Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аллельные распределения генов АРОВ, АРОСЗ, к АРОЕ и липидные показатели у больных инфарктом миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аллельные распределения генов АРОВ, АРОСЗ, к АРОЕ и липидные показатели у больных инфарктом миокарда"

<4. ^ /

<ч4' <' На правах рукописи

'V «...

ч

'Ч

. ШЕВЦОВ Сергей Петрович

АЛЛЕЛЬНЫЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНОВ АРОВ. АРОСЗ И АРОЕ И ЛИПИДНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ У БОЛЬНЫХ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

( 03. 00.04 - биохимия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

1995

- г -

Раоога выполнена в Отделе молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН.

Научные руководители: • ■

;,октср медицинских наук, профессор Шварц Е.И., доктор медицинских наук, профессор Ковалев Ю.Р. .

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Денисенко А.Д., доктор биологических наук, профессор Томилин Н.В.

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт кардиологии Минздрава России.

Защита состоится "_" ___ 1995 г. в "_" часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук К 001.23.01 при Санкт-Петербургском институте экспериментальной медицины по адресу: 197376,Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН.

Автореферат разослан У ИоА^ 1995 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Куликова 0. Г.

Актуальность проблемы.

В настоящее время молекулярно-генетические аспекты предрасположенности к развитию атеросклероза и его осложнений являются предметом изучения многих исследователей. Строгие доказательства того, что генетические факторы могут быть фактически единственной причиной для ускоренного развития атеросклероза, получены в классической серии работ по изучении семейной гиперхолестерине-мии M.Brown и J.L.Goldstein.. В этих работах был изучен гомеостаз холестерина в организме человека и, в частности, было показано, что мутационного нарушения в гене рецептора липопротеинов низкой •' плотности (ЛНП) может быть достаточно для развития тяжелой ги-перхолестеринемии и инфаркта миокарда в раннем возрасте. С этого момента в изучении атеросклероза началась молекулярно-генешчес-кая эра. В результате интенсивной работы многих исследователей были картированы, клонированы и секвенированы более двадцати генов, вовлеченных в транспорт и метаболизм липидов.

- Генетическое изучение атеросклероза идет по двум направлениям. Первое предполагает поиски ассоциаций общих (т.е. широко распространенных в популяции) полиморфизмов кандидатных генов либо с клинически выявленными проявлениями, такими как инфаркт миокарда или инсульт, либо с. биохимическими параметрами, такими как уровень липидов плазмы крови. В этом случае сцелленность ал-лельного варианта исследуемого гена с болезнью и/или с повышенным уровнем липидов крови позволяет сделать заключение о том, в какой степени исследуемый ген вносит вклад в развитие заболевания в изучаемой популяции. Второе направление связано с поиском функционально значимых нарушений кандидатных генов с последующим изучением их влияния на метаболизм. В этом случае исследователь получает мощный инструмент, позволяющий понять процессы, в которых участвует прэдукт исследуемого гена, и выявить этапы, нарушения в которых приводят к развитию атеросклеротического процесса.

К началу нашего исследования в разных лабораториях были выполнены многочисленные исследования, направленные на выявление ассоциации отдельных полиморфизмов и редких мутяишЧ с инфарктом миокарда и/илн дислипидемиями. Однако полученные- данные носили противоречивый характер. В результате, для одного и two жо лп-

куса в двух независимых исследованиях могли быть получены статистически значимые ассоциации аллельных вариантов исследуемого гена с дислипидемией и/или болезнью в одном исследовании и отсутствие таких ассоциаций в другом.

В свою очередь, и мы предприняли исследование генетических аспектов предрасположенности к атеросклерозу и инфаркту миокарда.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение связи между структурной организацией генов аполипопротеинов АРОВ, АРОСЗ и АРОЕ и наличием ишемической болезни сердца (инфаркта миокарда) у мужчин при отсутствии стойкой артериальной гипертензии и сахарного диабета.

Задачи исследования включали:

1) Определение частоты встречаемости "семейного дефектного гена АРОВ" (мутация в 3500-ом кодоне) среди больных инфарктом миокарда, жителей города С.-Петербурга.

2) Поиск других мутаций гена АРОВ, приводящих к нарушению связывания ЛНП с их рецептором и таким образом вызывающих развитие гиперхолестеринемии и инфаркта миокарда.

3) Оценка частот встречаемости общих полиморфизмов генов АРОВ. АРОСЗ, АРОЕ у больных инфарктом миокарда и здоровых лиц контрольной группы, жителей города С.-Петербурга.

