Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP

Серебряная, Дарья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP"

На правах рукописи

Серебряная Дарья Владимировна

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ АСПЕКТОВ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИОЗИНА II В МЫШЕЧНОМ СОКРАЩЕНИИ И КЛЕТОЧНОЙ ПОДВИЖНОСТИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА КНР

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский Кардиологический научно-производственный комплекс» Росдрава РФ

Научный руководитель: Научный консультант:

кандидат биологических наук

A.B. Воротников

доктор биологических наук, профессор

B. П. Ширинский

Официальные оппоненты

доктор биологических наук О.С. Тарасова

кандидат биологических наук А.Ю. Александрова

Ведущая организация:

Институт биологии развития РАН имени Н.К. Кольцова

Защита состоится 26 октября в 11 часов на заседании Диссертационного совета К.208.073.02 в РКНПК Росздрава по адресу Москва, 121552, Зя Черепковская ул., д 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Автореферат разослан 25 сентября 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Двигательная активность является фундаментальным свойством всех клеток животных. В специализированных мышечных клетках она проявляется в виде их сократительной активности, а в немышечных клетках — в их пространственном перемещении, или миграции. Эти процессы играют ключевую роль в репарации тканей, ремоделировании, ангиогенезе, иммунном ответе и патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний. Поэтому исследование механизмов регуляции двигательной активности клеток необходимо и актуально как с фундаментальной, так и с прикладной биомедицинской точки зрения.

Одним из базовых принципов клеточной подвижности является функционирование миозина II как внутриклеточного молекулярного мотора. Активность «несаркомерных» миозинов немышечных клеток и гладких мышц контролируется фосфорилированием остатка Ser19 регуляторных легких цепей (РЛЦ). Это фосфорилирование выполняет одновременно две функции: с одной стороны, активируя АТФ-азную (моторную) активность миозина, а с другой -приводя к полимеризации его молекул в филаменты. Обе функции необходимы для образования функционального актомиозина и развития сокращения. В клетках обнаружены несколько киназ РЛЦ миозина, основными из которых являются Са2+-зависимая киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) и ряд Са2+-независимых протеинкиназ, к которым относятся Rho-зависимая киназа (Rho-киназа), интегрин-ассоциированная протеинкиназа (ILK) и Zip-киназа. Дефосфорилирование миозина осуществляется под действием фосфатазы РЛЦ миозина (ФЛЦМ). Баланс активностей киназ и ФЛЦМ определяет внутриклеточный уровень фосфорилирования РЛЦ и двигательную активность гладких мышц и немышечных клеток.

В гладких мышцах миозин II в основном находится в филаментарном состоянии. В связи с этим, фосфорилирование Ser19 РЛЦ реализует в гладкой мускулатуре, главным образом, функцию активации миозинового мотора и сокращения. Напротив, в немышечных клетках, где значительная доля миозина II представлена мономерами, фосфорилирование РЛЦ необходимо не только для активации АТФазной активности миозина, но и для образования его филаментарных структур. Известно, что моторная функция миозина II играет ведущую роль в движении клеток, в то время как значение структурной организации и динамики филаментов немышечного миозина в этом процессе остается неясным.

Трудность определения вклада структурной организации миозина II в клеточную подвижность связана с невозможностью разобщения эффектов фосфорилирования РЛЦ на полимеризацию миозина II и активацию его моторной функции. В настоящей работе мы

применили два подхода с использованием свойств белка KRP (Kinase Related Protein, телокин), который представляет собой независимо экспрессирующийся только в гладких мышцах С-концевой домен КЛЦМ. Этот белок взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозинами in vitro и подавляет фосфорилирование Ser19 РЛЦ, но вызывает полимеризацию миозина в филаменты (Shirinsky et al., 1993). Используя препараты гладких мышцах мы, во-первых. установили эффект KRP только на моторную функцию миозина. Во-вторых, в системе немышечных клеток мы использовали способность KRP разобщать эффекты фосфорилирования РЛЦ на полимеризацию и моторную активность миозина. Учитывая, что общие принципы сократимости актомиозина одинаковы в гладких мышцах и немышечных клетках, сравнительный анализ двигательных реакций актомиозина в этих двух системах позволил нам вычленить значимость структурной динамики миозина II в клеточной подвижности.

Целью нашего исследования было выяснение механизма функционирования миозина II с использованием двух экспериментальных систем и белка KRP в качестве инструмента для разобщения структурной и моторной составляющих активности миозина. В модели трансгенных фибробластов мы исследовали действие K.RP на актомиозин-зависимую клеточную подвижность, а в модели скицированных гладких мышц — избирательное действие KRP на сократительные свойства актомиозина. В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать влияние KRP на сократимость скинированных гладкомышечных волокон.

2. Получить линии трансгенных фибробластов, экспрессирующих белок KRP и измерить уровень фосфорилирования и содержание полимерного миозина II в этих клетках.

3. Исследовать двигательный фенотип трансгенных фибробластов.

4. Исследовать влияние селективных ингибиторов протеинкиназ на хемотаксис и уровень фосфорилирования миозина II в трансгенных клетках.

5. Установить вклад С-концевой миозин-связывающей последовательности KRP в регуляцию состояния миозина II и миграцию трансгенных клеток, а также сократимость скинированных волокон.

Научная новизна работы. В ходе данной работы впервые обнаружено, что белок KRP ингибирует сокращение гладкой мускулатуры и фосфорилирование РЛЦ миозина, осуществляемое Са2+-независимыми протеинкиназами, за счет связывания с миозином. Установлено, что в трансгенных фибробластах белок KRP является регулятором активности

миозина II и активирует двигательную активность фибробластов. Определено, что мишенью KRP в клетке является миозин, регулируемый КЛЦМ и, возможно, Zip-киназой. С помощью сравнительного анализа эффектов KRP на сократимость гладких мышц и двигательные реакции фибробластов мы установили, что структурная составляющая активности миозина II играет критическую роль в реализации клеточной подвижности.

Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы вносят значительный вклад в понимание механизмов функционирования миозина II и объясняют некоторые феномены клеточной подвижности. Получена новая информация о механизмах клеточной подвижности в целом, которая может служить основой для разработки новых подходов для коррекции как сократительных, так и двигательных реакций клеток.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных симпозиумах «Biological motility» (Пущино, Россия, 2004), «Biological motility: basic research and practice» (Пущино, Россия, 2006), XII конференции «Ломоносов-2005» (Москва, Россия, 2005), а также на 34-ой и 35-ой Европейских мышечных конференциях (Дебрецен, Венгрия, 2005; Гейдельберг, Германия, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 31 рисунком. Диссертация изложена на 130 страницах. Список литературы включает 208 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение концентрации белков. Концентрацию KRP человека определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции (Е28о нм1 мг/мл) равным 0.77 (Shirinsky et al, 1993). Концентрацию других белков определяли по методу Bradford (1976).

Разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН'). Очищенные белки, клеточные лизаты и экстракты тканей подвергали электрофорезу в пластинах 7.5-15% ПААГ по методу Laemmli (1970). Клетки выращивали до 8090% от конфлюэнтного монослоя, промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) и лизировали на льду трехкратным буфером для нанесения образцов. Замороженные препараты интактных гладких мышц, или фиксированные в 95% ацетоне скинированные волокна экстрагировали трехкратным буфером для нанесения образцов. Все пробы центрифугировали (20 мин, 15000 g) и кипятили 3 минуты. Для окраски гелей Кумасси нагрузка дорожек составляла 0.5

- 3 мкг для очищенных белков и 20-30 мкг общего белка для лизатов клеток и тканевых

экстрактов. В случае последующего иммуноблоттинга наносили 3 - 200 нг очищенного белка, а количество клеточных и тканевых образцов подбирали экспериментально.

Мочевинно-глицерольный электрофорез. Для оценки степени фосфорилирования миозина образцы гладкомышечных волокон и фибробластов анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии 6 М мочевины и 15% глицерола согласно Lubomirov et al (2006). Гладкомышечные волокна (200 мкм/5 мм) фиксировали на льду 10 минут в 15% ТХУ, содержащей 2% пирофосфат, после чего промывали 3-4 раза 95 % ацетоном. Затем ткань гомогенизировали в буфере для нанесения образцов, инкубировали 1 час при комнатной температуре, снова гомогенизировали и центрифугировали (2 мин, 15000 g). Пробы повторно инкубировали 1 час при комнатной температуре и использовали для электрофореза. Фибробласты культивировали до 80-90% от конфлюэнтного монослоя, промывали ФСБ, и фиксировали 3 минуты в 15% ТХУ на льду. Осадок клеток собирали, центрифугировали (3 мин, 10000 g) и растворяли в буфере для нанесения.

Иммуноблоттинг. Иммуноблоттинг проводили по методу (Towbin et al, 1979) с модификациями. Электроперенос (80 V/350 мА) после ДСН-электрофореза проводили на мембраны PVDF: KRP - в течение 1 часа в 10 мМ CAPS, рН 11.0, 10% этанол, другие белки — в течение 1 - 4 часов в 25 мМ трис, 180 мМ глицин, рН 8.3, 20% этанол, 0.1% ДСН. Электроперенос после мочевинно-глицерольного электрофореза осуществляли на нитроцеллюлозную мембрану в 25 мМ трис, 192 мМ глицин рН 8.6 и 20% метанол в течение ночи при 50 мА. Мембраны блокировали 1 час при комнатной температуре (или в течение ночи при +4°С) в 5% растворе обезжиренного молока в буфере ТСБ-Т (20 мМ трис- НС1, рН 7.6, 165 мМ NaCl, 0.05% Твин-20). Инкубацию как с первичными, так и с вторичными антителами (коньюгаты антител с пероксидазой хрена) проводили 1 час при комнатной температуре в растворе 1% обезжиренного молока в ТСБ-Т. Препараты первичных и вторичных антител использовали в разведениях, рекомендованных производителем. В работе были использованы антитела к КЛЦМ (клон К36), глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (ГАФД) и РЛЦ (все - Sigma, США), к немышечному миозину II В (Covance, США), Rho-киназе (Bethyl, США), Zip-киназе (eBioscience, США), ILK (Stressgen, Канада), шус-эпитопу (Invitrogen, США), MYPT (Abeam, Великобритания), KRP (Хапчаев, 2004) и фосфорилированным по остатку Ser19 РЛЦ (Goncharova et al, 2002), а также наборы вторичных антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (Amersham, Великобритания и Pierce,США). Белковые полосы выявляли с помощью хеминилюминесцентной реакции (Amersham, Великобритания) или 3,3-диаминобензидина (ДАБ).

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. Бактериальную экспрессию белков

проводили в клетках E.coli штамм BL21(DE3). Экспрессию индуцировали изопропил-P-D-

тиогалактопиранозидом (3 мМ) при достижении плотности культуры Абоо=0.3-0.4. Через 3 часа клетки осаждали центрифугированием (5000g, 20 минут), ресуспендировали в 20 мл буфера (25% сахароза, 0.2 М КС1, 30 мМ трис-HCl, рН 8.0, 0.2 мМ ингибитор трипсина ТРСК, 0.5 мМ смеси ингибиторов протеаз AEBSF, 10 мМ р-меркаптоэтанол, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ЭГТА). Клетки разрушали с помощью обработки ультразвуком (Branson SONIFIER 450, Branson Ultrasonics Corp., США). Полученный лизат центрифугировали (9000 g, 20 мин) и из надосадочной жидкости выделяли рекомбинантные KRP и его мутантные формы по методу Ito et al (1989) с модификациями. Белки высаливали в диапазоне 40-60% насыщения (NH4)2S04. Осадок диализовали против 30 мМ КС1, 30 мМ трис-HCl, рН 7.5, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.1 мМ AEBSF, наносили на колонку DEAE-Sepharose (Pharmacia, США) и элюировали линейным градиентом 0 — 0.6 М градиентом NaCl. Фракции, содержащие KRP или его мутантные формы, объединяли, диализовали против 2 М (NH4)2S04, 1 мМ СаС12, 30 мМ трис-804, рН 7.5, 20 мМ Р-меркаптоэтанол и проводили хроматографию на Phenyl-Sepharose (Pharmacia, США), элюируя ниспадающим 2.0 — 0.0 М градиентом (NH4)2S04. Затем фракции, содержащие KRP или его мутантные формы, диализовали против МРВ (10 мМ MOPS, рН 7.0, 1мМ MgCl2, 0.1 мМ EGTA, 20 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ)) и концентрировали на концентраторах фирмы Pierce (США). Очищенные белки хранили в аликвотах при -20°С. Фильтрат, полученный при концентрировании белка, использовали как контрольный буфер для измерения сократительной активности гладкомышечных волокон (см. ниже).

Получение KRP и ACKRP, меченых 5'-TMRIA. Растворы KRP или ACKRP (KRP с делецией С-концевого миозин-связывающего домена) инкубировали в концентрации 1 мг/мл с 20 мМ ДТТ в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего диализовали в течение ночи против 30 мМ КС1, 10 мМ имидазола (рН 6.5), 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 0.1 мМ ДТТ. Затем раствор инкубировали с 10-кратным избытком 5'-TMRIA (тетраметилродамин-5-йодацетамид-дигидроиодидом) 4 часа в темноте при перемешивании при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2 мМ ДТТ. После этого раствор белка диализовали против МРВ, концентрировали и хранили при -20°С.

