Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические функции фактора некроза опухолей, продуцируемого отдельными видами клеток иммунной системы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Биологические функции фактора некроза опухолей, продуцируемого отдельными видами клеток иммунной системы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правахрукописи

ГРИВЕННИКОВ Сергей Игоревич

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ, ПРОДУЦИРУЕМОГО ОТДЕЛЬНЫМИ ВИДАМИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

(

!

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной иммунологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (г. Москва, Россия) и в Институте трансгеноза (г. Орлеан, Франция)

Научные руководители:

Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор С.А.Недоспасов Кандидат биологических наук Д.В.Купраш

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.С. Апт

Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор А.Г. Габибов

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Зашита диссертации состоится 10 июня 2004 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.23S.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан 30 апреля 2004 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат химических наук А.М. Крицы! I

Актуальность проблемы.

Фактор некроза опухолей (ФНО) является важнейшим цитокином, регулирующим множество аспектов развития, функционирования и поддержания иммунной системы и организма в целом. Исследования с применением биохимической инактивации ФНО in vivo или с использованием «нокаутных» животных показали, с одной стороны, критическую роль ФНО для развития иммунного ответа и для поддержания структурной организации лимфоидных органов. С другой стороны, была выявлена негативная роль ФНО как индуктора или медиатора развития аутоиммунных заболеваний и различных видов воспалительного шока. Еще в 80-х годах были сформулированы представления о «плохом» и «хорошем» ФНО, одновременно присутствующем в организме или вырабатывающемся в конкретных патофизиологических ситуациях. ФНО нашел ограниченное применения в онкологии (при несистемном введении). Интересно, что в настоящее время для лечения некоторых заболеваний применяются системные блокаторы ФНО, которые имеют и нежелательные побочные эффекты, связанные с подавлением иммунной системы, в частности, функций защиты организма.

Для обеспечения своей физиологической роли, связанной с развитием иммунного ответа, ФНО должен производиться в определенных частях организма, причем его количество, время синтеза и кинетика высвобождения должны четко регулироваться. В избыточных количествах ФНО приводит к негативным эффектам и является причиной развития многих аутоиммунных и воспалительных патологий, таких как ревматоидный артрит (РА), септический шок и болезнь Крона (БК). Недавно применение блокаторов ФНО, таких как Infliximab и Etanercept, позволило добиться терапевтических результатов при лечении РА и БК. Однако системное ингибирование ФНО сопряжено и с опасностями, так как в его отсутствие нарушается индукция многих механизмов антибактериальной защиты, а также затрагивается структура лимфоидных органов. Так, например, у пациентов, страдающих ревматоидным артритом и находящихся на длительной терапии с применением блокаторов ФНО, во много раз возрастает вероятность реактивации туберкулеза.

ФНО в его растворимой и мембранно-связанной форме продуцируется многими типами клеток в различных количествах и с различной кинетикой, в зависимости от вида изначального стимула. Логично предположить, что ФНО, производимый каким-то конкретным типом клеток, играет уникальную роль в отдельно взятом физиологическом процессе - например, в устойчивости к патогенам или развитии

аутоиммунного заболевания. С появлением нового генетического метода -кондиционного (тканеспецифического/индуцибельного) нокаута у мышей - появилась возможность изучить сравнительный вклад различных клеток иммунной системы в продукцию ФНО in vivo. Можно ожидать, что специфическое блокирование ФНО только в одном типе клеток сможет в достаточной степени ингибировать развитие аутоиммунной болезни или шока, в то же время минимально влияя на нормальное функционирование иммунной системы.

Цель и задачи исследования.

Целью данного исследования является изучение биологической роли ФНО мыши, продуцируемого главными видами клеток иммунной системы - макрофагами, гранулоцитами, Т и В лимфоцитами, при ответе организма на патогены и при различных патофизиологических состояниях. Были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Получить и охарактеризовать линии нокаутных мышей с тканеспецифической инактивацией гена ФНО в клетках иммунной системы, в частности, макрофагах, нейтрофилах, Т и В лимфоцитах.

2. Изучить роль ФНО, продуцируемого клетками врожденного иммунитета (макрофагами и нейтрофилами) и адаптивного иммунитета (Т и В клетками) в устойчивости к внутриклеточному патогену Listeria monocytogenes.

3. Изучить роль тканеспецифической продукции ФНО в развитии классических патофизиологических состояний, таких как токсический шок и экспериментальный аутоиммунный гепатит.

Научная новизна.

В настоящей работе в рамках международного проекта впервые создана и охарактеризована панель мутантных мышей с тканеспецифической инактивацией гена ФНО в макрофагах и гранулоцитах, а также в Т и В клетках. Эти мыши являются уникальными моделями для изучения in vivo физиологической роли ФНО, продуцируемого соответствующими типами клеток. В настоящей работе впервые исследованы функции ФНО, производимого раздельно только Т клетками или только макрофагами/нейтрофилами. Показано, что для устойчивости к внутриклеточным патогенам необходим как ФНО, производимый макрофагами и нейтрофилами, так и

ФНО, продуцируемый Т лимфоцитами, причем эти два источника ФНО не могут компенсировать друг друга. Для развития септического шока и системной токсичности, вызванной бактериальным липополисахаридом (ЛПС) в присутствии D-галактозамина (D-Гал), необходим только макрофагальный ФНО. С другой стороны, ФНО, производимый Т клетками, необходим для возникновения аутоиммунного гепатита, индуцированного инъекцией Конканавалина А, и токсического шока, вызванного энтеротоксином В золотистого стафилококка в присутствии D-Гал. ФНО, продуцируемый макрофагами, также принимает участие в развитии этих патологических состояний, предположительно на эффекторной стадии.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для фундаментальной науки о цитокинах как медиаторах иммунных, в том числе и патологических, реакций, но и для практического применения. ФНО при локальном введении по-прежнему используется для лечения некоторых видов рака. С другой стороны, в последние годы биохимические ингибиторы ФНО, такие как Infliximab (блокирующие антитела против рекомбинантного ФНО человека) или Etanercept (растворимый ФНОР2 рецептор человека) активно и успешно используются для лечения таких аутоиммунных заболеваний, как ревматоидный артрит, аутоиммунный диабет, болезнь Крона. Поскольку ФНО, как это подтверждено и в настоящей работе, является критически важным медиатором устойчивости организма к различным патогенам, его полное системное ингибирование способно привести к серьезным негативным последствиям, что и было отмечено у пациентов, принимающих блокаторы ФНО. Детальное понимание функций ФНО, продуцируемого определенными клетками иммунной системы в физиологических и патологических условиях, необходимо для разработки более эффективных методов терапии.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на нескольких международных и отечественных симпозиумах и конференциях, в том числе: "Keystone Symposia: Link Between Innate and Adaptive Immunity", Taoc, Нью Мехико, США, 2002; "The 9th International Congress on TNF-related cytokines", Сан Диего, Калифорния, США, 2002;