4) Анализ влияния исследуемых полиморфизмов (ХЬа1, ЕсоЯ1, Мзр1 КПРэ гена АРОВ. Бэ ЙПР гена АРОСЗ и изоаллельный полиморфизм в 112-ом и 158-ом кодонах гена АРОЕ) на липидные показатели у больных инфарктом миокарда.

Научная новизна полученных результатов.

1) Отсутствие нуклеотидных замен в 120 обследованных образцах ДНК на участке гена АРОВ, кодирующем предполагаемый участок связывания ЛНП с их рецептором, указывает на необычайно высокую консервативность исследуемого домена.

2) Отсутствие мутаций на исследованном домене, а также отсутствие мутации в 3500-ом кодоне гена АРОВ позволяют заключить, что мутационные события, нарушающие связывание ароВ-100 с рецептором лшюпротеинпь низкой плотности, не являются частой причиной развития инфаркта миокарда у лиц без стойкой артериальной

- 5 -

гипертензией и сахарного диабета.

3) Впервые даются оценки частот встречаемости аллелей в рестрикционных полиморфизмах Мзр1 и ЕсоИ1 гена АРОВ; в гипервариабельном по числу тандемных повторов локусе в 3' нетранслируе-мом районе этого же гена; в БзИ рестрикционном полиморфизме гена АРОСЗ и изоаллельном полиморфизме в 112-ом и 158-ом кодонах гена АРОЕ для российской популяции.

4) Впервые показано сцепление аллельных вариантов генов АРОСЗ и АРОЕ с повышенными уровнями, соответственно, триглицери-дов и общего холестерина сыворотки крови у пациентов с инфарктом миокарда в Санкт-Петербурге.

Научно-практическая значимость работы.

Нами был разработан оригинальный метод выявления мутации в 3500-ом кодоне гена АРОВ. Было показано отсутствие этой мутации среди больных инфарктом миокарда жителей С.-Петербурга. Обнаружено также отсутствие мутационных повреждений на участке гена АРОВ, кодирующем предполагаемый домен связывания ЛНП с рецептором. Эти результаты позволяют предполагать незначительный вклад "сильных" повреждений гена АРОВ в 'развитие инфаркта миокарда. Проведена оценка частот встречаемости аллелей и генотипа шести полиморфных локусов трех генов, и показано,что частоты встречаемости не различались достоверно между больными инфарктом миокарда и здоровыми лицами контрольной группы. В то же время носители аллеля Б2 гена АРОСЗ и аллеля Е4 гена АРОЕ имеют достоверно более высокие уровни, соответственно, триглицеридов и холестерина сыворотки крови.

Проведенное исследование имеет как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны,получены базисные данные о генетической структуре российской популяции, с другой,- пока -зано, что аллельнне варианты генов аполипопротеинг• вносят зна чительный вклад в регуляцию липидного обмена в норм и патоло гии. Поскольку инфаркт миокарда является ведущей причиной смертности и инвалидности во всем мире, использование ДНК-техж>Л"Гш1 для выявления предрасположенности к нему должно стать гудущим диагностическим (и прогностическим) инструментом р клинически практике.

- 6 -

Основные положения,выносимые на защиту.

1) ИБС и гиперлипидемии в исследованной группе пациентов не связаны ни с наличием мутации в 3500-ом кодоне гена АРОВ, ни с наличием мутаций внутри предполагаемого домена связывания ароВ-100 с рецептором липопротеидов низкой плотности (позиции 9940-10213 по последовательности кДНК).

2) Наличие ИБС в изученной группе больных не обусловлено но-сительством какого-либо из генотипов Xbal, EcoRI. Mspl рестрик-ционных полиморфизмов гена АРОВ, а также полиморфизма числа тан-демных повторов в гипервариабельном районе в 3'-нетранслируемой области гена АРОВ.

3) Носительство аллеля Е4 гена АРОЕ является фактором риска для развития гиперхолестеринемии, т.к. средний уровень холестерина крови в группе болыгих инфарктом миокарда с генотипом ЕЗ/Е4 статистически достоверно выше, чем в группе с генотипом ЕЗ/ЕЗ.

4) Носительство аллеля S2 гена АРОСЗ является фактором риска для развития гипзртриглицеридемии. т.к. средний уровень тригли-церидов в крови.больных инфарктом миокарда носителей S1S2 генотипа статистически достоверно выше, чем в группе больных с генотипом S1S1.