Создание молекулярно-генетических конструкций. Для постоянной экспрессии KRP в клетках, последовательности кДНК KRP и ACKRP были амплифицированы методом ПЦР с использованием 5'-праймера 5'tatagatctccatggcaatgatctcagggc3' и З'-праймеров 5'gctagttattgctcagcggtggc3' и 5'aaactcgagctaaagctctgctgtgcaggtg3,' для KRP и ACKRP, соответственно, и переклонированы в вектор pCMV/c-myc/cyto. Клонирование проводили по рестриктным сайтам Neo I и Xho I таким образом, чтобы отус-эпитоп (QQKL1SQEDL) оказался на С-конце KRP и ACKRP. Для переклонирования ACKRP в вектор рЕТ28а+ его последовательность

была амплифицирована методом ПЦР с использованием 5'-праймера 5'tatagatctccatggcaatgatctcagggc3' и З'-праймера 5'aaactcgagctaaagctctgctgtgcaggtg3'. Клонирование проводили по рестриктным сайтам Neo I и Xho I. Правильность полученных конструктов была подтверждена секвенированием.

Культивирование ЗТЗ фибробластов. Фибробласты мыши линии NIH3T3 (CRL-1658, АТСС) культивировали в среде роста DMEM с 2 мМ L-глутамином, 100 ед/мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином и 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) при 37°С и 5% С02 соответствии со стандартным протоколом АТСС (http://www.atcc.org).

Транзиторная трансфекция. ЗТЗ фибробласты трансфицировали плазмидами pCMV/KRP/c-myc/cyto и pCMV/ACKRP/c-myc/cyto, используя набор реагентов Unifectin-21(Пеплайн, Россия). Для определения количества трансфицированных клеток параллельно проводили трансфекцию плазмидой pCMV/GFP/c-myc/cyto. Эффективность трансфекции оценивали по флуоресценции GFP-позитивных клеток.

Постоянная трансфекция. Для получения трансгенных ЗТЗ фибробластов, стабильно экспрессирующих KRP и ACKRP, клетки трансфицировали плазмидами pCMV/KRP/c-myc/cyto и pCMV/ACKRP/c-myc/cyto (см.выше). Для получения контрольных mock клонов, устойчивых к G418, но не экспрессирующих исследуемого белка, фибробласты трансфицировали плазмидой pCMV/c-myc/cyto. Через 36 часов клетки трипсинизировали и делали серийные разведения клеточной суспензии (от 10% до 0,01%) в DMEM с G418 (600 мкг/мл). Затем клетки высаживали на 96-луночные планшеты и выращивали на DMEM с 10% ЭТС, содержащей антибиотик G418 (600 мкг/мл). После гибели нетрансфицированных клеток отмечали лунки, в которых образовалась только одна клеточная колония. Далее колонии культивировали до 80-90% от конфлюэнтного монослоя и затем последовательно высаживали на 24-х-луночный планшет, 6-луночный планшет, 35 мм чашку, 60 мм чашку и, наконец, на 100 мм чашку. Отобранные клоны анализировали на содержание KRP и ACKRP методом иммуноблоттинга. Клетки клонов, экспрессирующие KRP и ACKRP, замораживали и хранили в жидком азоте.

Определение внутриклеточной концентрации KRP, ACKRP и миозина II в трансгенных ЗТЗ фибробластах. Лизаты клонов фибробластов, содержащих KRP и ACKRP с известной концентрацией клеток, анализировали методом количественного иммуноблоттинга с помощью поликлональных антител KRP, используя рекомбинантный KRP человека в качестве стандарта, и определяли количество KRP в одиночной клетке. Внутриклеточную концентрацию KRP рассчитывали, измеряя средний объем ЗТЗ фибробласта под микроскопом. Внутриклеточную концентрацию миозина определяли по аналогичной схеме, используя в качестве стандарта гладкомышечный миозин курицы.

Миграция в камере Бойдена. Миграцию клонов ЗТЗ фибробластов, экспрессирующих KRP, проводили в камере Бойдена 3 часа при 37° С. Мембрану для миграции предварительно дегазировали и покрывали коллагеном I типа. В качестве контроля использовали исходные ЗТЗ фибробласты и mock клоны. В качестве хемоаттрактанта использовали DMEM с 10% ЭТС. Для проведения эксперимента клетки выращивали до 60 — 80 % от конфлюэнтного монослоя и выдерживали сутки в DMEM с 0.5% ЭТС. Затем фибробласты трипсинизировали и проводили подсчет клеток. В каждую лунку вносили 1х105 клеток, суспендированных в бессывороточной среде. Через 3 часа мембрану фиксировали 96% этанолом в течение 5 минут, удаляли непромигрировавшие клетки и окрашивали с использованием красителя Diff Quick 5 минут.

Адгезия. Адгезию клонов ЗТЗ фибробластов, постоянно экспрессирующих KRP, измеряли по методу (Arefieva et al, 2001). В качестве контроля использовали исходные ЗТЗ фибробласты и mock клоны. Клетки выращивали до 80-90% конфлюэнтного монослоя, после чего выдерживали сутки в ДМЕМ с 0.5% ЭТС. 96-луночные планшеты предварительно покрывали раствором коллагена I типа. В каждую ячейку вносили ДМЕМ с 10% ЭТС (200 мкл), и затем по 50000 клеток. Адгезию клеток проводили 40 минут при 37°С. Неприкрепившиеся клетки смывали ФСБ, а клетки, оставшиеся на планшете, фиксировали 96% этанолом 5 минут и окрашивали 20 минут красителем Гематоксилин-Эозин.

Миграция клеток в «рану». Фибробласты выращивали до 95% конфлюэнтного монослоя и повреждали поверхность клеточного слоя скребком толщиной 0.5 мм. Клетки оставляли в инкубаторе при 37°С и 5% С02. За миграцией клеток в «царапину» следили, фотографируя изображения царапины через 24-часовые интервалы после повреждения клеточного слоя, используя микроскоп Zeiss Axiovert 200М (Оберховен, Германия), оснащенный AxioCam CCD камерой и программным обеспечением Axiovision v. 3.1. В качестве контроля сравнения использовали свежую «царапину».

Экстракция растворимого миозина из клеток Тритоном Х-100. Фибробласты выращивали до монослоя, промывали ФСБ и экстрагировали растворимый миозин 10 минут при +4° С в растворе ФСБ, с добавлением 0.2% Тритона Х-100, 1 тМ ванадата натрия и 0.02% смеси ингибиторов протеаз (Roche, США). В экстракты добавляли двукратный буфер для образцов по Лэммли. Нерастворимые цитоскелетные фракции фибробластов, содержащие филаментный миозин, промывали ФСБ и растворяли в двукратном буфере для образцов по Лэммли. Затем препараты кипятили в течение 5 минут и хранили при -70° С.

Пермеабилизация гладких мышц taenia caeci под действием Тритона Х-100. Волокна taenia caeci вырезали из гладкомышечного слоя ободочного кишечника морской свинки, препарировали и монтировали в изометрическом режиме в растворе, содержащем 118 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1.2 мМ Na2HP04, 1.2 мМ MgCl2, 1.6 мМ СаС12, 24 мМ Hepes pH 7.4, 10 мМ глюкозы.

Затем волокна инкубировали 30 минут в растворе 1 (20 мМ имидазол рН 7.4, 5 мМ EGTA, 50 мМ КС1, 150 мМ сахароза, 2 мМ ДТТ) при +4°С при перемешивании. Далее их переводили в раствор 2 для пермеабилизации (скинирования), приготовленный на растворе 1 с добавлением 1% Тритона Х-100, и выдерживали 4 часа при +4°С при перемешивании. Затем волокна промывали раствором 1 и переводили в раствор 3 для хранения (10 мМ имидазол рН 6.7, 3.75 мМ Na2ATP, 5 мМ MgCl2, 2 мМ EGTA, 0.5 мМ NaN3, 50% глицерол, 2 мМ ДТТ) и инкубировали в течение 15 минут при тех же условиях. Волокна хранили в растворе 3 две-три недели при -20° С.

Измерение сократительной активности taenia caeci. Пермеабилизованные Тритоном Х-100 волокна (200 мкм/5 мм) закрепляли в изометрическом датчике, помещали в камеры объемом 200-1000 мкл с релаксирующим раствором (20 мМ имидазол рН 6.7, 7.5 мМ Na2ATP, 10 мМ MgCl2, 4 мМ EGTA, 1 мМ NaN3, креатинкиназу 140 ед/мл, 10 мМ креатинфосфат, 1 мкМ лейпептин, 2 мМ ДТТ, 0.5 мкМ кальмодуллин), растягивали до развития необходимого потенциала и уравновешивали 15-20 минут. Силу сокращения двух препаратов регистрировали одновременно в двух камерах с помощью изометрических тензодатчиков, оснащенных трансдьюсерами KG7 (Scientific Instruments, Германия) при комнатной температуре. Регистрацию и анализ данных проводили с помощью программного обеспечения Real View v 7.0. Контрольный сократительный ответ вызывали добавлением Са2+-содержащего раствора (рСа 4.54), после чего отмывали волокна релаксирующим раствором до базального уровня. Затем волокна инкубировали с 0.32 мг/мл KRP (30 мкМ) или с его фильтратом (см. выше) в течение 3 часов и стимулировали сокращение глад ком ышечных волокон добавлением 10 мкМ микроцистина.

Приготовление препаратов волокон для конфокальной микроскопии. Скинированные волокна taenia caeci фиксировали изометрически и инкубировали с 30 мкМ меченым 5' — TMRIA KRP (см. выше) в течение 1.5 часов в темноте при комнатной температуре. После этого волокна фиксировали в 4% параформальдегиде, отмывали несколько раз ФСБ и закрепляли на предметных стеклах. Иммунофлуоресцентный сигнал визуализировали при длине волны Х=560 нм с помощью конфокального микроскопа Zeiss (Германия).

Количественная обработка изображений и статистический анализ. Гели, окрашенные Кумасси R-250, иммуноблоты и мембраны после миграции фибробластов сканировали с помощью сканера Hewlett-Packard HP-IIcx. 96-луночные планшеты после адгезии фотографировали при помощи трансиллюминатора Т 2201 (Sigma, США), оснащенного камерой Kodak и обрабатывали изображение с использованием программы Kodak Digital Science. Для денситометрического и статистического анализов использовали программное обеспечение NIH Image и Microsoft Excel v 5.0 / GraphPad Prism v. 4.0, соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕН И Е

Влияние KRP на сократимость скинированных гладких мышц.

Сократительный аппарат гладких мышц имеет упорядоченное строение, поскольку основной его задачей является обеспечение сокращения. В этой системе миозин II постоянно находится в филаментарном (полимерном) состоянии. Поэтому в гладких мышцах действие KRP на миозин II связано, в основном, с регуляцией его моторной и сократительной активности. Применение модели скинированных гладких мышц, в которой возможна замена эндогенного KRP на экзогенный белок, позволяет селективно исследовать именно этот аспект внутриклеточного действия KRP.

KRP подавляет Са2*-независимое сокращение и фосфорилирование РЛЦ миозина за счет связывания с миозином. KRP рассматривают как негативный регулятор сокращения гладких мышц и фосфорилирования РЛЦ миозина (Silver et al, 1997, Wu et al, 1998, Walker et al, 2001, Choudhuiy et al, 2004, Sobiezhek et al, 2004). Однако механизм действия этого белка в гладкой мускулатуре до конца не определен. Известно, что в условиях in vitro KRP связывается своей С-концевой областью с миозином и препятствует фосфорилированию остатка Ser19 РЛЦ миозина (Silver et al, 1997, Щербакова, 2006). Для того, чтобы проверить реализуется ли этот механизм в гладкой мускулатуре, мы исследовали влияние KRP и его делеционного мутанта, лишенного С-концевого фрагмента (ACKRP), на Са2+-независимое сокращение гладких мышц при полном ингибировании ФЛЦМ под действием микроцистина. В таких условиях сократительный ответ мыщцы и стационарный уровень фосфорилирования РЛЦ обеспечиваются исключительно за счет фосфорилирования миозина под действием РЛЦ-киназ, отличных от КЛЦМ (см. ниже, рис. 2).

Гладкомышечные волокна taenia caeci были предварительно пермеабилизованы Тритоном Х-100, в результате чего эндогенный KRP полностью диффундировал из ткани. Прединкубация таких волокон с экзогенным KRP приводила к появлению выраженной лаг-фазы в ходе развития Са2+-независимого сокращения, вызванного добавлением микроцистина (см. рис.1 А, зеленая кривая) по сравнению с контрольным сокращением (розовая кривая). В отличие от полноразмерного белка, ACKRP не оказывал ингибирующего действия на Са2+ -независимое сокращение (голубая кривая) в присутствии микроцистина. Внедрение KRP в пермеабилизованные волокна вызывало достоверное снижение уровня фосфорилирования РЛЦ миозина на ранних этапах развития сокращения, в то время как ACKRP не изменял уровня фосфорилирования РЛЦ по сравнению с контролем (см. рис. 1Б).