"International Cytokine Society Annual Meeting", Дублин, Ирландия, 2003, конференции "Цитокины, воспаление, иммунитет", Санкт-Петербург, Россия, 2002, и Энгельгардтовской конференции 2003 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и обсуждение, выводы, список литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают рисунков, таблицы и список литературы из источников.

Содержание работы

Нормальный фенотип ФНО flox/flox мышей

Для специфической инактивации гена ФНО в различных типах клеток мы использовали систему рекомбинации loxP/Cre, а также панель различных «нок-ин» (knock-in) и трансгенных мышей, с тканеспецифической экспрессией рекомбиназы Сге. Сначала в нашей лаборатории методом гомологичной рекомбинации в эмбриональных стволовых клетках были получены' ФНО"0*"10* мыши (Рис. 1А), во всех клетках которых ген ФНО был фланкирован двумя со-направленными последовательностями узнавания рекомбиназы Сге (участками 1охР), помещенными таким образом, чтобы оставить ген ФНО полностью функциональным. Такие мыши проявляли фенотип "дикого типа" (Рис. 1 А) в ответ на инъекции различных количеств ЛПС, по устойчивости к микобактериям и листерии, а также имели нормальную структуру селезенки и лимфатических узлов и нормальный специфический антительный ответ на тимус-зависимый антиген. С помощью такой генетической модификации ген ФНО в этих мышах был «подготовлен» к последующей делеции за счет действия рекомбиназы Сге, экспрессируемой под контролем тканеспецифического промотора у трансгенных мышей.

Специфическая и эффективная инактивация ФНО в макрофагах/нейтрофилах, Т и В лимфоцитах.

Для получения мышей с делецией гена ФНО только в макрофагах и нейтрофилах мы скрестили фНОЛох"'<ж мышей с ранее полученными мышами, несущими «нок-ин» Сге рекомбиназы в локус мышиного лизоцима (мыши MlyslCre, (Clausen et al. 1999)). В таких мышах Сге рекомбиназа высоко специфично экспрессируется только в макрофагах, нейтрофилах и моноцитах, но не в других типах клеток и тканей. Мыши, имеющие генотип д1уйо*"1ох rnfys!CK/vt, были названы М-ФНО мышами (Рис 1А). Следует отметить, что для всех последующих опытов использовались мыши, гетерозиготные по Сге рекомбиназе в Mlysl локусе, так как гомозиготность в данном случае приводит к полной инактивации гена Mlysl, кодирующего лизоцим, важный для осуществления антибактериального ответа.

Инактивация гена ФНО в М-ФНО мышах происходила тканеспецифично и эффективно. По данным Саузерн- гибридизации делеция гена в очищенных нейтрофилах из брюшной полости и в костно-мозговых макрофагах была практически полной (> 98%), в то время как ген не был даже частично делегирован в тканях почки или в тимусе (Рис. 1В-Е). мРНК ФНО в костно-мозговых макрофагах, полученных из М-ФНО мышей и стимулированных ЛПС, практически отсутствовала (Рис. 2F), в то время как в контрольных макрофагах дикого типа наблюдался высокий уровень ФНО транскрипта. Наконец, белок ФНО практически не детектировался методом ИФА в супернатантах очищенных нейтрофилов (Рис. 2А), костно-мозговых макрофагов (Рис. 2В) и перитонеальных макрофагов (Рис. 2C,D), стимулированных ЛПС. В то же время костно-мозговые дендритные клетки, которые представляют собой преимущественно миелоидный подтип дендритных клеток, содержали делецию около 50% гена ФНО по данным Саузерн анализа (Рис. ID). В противоположность этому, ген ФНО в плазмацитоидных дендритных клетках и в тучных клетках не претерпевал делеции (Рис. 1 F,E). Следовательно, М-ФНО мыши представляют собой модель с полной инактивацией ФНО в макрофагах и нейтрофилах, а также частичной делецией этого гена в миелоидных дендритных клетках, происходящих из моноцитов.

По сходной методике мы получили мышей с тканеспецифической инактивацией ФНО в Т лимфоцитах, следуя схеме, ранее использованной для JlTß (Tumanov et al. 2003). Используя предоставленные другими лабораториями Т клеточно-специфичных

яыаьс

Мымс "флмсирмакиыа"

пма ФИО

i

"5ЙЬ

Мывьсдадацва!

гам «НО»

КЛЛЯЧИМ ПМ

М-ФНО (аакрафага, ааВтрофаль^ Т-ФН0 (Гааафи»ш|

В «НО (Вааафаиаш)

В

WT м-«но

V ч-фнов

МФНО ОНО С01ИГ К КО ОН"»1

4-wt

«•ФНОА

И.ФНО _ »ФИО юд.

la-wt f ФНО&

J

ш S 1 2

flfr&fti «нк G

T***v I . sí ♦TNF A

К-ФНО IM lywiM

ДИК '----

М-ФНО «I юг

CPHc*

1 ИМ «-Ч

' «ФН0Д

Рисунок 1. Получение и характеристика М-ФНО, Т-ФНО и В-ФНО мышей.

A. Схема скрещивания. TNF flox/flox мышей скрещивали с мышами, экспрессирующими Сге рекомбиназу под контролем соответствующего тканеспецифического промотора с целью палучеииа мышей с селективной инактивацией гена ФНО в соответствующем типе клеток.

