Роль сигнальной системы сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера

Бугрова, Анна Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль сигнальной системы сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Роль сигнальной системы сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера"

На правах рукописи

I-

11111111111111

Бугрова Анна Евгеньевна 0030560Т2

РОЛЬ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ СФИНГОМИЕЛИНОВОГО ЦИКЛА В РАЗВИТИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации ж. соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007

Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Алесенко Алиса Владимирова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Петренко Юрий Михайлови ч

доктор медицинских наук, профессор Ковалёв Георгий Иванович

Ведущая организация: НИИ физиологически активных

веществ РАН

Защита состоится СЮрб-АьС- 2007 года в 11 часоЕ на заседании

Диссертационного совета Д 002.039.01 при Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Косыгина, д.4.

С диссертацией мсжно ознакомиться в библиотеке Института химической физики им. H.H. Семенова РАН.

Автореферат разослан <^ü»c■ctC^PTCL' 2007 г.

Ученый секретарь ди ссертационного совета кандидат химических наук

М.А.Смотряева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Болезнь Альцгеймера (БА) - нейродегенеративное заболевание, для которого характерно прогрессирующее расстройство памяти и когнитивных функций у людей пожилого возраста. Важной особенностью БА является длительный период бессимптомного развития, что практически исключает возможность исследования механизмов её возникновения и ранней диагностики. Одной и:: главных причин этого является неясный характер этиологии БА, что особенно характерно в отношении спорадической (ненаследственной) его формы, которая встречается в 9 раз чаще, чем семейная, генетически обусловленная форма. В связи с этим исследование патогенетических механизмов БА и поиск: направленных способов коррекции имеет важнейшее научно-практическое и социальное значение.

К настоящему времени установлено, чтб ключевым патогенетическим событием Е А является отложение в мозге [^-амилоидных пептидов (рА) в виде нерастворимых конгломератов, которое сопровождается гибелью нейронов и воспалительными процессами, опосредованными цитокинами, в частности, ФНО-а. Однако до сих пор не установлено точное биохимическое звено, которое способно приводить к усилению токсического влияния ФНО-а и РА при их совместном воздействии на клетки мозга. К таким звеньям мы отнесли сфингомиели-новый цикл (СФМ-пикл), продукты которого являются вторичными мессенже-рами и участвуют в проведении сигнала апоптоза, индуцируемого ФНО-а.

Сф ингомиелиновый цикл - сигнальная система, которая опосредует действие различных экзогенных факторов, включая ФНО-а Коквшск, 1995, ВоЬголУвИ е1 а1., 1994). СФМ-цикл включает деградацию сфингомиелина (СФМ) сфингомнелиназэй (СФМазой) с образованием церамида, который, в свою очередь, при участий церамидазы превращается в сфингозин.

Особый интерес исследователей обращен к СФМ-циклу, поскольку СФМ и продукты его гидролиза - церамид и сфингозин - являются не только существенными компонентами мембран клеток ЦНС, но и играют важную роль в развитии, жизнедеятельности и гибели нервных клеток. Активность метаболизма СФМ в мозге в несколько раз превышает активность в других органах, что может отразиться и на реализации действия как ФНО-а, так и рА. Снижение вязкости мембран, вызванное снижением уровня СФМ, вероятно, способствует отложению РА и образованию бляшек. Таким образом, активация СФМ-цикла при БА можег представлять важный механизм развития нейродегенеративного процесса.

Одним из ¡механизмов токсического действия как РА, так и ФНО-а является генерация активных форм кислорода. Сигнальная система СФМ-цикла взаимодействует с другими сигнальными системами, в том числе и с системой генерации активных форм кислорода. В связи с этим перспективным является направление исследований взаимосвязи окислительных процессов и активации сфингомиелинового цикла, вызванных действием РА и ФНО-а. Это позволяет

лучше понять роль продукции активных форм кислорода (АФК) и церамида как медиаторов клеточкой гибели и их функции в патогенезе БА и других заболеваний, сопровождающихся апоптозом.

Если цитоток;ичность ßA для зрелых нейронов в настоящее время не вызывает сомнений, то роль ФНО-а a остается не вполне ясной. В литературе наиболее распространенным является мнение о цитотоксическом действии ФНО-а, однако известно и о защитном действии ФНО-а на нейроны (при соблюдении оптимальной дозы и времени воздействия) (Viel et al, 2001).

Основной объем исследований роли ßA и ФНО-а в развитии Е!А ка данный момент выполнен на клеточных культурах, поскольку моделирование IIA in vivo встречает значительные трудности. Трансгенные модели с мутациями белка-предшественника ßA или использование специфических блокаторов рецепторов, вызывающих амнезию, не позволяют пока получить оптимальную модель заболевания. В связи с этим прерспективным является создание и использование оперативных моделей, среди которых наиболее распространёнными являются инъекционные модели, основанные на введении в мозг животных амилоидных пептидов и других факторов, важных для развития БА. Также используют моделирование нейродегенерации удалением обонятельных луковиц, что приводит к нарушению поведенческих реакций и накоплением в мозге белка, по своей структуре частично напоминающего ßA человека.

В представленной работе исследование молекулярных механизмов нейродегенерации проводилось на инъекционной модели БА, а именно при центральном введении ßA и ФНО-а. В качестве контрольной использовалась модель с удалением обонятельных луковиц.

Целью настоящей работы являлось исследование роли сфингсмиелино-вой сигнальной, системы и пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в развитии повреждений в мозге животных, возникающих при развитии нейродегенератив-ного процесса альцгеймеровского типа. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность сфингомиелинового цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) и разных отделах мозга животных (кора больших полушарий, мозжечок i; гиппокамп) при действии ßA, ФНО-а и их комбинации через 3 чага и 7 суток после введения препаратов.

2. Определить интенсивность процессов пероксидного окисления липидов в разных отделах мозга (кора больших полушарий, мсзжечок и гиппо-камп) при д ействии ßA, ФНО-а и их комбинации через 3 часа и 7 суток после введения препаратов.

3. Исследовать активность сфингомиелинового цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) и разных отделах мозга животных при развитии нейродегенерации, вызванной удалением обонятельн ых луковиц (бульбэктомией).

4. Определить интенсивность пероксидного окисления липидов в разных отделах мозга животных при развитии нейродегекерации, вызванной удалением обонятельных луковиц (бульбэктомией).

5. Изучить влияние церамида на интенсивность процессов пероксидного окислеш-я липидов и экспрессию ФНО-а в мозге животных.

6. Исследовать Елияние нейропротекторных препаратов мексидола (2-этил-6--метил-3-гидроксипиридина сукцината) и мемантнна (3,5-диметил-1-адамантамина гидрохлорида) на параметры сфингомиелинового цикла, интенсивность ПОЛ и когнитивные функции животных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Р-амилоидный пептид активирует сфингомиелиназу в мозге животных in vivo. Наиболее выраженная активация сфингомиелинового цикла при действии РА наблюдается в гиппокампе.

2. Как РА, так и ФНО-а инициируют накопление в мозге продуктов ПОЛ (диеновых коныогатов и диенкетонов), наиболее интенсивно происходящее в гиппокампе. Увеличение содержание продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в соответствующих отделах мозга.

3. Совместно РА и ФНО-а оказывают меньший эффект на параметры сфингомиелинового цикла и ПОЛ по сравнению с эффектом каждого из них отдельно.

4. Церамид - продукт деградации сфингомиелина сфингомиелиназой - индуцирует пероксидиое окисление липидов и накопление ФНО-а в мозге животных.

5. Мексидол и мемантин действуют на разные компоненты СФМ-цикла. При совместном введении препараты оказывают аддитивный эффект на когнитивные способности животных.

На момент постановки задач фактически отсутствовали данные о роли продуктов СФМ-цикла в реализации токсического действие РА как на клеточных культурах, так и; в мозге животных in vivo. В данной работе впервые исследовано влияние Р-амилоидного пептида на активность сфингомиелинового цикла в мозгг животных irt vivo. Впервые показано, что разные отделы мозга (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) обладают специфичностью по отношению к активации сфингомиелинового цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) при действии рА, наиболее чувствительным является гиппокамп. В этой структуре в поцессе нейродеггнрации, индуцированной рА, активируется СФМаза и накапливается проапоптотический агент церамид. Введение животным рА и ФНО-а индуцирует в мезге процессы ПОЛ, интесивность которых также различается в исследованных отделах мозга. Показано, что продукт сфингомиелинового цикла церамид, который накапливается в мозге при действии [ÍA и ФНО-а, способен самостоятельно индуцировать ПОЛ и накопление ФНЭ-С. Препараты мексидол и мемантин, которые используются для лечения нейродегенеративных заболеваний (БА, болезни Паркинсона, ише-мического инсульта и др.), препятствуют накоплению проапоптотического аген-

та церамида, приводящего к гибели нейронов, что позволяет предполагать возможный механизм ix действия, заключающийся в инактиваций сфингомиелино-вого цикла и предотвращении накопления церамида.

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН в соответствии с планами научно-исследовательских работ Института е рамках программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Научно-практическая значимость. Результаты проведенных исследований имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания роли сфингомиелиновош цикла в механизме передачи сигнала ßA в клетках мозга при развитии нейродегенеративного процесса. Данные об участии СФМ-цикла в развитии нейродегенративных заболеваний ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких заболеваний, как БА, болезнь Паркинсона и др.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении: экспериментов, обобщение, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работал, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследовании - от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссгртации представлены в 12 печатных работах, из них 4 - статьи в отечественных и зарубежных журналах и 8 тезисов докладов. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: III Съезде биохимического общества, С.-Петербург, 2002; VIII Interl. Congr. on Phospholipids, Vienna, Austria, 2002; III Российкой конф. "Болезнь Альцгеймера и старение", посвященной 100-летию со дня рождения проф. Э.Я. Штернберга. Москва, Черноголовка. 2003; 44th Int. Conf. on the Bioscience of Lipids (ICBL). Oxford, England. 2003; Physiol. Soc. Spring Workshop «Receptors and Cell Signaling in Oxidative Stress». Budapest, Hungary. 2003; 3rd Euro Fed Lipid Congr. Edinbirgh, Scotland, 2004. Conf. «Drug discovery in neurodegenerative diseases». Cold Spring Harbor Laboratory, USA. 2004; 8th ECNP Reg. Meeting. Moscow, Russia. 2005.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 145 стр., включая 18 рисунков, 10 таблиц и список литературы. Диссертация состоит из введения, описания объектов, материалов и методов исследования, глав «Обзор литературы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов исследования», выводов, списка аббревиатур и библиографического указателя (264 источника, из них 255 опубликованы в зарубежных изданииях).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Объекты, материалы и методы исследования

Основным предметом исследования являлись фермент офингомиелиназа и липиды, выделенные из мозга животных.

Биофизические и биохимические методы. Сфингомиелиназную активность определяли в гомогенатах мозга по методике (Hostetier, Yazaki, 1979) с использованием 12 мкМ [М-метил-14С] сфингомиелина. Радиоактивность определяли на счетчике «Delta» (Нидерланды).

Количественное, определение белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Липиды из гомогенатов мозга животных экстрагировали по методу (Bligh, Dyer, 195!)), их количество определяли гравиметрически.

Интенсивность ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов и диенкетонов. Спектры растворов липидов регистрировали в смеси метанол-гексан на спектрофотометре фирмы «Beckman» (США) (Стальная, Гаришвили, 1979).

Липидный состав изучали методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках фирмы «Merck» (Германия), с последующим ден-ситометрироЕ1анием. Разделение фосфолипидов проводили в системе растворителей хлороформ-метанол-муравьиная кислота (65:25:4, v/v/v), для разделения церамидов испотьзовали две системы растворителей: этиловый эфир и хлороформ-метанол-вода (40:10:1, v/v/v).

Идентификацию ФНО-а в печени проводили с помощью ECL-иммуноблоттинга, используя поликлональные антитела производства фирмы «Santa Cruz» (США). Белки гомогената печени разделяли электрофорезом в 13% ПААГ по методу (Laemmli, 1970). В качестве контроля использовали рекомби-нантный ФНО-а мыши, полученный в Институте биоорганической химии РАН.

Работа с животными. В работе использовали мышей линий NMR1, С57 black и крыс линии Wistar, содержавшихся в виварии при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище.

Крыс линии Wistar наркотизировали хлоралгидратом (325 мг/кг) и интра-церебрально в:юдили ßA(25-35) (3 нмоль/полушарие), ФНО-а (1,5 мкл/полушарие) и их комбинацию. Контролем служили ложнооперированные животные, получавшие инъекцию изотонического раствора NaCl.

Эксперименты по бульбэктомии были проведены на мышах линии NMR1. Мышей наркотизировали гексеналом (40 мг/кг) и проводили удаление обонятельных луковиц путём аспирации через трепанациопное отверстие. Ложнооперированные животные подвергались аналогичной манипуляции, но без удаления обонятельной структуры.

С2-\\ерамид мышам линии С57 black вводили внутрибрюшинно в 5% растворе этанола в дозах 50 мкг/мышь (2,5 мг/кг веса) и 100 мкг/мышь (5 мг/кг веса), в качестве контроля использовали 5% раствор этанола.

МексчЬол ¡^-этил-б-метил-З-гидроксипиридина сукцинат), использовали в виде лекарственной формы (5% раствор в ампулах). Препарат вводили крысам линии Wistar внутрибрюшинно в дозе 100 мг/ кг веса жиеютных. Мемаитип (3,5-димегил-1-адамантамин гидрохлорид) растворяли в изотоническом растворе

NaCl и вводили животным внутрибрюшннно в дозе 2,5 мг/кг веса животных. Контрольным животным вводили изотонический раствор NaCl.

Влияние мексидола (100 мг/кг), мгмантина (1 мг/кг) и их совместного применения на амнезию условной реакции пассивного избегания, вызванную М-холиноблокатором скополамином («Sigma», США), исследовали в опытах на крысах-самцах линии Wistar. Скополамин вводили внутрибрюшинно в дозе 1,5 мг/кг. Для оценки когнитивных функций использовали условный рефлекс пассивного избегания в темной и светлой камерах (установка Lafayette Instrument Co., США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и Origin Pro 6.1 методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стыодента. Достоверными считали различия при Р<0,05. На рисунках и в таблицах приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса экспериментальных данных указаны среднеквадратичные отклонения.