5) Наличие ИБС в исследованной группе пациентов не обусловлено носительством аллеля Е4 гена АРОЕ или аллеля S2 гена АРОСЗ, т.к. частоты встречаемости этих аллелей и, соответственно, генотипов ЕЗ/Е4 и S1S2 не различаются достоверно между группами больних и здоровых лиц.

Апробация работы. Материалы лиссертационной работы были доложены на 20-ой конференции Европейского биохимического общества. Hungary, (1990); 8-ом Международном конгрессе по генетике человека. Washington D.С. _ (1991); 25-ой ежегодной конференции Европейского общества генетики человека, Barcelona, (1993); и двух Всесоюзных, симпозиумах "Геном человека", г.Черноголовка, ' (1993) и (1994).

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных' работ из них: 1 в международном журнале, 2 в отечественных журналах. 3 тезиса с международных и 2 тезиса с российских конференций.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения. обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования. обсуждения, выводов и списка литературы (226 наименова-' ний). Работа изложена на 94 страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц и 10 рисунков и фотографий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных групп. В группу больных инфарктом миокарда вошли 109 мужчин в возрасте от 39 до 60 лет (средний возраст 49.9± 7.), перенесших крупноочаговый инфаркт миокарда. не страдающих стойкой артериальной гипертонией или сахарным диабетом. Средние величины липидных показателей в этой группе: общий холестерин (Хс) - 2?1,6±13,8 мг/дл, холестерин липопротеи-нов высокой плотнорти 'Хс ЛВП) - 35.3±2,8 мг/дл. холестерин ли-попротеинов низкой плотности (Хс ЛНП) - 157.Ш1.3 мг/дл, триг-лицериды (ТГ)1- 198,5±26.9 мг/дл.

Контролем служили данные обследования 86 здоровых мужчин в возрасте от 30 до 60 лет (средний возраст 43,0±10) с нормальным уровнем липидов крови. Средние величины липидных показателей в контрольной группе: общий Хс - 203,4+11,4 мг/дл, Хс ЛВП •-43,9±3,5 мг/дл, Хс ЛНП - 134,9±10.0 мг/дл и ТГ - 133,9±21.1 мг/дл. У этих лиц клинически и в результате велоэргометрической пробы была искл-чена коронарная недостаточность. При наборе группы исключались сахарный диабет.и стойкая артериальная гипер-тензия.

Как больные ИМ, так й лица контрольной группы представляли собой смешанную популяцию жителей Санкт-Петербурга и не состояли друг с другом в родстве.

Исследование липидов крори._У всех больных ИБС и лиц контрольной группы определяли основные показатели липидного обмет. Содержание общего холестерина (Хс) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови определяли на автоанализаторе АА-П Фирмы "Техникой". Холестерин липопротеидов высокой плотности (Хс ЛВП) определяли после оолжденпя р и пре-р липопротеидов гепарином в присутствии ионов Мпг\ Уровень холестерина липопро ¡'видов низкой плотности (Хс Л1!П> рассчитывали по Формуле:

- в -

Хс.лнп - Хс.06ч - (Хс.лвп + ТГ/5).

Молекулярно-генетические методы. ДНК выделяли из буккального эпителия или из периферической крови, по стандартным методам. Амплификация специфических участков ДНК. методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). проводилась на автоматическом термоциклере производства ТТО "ИРЛЕН", Гатчина, с использованием термоста-Оильной Tth-ДНК-полимеразы. Температурно-временной режим реакции подбирался для каждого локуса.

Для анализа рестрикционных полиморфизмов Xbal, EcoRI, Mspl гена АРОВ, SstI гена АРОСЗ, 3500-ой мутации гена АРОВ и геноти-пирования гена АРОЕ продукт амплификации экстрагировали хлороформом, осаждали спиртом и растворяли в воде. Аликвоту образца, содержащую 0.2 - 0.5 мкг ДНК, смешивали с равным объемом 2х -кратного буфера для соответствующей рестриктазы, содержащего 3 ед. фермента. Инкубацию ДНК с ферментом проводили в течение ночи при 37°С. Продукты рестрикции разделяли при помощи электрофореза в акриламидном геле подходящей концентрации.

Определение числа повторов в аллелях VWTR в 3' нетранслируе-мой- области гена АРОВ проводили путем электрофореза исследуемого образца рядом с ранее охарактеризованным образцом с тем же числом' повторов. Образцы с охарактеризованными аллелями VNTR были получены от Dr. Deka R..' University of Pittsburgh.