111

фильтрат KRP ДСККР

Рис.1. KRP ингибирует Са2+-независимое сокращение гладких мышц и фосфорилирование РЛЦ миозина, вызванные добавлением микроцистина. А, - скинированные волокна прединкубировали с 30 мкМ KRP, ACKRP или фильтратом в релаксирующем растворе 3 часа, затем инициировали сокращение добавлением 10 мкМ микроцистина. Субмаксимальное сокращение определяли добавлением раствора с рСа 4.54. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, п=7, Б, - скинированные волокна прединкубировали с 30 мкМ KRP, ACKRP или фильтратом в релаксирующем растворе 3 часа, инициировали сокращение добавлением 10 мкМ микроцистина и фиксировали на 25 минуте сокращения, как описано в «Материалах и методах исследования». Затем экстракты волокон подвергали мочевинно-глицерольному электрофорезу. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, п=8, *р<0.05.

Следует отметить, что и KRP, и ACKRP обнаруживались в экстрактах taenia caeci после прединкубации с этими белками с помощью специфических антител к KRP, а конфокальная микроскопия препаратов волокон, прединкубированных с KRP и ACKRP, мечеными 5-TMRIA выявила равномерное распределение этих белков в ткани (данные не представлены).

Таким образом, в этой системе KRP связывается с миозином за счет С-концевой последовательности, ингибирует Са2+-независимое фосфорилирование РЛЦ миозина и развитие сокращения гладких мышц.

ZIP-кипаза и ILK могут фосфорилировать РЛЦ миозина в присутствии микроцистина. Для того чтобы выяснить, какие протеинкиназы опосредуют Са2+-независимое сокращение и фосфорилирование РЛЦ миозина в присутствии микроцистина, мы использовали специфические ингибиторы КЛЦМ и Rho-киназы вортманнин и Y-27632, соответственно, а также неспецифический ингибитор всех протеинкиназ стауроспорин. В этих экспериментах только стауроспорин достоверно блокировал развитие Са2+-независимого сокращения в присутствии микроцистина (см.рис 2А). Поскольку КЛЦМ и Rho-киназа выходят из волокон при скинировании (данные иммуноблоттинга не представлены), то полученные данные свидетельствуют о том, что сокращение, вызванное добавлением микроцистина, опосредуется Са2+-независимыми протеинкиназами, отличными от КЛЦМ. Мы предположили, что эти ферменты могут быть представлены Zip-киназой и интегрин-ассоциированной киназой (ILK).

100 -I

onaiaa uuu

Действительно, Zip-киназа и ILK детектировались в taenia caeci до и после пермеабилизации ткани с помощью специфических антител к этим белкам (см. рис. 2Б).

ZIP-кнназа Ш» ——

и....... .. .. <

1 2

_П_I-

рСа 8.0 4.5 8.0 4.5

Рис.2. Zip-киназа и ILK, вероятно, опосредуют Са2+-независимое сокращение и фосфорилирование РЛЦ, вызванное добавлением микроцистина. А, - Волокна подвергали контрольному сокращению как описано в «Материалах и методах исследования», прединкубировали с 10 мкМ вортманином (зеленая кривая), или 10 мкм Y-27632 (красная кривая), или 2 мкМ стауроспорином (синяя кривая), или ДМСО (черная кривая) в течение 15 минут и стимулировали сокращение добавлением 10 мкМ микроцистина. Б, - Содержание Zip-киназы и ILK в taenia caeci до (1) и после (2) пермеабилизации Тритоном Х-100.

Таким образом, можно заключить, что в полном сократительном аппарате клетки KRP связывается с миозином и ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина, под действием разных протеинкиназ, что хорошо согласуется с результатами модельных исследований in vitro, согласно которым KRP затрудняет фосфорилирование РЛЦ миозина под действием КЛЦМ (Silver et al, 1997), а также DAP-киназы (Щербакова, 2006).

Изучение молекулярного механизма действия KRP на модели трансгенных фибробластов.

Цитоскелет немышечных клеток имеет более динамичное строение, чем сократительный аппарат гладких мышц. Большая часть миозина II немышечных клеток находится в растворимой форме. Поэтому в данной системе эффекты KRP могут быть связаны как с моторной активностью миозина II, так и с его структурной организацией. В связи с этим, мы изучили, как принудительная экспрессия KRP в системе немышечных клеток, в норме не экспрессирующих этот белок, повлияет на структуру и уровень фосфорилирования миозина II, а также как это отразится на функционировании двигательного аппарата клеток.

Характеристика трансгенных ЗТЗ фибробластов, стабильно экспрессирующих

КИР. ЗТЗ фибробласты являются удобной моделью для исследования свойств КИР, поскольку обладают хорошо развитым цитоскелетом, яркой способностью к двигательным реакциям и в норме не экспрессируют этот белок. Мы создали трансгенные линии ЗТЗ фибробластов, стабильно экспрессирующие КЯР и его делеционный мутант, лишенный С-концевого миозин-связывающего домена (АСКЯР), имеющие в своем составе тус-эпитоп.

ЗТЗ М1 К2 КЗ К4 ЗТЗ М1 С5 С6 С7

да

анти-ГАФД ДрЩЩ? Ш ** 11?

анти-myc ИЖШ Ы-

Рис.3. Содержание KRP(A) и ACKRP(B) в трансгенных клонах ЗТЗ фибробластов. Лизаты обозначенных на рисунке клонов ЗТЗ фибробластов анализировали специфическими антителами к ГАФД, KRP и /яус-эпитопу.

Нами было отобрано по три клона, экспрессирующих KRP (клоны К2, КЗ, К4) и ACKRP (клоны С5, С6, С7), а также ложнотрансфицированный mock клон Ml. Как показано на рис. 3, ни в исходных фибробластах, ни в контрольных mock клетках KRP не детектировался, тогда как остальные трансфектанты содержали различные, но сопоставимые количества KRP и ACKRP. KRP и ACKRP в этих клонах также детектировались антителами к тус-эпитопу, что свидетельствует о целостности белковых продуктов.

Наиболее вероятно, что немышечный миозин II является прямой мишенью KRP в клетке. Константа диссоциации KRP и миозина II in vitro составляет около 5-10 мкМ, тогда как для ACKRP это значение существенно выше (45,5 мкМ) (Silver et al., 1997). Для эффективного взаимодействия этих белков в клетке необходимо, чтобы их концентрации находились по крайней мере в диапазоне константы диссоцииации их комплексов. Кроме того, во избежание артефактов, связанных со сверхэкспрессией белка, внутриклеточные концентрации KRP и ACKRP должны быть сопоставимы с концентрацией миозина II, так как это наблюдается в клетках организма (Хапчаев и др., 2004). Поэтому мы определили внутриклеточные концентрации миозина II, KRP и ACKRP во всех полученных линиях клеток. Как видно из результатов (см. табл.1), в полученных нами трансгенных фибробластах не происходит сверхэкспрессии KRP и ACKRP, а их содержание (за исключением клона С6) соизмеримо с концентрацией миозина II.

Таблица 1. Цитоплазматические концентрации KRP и миозина и ожидаемое количество комплекса миозин-KRP в ЗТЗ фибробластах.

Клон Ml К2 КЗ К4 С5 С7 С6

KRP, мкМ 0 2,4 ± 0,3 2,1 ±0,2 3,6 ± 0,4 2,1 ± 0,2 2,5 ± 0,2 0,6±0.3

Миозин II, мкМ 4,9 ± 1,5

Ожидаемый % миозина в комлексе с KRP *) 0 15 10 21 3 4 0

Данные представлены как среднее значение (п=3)±стандартное отклонение.

*). Теоретически рассчитанная доля внутриклеточного миозина (в %), образующего комплекс с KRP в клетках, принимая константы связывания KRP с миозином - 9.5 мкМ, ACKRP с миозином - 45.5 мкМ (Silver et al., 1997), а также определенные экспериментально внутриклеточные концентрации этих белков.

Теоретический расчет показывает, что в разных клонах 10-20% внутриклеточного миозина И может формировать комплекс с KRP (см. табл.1). При этом теоретическое количество комплекса ACKRP-миозин в трансгенных фибробластах крайне мало. Таким образом, полученные результаты позволяют предложить, что в созданной нами трансгенной системе KRP, в отличие от ACKRP, может взаимодействовать с миозином II и влиять на его функциональное состояние.

KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина в трансгенных фибробластах. Мы измерили степень фосфорилирования РЛЦ миозина в исходных фибробластах, ЗТЗ-mock и ЗТЗ-KRP фибробластах методом мочевинно-глицерольного электрофореза, позволяющим разделить нефосфорилированные формы РЛЦ от моно- и дифосфорилированных. Оказалось, что доля фосфорилированного миозина в фибробластах невелика и представлена только монофосфорилированной формой. В контрольных клетках доля этой формы составила 20.8%, тогда как в фибробластах, экспрессирующих KRP, она была значительно снижена (см. рис.4А). В связи с тем, что низкая чувствительность этого метода не позволила нам установить эту величину, для ее определения мы использовали более точный в количественном отношении метод, -иммунодетекцию с использованием фосфоспецифических антител против Ser19 (рис.4Б). Было обнаружено, что уровень фосфорилирования Ser19 РЛЦ во всех клонах фибробластов, экспрессирующих KRP, был приблизительно на 60% ниже, чем в контрольных клетках и достоверно от них отличался. Таким образом, экспрессия KRP в ЗТЗ фибробластах приводит к уменьшению степени фосфорилирования РЛЦ с 20.8% до 9% от общего пула миозина II.

Следует отметить, что принудительная экспрессия КИР в ЗТЗ фибробластах не изменяла содержания основных белков-регуляторов фосфорилирования миозина II, таких как КЛЦМ, Ию-киназа и ФЛЦМ (данные не представлены). Это позволяет считать, что влияние КЯР на фосфорилирование РЛЦ связано только с экспрессией этого белка.

Рис.4. KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина в трансгенных ЗТЗ фибробластах. А, -

иммуноблот лизатов ЗТЗ-mock (Ml) и 3T3-KRP (К4) фибробластов после мочевинно-глицерольного электрофореза. Для определения положения фосфорилированных РЛЦ миозина в геле использовали лизат фибробластов, стимулированных 30% ЭТС (маркер). Б, - лизаты клеток обозначенных на рисунке клонов фибробластов анализировали антителами к фосфорилированному Ser-19 РЛЦ и суммарным РЛЦ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (п=15), *р<0.05.

В фибробластах, экспрессирующих ACKRP, уровень фосфорилирования РЛЦ миозина был близок к таковому у контрольных клеток (см. рис. 4Б). Это означает, что С-концевая последовательность KRP вносит существенный вклад в ингибирующий эффект KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина в фибробластах. Тем не менее, величина ингибирующего эффекта KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина более чем в 2 раза превышает теоретическое значение комплекса миозин-KRP (см. табл.1). Это может указывать на реализацию дополнительных механизмов действия KRP в контексте живой клетки, функционирующих независимо от его С-концевой последовательности. Мы предполагаем, что один из таких механизмов связан с фосфорилированием N-концевой области KRP (Щербакова, 2006).

Таким образом, можно сказать, что в трансгенных фибробластах KRP подавляет фосфорилирование РЛЦ миозина так же как и в других модельных системах (условия in vitro, скицированные гладкие мышцы) и его С-концевая миозин-связывающая последовательность играет в этом процессе значительную роль.

KRP увеличивает содержание полимерного миозина в трансгенных фибробластах. Из данных in vitro известно, что взаимодействие KRP и миозина II приводит не только к подавлению фосфорилирования РЛЦ миозина, но и к усилению его полимеризации в филаменты (Shirinsky et al, 1993).

Для определения доли внутриклеточного миозина, находящегося в филамснтах, мы использовали свойство мономерного, но не полимерного миозина растворяться под действием Тритона Х-100.

К4 М1

■ р ' '»т^и^йГ ■ Мп>

Рис.5. KRP увеличивает долю филаментного миозина в ЗТЗ фибробластах. ЗТЗ-mock (Ml) и 3T3-KRP (К4) фибробласты фракционировали Тритоном Х-100 как описано в «Материалах и методах». Растворимые (р) и нерастворимые (н\р) фракции анализи-ровали антителами к немышечному миозину IIB.

В серии экспериментов мы показали, что содержание филаментарного миозина IIB, который в основном представляет миозин II в ЗТЗ фибробластах (Meshel et al, 2005), в нерастворимой Тритоном Х-100 субклеточной фракции клонов К2 и К4 было на 15-20% выше по сравнению с таковым в ЗТЗ фибробластах и контрольных mock клетках. Вместе с тем, в фибробластах, экспрессирующих ACKRP, мы не обнаружили увеличения доли филаментного миозина (см. рис.5 и табл.2).

Таблица 2 Доля полимерного миозина в трансгенных фибробластах.

название клона растворимая фракция (мономерный миозин) нерастворимая фракция (филаментарный миозин) прирост доли миозина IIB в филаментах

Ml 57 ± 6.3 % 43 ± 3.5% 0

К2 42 ± 3.8% 58 ± 4.2% 15

К4 36 ±4.1% 64 ± 3.7% 21

С7 58 ±4.5% 42 ± 3.5% 0

Данные представлены как среднее±стандартное отклонение, п=3. Важно заметить, что определенный экспериментально прирост доли филаментарного миозина в клетках, экспрессирующих К^Р, соответствует ожидаемому содержанию комплекса миозин-К^Р (см. табл 1, 2).