B. Удаление гена ФНО в костно-мозговых макрофагах. Костно-мозговые макрофаги (10 день культивировании) из М-ФНО мышей подвергали лизису н получали геномную ДНК, которую расщепляли рестриктазой BamHI и подвергали Саузерн блот анализу, используя в качестве пробы фрагмент промотора JTTß

C. Инактивация гена ФНО в иейтрофилах. Геномная ДНК из сортароваиных СО) 1Ы- GRlhigh клеток (проточная цитофлюорометрия), выделенных из перитонеальной полости М-ФНО мышей, инъецированных тногликолятом, была подвергнута Саузерн блот анализу.

D. Удаление гена ФНО в дендритных клетках. Геномная ДНК из костно-мазговых дендритных клеток М-ФНО мышей была проанализирована на делению гена ФНО методом Саузерн блоггинга (типичный результат двух независимых экспериментов).

E. Анализ ткан специфичности делеции гена ФНО в М-ФНО мышах

Геномная ДНК из различных типов клеток и тканей была подвергнута Саузерн блот анализу. Перитонеальиые клетки (РЕС) были получены после инъекции 1 мл 3% тиогликолята внутрибрюшинно за 36 часов до сбора клеток (типичный результат двух независимых экспериментов)

F. Отсутствие делеции гена в тучных клетках. Костно-мозговые тучные клетки выращивались в течении 28 дней в среде OptiMEM с 10% FCS с добавлением рекомбинаитиого интерлейкина 3. Геномная ДНК анализировалась Саузерн блотшнгом с фрагментом промотора JTTß

G. Отсутствие делеции гена в шшмяцитоидных дендритных клетках. B22CH-CD11 с+ клетки из селезенки М-ФНО мышей были отсортированы на проточном цитофлюориметре. Геномная ДНК была подвергнута Саузерн блот анализу, используя в качестве пробы фрагмент промотора JTTß.

трансгенных мышей, Lck-Cгe (Takahama et э1. 1999) или CD4-Cгe (Radtke et al. 1999) мы получили Т-ФНО мышей. Делеция гена ФНО в тимусе данных мышей была около 95%, а в селезенке около 25%, что хорошо коррелирует с процентным содержанием Т клеток в данных органах. Очищенные Т клетки из этих мышей характеризовались практически полной делецией гена ФНО, которая не детектировалась в тканях почки или легкого, а также в В клетках. CD3+ клетки из селезенки Т-ФНО мышей практически не продуцировали ФНО в ответ на стимуляцию форболовым эфиром и иономицином или конканавалином А, как было установлено методом внутриклеточного окрашивания и проточной цитофлюорометрии. Остаточное ФНО-специфичное окрашивание, по-видимому, объясняется экспрессией ФНО В клетками, так как после инактивации гена и в В клетках (ТВ-ФНО мыши, с инактивацией гена ФНО одновременно в Т- и В- клетках) окрашивание пропадало полностью (Рис. 2Е). Аналогично, В-ФНО мыши с тканеспецифической делецией гена ФНО в В лимфоцитах были получены при скрещивании «флоксированных» ФНО мышей с CD 19- Сге мышами, в точности так же, как это ранее было сделано для ЛТР (Tumanov et э1. 2002). У этих мышей был также установлен исключительно высокий и тканеспецифический уровень делеции гена ФНО именно в В клетках, но не Т клетках, тимусе, тканях почки или печени. У взрослой мыши этого типа около 50% гена ФНО вырезалось в клетках селезенки, что коррелирует с общим содержанием В клеток в этом органе. В костном мозгу В-ФНО мышей делеция происходила в 20% клеток. Результаты по определению специфичности и эффективности делеции гена ФНО в различных типах клеток и тканей мышей с кондиционным нокаутом гена ФНО (М-ФНО, Т-ФНО и В-ФНО) суммированы в таблице 1.

ФНО, производимый макрофагами и нейтрофилаии, важен для развития септического шока и вместе с ФНО из Т лимфоцитов участвует в ответе на бактериальный суперантиген.

ФНО является важнейшим медиатором септического шока - состояния, связанного с острой системной токсичностью и приводящего к смерти - у человека и у мышей. ФНО также опосредует экспериментальную системную токсичность, вызываемую комбинированным введением ЛПС/Д-Галактозамина. Мыши с инактивацией гена ФНО

Рисунок 2. Экспрессия ФИО в М-ФНО мышах

A. Продукция ФИО нейтрофилами, активированными ЛПС. Очищенные при помощи проточной цнтофлюорометрки CD11 b+ GRlhigh клетки перитоннальной полости мышей, инъецированные 3% тиогликолатом, инкубировались 2 часа в среде RPMI-1640 с L-глутамином и 10% сыворотки и затем были стимулированы инкубацией в присутствии ЛПС (100 нг/мл) в течение 4 часов. Уровень ФНО в супернатантах клеток определялся методом ИФА, используя набор фирмы R&D Systems

B. Продукция ФНО стимулированными костно-мозговыми макрофагами М-ФНО мышей Прилипающие клетки (10 день культивации костномозговых макрофагов, 106 клеток/мл) из М-ФНО мышей были активированы в течение 24 часов в 96 луночной плашке при помощи: ЛПС (100 нг/мл), бактериальный липопротеин (БЛП) (500 нг/мл), CpG (1 нг/мл), убитой тепловой обработкой листерией (HKLM) (m. o. i. 100: 1), БЦЖ-липоманнаном (BCGLM) (50 ng/ml), живой листерией (LM) (m. o. i. 2: 1) или инкубировались без стимулятора в присутствии интерферона- гамма (50 нг/мл). Уровень ФНО в супернатантах клеток определялся методом ИФА, используя набор фирмы R&D Systems.

С. Продукция ФИО перитонеальными клетками, активированными ЛПС. Псритонеальные клетки (РЕС) были получены после иньекции 1 мл 3% тиогликолята внутрибрюшинно за 36 часов и активированы ЛПС (100 нг/мл) в течение б часов. Уровень ФНО в супернатантах клеток определялся методом ИФА (типичные данные двух независимых экспериментов)

Б. Внутриклеточное окрашивание ФНО в перитонеальных клетках, стимулированных липополисахаридом. Клетки были активированы ЛПС (100 нг/мл) в течение 5 часов с последующим добавлением (через 1 час после начала активации) реагента блокирующим секрецию. Далее

клетки были фиксированы, пермеабилизованы, окрашены флуюресцектными антителами к ФНО и поверхностным маркерам и проанализированы на цитофлюориметре.