Поиск новых мутаций на участке гена АРОВ, кодирующем предполагаемый домен связывания с рецептором, проводился методом прямого секвенирования продукта амплификации для 25-ти пациентов с наивысшими показателями холестерина ЛКП. Для интенсификации поиска нами был применен метод конформационного полиморфизма одно-нитевых фрагментов ДНК при электр' порезе в неденатурирующем акриламидном геле.

Статистические методы. Все расчеты, использованные в этой работе, сделаны на IBM совместимом PC при помощи пакета программ для статистических расчетов "StatGraflcs".

Сравнение частот генотипов и аллелей изучаемых полиморфизмов проводили с использованием критерия Хг. Средние значения липид-ных показателей у больных с различными генотипами сравнивали при помощи t-критерия Стьюдента. Ввиду асимметрии в распределении значений триглицеридов все вычисления проводили дважды - один

раз с ^трансформированными их значениями и второй раз использовали десятичные логарифмы этих показателей.

Коэффициенты линейной регрессии величин липидных показателей по возрасту, индексу массы тела и количеству выкуриваемых сигарет. как в контрольной группе, так и в группе больных ИБС. оказались недостоверными. Средние показатели индекса массы тела и курения в сравниваемых группах (в которых анализировали ассоциации между средними величинами липидных показателей и носительст-вом тех или иных генотипов или аллелей) достоверно не различались.

Результаты и их обсуждение

Оценка встречаемости 3500-ой мутации среди больных инфарктом миокарда (ИМ). К началу наших исследований транзиция G А, приводящая к замене 3500ой аминокислоты ароВ-100 Arg на Gin. была единственной описанной мутацией АРОВ, приводящей к нарушению связывания ЛНП с их рецептором. Нами был разработан и апробирован оригинальный метод идентификации этой специфической мутации. Суть метода заключается в специальном дизайне амплификационных праймеров: верхний праймер (рг8) прилегает к нуклеотиду, в котором происходит искомая мутация, и е предпоследнем (к 3' концу) положении его введен нуклеотид некомплементарный геномной последовательности С вместо А) так,чтобы в процессе амплификации в амплификате образовывался рестрикционный сайт, отсутствующий в геномной ДНК. На рисунке 1 показана динамика процесса образования рестрикционного сайта в нормальном аллеле. В то же время, в случае наличия мутантного аллеля сайт нарушается и в результате продукты амплификации-рестрикции нормального и мутантного аллелей легко разрешаются путем электрофореза в акриламидном геле, как показано на рисунке 2. Используя этот подход, мы провели скрининг 120 пациентов с ИМ и 130 лиц контрольной группы. Ни в одном из обследованных образцов анализируемая Miгация обнаружена не была[. Однако, в других популяциях 3500-ая мутация встречается с относительно высокой частотой среди пациентов с ИКС, поэтому разработанный нами метод имеет большое практическое значение, т.к. может быть применен при скрининге других популяций и этнических групп к.зк на территории России, так и за ее предплчми.

Рисунок 1. Динамика образования рестрикционного сайта при амплификации участка, содержащего 3500-ый кодон гена АРОВ. Нить геномной ДНК написана большими буквами; амплификационный праймер, прилегающий к 3500-ому кодону - жирными буквами; предпоследний нуклеотид праймера большой жирной буквой; нить, синтезированная в процессе амплификации, выделена курсивом; нуклеотидная позиция, в которой происходит мутационная замена й—>А, приводящая к Аг^-3500--->С1п аминокислотной замене, помечена подчеркиванием.

5'-acacttacttgaattccaagagcacCc _____>

3'-ССССТТСТСААТСААСТТАЛССТТСТССТСТСССАСААСТСАСТТССАССТССССТС

5'-acacttacttgaattccaagagcacCcggtcttcодtgaagctgcagg—> З'-ССССТТСТСААТСААСТТААССТТСТССТСТСССАСААСТСАСТТССАССТССССТС

5'-acacttacttgaattccaagagcacCcggtcttcagtgaagctgcaggg

<----tcga.cgtcccgtga.-5'

5' -acacttacttgaattccaagagcacCcggtct tcagtgaJagctgcagggca---->

tgtgaatgaacttaaggttctcgtgGgccagaagtcacttcgacgtcccgtgaa-5'

Таким образом,при амплификации здорового аллеля образуется сайт для рестриктязы МэрГ 5'-ccgg-3' и не образуется при амплификации мутантного аллеля 5'-ссав~3'.