Это означает, что эффект KRP на полимеризацию миозина в трансгенных фибробластах зависит от концентрации комплекса миозин-KRP, что подтверждает функциональность взаимодействия этих белков в этой системе. Отсутствие соответствующего эффекта в случае 3T3-ACKRP фибробластов согласуется с теоретически рассчитанным крайне низким количеством комплекса миозин-ACKRP. Следовательно, можно заключить, что, как и в условиях in vitro, в трансгенных клетках KRP увеличивает количество филаментного миозина благодаря связыванию с миозином своей С-концевой последовательности.

Таким образом, в созданной нами системе трансгенных клеток KRP взаимодействует с миозином II и регулирует его структурно-функциональное состояние. С одной стороны, он увеличивает долю филаментного миозина, а с другой стороны снижает фосфорилирование РЛЦ миозина и его моторную активность. Чтобы выявить какой из этих компонентов играет более значимую роль для двигательной активности клеток, мы сравнили контрольные и KRP содержащие клетки в двух основных двигательных тестах —их миграции и адгезии.

KRP активирует двигательную активность ЗТЗ фибробластов. Мы протестировали исходные фибробласты, ЗТЗ-mock и 3T3-KRP на скорость адгезии (рис. 6А), хемотаксиса в камере Бойдена (рис. 6Б), а также миграции клеток в «рану» (рис. 6В).

150 1 I I

¡ llll

ЗТЗ Ml К2 КЗ К4

!: illl

ЗТЗ Ml К2 КЗ К4

Рнс.6. КНР стимулирует двигательную активность трансгенных ЗТЗ фибробластов. А, -

влияние КЯР на адгезию, п=15, *р<0.01 по сравнению с ЗТЗ и М1, Б,- влияние КНР на хемотаксис в камере Бойдена, п=17,* р<0.01 по сравнению с ЗТЗ и М1, В, - миграция ЗТЗ-шоск (М1) и ЗТЗ-КЯР (К4) в «рану».

Было обнаружено, что фибробласты, экспрессирующие KRP, адгезировали на 20-40%, а мигрировали в камере Бойдена на 40-60% быстрее в зависимости от клона по сравнению с контрольными и mock-клетками, которые проявляли одинаковую активность, что говорит об отсутствии клоногенных эффектов. 3T3-KRP фибробласты были более активны и при миграции в «рану» (рис. 6В).

В отдельной серии экспериментов мы определили скорость миграции фибробластов, содержащих ACKRP, в камере Бойдена. Оказалось, что эти клетки мигрируют только на 10% быстрее, чем контрольные фибробласты, и на 40% медленнее, чем клетки, содержащие полноразмерный белок (данные не представлены). С одной стороны, это свидетельствует о том, что С-концевая последовательность KRP играет ключевую роль в активации движения клетки. С другой стороны, наличие слабого, но достоверного стимулирующего эффекта ACKRP на миграцию клеток может указывать на существование дополнительного механизма действия KRP, связанного с фосфорилированием N-концевой области KRP. Очевидно, что для его изучения необходимо проведение дополнительных исследований.

Таким образом, фибробласты, обладающие пониженным уровнем фосфорилирования, но увеличенным количеством филаментного миозина, более активны в различных двигательных реакциях. Эти данные указывают на важность структурной составляющей активности миозина в двигательной активности клеток. Далее мы попытались локализовать эффект KRP в клетке, базируясь на данных о пространственной регуляции миозина КЛЦМ, Zip-киназой и Rho-киназой.

Эффекты KRP в клетке связаны с миозином, регулируемым КЛЦМ / Zip-киназой. Недавно было показано, что КЛЦМ фосфорилирует миозин II в переферической, а Rho-киназа— в центральной зоне клетки (Totsukawa et al, 2000, 2004, Katoh et al, 1997), тогда как Zip-киназа фосфорилирует миозин независимо от его локализации в клетке (Komatsu and Ikebe, 2004).

Рис.7. Влияние У-27632 (А) и МЬ-7 (Б) на уровень фосфорилирования РЛЦ миозина в ЗТЗ-тоск (М1) и ЗТЗ-ККР (К4). ЗТЗ-шоск и ЗТЗ-^Р фибробласты выдерживали с 10 мкМ У-27632 или МЬ-7 в течение 1.5 или 2.5 часов, соответственно. Затем измеряли уровень фосфорилирования РЛЦ миозина с помощью фосфоспецифических антител к Бег-!9 и тотальным РЛЦ, п=4.

Мы сравнили эффекты селективных ингибиторов Rho-киназы Y-27632, а также КЛЦМ и Zip-киназы ML-7 на уровень фосфорилирования Ser19 РЛЦ миозина в ЗТЗ-mock и 3T3-KRP фибробластах (рис. 7). В клетках mock клона Ml, Y-27632 и ML-7 подавляли фосфорилирование РЛЦ на 40% и 60%, соответственно. В 3T3-KRP фибробластах, где фосфорилирование миозина было уже снижено примерно на 50%, только Y-27632 снижал фосфорилирование РЛЦ еще на 20%, в то время как ML-7 не имел достоверного эффекта.

Полученные результаты могут означать, что функциональной мишенью KRP является миозин, регулируемый КЛЦМ и, возможно, Zip-киназой, и который, по данным других авторов, расположен на периферии клетки. При этом KRP не влияет на фосфорилирование миозина, регулируемого Rho-киназой и локализованного в центре клетки. Однако возможна и другая интерпретация этих результатов. По последним данным, КЛЦМ и Zip-киназа являются основными киназами, прямо фосфорилирующими миозин в фибробластах (Totsukawa et al, 2004, Komatsu and Ikebe, 2004), тогда как Rho-киназа влияет на уровень фосфорилирования миозина в этих клетках опосредовано, а именно путем подавления активности ФЛЦМ (Amano et al, 1996). Возможно, что KRP ингибирует только прямое фосфорилирование миозина, но не влияет на процесс его дефосфорилирования. Эти данные согласуются с результатами, полученными нами в модельной системе скинированных гладких мышщ, а также с результатами экспериментов in vitro (Silver et al, 1997, Щербакова, 2006).

Эффект KRP на двигательную активность фибропластов при ингибировании Rho-киназы, КЛЦМ и Zip-киназы. Аналогично, мы проанализировали миграционную активность в камере Бойдена исходных клеток, ЗТЗ-mock и 3T3-KRP фибробластов в условиях ингибирования этих протеинкиназ (см. рис. 8).

200 п

« 150 i es

я 100 -о«

я 50 Н

Я контроль

□ +ML-7

□ +Y-27632

зтз

К4

Рис.8. Влияние У-27632 и МЬ-7 на двигательную активность исходных ЗТЗ, ЗТЗ-тоск (М1) и ЗТЗ-ККР фибробластов (К4). Исходные ЗТЗ, ЗТЗ-тоск и ЗТЗ-КЯР фибробласты, выращивали до 60-80% конфлюэтного монослоя, депривировали сутки в ДМЕМ с 0.5% ЭТС. Затем клетки выдерживали в присутствии 10 мкМ У-27632 или МЬ-7 в ДМЕМ с 0.5% ЭТС в течение 1.5 или 2 часов и анализировали миграционную активность в камере Бойдена, как описано в «Материалах и методах исследования», п=4.

Ингибирование КЛЦМ и 21р-киназы под действием МЬ-7 снижало подвижность контрольных клеток на 50%, но не влияло на скорость миграции ЗТЗ-КЯР фибробластов. Напротив, ингибитор Шю-киназы У-27632 не изменял двигательной активности контрольных клеток, но подавлял скорость миграции ЗТЗ-КИР фибробластов более чем в 2 раза. Мы предполагаем, что в процессе активного движения клетки основной смысл фосфорилирования миозина КЛЦМ и 71р-киназой на периферии клетки заключается в структуризации миозина в филаменты, но не активации его моторной функции. В условиях ингибирования ответственных за это киназ КИР «замещает» эффект фосфорилирования РЛЦ миозина, связываясь и полимеризуя миозин в филаменты. Это не только способствует сохранению двигательной активности клеток, но и приводит к ее увеличению, так как КИР-экспрессирующие клетки исходно содержат больше полимерного миозина, чем контрольные (см. табл. 2). Эти результаты не только подтверждают данные других авторов о том, что стабилизация олигомерного миозина на переферии клетки крайне важна для реализации ее движения (УегкЬоУБку е1 а1, 1995, Нопег, е1 а1, 1987), но и указывают на нелинейный характер зависимости скорости миграции клетки от моторной (сократительной) активности миозина, которая определяется исключительно уровнем фосфорилирования его РЛЦ (см. также рис. 1). В пользу последнего утверждения ярко свидетельствует тот факт, что в то время как ингибирование Шю-киназы снижает уровень фосфорилирования миозина в клетках (см. рис. 7), скорость их миграции не изменяется (см. рис. 8). В то же время, совершенно очевидно, что некий критический уровень моторной активности миозина необходим для движения клетки, поскольку дальнейшее снижение степени фосфорилирования миозина до 4-5% (при ингибировании Юю-киназы в КИР-содержащих клетках, см. рис. 7) существенно подавляет их двигательную активность (рис. 8).

Гладкая Немышечная мышца клетка

Фосфорилирование РЛЦ миозина Полимеризация миозина Сокращение/миграция

Рис. 9. Ключевая роль структурной динамики миозина II в клеточной подвижности, установленная при сравнительном анализе функциональных эффектов КНР в системах немышечных клеток и гладких мышц (объяснения в тексте).

I I

4 I

В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что моторная активность миозина II может не являться определяющим фактором скорости движения клетки. Искусственная структуризация миозина в филаменты за счет введения в клетку КМ* показывает, что подвижность увеличивается даже при сниженном уровне фосфорилирования РЛЦ миозина (рис. 9). В то же время, моторная функция миозина и сократительная активность актомиозина прямо зависят от уровня фосфорилирования РЛЦ, что отвечает общепринятой концепции и подтверждается экспериментами в структурированной системе гладкомышечных волокон (рис. 9). Это означает, что структурная динамика миозина II в немышечных клетках является необходимым условием их двигательной активности.

ВЫВОДЫ

1. Получены линии трансгенных фибробластов, экспрессирующих КНР в концентрациях, сравнимых с содержанием миозина II. Уровень фосфорилирования РЛЦ миозина в этих клетках снижен в 2 раза, но содержание полимерного миозина повышено на 15-20% по сравнению с контрольными клетками.

2. По сравнению с контрольными, экспрессирующие КИР клетки обладают более высокой активностью в адгезии и миграции в различных тест-системах.

3. Ингибиторный анализ показывает, что КЯР препятствует фосфорилированию РЛЦ миозина II под действием КЛЦМ и, возможно, ZIP-кинaзы, но не блокирует действия Шю-киназы на фосфорилирование РЛЦ миозина в клетках.

4. КЯР ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина и развитие Са2+-независимого сокращения скинированных гладкомышечных волокон.

5. С-концевая миозин-связывающая последовательность необходима для внутриклеточного действия КИР. Сделан вывод о том, что наблюдаемые эффекты КЯР обусловлены его прямым взаимодействием с миозином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серебряная Д.В., Щербакова О.В., Дуднакова Т.В., Ширинский В.П. и Воротников А.В. (2006) KRP/ телокин разнонаправленно регулирует филаментообразование и фосфорилирование легких цепей немышечного миозина II в фибробластах, Биофизика, 51,(5), 866-874.

2. А.В. Воротников, М.А. Крымский, А.Ю. Хапчаев, Д.В. Серебряная (2004) Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц, Российский Физиологический Журнал, 90, 705-718.

3. D.V. Serebryanaya, А.В. Postnikov, S. Hilsdorf, L. Lubomirov, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov, G.Pfitzer (2006) Kinase Related Protein (telokin) binds to myosin and inhibits phosphorylation of MLC2o and Ca2+- independent contraction of guinea pig taenia cacci skinned fibers, Abstracts of XXXVth European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, J. Muscle Res. Cell Motil., 27 (5-7): 493-494.

4. D.V. Serebryanaya, A.B. Postnikov, S. Hilsdorf, L. Lubomirov, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov, G.Pfitzer. (2006) Telokin (KRP) inhibits the phosphorylation of myosin regulatory chain and Ca2+-independent contraction of guinea pig taenia caeci skinned fibers., Abstracts of International Simposium "Biological Motility: basic research and practice", Puschino, Russia, 36.

5. D.V. Serebryanaya, A.V. Chadin, I.M.Kulikova, O.V. Scherbakova, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov (2006) Ectopic expression of KRP/telokin accelerates 3T3 fibroblast motility at low levels of myosin II regulatory light chain phosphorylation., Abstracts of International Simposium "Biological Motility: basic research and practice", Puschino, Russia, 108.

6. I.M. Kulikova, O.V. Scherbakova, D.V. Serebryanaya, A. Yu. Khapchaev, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov (2006) Contribution of the N- and C-termini of Kinase Related Protein (KRP) to myosin activation and fibroblast motility., Abstracts of International Simposium "Biological Motility: basic research and practice ", Puschino, Russia, 81.

7. D.V. Serebryanaya, I.M. Kulikova, V.P. Shirinsky, A.V. Vorotnikov (2005) Ectopic expression of KRP/telokin augments 3T3 fibroblast motility at low level of myosin II light chain phosphorylation, Abstracts of XXXlVth European Muscle Conference, Debrecen, Hungary, J. Muscle Res. Cell Motil., 26 (1): 79.

8. Куликова И.М., Серебряная Д.В., Воротников A.B., (2005) Влияние белка KRP на актомиозин-зависимые двигательные реакции ЗТЗ фибробластов, Материалы XII конференции "Ломоносов-2005", Москва, Россия.

9. D.V. Serebryanaya, VP Shirinsky and AV Vorotnikov (2004) Generation of recombinant adenoviruses to study the physiological function of Kinase Related Protein. Abstracts of the International Simposium "Biological Motility", Puschino, Russia, 100-101.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серебряная, Дарья Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ АКТОМИОЗИН-ЗАВИСИМОЙ КЛЕТОЧНОЙ

ПОДВИЖНОСТИ И СОКРАТИМОСТИ ГЛАДКИХ МЫШЦ.

1.1 Актомиозиновый цитоскелет - механическая основа движения клеток.

1.2. Актин и миозин II - главные сократительные белки клетки.

1.3. Фосфорилирование РЛЦ - ведущий механизм активации миозина.

1.4. Ферменты, регулирующие уровень фосфорилирования миозина II.

1.4.1. Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ).

1.4.2. Rho-активируемая киназа (Rho-киназа).

1.4.3. Другие Са"' -независимые протеинкиназы.

1.4.4. Фосфатаза легких цепей миозина (ФЛЦМ).

1.4.5. Химические ингибиторы ферментов-модуляторов активности миозина II

2. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ МИОЗИНА II В

СОКРАТИТЕЛЬНОМ АППАРАТЕ ГЛАДКИХ МЫ1ИЩ.

2.1. Ультраструктура миозиновых филаментов II гладких мышц.

2.2. Факторы, препятствующие деполимеризации миозиновых филаментов гладких мышц.

2.3. Особенности регуляции сокращения гладких мышц под действием фосфорилирования РЛЦ миозина.

2.4. Пермеабилизованные гладкомышечные волокна как модель исследования регуляции сокращения гладкой мускулатуры.

3. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ

МИОЗИНА II В НЕМЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАХ.

3.1. Двигательные реакции в миграции немышечных клеток.

3.2. Распределение структурных элементов миозина II в мигрирующей клетке.

3.3. Пространственная регуляция фосфорилирования РЛЦ миозина II в клетке.

3.4. Экспериментальные подходы к исследованию механизмов миозин II -зависимой подвижности немышечных клеток.

4. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКА KRP (ТЕЛОКИНА).

4.1. Структура KRP.

4.2. KRP как эндогенный регулятор активности миозина II.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

1.1 .Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований.

1.2.Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований.

1.3. Реактивы и материалы для физиологических исследований.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Биохимические методы.

2.1.1. Определение концентрации белка.

2.1.2. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-электрофорез).

2.1.3. Мочевинно-глицеролъный электрофорез.

2.1.4. Иммуноблоттинг.

2.1.5. Приготовление образцов клеток и гладкомышечных волокон для ДСП-электрофореза

2.1.6. Приготовление образцов из гладкомышечных волокон и NIH3T3 фибробластов для мочевинно-глицеролъного электрофореза.

2.1.7. Экспрессия и очистка рекомбинантного KRP и его мутантных форм.

2.1.8. Фосфорилирование KRP in vitro.

2.1.9. Получение KRP, меченого 5-TMRIA.

2.2. Молекулярно-биологические методы.

2.2.1. Создание и характеристика молекулярно-генетических конструкций.

2.3. Клеточно-биологические методы.

2.3.1. Культивирование фибробластов линии NIH ЗТЗ.

2.3.2. Транзиторная трансфекция фибробластов линии NIH3T3.

2.3.3. Получение трансгенных фибробластов линии NIH ЗТЗ, стабильно экспрессирующих KRP и ACKRP.

2.3.4. Направленная миграция в камере Бойдена.

2.3.5. Адгезия фибробластов на иммунологические планшеты, покрытые коллагеном

I типа.

2.3.6 Измерение миграции клеток методом зарастания царапины (Scratch assay).

2.3.7. Измерение сократительной активности фибробластов в коллагеновом матриксе.

2.3.8. Экстракция растворимого миозина из клеток с помощью Тритона Х-100.

2.3.9. Вычисление линейных параметров ядер и объема фибробластов линии ШНЗТЗ

2.4. Физиологические методы.

2.4.1. Получение препарата taenia caeci, пермеабшизованного Тритоном Х-100.

2.4.2. Измерение сократительной активности taenia caeci.

2.4.3. Приготовление препаратов taenia caeci с меченым KRP для флуоресг(ентной микроскопии.

2.5. Количественная обработка изображений и статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ВЛИЯНИЕ KRP НА СОКРАТИМОСТЬ СКИНИРОВАННЫХ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ

ВОЛОКОН.

1.1. Характеристика скинированных препаратов гладких мыщц taenia caeci.

1.2 .Влияние KRP на Са2+-независимое сокращение, вызванное микроцистином.

1.3.Влияние KRP на Са2+-зависимое сокращение и расслабление.

1.3.1. Эффекты полноразмерного и фосфорилированного KRP на расслабление скинированных волокон.

1.3.2. Релаксирующие эффекты мутантных форм KRP.

2. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ KRP НА МОДЕЛИ

ТРАНСГЕННЫХ КЛЕТОК.

2.1 .Получение и характеристика трансгенных по KRP фибробластов.

2.2. Влияние KRP на фосфорилирование РЛЦ миозина в фибробластах.

2.3. Влияние KRP на количество полимерного миозина II в фибробластах.

2.4. Роль С-концевого домена KRP в регуляции функционального состояния миозина II в клетках

2.5. Влияние KRP на подвижность и сократимость трансгенных фибробластов.

2.6. С-концевая последовательность KRP необходима для стимуляции хемотаксиса фибробластов.

2.7. Внутриклеточные эффекты KRP связаны с миозином, регулируемым КЛЦМ и, возможно, Zip-киназой, но не Ию-киназой.

2.7.1. Влияние KRP на фосфорилирование миозина при ингибировании киназ РЛЦ миозина.

2.1.2. Влияние KRP на двигательные реакции клеток при ингибировании киназ РЛЦ миозина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИОЗИНА II В КЛЕТКЕ ПОД

ДЕЙСТВИЕМ KRP.

2. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ KRP ОБУСЛОВЛЕНЫ ЕГО ПРЯМЫМ

СВЯЗЫВАНИЕМ С МИОЗИНОМ.

3. KRP ПРЕПЯТСТВУЕТ ФОСФОРИЛИРОВАНИЮ РЛЦ МИОЗИНА В КЛЕТКЕ.

4. РОЛЬ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИОЗИНА II В АКТОМИОЗИН

ЗАВИСИМОЙ ПОДВИЖНОСТИ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP"

Двигательная активность клеток, обеспечиваемая работой двух главных белков -актина и миозина II типа, является фундаментальным свойством всех живых систем и играет ключевую роль в широком спектре биологических явлений. В специализированных мышечных клетках она проявляется в их сократительной деятельности, или сокращении, а в немышечных клетках обеспечивает сложные процессы пространственного перемещения, или миграции. Данная работа посвящена изучению функции миозина II именно в этих процессах, а разнообразные формы внутриклеточной подвижности не рассматриваются.

В норме клеточная миграция происходит на всем протяжении эмбриогенеза, в постнатальном развитии, репарации и ремоделировании тканей, при ангиогенезе, воспалительном и иммунном ответах и других биологических процессах. Нарушения миграционного поведения клеток часто сопровождают различные патологические состояния, в том числе в сердечно-сосудистой системе, при заживлении ран и канцерогенезе. Например, опухолевые клетки активно секретируют пептидные и белковые факторы, являющиеся специфическими хемоаттрактантами для сосудистого эндотелия, что стимулирует ангиогенез и рост сосудов в направлении опухоли. Метастазирование связано с миграцией раковых клеток из первичной опухоли в кровоток, который они впоследствии покидают и инвазируют в участки новообразований. Кроме того, миграция клеток является важным аспектом современной биотехнологии, играя ключевую роль в наполнении биоматериалов и формировании биокаркасов при биопротезировании. Очевидно, что знание внутриклеточных механизмов и путей регуляции двигательной активности клеток совершенно необходимо для создания способов направленного воздействия и управления двигательными реакциями клеток.

Эксперименты с культивируемыми клетками in vitro в настоящее время - главный источник информации о механизмах клеточной подвижности. Хотя большинство используемых подходов и ограничено поведением клеток в двумерных моделях, общепринято считать, что основные принципы будут адекватны трехмерным системам и ситуации in vivo. Сравнительный анализ результатов, полученных с использованием моделей трехмерного матрикса или тканевых препаратов, позволяет оценить справедливость таких заключений. Эти соображения и составили методическую основу настоящей работы.

Функционирование миозина II типа как молекулярного мотора клетки является одним из базовых принципов клеточной подвижности, анализу которого посвящено данное исследование. Клетки гладкой мускулатуры используют миозин II типа для выполнения специализированной функции сокращения. В составе дифференцированной гладкомышечной ткани они связаны друг с другом и внеклеточным матриксом, что исключает возможность их пространственного перемещения. "Сократительная" специализация этих клеток поддерживается высоким содержанием основных сократительных белков, актина и миозина, и их организацией в полимерные структуры -миофиламенты, концы которых прочно прикреплены к клеточной мембране. Сборка-разборка этих структур за счет обратимой полимеризации актина и миозина препятствует быстрой силовой реакции клеток и поэтому сведена до минимума в клетках гладких мышц.

Для реализации своей двигательной активности немышечные клетки используют миозин II типа, гомологичный гладкомышечному миозину II. Необходимо отметить, что движение немышечных клеток является интегральным процессом, включающим два основных типа подвижности, только один из которых требует минимального участия миозина. Этот тип, условно обозначаемый как амебоидный, в чистом виде характерен только для некоторых эукариотических клеток, таких как кератиноциты и нейтрофилы, и морфологически выглядит как "перетекание" клетки по субстрату. Такой способ движения основан на обратимой полимеризации актина и является в настоящее время предметом пристального внимания, но выходит за рамки данной работы и будет лишь кратко проанализирован в одном из разделов обзора литературы. Далее под термином клеточной подвижности мы будем понимать форму актомиозин-зависимой подвижности, наиболее характерной для таких клеток с ярко выраженной структурой цитоскелета и адгезивными свойствами, как фибробласты. Именно поэтому эти клетки были выбраны нами в качестве объекта исследования. Как и большинство клеток организма, фибробласты используют актиновый тип подвижности как одну из важных компонент для поляризации и начальной фазы движения, но затем привлекают миозин II для координированного перемещения тела клетки и подтягивания ее задней части на заключительных этапах цикла миграции. Предполагается, что при этом миозин II играет важную роль как в структурной организации одиночных филаментов актина в пучки стресс-фибрилл, так и их связи с адгезивными контактами. Натяжение стресс-фибрилл вследствие сократительной активности актомиозина является существенным элементом как движения этих клеток, так и формирования прочных адгезивных контактов. Однако, эти аспекты функционирования миозина II в настоящее время исследованы мало, особенно это касается структурной роли миозина II.

Стабильность структуры гладкомышечного актомиозина, но общие принципы его сократимости как в гладкомышечных, так и в немышечных клетках позволяют избирательно исследовать моторную функцию актомиозина, используя препараты гладких мышц. Полученные результаты далее могут быть использованы для анализа поведения немышечных клеток при аналогичных воздействиях, и дать возможность вычислить, дедуктивным путем, роль структурной компоненты в клеточной подвижности. Такой сравнительный анализ и был применен в настоящей работе.

Для реализации функций немышечного и гладкомышечного миозина II типа требуется активация, для которой необходимо и достаточно фосфорилирования единственного остатка Ser19 регуляторных легких цепей (РЛЦ) миозина. В результате активации молекула миозина претерпевает конформационное изменение, которое одновременно "включает" как моторную активность, так и разрешает спонтанную ассоциацию миозина II в филаменты. С неразрывностью этих двух событий связана трудность анализа индивидуальной значимости каждой из составляющих для клеточной подвижности. Мы предположили, что нужного разобщения этих процессов можно достигнуть используя свойства белка KRP (Kinase Related Protein, или телокин), который взаимодействует с гладкомышечным и немышечным миозином in vitro и подавляет фосфорилирование его РЛЦ, но вызывает при этом полимеризацию миозина в филаменты.

В связи с этим, в начале мы использовали модель скинированной гладкой мускулатуры для определения избирательного эффекта KRP только на моторную функцию миозина II. Затем нашей задачей было создать модель трансгенных фибробластов с гетерологичной экспрессией KRP и показать, что этот белок регулирует состояние миозина II именно так, как это следует ожидать из результатов экспериментов in vitro, а также исследовать двигательный фенотип таких клеток. Мы предполагали, что дифференциальный анализ эффектов KRP в этих системах позволит нам выявить функциональную роль структурной организации миозина II в клеточной подвижности. Наконец, важной составляющей каждого раздела работы было проследить, связаны ли эффекты KRP на миозин II с прямым взаимодействием этих белков, в котором главную роль играет С-концевая последовательность KRP, или KRP может действовать иначе, например, используя фосфорилирование своей N-концевой последовательности, не являющееся критическим для связывания с миозином.

Таким образом, целью нашего исследования было выяснение механизма функционирования миозина II в клеточной подвижности с использованием двух экспериментальных систем и белка KRP в качестве инструмента для разобщения структурной и моторной функций миозина II. В модели скицированных гладких мышц мы исследовали избирательное действие KRP на сократительные свойства актомиозина, а в модели трансгенных фибробластов линии NIH3T3 - действие KRP на актомиозин-зависимую клеточную подвижность.

В работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать влияние KRP и его фосфорилирования на сократимость скинированных гладкомышечных волокон.

3. Исследовать двигательный фенотип трансгенных фибробластов.

4. Исследовать влияние ингибиторов протеинкиназ на хемотаксис и уровень фосфорилирования миозина II в трансгенных клетках

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Серебряная, Дарья Владимировна

выводы

1. Получены линии трансгенных фибробластов, экспрессирующих KRP в концентрациях, сравнимых с содержанием миозина II. Уровень фосфорилирования РЛЦ миозина в этих клетках снижен в 2 раза по сравнению с контрольными клетками, но содержание полимерного миозина повышено на 20% по сравнению с контрольными клетками.

I. По сравнению с контрольными, экспрессирующие KRP клетки лучше адгезируют, сокращаются и мигрируют в различных тест-системах.

3. Ингибиторный анализ показывает, что KRP препятствует фосфорилированию РЛЦ миозина II под действием КЛЦМ и, возможно, ZIP-киназы, но не блокирует действия Rho-киназы на фосфорилирование РЛЦ миозина в клетках.

I. KRP ингибирует фосфорилирование РЛЦ миозина и развитие Са -независимого сокращения скинированных гладкомышечных волокон. Фосфорилирование KRP усиливает расслабление волокон, сокращенных в присутствии Са2+.

5. С-концевая миозин-связывающая последовательность необходима для внутриклеточного действия KRP. Сделан вывод о том, что наблюдаемые эффекты KRP обусловлены его прямым взаимодействием с миозином.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серебряная, Дарья Владимировна, Москва

1. Воротников А. В., Крымский М. А., Хапчаев А. Ю., Серебряная Д. В. (2004) Сигнальные механизмы регуляции сократительной активности гладких мышц. Российский Физиол. Журнал, 90, 705-718.

2. Воротников А.В., Крымский М.А., Ширинский В.П. (2002) Внутриклеточная сигнализация и фосфорилирование белков при сокращении гладких мышц. Биохимия, 67, 12, 1587-1610.

3. Хапчаев А. Ю., Ширинский В. П., Воротников А. В. (2003) Структура, свойства и регуляция белковых продуктов генетического локуса киназы легких цепей миозина. Yen. Виол. Химии, 43, 365-420.

4. Чадин А.В.(2004) Исследование роли белка KRP в актомиозин-зависимой клеточной подвижности. Дипломная работа.

5. Щербакова О.В. (2006). Изучение механизма ингибиторного действия KRP на фосфорилирование миозина. Дипломная работа.

6. Ahnert-Hilger, G, Mach, W, Fohr, К.J., Gratzl, M. (1989) Poration by alpha-toxin and streptolysin O: an approach to analyze intracellular processes. Methods Cell Biol, 31, 6390.

7. Amano, M, Mukai, H, Ono, Y, Chihara, K, Matsui, T, Hamajima, Y, Okawa, K, Iwamatsu, A, Kaibuchi, K. (1996) Identification of a putative target for Rho as the serine-threonine kinase protein kinase N. Science, 271, 5249, 648-650.

8. Applegate, D, Pardee, J.D. (1992) Actin-facilitated assembly of smooth muscle myosin induces formation of actomyosin fibrils. J Cell Biol., 117,6, 1223-1230.

9. Arefieva, T.L., Krasnikova, T.L. (2001) Monocytic cell adhesion to intact and plasmin-modified fibrinogen: possible involvement of Mac-1 (CD1 lb/CD 18) and ICAM-1 (CD54). J Cell Physiol, 188, 3,403-409.

10. Arner, A. (1982) Mechanical characteristics of chemically skinned guinea-pig taenia coli. Pflugers Arch, 395, 4, 277-284.

11. Ashton, F.T., Somlyo, A.V., Somlyo, A.P. (1975) The contractile apparatus of vascular smooth muscle: intermediate high voltage stereo electron microscopy. J Mol Biol. 98, 1, 17-29.

12. Bagby, R.M. (1983) Organization of contractile/cytoskeletal elements. In: Biochemistry of Smooth muscle (Stephens, N.L., ed), CRS Press, Boca Raton, FL, 4-84.

13. Bain, J, McLauchlan, H, Elliott, M, Cohen, P. (2003) The specificities of protein kinase inhibitors: an update. BiochemJ. 371,199-204

14. Bao J., Jana S.S., Adelstein R.S. (2006) Vertebrate nonmuscle myosin II isoforms rescue small interfering RNA-induced defects in COS-7 cell cytokinesis. J.Biol.Chem., 280, 20, 19594- 19599.

15. Bershadsky, A. (2004) Magic touch: how does cell-cell adhesion trigger actin assembley? Trends Cell Biology, 14, 11, 588 594.

16. Bershadsky, A.D., Balaban, N.Q., Geiger, B. (2003) Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. A mm Rev Cell Dev Biol.\9, 677-695.

17. Borman, M.A., MacDonald, J.A,. Muranyi, A., Hartshorne, D.J., Haystead, T.A. (2002) Smooth muscle myosin phosphatase-associated kinase induces Ca2+ sensitization via myosin phosphatase inhibition. J Biol Chem. 277, 26, 23441 23446.

18. Borovikov, Yu.S. (1999) Conformational changes of contractile proteins and their role in muscle contraction. IntRev Cytol, 189, 267 301.

19. Borovikov, Yu.S., Horiuchi, K.Y., Avrova, S.V., Chacko, S. (1996) Modulation of actin conformation and inhibition of actin filament velocity by calponin. Biochemistry, 35, 43, 13849 13857.

20. Carlier, M.F., (1991) Minireview: Actin: Protein Structure and Filament Dinamics. J. Biol. Chem., 266, 1 4.

21. Chen, X.Q., Tan, I, Nig, C.H., Hall, C., Lim, L., Leung, T. (2002) Characterization of RhoA-binding kinase ROKalpha implication of the pleckstrin homology domain in ROK alpha function using region-specific antibodies, J Biol Chem. 277(15), 12680 12688.

22. Choudhury, N., Khromov, A. S., Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. (2004) Telokin mediates2+

23. Conti, M.A., Adelstein, R.S. (1981) The relationship between calmodulin binding and phosphorylation of smooth muscle myosin kinase by the catalytic subunit of 3',5' cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem, 256,7, 3178-3181.

24. Conrad, P.A., Giuliano, K.A., Fisher, G., Collins, K., Matsudaira, P.T., Tailor, D.L. (1993) Relative distribution of actin, myosin I, and myosin II during the wound healing response of fibroblasts. J. Cell. Biol, 120, 1381 1391.

25. Cooke, P.H., Kargacin, G., Craig, R., Fogarty, K., Fay, F.S. (1987) Molecular structure and organization of filaments in single, skinned smooth muscle cells. Prog Clin Biol Res. 245, 1-25.

26. Davies, S.P., Reddy, H., Caivano, M., Cohen, P. (2000) Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J., 351, 95-105

27. Deng, J.T., Van Lierop, J.E., Sutherland, C., Walsh, M.P. (2001) Ca2+-independent smooth muscle contraction. A novel function for integrin-linked kinase. J Biol Chem., 276, 19,16365-16373.

28. DiMilla, P.A., Barbee, K., and Lauffenburger, D.A. (1991) Mathematical model for the effects of adhesion and migration on cell migration speed., Biophys.J., 60, 15 37.

29. Eddy, R.J., Pierini, L.M., Matsumura, F., Maxfield, F.R. (2000) Ca2+-dependent myosin II activation is reqiured for uropod retraction during neutrophil migration. J.Cell.Sci, 113, 7, 1287-1298.

30. Eddy, R.J., Pierini, L.M., Maxfield, F.R. (2002) Microtubule asymmetry during neutrophil polarazation and migration. Mol. Cell. Biol., 13,12, 4470 4483.

31. Eto, M., Ohmori, Т., Suzuki, M., Furuya, K., Morita, F. (1995) A novel protein phosphatase-1 inhibitory protein potentiated by protein kinase C. Isolation from porcine aorta media and characterization. J Biochem (Tokyo). 118, 6, 1104-1107.

32. Eto, M., Senba, S., Morita, F., Yazawa, M. (1997) Molecular cloning of a novel phosphorylation-dependent inhibitory protein of protein phosphatase-1 (CPU 7) in smooth muscle: its specific localization in smooth muscle. FEBS Lett. 410, 2-3, 356-360.

33. Fabiato, A., Fabiato, F. (1979) Use of chlorotetracycline fluorescence to demonstrate Ca2+-induced release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum of skinned cardiac cells. Nature, 281(5727), 146-148.

34. Fay, F.S., Delise, C.M. (1973) Contraction of isolated smooth-muscle cells structural changes. Proc Natl Acad Sci USA. 70, 3, 641-645.

35. Feng, J., Ito, M., Kureishi, Y., Ichikawa, K., Amano, M., Isaka, N., Okawa, K., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K., Hartshorne, D.J., Nakano, T. (1999) Rho-associated kinase of chicken gizzard smooth muscle. J Biol Chem, 21 A, 6, 3744 3752.

36. Fisher, B.A., Bagby, R.M. (1977) Reorientation of myofilaments during contraction of a vertebrate smooth muscle. Am J Physiol., 232, 1, 5 14.

37. Ford, H.L., Silver, D.L., Kaehar, B, Sellers, J.R, Zain, S.B. (1997) Effect of Mtsl on the structure and activity of nonmuscle myosin II. Biochemistry, 36, 51, 16321-16327.

38. Fukata, M., Nakagawa, M., Kuroda, S., Kaibuchi, K. (1999) Cell adhesion and Rho small GTPases., J Cell ScL, 24, 4491 5000.

39. Gabella, G. (1977) Arrangement of smooth muscle cells and intramuscular septa in the taenia coli. Cell Tissue Res. 184, 2, 195-212.

40. Gallagher, P. J., Herring, B. P. (1991) The carboxyl terminus of the smooth muscle myosin light chain kinase is expressed as an independent protein, telokin. J. Biol. Chem., 266, 35, 23945-23951.

41. Gallagher, P.J., Herring, B.P., Griffin, S.A., Stull, J.T. (1991) Molecular characterization of a mammalian smooth muscle myosin light chain kinase. J Biol Chem., 266, 35, 2393623944.

42. Geiger, В., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K.M. (2001) Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk. Nat Rev Mol Cell Biol, 2, 11, 793805.

43. Gillis, J.M., Cao, M.L., Godfraind-De Becker, A. (1988). Density of myosin filaments in the rat anococcygeus muscle, at rest and in contraction. II. J Muscle Res Cell Motil, 9, 1, 18 -29.

44. Giuliano, K.A., Kolega, J., De Biasio, R.L., Taylor, D.L. (1992) Myosin II Phosphorylation and the dynamics of stress fibers in serum-deprived and stimulated fibroblasts. Mol. Biol.Cell., 3, 1037- 1048.

45. Goeckeler, Z.M., Masaracchia, R.A., Zeng, Q., Chew, T.L., Gallagher, P., Wysolmerski, R.B. (2000) Phosphorylation of myosin light chain kinase by p21-activated kinase PAK2, J Biol Chem., 275, 24, 18366 18374.

46. Gong, M.C., Cohen, P., Kitazawa, Т., Ikebe, M., Masuo, M., Somlyo, A.P., Somlyo, A.V. (1992). Myosin light chain phosphatase activities and the effects of phosphatase inhibitors in tonic and phasic smooth muscle. J Biol Chem. 267, 21, 14662 14668.

47. Grinnell, F. (2000) Fibroblast-collagen-matrix contraction: growth-factor signalling and mechanical loading. Trends Cell Biol, 10, 9, 362 365.

48. Guilford, W.H., Warshaw, D.M. (1998) The molecular mechanics of smooth muscle myosin. Comp Biochem Physiology В Biochem Mol Biol., 119, 3, 451 458.

49. Gumbiner, B.M. (1996) Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis. Cell., 84, 3, 345 357.

50. Gunst, S.J., Fredberg, J.J. (2003) The first three minutes: smooth muscle contraction, cytoskeletal events, and soft glasses. JAppl Physiol. 95,1, 413 425.

51. Hannigan, G.E., Leung-Hagesteijn, C., Fitz-Gibbon, L., Coppolino, M.G., Radeva, G., Filmus, J., Bell, J.C., Dedhar, S. (1996) Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new beta 1-integrin-linked protein kinase. Nature, 379, 91-96.

52. Hartshorne, D.J., Ito, M., Erdodi, F. (1998) Myosin light chain phosphatase: subunit composition, interactions and regulation, J Muscle Res Cell Motil. 19, 4, 325-341.

53. Hashimoto, Y., Saaki, H., Togo, M., Tsukamoto, K., Horie, Y., Fukata, H., Watanabe, Т., Kurokawa, K. (1994) Roles of myosin light chain kinase in platelet shape change and aggregation. Biochim. Biophys. Acta, 1223, 163-169.