К Экспрессия мРНК ФНО в стимулированных костно-мозговых макрофагах М-ФНО мышей Прилипающие к пластику клетки (10 день культивации костно-мозговых макрофагов) из М-ФНО мышей были активированы ЛПС (100 нг/мл) в течение 1. 5 часа, собраны и лизированы в Три-реагенте для приготовления РНК. Нозерн гибридизация осуществлялась с применением пробы из 2ого экзона мышиного ФНО.

Б. Внутриклеточное окрашивание ФНО в клетках селезенки. Клетки были активированы смесью КонА (5 мкг/мл) и РМА/иономицин (50нг и 5 мкг/мл соотвественно) в течение 9 часов с последующим добавлением (через 3 часа после начала активации) реагента блокирующим секрецию. Далее

клетки были фиксированы, пермеабилизованы, окрашены флуюресцентными антителами к ФНО и поверхностным маркерам и проанализированы на цитофлюориметре

Таблица 1 Эффективность и специфичность делеции гена ФНО в клетках и тканях мышей с тканеспецифическим нокаутом ФНО

линия

мышей

М-ФНО

Т-ФНО

В-ФНО

М-ФНО Т-ФНО В-ФНО

печень тимус - селезенка почка

>5% N/D 10% >5%

>5% >98% 23% N/D

N/D N/D 50% N/D

BMDM BMDC BMDMC РЕС

>96% 50% N/D >75%

N/A N/A N/A N/D

N/A N/A WA N/A

сортированные Сортированные В клетки Т клетки

N/A N/D >98%

сортированные Grl+ клетки

>98%

N/A

N/A

N/A >98%

NVA

Сортированные плазмаютоидные

ДС >5%

N/A N/A

BMDM-косшо-мозговые макрофаги; BMDC- костно-мозговые дендритные клетки; BMDMC-костно-мозговые тучные клетки; РЕС- клетки брюшной полости; N/A - не анализировалось; N/D - не детектировалось применяемым методом (Саузерн анализ).

или его основного рецептора ФНОР1 полностью устойчивы к такой обработке, в то время как мыши дикого типа умирают в течение 8 часов после инъекции ЛПС и Б-Гал (РаБрагаМв et а1, 1996). Анализ уровня ФНО в сыворотках мышей после инъекции ЛПС (1-100 мкг) показал, что концентрация ФНО в сыворотке крови сильно снижена у М-ФНО мышей (Рис. ЗА), хотя не до нулевого уровня, характерного для ФНО КО. В то же время, несколько неожиданно, у В-ФНО и Т-ФНО мышей были отмечены абсолютно нормальные уровни ФНО в сыворотке (Рис. ЗА). Следовательно, макрофаги и нейтрофилы являются основным источником системного растворимого ФНО, индуцируемого ЛПС. Логично предположить, что данные клетки также в основном опосредуют системный выброс ФНО при любой грам-негативной инфекции.

Интересно, что инактивация гена ФНО только в макрофагах и нейтрофилах была достаточна для защиты от ЛПС/Э-Гал шока, вызванного инъекцией 10 мкг ЛПС в комбинации с 20 мг Э-Гал, подобной той, которая наблюдалась в мышах с полной инактивацией гена ФНО или ФНОР1 (Рис. 3В). Даже более низкие дозы ЛПС (1 мкг), инъецированные вместе с Э-Гал, были летальными для В-ФНО, Т-ФНО и контрольных мышей.

чаем иш

Рисунок 3. Макрофаги и нейтрофилы являются главными источниками системного ФНО при токсическом шоке

A. Системная in vivo продукция ФНО в ответ на липополисахарид. В мышей было внутрибрюшинно заколото 50 мкг ЛПС, и сыворотка была собрана через 90 мин. Уровень ФНО в сыворотке определялся методом ИФА, используя набор фирмы R&D Systems (типичные данные двух независимых экспериментов).

B. Инактивация гена ФНО только в макрофагах и нейтрофилах вызывает устойчивость мышей к ЛПС^-Гал токсичности. В мышей было внутрибрюшинно заколото 10 мкг ЛПС вместе с 20 мг D-Гал, мыши наблюдались каждый час и усыплялись при наступлении терминальной стадии токсичности (типичные данные двух независимых экспериментов).

C. ФНО из макрофагов и Т лимфоцитов важен для развития SEB/Д-Гал токсичности

В мышей было внутрибрюшинно заколото 100 мкг SEB вместе с 20 мг D-Гал, мыши наблюдались каждый час и усыплялись при наступления терминальной стадии токсичности (типичные данные двух независимых экспериментов).

В физиологической модели цитокинового шока, индуцированного другим агентом -суперантигеном грам-положительной бактерии (SEB- staphylococcal enterotoxin В, энтеротоксин В золотистого стафилококка) в присутствии D-Гал была обнаружена важная роль ФНО, продуцируемого Т лимфоцитами. Интересно, что в этой же модели была выявлена роль ФНО, продуцируемого и макрофагами/нейтрофилами. В-ФНО

мыши не имели ярко выраженного фенотипа, отличного от контрольных мышей дикого типа, ни в одной из изученных токсических моделей.

ФНО, продуцируемый как макрофагами/нсйтрофилами, так и Т клетками, необходим для защиты организма отлнстериоза

Листерия (Listeria monocytogenes) является грам-положительной бактерией и представляет собой хорошо известную модель быстротекущей внутриклеточной инфекции, для которой ранее уже была установлена центральная защитная роль ФНО. Устойчивость к внутриклеточному бактериальному патогену (листерии) достигается за счет координированного взаимодействия многих типов иммунных и стромальных клеток, а также цитокинов, хемокинов и других медиаторов, производимых этими клетками. Макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и Т лимфоциты (особенно CD8+ клетки) необходимы для защиты от листерии, так как после удаления этих клеток из организма при помощи антител, животные быстро погибают от инфекции или развивают хронический листериоз без проявлений стерилизующего иммунитета (DiTirro et al., 1999, Unanue et al, 1997). Аналогичные данные были получены и на мышах с инактивацией генов, участвующих в развитии перечисленных типов клеток иммунной системы Эти клетки опосредуют прямые антибактериальные реакции организма и являются источниками важных провоспалительных цитокинов, таких как ФНО и интерферон-гамма, которые абсолютно необходимы для развития полноценного иммунного ответа на такой тип патогенов. В то же время известно, что все эти клетки и продуцируемые ими цитокины и хемокины важны только на конкретных стадиях инфекции, или даже только в одном типе ткани или органе. Например, известно что антибактериальная защита по-разному осуществляется в печени и селезенке, по сравнению с легкими. Следовательно, ФНО, продуцируемый только каким-то одним типом иммунных клеток в конкретном органе, может быть незаменим для иммунного ответа и защиты организма, в то время как другие источники этого цитокина могут оказаться несущественны.