Анализ структурной организации предполагаемого домена связывания ароВ-100 с рецептором ЛНП. Мутации в гене АРОВ, препятствующие связыванию ЛНП с их рецептором, все еще оставались вероятными кандидатами на роль скрытой причины предрасположенности к ускоренному развитию атеросклероза и инфаркта миокарда. Мы провели скрининг нашей группы пациентов на наличие мутаций на участке гена АРОВ с высокой гомологией белка ароВ-100 к домену арпЕ, ответственному за связывание белка ароЕ с рецептором. ЛНП. В группе из 25 пациентов, у которых Хс ЛНП был выше 197 мг/дл С^родниЯ Хс ЛНП 255.3±5 мг/дл). этот участок был проанализирован

М 1 2 3 4 Н

Рисунок 2. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции для детекции мутации в 3500-ом кодоне гена АРОВ. Дорожки геля: М- маркер молекулярных весов рВ11322-Мзр1, 1 и 3- дик здорового донора н гетерозиготного носителя мутации I 3500-ом кодоне, нерестрипировлнные, 2- ДНК здорового донора, рестрицировяииоя по Мзр1, 4- ДНК гетерозиготного носителя 3500-оП мутации, ростршш-рованная при помощи МэрТ.

с помощью прямого секвенирования амплификатов. Ни одной гетеро-зиготы, указывающей на наличие мутаций на интересующем нас участке длиной 245 н.п. (позиции 9940-10213 по последовательности кДНК), не было выявлено.

Для интенсификации поиска мутаций на этом участке нами был применен метод выявления однонуклеотидных замен, основанный на обнаружении изменений конформации однонитевых•фрагментов. Используя этот метод, мы проскринировали всю группу пациентов ИМ -126 человек. В этих исследованиях также не было выявлено ни одного образца ДНК с измененной подвижностью, ' что с вероятностью 80 - 90% указывает на отсутствие нуклеотидных замен на изучаемом участке.

Таким образом, наше исследование показывает, что мутации гена АРОВ, нарушающие связывание ЛНП с их рецептором, встречаются крайне редко и не вносят ощутимого вклада в развитие атеросклероза и ИМ. Остается открытым вопрос: не является ли другой домен ароВ-100 ответственным за связывание с рецептором ЛНП? Отсутствие даже синонимичных нуклеотидных замен на столь значительной выборке указывает на высокую консервативность анализированного нами фрагмента ДНК.

Анализ рестрикционных полиморфизмов гена АРОВ. С целью выявления аллельных вариантов, которые могут быть сцеплены с неизвестными мутациями,' мы исследовали четыре общих полиморфизма гена АРОВ: 'молчащую.замену в кодоне 2488, приводящую к Xbal полиморфизму: замену Arg-3611—Glu. приводящую к MspI полиморфизму; замену Glu-4154—Lys. природящую k EcoRI полиморфизму и ги-первариабельныг регион в 3' нетранелируемой области гена. Ни один из исследованных рестрикционных полиморфизмов гена АРОВ не имеет статистически достоверных отличий в частотном распределении генотипов и аллелей между группами здорового контроля и больных инфарктом миокарда. В таблице 1 приведены значения частот встречаемости генотипов и аллелей трех RFLP гена АРОВ. Сопоставление изучавшихся рестрикционных полиморфизмов гена АРОВ с уровнем липидов плазмы показало, что их средние значения как у больных, так и у здоровых мужчин существенно не различались в зависимости от идентифицированных генотипов.

Анализ гипервариабельного региона в 3' нетранслируемой области гена АРОВ. Гипервариабельный регион в 3' нетранслируемой области АРОВ (3'УНТЮ является особым генетическим маркером в силу своей высокой полиморфности и гетерозиготности. На рис. 3

представлены в виде двух гистограмм частотные распределения аллелей этого локуса в группах больных и здоровых лиц. В нашем исследовании было идентифицировано 13 аллелей, причем каждый из них был представлен как в здоровой популяции, так и в группе больных ИМ:

е

о

0,5

0.4

| 0.2

0.2

0.1

■П ^

иП ■»Дл ВЦ ДП

31 33 35 з? 39 41 ЧЪ II? ЧЪ 51 5$ 55 Длина (число повторов)

Рисунок 3. Частотные распределения аллелей гипервариабельного региона в 3'-нетранслируемой области гена АРОВ в сравниваемых группах. По оси абсцисс - аллели, отличающиеся числом повторов в них корового пятнадцатичленника, по оси ординат-' - удельная частота встречаемости данного аллеля. Темные столбики - больные ИБС. светлые - контрольная группа.