2. Определение параметров сфингомиелинового цикла и ПОЛ в гиппокам-пе, коре и мозжечке мозга крыс при при введении [¡-амилоидного пептида,

ФНО-а и их комбинации

Интрацеребральное введение разные фрагментов синтетического рА человека как модель БА довольно активно используется. Например, показано, что через неделю после инъекции рА в гиппокамп отмечалось снижение способности к обучению (Sweeney et al., 1997), при введении нейротоксичного участка Р-амилоидных пептидов - РА(25-35) у экспериментальных животных развивается нейродегенерация, сопровождающаяся окислительным стрессом в мозге. Перспективным может быть подход, позволяющий учесть при моделировании несколько факторов патогенеза БА, что позволило бы сделать модель более адекватной заболеванию. Модель БА, основанная на введении в мозг животных ФНО-а и рА была разработана совместно с Институтом высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. Нами были изучены количественные изменения компонентов СФМ-цикла при действии ФНО-а и рА на ранних сроках развития нейродегенеративного процесса: через 3 часа и 7 суток после введения ФНО-а и РА.

Мозг животных является морфологически, биохимически и функционально неоднородным органом, поэтому в данном разделе работы было исследовано действие ФНО-а и РА на сфингомиелиновый цикл в разных отделах мозга: коре больших полушарий, мозжечке и гиппокаипе крыс.

2.1. Исследование активности сфингомиелиназы при введении fi-амилоидпого пептида, ФНО-а и их комбинации в мозг крыс

Активность СФМазы различалась в изучаемых отделах мозга ложноопери-рованных животных. Независимо от срока после ложной операции (через 3 часа

или 7 дней), наибольшая активность фермента фиксировалась в гиппокампе, что соответствует литературным данным (?ожнова и др., 1999).

Через три часа после введения рА активность СФМазы о гиппокампе снижалась от 86 до 68 нми/мин/мг белка, в то время как в мозжечке и коре активность фермента не изменялась. Отмечалась тенденция к повышению активности фермента в коре больших полушарий после введения цитокииа. При совместном введении (ЗА и ФПО-а активность СФМазы снижалась практически в два раза в гиппокампе ( от и незначительно в мозжечке (от 21 до 14 имп/мин/мг белка), в коре активность фермента оставалась на контрольном уровне. Таким образом, па ранние сроки после операции, когда животные находились еще под действием наркоза и па фоне сложнейших манипуляций, связанных со способом введения веществ в мозг, активность СФМазы в гиппокампе достоверно снижалась как при действии одною РА, так и при совместном введении цитокина и (}А.

Через 7 дней после раздельного или совместного введения ФИО-« и рА в мозжечке и коре достоверных изменений активности фермента не выявлено. В гиппокампе после введения рА был отмечался достоверный рост активности СФМазы. При совместном введении препаратов в этой структуре намечалась тенденция к снижению активности СОМ азы до уровня нормы (рис. 1А). Таким образом, через 7 дней после введение (ЗА, когда появлялись морфологические признаки нейродегенерации, фермент 1>ыл активирован только в гиппокампе.

гЬ

И ¡1 и

гЬ

О Ложная операция *ФНО О амилоид цФНО'ймипоид

гЬ

ИЛПОК8МП

мозжечок

111 2

I 0,8 я

3 0.4

О Ложная операций ■<ьно □ амипоод ■ ФНО+амилоид

I 00т

М«1№ЧСН НОрА

Рис, I. Активность сфингомиелиназы (А) и содержание церамидов (Б) в мозге крыс через 7 суток после введения ФНО-а, рА и их комбинации. (*- I1 < 0,05)

2.2. Исследование содержания сфингомиелина и церамидов при введении //-

амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации в мозг крыс

Измерение содержания СФМ в липидах гиппокампа, коры больших полушарий и мозжечка также проводили через 3 часа и 7 дней после операции. Содержание СФМ было стабильным в коре и мозжечке как через 3 часа, так и через 7 суток после всех способов введения препаратов, что, в основном, соответствует небольшим изменениям активности СФМазы в этих структурах.

В гиппокампе снижение уровня СФМ отмечалось через 2 часа после введения ФНО-а, что могло служить отражением очень раннего повышения активности СФМазы в структурах мозга (в течение первого часа действия), которое ранее наблюдалось при внутрибрюшинной инъекции цитокина (Рожнова и др., 1999). В наших экспериментах мы не могли исследовать такие сроки, поскольку крысы находились в состоянии глубокого наркоза.

Через 7 суток после введения препаратов как раздельно, так и комплексно содержание СФМ в липидах гиппокампа несколько превышало контрольный уровень, однако достоверных изменений зафиксировано не было.

Содержание церамида определяли только через 7 суток после введения препараторв. На этот срок в коре и мозжечке количество церамида оставалось близким к контольному при совместном и раздельном введении ФНО-а и рА. Достоверное снижение церамида зафиксировано при введении ФНО-а в гиппокампе, однако СФМаза в этом случае проявляла тенденцию к говышеиию. При введении рА через 7 дней мы наблюдали повышение содержания церамидов в гиппокампе, что соответствует активации СФМазы. Однако при совместном введении препаратов содержание церамидов в гиппокампе оставалось на контрольном уровне (рис. 1Б).

Причиной того, что не просходит накопления церамида при активации СФМазы, вызванной введением ФНО-а, может служить то, что церамид способен быстро превращаться (через активацию церамидазы) в другой метаболит сфингомиелинового цикла - сфингозин, который также является сигнальной молекулой при действии ФНО-а.

Таким образом, в гиппокампе зафиксировано накопление проапоптотиче-ского агента церамида при введении РА, что соответствует активации СФМазы в этой структуре. И нтересным является то, что при совместном введении препаратов содержание церамидов в гиппокампе остается на контрольном уровне.

2.3. Определение параметров пероксидпого окисления липидов при введении

Р-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации

Развитие окислительного стресса при БА является одной из ее характерных черт. Принимая во внимание тот аспект, что активность СФМазы находится под контролем окислительно-восстановительного состояния клетки, представляло интерес исследование взаимосвязи пероксидпого процесса и активации сфингомиелинового цикла при введении в мозг животных рА, ФНО-а и их комбинации.

Установлено, что через 3 часа действия ФНО-а происходит увеличение содержания диеновых конъюгатов и диенкетонов во всех изученных структурах мозга - гиппокампе, коре и мозжечке. Еведение рА в гиппокамп увеличивает содержание пероксидных продуктов липидов в этой структуре практически в два раза, а при совместном введении рА и ФНО-а уровень диенкетонов и диеновых конъюгатов увеличивается в 4 раза (рис. 2А, Б).

Через 7 суток после введения препаратов в коре и мозжечке содержание окисленных липидов находится на контрольном уровне. В гиппокампе сохраняется высокий уровень продуктов пероксидного окисления (рис. 2 В, Г). При введении одного РА или ФНО-а пероксидный процесс в липидах гиппокампа более интенсивный, чем при их совместном введении, когда уровень диеновых конъюгатов и, особенно, диенкетонов заметно снижается.

Таким образом, сопоставляя эти данные с результатами, полученными при исследовании сфингомиелинового ник/а, можно сказать, что наблюдаемое образование продуктов ПОЛ при действии ФНО-а и РА происходит в тех же отделах мозга, где наблюдается активация СФМазы. Липиды гиппокампа оказываются более подвержены пероксидации, и этот процесс развивается в течение продолжительного времени.

3. Определение параметров сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в структурах мозга мышей после бульбэктомии

Вторая использованная нами модель представляла собой модель нейро-денгеиерации, вызванной удалением обонятельных луковиц, для которой характерны нарушения некоторых составляющих симптомокомплекса БА. Работа проводилась совместно с Институтом биофизики клентки РАН. В основу этой модели положена гипотеза о роли нарушений в обонятельной системе в генезе БА. Изначально бульбэктомия рассматривалась как одна из моделей депресии (Redmond et al., 1997). Однако было показано, что помимо депрессивного состояния, ведущим признаком у бульбэктомированных (БЭ) животных является снижение способности к обучению и воспроизведению навыка в различных поведенческих тестах (Otmakhova et al.,1992), включая нарушение пространственной памяти, тестируемой в водном лабиринте Морриса (Бобкова и др., 2001). Морфофункциональное исследование мозга БЭ мышей выявило у них также нарастание числа дегенерирующих нейронов с такими видами патологий, как цитолиз, кариолизис, пикнолиз и др., а также снижение плотности ацетилхолин-синтезиующих нейронов в базапьных структурах переднего мозга (Бобкова и др., 2003). Перечисленные последствия БЭ по характеру проявления и по локализации нейродегенерации напоминает БА у человека (Robichaud et al., 2001, Степаничев и др., 2002). Эта модель была использована в качестве контроля к первой, в связи с различиями в структуре рА.

Подобно первой серии экспериментов, в данном разделе работы были исследованы параметры сфингомиелиноного цикла и ПОЛ в гиппокампе, коре и

сумме остальных структур (мозжечок и ствол мозга) мышей через I, 2 и 6 недель после удаления обонятельных луковиц.

□ Лажная операция л 'и:': сгаыилоиа иФНО+амипоад

оо I—и—11— Гиппокаип

шш □

Кора

| 0,05

^ гЬ

>1 =1 гЬ

1 о "

4 2

•Я"

2 п

5 ш 0,1 I

3 0.1

0,0

У 0.08

Г ш токам п

Кора

гЬ

□□В

Гипгю*амл Мозжечок Кора

РнС. 2. Содержание диеновых конъюгатов и диенкетонов в мозге крыс через 3 часа (Л, Б) и через 7 суток (И, Г) после введения ФНО-а, ¡ЗА и их комбинации (*- Р < 0,05).

Были установлено, что в разных отделах мозга интактных мышей активность СФМазы была различна. У интактиы). животных наибольшая активность фермента фиксировалась в гиппокампе (СИ,6 имп/мин/мг белка, меньше в коре (51,5 имп/мин/мг белка) и сумме остальных структур (45,0 имп/мин/мг белка), однако, у мышей эти различия менее вырыжеиы по сравнению с крысами. После ложной операции, независимо от срока (через 1, 2 и 6 недель), различия в активности в разных отделах мозга сохранялись. Следует отметить различия в активности СФМазы у йожнооперированных. и интактных животных. Так, через неделю было отмечено понижение активности фермента, вызванное ложной операцией, как в гиппокампе (от 64,6 до 48,1 имп/мин/мг белка), так и в коре (ог 51,5 до 36,4 имп/мин/мг белка), и в сумме остальных структур (от 45,0 до 37,4 имп/мин/мг белка).

ГИППОНМП кора "остатии"

□ моетрежъ

□ сгыг

Рис. 3. Активность ефш I том исл и лазы в мозге мышей через I (А), 2 (Б) и 6 (В) педель после бульбэктомин.

гнпгсокамл

Через неделю после БЭ наблюдалась тенденция к снижению активности фермента в гиппокампе, коре, и сумме остальных структур. Через 2 и 6 недель после операции достоверных изменений в активности СФМазы в гиппокампе и (соре у бульбэктомированных мышей по сравнению с ложноолерированными животными зафиксировано не было, повышение активности фермента наблюдалось через 6 недель лишь в сумме остапьных структур (в мозжечке и стволе мозга, иа рисунках - «остатки») (рис. 3). Содержание СФМ в исследуемых структу-

pax оставалось стабильным после ЬЭ, независимо от срока (через I, 2 или б недель), что соответствует незначительным изменениям активности СФМазы.

Достоверных изменений интенсивности процессов ПОЛ у бульбэктомпроданных мышей также не наблюдалось (рис. 4). Отмечены тенденции к повышению содержания диеновых конъюгатов в коре через I неделю и 6 недель, диен-кетонов - через I и 2 недели, через 6 не;,ель в коре, а в сумме остальных структур - тенденции к понижению содержания продуктов ПОЛ. В гиппокампе содержание продуктов ПОЛ было стабильным, и лишь через 6 недель увеличивалось содержание диеновых конъюгатов, но и здесь достоверных изменений не зафиксировано.

Рис. 4. Содержание диеновых конъюгатов в мозге мышей через 1 (А), 2 (Б) и 6 (В) недель после бульбэктомии.

2.S

Ё о ¡11* о В ■ i

'Л 1

о о

rtl

□ коктрогь О ОПЫТ

гЬ

гипионамп кора "остатки"

4. Влияние церамнда мм интенсивность процессов ПОЛ и экспрессию ФНО-а в мозге мышей

В последнее время появляется всё больше данных об участии церамнда в агсаптотической гибели клеток при нейроде генеративных заболеваниях и старении (Нап е1 а1„ 2002). Показано, что уровень церамнда в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) пациентов с БА значительно выше, чем у пациентов без деменции

или с другими неврологическими заболеваниями. Известно о повышении уровня церамида и в мозге при БА (Сочнее е1 а1.Д996, Нал й а1., 2002).

В экспериментах на клеточных культурах показано, что церамид активирует процессы ПОЛ и экспрессию ФНО-а, что даёт основания предполагать механизм действия церамида в мозге, в том числе и при нейродегеперативных заболеваниях. ФНО-а, как известно, способен активировать СФМазу, связываясь со своим рецептором на поверхности мембран, а также индуцировать образование в клетках--активных форм кислорода, под действием которых снижается внутриклеточное содержание амтиоксидантов, активируются окислительные процессы, в том числе и ПОЛ, что совместно оказывает дополнительное воздействие на СФМазу, повышая активность фермента. В наших экспериментах использовался синтетический аналог церамида, имеющий укороченную жирнокис-лотную цепь (С2-церамид), который способен проникать в клетки.

4.1. Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ в мозге

мышей

Внутрибрюшинное введениие С2-церамида в дозе 2,5 мг/кг веса (50 мкг/мышь) вызывало повышение содержания продуктов ПОЛ в мозге животных через 8 "-асов после введения препарата, показатели интактного контроля были превышены в 1,4 и 1,2 раза для диеновых коныогатов и диенкетонов соответственно (рис. 5).

--■-■г.бмг'кг —•—5 мгДг

время после введения,ч

Рис. 5. Содержание продуктов ПОЛ при введении церамида. А - диеновые конъюгаты, Б - диенкетоны (*- Р < 0,05)

Через 18 л 24 часа все показатели интенсивности ПОЛ приближались к контрольным значениям. Церамид в дозе 5 мг/кг веса (100 мкг/мышь) оказывал более заметный эффект на процессы ПОЛ.

Через 8 часов после введения препарата содержание диеновых коныогатов достигало значении, превышающих контрольные в 1,6, а диенкетонов - в 1,4 раза. Через 18 и 24 часа содержание продуктов ПОЛ было в пределах нормы (рис. 5). Таким образом, в нашей работе продемонстрировано, что церамид спо-

собен самостоятельно индуцировать пероксидное окисление липндоп в мозге животных при внутрибрюшинпом введении Сг-церамида.