Рисунок 4. Роль ФНО, производимого макрофагами и Т клетками в устойчивости к

А. Мыши инъецировались внутривенно 5* 10* коэ листерии и их выживаемость наблюдалась каждый день в течение 10 дней (данные трех независимых экспериментов, 5* 10 мышей • каждой группе) •

В- Мыши были лишены пищи и получали 5% распор бикарбоната натрия в течение 12 часов, после чего были инфицированы внутрижелудочно 101 коэ Листерии. Выживаемость наблюдалась каждый день в течение 10 дней (данные 3 независимых экспериментов» 7-12 мышей в каждой группе) -

С. Гистопатология печени инфицированных мышей. Мыши внутривенно инфицировались 5*104 коэ Листерии к забиты на день 3. Вырезанные фрагменты печени помешались в О.С.Т. compound для приготовления замороженных срезов или фиксировались в 10% -ном распоре формалина. Верхняя панель: окрашивание фиксированной > формалине тюхи печени гематоксилином и эозином. Нижние панели: серийные замороженные срезы печени, окрашенные антителами к CD11Ъ и GR1.

D, Е. Количество бактерий в печени инфицированных мышей. Мышя были заколоты внутривенно 5*10* коэ Листерии и 3 мыши нз каждой группы была забиты на день 2 (D) или 4 (Е). Печени стерильно вырезались и гомогенизировались в стеклянном гомогенизаторе • растворе PBS с 0.05% Твкн-20. Серийные последовательные разведения полученных гомогенатов высевались иа чашки с агаром brain-heart infusion agar и к.ол. оодсчнтывались после 24 часов роста при 37°С (типичные данные трех независимых экспериментов).

Системная инфекция мышей высокой дозой листерии показала чрезвычайную чувствительность М-ФНО мышей к внутриклеточному патогену, сравнимую с таковой у ФНО КО мышей. Так, М-ФНО мыши развивали неконтролируемую инфекцию, ведущую к смерти в течение 4 дней и сопровождающуюся 3-4 log увеличением количества бактерий в печени и селезенки по сравнению с контрольными мышами, способными пережить инфекцию (Рис. 4 A3).

В то же время, мы продемонстрировали роль ФНО, продуцируемого Т клетками, в защите от модельного патогена (Рис. 4). Хотя кривые смертности отличались от таковых для М-ФНО мышей и часть Т-ФНО мышей выживали, такие мыши отличались повышенными титрами инфекционного агента в органах. Интересно, что количество бактерий в селезенке и печени Т-ФНО мышей было сравнимым с таковым у мышей дикого типа на ранних стадиях инфекций, но быстро увеличивалось и достигало аномальных значений на более поздних стадиях инфекции (Рис. 4 D.E).

Проведенные ранее исследования выявили лишь весьма ограниченную роль В клеток и специфических антител в защите организма от листериоза. В согласии с этими данными мы установили, что В-ФНО мыши были так же устойчивы к инфекции листерией, как и мыши дикого типа, и могли успешно контролировать болезнь (Fig. 4 A,D,E).

Печень и селезенка инфицированных мышей дикого типа и В-ФНО мышей содержали лишь небольшое число очагов воспаления, в то время как у мышей с полной инактивацией гена ФНО или у М-ФНО мышей развивались крупные очаги некроза, окруженные зонами воспаления, характеризуемые большой концентрацией Мас-1 и Grl -положительных клеток (т.е. нейтрофилов и макрофагов). Такие очаги некроза и воспаления встречались гораздо реже в органах Т-ФНО мышей и практически не наблюдались у В-ФНО и контрольных мышей дикого типа (Рис. 4С). Важно вновь отметить, что Т-ФНО мыши также были аномально чувствительны к инфекции листерией, однако их гибель происходила лишь частично и с другой кинетикой, нежели у М-ФНО мышей или мышей ФНО КО (Рис. 4А).

Известно, что макрофаги и нейтрофилы являются клетками врожденного иммунитета, активирующимися на самых первых стадиях инфекции и способными к быстрой продукции больших количеств ФНО. Это, в свою очередь, приводит к активации как других компонентов врожденного иммунитета, так и системы адаптивного иммунитета, а также вызывает привлечение дендритных и других воспалительных клеток к очагам инфекции. Крайне выраженная чувствительность

мышей к внутриклеточному патогену в отсутствие ФНО, производимого макрофагами и нейтрофилами, может объясняться как дефектами в функционировании врожденного иммунитета (для многих компонентов которого ФНО является ключевым активатором), так и недостаточностью или несвоевременностью развития адаптивного Т клеточного ответа.

В экспериментах по комплементации фенотипа (т.е. попытке лечения) при -помощи системной внутривенной инъекции рекомбинантного ФНО (2 мкг/мышь, 2 раза в день на протяжениии инфекции) нам не удалось восстановить устойчивость у мышей ФНО КО или М-ФНО мышей. Такие же отрицательные результаты были получены в опытах с адоптивным переносом костно-мозговых макрофагов дикого типа (107 клеток/мышь), иньецируемых в день заражения, а также на 1-ый и 2-ой день после инфекции. Эти отрицательные результаты указывают, что по-видимому для обеспечения защиты от патогена, ФНО должен производиться не системно, а локально. Другое возможное объяснение предполагает главную роль для мембранно-связанного ФНО, который не может быть компенсирован растворимым цитокином.

В последующих экспериментах мы вакцинировали здоровых мутантных мышей переносом иммунных спленоцитов дикого типа (от зараженных мышей, успешно справляющихся с инфекцией) за 4 часа до инфекции и показали, что иммунные специфические Т клетки дикого типа, инъецированные М-ФНО мышам, способны приводить к ощутимой защите от листерии.