/

Таблица 1. Сравнение частот встречаемости генотипов и аллелей трех РПРз гена АРОВ и одного - гена АРОСЗ

1 1 1 1 1 1 Группы 1

1 Ген I Генотипы и 1 Больные КБ С I Контроль 1

1 1 1 | аллели 1 п 1 % 1 п 1 1 1 % |

1 1 I Ген АроВ I ХЬа1: Х1Х1 1 I 27 25 1 1 1 23 I 31 |

1 1 Х1Х2 I 52 48 1 37 | 49 |

1 1 Х2Х2 I 29 27 1 15 I 20 |

1 1 XI I 106 49 1 83 | 55 |

Х2 I 110 51 1 67 I 45 |

1 1 ЕсоИ1 1Ш?1 1 4 4 1 4 I 7 '1

! 1 {?Ш2 1 21 23 1 10 I 19 |

1 1 Ш2 1 68 73 1 39 I 74 |

1 1 т 1 29 16 1 18 1 17 I

1 1 К2 | 157 84 1 88 I 83 |

Мэр!: М1М1 1 8 8 1 3 I 6 I

1 1 М1М2 1 12 12 1 15 | 27 |

М2М2 I 78 80 1 37 | 67 |

1 1 М1 I 28 14 1 21 1 19 |

1 1 М2 I 168 86 1 89 I 81 1

I Ген АроСЗ1 БэИ: 51Б1 1 71 70 1 50 | 74 |

1 1 8182 I 29 29 1 18 I 26 |

1 1 эгэг 1 1 1 1 0 | 0 1

1 1 1 171 85 1 118 1 87 |

1 1 Б2 1 31 1 ....... 15 ........ 1 18 I .1 . ..1 13 1

Методом Хг было показано, что частотные распределения в группах больных и здорового контроля различаются достоверно. В то же время попарное сравнение частот встречаемости отдельных аллелей в обеих группах не позволило выявить статистически значимых различий п частотах их встречаемости, что обуелмр.гнчт мл лой численностью членов в группах сравнения. Значения липидниу нокязате.'И» не различались дггтперно меялу группами с рпиличнч ни генптитми и аллелями ятмго локугп.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что структурные вариации на С-конце гена АРОВ не влияют на липидные показатели как среди больных инфарктом миокарда, так и среди здоровых лиц контрольной группы.

Таблица 2. Уровни липидов крови у пациентов с различными генотипами полиморфизма БвИ в гене АРОСЗ. Звездочками и галочками отмечены логарифмически трансформированные значения триглицеридов, которые статистически достоверно отличаются друг от друга

(р<0. 05).

I----т-1-1-1-1

IГруппа об- | Хс. общ. |Хс.ЛНП I Хс.ЛВП I ТГ |

I следованных|-1-1-1-1-1

I I мг/дл I I

I Больные ИБС I I

13131, П=65 | 236+14 159+14 37+1 214+24 2.282* | |Б132. П=25 I 245+18 162+13 35+3 .270+46 2.391* I |Контроль, трансформированный регрессией на возраст ■ I 13151, п=50 I 212+12 144+12 46+4 134+15 2.127' | 15132, п=17 | 214+13 141+12 41+4 176+18 2.246л |

I_I_I

Анализ полиморфизма ЭэЧ гена АРОСЗ. Частоты встречаемости генотипов и аллелей полиморфизма 5эи гена АРОСЗ представлены в таблице 1. Нами было показано отсутствие достоверных различий в частотах встречаемости аллеля 52 и генотипа 3182 между группами больных и лиц контрольной группы. В то же время установлено, что у больных ИБС, имеющих аллель Б2 (генотипы Б152 и 5252), уровень триглицеридов сыворотки крови оказался достоверно выше, чем у больных без этого аллеля (генотип 5151) (табл.2). Регрессия по возрасту в контрольной группе делает достоверно значимой разницу между средними значениями уровней триглицеридов для различных генотипов. Наши данные позволяют заключить, что аллель 52 гена АРОСЗ является фактором риска для развития гиперлипидемий. особенно гипертрнглицеридемий у жителей С.-Петербурга. Лишь умерен-

ное влияние его на уровни липидов может объясняться как тем. что аллель, несущий сайт, сцеплен со слабо-патогенными мутациями гена, так и тем, что лишь небольшая фракция этого.аллеля является одновременно носителем мутаций.

Таблица 3 . Частотные распределения генотипов и аллелей гена АРОЕ среди больных инфарктом миокарда и в контрольной группе.

1 1 1 Группы '■ 1

| Генотипы и I Больные КБС | Контроль |

I аллели 1 п | 1 | % | 1 п 1 % 1 | |

I Е2/Е2 1 1 1 0 | 1 0.0 I 1 1 1.7 I

I Е2/ЕЗ I 17 I 9.7 | 3 1 5.0 |

I ЕЗ/ЕЗ 1 122 | 69.3 | 37 1 61.7 |

I . ЕЗ/Е4 1 34 | 19.3 | 14 I 23.3 |

I ' Е4/Е4 1.2| 1.1 1 0 1 0.0 I

1 Е2/Е4 1 1 I 1 1 0.6 | 1 ' 5 1 8.3 I 1 |

I Е2 со 5.1 | 10 1 1 1 8.3 |

I ЕЗ I 295 | 83.8 | 91 1 75.8 I

| Е4 | 1 39 | 1 | 11.0 | 1 19 1 15.8.1 1 ■

Изотипирование гена АРОЕ. Использованный в настоящей работе метод генотипирования АРОЕ позволяет идентифицировать три общих и три редких изоаллеля гена. Нами было проанализировано 176 пациентов с инфарктом миокарда и 60 лиц контрольной группы. Среди проанализированных образцов нами- были идентифицированы все шесть общих генотипов, являющихся комбинациями трех общих изоаллелей. Мы не обнаружили ни одного редкого аллеля в обеих группах. В таблице 3 приведены данные о частотах встречаемости генотипов и аллелей в обеих группах. В таблице 4 приведены величины липидных показателей у пациентов с различными генотипами АРОЕ.

Видно, что.в группе больных инфарктом миокарда, обладающих генотипом ЕЗ/Е4. среднее содержание общего холестерина сыворотки' достоверно повышено по сравнению с больными, обладающими геноти-

пом ЕЗ/Е4. Аналогичные различия наблюдались между носителями перечисленных генотипов и в контрольной группе, однако они не достигали уровня статистической достоверности. Отмеченная тенденция выявлена и для величин Хс. ЛПНП.

Таблица 4. Величины липидных показателей у пациентов с имеющих различные генотипы АРОЕ. Звездочками помечены*значения уровней общего холестерина, достоверно различающиеся между собой

(р<.05).

1 1 Генотип 1 АроЕ 1 Хол. | общий, | мг/дл | 1 Хол. ЛНП , мг/дл Хол. ЛВП, мг/дл I- 1 1 18ТС |

1 больные 1 1

| ЕЗ/З П=72 223+13* | 159±10 34+3 12.255±.0751

1 ЕЗ/4 П=15 261±37* | 1 185+28 38±12 12.229+.269|

I контроль I ЕЗ/З п-32 1 ЕЗ/4 п-14 1 1 1 196±16 | 212±39 | ........1 128+12 145+23 44+4 44±9 |2.019±.100| I2.066i.232l 1 1

ВЫВОДЫ

1. Обнаружены достоверные взаимосвязи между аллельными вариантами генов АРОСЗ и АРОЕ и величиной липидных показателей. Но-сительство аллеля Б2 (Бэ^ полиморфизм в 3' области гена АРОСЗ) достоверно предрасполагает к развитию гипертриглицеридемии. Наличие аллеля Е4 гена АРОЕ является строгим Фактором развития ги-перхолестеринемии. Эти закономерности наблюдаются как у пациентов с инфарктом миокарда,так и у здоровые лиц контрольной группы.

2. Развитие инфаркта миокарда в изученной группе больных не обусловлено структурными изменениями генов аполипгпротеинов АРОСЗ и АРОЕ,поскольку частоты аллелы-ых вариантов в исследованных полиморфных сайтах генов аполипопротеинов АРОСЗ и АРОЕ у лиц. не-

ренесших инфаркт миокарда,по сравнению со здоровыми лицами достоверно не различаются.

3. Разработанный нами метод анализа мутационного повреждения в 3500-ом кодоне АРОВ гена при помощи сайт-специфического мутагенеза в одном из праймеров превосходит по простоте выполнения метод аллель-специфической гибридизации.

4. Установлено, что в отличие от ряда западных популяций у жителей Санкт-Петербурга развитие инфаркта миокарда не связано с мутацией в 3500-ом кодоне гена АРОВ.

5. Среди 100 обследованных больных, перенесших инфаркт миокарда, не обнаружено, ни одной нуклаотидной замены в гене АРОВ на участке 9974-10190 нуклеотидов, который, согласно литературным данным, кодирует домен связывания ароВ-100 белка с его рецептором.

6. При анализе гипервариабельного региона в 3' нетранслируе-мой области гена АРОВ идентифицировано 13 аллелей, каждый из которых встречается со сходной частотой как в группе больных ИМ, так и в контрольной группе здоровых людей.

7. Структурный полиморфизм по трем рестрикционным сайтам (Xbal, Mspl. EcoR'I) и гипервариабельному району в 3' нетрансли-руемой зоне гена АРОВ не ассоциирован с показателями липидного обмена сыворотки крови как в группе больных инфарктом миокарда, так и в контрольной группе.

8. Развитие инфаркта миокарда в изученной группе больных не обусловлено стуктурными изменениями гена аполипопротеина АРОВ, поскольку частоты аллельных вариантов в исследованных полиморфных сайтах гена у лиц, перенесших инфаркт миокарда по сравнению со здоровыми лицами достоверно не различаются.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Schwartz E.I.,. Shevtsov S.P.. Kuchlnskl A. P., Kovalev Yu. P., Plutalov 0. V.. Berlin Yu. A. (1991). Approach to Identification of a point mutation In apo B100 gene by means of PCR-medlated site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Research 19:0752.

2. Кучинский А. П.. Ковалев Ю. P., Шварц E. И., Дзеранова Н.Я., ' Khopfi'i Т. Р. , Шевцов С. П. (19Э2) Структурные особенности APTí и

APOCIII генов у больных ишемической болезнью сердца. Кардиология. Том 32, # 3, стр. 32 - 34.

3. Шевцов С.П., Кучинский А.П., Дзеранова Н.Я., Кцоева Т.В.. Фомичева К. В.. Ковалев (0. Р., Шварц Е.И., (1994) Анализ ДНК-полиморфизмов генов аполипопротеинов АРОВ и АРОСЗ у больных инфарктом миокарда. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1994, # 3, стр. 33 - 36.

4. Schwartz Е. I. .Shevtsov S. P. .Kuchlnski А.Р. .Kovalev Yu. Р., Dzeranova N. А., Ktsoeva. T.V., Plutalov O.V., Berlin Yu.A., Genetic study of predisposition to myocardial Infarction. In: Abstracts of 20th Meeting- of the Federation . of European Biochemical Societies, Budapest, Hungary. August, 1990:.116.

5. Shevtsov S.P., Kuchlnskl A.P., Kovalev Yu.P.. Dzeranova N. A.. Ktsoeva Т. V., Plutalov 0. V., Berlin Yu.A., Schwartz E.I. Genetic study of predisposition to myocardial infarction. In: Abstracts of 8th International Congress of Human Genetics. Washington D.C. 1991:203.

6. Shevtsov S.P., Kuchinsky A.P., Kovalev Yu.A., Dzeranova N. Ya., Fomicheva E. V., Ktsoeva T. A., Schwartz E.I. Structural organization of APO В and APO CIII genes In patients with myocardial Infarction. Iq: Abstracts of the 25 th Annual Meeting of European Society of Human Genetics, Barcelona, 1993:92.

7. Шевцове.П., Кучинский А.П., Ковалев Ю.А.. Дзеранова Н.Я., Фомичева Е. В., Смелянский А. Я., Кцоева Т. А., Шварц Е. И.. Сопостовительный анализ структурной организации генов АРОВ и APOCIII у больных инфарктом миокарда и контрольной группы. Третья . конференция "Геном , человека-93", г. Черногиловка. 1993:104..

8. Шевцов С. П., Кучинский А. П.. Дзеранова Н.Я., Кцоева Т. В.. Фомичева К. В.-,- Ковалев Ю. Р.. Шварц Е.И. Изучение молекулярно-генетических основ наследственной предрасположенности к ишекичео-кой болезни сердца. . Четвертая конференция "Геном человека-9!". г.Черноголовка, 1994:43.

Отпечатано в типографии ПИЯФ

За*. J29,тир. 100, уч.-иая. л. 0,9; li/XI-l«95r. Бесплатно