54. Helfman, D.M., Pawlak, G. (2005) Myosin light chain kinase and acto-myosin contractility modulate activation of the ERK cascade downstream of oncogenic Ras. J Cell Biochem. 95,5,1069-1080.

55. Herman, I.M. (1993) Actin isoforms. Curr Opin Cell Biol, 1, 48-55.

56. Herrera, A.M., McParland, B.E., Bienkowska, A., Tait, R., Pare, P.D., Seow, C.Y. (2005) "Sarcomeres" of smooth muscle: functional characteristics and ultrastructural evidence,.J Cell Sci. 118, 11,2381 -2392.

57. Herring, B. P., Lyons, G. E., Hoggatt, A. M., Gallagher, P. J. (2001) Telokin expression is restricted to smooth muscle tissues during mouse development. Am. J. Physiol. Cell. Physiol., 280, 12-21.

58. Herring, B. P., Smith, A. F. (1996) Telokin expression is mediated by a smooth muscle cell-specific promoter. Am. J. Physiol., 270, C1656-C1665.

59. Holden, H. M., Ito, N., Hartshorne, D. J., Rayment, I. (1992) X-ray structure determination of telokin, the C-terminal domain light chain kinase, at 2.8 A resolution. J. Mol. Biol., 259, 11639-11642.

60. Holmes, K.C., Popp, D, Gebhard, W., Kabsch, W. (1990) Atomic model of the actin filament, Nature, 347, 44 49.

61. Honer, В., Citi, S., Kendrick-Jones, J., Jockusch, B.M. (1988) Modulation of cellular morphology and locomotory activity by antibodies against myosin, J Cell Biol, 107, 21812189.

62. Howard, J. (1997) Molecular motors: structural adaptations to cellular functions. Nature, 389, 561-567.

63. Iizuka, K, Ikebe, M, Somlyo, A.V., Somlyo, A.P. (1994) Introduction of high molecular weight (IgG) proteins into receptor coupled, permeabilized smooth muscle. Cell Calcium, 16,431-445.

64. Ikebe, M., Inagaki, M., Kanamaru, K., Hidaka, H. (1985) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by Ca2+-activated, phospholipid-dependent protein kinase. J Biol Chem., 260, 4547-4550.

65. Ikebe, M., Inagaki, M., Naka, M., Hidaka, H. (1988) Correlation of conformation and phosphorylation and dephosphorylation of smooth muscle myosin. J Biol Chem., 263, 10698-10704.

66. Ikebe, M., Koretz, J., Hartshorne, D.J. (1988) Effects of phosphorylation of light chain residues threonine 18 and serine 19 on the properties and conformation of smooth muscle myosin. J Biol Chem, 263, 6432-6437.

67. Ю. Ikebe, M., Reardon, S. (1990) Phosphorylation of smooth myosin light chain kinase by smooth muscle Ca2+/calmodulin-dependent multifunctional protein kinase. J Biol Chem., 265, 8975-8978.

68. H. Ito, M., Dabrowska, R, Guerriero, V. Jr., Hartshorne, D.J. (1989) Identification in turkey gizzard of an acidic protein related to the C-terminal portion of smooth muscle myosin light chain kinase. J Biol Chem. 264, 13971-13974.

69. Ito, M., Nakano, Т., Erdodi, F., Hartshorne, D.J. (2004) Myosin phosphatase: structure, regulation and function, Mol Cell Biochem. 259(1-2), 197-209.

70. S3. Itoh, K., Yoshioka, K., Akedo, H., Uehata, M„ Ishizaki, Т., Narumiya, S. (1999) An essential part for Rho-associated kinase in the transcellular invasion of tumor cells. Nat Med. 5(2), 221-225.

71. Johnson, D., Cohen, P., Chen, M.X., Chen, Y.H., Cohen, P.T. (1997) Identification of the regions on the Ml 10 subunit of protein phosphatase 1M that interact with the M21 subunit and with myosin. Eur J Biochem. 244, 931-939.

72. Kamm, K.E., Stull, J.T. (1985) Myosin phosphorylation, force, and maximal shortening velocity in neurally stimulated tracheal smooth muscle. Am J Physiol., 249, 238-247.

73. Kasturi, R., Vasulka, C., Johnson, J.D. (1993) Ca2+, caldesmon, and myosin light chain kinase exchange with calmodulin. J Biol Chem., 268, 7958-7964.

74. Katoh, K., Kano, Y„ Amano, M., Kaibuchi, K., Fujiwara, K. (2001) Stress fiber organization regulated by MLCK and Rho-kinase in cultured human fibroblasts, Am J Physiol Cell Physiol, 280, 1669-1679.

75. Katoh, K., Kano, Y., Masuda, M., Onishi, H., Fujiwara, K. (1998) Isolation and contraction of the stress fibers. Mol Biol Cell, 7,1919-1938

76. Katoh, T, Morita, F. (1995) The effect of cross-linking of the two heads of porcine aorta smooth muscle myosin on its conformation and enzymic activity. Eur J Biochem, 233(1), 123-131.

77. Kawabata, S., Usukura, J., Morone, N., Ito, M., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K., Amano, M. (2004) Interaction of Rho-kinase with myosin II at stress fibers. Genes Cells, 9, 1, 653 -650.

78. Kawai, Т., Matsumoto, M., Takeda, K., Sanjo, H., Akira, S. (1998). ZIP kinase, a novel serine/threonine kinase that mediates apoptosis. Mol Cell Biol. 18, 3, 1642- 1651.

79. Kelley, C.A., Takahashi, M., Yu, J.H., Adelstein, R.S. (1993) An insert of seven amino acids confers functional differences between smooth muscle myosins from the intestines and vasculature. J. Biol. Chem., 268, 7958 7964.

80. H. Khatri, J.J., Joyce, K.M., Brozovich, F.V., Fisher, S.A. (2001) Role of myosin phosphatase isoforms in cGMP-mediated smooth muscle relaxation. J Biol Chem, 276, 40, 3725037257.

81. Kim, K.Y., Kovacs, M., Kawamoto, S., Sellers, J.R., Adelstein, R.S. (2005) Desease-associated mutations and alternative splicing after the enzymatic and motile activity of non-muscle myosins II В and IIC. J. Biol. Chem, 280, 24, 22769-22775.

82. King, G.G., Pare, P.D., Seow, C.Y. (1999) The mechanics of exaggerated airway narrowing in asthma: the role of smooth muscle. Respir Physiol, 118, 1,1 -13.

83. Kitazawa, Т., Takizawa, N., Ikebe, M., Eto, M. (1999) Reconstitution of protein kinase C-induced contractile Ca2+ sensitization in triton Х-100-demembranated rabbit arterial smooth muscle. J Physiol, 520, 1,139-152.

84. Komatsu, S., Ikebe, M. (2004) ZIP kinase is responsible for the phosphorylation of myosin II and necessary for cell motility in mammalian fibroblasts, J Cell Biol, 165, 2, 243-254.

85. Krymsky, M. A., Kudryashov, D. S., Shirinsky, V. P., Lukas, T. J., Watterson, D. M., Vorotnikov, A. V. (2001) Phosphorylation of kinase-related protein (telokin) in tonic and phasic smooth muscles. J. Muscle Res. Cell. Motil., 22, 425-437.

86. Kuo, K.H., Herrera, A.M., Wang, L., Pare, P.D., Ford, L.E., Stephens, N.L., Seow, C.Y. (2003). Structure-function correlation in airway smooth muscle adapted to different lengths. Am J Physiol Cell Physiol., 285, 2, 384-390.

87. Kureishi, Y., Ito, M., Feng, J., Okinaka, Т., Isaka, N., Nakano, T.(1999) Regulation of Ca2+-independent smooth muscle contraction by alternative staurosporine-sensitive kinase. Eur J Pharmacol, 376, 3, 315-320.

88. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 12257-12260.

89. Laudanna, С, Campbell, J.J., Butcher, E.C. (1996) Role of Rho in chemoattractant-activated leukocyte adhesion through integrins. Science, 271, 981-983.

90. Lauffenburger, D.A., Horwitz, A.F. (1996) Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell, 9, 84, 359-369.

91. Lee, M.R., Li, L., Kitazawa, T. (1997) Cyclic GMP causes Ca2+ desensitization in vascular smooth muscle by activating the myosin light chain phosphatase. J Biol Chem, 272, 50635068.

92. Lehman, W., Craig, R., Vibert, P., Barany, M. (1996) Actin and structure of smooth muscle thin filaments. Biochem of Muscle Contr., 47 60, Acad. Press.

93. Leung, Т., Chen, X.Q., Manser, E., Lim, L. (1996) The pl60 RhoA-binding kinase ROK alpha is a member of a kinase family and is involved in the reorganization of the cytoskeleton. Mol Cell Biol. 16,10, 5313 5327.

94. Li, Z.H., Spektor, A., Varlamova, O., Bresnick, A.R. (2003) Mtsl regulates the assembly of nonmuscle myosin-IIA. Biochemistry, 42, 14258 14266.

95. Limouze, J., Straight, A.F., Mitchison, Т., Sellers, J.R. (2004) Specificity of blebbistatin, an inhibitor of myosin II. J Muscle Res Cell Motil, 25, 4-5, 337-341.

96. MacDonald, J.A., Eto, M., Borman, M.A., Brautigan, D.L., Haystead, T.A. (2001). Dual Ser and Thr phosphorylation of CPI-17, an inhibitor of myosin phosphatase, by MYPT-associated kinase. FEBS Lett, 493,2-3, 91-94.

97. Machevsky, L.M., Borners, M (2003) Cell structure and dynamics, Curr Opin in Cell Biol, 15,2-5.

98. Madaule, P., Eda, M., Watanabe, N., Fujisawa, K., Matsuoka, Т., Bito, H., Ishizaki, Т., Narumiya, S. (1998) Role of citron kinase as a target of the small GTPase Rho in cytokinesis, Nature, 394, 491-494.

99. Margossian, S.S., Lowey, S. (1982). Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol, 85B, 55-71.

100. Marston, S.B., Fraser, I.D., Huber, P.A., Pritchard, K., Gusev, N.B., Torek, K.(1994) Location of two contact sites between human smooth muscle caldesmon and Ca(2+)-calmodulin., J Biol Chem. 269, 11, 8134-8139.

101. Marston, S.B., Fraser, I.D., Huber, P.A. (1994) Smooth muscle caldesmon controls the strong binding interaction between actin-tropomyosin and myosin, J Biol Chem. 269, 32104- 32109.

102. Masato, Т., Numata, Т., Katoh, Т., Morita F., Yazawa, M. (1997) Crosslinking of telokin to chicken gizzard smooth muscle myosin. JBiochem (Tokyo), 121, 2, 225-230.

103. Matsumura, F. (2005) Regulation of myosin II during cytokinesis in higher eukaryotes, Trends. Cell. Biol., 15, 7, 371-377.

104. Matsumura, F., Ono, S., Yamakita, Y., Totsukawa, G., Yamashiro, S. (1998) Specific localization of serine 19 phosphorylated myosin II during cell locomotion and mitosis of cultured cells. J Cell Biol. 140(1), 119-129.

105. Meisheri, K.D., Ruegg, J.C. (1983) Dependence of cyclic-AMP induced relaxation on Ca2+ and calmodulin in skinned smooth muscle of guinea pig Taenia coli. Pflugers Arch, 399,4,315-320.

106. Meshel, A.S., Wei, Q., Adelstein, R.S., Sheetz, M.P. (2005). Basic mechanism of three-dimensional collagen fibre transport by fibroblasts. Nat Cell Biol., 1, 2,157-164.

107. Mitchinson, T.J., Cramer, A.L. (1996) Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84,3,371-379.

108. Nakayama, M., Amano, M., Katsumi, A., Kaneko, Т., Kawabata, S., Takefuji, M., Kaibuchi, K. (2005) Rho-kinase and myosin II activities are required for cell type and environment specific migration. Genes Cells, 10, 2, 107-117.

109. Nieznanski, K., Sobieszek, A. (1997) Telokin (kinase-related protein) modulates the oligomeric state of smooth-muscle myosin light-chain kinase and its interaction with myosin filaments. Biochem J, 322, 65-71

110. Niggli, V. (1999) Rho-kinase in human neutrophils: a role in signalling for myosin light chain phosphorylation and cell migration. FEBS Lett., 445, 1, 69-72

111. Niiro, N., Ikebe, M. (2001) Zipper-interacting protein kinase induces Ca (2+)-free smooth muscle contraction via myosin light chain phosphorylation. J Biol Chem., 276, 31, 2956729574.

112. Nishikawa, M., Shirakawa, S., Adelstein, R.S. (1985) Phosphorylation of smooth muscle myosin light chain kinase by protein kinase C. Comparative study of the phosphorylated sites. J. Biol. Chem, 260, 8429-8436.

113. Nobes, C.D., Hal,l A. (1995) Rho, rac and cdc42 GTPases: regulators of actin structures, cell adhesion and motility. Biochem Soc Trans., 3, 456-459.

114. Okagaki, Т., Nakamura. A., Suzuki, Т., Ohmi, K., Kohama, K. (2000). Assembly of smooth muscle myosin by the 38k protein, a homologue of a subunit of pre-mRNA splicing factor-2. J Cell Biol, 148, 4, 653-663.