Таблица 2. Перенос иммунных спленоиитов защищает М-ФНО мышей от летальной ифекции листерией_

Донор Наивный реципиент Доза листерии (внутривенно) Выжившие мыши/всего

У/Т (иммунные) М-ФНО 105 6/6

\УТ (иммунные) ФНО КО 105 0/5

ОТ (наивные) \УТ 105 6/6

\УТ (наивные) М-ФНО 105 0/5

1ЛГГ (наивные) ОНО ко 105 0/5

ОТ (иммунные) ч/т 10" 5/6

\УТ (наивные) от 10" 0/5

ОТ мыши были инфицированы Листерией, иммунные спленоциты выделялись через 8 дней после инфекщш гомогенизацией селезенки через 70 мкм ситечки с удалением прилипающих клеток адсорбцией на культуральном пластике в течение 2 часов, после чего переносились внутривенно (ЗхЮ7 клеток/мышь) наивным реципиентам за 4 часа до инфекции. Мыши наблюдалась каждый день, терминально больные мыши эвтанизировались.

Перенос иммунных клеток мышам с полной инактивацией ФНО (ФНО КО) не защищал их от инфекции (Таблица 2). Из этих данных следует, что нормальный и своевременный Т клеточный ответ по каким-то причинам не индуцируется у М-ФНО мышей.

Пероральное (или внутрижелудочное) заражение листерией представляет собой более естественный путь инфекции человека листериями. В этом случае бактериям перед попаданием в кровоток необходимо еще преодолеть стенку кишечника, содержащую в себе организованные защитные клетки, способные к индукции иммунного ответа. Значения эффективной дозы, ДЦ50, для перорального пути заражения существенно выше, нежели для системной внутривенной или внутрибрюшинной инфекции. Интересно, что при внутрижелудочной инфекции мышей низкой дозой листерии ответ у М-ФНО мышей сильно отличается от такового у ФНО КО мышей, а именно - большинство М-ФНО мышей способны пережить инфекцию (Рис. 4В). По-видимому, при этом пути заражения какие-то другие клетки (отличные от макрофагов и нейтрофилов) являются источником «защитного» ФНО, необходимого для индукции эффективного иммунного ответа. Вероятно, что при проникновении через стенку кишечника бактерии взаимодействуют с тучными клетками, которые в М-ФНО мышах содержат ненарушенный ген ФНО (Рис. IF) и обладают способностью высвобождать при активации большие количества ФНО, содержащиеся в цитоплазматических гранулах. Другие возможные кандидаты, обеспечивающие продукцию защитного ФНО в этой модели - это дендритные клетки и недавно охарактеризованные Tip-DC клетки (специализированный субтип дендритных клеток, образующихся при инфекции из моноцитов и способных производить большие количества как ФНО, так и индуцируемой N0 синтазы - важного бактерицидного фермента).

Можно заключить, что ФНО, производимый макрофагами и нейтрофилами локально в очаге инфекции, является необходимым для защиты организма, хотя в некоторых ситуациях его отсутствие может быть частично компенсировано другими клеточными источниками этого цитокина. В то же время мы обнаружили неожиданную и важную роль ФНО, производимого Т лимфоцитами, который по-видимому реализует свою защитную функцию на других стадиях инфекции, либо через какие-то другие механизмы. Именно поэтому его отсутствие не может быть компенсировано продукцией ФНО макрофагами и нейтрофилами, даже с учетом того, что эти клетки производят гораздо больше ФНО, и он распространяется системно.

ФИО, производимый макрофагами и Т клетками, необходим для развития «молниеносного» гепатита, индуцированного конканавалином А

ФНО вовлечен в развитие воспалительных и аутоиммунных патологий, таких как ревматоидный артрит, гепатит, мозговая стадия малярии, септический шок и болезнь Крона. Экспериментальный «молниеносный» гепатит, индуцированный конканавалином А (далее КонА-гепатит) - это хорошо известная модель аутоиммуного повреждения печени (Tiegs et al. 1992). Ранее было показано, что у ФНО КО мышей этот вид экспериментального гепатита не развивается (Leist et al. 1996, Schumann et al., 2000), что указывало на важную роль ФНО в патогенезе этого заболевания, причем как на стадии индукции, так и на стадии развития патологии. Также ранее было показано, что основная часть ФНО, производимого при гепатите, является мембранно-связанной и использует для передачи сигнала оба типа рецепторов - ФНОР1 и ФНОР2. Присутствие резидентных макрофагов печени (Купферовских клеток) и Т лимфоцитов необходимо для развития КонА-гепатита. Ранние исследования методом флюоресцентной микроскопии показали, что большая часть ФНО в печени производится именно Купферовскими клетками, и их удаление из системы приводит к существенному ослаблению заболевания (Schumann et al., 2000). Однако, Купферовские клетки способны производить не только ФНО, но другие важные медиаторы патологических процессов, такие как индуцируемую NO синтазу и некоторые хемокины. Используя панель мышей с тканеспецифической инактивацией ФНО нам удалось выявить источник ФНО, необходимый для развития патологических процессов в печени. Интересно, что и М-ФНО, и Т-ФНО мыши обладали повышеннной устойчивостью к индукции КонА-гепатита, сравнимой с таковой у ФНО КО мышей (Рис 5А,С). В противоположность этому, В-ФНО мыши и контрольные мыши дикого типа развивали «молниеносный» гепатит, характеризующийся многочисленными повреждениями печени. Активность печеночного фермента аланин-аминотранферазы в сыворотке (АЛТ) коррелировала с гистологическими данными и была сильно повышена у мышей, развивающих гепатит (дикий тип и В-ФНО), в то время как в ФНО КО, М-ФНО и Т-ФНО мышах этот уровень был невысок (Рис. 5В).