4.2. Влияние церамида на экспрессию ФНО-а в мозге мышей

Провоспалигельный цитокин ФНО-а , как известно, играет особую роль в развитии БА. Показано, что рА индуцирует синтез цитокинон, в том числе и ФИО-а в различных клеточных культурах (Meda et al., 1995, Shalit et ai., 1997, Sutton et al., 1999; Akama, Van Eldik, 2000). С другой стороны, уровень рА в мозге может контролироваться ФНО-а, вследствие того, что он, ка< было показано, регулирует синтез и процессинг белка-предшественника (ЗА (GoldgaDer et al., 1989, Monning et al., 1994, Blasko et al., 1999, 2000, Gianni et al., 2003 Liao et al., 2004 и др.). Таким образом, ФНО-а может выступать в качестве первопричины нейродегенерагивного процесса.

В условиях, е которых изучалась активация ПОЛ в мозге мышей при введении С2-церамида определена экспрессия ФНО-а методом иммуноблоттинга

Церамид стимулировал экспрессию ФНО-а (рис. 6). При введении церамида в дозе 2,5 мг/кг веса максимальная экспрессия ФНО-а наблюдалась через 18 часов, исходный уровень был превышен более чем в 2 раза. Церамид в дозе 5 мг/кг веса, вызывал достоверное повышение уровня экспрессии уже через 8 часов, контрольные показатели были превышеныв 3,5 раза.

Через 18 часов уровень экспрессии оставался ловышен-ным (в 3 раза по сравнению с контролем), и чгрез 24 часа возвращался к контрольным показателям.

Таким образом, показано, что Сг-церамид способен индуцировать ПОЛ и экспрессию ФНО-а в мозге животных. Известно, что эти два процесса взаимосвязаны, и каждый из них приводит к повышению содержания церамида. Генерация церамида, индуциро-Рис. 6. Содержание ФНО-а при введении це- ванная ФНО-а, приводит к на-рамида в дозах 2,5 и 5 мг/кг веса (*- Р < 0,05) коплению эндогенного ФНО-а, который, в свою очередь, генерирует новые порции церамида. Эндогенный церамид индуцирует ПОЛ и экспрессию ФНО-а. что, в свою очередь, приводит к появлению новых порций эндогенного церамида за счет активации сфингомие-линового цикла. Эти данные позволяют объяснить бифазный характер накопления церамида в клетках, обработанных ФНО-а (Рожнова и др, 1999).

О 5 10 15 20 25

Время после введения, ч

Из наших экспериментов можно сделать заключение, что индукция сфин-гомиелинэвого никла, результатом которой является накопление церамида, может вызывать цепную реакцию усиления токсического сигнала (ЗА.

5. Влияние нейропротекторных препаратов (мексидола п мемаитииа) па параметры сфшюгомнелииового цикла и ПОЛ

В настоящее время активно изучаются препараты нового поколения для лечения БА. Поскольку мы и другие авторы показали активацию СФМазы и накопление церамида при действии (ЗА, то вполне возможно, что новые препараты и препараты, которые успешно зарекомендовали себя в качестве пейропрогекто-ров, могли бы эыть эффективны в отношении изучаемых нами параметров сфингомиелинового цикла и ПОЛ. Нами были выбраны мексидол и мемантин.

Мексидол - водорастворимый антиоксидант, представляющий собой производное 3-оксипиридина, обладает мембраностабилизирующим действием. В настоящее время этот препарат широко используется в неврологии для лечения нарушений мозгового кровообращения и в геронтологии для улучшения памяти пациентов, страдающих ее ослаблением или нарушениями. Мемантин - модулятор глутаматэргической системы. В эксперименте было показано, что мемантии защищает нейроны от нейротоксических воздействий, а также демонстрирует позитивный эффект на моделях обучения и памяти животных (\V.Danysz е1 а1., 2000).

Поскольку СФМ и другие липиды, в метаболизме которых участвуют цера-мид и сфингомиелин, активно влияют на лиганд-рецепторные взаимодействия, мы предположили, что мексидол, обладающий антиоксидантпым и мембрано-протекторным действием, и мемантин, контролирующий глутаматэргическую систему, могут оказывать влияние на метаболизм СФМ.

5.1. Влияние мексидола на параметры сфиногомиелипового цикла и ПОЛ

Мексидол вводился крысам внутрибрюшинно один раз в день в течение трех и пяти дней в виде одноразовой дозы 100 мг/кг веса живэтных.

В коре мексидэл не оказывал эффекта на СФМазу, достоверных изменений активности фермента не наблюдалось ни через три, ни через пять дней, содержание церамида также продолжало оставаться на контрольном уровне (табл. 1).

В гиппокампе содержание церамида оставалось такхе в пределах контрольных значений, однако СФМаза проявляла тенденцию к снижению: от 93,74 до 84,68 имп/мин/мг белка после трех дней введения препарата, и от 93,74 до 79,75 имп/ мин/мг белка после пяти дней введения препарата (табл. 1). Содержание продуктов ПОЛ. оставалось в пределах контрольных значений, в отдельных случаях проявляя тенденцию к снижению.

Табл. 1. Содержание продуктов ПОЛ, церамиди и активность сфингомиелииа-

кора больших полушарий

контроль 3 дня £> дней

Диеновые коиъюгаты, нмоль/мг ЛИПИД0 5 6,74 ± 0,46 6,96 ± 0,43 6,17 ±0,32

Днснкетоны, нмоль/мг липидоз 1,54 ±0,03 1,53 ±0,1 1,29 ±0,02

СфМага, имп/мин/мг белка 52,01 ±4,67 55,97 ±7,41 52,80 ± 2,30

Церамид, Мкг/мг липидов 1,52 ±0,16 1.49 ±0.18 1.38 ±0.14

гиппокамп

контроль 3 дня Г> дней

Диеновые конъюгаты, нмоль/мг липидов 5,26 ± 0,5 5,12 ±0,29 4,73 ± 0,21

Диепкетоны, нмоль/мг липидов 1,19 ± 0,26 1,03 + 0,14 1,С<0 + 0,12

Сфмаза> имп/мин/мг белк.1 93,74 ± 10,49 84,68 ±11,92 79,75 ±9,11

Церамид, Мкг/мг липидов 1,61+0,17 1.56 ±0.18 1.48 ±0.19

5.2. Влияние мемашпипа на параметры сфиногомиелинового никла и

ПОЛ

Мемантин вводился крысам внутрибрюшинио один раз в день в течение 3 и 5 дней в одноразово й дозе 2,5 мг/кг веса животных.

В коре мемантин не влиял на СФМазу, достоверных изменений активности фермента не наблюдалось ни через три, ни через пять дней, однако лёгкую тендецию к снижению активности (от 52,01 до 43,91 имп/мин/мг белка) можно было заметить после третьей инъекции. Содержание мерами/,а оставалось на контрольном уровне (табл. 2).

В гиппокампе изменения более выражены. Содержание цераммда было снижено от 1,61 до 1,21 мкг/мг липидов (на 25 %) через три.дня введения препаратов, и через пять дней также продолжает оставаться пониженным (1,30 мкг/мг липидов). А вот активность СФМазы стабильна и после трех, и после пяти дней введения мемантин;! (табл. 2).

Содержание продуктов ПОЛ при введении мемантина остаётся в пределах контрольных значений.

Табл. 2. Содержание продуктов ПОЛ, I дерам ид а и активность сфингомнёлина-

ГШШОКШП

КОМ)роль 3 дни 5 дней

Диеновые колъюгаты, пмоль/мг липидов 5,26 ± 0,5 4,56 ±0,29 4,88 ±0,18

Дненкетоны, нмоль/мг липидов 1,19 ±0,26 1,07 ±0,07 1,17 ± 0,13

имп/мин/мг бел ка 93,74+ 10,4? 95,06 ± 15,84 88,39 ± 12,65

Мерами,и, Мкг/мг липидов 1,61 ±0,17 1,21 ±0,09 1,30 ±0,15

кода больших полушарий

контроль 3 дни 5 диен

Диепопыс конъюгаты, нмоль/мг липидов 6,74 ± 0,46 6,63 ± 0,43 6,84 ± 0,69

Дненкетоны, НмОйь/мг липидов 1,54 ±0,03 1,47 ± 0,09 1,46 ±0,15

Сфма)я, имп/мин/мг белка 52,01 ± 4,67 43,91 ± 2,95 52,96 ± 4,86

Церамид, Мкг/мг липидов 1,52 ±0,16 1,51 ±0,16 1,48 ±0,13

Исследование влияния мек с идола, мемантина и их совместного применения на амнезию условной реакции пассивного избегания

В опытах на крысах-самцах линии \УЬ1аг исследовалось влияние мексидола, мемантина и их совместного примене! ия на амнезию условной реакции пассивного избегания (УРПИ), вызванную М ■ ход и н об локатором скополамином. Работа проводилась совместно с Институтом фармакологии им. П.В. Закусова РАМН.

Крысы, получавшие скополамин в дозе 1,5 мг/кг (внутрибрюшинно) до обучения, через сутки воспроизводили рефлекс только п 10% случаев, в то время как в группе контрольных животных на фоне внутрнбрюшинного введения физиологического раствора этот показатель состав-пял 90%. Мемантин в дозе I мг/кг предупреждал развитие амнезии УРПИ у 20% животных, а мексидол в дозе 100 мг/кг -у 30% крыс. При совместном применении препаратов а нтиам нести чески й эффект отмечался у 50% животных, что свидетельствует о суммировании антиамнеСТЙ-ческих эффектов веществ.

I а

ш о

I» а 5

—-—----

г- И' —

12 3 4 5 Рис. ¡4, Воспроизведение рефлекса пассивного избегания при введении мексидола и мемантина. 1-контроль, 2- скополамин, 3-сконоламин + мексидол, 4-скополамин + мемантин, 5-скополамин + мексидол -I- мемантин

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени накоплено немало доказательств участия сфинго-липидов в патогенезе БА. Так, показано снижение содержания СФМ в мембранах на фоне повышенного уровня РА у трансгенных животных (Sawarnura et al., 2002) и в мозге больных БА (Soderberg et al., 1992). В то же время, уровень це-рамида в СМЖ и в ткани мозга у пациентов с БА значительно вышг, чем у пациентов без деменции или с другими нейрологическими заболеваниями, например, боковым амиотрофным склерозом (Gottfries et al.,1996, Han et al., 2002, Satoi et al., 2005).

Роль сфинголипидов и непосредственно СФМ в настоящее время активно обсуждается в связи с амилоидогенезом. Известно, что СФМ присутствует, главным образом, в определённых участках мембран, устойчивых к действию детергентов, так называемых рафтах. Кроме СФМ, рафты содержат и другие сфинголипиды, гапглиозиды и холестерин. Гидролиз СФМ снижает кластеризацию холестерина е рафтах, в результате вязкость мембраны снижается, что, вероятно, способствует отложению РА и образованию сенильных бляшек. Кроме того, амилоид, как известно, индуцирует окислительный стресс, который вызывает изменения в составе и структуре мембранных липидов (Culter et al., 2004). Изменения мембран не могут не сказаться на работе мембранэ-связанных ферментов, в том числе и ферментов процессинга белка-предшественника РА. Показано, например, что в таких условиях облегчается доступ у-секретгвы к субстрату - предшественнику рА, и, следовательно, повышается и секреция РА (Puglielli, 2003).

В нашей работе мы попытались оценить параметры сфингоммелиновой сигнальной системы при инъекции рА, провоспалительного цитокина ФНО-а, a также при совместном введении препаратов. Через 7 суток пссле введения рА, когда появляются морфологические признаки нейродегенерации, отмечена активация СФМазы в гиппокампе, которая сопровождается накоплением церамида. В то же время, в коре и мозжечке никаких значительных изменений 13 активности фермента и уровне церамидов не зафиксировано.

Так же, как и в наших исследованиях, другими авторами установлено, что гиппокамп обладает более активными и более лабильными ферментативными системами (например, NO-синтаза) по отношению к внешним и токсическим факторам. Также известно, что гиппокамп является наиболее уязвимым отделом мозга по отношению к ФНО-а и другим цитокинам.

Таким образам, в нашей работе впервые показано, что не только ФНО-а, но и РА вызывает изменения в метаболизме СФМ в мозге животных in vivo. Активируя нейтральную СФМазу, РА приводит к накоплению церамида в гиппокампе крыс. НедаЕНО на культурах олигодендроцитов (Lee et si., 2004) и нейронов (Jana and Paha т., 2004) также было проде монстрировано, что рА а ктивирует нейтральную СФК' азу и повышает содержание церамида.

Точный механизм, лежащий в основе индуцированной РА активации нейтральной СФМазы, не установлен, но уже сейчас можно считать доказанным

участие изменений в окислительно-восстановительном состоянии клетки и/или метаболизме глутатиона в этом процессе. Активность нейтральной СФМазы непосредственно регулируется клеточным уровнем глутатиона (Liu et al., 1998). PA снижает содержание глутатиона в культуре кортикальных нейронов (Medina et al., 2002) и снижение глутатиона при окислительном стрессе, индуцированном амилоидом, рассматривается как основной механизм, лежащий в основе токсичности (ЗА {Medina et al., 2002).

Известно, что нейтральная СФМаза активируется Н2С>2 и ингибируется глутатионом (Liu et al., 1998). Ингибирование вызванного цитокинами гидролиза СФМ с образованием церамида антиоксидантами, такими как N-ацетилцистеип, и индукция накопления церамида оксидантами и прооксидантами, такими как ЬЬСЬ, аминотриазол и диамид, определяют функцию АФК и глутатиона в регуляции первого шага в передаче сигнала по сфингомиелиновому пути. Более того, пониженный уровень глутатиона и повышение уровня церамида коррелируют с фрагментацией ДНК в первичных олигодендроцитах крысы (Singh et al., 1998). Очевидно, в живых клетках существует взаимосвязь между окислительной системой и сфингомиелиновым циклом, что может играть важную роль в развитии апоптоза при нейродегенеративных заболеваниях, включал БА. Именно эту взаимосвязь мы и пытались установить в пашей работе.

Развитие окислительного стресса при действии РА и ФНО-а мы контролировали по интенсивности ПОЛ. Е$ нашей работе показано, что липиды гиппо-кампа также оказываются подвержены более активному пероксидному процессу по сравнению с другими отделами мозга, что было отмечено при изучении СФМ-цикла.

Через семь дней после введения одного ФНО-а или рА пероксидный процесс в липидах ^иппокампа оказывался более интенсивным, чем через 3 часа. Однако при совместном введении препаратов уровень диеновых коныогатов и, особенно, диенкетонов гораздо ниже и превышает контрольные значения только в два раза. Интересным является тот факт, что при совместном введении препаратов через 7 суток намечалась тенденция к снижению активности СФМазы в гиппокампе до уровня нормы.

Таким образом, можно говорить о том, что нетоксичные дозы ФНО-а обладают протекторным действием, защищая нейроны от токсичности р-амилоида. Аналогичные данные получены на культурах клеток, где ФИО-а защищал нейроны и глиальные клетки от токсичности р-амилоидного пептида (Barger et al., 1995, 1997; Kaltschmidt et al., 1999; Viel et al., 2001). Этот факт может позволить по-новому оценить значение накопления цитокинов в определенных фазах развития болезни Альцгеймера. Возможно, в начальной стадии, когда уровень цитокинов мал, они оказывают протекторное действие, затем, когда их содержание резко увеличивается, они проявляют провоспалительные свойства и усиливают действие РА.

На второй использованной нами модели нейродегеьерации, вызванной бульбэктомией, изменений в метаболизме СФМ мы не обнаружили, несмотря на

то, что БЭ вызывает повышение уровня |ЗА в коре и гиппокампе - структурах, поражаемых при БА человека. Так, показано, что через 6 недель после удаления обонятельных луковиц животные демонстрируют потерю пространственной памяти на фоне достоверного повышения уровня (ЗА в экстрактах новой коры и гиппокампа по сравнению с ложнооперированными животными (Александрова и др., 2004). Изменений в метаболизме СФМ нам не удалось зафиксировать ни через 6 недель, ни на более ранних сроках после операции. Безусловно, бульбэк-томия представляет собой более «мягкую» модель развития нейродегенератив-ного процесса по сравнению с введением определяющих развитие заболевания факторов непосредственно в мозг. Наличие (ЗА в мозге мышей не представляется удивительным, поскольку он является продуктом протеолитического расщепления белка-предшественника РА, ген которого относится к консервативной части генома и обнаружен у большинства видев животных, в том числе и у мышей. Однако следует обратить внимание на ргзличия в первичной структуре амилоидного пептида мыши и человека. Они отличаются тремя аминокислотными остатками. Если токсическое действие амилоида обусловлено в какой-то мере его взаимодействием с мембранными рецепторами, эти различия могут объяснить отсутствие эффекта в отношении СФМа:ы. Кроме того, такие различия в первичной структуре влияют на способности к агрегации и образованию бляшек, как это происходит при БА.

Таким образом, нейродегенерация, вызванная бульбэктомией, не вызывает изменений в метаболизме СФМ и, по-видимому, развивается с участием других сигнальных событий.

Полученные нами данные о способности церамида самостоятельно индуцировать процесс ПОЛ также свидетельствуют о наличии двусторонней регуляции сигнальных систем сфингомиелиновсго цикла и АФК: с одной стороны, известно, что активность СФМазы зависит от интенсивности окислительных процессов в клетке, с другой стороны, продукты гидролиза СФМ, в нашем случае церамид, сами способны индуцировать пероксидное окисление липидов. В литературе имеются данные о том, что церамид вызывает нарушения в электронной транспортной цепи, изменение митохонд зиальной проницаемости и активацию образования активных форм кислорода, что свидетельствует о связи церамида с окислительным стрессом в митохондриях. С другой стороны, в работах, выполненных на клеточных культурах, было показано, что оксиданты (пероксид водорода, доноры оксида азота и другие) активируют образование церамида. Полученные нами результаты и литературные данные свидетельствуют в пользу наличия взаимосвязи между содержанием продукта сфингомиелинового цикла -церамида и интенсивностью пероксидного окисления липидов.

Накопление эндогенного ФНО-а, индуцированное церамидом, приводит к образованию новых порций церамида, так как ФНО-а, как известно, способен активировать СФМазу, связываясь со своим рецептором на поверхности мембран. Кроме того, ФНО-а индуцирует образование активных форм кислорода в клетках, под действием которых снижается внутриклеточное содержание анти-

оксидантов, активируются окислительные процессы, в том числе и ПОЛ, что совместно оказывает дополнительное воздействие на СФМазу, повышая активность фермента. Этот механизм может реализовываться при БА. Церамид участвует в проведении токсического сигнала РА, и мы предположили, что мексидол и мемантин, которые успешно зарекомендовали себя в качестве нейропротекто-ров, могли бы быть эффективны в отношении параметров сфингомиелинового цикла и ПОЛ.

Каждый из этих препаратов оказывал влияние на компонетты сфингомиелинового цикла. Самые четкие изменения изучаемых параметров были отмечены в гиппокампе. Тот факт, что мемантин ингибировал накопление церамида на фоне стабильной ферментативной активности СФМазы, может указывать на ин-гибирование этим препаратом церамидсинтазы или активации ферментов, участвующих в синтезе сложных сфинголипидов, например, ганглиозидов, синтезируемых из церамида.

Таким образом, препараты, которые обладают нейропротекторным действием, ингибируют развитие сфингомиелинового цикла и препятствуют накоплению проапоптотического агента церамида, который в общих чертах имитирует токсическое действие РА. Эксперименты по изучению когнитивных способностей животных показали, что при совместном применении мексидола и меман-тина, действующих на разные компоненты сфингомиелинового цикла, антиам-нестический эффект препаратов суммировался. Полученные данные, представляют интерес, так как позволяют предполагать возможный механизм действия мексидола и мемантина, предлагаемых для лечения нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Парки неона, , ишемического инсульта и др.), заключающийся в инактивации сфингомиелинового цикла и предотвращении накопления церамида - проапоптотического агента, приводящего к гибели нейронов:

Участие сфингомиелинового цикл;! в реализации токсического действия РА позволяет предложить при комплексном лечении БА препараты, обладающие ингибирующим действием на ключеиой фермент сфингомиелинового цикла СФМсВу.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

• ПОЛ - пероксидное окисление

• БА - болезнь Альцгеймера липидов

• БЭ - бульбэктомия • СФМ - сфингомиелин

• РА - 3-амилоидный пептид • СФМаза - сфингомиелиназа

• АФК - активные формы кислорода • ФНО-а - фактор некроза опухоли-а

• СМЖ- спинномозговая жидкость • ЦНС - центральная нервная система

выводы

1. Исследовано влияние РА, ФНО-а и их комбинации на активность СФМ-цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) и ПОЛ в коре больших полушарий, мозжечке и гиппокампе крыс через 3 часа и 7 суток после интерцеребрального введения препаратов. Показано, что исследованные отделы мозга обладают специфичностью по отношению к активации как сфингомиелинового цикла, так и ПОЛ на ранних сроках развития нейроде-генеративного процесса. Наиболее чувствительной структурой является гиппо-камп. Увеличение содержание продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в соответствующих отделах мозга.

2. Сравнительное исследование выявило различия в активации сфингомиелинового цикла фактором некроза опухоли и Р-амилоидным пептидом. ФНО-а как сигнальная молекула активирует СФМазу уже через 3 часа, а РА только через 7 суток. Впервые показано, что максимальная активация фермента, сопровождающаяся накоплением церамида, обнаружена при действии РА в гиппокампе.

3. При совместном' введении РА и ФНО-а наблюдается тенденция к снижению активности сфингомиелиназы и содержания продуктов ПОЛ до контрольного уровня. Таким образом, нетоксичные дозы ФНО-а обладают протекторным действием, защищая нейроны от токсического действия Р-амилоида.

4. Исследованы параметры сфингомиелинового цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) и ПОЛ в коре больших полушарий, гиппокампе и сумме остальных структур (мозжечок, средний мозг и ствол мозга) мышей после бульбэктомии. Показано, что нейродегенерация, обусловленная бульбэктомией, не вызывает изменений в метаболизме СФМ. Не обнаружено также достоверных изменений параметров ПОЛ после бульбэктомии.

5. Изучено действие церамида на процессы ПОЛ и накопление ФНО-а в мозге животных. Впервые показано, что Сг-церамид при внутрибрюшинном введении вызывает дозозависимое накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов) и ФНО-а.

6. Исследованы параметры сфингомиелинового цикла (активность СФМазы, содержание церамида) и ПОЛ в коре больших полушарий и гиппокампе крыс при действии нейропротекторных препаратов мексидола и меман-тина. Показано, что мексидол и мемантин действуют на разные компоненты СФМ-цикла (СФМаза при действии мексидола проявляет тенденцию к снижению, а мемантин снижает содержание церамида). При совместном введении препараты оказывают аддитивный эффект на когнитивные способности животных.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алесенко А.В., Бугрова А.Е., Дудник Л.Б., Коробко В.Г., Шингарова Л.Н. Роль сфингомиелинового цикла и фактэра некроза опухоли альфа в проявлении токсического эффекта р-амилоидного пептида // Ж. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2004. №3. С.55-61.

2. Alessenko A.V., Bugrova А.Е., Dudnik L.B. Connection of lipid peroxide oxidation with sphingomyelin cycle pathway in the development of Alzheimer's disease // Bio-chem. Soc. Transaction. 2004. V.32. №1. P. 144-146.

3. Alessenko A.V., Shupik M.A., Gutnsr U.A., Bugrova A.E., Dudnik L.B., Shinga-rova L.N., Mikoyan A., Vanin A.F. The relation between sphingomyelinase activity, lipid peroxide oxidation and NO-releasing in mice liver and brain // FEBS Letters. 2005. V.579. P. 5571-5576.

4. Алесенко A.B., Бугрова A.E., Дудник Л.Б., Гутнер У.А. Роль сигнальной системы сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов при развитии болезни Аоьцгеймера // Сб. трудов III Российкой конф. "Болезнь Альцгеймера и старение", посвященной 100-летию со дня рождения проф. Э.Я. Штернберга. Москва, Черноголовка. 2003г. Изд-во "Пульс"2003г. Москва. С. 190-197.

5. Алесенко А.В., Бугрова А.Е., Дудник Л.Б., Гутнер У.А. «Индукция сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов при введении в мозг крыс р-амилоидного пептида и ФНО-а» // Тез. III Съезда Биохим. общества. Санкт-Петербург, 2002г. С. 366.

6. Бугрова А.Е., Дудник Л.Б., Коробко В.Г., Шингарова Л.Н., Алесенко А.В. «Новый механизм болезни Альцгеймера» // I Межд. Конг. «Биотехнология - состояние и перспективы развития» Москва. 2002г. С. 120.

7. Бугрова А.Е., Гутнер У.А., Дудннк Л.Б., Алесенко А.В. «Влияние фактора некроза опухоли альфа и р-амилоидного пептида на параметры сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов» // Тез. II Ежег. молод, конф. ИБХФ-ВУЗы. «Биохимическая физика». Москва. 2002г. £.215.

8. Alessenko A.V., Bugrova А.Е., Dudnik L.B. «Connection of lipid peroxide oxidation with sphingomyelin cycle pathway in the development of Alzheimer disease» // Abs. of 44th Int. Conf. on the Bioscience of Lipics (ICBL). Oxford, England. 2003. P. 153.

9.Bugrova A.E. «Influence of P-amyloid peptide and TNF-a on induction of peroxide oxidation and sphingomyelin pathway in rat brain» // Abs. of Physiol. Soc. Spring Workshop «Receptors and Cell Signaling in Oxidative Stress». Budapest, Hungary. 2003. P. 48.

10. Alessenko A.V., Shupik M.A., Gutner U.A., Bugrova A.E., Dudnik L.B. «Connection between sphingomyelinase activity and lipid peroxide oxidation in mice brain and liver» // Abs. 3rd Euro Fed Lipid Cong. Edinburgh, Scottland. 2004. P. 273.

11. Bugrova A.E., Alessenko A.V. «Protective role of TNF-a against P-amyloid peptide toxicity» // Abs. of Conf. «Drug discovery in neurodegenerative diseases» Cold Spring Harbor Laboratory, USA. 2004. P. 51.

12. Bugrova A.E., Dudnik L.B., Alessenko A.V. «Action of p-amyloid peptide and TNF-a on sphingomyelin cycle signaling system and lipid peroxide oxidation in rat brain sections» И Abs. of 8th ECNP Reg. Meeting. Moscow, Russia. 2005. P. 124.

Подписано в печать 4%/т 2007 г. Формат60x84/16. Заказ №/!2.. ТиражУ00экз. П.л. 5 Отпечатано в Редакционно-издателыжой и информационной службе Физического института им. П.Н. Лебедева РАН с оригинал-макета заказчика. 119991 Москва, Ленинский проспект, 53. Тел. 132 51 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бугрова, Анна Евгеньевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Роль сигнальных систем в развитии болезни Альцгеймера.

1.1. Роль Р-амилоидного пептида в развитии болезни Альцгеймера

1.1.1. Характеристика Р-амилоидного пептида.

1.1.2. Взаимодействие Р-амилоидного пептида с мембранными рецепторами.

1.1.3. Роль сигнальных систем в цитотоксичности Р-амилоидного пептида.

1.1.3.1. Активные формы кислорода.

1.1.3.2. Р53.

1.1.3.3. N0.

1.1.3.4. NF-kB.

1.1.3.5. Протеинкиназы.

1.1.3.6. Продукты действия фосфолипаз как вторичные мессенджеры.

1.1.4. Роль продуктов сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера.

1.1.4.1. Роль церамида в регуляции гибели клеток нервной ткани.

1.1.4.2. Мишени церамида при реализации апоптоза.

1.1.4.3. Участие церамида в апоптотической гибели клеток при нейродегенеративных заболеваниях и старении.

1.1.4.4. Влияние церамида на амилоидогенез.

1.1.4.5. Действие р-амилоидного пептида на сфингомиелиназу.

1.1.4.6. Роль сфингозина в развитии болезни Альцгеймера

1.2. Воспалительные реакции при БА. Роль цитокинов.

1.2.1. Роль фактора некроза опухоли в развитии болезни Альцгеймера.

1.2.2. Характеристика ФНО-а и его участие в патогенезе болезни Альцгеймера.

1.2.3. Протекторное действие ФНО-а.

1.2.4. Сигнальные системы, активируемые при токсических эффектах ФНО-а.

1.3. Взаимодействие сигнальных систем при реализации токсических эффектов (ЗА и ФНО-а.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Экспериментальные модели.

2. Препаративные методы.

3. Аналитические методы.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Определение параметров сфингомиелинового цикла и ПОЛ в гиппокампе, коре и мозжечке крыс при при введении (3-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации.

3.1.1. Исследование активности сфингомиелиназы при введении (3-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации в мозг крыс.

3.1.2. Исследование содержания сфингомиелина и церамидов при введении (3-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации в мозг крыс.

3.1.3. Определение параметров пероксидного окисления липидов при введении р-амилоидного пептида, ФНО-а и их комбинации.

3.2. Определение параметров сфингомиелинового цикла и пероксидного окисления липидов в гиппокампе, коре и мозжечке мышей после бульбэктомии.

3.2.1. Исследование активности сфингомиелиназы, содержания сфингомиелина и церамидов.

3.2.2. Определение параметров пероксидного окисления липидов.

3.3. Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ и экспрессию ФНО-а в мозге мышей.

3.3.1. Влияние церамида на интенсивность процессов ПОЛ в мозге мышей.

3.3.2. Влияние церамида на экспрессию ФНО-а в мозге мышей.

3.4. Влияние нейропротекторных препаратов (мексидола и мемантина) на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ

3.4.1. Влияние мексидола на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ.

3.4.2. Влияние мемантина на параметры сфиногомиелинового цикла и ПОЛ.

3.4.3. Исследование влияния мексидола, мемантина и их совместного применения на амнезию условной реакции пассивного избегания.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль сигнальной системы сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера"

В настоящее время особый интерес клиницистов и учёных, занимающихся проблемами фундаментальной медицины, вызывает болезнь Альцгеймера (БА). Этот недуг, как правило, поражает лиц преклонного возраста, характеризуется прогрессирующим расстройством памяти и приводит к полной деградацией личности. Характерной особенностью БА является длительный период бессимптомного развития, что практически исключает возможность исследования механизмов её возникновения и ранней диагностики. Терапия сводится пока к симптоматическому лечению. Одной из главных причин этого является неясный характер этиологии заболевания, что особенно характерно в отношении спорадической (ненаследственной) его формы, которая встречается в 9 раз чаще, чем семейная, генетически обусловленная форма. В связи с этим исследование патогенетических механизмов БА и поиск направленных способов коррекции имеет важнейшее научно-практические и социальное значение.

К настоящему времени установлено, что центральным событием возникновения деменции альцгеймеровского типа является образование (З-амилоидных отложений в коре и гиппокампе (Selkoe, 1994). Отложение (З-амилоида ((ЗА) и созревание сенильных бляшек вызывает множество молекулярных изменений различного рода, которые приводят к прогрессирующей дисфункции и смерти нервных клеток по типу апоптоза или некроза.

Механизмы токсичности (ЗА активно исследуются. Показано участие различных сигнальных событий в реализации действия (ЗА: активация каспаз 2, 3, 6 (Allen et al., 2001), РК С (Nakai et al., 1998, Giri et al., 2000) и iNOS (Akama, 1998), генерация АФК (Retz et al., 1998, Yao et al., 1999), и др. Однако последовательность событий остается не ясной и точный механизм не установлен. В последние годы появляется всё больше фактов, свидетельствующих в пользу участия сигнальной системы сфингомиелинового цикла в реализации токсического действия (ЗА и в патогенезе болезни Альцгеймера (БА).

Сфингомиелиновый цикл (СФМ-цикл) - повсеместно распространённая и эволюционно консервативная сигнальная система. Сфингомиелиновый путь передачи сигнала опосредует действие некоторых экзогенных факторов, таких как цитокины, ростовые факторы, гормоны, окислительный стресс, которые приводят к важным биохимическим и клеточным эффектам (Kantey et al., 1995, Zhang, Kolesnick, 1995, Dobrowski et al., 1994). Сфингомиелиновый цикл (СФМ-цикл) включает деградацию сфингомиелина (СФМ) сфингомиелиназой (СФМазой) с образованием церамида, который, в свою очередь, при участии церамидазы превращается в сфингозин.

Особый интерес исследователей обращен к СФМ циклу, поскольку СФМ и продукты его гидролиза - церамид и сфингозин - являются не только существенными компонентами мембран клеток ЦНС, но и играют важную роль в развитии, жизнедеятельности и гибели нервных клеток. В клетках мозга много СФМ, активность его метаболизма в мозге в несколько раз превышает активность в других органах, что может отразиться и на реализации действия (ЗА.

Было показано, что при БА содержание СФМ в мозге понижено (Soderberg et al., 1992), а уровень церамида в СМЖ и в ткани мозга, напротив, повышен (Gottfries et al.,1996, Han et al., 2002). Установлено, что (ЗА активирует нейтральную СФМазу и повышает продукцию церамида, что было продемонстрировано на культурах олигодендроцитов (Lee et al., 2004) и нейронов (Jana and Pahan., 2004). Кроме того, церамид может способствовать отложению амилоида и образованию сенильных бляшек (Puglielli, 2003). Все эти факты не оставляют сомнений в том, что сфингомиелиновый цикл играет важную роль в патогенезе БА.

Развитие окислительного стресса является одной из характерных черт БА (ВеЫ, 1994, Schapira, 1996, Holscher, 1998, Retz et al., 1998). Снижение глутатиона при окислительном стрессе, индуцированном амилоидом, рассматривается как важный механизм, лежащий в основе токсичности PA (Medina et al., 2002). Глутатион участвует в регуляции нейтральной СФМазы: показано, что РА индуцирует апоптоз посредством активации нейтральной СФМазы через изменения в окислительно-восстановительном состоянии клетки и/или метаболизме глутатиона (Lee et al., 2004). Известно, что нейтральная СФМаза активируется Н2О2 и ингибируется глутатионом (Liu et al., 1998). Ингибирование продукции церамида антиоксидантами, и индукция оксидантами и прооксидантами определяют функцию активных форм кислорода (АФК) и глутатиона в регуляции первого шага в трансдукции сигнала по сфингомиелиновому пути. Более того, пониженный уровень глутатиона и повышенный церамида коррелируют с фрагментацией ДНК при апоптозе (Singh et al., 1998).

РА и церамид имеют общие характеристики в сигнализации клеточной гибели. И PA (Ditaranto-Desimone et al., 2003) и церамид (Singh et al., 1998) вызывают дисфункцию митохондрий и индуцируют окислительный стресс. Очевидно, взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, существующая в живых клетках, вносит существенный вклад в развитие апоптоза при нейродегенративных заболеваниях, включая БА.

Важная роль в развитии Б А отводится цитокинам. Наряду с прямым цитотоксическим действием РА повышает экспрессию провоспалительных цитокинов, таких, как ФНО-а, HJI-ip, ФРТ-Р, ИФН-у и др. (Klegeris, 1997, Fiala, 1998, Suo et al., 1998, Akama, 1998 и др.). В пользу этого свидетельствует тот факт, что практически во всех случаях при БА в мозге наблюдаются воспалительные процессы и повышены провоспалительные медиаторы, включая ФНО-а, ШТ-ip, ИЛ-6, ИФН-у и др.

РА индуцирует синтез цитокинов в различных клеточных культурах (Meda et al., 1995, Shalit et al., 1997, Sutton et al., 1999, Akama, Van Eldik, 2000) и результатом цитотоксического действия цитокинов, в частности ФНО-а, могут быть такие вызываемые амилоидом эффекты, как активация протеинкиназ, NF-kB, iNOS, РК С, генерация АФК и N0.

Цитокины участвуют в регуляции уровня амилоида в мозге, поскольку они регулируют синтез и процессинг П0А (Goldgaber et al., 1989, Monning et al., 1994, Blasko et al., 1999, 2000, Gianni et al., 2003 Liao et al., 2004 и др.). Таким образом, цитокины, в частности, ФНО-а, могут выступать в качестве первопричины нейродегенеративного процесса.

Механизм совместного токсического действия 0А и ФНО-а в клетках мозга не выявлен, однако, показано, что в присутствия ФНО-а наблюдается синергическое усиление нейротоксических эффектов (ЗА, опосредованных свободными радикалами (Rossi et al., 1996). Предполагается, что связующими элементоми могут выступать продукты сфингомиелинового цикла (церамид и сфингозин), которые являются вторичными мессенджерами и участвуют в проведении сигнала апоптоза, индуцируемого как ФНО-а, так и (ЗА.

Одним из основных механизмов токсического действия ФНО-а является генерация активных форм кислорода. С другой стороны, было показано, что СФМ-цикл взаимосвязан с регуляцией процессов перекисного окисления липидов. В связи с этим перспективным является направление исследований взаимосвязи окислительных процессов и активации СФМ-цикла, вызванных действием (3-амилоида , и ФНО-а. Это позволит лучше понять роль продукции АФК и церамида как медиаторов клеточной гибели и их функции в патогенезе БА и других заболеваний, сопровождающихся апоптозом.

Если цитотоксичность (ЗА для зрелых нейронов в настоящее время не вызывает сомнений, то роль ФНО-а а остается не вполне ясной. В литературе наиболее распространенным является мнение о цитотоксическом действии ФНО-а, однако известно и о защитном действии ФНО-а на нейроны.

В настоящее время изучению роли (ЗА и ФНО-а в развитии БА уделяется большое внимание, однако основной объем исследований на данный момент выполнен на клеточных культурах, и лишь незначительная часть экспериментов была проведена на животных in vivo, причем в основном были исследованы морфологические, иммунологические или физиологические параметры при введении препаратов. Несмотря на активные исследования в системах in vitro, моделирование БА in vivo встречает значительные трудности. Создание трансгенных моделей с мутациями белка предшественника (ЗА, использование специфических блокаторов рецепторов, вызывающих амнезию, не позволяют пока получить оптимальную модель заболевания. В связи с этим перспективным является создание и использование оперативных моделей. Среди таковых наиболее распространёнными являются инъекционные модели, основанные на введении в мозг животных амилоидных пептидов и других факторов, важных для развития БА. Также используют моделирование нейродегенерации удалением обонятельных луковиц, что приводит к нарушению поведенческих реакций и накоплению белка, по своей структуре частично напоминающего РА человека.

В представленной работе исследование молекулярных механизмов нейродегенерации проводилось на инъекционной модели БА, а именно при центральном введении РА и ФНО-а. В качестве контрольной использовалась модель с удалением обонятельных луковиц.

Целью настоящей работы являлось исследование роли сфингомиелиновой сигнальной системы и пероксидного окисления липидов в развитии повреждений в мозге животных in vivo, возникающих при развитии нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать активность СФМ-цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) в разных отделах мозга животных (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) при действии РА, ФНО-а и их комбинации через 3 часа и 7 суток после введения препаратов.

2.0пределить интенсивность процессов пероксидного окисления липидов в разных отделах мозга (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) при действии рА, ФНО-а и их комбинации через 3 часа и 7 суток после введения препаратов.

3.Исследовать активность СФМ-цикла (изменение активности СФМазы, содержания сфингомиелина и церамида) в разных отделах мозга животных при развитии нейродегенерации, вызванной удалением обонятельных луковиц (бульбэктомией).

4.0пределить интенсивность пероксидного окисления липидов в разных отделах мозга животных при развитии нейродегенерации, вызванной удалением обонятельных луковиц (бульбэктомией).

5.Изучить влияние церамида на интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и экспрессию ФНО-а в мозге животных.

6. Исследовать влияние нейропротекторных препаратов мексидола и мемантина на параметры СФМ-цикла, интенсивность ПОЛ и когнитивные функции животных.

В данной работе впервые исследовано влияние Р-амилоидного пептида на активность СФМ-цикла в мозге животных in vivo. Впервые показано, что разные отделы мозга (кора больших полушарий, мозжечок и гиппокамп) обладают специфичностью по отношению к активации СФМ-цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) при действии рА, наиболее чувствительным является в гиппокамп. Введение животным РА и ФНО-а индуцирует в мозге процессы ПОЛ, интенсивность которых различается в исследованных отделах мозга. Показано, что продукт СФМ-цикла церамид способен самостоятельно индуцировать пероксидное окисление липидов и накопление ФНО-а.

Препараты мексидол и мемантин, которые используются для лечения нейродегенеративных заболеваний (БА, болезни Паркинсона, ишемического инсульта и др.), препятствуют накоплению проапоптотического агента церамида, приводящего к гибели нейронов, что позволяет предполагать возможный механизм их действия, заключающийся в инактивации СФМ-цикла и предотвращении накопления церамида.

Результаты проведенных исследований имеют важное значение для понимания роли СФМ-цикла в механизме передачи сигнала РА в клетках мозга. Данные об участии СФМ-цикла развитии нейродегенративных заболеваний ставят вопрос о новых стратегиях лечения таких заболеваний как БА, болезнь Паркинсона и др.

На защиту выносятся следующие положения:

1. РА активирует сфингомиелиназу в мозге животных in vivo. Наиболее выраженная активация СФМ-цикла при действии рА наблюдается в гиппокампе.

2. Как РА, так и ФНО-а инициируют накопление в мозге продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов), наиболее интенсивно происходящее в гиппокампе. Увеличение содержание продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в соответствующих отделах мозга.

3. Совместно [ЗА и ФНО-а оказывают меньший эффект на параметры СФМ-цикла и ПОЛ по сравнению с эффектом каждого из них отдельно.

4. Церамид - продукт деградации сфингомиелина сфингомиелиназой -индуцирует пероксидное окисление липидов и накопление ФНО-а в мозге животных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бугрова, Анна Евгеньевна

выводы

1. Исследовано влияние |ЗА, ФНО-а и их комбинации на активность СФМ-цикла (активность СФМазы, содержание СФМ и церамида) и ПОЛ в коре больших полушарий, мозжечке и гиппокампе крыс через 3 часа и 7 суток после интерцеребрального введения препаратов. Показано, что исследованные отделы мозга обладают специфичностью по отношению к активации как СФМого цикла, так и ПОЛ на ранних сроках развития нейродегенеративного процесса. Наиболее чувствительной структурой является гиппокамп. Увеличение содержание продуктов ПОЛ соответствует активации СФМазы в соответствующих отделах мозга.

2. Сравнительное исследование выявило различия в активации СФМого цикла фактором некроза опухоли и Р-амилоидным пептидом. ФНО-а как сигнальная молекула активирует СФМазу уже через 3 часа, а РА только через 7 суток. Впервые показано, что максимальная активация фермента, сопровождающаяся накоплением церамида, обнаружена при действии РА в гиппокампе.

3. При совместном введении РА и ФНО-а наблюдается тенденция к снижению активности СФМазы и содержания продуктов ПОЛ до контрольного уровня. Таким образом, нетоксичные дозы ФНО-а обладают протекторным действием, защищая нейроны от токсического действия Р-амилоида.

4. Исследованы параметры СФМого цикла (активность СФМазы, содержание сфингомиелина и церамида) и ПОЛ в коре больших полушарий, гиппокампе и сумме остальных структур (мозжечок, средний мозг и ствол мозга) мышей после бульбэктомии. Показано, что нейродегенерация, обусловленная бульбэктомией, не вызывает изменений в метаболизме СФМ. Не обнаружено также достоверных изменений параметров ПОЛ после бульбэктомии.

5. Изучено действие церамида на процессы ПОЛ и накопление ФНО-а в мозге животных. Впервые показано, что С2-церамид при внутрибрюшинном введении вызывает дозозависимое накопление продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и диенкетонов) и ФНО-а.

6. Исследованы параметры СФМого цикла (активность СФМазы, содержание церамида) и ПОЛ в коре больших полушарий и гиппокампе крыс при действии нейропротекторных препаратов мексидола и мемантина. Показано, что мексидол и мемантин действуют на разные компоненты СФМ-цикла (СФМаза при действии мексидола проявляет тенденцию к снижению, а мемантин снижает содержание церамида). При совместном введении препараты оказывают аддитивный эффект на когнитивные способности животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бугрова, Анна Евгеньевна, Москва

1. Александрова И.Ю., Кувичкин В.В., Кашпаров И.А., Медвинская Н.И., Нестерова И.В., Лунин С.М., Самохин А.Н., Бобкова Н.В. Повышенный уровень б-амилоида в мозге у бульбэктомированных мышей // Биохимия. 2004. Т.69. Вып.2. С. 218-224.

2. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Нестеров В.В. // Бюлл. Эксперим. Биол. и мед. 2001. Т.131. С. 507-511

3. Бобкова Н.В., Нестерова И.В., Дана Р., Нестеров В.В., Александрова И.Ю., Медвинская Н.И., Самохин А.Н. // Мофология 2003. Вып.4. С. 429-434.

4. Завалишин И.А., Захарова М.Н. Гибель нейрона кардинальная проблема неврологии и психиатрии // Вестник РАМН. 1999. №1. С. 21-23.

5. Рожнова У.А., Степаничев М.Ю., Коробко В.Г., Гуляева Н.В., Алесенко А.В. Активация сфингомиелинового цикла и накопление холестерина в коре, гиппокампе и мозжечке крыс при действии фактора некроза опухоли альфа // Нейрохимия. 1999.Т. 16, №4. С. 302309.

6. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1997. С. 63-64.

7. Футерман А.Х. Роль церамида в регуляции роста и развития нейронов //Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 1. С. 89-100.

8. Шпигель С., Гувилер О, Мензелеев Р.Н., Оливера А., Томас Д., Ти 3., Вонг Ф. Роль сфингозин-1-фосфатав клеточном росте, дифференциации и смерти клеток // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 1. С. 78-88.

9. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Пат. физиология и эксп. терапия. 1998. №2. С. 91-99.

10. Aisen P.S. The potential of anti-inflammatory drugs for the treatment of Alzheimer's disease // Lancet. Neurol. 2002. Vol. 1, 5. P. 279-284.

11. Akama K.T., Albanese C., Pestell R.G., Van Eldik L.J. Amyloid beta-peptide stimulates nitric oxide productionin astrocytes through an NFkappaB-dependent mechanism // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. Vol. 95, 10. P. 5795-5800.

12. Allen J.W., Eldadah B.A., Huang X., Knoblach S.M., Faden A.I. Multiple caspases are involved in beta-amyloid-induced neuronal apoptosis // J. Neurosci. Res. 2001. Vol. 65,1. P. 45-53.

13. Araki W., Kitaguchi N., Tokushima Y., Ishii K., Aratake H., Shimohama S., Nakamura S., Kimura J. Trophic effect of beta-amyloid precursor protein on cerebral cortical neurons in culture // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. Vol. 181, 1. P. 265-271.

14. Ariga Т., Jarvis W.D., Yu R.K. Role of sphingolipid-mediated in neurodegenerative diseases // J. Lipid. Res. 1998. Vol. 39, 1. P. 1-16.

15. Arnett H.A., Mason J., Marino M., Suzuki K., Matsushima G.K., Ting J.P. TNF alpha promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination // Nat. Neurosci. 2001. Vol. 11. P. 1116-1122.

16. Ayasolla K., Khan M., Singh A.K., Singh I. Inflammatory mediator and beta-amyloid (25-35)-induced ceramide generation and iNOS expression are inhibited by vitamin E // Free Radic. Biol. Med. 2004. Vol. 37, 3. P. 325-338.

17. Back S.A., Gan X., Li Y., Rosenberg P.A., Volpe J.J. Maturation-dependent vulnerability of oligodendrocytes to oxidative stress-induced death caused by glutathione depletion // J. Neurosci. 1998. Vol. 18,16. P. 6241-6253.

18. Ballou L.R., Laulederkind S.J., Rosloniec E.F., Raghow R. Ceramide signalling and the immune response. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1301. P. 273-287.

19. Banati R.B., Beyreuter K. Alzheimer's disease. In: Kettenman H, Ransom BR, eds. Neuroglia. New York: Oxford University Press, 1995:1027-43.

20. Barger S.W., Mattson M.P. Induction of neuroprotective kappa B-dependent transcription by secreted forms of the Alzheimer's beta-amyloid precursor// Brain. Res. Mol. Brain. Res. 1996. Vol. 40, 1. P. 116-126.

21. Behl C., Davis J.B., Lesley R., Schubert D. Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity // Cell. 1994. Vol. 77, 6. P. 817-827.

22. Behl C., Sagara Y. Mechanism of amyloid beta protein induced neuronal cell death: current concepts and future perspectives // J. Neural. Transm. Suppl. 1997. Vol.49. P. 125-134.

23. Berridge M.J. Inositol trisphosphate and calcium signaling // Nature. 1993. Vol. 361, 6410. P. 315-325.

24. Bishop G.M., Robinson S.R. Insights on Alzheimer's Disease from the Intracerebral Injectionand Infusion of Amyloid-p // In: New Research on Alzheimer's Disease. Nova Science. 2006. P. 10-38.

25. Blake R.A., Walker T.R., Watson S.P. Activation of human platelets by peroxovanadate is associated with tyrosine phosphorylation of phospholipase С gamma and formation of inositol phosphates // Biochem. J. 1993. Vol.290. P. 471-475.

26. Blasko I., Marx F., Steiner E., Hartmann Т., Grubeck-Loebenstein B. TNFalpha plus IFNgamma induce the production of Alzheimer beta-amyloid peptides and decrease the secretion of APPs // FASEB J. 1999. Vol. 13, l.P. 63-68.

27. Bolanos J.P., Almeida A., Stewart V., Peuchen S., Land J.M., Clark J.B., Heales S.J. Nitric oxide-mediated mitochondrial damage in the brain: mechanisms and implications for neurodegenerative diseases // J. Neurochem. 1997. Vol. 68, 6. P. 2227-2240.

28. Bongioanni P., Romano M.R., Sposito R, Castagna M., Boccardi В., Borgna M. T-cell tumour necrosis factor-alpha receptor binding in demented patients //J. Neurol. 1997. Vol. 244. P. 418-425.

29. Brera В., Serrano A., Caballos M.L. (3-Amyloid peptides are cytotoxic to astrocytes in culture: a role for oxidative stress // Neurobiol. Disease. 2000. №7. P. 395-405.

30. Broe M., Shepherd C.E., Milward E.A., Halliday G.M. Relationship between DNA fragmentation, morphological changes and neuronal loss in Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies // Acta Neuropathol. (Berl.). 2001. Vol. 101, 6. P. 616-624.

31. Brown G.C., Bal-Price A. Inflammatory neurodegeneration mediated by nitric oxide, glutamate, and mitochondria // Mol. Neurobiol. 2003. 3. P. 325-355.

32. Brown W.R., Moody D.M., Thore C.R., Challa V.R. Cerebrovascular pathology in Alzheimer's disease and leukoaraiosis // Ann. NY Acad. Sci. 2000. Vol. 903. P. 39-45.

33. Brugg В., Michel P.P., Agid Y., Ruberg M. Ceramide induces apoptosis in cultured mesencephalic neurons // J. Neurochem. 1996. Vol. 66, 2. P. 733739.

34. Buccoliero R., Futerman A.H. The roles of ceramide and complex sphingolipids in neuronal cell function // Pharmacol. Res. 2003. Vol. 47, 5. P. 409-419.

35. Butterfield D.A., Drake J., Pocernich C., Castegna A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid beta-peptide//Trends Mol. Med. 2001. Vol. 12. P. 548-554.

36. Camandola S., Mattson M.P. Pro-apoptotic action of PAR-4 involves inhibition of NF-kappaB activity and suppression of BCL-2 expression // J. Neurosci. Res. 2000. Vol. 61, 2. P. 134-139.

37. Chao C.C., Hu S., Kravitz F.H., Tsang M., Anderson W.R., Peterson P.K. Transforming growth factor-beta protect human neurons against beta-amyloid-induced injury // Mol. Chem. Neuropathol. 1994. Vol. 23, 2-3. P. 159-178.

38. Cheng В., Christakos S., Mattson M.P. Tumor necrosis factors protect neurons against metabolic-excitotoxic insults and promote maintenance of calcium homeostasis // Neuron. 1994. Vol. 12. P. 139-153.

39. Choo-Smith L.P., Surewicz W.K. The interaction between Alzheimer amyloid beta(l-40) peptide and ganglioside GM1-containing membranes // FEBS Lett. 1997. Vol. 402, 2-3. P. 95-98.

40. Clemens J.A., Stephenson D.T., Dixon E.P., Smalstig E.B., Mincy R.E., Rash K.S., Little S.P. Global cerebral ischemia activates nuclear factor-kappa В prior to evidence of DNA fragmentation // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 1997. Vol. 48. P. 187-196.

41. Combs C.K., Karlo J.C., Kao S.C., Landreth G.E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFalpha-dependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal apoptosis // J. Neurosci. 2001. Vol. 21,4. P. 1179-1188.

42. Costantini C., Weindruch R., Delia Valle G., Puglielli L. A TrkA-to-p75NTR molecular switch activates amyloid beta-peptide generation during aging // Biochem. J. 2005. Vol. 391. P. 59-67.

43. Costantini C., Scrable H., Puglielli L. An aging pathway controls the TrkA to p75NTR receptor switch and amyloid beta-peptide generation // EMBO J. 2006. Vol.25, 9. P. 1997-2006.

44. D'Andrea M.R., Nagele R.G., Wang H.Y., Peterson P.A., Lee D.H. Evidence that neurones accumulating amyloid can undergo lysis to form amyloid plaques in Alzheimer's disease. Histopathology // 2001. Vol. 38, 2. P. 120-134.

45. Danysz W., Zajaczkowski W., Parsons C.G. Modulation of learning processes by ionotropic glutamate receptor ligands // Behav. Pharmacol. 1995. Vol.6. P. 455-474.

46. Da Silva J., Pierrat В., Mary J.L., Lesslauer W. Blockade of p38 mitogen-activated protein kinase pathway inhibits inducible nitric-oxide synthase expression in mouse astrocytes // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 2837328380.

47. Davis J.B. Oxidative mechanisms in beta-amyloid cytotoxicity // Neurodegeneration. 1996. Vol. 4. P. 441-444.

48. De la Monte S.M., Sohn Y.K., Wands J.R. Correlates of p53- and Fas (CD95)-mediated apoptosis in Alzheimer's disease // J. Neurol. Sci. 1997. Vol. 152, l.P. 73-83.

49. Del Villar K., Miller C.A. Down-regulation of DENN/MADD, a TNF receptor binding protein, correlates with neuronal cell death in Alzheimer's disease brain and hippocampal neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2004. Vol. 101,12. P. 4210-4215.

50. Dickson D.W. Apoptotic mechanisms in Alzheimer neurofibrillary degeneration: cause or effect? // J. Clin. Invest. 2004. Vol. 114, l.P. 23-27.

51. Dobrowski R.T., Werner M.N., Castellino A.M., Chao M.V., Hannun Y.A. Activation of the sphingomyelin cycle through the low-affinity neurotrophinreceptor// Science. 1994. Vol. 265. P. 1596-1599.

52. Esch F.S., Keim P.S., Beattie E.C., Blacher R.W., Culwell A.R., Oltersdorf Т., McClure D., Ward P.J. Cleavage of amyloid beta peptide during constitutive processing of its precursor // Science. 1990. Vol. 248, 4959. P. 1122-1124.

53. Forloni G., Mangiarorotti F., Angerretti N., Lucca E., De Simoni M.G. Beta-amyloid fragment potentiales IL-6 and TNF-alpha secretion by LPS in astrocytes but not in microglia // Cytokine. 1997. Vol. 9,10. P. 759-762.

54. France-Lanord V., Brugg В., Michel P.P., Agid Y., Ruberg M. J. Mitochondrial free radical signal in ceramide-dependent apoptosis: a putative mechanism for neuronal death in Parkinson's disease // Neurochem. 1997. Vol. 69. P. 1612-1621.

55. Frautschy S.A., Baird A., Cole G.M. Effects of injected Alzheimer beta-amyloid cores in rat brain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88, 19. P. 8362-8366.

56. Fiers W. Tumor necrosis factor. Characterization at the molecular, cellular and in vivo level // FEBS Lett. 1991. Vol. 285, 2. P. 199-212.

57. Furukawa K., Barger S.W., Blalock E.M., Mattson M.P. Activation of K+ channels and suppression of neuronal activity by secreted beta-amyloid-precursor protein // Nature. 1996. Vol. 379, 6560. P. 74-78.

58. Gill J.S., Windebank A.J. Ceramide initiates NFkappaB-mediated caspase activation in neuronal apoptosis // Neurobiol. Dis. 2000. Vol. 4. P. 448461.

59. Giri R., Shen Y., Stins M., Schmidt A.M. Stern D., Kim K.S., Kalra V.K. Beta-amyloid-induced migration of monocytes acros human brain endotelial cells involves RAGE and PECAM-1 // Am. J. Physiol. Cell Phisiol. 2000. Vol. 279, 6. P. 1772-1781.

60. Golde Т.Е., Estus S., Younkin L.H., Selkoe D.J., Younkin S.G. Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives // Science. 1992. Vol. 255, 5045. P. 728-730.

61. Gottfries C.G., Karlsson I., Svennerholm L. Membrane components separate early-onset Alzheimer's disease from senile dementia of the Alzheimer type // Int. Psychogeriatr. 1996. Vol. 8, 3. P. 365-372.

62. Gouras G.K., Tsai J., Naslund J., Vincent В., Edgar M., Checler F., Greenfield J.P., Haroutunian V., Buxbaum J.D., Xu H., Greengard P., Relkin N.R. Intraneuronal Abeta42 accumulation in human brain // Am. J. Pathol. 2000. Vol. 156, l.P. 15-20.

63. Haddad J.J. Mitogen-activated protein kinases and the evolution of Alzheimer's: a revolutionary neurogenetic axis for therapeutic intervention? // Prog. Neurobiol. 2004. Vol. 73, 5. P. 359-377.

64. Han X., Holtzman D.M., McKeel D.W., Kelly J., Morris J.C. Substantial sulfatide deficiency and ceramide elevation in very early Alzheimer's disease: potential role in disease pathogenesis // J. Neurochem. 2002. Vol. 82. P. 809-818.

65. Hannum Y.A. The sphnngomyelin cycle and the second messenger function of ceramide // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, 5. P. 3125-3128.

66. Hannun Y.A., Bell R.M. Regulation of protein kinase С by sphingosine and lysosphingolipids // Clin. Chim. Acta. 1989. Vol. 185, 3. P. 333-345.

67. Hannun Y.A., Luberto C. Ceramide in the eukaryotic stress response // Trends Cell. Biol. 2000. Vol. 10, 2. P. 73-80.

68. Harris M.E., Hensley K., Butterfield D.A., Leedle R.A., Carney J.M. Direct evidence of oxidative injury produced by the Alzheimer's beta-amyloid peptide (1-40) in cultured hippocampal neurons // Exp. Neurol. 1995. Vol. 131, 2. P. 193-202.

69. Herreman A., Serneels L., Annaert W., Collen D., Schoonjans L., De Strooper B. Total inactivation of gamma-secretase activity in presenilin-deficient embryonic stem cells // Nat. Cell Biol. 2000. Vol. 2, 7. P. 461462.

70. Holscher C. Possible causes of Alzheimer's disease: amyloid fragments, free radicals, and calcium homeostasis // Neurobiol. Diseases. 1998. Vol. 5. P. 129-141.

71. Hostetler K.J., Yazaki P.J. The subcellular localization of neutral sphingomyelinase in rat brain // J. Lip. Res. 1979. Vol. 20. P. 456-463.

72. Houzen H., Kikuchi S., Kanno M., Tashiro K. Tumor necrosis fsctor enhancement of transient outward potassium currents in cuitured rat cortical neurons // J. Neurosci. Res. 1997. Vol. 50, 6. P. 990-999.

73. Hu J., Akama K.T., Krafft G.A., Chromy B.A., Van Eldik L.J. Amyloid-beta peptide activates cultured astrocytes: morphological alterations,cytokine induction and nitric oxide release // Brain Res. 1998. Vol. 785, 2. P. 195-206.

74. Huang S.S., Huang F.W., Xu J, Chen S., Hsu C.Y., Huang J.S. Amyloid beta-peptide possesses a transforming growth factor-beta activity // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, 42. P. 27640-27644.

75. Huang H.M., Ou H.C., Hsieh S.J. Antioxidants prevent amyloid peptide-induced apoptosis and alteration of calcium homeostasis in cultured cortical neurons//Life Sci. 2000. Vol.66, 19. P. 1879-1892.

76. Jayadev S., Linardic C.M., Hannun Y.A. Identification of arachidonic acid as a mediator of sphingomyelin hydrolysis in response to tumor necrosis factor alpha// J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, 8. P. 5757-5763.

77. Juurlink B.H. The multiple sclerosis lesion: initiated by a localized hypoperfusion in a central nervous system where mechanisms allowing leukocyte infiltration are readily upregulated? // Med. Hypotheses. 1998. Vol. 51,4. P. 299-303.

78. Kakio A., Nishimoto S.I., Yanagisawa K., Kozutsumi Y., Matsuzaki K. Cholesterol-dependent formation of GM1 ganglioside-bound amyloid beta-protein, an endogenous seed for Alzheimer amyloid // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, 27. P. 24985-24990.

79. Kaltschmidt В., Baeuerle P.A., Kaltschmidt C. Potential involvement of the transcription factor NF-kappa В in neurological disorders // Mol. Aspects. Med. 1993. Vol. 14. P. 171-190.

80. Kaltschmidt В., Uherek M., Wellmann H., Volk В., Kaltschmidt C. Ingibition of NF-kappaB potentiates amyloid beta-mediated neuronal apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96, 16. P. 9409-9414.

81. Kaltschmidt В., Heinrich M., Kaltschmidt C. Stimulus-dependent activation of NF-kappaB specifies apoptosis or neuroprotection in cerebellar granule cells // Neuromol. Med. 2002. Vol. 2, 3. P. 299-309.

82. Kim J.Y., Kim H., Lee S.G., Choi B.H., Kim Y.H., Huh P.W., Lee K.H., Han H., Rha H.K. Amyloid beta peptide (Abeta42) activates PLC-deltal promoter through the NF-kappaB binding site // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 310, 3. P. 904-909.

83. Kim S.H., Smith C.J., Van Eldik L.J. Importance of МАРК pathways for microglial pro-inflammatory cytokine IL-1 beta production // Neurobiol. Aging. 2004. Vol. 25, 4. P. 431-439.

84. Kim S.K., Park H.J., Hong H.S., Baik E.J., Jung M.W., Mook-Jung I. ERK1/2 is an endogenous negative regulator of the gamma-secretase activity//FASEB J. 2006. Vol.20, l.P. 157-159.

85. Klegeris A., Walker D.G., McGeer P.L. Interaction of Alzheimer beta-amyloid peptide with the human monocytic cell line THP-1 results in a protein kinase C-dependent secretion of tumor necrosis factor-alpha // Brain. Res. 1997. Vol. 747, l.P. 114-121.

86. KoIesnick R.N., Kronke M. Regulation of ceramide production and apoptosis //Annu. Rev. Physiol. 1998. Vol. 60. P. 643-665.

87. Koppaka V., Axelsen P.H. Accelerated accumulation of amyloid beta proteins on oxidatively damaged lipid membranes // Biochemistry. 2000. Vol. 39, 32. P. 10011-10016.

88. Kunner P., Hertel C. NGF induces apoptosis in a human neuroblastoma cell line expressing the neurotrophin receptor p75NTR // J. Neurosci. Res. 1998. Vol. 54,4. P. 465-474.

89. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, 259. P. 680-685.

90. LaFerla F.M., Hall C.K., Ngo L., Jay G. Extracellular deposition of beta-amyloid upon p53-dependent neuronal cell death in transgenic mice // J. Clin. Invest. 1996. Vol. 98, 7, P. 1626-1632.

91. Lee J.T., Xu J., Lee J.M., Ku G., Han X., Yang D.I., Chen S., Hsu C.Y. Amyloid-beta peptide induces oligodendrocyte death by activating the neutral sphingomyelinase-ceramide pathway // J. Cell. Biol. 2004. Vol. 164, 1.Р. 123-131.

92. Lee H.G., Casadesus G., Zhu X., Joseph J.A., Perry G., Smith M.A. Perspectives on the amyloid-beta cascade hypothesis // J. Alzheimers Dis. 2004a. Vol. 6, 2. P. 137-145.

93. Liu В., Andrieu-Abadiei N., Levadei Т., Zhang P., Obeid L.M., Hannun Y.A. Glutathione regulation of neutral sphingomyelinase in tumor necrosis factor-a-induced cell death // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 1131311320.

94. Liu В., Hannun Y.A. Inhibition of the neutral magnesium-dependent sphingomyelinase by glutathione // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, 26. P. 16281-16287.

95. Loo D.T., Copani A., Pike C.J., Whittemore E.R., Walencewicz A.J., Cotman C.W. Apoptosis is induced by beta-amyloid in cultured central nervous system neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. Vol. 90, 17. P. 7951-7955.

96. Lowry O.H., Rosebrogh N.G., Farr A.L. Protein measurement with folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

97. Lozano J., Berra E., Municio M.M., Diaz-Meco M.T., Dominguez I., Sanz L., Moscat J. Protein kinase С zeta isoform is critical for kappa B-dependent promoter activation by sphingomyelinase // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269,30. P. 19200-19202.

98. Lucca U., Tettamanti M., Forloni G., Spagnoli A. Nonsteroidal antiinflammatory drug use in Alzheimer's disease // Biol. Psychiatry. 1994. Vol.36, 12. P. 854-856.

99. Lue L.F., Wolker D.G., Brachova L., Beach T.G., Rogers J., Schmidt A.M., Stern D.M., Yan S.D. Involvement of microglial receptor for advanced glication endoprodcts (RAGE) in Alzheimer's disease // Exp. Neurol. 2001. Vol. 171,1. P. 29-45.

100. Luth H.J., Munch G., Arendt T. Aberrant expression of NOS isoforms in Alzheimer's disease is structurally related to nitrotyrosine formation // Brain Res. 2002.Vol. 953, 1-2. P. 135-43.

101. McCaffrey R.J., Duff K., Solomon G.S. Olfactory dysfunction discriminates probable Alzheimer's dementia from major depression: a cross-validation and extension // J. Neuropsychiatry Clin. Neurosci. 2000. Vol. 12, 1. P. 29-33.

102. McGeer E.G., McGeer P.L. Inflammatory processes in Alzheimer's disease // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2003. Vol. 27, 5. P. 741749.

103. Malchiodi-Albedi F., Domenici M.R., Paradisi S., Bernardo A., Ajmone-Cat M.A., Minghetti L. Astrocytes contribute to neuronal impairment inbeta A toxicity increasing apoptosis in rat hippocampal neurons // Glia. 2001. Vol. 34, l.P. 68-72.

104. Mangoura D., Dawson G. Programmed cell death in cortical chick embryo astrocytes is associated with activation of protein kinase PK60 and ceramide formation//J. Neurochem. 1998. Vol. 70, 1. P. 130-138.

105. Marcinkiewicz M., Seidah N.G. Coordinated expression of beta-amyloid precursor protein and the putative beta-secretase BACE and alpha-secretase ADAM10 in mouse and human brain. J. Neurochem. 2000. Vol. 75, 5. P. 2133-2143.

106. Marcus J.S., Karackattu S.L., Fleegal M.A., Sumners C. Cytokine-stimulated inducible nitric oxide synthase expression in astroglia: role of Erk mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB // Glia. 2003. Vol. 41,2. P. 152-160.

107. Masliah E., Sisk A., Mallory M., Mucke L., Schenk D., Games D. Comparison of neurodegenerative pathology in transgenic mice overexpressing V717F beta-amyloid precursor protein and Alzheimer's disease//J. Neurosci. 1996. Vol. 16, 18. P. 5795-5811.

108. Mattson M.P. NF-kappaB in the survival and plasticity of neurons // Neurochem. Res. 2005. Vol. 30, 6-7. P. 883-893.

109. Medina S., Martinez M., Hernanz A. Antioxidants inhibit the human cortical neuron apoptosis induced by hydrogen peroxide, tumor necrosis factor alpha, dopamine and beta-amyloid peptide 1-42 // Free Radic. Res. 2002. Vol.36,11. P. 1179-1184.

110. Merrill A.H. De novo sphingolipid biosynthesis: a necessary, but dangerous, pathway // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, 29. P. 25843-25846.

111. Miller C.J., Stein G.H. Human diploid fibroblasts that undergo a senescent-like differentiation have elevated ceramide and diacylglycerol // J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 2001. Vol. 56, l.P. 8-19.

112. Montine T.J., Markesbery W.R., Morrow J.D., Roberts LJ 2nd. Cerebrospinal fluid F2-isoprostane levels are increased in Alzheimer's disease // Neurol. 1998. Vol. 44, 3. P. 410-413.

113. Morihara Т., Chu Т., Ubeda O., Beech W., Cole G.M. Selective inhibition of Abeta42 production by NSAID R-enantiomers // J. Neurochem. 2002. Vol. 83,4. P. 1009-1012.

114. Mouton R.E., Venable M.E. Ceramide induces expression of the senescence histochemical marker, beta-galactosidase, in human fibroblasts // Mech. Ageing Dev. 2000. Vol. 113, 3. P. 169-181.

115. Monning U., Sandbrink R., Banati R.B., Masters C.L., Beyreuther K. Transforming growth factor beta mediates increase of mature transmembrane amyloid precursor protein in microglial cells // FEBS Lett. 1994. Vol. 342,3. P. 267-72.

116. Nakai M., Hojo K., Taniguchi Т., Terashima A., Kawamata Т., Hashimoto Т., Maeda К., Tanaka С. PKC and tyrosine kinase involvement in amyloid beta (25-35)-induced chemotaxis of microglia // Neuroreport. 1998. Vol. 9, 15. P. 3467-3470.

117. Neeper M., Schmidt A.M., Brett J., Yan S.D., Wang F., Pan Y.C., Elliston K., Stern D., Shaw A. Cloning and expression of a cell surface receptor for advanced glycosylation end products of proteins // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, 21. P. 14998-15004.

118. Pahan К., Sheikh F.G., Khan M., Namboodiri A.M., Singh I. Sphingomyelinase and ceramide stimulate the expression of inducible nitric-oxide synthase in rat primary astrocytes // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, 5. P. 2591-2600.

119. Pahan K., Dobashi K., Ghosh В., Singh I. Induction of the manganese superoxide dismutase gene by sphingomyelinase and ceramide // J. Neurochem. 1999. Vol. 73, 2. P. 513-520.

120. Pappolla M.A. Amyloid deposition in diffuse plaques may or may not start at the neuronal cell surface membrane // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2001. Vol. 60, l.P. 105-106.

121. Parkinson J.F., Mitrovic В., Merrill J.E. The role of nitric oxide in multiple sclerosis // J. Mol.Med. 1997. Vol. 75,3. P. 174-186.

122. Paris D., Townsend K.P., Obregon D.F., Humphrey J., Mullan M. Proinflammatory effect of freshly solubilized beta-amyloid peptides in the brain // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. Vol. 70, 1-2. P. 1-12.

123. Pasinetti G.M. Cyclooxygenase and inflammation in Alzheimer's disease: experimental approaches and clinical interventions // J. Neurosci. Res. 1998. Vol. 54, l.P. 1-6.

124. Payne S.G., Milstien S., Spiegel S. Sphingosine-1-phosphate: dual messenger functions // FEBS Lett. 2002. Vol. 531, 1. P. 54-57.

125. Pettus B.J., Chalfant C.E., Hannun Y.A. Ceramide in apoptosis: an overview and current perspectives // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1585,2-3. P. 114-125.

126. Pike C.J., Ramezan-Arab N., Cotman C.W. Beta-amyloid neurotoxicity in vitro: evidence of oxidative stress but not protection by antioxidants // J. Neurochem. 1997. Vol. 69, 4. P. 1601-1611.

127. Pitsi D., Kienlen-Campard P., Octave J.N. Failure of the interaction between presenilin 1 and the substrate of gamma-secretase to produce Abeta in insect cells // J. Neurochem. 2002. Vol. 83, 2. P. 390-399.

128. Puglielli L., Ellis B.C., Saunders A.J., Kovacs D.M. Ceramide stabilizes (3 -site Amyloid precursor protein- cleaving enzyme 1 and promotes amyloid P -peptide biogenesis // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 19777-19783.

129. Qin S., Inazu Т., Yamamura H. Activation and tyrosine phosphorylation of p72syk as well as calcium mobilization after hydrogen peroxide stimulation in peripheral blood lymphocytes // Biochem. J. 1995. Vol. 308, 1. P. 347352.

130. Quadros A., Patel N., Crescentini R., Crawford F., Paris D., Mullan M. Increased TNFalpha production and Cox-2 activity in organotypic brain slice cultures from APPsw transgenic mice // Neurosci. Lett. 2003. Vol. 353, l.P. 66-68.

131. Redmond A.M., Kelly J.P., Leonard B.E. Behavioural and neurochemical effects of dizocilpine in the olfactory bulbectomized rat model of depression //Pharmacol. Biochem. Behav. 1997. Vol. 58, 2. P. 355-359.

132. Retz W., Gsell W., Munch G., Rosier M., Riederer B. Free radicals in Alzheimer's disease // J. Neural. Transm. Suppl. 1998. Vol. 54, 3. P. 221236.

133. Robichaud M., Beauchemin V., Lavoie N., Dennis Т., Debonnel G. Effects of bilateral olfactory bulbectomy on N-methyl-D-aspartate receptor function: autoradiographic and behavioral studies in the rat // Synapse. 2001. Vol.42,2. P. 95-103.

134. Rossi F., Bianchini E. Synergistic induction of nitric oxide by beta-amyloid and cytokines in astrocytes // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1996. Vol. 225,2. P. 474-478.

135. Ruberg M., France-Lanord V., Brugg В., Lambeng N., Michel P.P., Anglade P., Hunot S., Damier P., Faucheux В., Hirsch E., Agid Y.

136. Neuronal death caused by apoptosis in Parkinson disease // Rev. Neurol. (Paris) 1997. Vol. 153. P. 499-508.

137. Ryffel B. Pathology induced by inflammatory cytokines. Introduction // Int. Rev. Exp. Pathol. 1993. Vol. 34. P. 3-6.

138. Sarchielli P., Orlacchio A., Vicinanza F., Pelliccioli G.P., Tognoloni M., Saccardi C., Gallai V. Cytokine secretion and nitric oxide production by mononuclear cells of patients with multiple sclerosis // J. Neuroimmunol. 1997. Vol. 80. P. 76-86.

139. Sastry P.S., Rao K.S. Apoptosis and the nervous system // J Neurochem. 2000. Vol. 74, 1. P. 1-20.

140. Savage M.J., Lin Y.G., Ciallella J.R., Flood D.G., Scott R.W. Activation of c-Jun N-terminal kinase and p38 in an Alzheimer's disease model isassociated with amyloid deposition // J. Neurosci. 2002. Vol. 22, 9. P. 3376-3385.

141. Schapira A.H. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegeneration // Curr. Opin. Neurol. 1996. Vol. 9, 4. P. 260-264.

142. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: a central role for amyloid // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1994. Vol. 53, 5. P. 438-447.

143. Seidl R., Fang-Kircher S., Bidmon В., Cairns N., Lubec G. Apoptosis-associated proteins p53 and APO-l/Fas (CD95) in brains of adult patients with Down syndrome // Neurosci. Lett. 1999. Vol. 260, 1. P. 9-12.

144. Shen Y., Li R., Shiosaki K. Inhibition of p75 tumor necrosis factor receptor by antisense oligonucleotides increases hypoxic injury and beta-amyloid oxicity in human neuronal cell line // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, 6. P. 3550-3553.

145. Shinpo K., Kikuchi S., Moriwaka F., Tashiro K. Protective effects of the TNF-ceramide pathway against glutamate neurotoxicity on cultured mesencephalic neurons // Brain. Res. 1999. Feb. P. 170-173.

146. Shoji M., Iwakami N., Takeuchi S., Waragai M., Suzuki M., Kanazawa I., Lippa C.F., Ono S., Okazawa H. JNK activation is associated with intracellular beta-amyloid accumulation // Brain Res. Mol. Brain Res. 2000. Vol.85, 1-2. P. 221-233.

147. Schubert D., Behl C., Lesley R., Brack A., Dargusch R., Sagara Y., Kimura H. Amyloid peptides are toxic via a common oxidative mechanism //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92, 6. P. 1989-1993.

148. Singh I., Pahan K., Khan M, Singh A.K. Cytokine-mediated Induction of Ceramide Production Is Redox-sensitive // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 20354-20362.

149. Slotte J.P., Jungner M., Vilcheze C., Bittman R. Effect of sterol side-chain structure on sterol-phosphatidylcholine interactions in monolayers and small unilamellar vesicles // Biochim. Biophys Acta. 1994. Vol. 1190, 2. P. 435-443.

150. Smale G., Nichols N.R., Brady D.R., Finch C.E., Horton W.E. Evidence for apoptotic cell death in Alzheimer's disease // Exp Neurol. 1995. Vol. 133,2. P. 225-230.

151. Soderberg M., Edlund C., Alafuzoff I., Kristensson К and Dallner G. Lipid composition in different regions of the brain in Alzheimer's disease/seniledementia of Alzheimer's type // J. Neurochem. 1992. Vol. 59. P. 1646-1653.

152. Steiner H., Haass C. Intramembrane proteolysis by presenilins // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 1, 3. P. 217-224.

153. Su J.H., Anderson A.J., Cummings B.J., Cotman C.W. Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease // Neuroreport. 1994. Vol. 5, 18. P. 2529-2533.

154. Suo Z., Tan J., Placzek A., Crawford F., Fang C., Mullan M. Alzheimer's beta-amyloid peptides induce inflammatory cascade in human vascular cells: the roles of cytokines and CD40 // Brain Res. 1998. Vol. 807, 1-2. P. 110-117.

155. Susen K., Blochl A. Low concentrations of aggregated beta-amyloid induce neurite formation via the neurotrophin receptor p75 // J. Mol. Med. 2005. Vol. 83, 9. P. 720-735.

156. Sweeney W.A., Luedtke J., McDonald M.P., Overmier J.B. Intrahippocampal injections of exogenous beta-amyloid induce postdelay errors in an eight-arm radial maze // Neurobiol. Learn. Mem. 1997. Vol. 68, l.P. 97-101.

157. Tamatani M., Che Y.H., Matsuzaki H., Ogawa S., Okado H., Miyake S., Mizuno Т., Tohyama M. Tumor necrosis factor induces Bci-2 expression through NFkB activation in primary hippocampal neurons // J. Biol. Chem. 1999. Vol.274, 13. P. 8531-8538.

158. Tanaka S., Takehashi M., Matoh N., Iida S., Suzuki Т., Futaki S., Hamada

159. H., Masliah E., Sugiura Y., Ueda K. Generation of reactive oxygen species and activation of NF-kappaB by non-Abeta component of Alzheimer's disease amyloid // J. Neurochem. 2002. Vol. 82, 2. P. 305-315.

160. Tarkowski E., Blennow K., Wallin A., Tarkowski A. Intracerebral production of tumor necrosis factor-alpha, a local neuroprotective agent, in Alzheimer disease and vascular dementia // J. Clin. Immunol. 1999. Vol. 19,4. P. 223-230.

161. Terai K., Matsuo A., McGeer P.L. Enhancement of immunoreactivity for NF-kappa В in the hippocampal formation and cerebral cortex of Alzheimer's disease // Brain Res. 1996. Vol. 735, 1. P. 159-168.

162. Thomas Т., Thomas G., McLendon C., Sutton Т., Mullan M. beta-Amyloid-mediated vasoactivity and vascular endothelial damage // Nature. 1996. Vol.380, 6570. P. 168-171.

163. Thorburne S.K., Juurlink B.H. Low glutathione and high iron govern the susceptibility of oligodendroglial precursors to oxidative stress // J. Neurochem. 1996. Vol. 67, 3. P. 1014-1022.

164. Troy C.M., Rabacchi S.A., Xu Z., Maroney A.C., Connors T.J., Shelanski M.L., Greene L.A. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation // J. Neurochem. 2001. Vol. 77, 1. P. 157164.

165. Tsukamoto E., Hashimoto Y., Kanekura K., Niikura Т., Aiso S., Nishimoto

166. Characterization of the toxic mechanism triggered by Alzheimer's amyloid-beta peptides via p75 neurotrophin receptor in neuronal hybrid cells // J. Neurosci. Res. 2003. Vol. 73, 5. P. 627-636.

167. Tuppo E.E., Forman L.J. Free radical oxidative damage and Alzheimer's disease//J. Am. Osteopath. Assoc. 2001. Vol. 101, 12. P. 11-15.

168. Urmoneit В., Turner J., Dyrks T. Cationic lipids (lipofectamine) and sphingomyelin distribution modulates gamma-secretase activity within amyloid precursor protein in vitro // Prostaglandins Other Lipid Mediat. 1998. Vol. 55,5-6. P. 331-343.

169. Varadarajan S., Yatin S., Aksenova M., Butterfield D.A. Rewiew: Alzheimer's amyloid b-peptide-associated free radical oxidative stress and neurotoxicity//J. Structural Biol. 2000. Vol. 130. P. 184-208.

170. Varadarajan S., Kanski J., Aksenova M., Lauderback C., Butterfield D.A. Different mechanisms of oxidative stress and neurotoxicity for Alzheimer's A beta(l-42) and A beta(25-35) // J. Am. Chem. Soc. 2001. Vol. 123, 24. P. 5625-5631.

171. Vassali P. The pathophysiology of tumor necrosis factor // Annual Rev, Immunol. 1992. Vol. 10. P. 411-452.

172. Venable M.E., Lee J.Y., Smyth M.J., Bielawska A., Obeid L.M. Role of ceramide in cellular senescence // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, 51. P. 30701-30708.

173. Verdier Y., Zarandi M., Репке B. Amyloid beta-peptide interactions with neuronal and glial cell plasma membrane: binding sites and implications for Alzheimer's disease // J. Pept. Sci. 2004. Vol. 10, 5. P. 229-248.

174. Verdier Y., Репке В. Binding sites of amyloid beta-peptide in cell plasma membrane and implications for Alzheimer's disease // Curr. Protein Pept. Sci. 2004. Vol. 5, l.P. 19-31.

175. Viel J.J., McManus D.Q., Smith S.S., Brewer G.J. Age- and concentration-dependent neuroprotection and toxicity by TNF in cortical neurons from beta-amyloid //J. Neurosci. Res. 2001. Vol. 64, 5. P. 454-465.

176. Wallace M.N., Geddes J.G., Farquhar D.A., Masson M.R. Nitric oxide synthase in reactive astrocytes adjacent to beta-amyloid plaques // Exp. Neurol. 1997. Vol. 144, 2. P. 266-272.

177. Xu J., Chen S, Ahmed S.H., Chen H., Ku G., Goldberg M.P., Hsu C.Y. Amyloid-beta peptides are cytotoxic to oligodendrocytes // J. Neurosci. 2001. Vol. 21, l.P. 118-125.

178. Yankner B.A., Dawes L.R., Fisher S., Villa-Komaroff L., Oster-Granite M.L., Neve R.L. Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated with Alzheimer's disease // Science. 1989. Vol. 245, 4916. P. 417-420.

179. Yao Z.X., Drieu К., Szweda L.I., Paradopoulos V. Free radicals and lipid peroxidation do not mediate beta-amyloid- induced neuronal cell death // Brain. Res. 1999. Vol. 847, 2. P. 203-210.

180. Yao M., Nguyen T.V., Pike C.J. Beta-amyloid-induced neuronal apoptosis involves c-Jun N-terminal kinase-dependent downregulation of Bcl-w // J. Neurosci. 2005. Vol. 25, 5. P. 1149-1158.

181. Yatin S.M., Varadarajan S., Link C.D., Butterfield D.A. In vitro and in vivo oxidative stress associated with Alzheimer's amyloid beta-peptide (1-42)//Neurobiol. Aging. 1999. Vol. 20, 3. P. 325-330.

182. Yin D., Kondo S., Barnett G.H., Morimura Т., Takeuchi J. Tumor necrosis factor-alpha induces p53-dependent apoptosis in rat glioma cells // Neurosurgery. 1995. Vol. 37, 4. P. 758-762.

183. Yoshiyama Y., Arai K., Hattori T. Enhanced expression of I-kappaB with neuropathology in Alzheimer's disease // Neuroreport. 2001. Vol. 12, 12. P. 2641-2645.

184. Yuan C., Furlong J., Burgos P., Johnston L.J. The size of lipid rafts: an atomic force microscopy study of ganglioside GM1 domains in sphingomyelin/DOPC/cholesterol membranes // Biophys. J. 2002. Vol. 82, 5. P. 2526-2535.

185. Zeng C., Lee J.T., Chen H., Chen S., Hsu C.Y., Xu J. Amyloid-beta peptide enhances tumor necrosis factor-alpha-induced iNOS through neutral sphingomyelinase/ceramide pathway in oligodendrocytes // J. Neurochem. 2005. Vol. 94, 3. P. 703-712.

186. Zhang P., Hogan E.L., Bhat N.R. Activation of JNK/SAPK in primary glial cultures: II. Differential activation of kinase isoforms corresponds to their differential expression//Neurochem. Res. 1998. Vol. 23. P. 219-225.

187. Zhang Y., Kolesnick R. Signaling through the sphingomyelin pathway // Endocrinology. 1995. Vol. 136. P. 4157-4160.

188. Zhang Y., McLaughlin R., Goodyer C., LeBlanc A. Selective cytotoxicity of intracellular amyloid beta peptidel-42 through p53 and Bax in cultured primary human neurons//J. Cell. Biol. 2002. Vol. 156, 3. P. 519-529.

189. Jaffrezou J.P., Maestre N., de Mas-Mansat V., Bezombes C., Levade Т., Laurent G. Positive feedback control of neutral sphingomyelinase activity by ceramide // FASEB J. 1998. Vol. 12, 11. P. 999-1006.

Информация о работе

Бугрова, Анна Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Роль сигнальной системы сфингомиелинового цикла в развитии болезни Альцгеймера - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы