиэстеразного каскада. -Предложена модель, описывающая взамодействие рековерина с его клеточной мишенью, родопсинкиназой.

3. Величина ЕС50 полумаксимального эффекта Са2+ на характеристическое Еремя жизни активированной формы фосфодиэстерззы возрастает при снижении рБ. На основании теоретического анализа структуры рековерина предложена модель рН-регуляции Са2+-связывающих свойств этого белка.

4. Обнаружен АТФ-зэвисимый эффект Сэ2+ на начальную скорость гидролиза цГМФ, который реализуется на втором этапе фосфодиэстеразного каскада (взаимодействие' трансдуцина и фосфодиэстерззы) .

Список публикаций по теме диссертации

1. A.A.Gimelbrant. Regulation of N-myristoylated proteins: the role for fatty acid residue. Biochemistry (Moscow). 58 (8): 1329-1330, 1993.

2. P.P.Philippov, E.N.Gorodovikova, A.A.Gimelbrant, I.I.Se-nin. Investigation of the function of a calcium-binding protein p26 or recoverin in bovine retina rod cells. Proceedings of FEBS special meeting "Biological membranes", Helsinki Espoo, Finland, -1994, p.555.

3. E.N.Gorodovikova, A.A.Gimelbrant, I.I.Senin; P.P.Philippov. Recoverin médiates the calcium effect upon rhodopsin phosphorylation and cGMP hydrolysis in bovine retina rod cells. FEBS Lett. 349: 187-190, 1994.

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

[Са2ч"]г - концентрация свободного ca2\- НСП - наружный сег мент палочки сетчатки,- РК - родопсинкиназа,- ФДЭ - фосфодизсте-раза цГМФ; ФДЭ* - активированная форма ФДЭ,- цГМФ - циклический 3' ,5'-гуанозинмонофосфат; Rh - темновой" родопсин,- Rh* - фото-Еозбужденный родопсин; т - характеристическое время жизни активированной формы ФДЭ.

3Тир. ¿00 Тип. Мнн-ва культуры