в

с 5 -------

и

л

---------са--лй—

□ Д »

---------—.д.--------

^ I

1 I

52 <6 * * *

Рисунок 5. Макрофагальный и Т клеточный ФНО необходимы для развития аутоиммунного гепатита, индуцированного КонА

A. Патологи« печени нокаутных мышей, инъецированных КонА. КонА (13 мг/кг массы тела) вводился внутривенно. Через 10 часов мыши были забиты и степень развития гепатита определялась визуально при осмотре печени, с использованием почуколичественной условной шкалы: 1-2, нормальная печень; 3, начальный гепатит, 4, средневыраженный гепатит; 5, сильный гепатит (типичные данные двух независимых экспериментов).

B. Активность печеночного фермента алаиин-аминотраисферазы (АЛТ) в сыворотке мышей после внутривенной инъекции КонА (15 мг/кг массы тела). Сыворотка была собрана через 10 часов после инъекции и активность АЛТ определялась при помоши колориметрического энзиматического кита фирмы 81алЫо (типичные данные двух независимых экспериментов).

В печени мышей дикого типа наблюдались зоны некроза, окруженные инфильтратами клеток, в то время как у мышей М-ФНО, Т-ФНО и ФНО КО инфильтрирующие клетки присутствовали, но при этом больших зон некроза не наблюдалось. Так как изначальной мишенью для действия КонА являются Т клетки, а не макрофаги, было очевидно, что активированные Т клетки в этой модели продуцируют некоторые факторы, которые в свою очередь вызывают активацию макрофагов. Поскольку делеция гена ФНО в Т клетках приводила к практически полной защите от КонА-гепатита, наши данные помогли установить, что ФНО, продуцируемый Т клетками, и является одним из факторов, активирующих макрофаги или индуцирующих синтез молекул адгезии, приводящих к миграции воспалительных клеток. Следовательно, раздельная инактивация ФНО либо в Т клетках, либо в макрофагах, достаточна для защиты от КонА-гепатита. Мы предполагаем, что ФНО из Т клеток в этой модели играет роль индуктора, в то время как макрофагальный ФНО выступает как часть эффекторного механизма гибели клеток и активации воспаления. Такая интерпретация хорошо согласуется как с полученными ранее данными, так и с

нашими наблюдениями на другой модели - токсичности, вызванной 8ЕБ/Б-Гал. Другими авторами было недавно показано, что в другой модели аутоиммунного заболевания (болезни Крона) неограниченная продукция ФНО либо макрофагами, либо Т клетками, которая достигалась в трансгенных мышах, была причиной возникновения патологии стенки кишечника (Койоуап^ е1 а1. 2002).

Таким образом, полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что ФНО, производимый макрофагами и Т клетками, играет разную, подчас противоположную роль. ФНО, продуцируемый этими видами клеток, может опосредовать как положительную (пример - защита организма), так и негативную функцию (пример - токсические эффекты при воспалении или аутоиммунитете), в зависимости от патофизиологической ситуации. Известно, что экспрессия ФНО на уровне транскрипции и трансляции по-разному регулируется в Т клетках, макрофагах и других типах клеток, при этом разные клетки могут производить разные количества ФНО с различной кинетикой. Так как мы установили, что продукция ФНО макрофагами и Т клетками важна для индукции аутоиммуного заболевания на примере КонА-гепатита и шока, вызванного суперантигеном, логично предложить разработку тканеспецифических блокаторов ФНО только в Т клетках. Так как для защиты от патогенов роль макрофагального ФНО наиболее важна, а роль ФНО, производимого В клетками критична для поддержания правильной структуры вторичных лимфоидных органов, то ингибирование продукции ФНО только в Т клетках может иметь более благоприятные терапевтические эффекты, нежели применение системных блокаторов ФНО. Можно предположить, что в этом случае удастся добиться эффективной нейтрализации действия «плохого» ФНО, сохранив при этом большинство положительных защитных функций этого цитокина. Подобные стратегии ингибирования могут базироваться на искусственных аналогах транскрипционных факторов, тканеспецифическом использовании технологии интерферирующих РНК или же на экспрессии или локальном введении доминантно-негативных форм ФНО. Кроме того, в будущих исследованиях целесообразно провести поиск избирательных ингибиторов, способных блокировать только растворимую форму ФНО, но не мембранно-связанную, или наоборот.

Дефекты иммунного ответа в отсутствии ФНО не могут быть компенсированы Лимфотоксином-<Х.

ФНО и и растворимый гомотример ЛТа передают сигнал через одни и те же рецепторы- ФНОР1 и ФНОР2. Ранее была показана весьма существенная роль лимфотоксинов и, в частности, растворимого ЛТа в защите организма от патогенов (Roach et al. 2001).

Для экспериментов использовали мышей, дефицитных по ФНО, ЛТр и ЛТа («тройной нокаут» всего локуса ФНО) полученных ранее в нашей лаборатории (Rupгash et al. 2002) с целью выяснить, не является ли "избыточность" лиганд-рецепторных взаимодействий причиной того, что в присутствии растворимого лимфотоксина фенотип ФНО КО проявляется не в полной мере. В опытах по вторичной инфекции иммунных мышей сальмонеллой, а также при системном и внутрижелудочном заражении листерией (Рис. 6) нам не удалось обнаружить дополнительного вклада лимфотоксинов, проявляемого на фоне отсутствия ФНО. Как ФНО КО, так и ФНО/ЛТДЗ мыши демонстрировали одинаковую чувствительность к инфекции. Таким образом, по крайней мере на этих моделях, основной вклад

принадлежит ФИО, и при его инактивации вклад лимфотоксинов в защиту от патогенов является незначительным.

Заключение.

В данной работе с помощью уникальных линий мутантных мышей впервые изучена и установлена физиологическая роль ФНО, производимого главными типами клеток иммунной системы, при ответе на внутриклеточные патогены, а также в развитии аутоиммунного гепатита, и двух видов токсического шока.

Выводы.

1 При помощи метода кондиционного генетического нокаута получены мыши с тканеспецифической делецией гена ФНО в макрофагах и нейтрофилах. В совокупности с ранее полученными мышами с делецией ФНО в лимфоцитах, создана уникальная панель для изучения роли ФНО во врожденном и приобретенном иммунитете

2. Установлен уникальный вклад макрофагов и нейтрофилов в продукцию

системного ФНО в ответ на липополисахарид, а также в токсичность, связанную с системной экспрессией ФНО.

3 Установлено, что ФНО из Т клеток и из макрофагов/нейтрофилов играет важную роль в защите организма от внутриклеточных патогенов, причем эти источники ФНО не могут компенсировать друг друга

4 Обнаружено, что ФНО, продуцируемый как макрофагами, так и Т-лимфоцитами, играет решающую роль в индукции и развитии экспериментального аутоиммунного гепатита, вызванного действием Конканавалина А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Kuprash D.V. Alimzhanov M.B., Tumanov A.V., Shakhov, A.N., Grivennikov S.I., Marino, M.W., Turetskaya, R.L., Anderson A.O., Rajewsky K., Pfeffer K. and Nedospasov S.A. Redundancy in TNF and LT signaling in vivo: mice with inactivation of the entire TNF/LT locus versus single knockout mice. 2002. Mol CellBiol, 22, 86268634.

2. Nedospasov,S.A., Grivennikov.S.I, and Kuprash,D.V. Physiologic roles ofmembers of the TNF and TNF receptor families as revealed by knockout models. 2003. In: Cytokine knockouts, G.Fantuzzi, ed. (Totowa, NJ: Humana Press), pp. 439-460.

3. Grivennikov S.I., Tumanov A.V., Kruglov A.A., Takeda J., Clausen В., Foerster I., Tessarollo L., Kuprash D.V., Nedospasov S-A. Role of cell-specific TNF production in host defense and immune functions as revealed by conditional gene targeting. 2003. Eur. Cytokine Netw. 14 Suppl, 111.

4. Tumanov A.V., Kuprash, D.V., Lagarkova, M.A., Grivennikov S.I., Abe, K., Shakhov

A.N., Drutskaya. L.N., Stewart C.L., Chervonsky A.V., Nedospasov, S.A. Distinct role of surface lymphotoxin expressed by В cells in the organization of secondary lymphoid tissues. 2002. Immunity 17,239-250.

5. Tumanov, A.V., Grivermikov,S.I., Shakhov ,A.N., Rybtsov.SA., Koroleva,E.P., TakedaJ.,

Nedospasov.S.A., and Kuprash,D.V. Dissecting the role oflymphotoxin in lymphoid organs by conditional targeting. 2003. Immunol. Rev. 195,106-116.

6. S.I. Grivennikov, A.V. Tumanov, M.S. Drutskaya, J. Takeda, E. Southon, L. Drutskaya,

B. Clausen, I. Foerster, L. Tessarollo, D.V. Kuprash, S.A. Nedospasov. Both T and macrophage derived TNF is required for the resistance against Listeria. Keystone Symposia "Innate Immunity: Evolution and Link to Adaptive Immunity", 2002.

7. СИ Гривенников., А.В. Туманов, М.С. Друцкая, Д. Такеда, Е. Саутон, Л.Н. Друцкая, Б. Клозен, И. Форстер, Л. Тессаролло, Д .В. Купраш, С.А. Недоспасов, Фактор некроза опухолей, производимый Т-лимфоцитами и макрофагами, необходим для устойчивости к листериозу "Цитокины, воспаление, иммунитет, стр. 110", Санкт-Петербург, 2002.

Издательство 000 "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 27.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 502. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Ш13120

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гривенников, Сергей Игоревич

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

ФНО и ЛТ - многофункциональные цитокины суперсемейства ФНО

Роль ФНО в поддержании структуры вторичных лимфоидных органов

Роль некоторых молекул суперсемейства ФНО и их рецепторов в 23 устойчивости к различным патогенам.

Роль ФНО и лимфотоксинов в иммунном ответе на патогены

ФНО и его рецепторы

Лимфотоксин а

Лимфотоксин (3 и его рецептор

Различные эффекты передачи сигнала посредством ФНО 31 в защите от патогенов

Экспрессия молекул адгезии

Индукция хемокинов

Индукция антибактериальных эффекторов

Роль ФНО при развитии аутоиммунных заболеваний

Роль тканеспецифической продукции ФНО в различных функциях in vivo

Материалы и методы исследований

Методы молекулярного клонирования

Генетической типирование мышей

Инъекции

Выделение РНК

Радиоактивное мечение проб и гибридизация

Проточная цитометрия

Анализ тимус-зависимого иммунного ответа

Бактерии и инфекционные эксперименты

Культуры макрофагов и дендритных клеток

Иммуногистохимия

Результаты и обсуждение

Нормальный фенотип TNF flox/flox мышей 49 Специфическая и эффективная инактивация ФНО в макрофагах/нейтрофилах,

Т и В лимфоцитах 49 ФНО, производимый макрофагами и нейтрофилами, важен для развития септического шока и вместе с ФНО из Т лимфоцитов участвует в ответе на суперантиген 57 ФНО, продуцируемый как макрофагами/нейтрофилами не играет роли в привлечении клеток в региональные лимфоузлы при подкожной инфекции 63 ФНО, продуцируемый как макрофагами/нейтрофилами, так и

Т клетками, необходим для защиты организма от листериоза 66 Роль лимфоцитарного ФНО в развитии иммунного ответа на тимус-зависимый антиген 74 ФНО, производимый макрофагами и Т клетками необходим для развития молниеносного" гепатита, индуцированного Конканавалином А

Роль тканеспецифической продукции ФНО в устойчивости к микобактериям 80 Дефекты иммунного ответа в отсутствии ФНО не могут быть компенсированы Лимфотоксином-а

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гривенников, Сергей Игоревич

1. При помощи генетического метода нокаута получены мыши с "флоксированным" геном ФНО, подготовленные к тканеспецифической делеции гена, и мып1и с делецией гена ФНО специфично в макрофагах/нейтрофилах. Вместе с ранее полученными мышами с делецией ФНО в лимфоцитах, данные мыши представляют собой уникальную панель для изучения роли тканеспецифической продукции ФНО во врожденном и приобретенном иммунитете.2. Показан уникальный вклад макрофагов и нейтрофилов в производство системного ФНО, индуцированного липополисахаридом.3. ФНО из Т клеток и макрофагов играет важную роль в устойчивости к внутриклеточным патогенам и при этом отдельно эти источники не могут компенсировать друг друга.4. ФНО, производимый как макрофагами, так и Т-лимфоцитами, играет важную роль в индукции и развитии "молниеносного" аутоиммуного гепатита, вызванного Конканавалином А.