115. Palecek, S., Lauffenburger, D.A., and Horwitz, A.F. (1996) Integrin fates in the uropod of migrating fibroblasts. J.Cell.Sci., 12, 7, 1174 -1188.

116. Parsons, J.T., Martin, K.H., Slack, J.K., Taylor, J.M., Weed, S.A. (2000) Focal adhesion kinase: a regulator of focal adhesion dynamics and cell movement. Oncogene, 19, 49, 5606-13.

117. Persechini, A., Hartshorne, D.J. (1981) Phosphorylation of smooth muscle myosin: evidence for cooperativity between the myosin heads. Science, 213, 1383-1385.

118. Pfitzer, G. (1996) Penneabilized smooth muscle, In: Biochemistry of Smooth Muscle Contraction (Stephens, N.L., ed), CRS Press, Boca Raton, FL, 112-135.

119. Pfitzer, G. (2001) Invited review: regulation of myosin phosphorylation in smooth muscle. JAppl Physiol, 91, 1, 497-503.

120. Pfitzer, G., Hofmann, F„ DiSalvo, J., Ruegg, J.C. (1984) cGMP and cAMP inhibit tension development in skinned coronary arteries. Pflugers Arch. 401, 3, 277-280.

121. Pfitzer, G., Ruegg, J.C., Zimmer, M., Hofmann, F. (1985) Relaxation of skinned coronary arteries depends on the relative concentrations of Ca2+, calmodulin and active cAMP-dependent protein kinase. Pflugers Arch, 405, 1, 70-76.

122. Pfitzer, G., Zeugner, C., Troschka, M„ Chalovich, J.M. (1993) Caldesmon and a 20-kDa actin-binding fragment of caldesmon inhibit tension development in skinned gizzard muscle fiber bundles. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 13, 5904-5908.

123. Pollard, T.D., and Cooper J.A. (1985) Actin and actin-binding proteins: a critical evaluation of mechanisms and functions. Annu.Rev.Biochem., 55, 987 -1035.

124. Post, P.L., DeBiasio, R.L., Taylor, D.L. (1995) A fluorescent protein biosensor of myosin II regulatory light chain phosphorylation reports a gradient of phosphorylated myosin II in migrating cells. Mol Biol Cell, 6, 12, 1755-1768.

125. Reisler, E. (1993) Actin molecular structure and function. Curr Opin Cell Biol. 5,1, 41-47.

126. Ridley, A.J. (2001) Rho GTPases and cell migration., J Cell Sci., 15, 2713-2722.

127. Rosenbluth, J. (1965) Smooth muscle: an ultrastructural basis for the dynamic of its contraction. Science. 4, 148, 1337-1339.

128. Rosenfeld, S.S., Xing, J., Chen, L.Q., Sweeney, H.L. (2003) Myosin lib is unconventionally conventional. J Biol Chem, 278, 30, 27449-27455.

129. Rottner, K., Hall, A., Small, J.V. (1999) Interplay between Rac and Rho in the control of substrate contact dynamics., Curr Biol, 9, 12, 640-648.

130. Rovner, A.S., Fagnant, P.M., Trybus, K.M. (2006) Phosphorylation of a single head of smooth muscle myosin activates the whole molecule. Biochemistry. 45, 16, 5280-5289

131. Ruppel, K.M., Spudich, J.A. (1996) Structure-function studies of the myosin motor domain: importance of the 50-kDa cleft. Mol Biol Cell, 7, 7, 1123-1136.

132. Rusconi, F., Potier, M.C., Le Caer, J.P., Schmitter, J.M., Rossier, J. (1997) Characterization of the chicken telokin heterogeneity by time-of-flight mass spectrometry. Biochemistry, 36, 36,11021-11026.

133. Sahai, E., Ishizaki, Т., Narumiya, S., Treisman, R. (1999) Transformation mediated by RhoA requires activity of ROCK kinases., Curr Biol. 9, 3, 136-145.

134. Saitoh, M., Ishikawa, Т., Matsushima, S., Naka, M., Hidaka, H. (1987) Selective inhibition of catalytic activity of smooth muscle myosin light chain kinase. J Biol Chem. 262, 16, 7796-7801.

135. Sellers, J.R. (1991) Regulation of cytoplasmic and smooth muscle myosin. Curr Opin Cell Biol 3, 98-104.

136. Sellers, J.R., Adelstein, R.S. (1985) The mechanism of regulation of smooth muscle myosin by phosphorylation. Curr Top Cell Regul, 27, 51-62.

137. Sellers, J.R., Adelstein, R.S. (1987). Regulation of Contractile Activity. In The Enzymes, vol. 18, ed. Boyer, P. D. & Krebs, E. G., 381-395. Academic Press Inc., Orlando, FL, USA.

138. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory manual., 1.74-1.82.

139. Seow, C.Y. (2005) Myosin filament assembly in an ever-changing myofilament lattice of smooth muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 6,1363-1368.

140. Schmidt, C.E., Chen, Т., and Lauffenburger, D.A. (1994) Simulation of integrin-cytoskeletal interactions in migrating fibroblasts. Biophys. J., 67, 461 474.

141. Silver, D.L., Vorotnikov, A.V., Watterson, D.M., Shirinsky, V.P., Sellers, J.R. (1997) Sites of interaction between kinase-related protein and smooth muscle myosin. J Biol Chem. 272, 40, 25353-25359.

142. Small, J.V. (1977) Studies on isolated smooth muscle cells: The contractile apparatus. J Cell Sci. 24,327-349.

143. Small, J.V., Geiger, В., Kaverina, I., Bershadsky, A. (2002) How do microtubules guide migrating cells. Nat Rev Mol Cell Biol, 12, 957-964.

144. Small, J.V., Herzog, M., Barth, M., Draeger, A. (1990) Supercontracted state of vertebrate smooth muscle cell fragments reveals myofilament lengths. J Cell Biol. 111,6, 2451-2461.

145. Sobiezhek, A. (2005) Vectorial activation of smooth muscle myosin filaments and its modulation by telokin. Can J Physiol Pharmacol, 83, 10, 899 -912.

146. Sobieszek, A., Andruchov, O.Y., Nieznanski, K. (1997) Kinase-related protein (telokin) is phosphorylated by smooth-muscle myosin light-chain kinase and modulates the kinase activity. J. Biochem., 328, 425-430.

147. Somlyo, A.P., Somlyo, A.V. (1994) Signal transduction and regulation in smooth muscle, Nature, 372, 231-236.

148. Somlyo, A.P., Somlyo, A.V. (2003) Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase, Physiol Rev., 83(4), 1325-1358.

149. Somlyo, A.V., Bradshaw, D., Ramos, S., Murphy, C., Myers, C.E., Somlyo. A.P. (2000) Rho-kinase inhibitor retards migration and in vivo dissemination of human prostate cancer cells, Biochem. Biophys. Res. Commun. 269, 652-659.

150. Somlyo, A.V., Butler, T.M., Bond, M., Somlyo, A.P. (1981) Myosin filaments have non-phosphorylated light chains in relaxed smooth muscle. Nature, 294, 567-569.

151. Stull, J.T., Tansey, M.G., Tang, D.-C, Word, R.A., Kamm, K.E., and Tang, D.C.(1993) Phosphorylation of myosin light chain kinase: a cellular mechanism for Ca2+-desensitization. Mol. Cell.Biochem., 127/128, 229-237.

152. Suzuki, H., Onishi, H., Takahashi, K., Watanabe, S. (1978) Structure and function of chicken gizzard myosin, J Biochem (Tokyo), 84, 6, 1529-1542.

153. Takai, Y., Sasaki, Т., Tanaka, K., Nakanishi, H. (1995) Rho as a regulator of the cytoskeleton. Trends Biochem Sci, 20, 6, 227-231.

154. Takizawa, N., Schmidt, D.J., Mabuchi, K„ Villa-Moruzzi, E., Tuft, R.A., Ikebe, M. (2003) M20, the small subunit of PP1M, binds to microtubules. Am J Physiol Cell Physiol, 284, 250-262.

155. Tamaoki, T. (1991) Use and specificity of staurosporine, UCN-01, and calphostin С as protein kinase inhibitors. Methods Enzymol, 201, 340-347.

156. Tan, I., Cheong, A., Lim, L., Leung, T. (2003) Genomic organization of human myotonic dystrophy kinase-related Cdc 42- binding kinase alpha reveals multiple alternative splicing and functional diversity. Gene, 304,107 -115.

157. Tessier, D.J., Komalavilas, P., Panitch, A., Joshi, L., Brophy, C.M. (2003) The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. J Surg Res. Ill, 1, 152-157.

158. Totsukawa, G., Wu, Y., Sasaki, Y., Hartshorne, D.J., Yamakita, Y., Yamashiro, S.,

159. Matsumura, F. (2004) Distinct roles of MLCK and ROCK in the regulation of membrane protrusions and focal adhesion dynamics during cell migration of fibroblasts. J Cell Biol., 164,3,427-439.

160. Towbin, H., Staehlin, Т., Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrileamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl, acad. Sci. U. S. A., 76, 4350-4354.

161. Trybus, K.M. (1991) Regulation of smooth muscle myosin. Cell Motil Cytoskeleton., 18, 2, 81-85.

162. Trybus, K.M. (1996) Myosin regulation and assembly. In: Barany K. and Barany M., editors. Biochemistry of smooth muscle contraction. NY: Acad. Press. 1996, 37-46.

163. Trybus, K.M., Huiatt, T.W., Lowey, S. (1982) A bent monomeric conformation of myosin from smooth muscle. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 20, 6151-6155

164. Van Aelst, L., D'Souza-Schorey, C. (1997) Rho GTPases and signaling networks. Genes Dev., 11, 18,2295-3222.

165. Verin, A.D., Gilbert-McClain, L.I., Patterson, C.E., Garcia, J.G. (1998) Biochemical regulation of the nonmuscle myosin light chain kinase isoform in bovine endothelium. Am JRespir Cell Mol Biol. 19, 5, 767-769.

166. Verin, A.D., Lazar, V., Torry, R.J, Labarrere, C.A„ Patterson, C.E, Garcia, J.G. (1998) Expression of a novel high molecular-weight myosin light chain kinase in endothelium. Am JRespir Cell Mol Biol. 19, 5, 758-766.

167. Verkhovsky, A.B, Borisy, G.G. (1993) Non-sarcomeric mode of myosin II organization in the fibroblast lamellum. J Cell Biol., 123, 3,637-652.

168. Verkhovsky, A.B, Svitkina, T.M, Borisy, G.G. (1995) Myosin II filament assemblies in the active lamella of fibroblasts: their morphogenesis and role in the formation of actin filament bundles. J Cell Biol. 131,4, 989-1002.

169. Vorotnikov, A.V. (1997) Kinase-related protein: a smooth muscle myosin-binding protein. Int J Biochem Cell Biol. 29, 5, 727-730.

170. Watterson, D.M, Collinge, M, Lukas, T.J, Van Eldik. L.J, Birukov, K.G, Stepanova, ON., Shirinsky, V.P. (1995) Multiple gene products are produced from a novel protein kinase transcription region, FEBS Lett., 373, 3, 217-220.

171. Wessels, D., Murray, J., Jung, G., Hammer, J.A., Soil, D.R. (1991) Myosin IB null mutants of Dictyostelium exhibit abnormalities in motility. Cell. Motil.Cytoskeleton, 20, 301 -315.

172. Wilkinson, S., Paterson, H.F., Marshall, C.J.(2005)Cde42-MRCK and Rho-ROCK signalling cooperate in myosin phosphorylation and cell invasion. Nat Cell Biol, 7, 3, 255261.

173. Wilson, D.P., Sutherland, C., Borman, M.A., Deng, J.T., Macdonald, J.A., Walsh, M.P. (2005) Integrin-linked kinase is responsible for Ca2+-independent myosin diphosphorylation and contraction of vascular smooth muscle. Biochem J., 392, 641-648.

174. Wirth, A., Schroeter, M., Kock-Hauser, C., Manser, E., Chalovich, J.M., De Lanerolle, P., Pfitzer, G. (2003) Inhibition of contraction and myosin light chain phosphorylation in guinea-pig smooth muscle by p21-activated kinase 1, J Physiol, 549, 489-500.

175. Wu, X., Haystead, T. A. J., Nakamoto, R. K., Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. (1998) Acceleration of myosin light chain dephosphorylation and relaxation of smooth muscle by telokin. J. Biol. Chem., 273,11362-11369.

176. Xia, D., Stull, J.T., Kamm, K.E. (2005) Myosin phosphatase targeting subunit 1 affects cell migration by regulating myosin phosphorylation and actin assembly. Exp Cell Res. 304, 2, 506-517.

177. Мне бы хотелось поблагодарить всех преподавателей кафедры Биохимии биологического факультета МГУ и заведующего кафедрой профессора Николая Борисовича Гусева за полученное мною образование.

178. И, в заключении, мне бы хотелось выразить благодарность своей семье моим родителям и мужу за понимание, терпение и веру в мои силы.

Информация о работе

Серебряная, Дарья Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Анализ молекулярных аспектов функционирования миозина II в мышечном сокращении и клеточной подвижности с помощью белка KRP - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы