Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях биологически активных соединений

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях биологически активных соединений"



На правах рукописи

ФЕОФАНОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

МЕТОД КОНФОКАЛЬНОЙ МИКРОСПЕКТРОСКОПИИ И РЕКОНСТРУКЦИИ СПЕКТРАЛЬНЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ В ИССЛЕДОВАНИЯХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор химических наук, профессор

Арсеньев Александр Сергеевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор

Соболев Александр Сергеевич

доктор биологических наук, профессор

Красновский Александр Александрович доктор физико-математических наук, профессор

Заседателев Александр Сергеевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Зашита состоится "13" апреля 2006 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "13" марта 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук,

профессор

Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Оптическая микроскопия уже более 300 лет является исследовательским инструментом, который все более разнообразно и широко используется в биологии, биофизике и медицине. Анализ окрашенных срезов тканей и клеток в проходящем белом свете - наиболее простое на сегодняшний день, но весьма информативное применение оптической микроскопии - в современном виде сформировалось десятки лет назад и остается неотъемлемой частью клинических и медико-лабораторных исследований. Разработка оптических систем для реализации методов дифференциального интерференционного и фазового контраста открыла исследователям возможность уверенного наблюдения и исследования микроструктур в составе неокрашенных и слабоконтрастных биологических объектов, таких как живые клетки. Создание микроскопов, позволяющих наблюдать флуоресценцию молекул в клетках и тканях, привело к развитию многообразия методов и подходов к изучению структуры и функции клеток, клеточных структур, биологических клеточных процессов, а также эндогенных и экзогенных (синтетических и природных) молекул и ионов металлов в клетках и срезах тканей.

До 60-х годов 20 века оптическая микроскопия являлась методом, который обеспечивал субмикронное разрешение только в фокальной плоскости объектива. Изобретение конфокальной системы фильтрации сигнала дало возможность измерения флуоресцентных сигналов с трехмерным субмикронным разрешением. Совпавший по времени прогресс в разработке лазерных систем и персональных компьютеров стимулировал наблюдаемое сейчас бурное развитие новых методов флуоресцентной микроскопии, включая лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (ЛСКМ), двух- и мульти- фотонную флуоресцентную микроскопию, микроскопию на основе измерения времени жизни флуоресценции, конфокальную микроспектроскопию, микроскопию с применением эффекта полного внутреннего отражения, а также методические подходы на основе анализа восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и флуоресцентного переноса энергии. Помимо флуоресцентной в настоящее время идет активное развитие микроскопии ближнего поля и методов оптической микроскопии на основе колебательной спектроскопии, таких как инфракрасная микроскопия и микроскопия комбинационного рассеяния (КР).

Развитие новых методов оптической микроскопии полностью востребовано в современной клеточной биологии и биофизике. Достигнутый к настоящему времени уровень понимания взаимодействия и функционирования биологических молекул и их комплексов в бесклеточной среде, глубокое проникновение в основы процессов жизнедеятельности клетки, с одной стороны, и возрастающая потребность в более информативных методах исследования, с другой стороны, создают основу для быстрого внедрения новых методов оптической микроскопии в исследовательский процесс. Развитие генной инженерии, протеомики и биотехнологии ставит на повестку дня вопрос об углубленном изучении процессов синтеза, транспорта и взаимодействий биологических молекул в живой клетке, а также о практическом использовании этих знаний. Для решения этих задач также необходимо скорейшее совершенствование экспериментальных подходов на основе оптической микроскопии.

Одной из возможностей значительного увеличения информативности оптической микроскопии является применение в микроскопии спектрального анализа. В данной диссертации представлены результаты разработки метода конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ), а также результаты применения этого метода в исследованиях биологически активных соединений (БАС). Метод КОМИРСИ базируется на измерении с субмикронным

пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта (живой клетки или среза ткани) полных спектров флуоресценции или КР исследуемого БАС. Это позволяет не только установить пространственное распределение БАС в сканируемом объекте, но и изучить по спектрам микроокружение и молекулярные взаимодействия БАС, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности, измерить концентрацию БАС и его молекулярных комплексов.

Данная работа выполнялась по приоритетным направлениям фундаментальных исследований РАН, разделы: «Методы, приборы и оборудование для исследований в области физико-химических основ биологии и биотехнологии»; «Направленный синтез и выделение химических соединений с уникальными свойствами и веществ специального назначения. Биологически активные синтетические и природные соединения и низкомолекулярные биорегуляторы. Зависимость структура-свойства». Часть исследований выполнена в рамках научно-технической программы Правительства Москвы, Миннауки РФ и РАН «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических заболеваний». Актуальность разработок и исследований, представленных в данной диссертации, подтверждена независимой научной экспертизой и положительным решением о присуждении в поддержку исследований грантов Российского фонда фундаментальных исследований (96-04-48421, 01-04-49298, 02-04-22001), Московского комитета по науке и технике (ГБ-24/00), фонда PICS (Франция), НАТО (LST.CLG.97770775) и фонда INTAS (93-1829, 010461).

Цель настоящей работы

Разработать применительно к исследованию БАС метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ), основанный на анализе полных спектров флуоресценции и комбинационного рассеяния, измеренных с трехмерным субмикронным пространственным разрешением в живых клетках и срезах ткани.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать основы метода КОМИРСИ для идентификации и изучения молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках и создать лабораторную установку для проведения исследований методом КОМИРСИ;

2. С использованием метода КОМИРСИ разработать методики измерения концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, методики оценки средних концентраций БАС в органоидах и доменах клетки, в среднем по клетке, а также методики проведения статистически достоверного анализа клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток;

3. На основе метода КОМИРСИ разработать методики выявления органоидов, в которых происходит преимущественное накопление исследуемых БАС.

4. С использованием метода КОМИРСИ разработать методики исследования распределения БАС в срезах тканей и оценки относительной концентрации БАС в различных структурах тканей.

5. Применить разработанный метод КОМИРСИ и методики, созданные на его основе, в исследованиях БАС, для получения новой информации о механизмах функциональной активности изучаемых БАС, о взаимосвязях между структурой и активностью БАС, о мишенях действия БАС в клетках и тканях.

Научное значение и новизна работы

Предложены и прошли успешную апробацию оригинальные методики, позволяющие по спектрам флуоресценции изучать молекулярные взаимодействия БАС в живых клетках

с субмикронным пространственным разрешением. Разработаны уникальные методы количественной оценки внутриклеточной концентрации БАС и их комплексов на основе анализа спектров с привлечением данных моделирования молекулярных взаимодействий в растворах. На основе проведенных исследований детально разработаны универсальные принципы нового направления оптической микроскопии, обеспечивающего неразрушающий количественный анализ БАС и их молекулярных взаимодействий в живых клетках.

Впервые предложена и успешно применена схема комплексного сравнительного исследования молекулярных и клеточных свойств фотосенсибилизаторов (ФС), позволяющая выяснить влияние структуры молекулы на способность образовывать комплексы с белками, нуклеиновыми кислотами и липидными структурами, на способность продуцировать в составе этих комплексов активные формы кислорода, проникать в раковые клетках и накапливаться там в фотодинамически-активной форме.

В растворах, клетках и срезах тканей животных охарактеризованы свойства безметального сульфированного фталоцианина, являющиеся основой его фотодинамической противоопухолевой активности. Эти исследования позволили пересмотреть укоренившийся ошибочный вывод о том, что хелатирование с металлом необходимо для проявления фотодинамической активности сульфированных фталоцианинов. Впервые исследованы свойства новых ФС, включая З-дезвинил-З-формил хлорин р6 (ФХрб), циклоимидные производные хлорина Рб (ЦИХЛ) и бактериохлорина (ЦИБХЛ) с различными заместителями, введенными в пиррольные циклы А, О и в имидный цикл Е. Среди 27 изученных соединений отобраны производные, наиболее перспективные для разработки на их основе препаратов для фотодинамической терапии рака.

Установлено, что, изменяя структуру заместителей, можно влиять на распределение ЦИХЛ и ЦИБХЛ в цитоплазме, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, либо в липидных каплях, что открывает возможность изучения особенностей и механизмов развития фотодинамического эффекта, инициализированного в этих структурах, а также позволяет обеспечить направленное повреждение в раковых клетках высокочувствительных к действию активных форм кислорода молекулярных и клеточных структур.

Практическое значение работы

Разработанный метод КОМИРСИ находит широкое применение в медико-биологических исследованиях. Препарат Фталасенс, при разработке которого использовался метод КОМИРСИ, находится на стадии клинических исследований в качестве ФС для фотодинамической терапии рака. Для повышения эффективности фотодинамической терапии с применением новых отечественных ФС в сотрудничестве с врачами и биологами МНИОИ им. П. А. Герцена методом КОМИРСИ ведется анализ накопления и распределения препаратов в пробах тканей пациентов. Результаты разработки метода КОМИРСИ успешно используются в исследованиях БАС в ИБХ РАН и в совместных научных исследованиях с МНИОИ им. П. А. Герцена, ФГУП ГНЦ «НИОПИК», МГАТХТ им. М В Ломоносова, Институтом иммунологии и Центром молекулярной биофизики (НЦНИ, г. Орлеан, Франция). Исследования, проведенные под моим научным руководством, с применением метода КОМИРСИ стали основой для двух магистрских и двух кандидатских диссертаций; готовится к защите третья кандидатская диссертация.

Результаты разработки метода КОМИРСИ могут быть полезны при коммерческой разработке отечественного лазерного сканирующего конфокального микроскопа с возможностью спектрального анализа и программного обеспечения к нему. Результаты,

изложенные в диссертации, могут быть использованы в работе лабораторий, занимающихся исследованиями БАС с применением методов оптической микроскопии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, а также представляют интерес для лабораторий и фирм, разрабатывающих ФС.

Исследованные объекты и примененные методы

Основными объектами исследований были противоопухолевый препарат митоксантрон, ФС на основе сульфированных производных фталоцианина, ФХрб, ЦИХЛ и ЦИБХЛ с различными заместителями введенными в пиррольные циклы А, D и в имидный цикл Е, октакарбоксифталоцианин кобальта, флуоресцентно-меченные пробы лектинов, цитотоксины из яда кобр Naja haje, Naja oxiana, Naja kaouthia, цитохром с и его генно-инженерные мутантные формы.

В работе широко использован разработанный автором метод КОМИРСИ, а также разнообразные методики на его основе. В исследованиях применяли традиционные методы оптической микроскопии, а также спектрофотометрии, флуоресцентной и КР-спектроскопии молекул в растворах.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты

1. Новый метод идентификации и изучения молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением (метод КОМИРСИ) на основе анализа полных спектров флуоресценции или KP.

2. Методика КОМИРСИ измерения концентрации БАС и их комплексов в живых клетках с учетом изменения формы спектра, тушения (усиления) интенсивности сигнала в различном микроокружении и при образовании молекулярных комплексов. Методика дает возможность оценки средних концентраций БАС в органеллах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также обеспечивает статистически достоверный анализ клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.

3. Методика КОМИРСИ на основе деконволюции полных спектров флуоресценции для изучения локализации БАС в живых клетках с использованием флуоресцентных зондов клеточных органелл. Методика обеспечивает исследование локализации БАС с одновременным введением до трех флуоресцентных зондов и возбуждением флуоресценции одной длиной волны лазера.

4. Методика КОМИРСИ для исследования распределения БАС в срезах тканей и оценки относительной концентрации БАС в различных структурах тканей.

5. Конструкция экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии, обеспечивающей проведение исследований методом КОМИРСИ.

6. ДНК является важной мишенью действия митоксантрона в раковых клетках, который, образуя комплексы с ней, вызывает остановку клеточного цикла на стадии анафазы.

7. Эффективное фотодинамическое действие безметального сульфированного фталоцианина со средним числом сульфо-групп на молекулу 2,4 (H2PcS2 4) достигается за счет его интенсивного накопления в плазматической мембране и цитоплазме раковых клеток в связанной с мембранными структурами мономерной фотодинамически активной форме, способной под действием света инициировать образование гидроксил-радикалов и синглетного кислорода. Способность H2PcS2 4 накапливаться в опухоли и окружающих ее тканях в активной форме является основой противоопухолевого эффекта фотодинамической терапии с использованием H2PcS2 4.

8. Структура электронных уровней порфиринов обеспечивает высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода (ф= 0,6-0,7), который не зависит от положения максимума длинноволнового поглощения (энергии первого возбужденного синглетного уровня) в диапазоне длин волн 665-820 нм, но на величину квантового выхода существенно влияют боковые заместители.

9. Отобранные в in vitro исследованиях по структуре и свойствам, ЦИХЛ-производные характеризуются высокой избирательностью накопления в опухолях животных, что определяет их противоопухолевый фотодинамический эффект.

10. Оптимизированные по структуре боковых заместителей, ЦИБХЛ-производные являются перспективными ИК-фотосенсибилизаторами для фотодинамической терапии рака.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались на 3-м Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс 1995); 16-й и 17-й Международных конференциях по спектроскопии KP (Cape Town 1998; Beijing, China

2000); 7-й международной конференции «Laser Applications in Life Seiendes» (Bratislava, Slovakia 1998); 2-м Съезде биофизиков России (Москва 1999); 8-й Международной конференции по спектроскопии биологических молекул (Enschede, the Netherlands 1999); 5-м Всеросийском съезде онкологов (Казань 2000); 9-м Конгрессе европейского фотобиологического общества Lillehammer, Norway 2001); 20-й Международной конференции по фотохимии (Москва 2001); 3-м Съезде фотобиологов России (Воронеж

2001); 9-й Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов (Суздаль 2003); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва 2003); Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-й годовщине со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва 2004); на Международном симпозиуме «Advances in Science for Drug Discovery. Chemistry-Biology-Informatics» (Москва 2005); на 10-м Всемирном конгрессе международной фотодинамической ассоциации (Munich, Germany 2005); на научных семинарах Центра молекулярной биофизики Национального центра научных исследований Франции (Orleans, France 2001, 2002), на семинарах лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (Москва 2001, 2002, 2003, 2004, 2005).

Публикации

Результаты работы изложены в 56 печатных работах, включая 33 публикации в рецензируемых отечественных и международных журналах и два патента.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка сокращений и списка литературы. Общий объем работы составляет 251 страницу текста, включая 122 рисунка, 20 таблиц и список литературы, содержащий 195 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во Введении обоснована необходимость и актуальность разработки и совершенствования спектральных подходов в области оптической микроскопии, в частности, для исследования БАС в клетках и тканях, сформулированы основные задачи, которые решались в данной диссертационной работе, перечислены объекты и методы исследования.

ГЛАВА I. МИКРОСПЕКТРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БАС. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ

В этой главе рассмотрено современное состояние проблемы применения спектрального анализа в микроскопии для изучения БАС в клетках. В начале главы дана краткая характеристика методов исследования БАС на основе микроскопии и флуоресценции, рассмотрены конструкционные особенности

микроспектрофлуориметров, начиная с экспериментальных лабораторных установок, разработанных в 60-х годах 20 века, и заканчивая современными коммерческими лазерными сканирующими конфокальными микроскопами (ЛСКМ), имеющими в своем составе спектральный модуль. Далее дан обзор литературы, характеризующий развитие и применения микроспектрофлуориметрии (МСФ) в исследованиях БАС. Представлены результаты исследования в живых клетках ксенобиотиков, включая полициклические ароматические углеводороды, лекарства против псориаза, противоопухолевые соединения. Рассмотрены применения МСФ в измерениях внутриклеточных концентраций свободных ионов кальция и магния. Дан обзор исследований методом МСФ фотосенсибилизаторов. Обсуждаются результаты анализа методом МСФ собственной флуоресценции клеток.

Следует отметить, что к началу разработки метода КОМИРСИ традиционные флуоресцентная микроскопия и ЛСКМ в подавляющем большинстве случаев были не применимы для количественного анализа БАС в клетках и срезах ткани. Это ограничение в первую очередь было связано с тем, что на основе измерения интегрального по полосе пропускания светофильтра сигнала невозможно распознать и учесть изменения внутриклеточных спектров БАС, сопровождающиеся изменениями квантового выхода флуоресценции. Были уже известны работы, в которых, используя метод МСФ, авторы проводили количественные оценки концентрации противоопухолевых препаратов в ядрах раковых клеток в культуре. Однако все эти оценки проводились на основе измерений спектров всего в нескольких точках клетки, в ряде случаев без использования конфокальной схемы фильтрации сигнала и на основе довольно упрощенного анализа внутриклеточных взаимодействий.

ГЛАВА II. ПРИБОРНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОМИРСИ

Во второй главе рассмотрены конструкционные особенности конфокального сканирующего микроспектрометра фирмы Dilor (раздел II. 1.1.) и созданной мной экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии (раздел II. 1.2.). С использованием этих приборов разрабатывался метод КОМИРСИ и были получены все основные результаты данной диссертационной работы. Во второй части (раздел II.2) этой главы представлены результаты разработки метода КОМИРСИ.

В основу метода КОМИРСИ (в статьях на английском языке- confocal spectral imaging technique) положен следующий общий алгоритм:

1. Конфокальный сканирующий микроспектрометр используется для измерения в каждой точке сканируемого оптического сечения образца полных спектров флуоресценции или КР. Важно, что эти спектры измеряются с трехмерным (как правило, субмикронным) пространственным разрешением;

2. Измеренный двумерный (2М) набор спектров в полном объеме сохраняется в виде файла, что дает отсроченную возможность многократного анализа этих спектров и использования их для реконструкции спектральных изображений на основе различных вариантов интерпретации обнаруженных сигналов;

3. Измерения повторяются для аналогичных образцов (например, группы клеток, серии срезов ткани) приготовленных в тех же и измененных условиях;

4. На основе интерактивного анализа 2М массива спектров, измеренных от образца, имеющейся информации о числе и природе присутствующих в образце хромофоров, с привлечением спектров флуоресценции или КР этих хромофоров определяется предварительный базисный набор спектров сравнения, который используется для разложения экспериментальных спектров по базису. Точность и адекватность этого разложения контролируется, как для всех измеренных точек одного образца, так и для аналогичных образцов;

5 На основе обнаруженных неточностей разложения спектров по базису выявляются недостающие спектры сравнения и/или уточняются условия измерения спектров от изолированных хромофоров для более точного описания всех спектров, наблюдаемых в образцах В результате формируется окончательный базисный набор спектров сравнения, точно и адекватно описывающий каждый спектр исследуемого образца,

6 Каждый спектр из измеренного 2М спектрального массива представляется в виде линейной комбинации спектров сравнения, а вклад каждого из базисных спектров в общий сигнал характеризуется его интегральной интенсивностью В результате для каждого из базисных спектров реконструируется 2М-изображение (спектральное изображение), описывающее интенсивность данного типа спектра в каждой точке образца;

7. Спектральные изображеггия сравниваются, интерпретируются и подвергаются дальнейшей обработке, исходя из того, какой смысл несут в себе базисные спектры;

8. При изменении условий приготовления исследуемых образцов (например, при стимуляции или ингибировании каких-то процессов в клетках) базисный набор спектров сравнения вновь подвергается проверке на точность и адекватность описания экспериментальных спектров Только после этого он может быть использован для реконструкции и анализа спектральных изображений, измерешплх в новы\ условиях.

11.1. Приборное обеспечение для конфокальной сканирующей микроспектроскопии

Приборное обеспечение является одним из важнейших условий успешного развития метода конфокальной сканирующей микроспектроскопии и во многом предопределяет, как диапазон решаемых задач, так и результаты применения метода.

11.1.1. Конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы ИИог

Принципиальная оптическая схема конфокального сканирующего микроспектрометра фирмы ОПог, в разработке которого я принимал непосредственное участие, представлена

Рисунок 1 Принципиальная схема линейного сканирования, используемая в приборе для конфокальной сканирующей микроспектроскопии фирмы 011ог (Франция) (РеоГапоу с! а1 1995)

на рисунке 1 Сканирование образца в этом приборе осуществляется с помощью синхронизованных зеркал-сканеров Колеблясь с частотой 10-20 Гц, первый сканер отклоняет лазерный луч, периодически перемещая сфокусированное объективом световое пятно вдоль пинии а-б-в на образце (Рис 1). Рассеянный назад и излученный образцом сигнал собирается объективом и отражается сканером назад вдопь оптической оси, по которой пришеч возбуждающий луч Перестраиваемая конфока шиая диафрагма опшчеекм сопряжена с фока п.пой плоскостью объектива и обеспечивав i как в любом конфокальном микроскопе, подав чение си i налов, oí слоев обраща выше и ниже фокуса обьектива. Светодели тельная пластина нейтральной оптической плотности (пропускание 50%) обеспечивает соосное прохождение возбуждающею лазерного луча и собранною сигнала ме,гду пластиной и фокалыюй плоскостью объекгива Rгорой сканер колеблется синхронно по фазе с первым сканером и распрецечяст отфилырованный конфокальной диафрагмой сигнал опять вдоль линии Затем с сохранением пространственного разрешения сигнал раскладывается спектрометром в спектр и фокусируется на 2М детекторе: спектры от различных точек вдоль линии а-б-в образца проецируются на различные ряды пикселов ССД-детектора, прибора с заряновьгм сопряжением (Рис 1) Полное 2М спектральное изображение записывается путем сканирования образца линия за линией, а перемещение образца осуществляется с помощью моюризованною предметною столика ЗМ спектральное июбражспис регистрируется, как набор 2М спектральных июбражслий. ¡¿писанных при ра;чичпоы ноложешт фокуса Jiaiepnoio луча вдоль оптической оси объектива (оси Z).

Линейное сканирование с помощью сканера пошоляет записывать спектры с постоянным пространственным разрешением от сотен к>чек образца параллельно, облегчая теплообмен, снижая фотообесцвечивание флуорофоров и уменьшая время измерения 2М спектрального изображения по сравнению с по-точечным сканированием Пространственное разрешение этого прибора АХ=ДУ=0.3 мкм, AZ=2 мкм. При этом разрешении 9600 спектров флуоресценции формирующих основ) геталытого сиекгралыюго изображения размером 120x80 точек (область сканирования 36x24 мкм) могут быть измерены и переданы в память компьютера за 45 с

II. 1.2. Ршработка лабораторной экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии

Для обеспечения исследований методом КОМИРСИ в ИБХ РАН мною с использованием коммерчески-доступных блоков создана экспериментальная установка для конфокальной сканирующей микроспекгроскопии (Рис 2) Возбуждение спектров в этой установке осуществляется одним из четырех лазеров: Аг'-лазер (/.„ - 457, 477, 488 или 514,5 им), Ile-Ne лазер (лех = 632,8 нм), непрерывный Nd,+-YAG лазер (/.ех = 532 нм), диодный лазер (А.м = 405 нм). Лазерный луч, проходит через фильтры, расширяется с помощью линз и через свстоделительную пластину (СП) нейтральной плотности с пропусканием 50% заводится в микроскоп (Рис. 2) В режиме лазерного сканирования зеркало 32 направляет лазерный л>ч через объект ив на образец и собранный объективом сигнал от образца обратно на СП. СП отражает 50% сигнала на линзу (Л), которая фокусирует его на конфокальную 'тиафратчу (КД) КД (диаметр 50, 100 или 150 мкм но выбору) усыновлена в сопряженной фокальной плоскости обьекгива и по гат'чяег сит пал от с loéis обращл выше и шис скаш1р\смот о обеспечивая тем самым шпмссши с обьеыивоч ра (решение \/ Зеркало í4 иаправ mei сиг на i черсч юлот рафичсскип фи плр (I Ф) па чишу, которая фоку сиру ei ею на в\о иту ю щель cneKipoi рафа (С) У ;кополосныи ГФ (Notch фильтр, ширина полосы подавления 500 см"', коэффициент подавления 5/ 10 ) подавляет упругую компоненту рассеяния на длине волны X^ В спектрографе (длина фокуса 500 мм) сигнал раскладывается в спектр плоской нарезной решеткой (600

и

штрихов/мм) и проецируется на ССД-камеру (система детекции на основе прибора с зарядовым сопряжением) с воздушным Пелтье-охлаждением (Wright Instruments LTD, Англия).

Установка создана на базе прямого микроскопа ВН2 (Olympus, Япония, Рис. 2) Для микроспектральных измерений используются объективы Olympus: 60х водоиммерсионный U Plan Apochromat (UPLAP060xW/l 2, NA=I,2, рабочее расстояние WD=0,25 мм); ЮОх маслоиммерсионный U Plan Apochromat (UPLAPOlOOxOI/O 50-1 35, NA=1,35, WD=0,1 мм); 50x сухой (MDPLAN50, NA=0,75) Образец размещается на предметном столике с электронно-механической системой микропозиционирования (Marzhauser-Wetzlar, Германия) и перемещается в плоскости XY с точностью 0,1 мкм. В состав микроскопа с помощью сконструированных механических адаптеров встроен флуоресцентный модуль от микроскопа ВХ50 (Olympus, Япония) с револьверным держателем на 4 флуоресцентных блока с фильтром возбуждения (ФВ), дихроичным зеркалом (ДЗ) и анализирующим фильтром (АФ) (Рис 2) На выходе гринокуляра микроскопа установлена видео-ССД-камера, согласованная с микроскопом с помощью фотоокуляра и С-адаптера Цифровой фотоаппарат Coolpix 4500 (Nikon, Япония) сопряжен с микроскопом через один из окуляров бинокуляра (Рис 2)

АФ- анализирующий фильтр, ГФ- голографический фильтр, ДЗ- дихроичное зеркало, 3- зеркало,

ИФ- интерференционный фильтр, КД- конфокальная диафрагма, Л- линза, Р- решетка,

С- входная щель спектрографа, СЗ- сферическое зеркало, СП- светоделительная пластина

(50 50), ФВ- фильтр возбуждения, ФНП- фильтр нейтральной плотности

Нг^е пир 61* 8 М "1 А!, лсгр диодный икр 41>>

Рисунок 2 Принципиальная схема экспериментальной установки для конфокальной сканирующей чикроспектроскопии

С использованием этой установки возможно автоматическое измерение в каждой точке микрообразца спектра флуоресценции (спектра КР) с трехмерным субмикронным пространственным разрешением (ДХ=ДУ=0,3 мкм, Д/=3 мкм; ДУ=0,2 мкм3) Регистрация спекфальных изображений происходит методом поточечного сканирования Время измерения отдельного спектра определяется интенсивностью сигнала и может быть нобым, начиная от 0,1 с Спектральное разрешение можно изменять от 0,5 нм до 10-20 нм (в спектрах КР от 5 до 20 см"1) в зависимости от задачи, путем объединения пикселов ССД-детектора в процессе1 считывания спектров Область сканирования (при максимальном пространственном разрешении) варьируется от 5x5 до 200x200 мкм

Исследование более протяженных объектов возможно путем по-кадрового сканирования или с использованием объектива с меньшим увеличением

Пакет программ, разработанный С. Шароновым (Реймский университет-''Dilor", Франция), обеспечивает управление измерением, анализ записанного набора спектров, математическое разложение на компоненты, соответствующие различным типам спектров, и реконструкцию спектральных изображений.

На созданной установке с применением метода КОМИРСИ успешно ведутся разнообразные исследования БАС в клетках и срезах тканей (Filatov et al, 2003; Chudakov et al., 2003; Водовозова и др., 2004; Назарова и др., 2005; Sharonov et al., 2005; Feofanov et al., 2005; Karmakova et al., 2005).

По сравнению с современными коммерческими конфокальными микроскопами, имеющими в своем составе спектральные модули, в нашей экспериментальной установке обеспечено намного более эффективное подавление светорассеяния на длине волны возбуждения, а это важно для измерения слабых сигналов, для записи спектров флуоресценции и КР вблизи Хех. У системы детекции в нашем приборе намного более высокая чувствительность в красной области спектра (650-850 нм), что критично для исследования БАС (в частности, фотосенсибилизаторов), флуоресцирующих в этом диапазоне. Использование системы детекции на основе прибора с зарядовым сопряжением и Пелтье-охлаждения обеспечивают расширенную возможность анализа слабых сигналов и пониженный уровень шумов в спектральных изображениях по сравнению с неохлаждаемыми ФЭУ коммерческих конфокальных микроскопов. Еще одним важным преимуществом является удобное программное обеспечение, которое в процессе разработки было подвергнуто адаптации для анализа и обработки больших массивов спектров.

II.2.1. Идентификация и изучение молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках методом КОМИРСИ

Молекулярные взаимодействия, в которых участвует БАС, могут вызывать заметные изменения его спектров флуоресценции или КР. Если объект исследования - живая клетка, то измерение внутриклеточных спектров БАС методом МСФ открывает путь к идентификации и изучению молекулярных взаимодействий и микроокружения БАС в живых клетках. Регистрация внутриклеточных молекулярных взаимодействий БАС, относящихся к лекарственным препаратам, - это ключ к пониманию механизмов их функциональной активности. Такая уникальная возможность привлекала и продолжает привлекает многих исследователей, однако применяемые на основе МСФ методические подходы имеют ряд серьезных недостатков: (i) часто измеряют усредненные спектры от всей клетки, ядра или цитоплазматической области, что приводит к потере информации об особенностях молекулярных взаимодействий на субмикронном уровне и о пространственном распределении комплексов; (ii) сходные недостатки и у подходов, основанных на измерении спектров в 5-15 произвольно выбранных точках клетки (ядра): (iii) во многих случаях не используется конфокальная система фильтрации сигнала, что резко снижает пространственное разрешение; (iv) методики анализа изменений во внутриклеточных спектрах БАС необоснованно упрощены и практически не разработаны; (v) недавно появившиеся в составе коммерческих J1CKM спектральные модути измеряют спектры с шагом (спектральным разрешением) несколько нм, что во многих случаях недостаточно для анализа изменений в спектрах, вызванных молекулярными взаимодействиями БАС.

Разработанный в данной диссертационной работе, оригинальный подход к изучению внутриклеточных взаимодействий и микроокружения БАС с применением метода КОМИРСИ основан на измерении полных спектров в каждой точке живой клетки с ЗМ

субмикронным разрешением. Условия эксперимента (мощность лазера и время накопления спектров) выбираются таким образом, чтобы в процессе измерения не происходило фотоиндуцированного изменения распределения БАС, его фотообесцвечивания и (или) изменения спектров. Это контролируется сравнением результатов последовательных повторных измерений. При анализе измеренного массива спектров сначала выявляются отличия во внутриклеточных спектрах изучаемого БАС и, по возможности, локализация соединения с измененными спектрами. Затем в растворах проводится детальное исследование влияния на спектры различных молекулярных взаимодействий БАС, а также изменений параметров микроокружения (гидрофобность, полярность, рН среды). Измерения спектров от растворов выполняются с помощью конфокального сканирующего микроспектрометра при той же длине волны возбуждения, что и клеточные эксперименты Молекулярные взаимодействия и влияние микроокружения могут вызывать сдвиг, изменение формы, усиление или тушение интенсивности спектров. Сдвиг и изменение формы учитываются автоматически при разложении экспериментальных спектров на базисные, а поправка на тушение/ усиление интенсивности вводится после реконструкции спектральных изображений, путем умножения шкалы интенсивности изображения на соответствующий коэффициент. В выполненных исследованиях (РеоГапоу е! а1., 1997; РеоГапоу е1 а!., 2000) показана возможность распознавания в живых клетках комплексов с перекрывающимися спектрами, максимумы флуоресценции (положения линий КР) которых отличаются всего на 5-7 им (5 см'1).

В результате такого анализа выявляются комплексы и микроокружение БАС, реализующиеся в клетках и распознаваемые по спектрам, и определяется базисный набор спектров сравнения, наиболее точно описывающий внутриклеточные состояния и взаимодействия изучаемого соединения. При необходимости в базисный набор спектров сравнения включается также спектр(ы) собственной флуоресценции клетки Если в клетках наблюдаются сигналы, которые не описываются модельными спектрами исходного БАС и не относятся к эндогенной клеточной флуоресценции, исследуется вопрос о возможном образовании флуоресцирующих продуктов метаболизма.

В конечном итоге 2М массив клеточных спектров раскладывается на линейную комбинацию базисных спектров сравнения. Интенсивность базисных спектров характеризует в каждой точке клетки состояние (микроокружение) исследуемого соединения и присутствие его различных комплексов. Реконструированные карты распределения по клетке этих состояний и комплексов (спектральные изображения) описывают накопление, микроокружение и взаимодействия изучаемого соединения в различных клеточных доменах и структурах. В комбинации с методиками, описанными в разделе П.2.3, данный подход впервые обеспечивает надежную основу для уникальных исследований, цель которых - идентификация и неразрушающий количественный анализ молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках

11.2.2. Проблема собственной клеточной флуоресценции и ее решение методом КОМИРСИ

В этом параграфе рассмотрены несколько конкретных примеров, демонстрирующих необходимость корректного учета собственной флуоресценции клетки при проведении исследований методами флуоресцентной микроскопии Основанный на анализе полных спектров флуоресценции и разложении экспериментальных спектров на составляющие их компоненты, метод КОМИРСИ позволяет правильно учесть вклад собственной флуоресценции клетки, какой бы сложной ни была форма спектра Это особенно важно при анализе малых внутриклеточных концентраций БАС. слабо флуоресцирующих молекул или при наличии интенсивного сигнала собственной флуоресценции клетки.

Проблема учета эндогенной флуоресценции стоит особенно остро при исследовании локализации БАС в срезах тканей животных и человека. Собственная флуоресценция клеток ткани может давать значительный вклад в измеряемый сигнал даже при возбуждении в красной области спектра. Вклад эндогенной флуоресценции и количество отличающихся по происхождению и форме сигналов резко возрастает по мере сдвига Хсх в область короче 630 нм. Распределение эндогенной флуоресценции неоднородно и зависит от типа клеток и тканевых структур. Количество БАС, которое вводится в организм человека или животного, жестко ограничено нетоксическими дозами, и концентрация БАС в исследуемых тканях, как правило, мала. Достоверно разделить эндогенные сигналы и флуоресценцию БАС, интенсивность которой мала, без анализа полных спектров флуоресценции с привлечением метода КОМИРСИ практически невозможно.

Следует отметить, что широко используемые в традиционной ЛСКМ процедуры разделения перекрывающихся сигналов (unmixing) дают хороший результат только в случае двух компонентов с высокой интенсивностью сигнала и значительно отличающимися спектрами.

11.2.3. Измерение концентрации БАС и их комплексов в живых клетках методом КОМИРСИ

Отталкиваясь от пионерских работ в области МСФ (обзор этих работ представлен в Главе I), мы пришли к пониманию, что регистрация полных спектров флуоресценции БАС с трехмерным пространственным разрешением является необходимой основой для количественного анализа БАС в живых клетках. С применением метода КОМИРСИ разработаны оригинальные методики измерения внутриклеточной концентрации БАС, которые основаны на следующих принципах:

1. Измерение внутриклеточной концентрации БАС возможно, если БАС обладает собственной флуоресценцией (интенсивным сигналом КР) или оно помечено флуорофором, который не мешает функциональной активности БАС;

2. Внутриклеточные спектры БАС должны точно и адекватно описываться набором спектров сравнения. Спектры сравнения должны быть получены в результате моделирования молекулярных взаимодействий и микроокружения БАС в растворах с известной концентрацией мономерной формы БАС в составе комплексов или в исследуемом окружении. В результате модельных экспериментов помимо формы спектра для спектров сравнения должны быть определены относительные коэффициенты усиления/тушения флуоресценции. Измерение этих коэффициентов проводится при той же А.еч, что и измерения на клетках, т.к. коэффициенты зависят от

3 Количественный анализ возможен только при проведении измерений с трехмерным пространственным разрешением (т.е. с использованием конфокальной схемы фильтрации сигнала). При этом толщина оптического сечения AZ должна быть меньше, чем толщина исследуемых клеток, а оптический слой AZ, от которого измеряется сигнал, должен находиться внутри объема клетки. С использованием одного из модельных растворов БАС должна быть измерена калибровочная зависимость интегральной интенсивности спектра от концентрации мономерной формы БАС в растворе. Это измерение должно проводиться на том же приборе, с той же при той же мощности лазера и с тем же разрешением AZ, что и измерения на клетках. Время накопления спектров может быть любым, но тогда интенсивность калибровочных спектров подлежит коррекции, с учетом времени накопления внутриклеточных спектров.

4 Для проведения количественного анализа необходимо обеспечить условия измерений (в первую очерель, мощность лазера и время накопления спектров), при которых не происходит фотоиндуцированных изменений спектров, перераспределения и фотообесцвечивания исследуемого БАС.

5. Количественный анализ реализуется после разложения 2М массива спектров на линейную комбинацию спектров сравнения Осуществляется он для реконструированных спектральных изображений (2М карт распределения комплексов БАС и состояний БАС в различном микроокружении) путем умножения интенсивности каждого спектрального изображения на свой коэффициент, обеспечивающий пересчет интенсивности сигнала в концентрацию. Этот коэффициент определяется на основе калибровочной зависимости с учетом поправки на относительный коэффициент усиления/тушения флуоресценции для соответствующего спектра сравнения Подобрав в модельных экспериментах условия, в которых происходят изменения формы спектров БАС, точно и адекватно отражающие изменения формы спектров БАС в клетках, мы полагаем, что и интенсивности сигналов жвимолярных количеств БАС в клетке и в модельных условиях будут одинаковыми Гогда, сравнивая интенсивности одинаковых по форме спектров от равных микрообъемов клетки и модельного раствора с известной концентрацией БАС, мы можем оценить концентрацию БАС (его комплексов) в микрообъеме клетки

6. Количественный анализ правильнее проводить на живых клетках, а не на фиксированных. При исследовании живых клеток исключены артефакты, вызванные процедурой фиксации Если необходимо использовать фиксированные клетки, то предварительно должны быть выполнены сравнительные контрольные эксперименты на живых и фиксированных клетках Первая цель этих экспериментов - определить на живых клетках набор спектров сравнения и проверить сохранение точности и адекватности анализа с использованием этого набора на фиксированных клетках Вторая цель -сравнить результаты количественного анализа на живых и фиксированных клетках, показав их совпадение.

7. В результате количественного анализа в каждом микрообъеме сканируемого оптического сечения клетки измеряется концентрация мономерной флуоресцирующей формы БАС Агрегаты БАС во многих случаях теряют способность флуоресцировать, и их концентрация в живых клетках методом КОМИРСИ не определяется. Если БАС образ) ет в клетках эксимеры или флуоресцирующие агрегаты, то для их количественного анализа (если он вообще возможен) требуется проведение детальных исследований в растворах с целью установления взаимосвязи между интенсивностью флуоресценции и концентрацией БАС в таких состояниях. В настоящее время у нас нет разработанных методик для оценки концентрации эксимеров или флуоресцирующих агрегатов БАС в клетках. Частично или полностью избежать проблемы агрегатов можно, проводя исследования при низких концентрациях БАС в клетках и во внешней среде. При таких условиях в общем случае обеспечивается доминирование мономерной формы БАС.

По результатам проведенных исследований сформулирован ряд следующих правил, соблюдение которых повышает точность и воспроизводимость количественного анализа Присутствие в клеточной среде сыворотки по-разному влияет на накопление БАС в клетках, поэтому количественный анализ необходимо проводить, поддерживая одинаковый процент сыворотки в тех экспериментах, результаты которых будут сравниваться Следует учитывать, что температура, при которой проводится инкубация, оказывает большое влияние на накопление БАС в клетках Измерение и выравнивание объема среды в лунке перед внесением БАС улучшает точность анализа. Для корректного сопоставления независимых тестов на функциональную активность (цитотоксичность) и результатов измерения внутриклеточных концентраций БАС сопоставляемые эксперименты следует проводить при одинаковых концентрациях ЬАС в среде или в пределах линейного участка зависимости внутриклеточной концентрации от концентрации БАС в среде.

Чтобы обеспечить статистически достоверный анализ, для каждого режима инкубации клеток с исследуемым веществом мы выполняем измерения на ограниченной

выборке клеток (10-20 клеток). Большинство режимов инкубации воспроизводится несколько раз, и средняя концентрация в итоге определяется по 30-60 измеренным клеткам.

Так как каждая точка видео изображения клетки напрямую сопоставлена с соответствующей точкой на 2М картах распределения БАС, то с помощью подходящей программы (например, Image J, National Institute of Health, США) можно обвести границу клетки, ядра и/или каких-то локализованных клеточных структур и определить в пределах обведенных зон средние концентрации БАС и его комплексов Таким образом нам удается определить средние концентрации соединения и его комплексов в цитоплазматической области, в ядре, в нуклеолях, а также в среднем по клетке

Разработанные на основе метода КОМИРСИ количественные методики лазерной сканирующей цитометрии успешно применяются для исследования концентрационных и временных зависимостей клеточного накопления, распределения и выведения различных "1

ФС и флуоресцентно-меченных БАС.

Временные зависимости клеточного накопления с хорошей точностью удается описать уравнением:

Ccyl(t) = Си Kk t / (Tup+ t) (1),

где C„,(t) - средняя цитоплазматическая концентрация ФС, зависящая от времени инкубации t (исследованные нами ФС в ядро не проникают); Ccv -концентрация ФС во внешней среде; К^ - максимальное значение отношения Сч,/Сех при насыщении накопления; Тир - время инкубации, при котором Ст достигает 50% от уровня насыщения. Данные по выведению ФС из клеток хорошо описываются с помощью уравнения:

Cert(t)= Сет1(0) exp(-ln21 /Trf) (2),

где Сч,(0) -средняя цитоплазматическая концентрация ФС в момент времени, когда ФС был удален из внешней среды; Tef- время полувыведения ФС из клеток.

Точность и воспроизводимость разработанных в данной работе количественных методик напрямую и косвенно подтверждаются следующими данными. Результаты анализа внутриклеточной концентрации противоопухолевого соединения митоксантрона, полученные методом КОМИРСИ (раздел IV.1), согласуются с оценкой, выполненной методом химической экстракции митоксантрона из клеток (Feofanov et al., 1997). Отличия в средних цитоплазматических концентрациях ЦИХЛ- и ЦИБХЛ- производных, выявленные методом КОМИРСИ (разделы IV.3 и IV.4), отражают отличия в относительной фотоиндуцированной цитотоксичности этих ФС (Feofanov et al, 2004; Sharonov et al., 2005). Рост внутриклеточной концентрации ЦИХЛ- производных, как функция времени инкубации клеток с этими соединениями, обнаруживаемый методом КОМИРСИ, сопровождается возрастанием фотоцитотоксического эффекта При выходе измеряемой методом КОМИРСИ внутриклеточной концентрации ФС на плато достигается максимальная и постоянная по величине фотоцитотоксичность (Feofanov et al., 2004). Показана прямая корреляция между относительной фотоцитотоксичностью H2PcS24 и внутриклеточной концентрацией H2PcS24, измеренной методом КОМИРСИ в клетках Raji, А549 и НЕр2 (Feofanov et al, 2002).

П.2.4. Применение метода КОМИРСИ для идентификации клеточных структур, в которых происходит преимущественное накопление исследуемых БАС

Одна из задач, решаемая методом КОМИРСИ,- это изучение внутриклеточной локализации БАС. определение органепл, преимущественно накапливающих исследуемое соединение Метод КОМИРСИ позволяет измерить и сравнить взаимное распределение БАС и флуоресцентного зонда анализируемых клеточных структур и путем перебора зондов выявить те органоиды, в которых накапливается БАС Показано, что во!можен анализ локализации исследуемого БАС с введением в клетку одновременно 2-3

флуоресцентных зондов На рисунке 3 приведен пример исследования взаимного распределения 4 флуорофоров- двух ФС и двух зондов клеточных органелл Важнейшим преимуществом метода КОМИРСИ является возможность с помощью процедуры деконволюции спектров полностью разделить перекрывающие спектры флуорофоров и повысить тем самым надежность анализа (Рис. 3, е).

Рисунок 3 Метод КОМИРСИ позволяет изучать взаимное внутриклеточное распределение нескольких соединений с перекрывающимися спектрами флуоресценции

(а) микрофотография клетки А549 (метка- 5 мкм), (б-д) конфокальные спектральные изображения распределения митохондрий, окрашенных Р6Ж (б), аппарата Гольджи, окрашенного BODIPY-церамидом (в), производного пирофеофорбида а (г) и ЦИХЛ (д)

(е) пример представления внутриклеточного спектра в виде линейной суперпозиции спектров Р6Ж, BODIPY-церамида, производного пирофеофорбида а и ЦИХЛ Расчетный спектр перекрывается с экспериментальным Размер спектрального изображения 80x60 точек (AX=AY= 0,4 мкм, AZ=3 мкм, >.схс=543 им) Время сканирования - 60 сек

Для выявления пространственного совпадения локализации двух исследуемых БАС или БАС и зонда клеточных органоидов используется компьютерное совмещение 2М спектральных изображений, а также дополнительные программные процедуры, обеспечивающие визуализацию и оценку степени со-локализации флуорофоров.

Разработанные на основе метода КОМИРСИ методики идентификации клеточных органоидов, в которых происходит преимущественное накопление исследуемых БАС, успешно использованы в исследованиях различных ФС (Feofanov et al., 2002, 2004; Назарова и др., 2005) и цитотоксинов из яда кобр (Feofanov et al., 2005). Методики выявления со-локализации двух флуорофоров использовались при изучении со-локализации флуоресцентно-меченных антител на мембране клеток (Filatov et al. 2003).

11.2.5. Исследования распределения БАС в срезах тканей методом КОМИРСИ

Уникальной особенностью метода КОМИРСИ является возможность использовать результаты модельных исследований в растворах и данных, полученные на клетках в культуре для проведения исследований на тканевом уровне

Для проведения исследований необходимы криостатные срезы тканей. Такие срезы готовятся путем замораживания в жидком азоте забранного хирургическим способом тканевого материала и нарезания его в виде тонких срезов (5-10 мкм) с помощью криотома Нарезаемый материал сразу же переносится на предметное стекло и полученный препарат хранится при -20°С Процедура приготовления срезов разработана и реализована в описываемых исследованиях к б н ТА. Кармаковой (МНИОИ им П.А. Герцена) До проведения исследований срезы не обрабатываются ни фиксирующими

агентами, ни гистохимическими красителями, чтобы избежать искажения реального распределения изучаемого соединения в результате его вымывания из тканевых структур, агрегации и химической модификации. Стандартные процедуры фиксации и окрашивания, необходимые для детальной идентификации тканевых структур, выполняются после микроспектральных измерений

Рисунок 4 Распределение АЛК-индуцированного протопорфирина IX в ткани базалиомы человека после местного нанесения аминолевулиновой кислоты (АЛК) в виде мази

(а) Изображение неокрашенного среза кожи пациента в проходящем белом свете Э - эпидермис, Д-дерма, Б - базалиома, (б, в) спектральные изображения распределения эндогенной флуоресценции с максимумом 580 нм (5) и протопорфирина IX (Хет=633 нм) (<), (г) вид спектров флуоресценции в точках среза 1 и 2 (точки отмечены на изображениях стрелками)

К исследованию на тканях мы приступаем, имея в своем распоряжении результаты клеточных исследований и моделирования молекулярных взаимодействий, и в первую очередь проверяем применимость базового набора спектров сравнения для описания экспериментальных спектров. Отмечу, что у нас пока не было случаев, чтобы модельные спектры, описывающие состояние БАС в клетках, не подошли для анализа тканей. При необходимости в базовый набор вводятся спектры собственной флуоресценции ткани, обнаруженные в исследуемых срезах Затем измеренные 2М массивы спектров БАС в тканях подвергаются разложению на линейную комбинацию спектров сравнения, в результате чего реконструируются спектральные изображения, описывающие распределение БАС или его компонентов (комплексов) в тканевых структурах. Опираясь на идентификацию тканевых структур, присутствующих в измеренном изображении, с помощью программы Image J (National Institute of Health, США) выполняется расчет средней интенсивности сигнала по области, занимаемой той или иной структурой Измерения, выполненные в разных частях среза, обеспечивают данные о содержании БАС в разных структурах и в аналогичных, но удаленных друг от друга структурах ткани После усреднения эти данные используются для анализа относительной концентрации БАС в различных типах ткани.

Впервые показано, что метод КОМИРСИ применим для изучения тканевого распредетения, как флуоресцирующих БАС (Рис. 4), так и нефлуоресцирующих, но обладающих интенсивным поглощением (Feofanov et al., 1999; Karmakova et al.. 2004, Karmako\ a et al., 2006, Feofanov et al, 2000). В последнем случае используется измерение колебате 1ьных спектров БАС на основе эффекта резонансного КР (Рис. 5)

,„ —» !_. - 6 Рисунок 5 Микрофотография среза ткани мыши (а) и конфокальное спектральное изображение распределения октакарбоксифталоцианина кобальта (препарат «Терафтал») в этом срезе, измеренное на основе эффекта резонансного КР Метка - 25 мкм Э- эпидермис, СТ - соединительная ткань, Ф-волосяной фолликул Шкала интенсивности сигнала - отн ед

Измерения относительной концентрации БАС в тканях опираются на предположение, что в высушенных в результате заморозки срезах БАС остается в мономерной флуоресцирующей форме и не подвергается агрегации из-за снижения содержания воды в срезе. Это допущение вполне оправдано в случае липофильных БАС, для которых в роли «растворителя» выступают липиды и гидрофобные тканевые структуры. Исследованные в данной диссертационной работе ЦИБХЛ. ЦИХЛ, безметальный сульфированный фталоцианин, фракции низкосульфированных фталоцианинов алюминия являются липофильными соединениями В тоже время большинство тканевых структур — это высоко конденсированные среды, и даже водорастворимые молекулы в большей части оказываются связанными с клеточными структурами, а также с белками и волокнами в межклеточном пространстве и не подвергаются значительной агрегации при замораживании срезов тканей. Например, спектры флуоресценции водорастворимого тетрасульфированного фталоцианина алюминия в срезах ткани соответствуют спектрам его комплексов с белками (РеоГапоу е1 а1., 1999). В контрольных экспериментах попытки увлажнить исследуемые срезы не приводили к увеличению интенсивности сигнала. Специально проведенные повторные измерения интенсивности сигнала ЦИХЛ в срезах, подвергнутых нескольким циклам заморозки-разморозки, не выявили падения интенсивности сигнала, которое можно было бы приписать агрегации при более полном высушивании среза.

В принципе, количественные методики на основе метода КОМИРСИ (описаны в параграфе П.2.3.) применимы при исследовании срезов тканей и для оценки абсолютной концентрации ФС в различных тканевых структурах Нами впервые измерены концентрации новых ЦИБХЛ- и ЦИХЛ- производных в срезах тканей мышей с перевивными опухолями (Кагтакоуа е1 а1., 2006; вЬагопоу е! а1., 2005). Данный подход предоставляет уникальную возможность прямого сравнения различных производных противоопухолевых соединений по их способности накапливаться в опухоли, а также различных систем направленной доставки лекарственных препаратов в опухоль и может значительно облегчить первичный скрининг флуоресцирующих антибиотиков и других лекарственных соединений, а также оптимизацию их фармакологической формы

Обобщая результаты оригинальных исспедований ФС. проведенных нами на срезах тканей мышей, основными направлениями применения метода КОМИРСИ являются'

- исследование относительной (или абсолютной) концентрации ФС в различных тканевых структурах при выбранном промежутке времени после введения в организм ФС. Если именно этот временной интервал используется для проведения ФДТ, то данные метода КОМИРСИ позволяют понять реализующиеся механизмы противоопухолевого

действия (например, сосудистое воздействие, прямое повреждение опухолевых клеток, повреждение поддерживающих опухоль тканей);

- измерение профилей распределения ФС в пределах опухолевых узлов для оценки однородности накопления ФС в опухоли и профилей распределения ФС по срезу (от кожи в глубь ткани, от сосудов к периферии и т п ) для выяснения особенностей проникновения ФС в ткани и их накопления там;

- измерение зависимости концентрации ФС в опухоли и окружающих тканях от времени после введения ФС. Эти исследования позволяют охарактеризовать ФС по избирательности накопления в опухоли, определить по максимуму накопления наиболее оптимальное время для проведения ФДТ, сравнить свойства данного ФС с другими исследуемыми ФС.

Методики, которые первоначально были разработаны и прошли апробацию на срезах тканей мышей, оказались применимыми и для анализа проб тканей пациентов. Пробы тканей пациентов были предоставлены д.м.н. В.В. Соколовым и к.м.н. Е. Филоненко, а подготовлены для измерений к.б.н. Т.А. Кармаковой (МНИОИ им. П.А. Герцена). Эти исследования позволяют:

1. выяснить способность разных ФС, используемых в клинике, накапливаться в опухолях, отличающихся по происхождению и локализации. Здесь метод КОМИРСИ дает возможность однозначно оценить накопление ФС именно в опухолевых клетках, сравнив его с окружающими тканями Это позволяет обосновать выбор ФС для лечения данного типа опухолей, а также дает детальное знание локализации ФС;

2 сравнить эффективность различных способов введения ФС по уровню накопления ФС в опухолевых клетках, по однородности распределения ФС в опухоли, по особенностям тканевого распределения при том или ином способе введения;

3 по максимуму накопления в опухолевых клетках уточнить наиболее оптимальный промежуток времени между введением ФС и проведением сеанса ФДТ.

Проведение данных исследований призвано способствовать повышению эффективности лечения злокачественных образований. Выполненные исследования дали интересующие клинику результаты по особенностям синтеза протопорфирина IX в опухолевых клетках и окружающих тканях под действием препарата Аласенс (5-аминолевулиновая кислота) при различных способах его введения в организм (Рис. 4). При этом сравнивалось оральное введение Аласенса и нанесение препарата в виде мази на пораженный участок кожи. В настоящее время в тесном сотрудничестве со специалистами из МНИОИ им. П.А. Герцена в пробах тканей пациентов ведутся ориентированные под задачи клиники исследования отечественных препаратов Аласенса, Фотосенса, Фотогема и Радахлорина.

П.2.6. Преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС

Опубликованные результаты и ведущиеся в настоящее время исследования показывают, что метод КОМИРСИ является новым высокоинформативным инструментом для разработки, скрининга и доклинических исследований новых противоопухолевых и других БАС, изучения механизмов их действия. К наиболее очевидным и уникальным преимуществам метода КОМИРСИ в исследованиях БАС следует отнести

1 возможность обнаружения и идентификации молекулярных комплексов БАС в живых клетках При этом образование молекулярных комплексов потенциально является основой механизмов клеточного действия БАС;

2 возможность количественного статистически достоверного анализа накопления, локализации и взаимодействий БАС в клетках, в различных клеточных органоидах и тканевых структурах;

3 уникальность метода КОМИРСИ, позволяющего исследовать особенности молекулярных взаимодействий и механизмов действия БАС на разных уровнях структурной организации биологических объектов: в растворах, в живых клетках, в срезах ткани;

4 возможность полного разделения перекрывающихся спектров нескольких флуорофоров в клетках, что снимает ряд ограничений на выбор флуоресцентных зондов и обеспечивает наиболее точный анализ в исследованиях клеточной локализации БАС.

К недостаткам метода КОМИРСИ, в первую очередь, следует отнести значительные О по сравнению с традиционной JICKM временные затраты на измерение детальных 2М спектральных изображений Однако совершенствование программного обеспечения и конструкционных особенностей приборов может в значительной степени решить эту проблему.

• Во вторую очередь, к недостаткам метода можно отнести относительную сложность

его реализации.

ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ

В начале третьей главы перечислены применявшиеся в работе реактивы, описаны составы растворов и реакционных смесей, в которых изучались молекулярные взаимодействия БАС. Затем изложены методики регистрации активных форм кислорода с использованием химических ловушек и методика оценки фотостабильности ФС. Описаны клетки, условия их культивирования, процедуры инкубации клеток с исследуемыми БАС и техника подготовки образцов для микроспектральных исследований. Представлены детали методик, применявшихся при изучении внутриклеточной локализации БАС с использованием метода КОМИРСИ, охарактеризованы особенности использования различных флуоресцентных зондов клеточных органоидов. В разделе 1П.7. описаны методики исследования цитотоксического воздействия БАС, включая тесты на механизм клеточной гибели и методики исследования состояния клеточных органоидов после фотодинамического воздействия с использованием ФС. Далее дано краткое описание ведения перевивных опухолей на мышах, инъекций ФС, методик приготовления криостатных срезов тканей для исследований методом КОМИРСИ, выполнявшихся нашими партнерами из МНИОИ им. П. А. Герцена. В последнем разделе этой главы описано приборное и программное обеспечение экспериментов.

ГЛАВА IV. ИССЛЕДОВАНИЯ БАС С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА КОМИРСИ

Метод КОМИРСИ и методики на его основе, разрабатывались для получения новой информации о механизмах функциональной активности БАС, о взаимосвязях между структурой и активностью БАС, а также о мишенях действия БАС в клетках и тканях. Разработка методик КОМИРСИ шла параллельно исследованиям БАС и диктовалась конкретными задачами, возникавшими при изучении данных БАС. В настоящей главе представлены результаты исследований БАС с применением метода КОМИРСИ. Очевидно, что наиболее эффективное применение метода КОМИРСИ возможно только в комбинации с традиционными биохимическими и цитологическими методами анализа на основе сопоставления и уточнения получаемых разными методами результатов. Именно такой комбинированный подход мы использовали при проведении исследований.

IV.1. Исследования митоксантрона

В данном разделе изложены результаты изучения митоксантрона (МИТО, Рис 6), препарата, успешно используемого в клинике для химиотерапии рака. В этих

исследованиях впервые проведен анализ внутриклеточного распределения и молекулярных взаимодействий МИТО в клетках эритролейкоза человека К562, их изменений (особенностей) на разных стадиях клеточного цикла и в клетках с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) Следуя методологии, изложенной в главе II, в основе исследований МИТО в клетках лежат детальные модельные эксперименты по изучению влияния на спектры флуоресценции МИТО взаимодействий с молекулярными мишенями (ДНК, РНК, ДНК топоизомераза II (топо II), комплекс ДНК-топо II, некоторые другие белки), концентрационно-зависимой агрегации, кислотности среды, гидрофобности микроокружения, метаболизации под действием некоторых ферментов. Результаты этих исследований кратко суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Параметры спектров поглощения и флуоресценции МИТО и нафтохиноксали-нового метаболита (НХМ) в различном микроокружении, комплексах и смесях

Растворитель, условия

Поглощение

(нм) Хмакс2 (нм) Ra

Флуоресценция"

(нм) (нм)

МИТО, 100% мономеры,"

ФСБ' рН7,4 610 661 1,34 685 58 1,0

МИТО, ФСБ рНЮ 614 665 0,56 685 58 0,08

МИТО, ФСБ рН7,4 610 661 0,87 685 58 0,7

МИТО, ФСБ рН4,5 610 661 0,95 685 58 0,8

МИТО, метанол 615 667 1,19 686 58 2,9*

МИТО, С2Н5ОН.СНС]3 1:1 618 671 1,20 690 56 2,9*

МИТО, этанол 620 673 1,36 692 49 2

МИТО, пропанол 623 675 1,34 694 46 2,1

МИТО, Тритон Х-100" 610 661 1,18 685 54 2,1*

МИТО-ДНК (1/17 п.о.) 628 680 1,34 700 50 0,65*

МИТО-РНК (1/14 п.о.) 626 678 1,34 688 61

МИТО-РНК (1/29 п.о.') 627 679 1,34 690 56

МИТО-ДНК-топо II 700 50 0,65*

МИТО-топо II 685 58 1,0*

НХМ, ФСБ рН7,4 587 631 0,75 652J 46'

НХМ, диоксан 588 636 1,2 652 36

"Интенсивности корректированы на эффект внутреннего фильтра 514,5 нм, отношение

поглощения в максимуме Хш^г к поглощению в максимуме Хмаь|, 'полная ширина спектра на половине высоты максимума, 'относительная интенсивность по сравнению с интенсивностью эквимолярного водного раствора мономерного МИТО, ^рассчитано, используя данные работы (Kapuscinski and Darzynkiewicz, 1985), "фосфатно-солевой буфер (0,15 М NaCl, 50 мМ Na2HPOj), "корректировано на концентрацию мономерного МИТО в исследуемом растворе, "вклад сигната МИТО вычтен, "концентрация Тритона Х-100 равна 0,24 мМ, 'по - пара оснований

По результатам исследования молекулярных взаимодействий в растворах и детального анализа внутриклеточных спектров МИТО определен базисный набор спектров сравнения (Рис. 6), который позволяет идентифицировать и изучать в живых клетках следующие состояния и комплексы МИТО' (а) свободный или связанный через аминоалкиламинные боковые цени с молекулами клегки мономерный МИТО, находящийся в полярном внутриклеточном окружении (МИТОмоио); (б) МИТО связанный с гидрофобными клеточными структурами (МИТОф^); (в) три типа комплексов с нуклеиновыми кислотами, которые дают идентичные спектры флуоресценции- МИТО-ДНК, тройные комплексы МИТО-Д11К-топо II и комплексы шуцепочечная РНК- МИ IО

(МИТОнк); (г) нафтохиноксалиновый метаболит (НХМ), образующийся в результате окислительного действия клеточных ферментов и связанный с акцепторными группами молекул клетки (Рис 6). В базисный набор был включен также спектр собственной флуоресценции клетки.

Длина волны, ны

635 685 735 «50 700

Длина волны, ни Длина ваты. Ш|

Рисунок 6 (в) Структурные формулы МИТО и его нафтохиноксалинового метаболита (НХМ) (б-г) Анализ внутриклеточных спектров МИТО с использованием метода КОМИРСИ Примеры представления спектров МИТО, измеренных в ядре (б) и в разных областях цитоплазмы (в, г) живой клетки К562, в виде линейной комбинации модельных спектров сравнения, описывающих МИТОнк (1), МИТОфо« (2), МИТО«,,» (3), НХМ (4) и собственную клеточную флуоресценцию (5) Перекрывающиеся спектры (6) показывают степень совпадения экспериментальных и расчетных спектров Интенсивности модельных спектров (1-5) соответствуют их вкладу в расчетные спектры

С использованием измеренных калибровочных зависимостей были рассчитаны 2М спектральные изображения количественного распределения МИТО„оно, МИТОф^ и МИТОнк в клетках, а также карты относительного распределения НХМ и собственной клеточной флуоресценции (Рис. 7). На основе анализа спектральных изображений охарактеризованы области гетерогенного накопления этих комплексов и состояний МИТО в отдельных клетках, рассчитаны их средние концентрации по клетке, в цитоплазматической области, в ядре (для митотических клеток - в хромосомах) и ядрышках (Табл. 2). Обнаружено, что внутриклеточная концентрация МИТО в десятки раз превышает концентрацию препарата, использованную для инкубации клеток, и возрастает пропорционально концентрации МИТО в культуральной среде

Модельные эксперименты выявили, что в гидрофобном окружении происходит двукратное усиление флуоресценции, а при образовании комплексов с нуклеиновыми кислотами - почти двукратное тушение флуоресценции МИТО (Табл. 1), что значительно искажает картину внутриклеточного распределения МИТО, измеренную на основе интегрального сигнала традиционными методами оптической микроскопии При низких

внутриклеточных концентрациях МИТО существенный вклад в интегральный сигнал дает флуоресценция эндогенных порфиринов. Спектры флуоресценции МИТО, его комплексов и эндогенных порфиринов перекрываются настолько значительно, что разделить эти сигналы не удается даже с помощью узкополосных анализирующих фильтров. Таким образом, только анализ полных спектров флуоресценции позволяет корректно описать состояние МИТО в каждой точке клетки, учесть влияние различных факторов на интенсивность спектров эмиссии, и установить реальное распределение МИТО, а также его комплексов в клетках (Рис. 7).

Таблица 2. Средняя внутриклеточная концентрация МИТО в различных состояниях и комплексах в клетках К562 по данным метода КОМИРСИ_

Состояние Средняя концентрация МИТО

МИТО в клетках цитоплазма, ядро, ядрышки, нуклеоплазма,

мкМ мкМ мкМ мкМ

режим инкубации 10 мкМх1 ч

МИТОнк" 11±7 2701170 410±150 2001140

МИТОфоб" 60±30 30+20

МИТ0ми)о' 80±50 22±9 режим инкубации 2 мкМх 1 ч

МИТОнк 2,1+1,5 45±20 65±20 40+20

МИТОфо6 3±2 4±2

МИТОмоно 23+14 13±6

"комплексы МИТО-ДНК, МИТО-ДНК-топо II, МИТО-РНК, "МИТО, связанный с гидрофобными клеточными структурами, 'мономерный МИТО в полярном внутриклеточном окружении

Установлено, что накопление МИТО в ядрах клеток происходит: (¡) пропорционально концентрации МИТО в культуральной среде; (и) в концентрации ~24 раза большей, чем концентрация МИТО во внешней среде; (ш) предпочтительно в виде комплексов с нуклеиновыми кислотами. Концентрация комплексов МИТОнк в ядрышках (Табл. 2) в ~2 раза выше, чем в периферийных областях ядер (нуклеоплазме).

Обнаружено концентрационно-зависимое усиление связывания и накопления МИТО в гидрофобных структурах, предположительно, цитоскелета клетки. Инкубация клеток с МИТО в концентрации 10 мкМ вызывает значительное изменение картины внутриклеточного распределения МИТОфоб по сравнению с 2 мкМ- концентрация МИТОфоб возрастает в 18 раз (Табл. 2).

Были изучены особенности внутриклеточного накопления и распределения МИТО на разных стадиях клеточного цикла. На основании проведенных исследований был сделан вывод, что МИТО вызывает остановку цикла клеток К562 в митозе на стадии анафазы. Согласно данным метода КОМИРСИ в хромосомах митотических клеток реализуется экстремально высокая концентрация МИТО интеркалированного в ДНК (Рис. 7), что за счет образования тройных комплексов МИТО-ДНК-топо II блокирует функционирование топо И, необходимое для решения топологических проблем в процессе расхождения сестринских хромосом к полюсам клетки. Этот эффект был впервые доложен нами для МИТО в клетках К562 (Рео£апоу, Пеигу е1 а1., 1995) и независимо подтвержден другими исследователями для МИТО в клетках СНО (Бшппег 1995). В настоящее время общепризнано, что блокирование расхождения хромосом в анафазе - это характерное свойство ингибиторов топо II, к которым относится МИТО, и данный эффект не наблюдается для ингибиторов ДНК топоизомеразы I.

1 II III IV

Рисунок 7 Исследование распределении и взаимодействий МИТО в живых клетках К562 (/, II) и в клетках K562R с множественной лекарственной устойчивостью (III, IV) с помощью метода КОМИРСИ

(а) - Микрофотографии клеток (метка - S мкм) Распределения в клетках собственной клеточной флуоресценции (б), МИТО«,«, (в), НХМ (г), МИТОнк (д) и МИТОфо« (е) Шкалы интенсивности в, д, е - мкМ, шкалы б, г - относительные единицы Клетки инкубировали с 10 мкМ МИТО в течение 1 ч В колонках II и IV представлены клетки на стадии митоза

В исследованиях особенностей накопления и распределения МИТО в клетках с МЛУ показано, что средняя внутриклеточная концентрация МИТО в клетках K562R в 7 раз меньше, чем в клетках К562 (учитывались только флуоресцирующие состояния и комплексы) и меняется пропорционально концентрации МИТО во внешней среде В клетках K562R доминирует МИТОчово (79%), в то время как содержание МИТОф0б и МИТОнк значительно снижается (13% и 8%, соответственно) Средние внутриклеточные концентрации МИТОфи6 и МИТОнк в клетках K562R в 10 и 20 раз меньше, чем в клетках К562. Помимо уменьшения концентрации меняется внутриклеточное распределение МИТОионо и МИТОфоб (Рис. 7). МИТОфоб обнаруживается теперь на внешней мембране клеток, а не в цитоплазматических гидрофобных структурах или мембране ядра, а распределение МИТОмоио становится гранчлярным, что может указывать на его

связывание в эндосомах и/или лизосомах клеток K562R. Таким образом, механизмы МЛУ не просто вызывают снижение внутриклеточной концентрации МИТО, но и резко уменьшают доступ агента к цитоплазматическим структурам, а также блокируют связывание МИТО с ДНК резистентных клеток. Совокупность этих факторов обеспечивает снижение цитотоксичности МИТО в отношении резистентных клеток в 66 раз.

Исследования МИТО показали, что метод КОМИРСИ предоставляет огромные возможности для изучения флуоресцирующих противоопухолевых соединений в живых клетках Метод может быть весьма полезен при разработке и скрининге новых производных, так как позволяет количественно сравнить их по способности накапливаться в клетках, образовывать комплексы с молекулярными клеточными мишенями, преодолевать механизмы МЛУ, позволяет выявить многие взаимосвязи между структурой соединений и их активностью. I

IV.2. Исследование сульфированного фталоцианнна в живых клетках и срезах

тканей

Успешное развитие ФДТ рака (Dougherty et al., 1998) неразрывно связано с поиском новых высокоактивных ФС. В результате детального исследования фталоцианинов, как перспективных ФС, в литературе появился ряд публикаций (в том числе и обзоров), утверждающих, что сульфированные фталоцианины не хелатированные с металлами (H2PcSn, п- среднее число сульфогрупп на молекулу) не обладают фотодинамической активностью (Rosenthal, 1991). Эти публикации сориентировали научное сообщество на изучение металло-фталоцианинов, стимулировав прекращение дальнейших исследований H2PcSn.

Разработанная в ГНЦ РФ «НИОПИК», новая процедура синтеза H2PcS„ (Ворожцов и др.,1999) позволила нам в тесном сотрудничестве с лабораторией проф. Р.И. Якубовской (МНИОИ им П.А. Герцена) повторно изучить вопрос об активности этих соединений, как ФС. Отмечу, что H2PcS„, фталоцианин алюминия и фталоцианин цинка обладают интенсивной флуоресценцией в красной области спектра, что позволяет их рассматривать, как объекты исследования методом КОМИРСИ на основе спектроскопии флуоресценции. Первоначальной целью наших исследований было понять причины отсутствия фотодинамической активности у H2PcS„. Однако уже первые измерения, выполненные методом КОМИРСИ, показали, что H2PcS„ способны проникать в живые клетки и накапливаться там в мономерной фотодинамически-активной флуоресцирующей форме, а данные, полученные в МНИОИ им. П.А. Герцена, свидетельствовали, что смесь да- и три- сульфированных производных со средним значением п=2,4 обладает фотоиндуцированной цитотоксичностью, сравнимой с активностями многих других ФС.

С использованием метода КОМИРСИ и методов оптической спектроскопии нами впервые детально исследованы молекулярные свойства H2PcS24, способность этого ФС накапливаться в различных раковых клетках и особенности его распределения в тканях мышей с разными перевивными опухолями (Feofanov et al., 2002, Karmakova et al., 2004). Показано, что H2PcS24проникает в различные раковые клетки человека (аденокарциномы легкого А549. карциномы гортано-глотки НЕр2, В-клеточной лимфомы Raji) Он диффузно распределен в цитоплазме и связан на плазматической мембране (Рис. 8) Проникновения ФС в ядро не обнаружено Анализ внутриклеточных спектров флуоресценции и их сопоставление с результатами модельных исследований в растворах позволили нам сделать вывод, что H2PcS24 в клетках преимущественно ассоциирован с мембранами, хотя нельзя полностью исключить, что некоторая часть красителя связана с белками клетки.

НЕр2 измеренные методом КОМИРСИ

Рисунок 8 Спектральные изображения распределения H2PCS24 в клетках НЕр2, А549 и Raji,

(/) Микрофотографии клеток

Стрелками отмечены границы

клеток N- ядро

(II) Спектральные изображения

Клетки инкубировали с 10 мкМ

to H2PcS2< 1 ч

14,5 им Мощность лазера на образце - 3 мкВт

I

и

В модельных экспериментах в растворе нами показано, что в мембранно-связанном состоянии и в комплексах с белками H2PcS24 проявляет фотоиндуцированную генерацию синглетного кислорода и "ОН-радикалов в отличие от агрегатов H2PcS2 4 воде.

Анализ, проведенный методом КОМИРСИ, выявил, что после 1 ч инкубации с 10 мкМ H2PcS24 средняя цитоплазматическая концентрация мономерной фотоактивной формы H2PcS2 4 в клетках Raji, А549 и НЕр2 составляет 21,2+1,7, 10,1±0,7 и 7,1±0,5 мкМ, соответственно. Значительная внутриклеточная концентрация фотоактивной формы H2PcS2 4 объясняет его высокую фотоцитотоксичность. Наблюдается прямое соответствие между относительной активностью и внутриклеточной концентрацией H2PcS24 в исследуемых типах клетках, то есть различная чувствительность клеток к фотоиндуцированному действию H2PcS2 4 связана с разной способностью клеток накапливать этот ФС.

Для многих ФС накопление в опухоли и распределение в тканях животных хорошо охарактеризовано с помощью методов экстракции и ex vivo флуоресцентного анализа, но о тканевом распределении ФС на микро-уровне известно немного. Чтобы заполнить это пробел, необходимы систематические исследования в данной области. Время жизни АФК очень мало, и радиус повреждений, который они обеспечивают в тканях, варьируется от нескольких нанометров до нескольких микрон от точки их образования. Следовательно, именно микро-распределение ФС в тканях является одним из критических факторов, предопределяющих избирательность и эффективность ФДТ, механизмы повреждения опухоли и возможные побочные эффекты.

Нами впервые изучено тканевое распределение и способность H2PcS24 накапливаться в мышиных опухолях различного происхождения, отличающихся по гистологическим характеристикам и кровоснабжению' карциноме молочной железы Эрлиха (ЕС), карциноме легкого Льюиса (LLC), меланоме В16 (В 16) и лимфоидного лейкоза Р388 (Р388) В этих экспериментах опухоли перевивались подкожно на заднюю лапу мышей, а исследования методом КОМИРСИ проводились на криогенных срезах тканей толщиной

10 мкм. Данные по относительному накоплению H2PcS24 в исследованных опухолях,

Таблица 3 Распределение H2PcS24 в тканях мышей с различными перевивными опухолями Концентрации H2PcS2 4 (отн. ед) рассчитаны на основе in situ анализа с применением метода КОМИРСИ. Доза H2PcS24 - 1 мг/кг веса. Анализ проводился через 24 ч после инъекции__

тип ткани Опухоль Р388 В16 ЕС LLC

опухолевый узелок 7±1 10±1 14+2 14±1

соединительная ткань 7±1 11±2 4±1 8±1

мышечные волокна 6±1 9+1 н/д* 12±1

кровеносные сосуды 2,0+0,4 5+1 1,7+0,6 1,5+0,4

кожа:

эпидермис 14±2 14+3 9+2 9+1

дерма 13±2 12±1 11±0,4 13±1

жировая ткань 7±1 9±1 9±1 13±1

сальные железы 19±2 н/д 21 29±3

удаленные от опухоли здоровые ткани 4±1 4±1 4±2 4±1

*н/д- эти тканевые структуры не были обнаружены в исследованных образцах.

различных тканевых структурах, прилежащих к опухолевым узелкам, и в удаленных от опухоли здоровых тканях (Табл 3) свидетельствуют о предпочтительном накоплении H2PcS24 в злокачественных тканях (опухолевых клетках и прилежащих тканях) по сравнению со здоровыми тканями (кожа, мышцы). Способность H2PcS2 4 накапливаться в опухоли и окружающих ее тканях в мономерной фотоактивной форме является основой противоопухолевого эффекта ФДТ с использованием H2PcS24.

Высокая концентрация ФС наблюдалась в эпидермисе и плотной соединительной ткани в зонах опухолевого роста. Кожные структуры, соседствующие с РЗ88 и В16, были окрашены H2PcS24 больше, чем опухолевые клетки, тогда как ЕС и LLC накапливали H2PcS24 также или лучше, чем прилежащие структуры кожи. Рост опухоли не влиял на накопление H2PcS2 4 в мышечных клетках, соседствующих с опухолью, и оно было также мало, как и в контрольной мышечной ткани.

На микроуровне распределение H2PcS24 в опухолевой ткани гетерогенно, а окрашивание периферических областей опухоли - довольно однородно. На примере LLC (Рис 9), видно, что концентрация H2PcS24 убывает по мере удаления от кожи вглубь опухолевого узелка. Монотонный характер профиля распределения без минимума в центре большого опухолевого узла указывает на то, что к 24 ч после инъекции устанавливается равновесное распределение H2PcS2 4 в опухоли.

На основании новых результатов исследования H2PcS„ был сделан вывод о перспективности создания на основе H2PcSn (п~2) препарата для ФДТ рака (Ворожцов и др , 1999). Этот препарат, получивший название «Фталасенс», разрабатывается в ГНЦ РФ «НИОПИК». Успешное завершение стадии доклинических испытаний Фталасенса, а также результаты первых его применений на добровольцах в клинике подтверждают правильность сделанного вывода.

С, отн ед.

Рисунок 9 Профиль распределения H2PcS24 в опухолевом узле LLC по направлению от кожи (слева) до слоя мышц (справа)

+

О —т—>—|—>—|—'—I—■—I—•—I—'—р—'—I

01234567« Глубина проникновения, мм

IV.3. Сравнительное исследование свойств ФС хлорннового ряда

Для создания эффективного ФС необходимо глубокое понимание взаимосвязи между структурой молекулы, ее физико-химическими и биологическими свойствами К настоящему времени изучено много молекул, обладающих эффективной генерацией АФК, однако на основе опубликованных данных довольно сложно проследить закономерности влияния структуры на свойства ФС в биологических системах (клетках и тканях), так как отличия затрагивают и хромофорный центр, и боковые заместители. Многие известные ФС предоставляют ограниченные возможности для направленной модификации их структуры. Разработанная проф. А.Ф. Мироновым (Миронов, 1998), стратегия химических модификаций структуры хлорина р6 предоставляет такую возможность (Рис. 10). Одна из задач, которую решает такая серия химических модификаций, - это сдвиг длинноволнового поглощения хлорина р6 в дальнюю красную область спектра, где биологические ткани более прозрачны для возбуждающего ФС света.

Хлорины - это перспективный класс ФС, производных хлорофилла а. Эти соединения широко доступны, обладают высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода, хорошими физико-химическими характеристиками и низкой темновой токсичностью (Sternberg et al., 1998) В настоящее время ведутся широкие исследования по модификации химической структуры хлоринов с целью дальнейшего улучшения их фотофизических свойств, увеличения уровня и избирательности накопления в опухоли и обеспечения направленного фотодинамического повреждения критических молекулярных и клеточных мишеней.

20 15 -105

Целями данной работы было: (1) исследовать молекулярные и клеточные механизмы действия ФС на основе производных хлорина р6; (2) изучить структурные особенности ФС, определяющие их функциональную активность; (3) отобрать в результате этой работы наиболее активные производные хлорина р6 для дальнейших исследований на животных и разработки нового препарата для ФДТ рака.

Я. Я2 я, а.

1 сн=сн2 (СН2),ОН н н

2 сн=сн2 (СН2)2ОН н н

3 сн=сн2 ОСОСНз н н

4 сн=сн2 он СН, н

5 сн=сн2 ООН, сн, н

6 сн=сн2 сн2соон сн, н

7 сн=сн2 (СН2)2СООН сн, н

8 сн=сн2 он н н

9 сно (СН2),ОН н н

10 сно осн, сн, н

11 сн=ыон оси, сн, н

12 сно ОН сн, н

13 сн=снсно ососн, сн, н

14 сн=снсно он сн, н

15 сн=сн2 (Снлон н он

Рисунок 11. Структуры исследованных ЦИХЛ.

Исследования производных хлорина р6 были начаты нами с изучения З-дезвинил-З-формилхлорина р6 (ФХрб). Методами оптической спектроскопии и КОМИРСИ были охарактеризованы ключевые свойства ФХрб, определяющие его фотодинамическую активность и поведение в живых клетках (ОпсЫпе е1 а1., 2001). Первоначально ФХрб рассматривался, как довольно эффективный ФС, на основе которого планировалась разработка препарата для ФДТ рака. Однако дальнейшие исследования показали, что ЦИХЛ являются намного более активными и перспективными ФС.

В тоже время исследование свойств ФХрб показало, что замена винильной группы в положении 3 хлорина р6 на электрон-акцепторный заместитель приводит к значительному батохромному сдвигу длинноволнового поглощения при сохранении способности молекулы проникать в живые клетки и продуцировать там АФК под действием света. Эти данные послужили основанием для проведения исследований ЦИХЛ, в которых 3-винильная группа замещена на электрон-акцепторные группы.

Кроме того, исследования ФХрб и Н2Рс824 позволили отработать способы применения метода КОМИРСИ к исследованию ФС и сформировать новый обобщенный подход к изучению взаимосвязей между структурой ФС и их ключевыми свойствами, определяющими фотодинамический эффект в растворах, клетках и живых организмах Данный подход на основе применения методов оптической спектроскопии и микроспектроскопии включает в себя (I) изучение тенденции ФС к агрегации в водных растворах и влияния агрегации на способность ФС проникать в клетки; (2) исследование способности ФС образовывать комплексы с биологическими молекулами в водных растворах и влияния комплексообраювания на процессы агрегации/диссоциации; (3) изучение способности ФС к фотоиндуцированному образованию АФК в различных состояниях, (4) изучение образования внутриклеточных молекулярных комплексов и метаболитов. (5) оценка внутриклеточной концентрации активной формы ФС и выявление факторов, влияющих на этот параметр; (6) изучение внутриклеточного распределения ФС и избирательности их накопления в определенных клеточных

структурах/органоидах; (7) исследование кинетических характеристик клеточного накопления и удержания ФС; (8) исследование распределения ФС в опухоли и окружающих тканях в сравнении с нормальными тканями; (9) изучение особенностей тканевого распределения в зависимости от времени после введения ФС в организм.

Проведенные исследования показали, что ЦИХЛ 1-15 не образуют комплексов с ДНК и РНК. Способность ЦИХЛ связываться с белками, в частности, с белками плазмы крови, зависит от структуры соединения Исследованные соединения практически не связываются с у- и р-глобулинами, а образование комплексов с а-глобулинами и человеческим сывороточным альбумином (ЧСА) происходит преимущественно для отрицательно заряженных ЦИХЛ. Нейтральные соединения (например, 4, 5, 10, 11) с а-глобулинами и ЧСА не связываются.

Таблица 4. Физико-химические характеристики ЦИХЛ

ЦИХЛ Х0, нм Ффо* Ю5 Ф ^етн

1 711 2,1±0,1 0,66±0,02 1

2 709 - 0,59±0,06 0,6

3 711 - 0,35±0,04 0,2

4 713 - 0,51 ±0,05 0,14

5 710 1,63+0,02 0,73±0,06 0,6

6 708 2,3±0,1 0,60±0,08 0,7

7 708 1,5±0,1 0,65+0,06 0,4

9 742 0,27±0,01 0,53±0,06 0,5

10 742 0,27±0,03 0,40±0,05 0,06

11 720 1,5±0,1 0,53+0,03 0,4

12 742 - - -

13 734 - - -

14 734 - - -

15 710 2,6±0,1 0,63±0,03 0,25

Ху-максимум <3-полосы поглощения ЦИХЛ в 1% Кремофоре, ф -квантовый выход генерации синглетного кислорода в 0,1 % Кремофоре при рН 7,3, ф<н> -квантовый выход фотообесцвечивания, Ут, - относительная эффективность фотоиидуцированной генерации 02*~ в 1% Кремофоре (32°С, рН 7,3), когда за единицу принята эффективность генерации О:" соединением 1

Пятнадцать впервые синтезированных в МГАТХТ им. М.В. Ломоносова ЦИХЛ-производных (Рис. 11) были изучены в качестве фотодинамически-активных соединений, поглощающих на границе ближней ИК области (Рис. 10). Большой выбор заместителей обеспечил возможность углубленного изучения влияния структуры ЦИХЛ-производных на ключевые характеристики, определяющие фотоцитотоксичность ФС в раковых клетках.

Соединения 1-7, 9-12 и 15 способны легко встраиваться в липидные структуры, как это показано на примере 1% эмульсии Кремофора, мицелл 1% нейтрального Тритона Х-100, отрицательно заряженного 808 и положительно заряженного СТАВ, а также лецитиновых липосом. Способность ЦИХЛ связываться с липидными структурами существенно выше, чем с исследованными белками. Изменение рН в биологически значимом диапазоне (рН 5-8) не вызывало агрегации ЦИХЛ-производных, связанных с липосомами. С точки зрения фотодинамического эффекта очень важно, что образование мономерной формы 1-7, 9-12 и 15 за счет встраивания в липидные структуры доминирует над тенденцией к агрегации молекул в полярной фазе, негативно влияющей на фотодинамические свойства ЦИХЛ Облучение светом водных растворов агрегированных ЦИХЛ не вызывает образования ни синглетного кислорода, ни *ОН-радикалов В то же время в мембранно-связанном состоянии мономерная форма соединений 1-7. 9-12 и 15 под действием света способна эффективно генерировать синглетный кислород, но не образует *ОН-радикалов (Табл.4) На основании

исследований в растворах сделан вывод, что в подходящем клеточном микроокружении ЦИХЛ помимо генерации синглетного кислорода могут образовывать 02*~.

Сравнительный анализ родственных по структуре хромофора ФС (хлорин р6 и ЦИХЛ), длинноволновое поглощение которых варьируется от 665 до 742 нм, показывает, что эффективность генерации синглетного кислорода в исследуемом спектральном диапазоне не зависит от положения длинноволнового максимума поглощения, а в значительной степени определяется влиянием заместителей Величины квантовых выходов фотообесцвечивания ффо свидетельствуют о высокой фотостабильности ЦИХЛ (Табл 4).

С применением метода КОМИРСИ установлено, что производные 1-7, 9-12 и 15 проникают в клетки А549 и НЕр2, накапливаются там в цитоплазме, но не проникают в ядро; в цитоплазме они присутствуют в мономерной флуоресцирующей форме. Наибольшего внутриклеточного проникновения и активности ЦИХЛ удается достичь, обеспечив стабилизацию мономерной формы в водной среде с помощью 0,002-0,01 % эмульсии Кремофора, которая к тому же разрешена к применению в клинике. Параметры внутриклеточных спектров флуоресценции соответствуют липидному микроокружению ЦИХЛ. Анализ спектров при возбуждении 514,5, 532, 543 и 632,8 нм не выявил время зависимого изменения спектров соединений 1-11 и 15 в течение многочасового нахождения ЦИХЛ внутри клеток. В спектральном диапазоне 525-800 нм не обнаружено появления новых внутриклеточных сигналов, которые можно было бы приписать продуктам метаболизации/деградации исследуемых соединений. Исследования, проведенные для 12-14 в широком диапазоне концентраций и времен инкубации, не выявили внутриклеточного проникновения данных соединений. Неудачные комбинации заместителей резко усиливают тенденцию молекул к самоассоциации и блокируют тем самым проникновение 12-14 в клетки, делая эти соединения непригодными для ФДТ.

Обнаружена возможность за счет изменения структуры боковых заместителей изменять внутриклеточное распределение ЦИХЛ- производных, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), либо в липидных каплях, клеточных органоидах, ответственных за хранение и метаболизм нейтральных липидов и стериновых эфиров (Рис. 12, 13) Это обеспечивает выбор ФС, направленных на различные внутриклеточные мишени, а также позволяет изучить особенности развития фотодинамического эффекта, который первоначально инициируется в функционально разных органоидах.

Анализ структуры ЦИХЛ (Рис. 11) и их внутриклеточной локализации (Табл. 5) показывает, что усиление накопления этих ФС в аппарате Гольджи осуществимо с помощью введения полярных групп в цикл Е при сохранении отрицательного заряда в цикле О. Усиление накопления ЦИХЛ в липидных каплях достигается метилированием остатка пропионовой кислоты в цикле О и введением гидрофобных заместителей в цикл Е. Электрон-акцепторные заместители в цикле А, такие как СНО и СН=ЫОН, не меняют внутриклеточную локализацию ЦИХЛ. Наличие 18-гидрокси-группы также не влияет на локализацию соединения 15 по сравнению с 1.

С применением методик КОМИРСИ выполнен детальный количественный анализ клеточного накопления и выведения ЦИХЛ. Измерены клеточные кинетики накопления и выведения соединений 1-11 и 15, концентрационные зависимости их внутриклеточного накопления (Рис. 14), а также определены максимальные коэффициенты внутриклеточного накопления (К) соединений 1-11 и 15 (Табл. 5) Времена полунакопления и полувыведения ЦИХЛ варьируются в широких пределах вне зависимости от внутриклеточной локализации. Это дает возможность выбрать ФС с

Рисунок 12 Анализ внутриклеточной локализации 4 методом КОМИРСИ

Окрашивание лизосом с помощью АО (колонка я), митохондрий с помощью РИЗ (колонка 6) и аппарата Гольджи с помощью BODIPY-церамида («) в живых клетках А549, проинкубированных с 4 Ряд I- микрофотографии клеток в проходящем белом свете N- ядро Метка - 6 мкм Ряд II - внутрикле-л точное распределение 4 Ряд Iii-распределение клеточных структур, окрашенных соответствующими флуоресцентными пробами Черный цвет соответствует наибольшей интенсивности флуо-ш ресценции (П и III)

Й?» л-''Vp; »!

-

t . 4 ■ гщ-t г к » г" * ^ ' 'V* ' / V ' ' * - г * а

Щ * Ч , • Г «. . L • . v 1 ! • >» • ■

4 --- «it. IV

т

Рисунок 13 Анализ внутриклеточной локализации соединения 5 методом КОМИРСИ Окрашивание лизосом с помощью АО и эндосом с помощью ТКТ (колонки а, 6) окрашивание митохондрий с помощью PI23 (колонка в), аппарата Гольджи с помощью BODIPY-церамида (колонка г) и липидных капель с помощью НИК (колонка д) в живых клетках А549, проинкубированных с соединением 5 Ряд I- микрофотографии клеток в проходящем белом свете N-ялро Метка - 6 мкм Рял ÍI - внутриклеточное распределение S Ряд III- распределение клеточных структур, окрашенных соответствующими флуоресцир\ ющими пробами (АО в случае панели Illa и III6) Ряд IV- распределение эмдосом, окрашенных с помощью ТКТ Стрелки на панели IV6 отмечают положение поздних эндосом и/или лизосом, где наблюдается со-локализация АО и ТКТ Черный цвет соответствует наибольшей интенсивности флуоресценции (ряды II, III и IV)

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СЛетсрвург

W * ИТ

Таблица 5. Клеточные свойства ЦИХЛ.

ЦИХЛ ИК<ю, нМ Локализация в клетке К Т 1 ир» МИН ТеГ, МИН

2ч 4ч

- +

1 220±30 180+20 220±30 АГ, ЭР 5,5±0,4 30 + 5 60±10

2 300+40 260+30 300±40 АГ, ЭР 5,2±0,4 5+2 57±8

3 520+40 500±50 520+40 АГ, ЭР 2,5±0,2 7±2 61+11

4 70±10 70+10 65±8 АГ, ЭР 10+1 87±11 330±70

5 150+10 140±10 150+10 ЛК 6±1 41±7 217+24

6 230±20 230±20 220+25 Ж, АГ, ЭР 11±1 30 + 6 17 ±4

7 240±20 240±20 200±30 АГ, ЭР 8±1 24+ 12 50 ± 10

9 330+30 270±50 420±20 АГ, ЭР 5,0+0,4 10± 5 7± 1

10 195±10 180±10 170±30 Ж 5,4±0,4 60± 5 30± 10

11 110+20 110±20 120+21 Ж 10,0±0,5 90± 10 40± 8

12 »1000 »1000 »1000 -

13 »1000 »1000 »1000 -

14 »1000 »1000 »1000 -

15 220±30 180±20 220±30 АГ, ЭР 3,8±0,4 30 ±5 60±10

ИК-х! - концентрация, соответствующая 90% уровню фотоцитотоксичности по данным МНИОИ им П А Герцена, (-) - ЦИХЛ удален из среды перед облучением, (+) - ЦИХЛ присутствует в среде во время облучения, К- коэффициент накопления, максимальное отношение внутриклеточной концентрации к концентрации в среде после 3 ч инкубации, Тщ, - время полунакопления (50% от уровня Кк) соединения в клетках, ТсГ - время полувыведения соединения из клеток ЛК- липилные капли, АГ- аппарат Гольджи, ЭР- эндоплазматический ретикулум

1 2 3 4 5 6 7 22 24 Время инкубации, ч

1 2 3 4 5 6 7 [СВ„Л, мкМ

Рисунок 14 Анализ методом КОМИРСИ накопления и удерживания 2 (V) 3 (Я), 4 (Э) и 5 (А) в клетках А549

(а) Кинетика накопления (закрашенные символы) в цитоплазме клеток инкубированных с 1,2 мкМ ЦИХЛ Удерживание 2-5 (не окрашенные символы) в кчетках, помещенных в среду без ЦИХЛ после 1 ч инкубации клеток с 1,2 мкМ ЦИХЛ (6) Зависимость [С1№ГТ] 2-5 в клетках А549 от [С««) Клетки инкубировали с 2-5 в течение 1 ч [С^] измеряли методом КОМИРСИ и \ средняли по выборке клеток

требуемой локализацией и желательными кинетическими параметрами клеточного накопления и выведения

Уменьшение числа заряженных групп и введение имидного цикла способствовало значительному увеличению коэффициента внутриклеточного накопления ЦИХЛ (Табл. 5)

по сравнению с исходными хлоринами и, в частности, с ФХрб (К=0,8) Это важный фактор, обеспечивающий достижение высокой фотоцитотоксичности.

Сравнивая величины фотоцитотоксичности и внутриклеточной концентрации ЦИХЛ при различных временах инкубации клеток А549. мы наблюдали однозначное соответствие между кинетикой внутриклеточного накопления изучаемого соединения и фотоцитотоксичностью. Выход на насыщение внутриклеточной концентрации сопровождается достижением максимального фотодинамического эффекта для данного соединения.

Показано, что снижение температуры, при которой проводится инкубация клеток с соединениями 1-4, с 37 до 22 °С уменьшает в 10 раз их накопление в раковых клетках, не меняя характер внутриклеточного распределения Так как пассивная диффузия слабо зависит от температуры, этот результат указывает, что вклад механизма пассивной у диффузии в клеточный транспорт 1-4, накапливающихся в аппарате Гольджи,

незначителен. Температурная зависимость клеточного транспорта соединения 5 более слабая: при 20 °С наблюдалось лишь двукратное снижение проникновения 5 в клетки Не исключено, что пассивная диффузия дает заметный вклад в перенос гидрофобного соединения 5 через плазматическую мембрану клеток.

Ингибируя синтез АТФ с помощью азида натрия и 2-дезокси-0-глюкозы, мы не обнаружили снижения скорости накопления и ингибирования транспорта 1, 2, 4 и 5 в аппарат Гольджи и липидные капли клеток А549 Следовательно, АТФ-зависимые механизмы клеточного транспорта не участвуют в интернализации и сортинге ЦИХЛ-' производных. Не выявлено влияния азида натрия и на скорость выведения 1, 4 и 5 из

клеток.

Экстракция холестерина из плазматической мембраны с помощью метил-(3-циклодекстрина была использована, чтобы проверить участие кавеолярного транспорта в интернализации ЦИХЛ-производных. Холестерин важен для образования и стабильности кавеол, и его удаление из плазматической мембраны вызывает их исчезновение. В то же время в ряде работ показано, что экстракция холестерина ингибирует, как кавеолярный, так и клатрин-зависимый эндоцитоз. В последнем случае блокируется образование клатрин-окаймленных ямок. Поскольку картина внутриклеточной локализации и скорость накопления 1, 2, 4 и 5 не менялись ни при каких режимах обработки клеток с помощью метил-Р-циклодекстрина (вплоть до режимов, вызывающих ошаривание и отлипание клеток от подложки), был сделан вывод, что кавеолярный и клатрин-зависимый типы эндоцитоза не являются основными путями поступления ЦИХЛ-производных в клетки. Этот вывод подтвержден экспериментами с хлорпромазином и имприманом, которые влияют на эндоцитоз, нарушая возврат клатрина и адаптерного АР2-белка обратно на мембрану и задерживая их в поздних эндосомах: хлорпромазин и У имприман не ингибируют интернализацию 1, 2, 4 и 5.

На примере клеток А549 для соединений 1 и 5 исследована зависимость скорости интернализации от концентрации ЦИХЛ-производных в среде. Целью измерения этой зависимости была проверка наличия «рецепторов», специфических центров связывания, на мембране клеток, обеспечивающих перенос ЦИХЛ-производных через мембрану, и оценка их множественности Для соединения 5 не обнаружено насыщения скорости интернализации в диапазоне концентраций от 0,6 до 6 мкМ. Для соединения 1 линейность скорости клеточного проникновения от концентрации в среде наблюдалась в диапазоне от 2,8 до 11 мкМ, а первые признаки насыщения обнаружены при 17 мкМ. Характер зависимостей указывает либо на отсутствие специфических мембранных центров связывания ЦИХЛ, либо, что менее вероятно, на их очень большое количество на клетках

Исследован механизм фотоиндуцированной гибели клеток под действием соединений 1. 4 и 5, отличающихся зарядом, полярностью и внутриклеточной локализацией Для всех

трех соединений установлено, что механизм гибели меняется в зависимости от дозы света и внутриклеточной концентрации ФС При условиях, вызывающих гибель около 50% клеток, доминирующим механизмом гибели является апоптоз Условия (доза света, концентрация ФС), обеспечивающие 100% фотоцитотоксичность. сопровождаются только некрозом.

Сравнивая состояние органелл до и сразу после облучения клеток, окрашенных производными ЦИХЛ в суб-фототоксической концентрации, методом КОМИРСИ было обнаружено, что в результате фотодинамического воздействия происходит значительное снижение активности митохондрий Это согласуется с апоптозным механизмом гибели клеток, при котором происходит падение потенциала митохондрий, открывание пор в мембране митохондрий и выход митохондриальных про-апоптозных факторов в цитоплазму Инактивация митохондрий происходила при сохранении интактной клеточной мембраны и без заметных изменений в состоянии и целостности лизосом

Принципиально иная картина наблюдалась после облучения клеток, окрашенных ЦИХЛ в концентрации превышающей уровень, необходимый для гибели 90% клеток В этих условиях помимо инактивации митохондрий наблюдалось разрушение лизосом и пермеабилизация клеточной мембраны

Полученные результаты показывают, что. изменяя структуру ЦИХЛ, можно влиять на внутриклеточную локализацию, уровень накопления в клетках, скорость клеточного накопления и выведения при сохранении высокой фотодинамической активности соединений В итоге, фототоксичность наиболее активных из изученных соединений, измеренная на клетках аденокарциномы легкого человека А549, оказалась в 50, 100 и 150 раз выше, чем фототоксичность хлорина р6, ФХрб и применяемого в клинике Фотогема, соответственно.

Рисунок ! 5 Средние концентрации соединений 1 (я) и 5 (0) в привитой подкожно опухоли Р388 и окружающих тканях мышей при различных интервалах после внутривенного введения соединений (5 мкмоль/кг) по результатам исследования срезов ткани методом КОМИРСИ Исследовались следующие тканевые структуры опухолевые клетки (•), подкожная соединительная ткань, окружающая опухолевый узелок (Д), подкожная жировая ткань (А), прилегающие к опухоли мышечные волокна (М), кожа (□) и стенки кровеносных сосудов (О)

По результатам исследований ЦИХЛ в растворах и клетках два высокоактивных соединения, 1 и 5, были отобраны для изучения на мышах Выбор 1 и 5 был продиктован еще и тем фактом, что в основе активности данных соединений лежат существенно отличающиеся молекулярные и клеточные свойства Соединения 1 и 5 отличаются по способности связываться с белками плазмы крови, по кинетике клеточного накопления и

240

140

0 12 3 4 5 6 Время, ч

0

0 1 2 3 4 5 6 Время, ч

выведения, а также по внутриклеточной локализации (Табл 5). Целью этой части работы было сравнить структурно-функциональные особенности 1 и 5 от vivo и сопоставить их с противоопухолевой фотодинамической активностью на животных, которую измеряли наши коллеги из МНИОИ им. П.А. Герцена.

В данной серии экспериментов мы впервые применили методику КОМИРСИ, подтвердившую свою эффективность на живых клетках, для количественной оценки концентрации ЦИХЛ в различных тканевых структурах при исследовании срезов опухолевых тканей мышей. Спектры 1 и 5 в тканях мышей совпадали по форме и максимуму со спектрами 1 и 5 в модельных липидных системах (эмульсия Кремофора, мицеллы Тритона Х-100, лецитиновые липосомы), то есть 1 и 5 накапливались в тканях мышей в липидоподобном окружении в мономерной фотоактивной форме. Соответственно, мы использовали прямую пропорциональную зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией мономерной мембранно-связанной формы ЦИХЛ для оценки средней концентрации ЦИХЛ (Рис. 15) по спектральным изображениям, измеренным от срезов тканей в конфокальном режиме (Рис. 16, 17).

Противоопухолевая эффективность ФДТ с использованием соединения 1 зависела, как от дозы 1, так и от интервала между инъекцией и облучением. Наилучшие результаты были достигнуты, когда облучение проводилось через 1,5 ч после инъекции, а доза соединения 1 составляла 4 мкмоль/кг. Кроме того, значительный эффект наблюдался, когда облучение выполняли через 15 мин после инъекции соединения 1 в дозе 1 мкмоль/кг.

ФДТ с использованием соединения 5 выполняли при дозе 4 мкмоль/кг и различных интервалах (15 мин - 3 ч) между инъекцией и облучением. Наилучший противоопухолевый эффект наблюдался при полуторачасовом интервале, и этот эффект значительно снижался при более коротких и более длинных интервалах.

Из сравнения тканевого распределения ЦИХЛ и результатов ФДТ следует, что наиболее оптимальный интервал между инъекцией и облучением (1,5 ч) совпадает с максимумом накопления соединений 1 и 5 в опухоли Хотя накопление соединения 1 в опухоли было больше (Рис. 15), эффективности ФДТ при дозе 4 мкмоль/кг и интервале 1,5 ч были одинаково высоки, как для соединения 1, так и для соединения 5. Отношения концентраций в опухоли и коже сходны для соединений 1 и 5, но 5 превосходит соединение 1 по избирательности накопления в опухолевых клетках (Рис. 15).

Снижение эффективности ФДТ всегда сопровождалось уменьшением содержания соединения 5 в опухолевых клетках (Рис. 15, б). При этом концентрация 5 в других тканях была относительно низкой Следовательно, фотодинамический эффект 5 связан с непосредственным повреждением опухолевых клеток.

Пик фотодинамической активности в случае соединения 1 был шире, чем для соединения 5: интервалы 45 мин и 3 ч были также приемлемы для успешной ФДТ Мы полагаем, что высокое накопление соединения 1 в рыхлой соединительной ткани давало значительный вклад в итоговый фотоиндуцированный эффект, а механизм гибели опухоли был комбинацией прямого повреждения опухолевых клеток и разрушения поддерживающих опухоль тканей.

Значительное отличие соединения 1 от соединения 5 проявилось при коротком (15 мин) интервале между инъекцией и облучением Соединение 5 было вообще неэффективно, а соединение 1 обеспечивало значительный противоопухолевый эффект Действие ФДТ при коротких интервалах связывают с повреждением кровеносных сосудов и микрокапилляров, питающих опухоль Данный механизм очень важен для противоопухолевого действия ФДТ (Kramer. 2001) В нашем случае высокая концентрация ФС сосудах через 15 мин после инъекции наблюдалась для обоих соединений (Рис. 15), но результат ФДТ при этом значительно отличался

Рисунок 16 Распределение соединения 1 в срезах ткани мышей с привитой подкожно опухолью Р388 по данным метода КОМИРСИ (а, в, д, ж) - микрофотографии срезов ткани, после окраски гематоксилином и эозином (б, г, е, *) - конфокальные спектральные изображения, описывающие тканевое распределение соединения 1 Метка - 10 мкм Шкалы интенсивности соответствуют концентрации 1 в нМ.

(о, б)- кровеносный сосуд через 15 мин после введения соединения 1 («, г)- опухолевые клетки через 1,5 ч после инъекции соединения 1 (д, е)- соединительная ткань через 3 ч после введения соединения 1 (ж, з)- мышечная ткань через 15 мин после введения соединения 1 Доза соединения 1-5 мкмоль/кг.

Рисунок 17. Распределение соединения 5 в срезах ткани мышей с опухолью Р388 по данным метода КОМИРСИ (я, в) -микрофотографии срезов ткани, после окраски Iематоксилином и эозином Метка - 20 мкм Обозначения' 1- кровеносный сосуд, 2- рыхлая соединительная ткань; 3- жировые клетки (6, г) ~ конфокальные спектральные изображения распределения 5 Шкалы интенсивности - концентрация 5 в нМ (а, 6)- сосуд в подкожной жировой ткани через 15 мин после инъекции 5 (в, г)- опухолевые клетки через 1,5 ч после инъекции Доза соединения 5-5 мкмоль/кг

В начальный период после внутривенной инъекции содержание соединения 1 в опухолевых клетках было низким, но его концентрация была высока в стенках сосудов, в рыхлой соединительной ткани вокруг сосудов и мышечной ткани, прилежащей к опухоли Соединение 5 на этот период помимо сосудов обнаруживается в больших количествах только в жировых клетках, и такого распределения оказывается не достаточным для противоопухолевого эффекта. Можно предположить, что для сосудистой ФДТ очень важно повреждение окружающих и поддерживающих сосуды структур

Проведенные исследования впервые продемонстрировали, что соединения 1 и 5, являются новыми эффективными ФС для противоопухолевой ФДТ. Соединение 1 может быть использовано и для ФДТ, действие которой нацелено на разрушение сосудистой системы опухоли.

1У.4. Исследование свойств фотосеисибилизаторов на основе циклоимидных производных бактериохлорина

Успешная разработка и применение методов оптической спектроскопии и микроспектроскопии для изучения и оптимизации свойств ЦИХЛ позволили нам расширить диапазон изучаемых ФС и перейти к изучению более сложных в исследовании ФС на основе производных бактериохлорина, поглощающих в ИК-области.

Длинноволновое поглощение производных бактериохлорофилла а (740-780 им) соответствует максимуму области прозрачности тканей животных и человека, и эти соединения способны под действием света образовывать АФК. Однако их существенным недостатком является низкая фотостабильность. Прилагаются значительные усилия, чтобы использовать благоприятные фотодинамические свойства природного хромофора и разработать новые ИК-ФС на основе бактериохлорофилла а. В то же время, список соединений, которые исследуются, в качестве возможных ИК-ФС, весьма ограничен, а применимость в клинике этих ИК-ФС еще не ясна.

Как только стало ясно, что ЦИХЛ обладают хорошими фотодинамическими и биологическими свойствами, было решено синтезировать похожие по структуре ЦИБХЛ (Рис. 18) и изучить их свойства. Целями данной работы было: (1) оценить свойства ЦИБХЛ, в качестве ИК-ФС; (2) изучить структурные особенности ИК-ФС, определяющие их функциональную активность; (3) отобрать в результате этой работы наиболее активные производные бактериохлорина для дальнейших исследований на животных и разработки нового препарата для ФДТ рака.

* к*

17 Н3С^ОН -осн,

18 Н3Су.(0(СН2)2)20Н -осн,

19 -осн,

20 НзС^ОСНзОДОНЭСНгОН -осн.

21 НзС^СХСНг^ОСНз -ОСН,

22 н3суМ-он -ОСН,

23 НзС^О -1Ч(СН,),

24 НзС^О

25 НзС^О АО 0

26 "э<у° О

16:Н3С^О н

СООН

Рисунок 18 Стрмпура бактериот рпурина а 16 и ЦИБХЛ-производных 17-30, синтезированных в МГА ГХТ им М В Ломоносова

Отметим, что вне диапазона, используемого для ФДТ, ЦИБХЛ поглощают свет существенно меньше, чем многие другие порфириновые ФС. Интегральное поглощение ЦИБХЛ распределено следующим образом: 35% в области 720-870 нм (область оптимальная для ФДТ) и 65% в области 350-720 нм. Для сравнения, 20 и 80% интегрального поглощения производных хлорина p¡, и пирофеофорбида лежат соответственно в области 600-700 (область, используемая для ФДТ) и 350-600 нм. Таким образом, риск нежелательного общего фотосенсибилизирующего действия дневного света в период после ФДТ значительно снижен в случае ЦИБХЛ.

Нами впервые установлено, что в мономерной форме в липидо-подобном окружении ЦИБХЛ под действием света не продуцируют гидроксил-радикалы, но эффективно образуют синглетный кислород. Большинство исследованных ЦИБХЛ, за исключением наиболее длинноволновых 23-26, имеют квантовый выход генерации синглетного кислорода ф существенно более высокий, чем бактериохлорин а в липосомах (ф = 0,33 (Garbo et al., 1998)) и бактериопурпурин 16 в мицеллах Кремофора (Табл. 6).

В тоже время сравнительный анализ родственных по структуре хромофора ФС (бактериохлорин а, бактериопурпурин 16 и ЦИБХЛ), длинноволновое поглощение которых варьируется от 760 до 832 нм, показывает, что величина ф, по крайней мере, в диапазоне 760-793 нм не зависит от положения длинноволнового максимума поглощения, а в значительной степени определяется влиянием заместителей (Табл. 6). Для соединений 17- 21 величина ф сравнима со значениями ф для ЦИХЛ, поглощающих в области 710 нм (Табл. 4).

Квантовые выходы фотообесцвечивания фФ0 (Табл. 6) свидетельствуют о высокой фотостабильности ЦИБХЛ, которая значительно превосходит фотостабильность бактериопурпурина 16. На клеточном уровне при мощностях лазера, не вызывающих фотообесцвечивания ЦИБХЛ, сигнал 16 исчезает в течение 1-2 секунд. Фотостабильность ЦИБХЛ (Табл. 6) оказалась в 3-30 раз выше, чем фотостабильность ЦИХЛ (Табл. 4).

ЦИБХЛ флуоресцируют в ИК-области, где чувствительность коммерческих биологических JICKM очень мала. Чувствительность используемых нами микроспектрофлуориметров в области 780-840 нм намного выше, но и их возможности в изучении ЦИБХЛ в клетках и срезах ткани ограничены. Многие проблемы в исследованиях ЦИБХЛ удалось решить, комбинируя методики КОМИРСИ с возможностями уникального ЛСКМ, сконструированного специалистами Университета Твент (Нидерланды) для экспериментов на единичных молекулах в ИК-области спектра.

В проведенных экспериментах показано, что соединения 16-26 проникают в клетки А549, НЕр2, К562 и HeLa, накапливаются там в цитоплазме, но не проникают в ядро. В цитоплазме 16-26 присутствуют в мономерной фотоактивной форме, в связанном с липидными структурами состоянии Внутриклеточные распределения ЦИБХЛ сходным образом воспроизводятся в клетках HeLa, А549, НЕр2 и К562

В экспериментах по установлению внутриклеточной локализации ЦИБХЛ методом КОМИРСИ доказано, что гранулярные структуры, в которых накапливаются 17-25, являются липидными каплями (ЛК), клеточными органеллами, ответственными за хранение и метаболизм нейтральных липидов и стериновых эфиров. Области преимущественного накопления диффузного сигнала ЦИБХЛ в околоядерной области хорошо совпадают с локализацией аппарата Гольджи (Рис. 19).

Аналогичные особенности внутриклеточного распределения были выявлены нами ранее для ЦИХЛ Такое сходство внутриклеточной локализации не является неожиданным, т к структуры ЦИХЛ и 1ДИБХЛ очень похожи. Исходя из сходства структуры двух типов ФС и основных особенностей клеточного распределения, можно предположить, что диффузное распределение ЦИБХЛ в цитоплазме вне аппарата Гольджи связано, как и в случае ЦИХЛ, с накоплением в ЭР. К сожалению,

чувствительности наших микроспектрофлуориметров не достаточно для измерения с высоким разрешением распределения слабого диффузного сигнала ЦИБХЛ в цитоплазме.

Таблица 6 Фототоксичность для клеток НеЬа и А549, фотохимические и клеточные характеристики ЦИБХЛ_

Соединение 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Я<, (нм) 812 778 782 781 782 783 793 821 832 827 828

■т Ьст (НМ) 821 794 797 797 797 797 809 831 840 840 842

¿"±10% 0.27 0,54 0,55 0,54 0,55 0,57 0,51 0,39 0,24 0,19 0,07

(¿фо'хЮ6 ±10% н/и' 0,7 1 1 1 0,7 0,9 0,6 0,7 0,5 н/и

Ь 1С„'(нМ, А549) 980 70 60 60 60 80 45 165 490 220

1С«, (нМ, НеЬа) 1050 60 60 60 60 60 50 90 440 500 -

К' (НеЬа) ±5% 0,37 4,7 10,4 8,5 7,9 13,1 2,3 3,8 3,4 1.6 0,6

< К(А549)±10% 16 9,6 5,8

» ) Та' (мин, НеЬа) 37±2 46±3 59±5 52±7 53±8

ТсГ (мин, А549) 13±2 40±6 44±6

Локализация ♦♦*/ */ ***/ «.*/ */ Л'

* (ЛК/Гольджи) *** ** ** **** ** * *

' "Квантовый выход генерации синглетного кислорода в О, I -0,3 % эмульсии Кремофора ^Квантовый

' выход фотообесцвечивания ЦИБХЛ в 0,1-0,3 % эмульсии Кремофора "Концентрация ЦИБХЛ в

1 среде, вызывающая 90% гибель клеток при стандартных условиях облучения, которое проводится

' через 3 ч инкубации клеток с ФС (по данным МНИОИ им П А Герцена) 'Фактор накопления -

отношение средней цитоплазматической концентрации ФС к его концентрации во внешней среде, 1 измеренное через 3 ч инкубации клеток с 1 мкМ ЦИБХЛ в полной среде ""Время полувыведения

ЦИБХЛ из клеток Не измерялось ^Предположительно, лизосомальная локализация

Соотношение количества ЦИБХЛ локализованного в липидных каплях и в аппарате Гольджи (Табл. 6) зависит от структуры боковых заместителей. Направленность внутриклеточного транспорта ЦИБХЛ, по-видимому, определяется балансом гидрофобных и гидрофильных заместителей и клеточными механизмами, осуществляющими тонкую сортировку молекул в клетке по гидрофобности. Гидрофобные заместители способствуют накоплению ЦИБХЛ в липидных каплях, а полярные -определяют связывание с цитоплазматическими мембранными структурами. Таким образом, с помощью различных заместителей можно усиливать накопление ЦИБХЛ в ^ липидных каплях или в аппарате Гольджи и ЭР или обеспечивать смешанный тип

внутриклеточного распределения.

Исследуя механизмы клеточного транспорта ЦИБХЛ, показано, что температурный фактор оказывает слабое влияние на проникновение 21 в клетки. С учетом отсутствия в о составе молекулы заряженных и полярных групп можно предположить, что пассивная диффузия через плазматическую мембрану дает заметный вклад во внутриклеточное накопление 21. Это согласуется с выводом о вкладе пассивной диффузии в механизмы транспорта гидрофобного соединения 5 и существенно отличает 5 и 21 от изучавшихся нами отрицательно заряженных ЦИХЛ

Интересно, что соединение 17 заметно отличается по особенностям интернализации от 21. Во-первых, зависимость скорости интернализации соединения 17 нелинейно зависит от его концентрации в среде Это позволяет предположить наличие ограниченного числа центров связывания 17 на мембране клеток, связывание с которыми

насыщается уже при концентрации 17 больше 1 мкМ. Во-вторых, прединкубация клеток с 2-дезокси-О-глюкозой снижала в 2 раза скорость интернализации 17, а прединкубация с метил-Р-циклодекстрином увеличивала эту скорость в 1,5 раза. Не исключено, что АТФ-зависимые механизмы транспорта в значительной мере участвуют в интернализации 17

в проходящем белом свете

флуоресцентный зонд

ЦИБХЛ

Рисунок 19 Локализация соединения 21 в клетках А549 по данным метода КОМИРСИ Клетки были нагружены соединением 21 из эмульсии Кремофора или из ДМСО и окрашены НИК (зонд на липидные капли). ВСШ1РУ-церамидом (зонд на аппарат Гольджи), Р123 (юнд на митохондрии) или АО (зонд на лизосомы)

Представлены изображения клеток в проходящем белом свете, конфокальные флуоресцентные изображения распределения флуоресцентных зондов клеточных органелл и соединения 21 Отметим, что (1) гранулярное распреде к-ние 21 соответствует локашзации чипидных капель, окрашенных НИК, (2) распределение наибо (ее яркого диффузного сигнала 21 в околоядерной области хорошо совпадает с локализацией аппарата Гольджи, окрашенного В001РУ-иерамидом, (3) распреде генис 21 не мвисит от того, из какого рас гвора (э\п чьсия Кремофора ити ДМСО) ЦИБХЛ в носится в срел\ с клетками

М- отмечает ядро, стрелки отмечают границу клеток, метка - 5 мкм

Таким образом, даже небольшие изменения структуры ЦИБХЛ приводят к заметным и трудно предсказуемым изменениям в особенностях и механизмах клеточной интернализации ЦИБХЛ Поэтому Ronpoc о механизмах проникновения ФС в клетки требует отдельного глубокого исследования для тех соединений, которые будут отобраны, как кандидаты для разработки препарата

Фоюцитотоксичпость наиболее активных и! ЦИБХ1. таких как 17-22 на клетках Не! а и Л549 ь 300 ра; выше чем фоюкжеичпооь применяемою в клинике Фототема Два, щат икра пюе превышение активности 17-22 над активное i ыо 16 па обеих клеточных линиях гакже подтверждает перспективность ра ¡работки ЦИБХЛ в качес!вс ИК-ФС (Табл. 6).

Проведенные исследования показали, что ЦИБХ1Т способны накапливаться в моиомерпой фоюактивной форме в опухолевых тканях (Таб i 7) что «яцаст падежную основу для эффективной ФДТ Характер распределения ЦИБХЛ позволяет предположить, что противоопухолевый фотодинамичсский эффект с использованием данного типа соединений будет определяться двойным действием- (1) прямым поражением опухолевых клеток; (2) повреждением питающих сосудов и поддерживающих опухоль тканевых структур.

Таблица 7 Распределение ЦИБХЛ в опухоли Р388 и окружающих íxamix мышей через

3 ч поте введения соединении в до;е 10 mi/ki_

Соединение

тканевая структура -—-—-—-—-

опухоль 44 ± 20* 100 1 35 75 ±45 290 + 90

соедини тельная ткань 115 ±80 150 ± 75 40 ± 15 330 ± 80

мышечные волокна 110 ±60 310 ± 195 80 ±65 520 ±208

кровеносные сосуды н/о 450 ± 230 250±150 1310 + 600

жировые клетки 295 \ 70 ПО i 50 80 ± 30 630 ± 270

дерма 90 ±60 170 ± 50 60 ±20 900 ±570

эпидермис 60 ±40 205 ± 130 45 ± 15 41 ±28

'Оценка концентрации ФС в нМ

** н/о — это тканевая структура в исследованных образцах не обнаружена

С учетом данных, полученных на срезах тканей животных, а также превосходства ЦИБХЛ над бактериохлоринами по фотофизическим свойствам (в частности, по фотостабильности, по наличию интенсивного поглощения в ближней ИК-области и по эффективности образования синглетного кислорода), можно заключить, что ЦИБХЛ являются перспективными ИК-ФС для ФДТ рака. Отметим, что многие свойства ЦИБХЛ, имеющие значение для успешной ФДТ, зависят от структуры заместителей, и это создает основу для дальнейшей оптимизации и улучшения фотодинамической активности ЦИБХЛ т vivo.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В peiyjn.idie решения носив течшых в цтипои работе задач удалось iciaibim раф.нннап, метод КОМИРС II и наши ему широкое применение, как в фундамента ibiibix так и в ориентированных на kjittiihkv исследованиях ЬЛС

Созданная лабораторная жеперпмешальная установка для конфокальной сканирующей микроспектроскопии обеспечила приборную базу для развития метода КОМИРСИ и реализации исследовательских программ с применением этою метода на базе ИБХ РАН Это г прибор успешно применялся в представленных в данной

диссертации исследованиях и продолжает интенсивно использоваться в нашей работе по исследовательским проектам Федерального агентства по науке и инновациям, РФФИ, НТП "Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний" на 2004-2006 гг.

Разработанный в данной диссертационной работе метод КОМИРСИ даст возможность исследовать не только локализацию, но и молекулярные взаимодействия флуорофоров в живых клетках с ЗМ субмикронным пространственным разрешением Анализ полных внутриклеточных спектров флуоресценции позволяет охарактеризовать микроокруженис и взаимодействия исследуемого флуорофора, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности. Такой анализ проводится в каждой точке сканируемой клетки и выявляет полную картину состояний и взаимодействий изучаемого соединения Внутриклеточные концентрации исследуемых молекул определяются по интенсивности флуоресценции с учетом тушения/усиления сигнала, вызываемого образованием комплексов и влиянием других факторов Это повое и принципиальное отличие от обычных методов оптической микроскопии дает возможность установить количественное распределение соединения и его комплексов в клеточных компартментах, изучить динамику их накопления и удержания в клетках. В результате, метод КОМИРСИ является уникальным дополнением к традициотшым методам флуоресцентной микроскопии и ЛСКМ.

Результаты применения метода КОМИРСИ для изучения локализации и молекулярных взаимодействий флуоресцирующих противоопухолевых соединений в живых раковых клетках на примере МИТО убедительно демонстрируют огромный потенциал метода в области разработки новых цитостатиков Кроме того, аналитические возможности метода способны обеспечить количественную оценку эффективности различных способов преодоления множественной лекарственной устойчивости и новых подходов к избирательной доставке противоопухолевых соединений в раковые клетки

Метод КОМИРСИ широко использовался нами в исследованиях Н2РсЯ2 4 в клетках и срезах тканей животных В результате этих исследований удалось доказать ошибочность сложившегося ранее мнения о неэффективности безметально! о сульфированного фталоцианина, как ФС, и охарактеризовать молекулярные, клеточные и тканевые свойства Н2Рс824; лежащие в основе противоопухолевого фотодинамического эффекта с использованием кого ФС. В настоящее время препарат на основе Н2Рс82 разрабатываемый ФГУП ГНЦ НИОГ1ИК под название Фталасенс, находится на стадии клинических исследований.

Реализуя уникальные возможности метода КОМИРСИ, были исследованы свойства новой группы ФС с поглощением в ближней ИК-области (708-746 нм) - ЦИХЛ-производных На примере пятнадцати производных с различными боковыми заместителями введенными в пиррольные кольца А, Б и имидный цикл детально изучена возможность за счет изменения структуры заместителей влиять на ключевые характеристики, определяющие фотодинамическую активность ФС в раковых клетках. Нами показано, что с помощью боковых заместителей можно в широком диапазоне варьировать скорость клеточного накопления и выведения ЦИХЛ, а также коэффициент их внутриклеточного накопления. В результате проведенных исследований продемонстрирована возможность создания на основе ЦИХЛ-нроизводных высокоэффективных ФС.

Детально, с акцентом на взаимосвящ между структурой и активностью исследованы 10 новых ИК-ФС. циклоимидных производных бактериохлорина (ЦИБХЛ) с различными 13.15-М- заместителями и заместитечями 3-ацетил группы Исследованные ЦИБХЛ поглощают свст в области окна прозрачности биологических тканей (780-830 нм) и

обладают высокой фотостабильностью при длительном облучении светом. Наиболее активные производные в 300 раз более фотоцитотоксичны в отношении клеток А549 и НеЬа, чем применяемый в клинике Фотогем (данные МНИОИ им. П.А. Герцена), благодаря заместителям, которые, как показано нами, улучшают внутриклеточное накопление (коэффициент накопления 8-13) и обеспечивают эффективную фотоиндуцированную генерацию синглетного кислорода (квантовый выход 0,54-0,57). Конфокальный флуоресцентный анализ срезов опухолевых тканей мышей выявил особенности тканевого распределения ЦИБХЛ и, в частности, их способность накапливаться в опухоли и окружающей соединительной ткани. Учитывая короткодействие синглетного кислорода, эти свойства ЦИБХЛ являются предпосылкой для эффективной противоопухолевой ФДТ и надежным основанием для разработки препарата.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод КОМИРСИ, обеспечивающий на основе анализа полных спектров флуоресценции уникальную возможность идентификации и изучения молекулярных взаимодействий биологически активных соединений (БАС) в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением.

2. Метод КОМИРСИ позволяет измерять концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, оценивать средние концентраций БАС в органоидах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также проводить статистически достоверный анализ клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.

3. Метод КОМИРСИ применим для решения широкого круга задач биофизики, молекулярной и клеточной биологии, включая изучение механизмов клеточного транспорта, внутриклеточной локализации и механизмов действия БАС. Метод позволяет идентифицировать и разделять в клетках перекрывающиеся сигналы нескольких введенных в клетку флуоресцирующих соединений, а также учитывать вклад эндогенной флуоресценции клетки, что существенно повышает надежность и точность анализа по сравнению с традиционной лазерной сканирующей конфокальной микроскопией.

4. Метод КОМИРСИ позволяет исследовать распределения БАС в срезах тканей и проводить оценку относительной концентрации БАС в различных структурах тканей. Метод дает уникальную возможность изучать БАС и сопоставлять результаты исследований, полученные одним и тем же методом, на разных уровнях структурной организации: молекулярном, клеточном, тканевом.

5. ДНК является важной мишенью действия митоксантрона, который, образуя комплексы с ней, вызывает остановку клеточного цикла клеток на стадии анафазы.

6. Фотодинамическое действие безметального сульфированного фтапоцианина Н2Рс824 достигается за счет его накопления в плазматической мембране и цитоплазме раковых клеток в связанной с мембранными структурами мономерной фотодинамически активной форме, способной под действием света инициировать образование гидроксил-радикалов и синглетного кислорода. Усиленное накопление Н2Рс824 происходит как в опухолевых клетках, так и в прилежащих к опухоли тканях, что, по-видимому, и служит основой эффективной ФДТ рака с использованием Н2РсБ24.

7. Введение в структуру хлорина р6 имидного цикла и подходящих заместителей принципиально улучшает способность этого ФС проникать в раковые клетки и накапливаться в чувствительных к фотодинамическому воздействию цитоплазматических

липидных структурах в виде активных мономеров. Оптимизация структуры боковых заместителей позволяет обеспечить быстрое накопление и сравнительно длительное удержание ЦИХЛ-производных в раковых клетках, что представляется важным для эффективной ФДТ. С помощью заместителей, можно изменять распределение ЦИХЛ-производных в цитоплазме, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, либо в липидных каплях, что дает возможность изучить особенности и механизмы развития фотодинамического эффекта, инициализированного в этих структурах. Варьируя структуру и изучая свойства ЦИХЛ-производных в растворах и клетках, удается отбирать соединения, обладающие высокой избирательностью накопления в опухолях животных, что является основой для наблюдаемого противоопухолевого эффекта ФДТ.

9. Оптимизированные по структуре боковых заместителей, ЦИБХЛ являются перспективными фотосенсибилизаторами для ФДТ рака, чему способствуют их свойства: интенсивное поглощение в области окна прозрачности тканей (778-830 нм); способность к проникновению и большому накоплению в цитоплазме раковых клеток; сохранение в цитоплазме мономерной формы за счет связывания с липидными структурами; высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода в липидном окружении; способность* эффективно накапливаться в опухоли и окружающих опухоль тканях. /

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ" /Г/

Статьи в международны! и отечественных журналах и сборниках:

1 Sharonov S , Chourpa I, Valisa P , Fleury F , Feofanov A , Manfait M Confocal spectral imaging analysis European Microscopy and Analysis 1994, №11, P 23-25

2 Sharonov S , Nabiev I, Chourpa I, Feofanov A , Valisa P , Manfait M Confocal 3D- scanning laser Raman/SERS/fluorescence microprobe Spectral imaging and high- resolution applications J. Raman Spectroscopy 1994, V 25, № 7&8, P 699-707

3 Sharonov S , Chourpa I, Morjani H, Nabiev I, Manfait M, Feofanov A Confocal spectral imaging analysis a new concept for studies of spatial distribution of antitumor drugs within living cancer cell Anal Chim. Acta 1994, V 290, №1-2, P 40-47

4 Feofanov A, Fleury F, Charonov S , Morjani H, Nabiev I, Manfait M Confocal spectral imaging analysis of the distribution of mitoxantrone within the single living cells as a function of cell cycle J.Trace and Microprobe Techniques. 1995, V 13, № 3, P 241-243

5 Feofanov A , Sharonov S , Valisa P, Da Silva E , Nabiev I, Manfait M A new confocal stigmatic spectrometer for micro-Raman and micro-fluorescence spectral imaging analysis Design and applications Rev. ScL lustrum 1995, V 66, №5, P 3146-3158

6 Feofanov A, Charonov S , Kudelina I, Fleury F, Nabiev I Localization and molecular interactions of mitoxantrone within living K562 cells as probed by confocal spectral imaging analysis Biophys. J 1997, V 73, P 3317-3327

7 Feofanov A, Charonov S, Fleury F, Kudelina I, Nabiev I Quantitative confocal spectral imaging analysis of mitoxantrone within living K562 cells intracellular accumulation and distribution of monomers, aggregates, naphtoquinoxaline metabolite and drug-target complexes Biophys. J. 1997, V 73, P 3328-3336

8 Феофанов А В , Гришин А И , Куделина И А , Шитова Л А , Кармакова Т А , Якубовская Р И , Эгрет-Шарлье M, Вини П Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях внутриклеточной локализации и молекулярных взаимодействий новых противоопухолевых агентов на основе фталоцианинов Российский химический журнал 1998, Т 42, №5, С 68-76

9 Якубовская Р И, Казачкина H И, Кармакова Т А , Шитова Л А , Пещерских Е В , Фомина Г И , Немцова Е Р, Деркачева В M , Феофанов А В , Чисов В И Скрининг и медико-биологические

исследования отечественных фотосенсибилизаторов Российский химический журнал, 1998, Т 42, №5, С 17-23

10 Feofanov А , Grichine А , Shitova L , Karmakova Т, Yakubovskaya R Intracellular distribution and states of a new anticancer agent teraftal as investigated with confocal Raman imaging technique Asian J. Spectrosc 1999, V 3,P 23-31

11 Феофанов А В , Гришин А И , Куделина И А , Шитова Л А , Кармакова Т А , Якубовская Р И, Эгрет-Шарлье М, Вини П Исследования локализации и молекулярных взаимодействий биологически активных соединений в живых клетках и срезах тканей на основе метода конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений Биоорганическая химия 1999, Т 25, №12, С 892-902

12 Feofanov А V , Karmakova Т А , Gnshme А I, Fomina GI, Nazimov IV , Yakubovskaya RI, Egret-Charlier M, Vtgny P Distribution and interactions of photosens in murine Ehrlich adenocarcinoma-fluorescent spectral imaging approach Fluorescence microscopy and fluorescent probes, ed A Kotyk, Espero Publishing, 1999, V 3,P 323-330

13 Feofanov A V, Kudelma IA, Grishme AI, Shitova L A, Karmakova T A, Yakubovskaya RI, Egret-Charlier M , Vigny P Confocal spectral imaging studies of new photosensitizer 3-devinyl-3-formylchlonn p6 m living cancer cells Fluorescence microscopy and fluorescent probes, ed A Kotyk, 1999, Espero Publishing 1999, V 3,P 317-322

14 Feofanov A V, Shitova L A, Gnshine A I, Kudelina I A, Nazimov I V, Karmakova T A, Yakubovskaya R I, Egret-Charlier M, Vigny P Confocal spectral imaging (CSI) analysis of new photosensitizer photosens and its constituent components in A-549 human lung adenocarcinoma cells Fluorescence microscopy and fluorescent probes, ed A Kotyk, 1999, Espero Publishing 1999, V 3, P 332-338

15 Feofanov A , Charonov S , Fleury F , Kudelina I, Nabiev I Confocal spectral imaging analysis of intracellular interactions of mitoxantrone at the different phases of cell cycle Anticancer Res 1999, V 19, P 5341-5348

16 Feofanov A , Grichine A , Shitova L , Karmakova T, Yakubovskaya R, Egret-Charlier M, Vigny P Confocal Raman Microspectroscopy and Imaging Study of Theraphthal in Living Cancer Cells Biophys. J 2000, V 78, Jfe 1, P 499-512

17 Filyasova A I, Kudelina I A , Feofanov A V A spectroscopic study of interaction of tetrasulfonated aluminum phthalocyanme with human serum albumin J. Mot Struct 2001, V 565-566, P 173-176

18 Grichine A , Feofanov A , Karmakova T, Kazachkina N, Pecherskih E, Yakubovskaya R , Mironov A , Egret-Charlier M , Vigny P Influence of the substitution of 3-vmyl by 3-formyl group on the photodynamic properties of chlonn p6 molecular, cellular and in vivo studies Photochem Photobiol

2001, V.73, №3, P 267-277

19 Galanina О , Feofanov A, Tuzikov А В , Rapoport E , Crocker P R, Grichine A , Egret-Charlier M, Vigny P, Le Pendu J , Bovin N V Fluorescent carbohydrate probes for cell lectins // Spectrochindca Acta 2001, V 57, P 2285-2296

20 Feofanov A , Grichine A, Karmakova T, Kazachkina N , Pecherskih E , Yakubovskaya R, Luk'yanets E, Derkacheva V, Egret-Charlier M, Vigny P Chelating with metal is not essential for antitumor photodynamic activity of sulfonated phthalocyanines Photochem. PhotobioL 2002, V 75, №5, P 527533

21 Feofanov A, Grichine A, Karmakova T, Pljutinskaya A , Lebedeva V, Filyasova A , Yakubovskaya R, Mironov A, Egret-Charlier M, Vigny P Near-infrared photosensitizer on the basis of cycloimide derivative of chlonn p6 13,15-N-(3'-hydroxypropyl)cycloimide chlonn p6 Photochem Photobiol

2002, V 75, №6, P 633-643

22 Filatov A V , Shmigol IВ , Sharonov G V , Feofanov A V , Volkov Y Direct and indirect antibody-induced TX-100 resistance of cell surface antigens Immunol Lett 2003, V 85,№3,P 287-295

23 Chudakov D M , Feofanov A V, Mudrik N N , Lukyanov S , Lukyanov К A Chromophore environment provides clue to "Kindling Fluorescent Protein" riddle J. Biol Chem 2003, V 278, №9, P 7215-7219

24 Filatov A V , Shmigol IВ , Kuzm 11, Sharonov G V, Feofanov A V Resistance of cellular membrane antigens to solubilization with Triton X-100 as a marker of their association with lipid rafts-analysis by flow cytometry J. Immunol Methods 2003, V 278, №1-2, P 211-219

25 Feofanov A , Sharonov G , Grichine A , Karmakova T, Pljutinskaya A , Lebedeva V , Ruziyev R , Yakubovskaya R , Mironov A , Refregier M , Maunzot J -C , Vigny P Comparative study of photodynamic properties of 13,15-N-cycloimide derivatives of chlorin p6 Photochem. Photobiol 2004, V 79, №2, P 172-188

26 Феофанов А В , Назарова А И , Кармакова T А , Плнггинская А Д, Гришин А И , Якубовская Р И , Лебедева В С , Рузиев Р Д, Миронов А Ф, Моризо Ж -К , Вини П Фотодинамические и клеточные свойства 13,15-Ы-карбоксиметил- и 13,15-Ы-(2-карбоксиэтил)- циклоимидных * производных хлорина рб Биоорганическая химия 2004, Т 30, №4, С 417-428

27 Водовозова Е Л , Назарова А И, Феофанов А В , Холоденко Р В , Пазынина Г В , Гаенко Г П , Бовин Н В , Молотковский Ю Г Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы человека Биологические мембраны. 2004, Т 21, №1, С 53-64

28 Karmakova Т, Feofanov А , Nazarova А , Grichine А , Yakubovskaya R, Luk'yanets Eu, Maunzot J-С, Vigny P Distribution of metal-free sulfonated phthalocyamne m subcutaneously transplanted murine tumors J.Photochem. Photobiol В 2004, T 75, №1-2, С 81-87

29 Feofanov A.V., Sharonov G.V., Astapova M.V , Rodionov D.I., Utkin Yu.N., Arseniev A.S. Cancer cell injury by cytotoxins from cobra venom is mediated through lysosomal damage. Biochem. J. 2005, V 390, P 11-18

30 Назарова А И, Феофанов А В , Кармакова T А, Шаронов Г В , Плютинская А Д, Якубовекая Р И, Лебедева В С , Миронов А Ф, Моризо Ж -К, Вини П Влияние заместителей на фотохимические и клеточные свойства 13,15-Н-циклоимидных производных хлорина рб Биоорганическая химия 2005, Т 31 №5, С 535-548

31 Karmakova Т, Feofanov А , Pankratov А, Kazachkina N, Nazarova А , Yakubovskaya R, Lebedeva V, Mironov A, Maurizot J -C , Vigny P Tissue distribution and in vivo photosensitizing activity of 13,15-[N-(3-hydroxypropyI)] cycloimide chlorin рб and 13,15-(N-methoxy)cycloimide chlorin рб methyl ester J.Photochem. Photobiol B, 2006, V 82, P 28-36

32 Sharonov G V, Feofanov A V, Bocharova О V, Astapova M V, Dedukhova VI, Chemyak В V , Dolgikh D A, Arseniev A S , Skulachev V P , Kirpichnikov M P Comparative analysis of proapoptotic activity of cytochrome с mutants in living cells Apoptosis, 2005, V 10, P 797-808

33 Sharonov G V, Karmakova T A , Kassies R, Pljutinskaya A D, Gnn M A, Refregiers M, Yakubovskaya R1, Mironov A F, Maunzot J -C , Vigny P, Otto С , Feofanov A V Cycloimide bacteriochlorin derivatives' photodynamic properties, cellular- and tissue distribution Free Radic. Biol Med ,2006, V 40, P 407-419

34 Ворожцов Г H, Деркачева В М , Казачкина Н И , Лукъянец Е А , Феофанов А В , Фомина Г И , Чиссов В И , Якубовская Р И Сульфозамещенные фталоцианины как фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии Патент РФ на изобретение M21S363S от 26 11 1999

35 Миронов А Ф , Грин М А , Ципровский А Г, Дзарданов Д В , Головин К В , Феофанов А В , г Кармакова Т А, Якубовская Р И Гидразиды в ряау бактериохлорофилла а, обладающие фотодинамической активностью и способ их получения Патент РФ на изобретение № 2223274 т 04 09 2002

*

Тезисы международных н отечественных конференций:

36 Feofanov А , Kudelina I, Fleury F , Sharonov S , Nabiev I, Manfait M Molecular interactions of mitoxantrone with DNA and other cellular targets at different stages of cell cycle In vitro and in situ studies by fluorescence spectroscopy and confocal spectral micro-imaging analysis Proc. of III Int Symp. on Bioorganic Chemistry. 1995, P 32

37 Feofanov A V, Grichine AI, Karmakova T A , Iakubovskaya RI Quantitative confocal resonance Raman spectral imaging technique in the study of anticancer drugs in cancer cells Proc. of 16-th Int Conf. on Raman Spectrosc Ed AM Heyns, Wiley, 1998, P 280-281

38 Feofanov A , Charonov S , Kudehna I, Fleury F, Nabiev I Intracellular interactions and distribution of anticancer drug mitoxantrone at the different phases of cell cycle in K562 and multidrug resistant K562R cancer cells as probed by confocal spectral imaging technique Abstracts of 7-th Int Conf. on Laser Applications in Life Sciencies Eds D Chorvat,N I Koroteev, 1998, P S2-S5

39 Feofanov A V Molecular interactions of antitumor drugs from solution to living cells and tissue structures Confocal spectral imaging (CSI) approach Spectroscopy of Biological Molecules: New Directions Eds Greve J, Puppels G J, Otto С Kluwer Academic Publisher, 1999, P. 487-488

40 Феофанов А В Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ) в исследованиях новых противоопухолевых соединений Материалы 2-го съезда биофизиков России 1999, Т 2, С 629-630

41 Feofanov AV, Grtchme AI, Kaimakova ТА, Pankratov A A, Yakubovskaya RI, Vigny P Resonance Raman spectral imaging analysis of theraphthal in tissue sections Proc. of 17-th Int Conf. on Raman Spectrosc Eds S-L Zhang, В F Zhu, Wiley, 2000, P 1048-1049

42 Феофанов A , Гришин A , Куделина И , Филясова A , Кармакова T, Якубовская Р , Эгрет-Шарлье М, Вини П Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ) в исследованиях новых противоопухолевых соединений. Материалы V Всеросийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии.» Казань,

2000, Т 1,С 229-230

43 Karmakova Т , Feofanov А, Gnchine А, Yakubovskaya R, Fomma G, Filyasova A, Luk'yanets E, Derkacheva V, Egret-Charlier M, Vigny P Cellular and tissue distribution of metal-free phthalocyanme Book of Abstracts of the 9-th Congress of the European Society for Photobiology,

2001, P 175-176.

44 Feofanov A, Sharonov G , Grichine A, Aksenova A , Mironov A, Egret-Charlier M, Vigny P Influence of sugar substituents on the photodynamic activity of naturally derived chlonns Book of Abstracts of the XX-th Intern. Conf. on Photochemistry Ed A Chibisov,2001,P 489-490

45 Кармакова T A , Плютинская А Д, Фомина Г И , Якубовская Р И, Феофанов А В , Гришин А И Распределение сульфофталоцианинов в тканях экспериментальных опухолей животных Материалы III съезда фотобиологов России. 2001, С 87-88

46 Feofanov А , Grichine А, Filyasova А, Karmakova Т, Plyutmskaya А, Yakubovskaya R, Lebedeva V, Ruziev R, Mironov A, Egret-Charlier M, Vigny P Photobiological effects of cycloimide derivatives of chlonn p6, new promising near-IR photosensitizers Book of Abstracts of the XX-th Intern. Conf. on Photochemistry Ed A Chibisov, 2001, P 262-263.

47 Феофанов А В , Шаронов Г В, Назарова А И, Кармакова Т А, Гришин А И , Плютинская А Д, Якубовская Р И, Лебедева В.С, Рузиев Р Д, Миронов А Ф, Моризо Ж -К, Вини П Оптимизация структуры циклоимидных производных хлорина рб для фотодинамической терапии рака IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов. S-12 сентября 2003 г, г. Суздалъ: Труды конференции. Ред ТА Агеева, Иваново Ивановский государственный химико-технологический университет, 2003, С 339-341

48 Феофанов А В , Шаронов Г В , Кармакова Т А , Плютинская А Д, Якубовская Р И , Грин М А, Ципровский А Г , Миронов А Ф, Гришин А И, Моризо Ж -К, Вини П , Кассис И Р, Огго К Новые ИК-фотосенсибилизаторы на основе циклоимидных производных бактериохлорина IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов, t-12 сентября 2003 г., г. Суздалъ: Труды конференции. Ред ТА Агеева, Иваново Ивановский государственный химико-технологический университет, 2003, С 332-334

49 Миронов А Ф, Грин М А , Кармакова Т А , Плютинская А Д, Якубовская Р И, Феофанов А В , Вини П Новые фотосенсибилизаторы для ФДТ рака на основе природного бактериохлорофилла а Российский биотерапевтический журнал 2003, Т 1, № 1, С 33-34

50 Шаронов Г В , Гришин А И , Кармакова Т А , Феофанов А В , Плютинская А Д, Якубовская Р И , Аксенова А А , Себякин И Л, Миронов А Ф , Моризо Ж.-К , Вини П Углеводные производные пирофеофорбида а спектральные, фотодинамические и биологические свойства IX Международная конференция по химии порфиринов и их аналогов. S-12 сентября 2003 г., г. Суздалъ: Труды конференции. Ред Т А Агеева, Иваново Ивановский государственный химико-технологический университет, 2003, С 341-343

51 Назарова А И , Шаронов Г В , Игнатова Н С , Кармакова Т А , Плютинская А Д, Лебедева В С , Грин М А, Рефрежье М , Феофанов А В , Якубовская Р И, Миронов А Ф, Моризо Ж -К , Вини П Циклоимидные производные хлорина рб, как основа для создания эффективных фотосенсибилизаторов с контролируемой внутриклеточной локализацией Тезисы докладов и стендовых сообщений международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова ИБХ РАН, Москва, 2004, С 102-103

52 Шаронов Г В , Кармакова Т А , Кассиес Р , Плютинская А Д, Мерфи К, Грин М А , Филлипс Д, Якубовская Р И, Миронов А Ф, Огго С, Феофанов А В Фотодинамические свойства, клеточное и тканевое распределение фотосенсибилизаторов ближнего ИК диапазона на основе циклоимидных производных бактериохлорина Тезисы докладов и стендовых сообщений международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова ИБХ РАН, Москва, 2004, С 63-64

53 Феофанов А В , Шаронов Г В , Астапова М В , Григал П П , Уткин Ю Н, Арсеньев А С Лизосомальная локализация цитотоксинов из яда кобр и ее роль в цитотоксическом эффекте Тезисы докладов и стендовых сообщений международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова ИБХ РАН, Москва, 2004, С 62

54 Karmakova Т А , Filonenko Е V , Feofanov А V, Sokolov V V , Yakubovskaya RI, Luk'yanets E A, Chissov VI Distribution of photosensitizers in human basal cell carcinoma tissue Abstracts of 10th World Congress of the International Photodynarmc Association, 2005, P 59

55 Karmakova T, Nazarova A , Pankratov A , Kazachkina N , Yakubovskaya R, Lebedeva V, Ruziyev R, Mironov A, Maunzot J -C, Vigny P, Feofanov A V Tissue distribution and in vivo photosensitizing activity of cycloimide derivatives of chlorin рб Abstracts of Int Symp. Advances in Science for Drug Discovery. Chendstry-Biology-Informatics, 2005, P B30

56 Feofanov A V Confocal spectral imaging approach as a method assisting drug development Abstracts of Int Symp. Advances in Science for Drug Discovery. Chemistry-Biology-Informatics, 2005, P B14

f

l

2/OOG ft

■9-5 92 t

\

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Феофанов, Алексей Валерьевич

Введение

Глава I. Микроспектральные исследования БАС: Современное состояние проблемы

1.1. Методы исследования БАС на основе микроскопии и флуоресценции

1.2. Микроспектрофлуориметры

1.3. Развитие метода МСФ и его применения

1.3.1. Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ

1.3.1.1. МСФ-исследования полициклических ароматических углеводородов (ПАУ)

1.3.1.2. МСФ в исследованиях лекарств против псориаза

1.3.1.3. МСФ в исследованиях противоопухолевых соединений

1.3.2. МСФ в измерениях внутриклеточных концентраций свободных ионов 30 кальция и магния

1.3.3. Метод МСФ в исследованиях ФС

1.3.4. Анализ методом МСФ собственной флуоресценции клеток

1.3.5. Некоторые другие исследования с применением метода МСФ

Глава II. Приборное обеспечение и разработка метода КОМИРСИ 45 II. 1. Приборное обеспечение для конфокальной сканирующей микроспектроскопии 45 II. 1.1. Конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы Dilor 45 II. 1.1.1. Спектрометр 46 II. 1.1.2. Микроскоп 48 II. 1.1.3. Входная конфокальная камера и принцип линейного сканирования 49 II. 1.1.4. Программное обеспечение 52 II. 1.2. Разработка лабораторной экспериментальной установки для конфокальной 58 сканирующей микроспектроскопии

II.2. Разработка метода КОМИРСИ

11.2.1. Идентификация и изучение молекулярных взаимодействий БАС в живых 67 клетках методом КОМИРСИ

11.2.2. Проблема собственной клеточной флуоресценции и ее решение методом 73 КОМИРСИ

11.2.3. Измерение концентрации БАС и их комплексов в живых клетках методом 77 КОМИРСИ

11.2.4. Применение метода КОМИРСИ для выявления органоидов, в которых 87 происходит преимущественное накопление исследуемых БАС

11.2.5. Исследования распределения БАС в срезах тканей методом КОМИРСИ

II.2.6. Преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС

Глава III. Материалы и методики 102 II 1.1. Реактивы

III.2. Исследование молекулярных взаимодействий БАС в растворах 104 III. 3. Измерение генерации активных форм кислорода

111.4. Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ

111.5. Эксперименты на культуре клеток

111.6. Методики, применявшиеся при изучении внутриклеточной локализации БАС

111.7. Методики исследования цитотоксического воздействия БАС

111.8. Приготовление криостатных срезов тканей

111.9. Приборное и программное обеспечение экспериментов

Глава IV. Исследования БАС с применением метода КОМИРСИ 117 IV. 1. Исследования митоксантрона 118 IV. 1.1. Исследование молекулярных взаимодействий МИТО в растворах 118 IV. 1.2. Анализ внутриклеточных спектров МИТО 122 IV.1.3. Количественный анализ МИТО и его комплексов в клетках К562 125 IV. 1.4. Особенности внутриклеточного накопления и распределения МИТО на 130 разных стадиях клеточного цикла

IV.1.5. Особенности накопления и распределения МИТО в клетках K562R с 136 множественной лекарственной устойчивостью

IV.2. Исследование сульфированного фталоцианина в живых клетках и срезах 140 тканей

IV.2.1. Молекулярные свойства сульфированного фталоцианина 141 IV.2.2. Накопление и распределение H2PCS2.4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности

IV.2.3. Распределение H2PCS2.4 в опухолевых тканях

IV.2.3.1. Гистологический анализ особенностей роста опухолей

IV.2.3.2. Распределение H2PCS2.4 в срезах тканей

IV.3. Сравнительное исследование свойств ФС хлоринового ряда

IV.3.1. Исследования З-дезвинил-З-формилхлорина рб

IV.3.1.1. Молекулярные свойства ФХрб

IV.3.1.2. Исследования ФХрб в живых клетках

IV.3.2. Циклоимидные производные хлорина рб (ЦИХЛ)

IV.3.2.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИХЛ

IV.3.2.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ в растворах

IV.3.2.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ

IV.3.2.4. Особенности внутриклеточных спектров флуоресценции ЦИХЛ

IV.3.2.5. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ

IV.3.2.6. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИХЛ

IV.3.2.7. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со 192 свойствами ЦИХЛ

IV.3.2.8. Механизмы ЦИХЛ-опосредованной фотоиндуцированной гибели клеток

IV.3.2.9. Распределение ЦИХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р

IV.3.2.10. ФДТ с использованием соединений 1 и

IV.3.2.11. Сравнительный анализ данных метода КОМИРСИ о распределении 205 ЦИХЛ в тканях и результатов ФДТ

IV.4. Исследование свойств фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных 207 производных бактериохлорина

IV.4.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИБХЛ

IV.4.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИБХЛ в растворах

IV.4.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИБХЛ

IV.4.4. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИБХЛ

IV.4.5. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИБХЛ

IV.4.6. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со 224 свойствами ЦИБХЛ

IV.4.7. Влияние ЦИБХЛ-опосредованного фотодинамического воздействия на 226 состояние митохондрий, лизосом и липидного транспорта

IV.4.8. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метод конфокальной микроспектроскопии и реконструкции спектральных изображений в исследованиях биологически активных соединений"

Оптическая микроскопия уже более 300 лет является исследовательским инструментом, который все более разнообразно и широко используется в биологии, биофизике и медицине.

Анализ окрашенных срезов тканей и клеток в проходящем белом свете - наиболее простое на сегодняшний день, но весьма информативное применение оптической микроскопии - в современном виде сформировалось десятки лет назад и остается неотъемлемой частью клинических и медико-лабораторных исследований. Данный подход основан на использовании различий в интенсивности и цвете естественной или искусственной окраски определенных веществ в клетках и тканях, в комбинации с анализом морфологических признаков для выяснения присутствия, локализации, а во многих случаях и оценки количественных характеристик этих веществ, клеточных и тканевых структур, типирования клеток и микроорганизмов.

Разработка оптических систем для реализации методов дифференциального интерференционного контраста и фазового контраста открыла исследователям возможность уверенного наблюдения и исследования микроструктур в составе неокрашенных и слабоконтрастных биологических объектов, таких как живые клетки.

Создание микроскопов, позволяющих наблюдать флуоресценцию молекул в клетках и тканях, привело к развитию многообразия методов и подходов к изучению структуры и функции клеток, клеточных структур, биологических клеточных процессов, а также эндогенных и экзогенных (синтетических и природных) молекул и ионов металлов в клетках и срезах тканей.

До 60-х годов 20 века оптическая микроскопия являлась методом, который обеспечивал субмикронное разрешение только в фокальной плоскости объектива. Изобретение конфокальной системы фильтрации сигнала дало возможность измерения флуоресцентных сигналов с трехмерным субмикронным разрешением. Совпавший по времени прогресс в разработке лазерных систем и персональных компьютеров стимулировал наблюдаемое сейчас бурное развитие новых методов флуоресцентной микроскопии. Среди новых и развивающихся методов отметим лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (JICKM), двух- и мульти- фотонную микроскопию, микроскопию на основе измерения времени жизни флуоресценции, конфокальную микроспектроскопию, микроскопию с применением эффекта полного внутреннего отражения, а также методические подходы на основе анализа восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и флуоресцентного переноса энергии. Помимо флуоресцентной в настоящее время идет активное развитие микроскопии ближнего поля и методов оптической микроскопии на основе колебательной спектроскопии, таких как инфракрасная микроскопия и микроскопия комбинационного рассеяния (КР).

Развитие новых методов оптической микроскопии полностью востребовано в современной клеточной биологии и биофизике. Достигнутый к настоящему времени уровень понимания взаимодействия и функционирования биологических молекул и их комплексов в бесклеточной среде, глубокое проникновение в основы процессов жизнедеятельности клетки, с одной стороны, и возрастающая потребность в более информативных методах исследования, с другой стороны, создают основу для быстрого внедрения новых методов оптической микроскопии в исследовательский процесс. Развитие генной инженерии, протеомики и биотехнологии ставит на повестку дня вопрос об углубленном изучении процессов синтеза, транспорта и взаимодействий биологических молекул в живой клетке, а также о практическом использовании этих знаний. Для решения этих задач также необходимо скорейшее совершенствование экспериментальных подходов на основе оптической микроскопии.

Одной из возможностей значительного увеличения информативности оптической микроскопии является применение в микроскопии спектрального анализа. В данной диссертации представлены результаты разработки метода конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ), а также результаты применения этого метода в исследованиях биологически активных соединений (БАС).

Метод КОМИРСИ базируется на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта (живой клетки или среза ткани) полных спектров флуоресценции или КР исследуемого БАС. Это позволяет не только установить пространственное распределение БАС в сканируемом объекте, но и изучить по спектрам микроокружение и молекулярные взаимодействия БАС, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности, измерить концентрацию БАС и его молекулярных комплексов.

К разработке метода КОМИРСИ меня подтолкнуло участие в создании прибора для конфокальной сканирующей микроспектроскопии КР и флуоресценции, проводившемся фирмой "Dilor" (Лиль, Франция) в сотрудничестве с лабораторией спектроскопии биомолекул Реймского университета (Реймс, Франция) в 1993-1994 гг. В процессе оптимизации конструкции прототипа прибора и тестировании программного обеспечения мной был выполнен ряд измерений и исследований разнообразных образцов, выявивший большой потенциал нового спектрального микроскопа в различных областях науки, включая минералогию, материаловедение, физику твердого тела, биофизику и клеточную биологию. В процессе исследований противоопухолевого препарата митоксантрона, проведенных мной в сотрудничестве с лабораторией спектроскопии биомолекул Реймского университета на приборной базе фирмы "Dilor" оформились первые две задачи настоящей работы:

1) Разработать основы метода КОМИРСИ для идентификации и изучения молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением;

2) с использованием метода КОМИРСИ разработать методики измерения концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, методики оценки средних концентраций БАС в органеллах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также методики проведения статистически достоверного анализа клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.

Решение этих задач было продолжено в исследованиях новых отечественных фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии рака. ФС для исследований были предоставлены профессором Е. А. Лукьянец (НИОПИК) и профессором А. Ф. Мироновым (МГАТХТ им. М. В. Ломоносова). Исследования ФС на раковых клетках и в срезах тканей животных и пациентов проводились в тесном сотрудничестве со специалистами лаборатории модификаторов и протекторов МНИОИ им. П. А. Герцена (зав. лаборатории профессор Р.И. Якубовская). Проблема отсутствия необходимой приборной базы в России на первом этапе была решена благодаря установлению долгосрочного научного сотрудничества с Центром молекулярной биофизики Национального центра научных исследований Франции (г. Орлеан, Франция), который предоставил возможность использования в исследованиях прибора для конфокальной сканирующей микроспектроскопии фирмы "Dilor". Для того, чтобы обеспечит возможность выполнения исследований методом КОМИРСИ в России, встала задача создать лабораторную установку для конфокальной сканирующей микроспектроскопии.

Необходимость выяснения точной внутриклеточной локализации изучаемых ФС, а также понимание важности расширенного исследования с выполнением анализа на срезах тканей привели к появлению еще двух задач:

3) На основе метода КОМИРСИ разработать методики выявления органоидов, в которых происходит преимущественное накопление исследуемых БАС;

4) с использованием метода КОМИРСИ разработать методики исследования распределения БАС в срезах тканей и оценки относительной концентрации БАС в различных структурах тканей.

Во многих исследовательских задачах метод КОМИРСИ может служить альтернативой методам JICKM и проточной цитометрии. Чтобы эффективно развивать и адекватно использовать метод КОМИРСИ, было необходимо выявить преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС.

Одной из ключевых задач, которая решалась на протяжении всей работы, было:

5) применить разработанный метод КОМИРСИ и методики, созданные на его основе, в исследованиях БАС, для получения новой информации о механизмах функциональной активности изучаемых БАС, о взаимосвязях между структурой и активностью БАС, о мишенях действия БАС в клетках и тканях.

Основными объектами исследований служили противоопухолевый препарат митоксантрон, ФС на основе сульфированных производных фталоцианина, октакарбоксифталоцианин кобальта, З-девинил-З-формил хлорин рб, циклоимидные производные хлорина рб и бактериохлорина с различными заместителями введенными в пиррольные циклы A, D и в имидный цикл Е, флуоресцентно-меченные пробы лектинов, кардиотоксины из яда кобр Naja haja, Naja oxiana, Naja kaouthia, цитохром с и его генно-инженерные мутантные формы.

Предметом детальных исследований были: применимость метода КОМИРСИ в исследовании различных БАС и новые возможности связанные с использованием этого метода; внутриклеточное распределение и молекулярные взаимодействия митоксантрона в клетках эритролейкоза человека К562, и их изменения (особенности) на разных стадиях клеточного цикла и в клетках с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ); особенности накопления и распределения безметального сульфированного фталоцианина в различных раковых клетках в культуре и в опухолях на срезах тканей мышей; молекулярные и клеточные механизмы действия ФС; влияние структуры циклоимидных производных хлорина рб и бактериохлорина на ключевые характеристики, определяющие фотодинамический эффект ФС в раковых клетках.

Помимо метода КОМИРСИ и методик на его основе в данной работе широко применяли флуоресцентную микроскопию, а также методы спектрофотометрии, флуоресцентной и КР- спектроскопии молекул в растворах.

В Главе I данной работы рассмотрено современное состояние проблемы применения спектрального анализа в микроскопии для изучения БАС в клетках, а в Главах II-IV изложены полученные мной и под моим руководством результаты, которые сгруппированы следующим образом. В Главе II описано приборное обеспечение метода КОМИРСИ, включая конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы «Dilor» и созданную мной лабораторную экспериментальную установку для конфокальной сканирующей микроспектроскопии, а также представлены результаты разработки метода КОМИРСИ. В Главе III описаны реактивы и экспериментальные методики, применявшихся в исследованиях, представленных в диссертации. В Главе IV изложены результаты исследований БАС с применением метода КОМИРСИ, включая исследования митоксантрона и отечественных ФС. В Заключении обобщены итоги разработки метода КОМИРСИ и исследований с применением этого метода и представлены выводы диссертационной работы. Используемые в работе сокращения и аббревиатуры приведены в виде отдельного списка в конце диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Феофанов, Алексей Валерьевич

выводы

1. Разработан метод КОМИРСИ, обеспечивающий на основе анализа полных спектров флуоресценции уникальную возможность идентификации и изучения молекулярных взаимодействий биологически активных соединений (БАС) в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением.

2. Метод КОМИРСИ позволяет измерять концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, оценивать средние концентраций БАС в органоидах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также проводить статистически достоверный анализ клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.

3. Метод КОМИРСИ применим для решения широкого круга задач биофизики, молекулярной и клеточной биологии, включая изучение механизмов клеточного транспорта, внутриклеточной локализации и механизмов действия БАС. Метод позволяет идентифицировать и разделять в клетках перекрывающиеся сигналы нескольких введенных в клетку флуоресцирующих соединений, а также учитывать вклад эндогенной флуоресценции клетки, что существенно повышает надежность и точность анализа по сравнению с традиционной лазерной сканирующей конфокальной микроскопией.

4. Метод КОМИРСИ позволяет исследовать распределения БАС в срезах тканей и проводить оценку относительной концентрации БАС в различных структурах тканей. Метод дает уникальную возможность изучать БАС и сопоставлять результаты исследований, полученные одним и тем же методом, на разных уровнях структурной организации: молекулярном, клеточном, тканевом.

5. ДНК является важной мишенью действия митоксаптропа, который, образуя комплексы с ней, вызывает остановку клеточного цикла клеток на стадии анафазы.

6. Фотодинамическое действие безметального сульфированного фталоцианина H2PCS2.4 достигается за счет его накопления в плазматической мембране и цитоплазме раковых клеток в связанной с мембранными структурами мономерпой фотодинамически активной форме, способной под действием света инициировать образование гидроксил-радикалов и синглетного кислорода. Усиленное накопление H2PCS2.4 происходит как в опухолевых клетках, так и в прилежащих к опухоли тканях, что, по-видимому, и служит основой эффективной ФДТ рака с использованием H2PcS2.4.

7. Введение в структуру хлорина рб имидпого цикла и подходящих заместителей принципиально улучшает способность этого ФС проникать в раковые клетки и накапливаться в чувствительных к фотодинамическому воздействию цитоплазматических липидных структурах в виде активных мономеров. Оптимизация структуры боковых заместителей позволяет обеспечить быстрое накопление и сравнительно длительное удержание ЦИХЛ-производных в раковых клетках, что представляется важным для эффективной ФДТ. С помощью заместителей, можно изменять распределение ЦИХЛ-производных в цитоплазме, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, либо в липидиых каплях, что дает возможность изучить особенности и механизмы развития фотодинамического эффекта, инициализированного в этих структурах. Варьируя структуру и изучая свойства ЦИХЛ-производных в растворах и клетках, удается отбирать соединения, обладающие высокой избирательностью накопления в опухолях животных, что является основой для наблюдаемого противоопухолевого эффекта ФДТ.

8. Оптимизированные по структуре боковых заместителей, ЦИБХЛ являются перспективными фотосенсибилизаторами для ФДТ рака, чему способствуют их свойства: интенсивное поглощение в области окна прозрачности тканей (778-830 нм); способность к проникновению и большому накоплению в цитоплазме раковых клеток; сохранение в цитоплазме мономерной формы за счет связывания с липидными структурами; высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода в липидном окружении; способность эффективно накапливаться в опухоли и окружающих опухоль тканях.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарю за финансовую поддержку данных исследований Российский фонд фундаментальных исследований (гранты 96-04-48421, 01-04-49298, 02-04-22001), Московский комитет по пауке и технике (грант ГБ-24/00), фонд PICS (Франция), НАТО (грант LST.CLG.97770775), фонд INTAS (93-1829, 01-0461), научно-техническую программу Правительства Москвы, Миннауки РФ и РАН «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических заболеваний».

Я искренне благодарен проф. Р.И. Якубовской, к.б.н. Т.А Кармаковой и другим сотрудникам лаборатории проф. Р.И. Якубовской за длительное и плодотворное сотрудничество в исследованиях ФС. Это сотрудничество было и остается важной предпосылкой развития метода КОМИРСИ, источником новых задач и новых идей. Еще раз спасибо проф. Р.И. Якубовской, которая увидела в нашем методе инструмент перспективный для исследований ФС, рекомендовала и поддержала наше участие в НТП Правительства Москвы. Я благодарю проф. Е.А. Лукьянец и проф. О.Л. Калея за предоставленную возможность участвовать в разработке и исследованиях ФС на основе фталоцианинов.

Я искренне благодарю проф. А.Ф. Миронова, к.х.н. М.А. Грина, к.х.н. B.C. Лебедеву и других сотрудников лаборатории проф. А.Ф. Миронова за синтез уникальных ЦИХЛ и ЦИБХЛ, за предоставленную нам возможность исследовать эти интересные ФС.

Большое спасибо за результативное сотрудничество нашим французским коллегам проф. М. Manfait, проф. P. Vigny, проф. J.-C. Maurizot, доктору М. Egret-Charlier, доктору М. Refregiers, а также голландскому проф. С. Otto. Надеюсь, что это сотрудничество будет также успешно развиваться и дальше. Я искренне восхищен работой доктора С.Шаронова и доктора А. Кокота, которые создали удивительно удобное программное обеспечение для измерений методом КОМИРСИ и всегда очень внимательно откликались на любые просьбы и идеи по оптимизации этого программного продукта под конкретные задачи эксперимента.

Я глубоко признателен проф. И. Набиеву, который в тяжелейшие для научных исследований годы «перестройки» всемерно поддерживал меня и работу нашей группы, организовал международное сотрудничество и обеспечил необходимое для выживания нашей группы вхождение в систему международных грантов.

Развитие метода КОМИРСИ было бы не возможно без активного и заинтересованного участия в исследованиях сотрудников ИБХ РАН И.А. Куделиной, к.б.н. М.В. Астаповой, моих бывших студентов и аспирантов А. Януля, А. Гришина, А. Назаровой и Г. Шаронова - спасибо Вам. Я от всей души благодарю своего научного консультанта проф. А.С. Арсеньева за консультации, помощь и поддержку в моих исследованиях, за большой вклад в развитие нашей исследовательской группы. Спасибо директору ИБХ РАН академику В.Т. Иванову, который поверил в мои аргументы и обеспечил целевое финансирование под создание лабораторной экспериментальной установки для конфокальной микроспектроскопии. Спасибо за сотрудничество д.х.н. Ю.Н. Уткину, д.б.н. Д.А. Долгих и всем-всем сотрудникам ИБХ РАН, оказывавшим мне посильную помощь в решении научных, организационных и административных проблем.

От всей души спасибо моей маме, Тамаре Алексеевне, за моральную поддержку, любовь и веру в мои силы. Огромное спасибо моей жене, Ане, за любовь, заботу, бесконечное терпение, помощь и понимание.

Список использованных сокращений

2М двумерный

АО акридиновый оранжевый

БАС биологически активные соединения

БСА бычий сывороточный альбумин

ДМСО диметилсульфоксид

КР комбинационное рассеяние

КОМИРСИ метод конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений

ЛСКМ лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

МСФ микроспектрофлуориметрия

МИТО митоксантрон

МЛУ множественная лекарственная устойчивость

МТТ 3-(4,5-димитилтиазол-2-ил)-2,5-бифенил тетразолий бромид

НДМА 4-нитрозо-М,Ы-диметиланилин

НИК нильский красный

НК нейтральный красный

НХМ нафтохиноксалиновый метаболит митоксантрона

ПАУ полициклические ароматические углеводороды п.о. пар оснований

РКР резонансное комбинационное рассеяние

Р6Ж родамин 6Ж

Р123 родамин 123

ТКТ конъюгат трансферрина с техасским красным топо II ДНК топоизомераза II

ФДТ фотодинамическая терапия

ФС фотосенсибилизатор(ы)

ФСБ фосфатно-солевой буфер (0,15 М NaCl, 50 мМ Na2HP04)

ЦИБХЛ циклоимидное(ые) производное(ые) бактериохлорина

ФХрб З-дезвинил-З-формилхлорин рб

ЦИХЛ циклоимидное(ые) производное(ые) хлорина рб

ЧСА человеческий сывороточный альбумин

ЭБ этидий бромид

ЭР эндоплазматический ретикулум

ЭТС эмбриональная телячья сыворотка

A-ern длина волны максимума спектра испускания флуоресценции

Xgx длина волны возбуждения

B16 меланома В16

BaPyr бензо[а]пирен

BODIPY- ^-((4-(4,4-дифлуоро-5-(2-тионил)-4-бора-За,4а-диаза-з-индацен-3-ил) церамид фенокси)ацетил)сфингозина

CFP циановый флуоресцирующий белок

CT цитотоксин из яда кобр

DOX доксорубицин

EC карцинома молочной железы Эрлиха

FRET резонансный перенос энергии флуоресценции

GFP зеленый флуоресцирующий белок

LLC карцинома легкого Льюиса

NADH восстановленный никотинадениндинуклеотид

NADPH восстановленный никотинадениндинуклеотид фосфат

P388 лимфоидный лейкоз Р388

SDS додецилсульфат натрия

YFP желтый флуоресцирующий белок

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате решения поставленных в данной работе задач удалось, на мой взгляд, детально разработать метод КОМИРСИ и найти ему широкое применение, как в фундаментальных, так и в ориентированных на клинику исследованиях БАС.

Созданный на основе коммерчески-доступных блоков конфокальный сканирующий спектральный микроскоп обеспечил приборную базу для дальнейшего развития метода КОМИРСИ и реализации исследовательских программ с применением этого метода на базе ИБХ РАН. Этот прибор успешно использован в представленных в данной работе клеточных исследованиях ЦИХЛ [91, 93, 99] и ЦИБХЛ, в изучении распределения ЦИХЛ в срезах тканей мышей [105], в ориентированных на клинику исследованиях проб опухолевых тканей пациентов [106] и ряде других исследований [76, 77, 84]. На этом приборе проводились клеточные исследования механизма действия флуоресцентно-меченных цитотоксинов из яда кобр [81] и апоптозной функции генно-инжененерных мутантов цитохрома с [82]. В настоящее время конфокальный сканирующий спектральный микроскоп продолжает интенсивно использоваться в исследовательских проектах Федерального агентства по науке и инновациям, РФФИ, Научно-технической программы "Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний" на 2004-2006 гг.

Разработанный нами метод КОМИРСИ дает возможность исследовать не только локализацию, но и молекулярные взаимодействия флуорофоров в живых клетках с ЗМ субмикронным пространственным разрешением. Метод основан на анализе спектров флуоресценции исследуемого соединения в клетках. Анализ внутриклеточных спектров флуоресценции позволяет охарактеризовать микроокружение и взаимодействия флуорофора, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности. Данный анализ проводится в каждой точке сканируемой клетки, что позволяет выявить полную картину состояния и взаимодействий соединения. Внутриклеточные концентрации изучаемых молекул определяются по интенсивности флуоресценции с учетом тушения/усиления сигнала, вызываемого образованием комплексов и влиянием других факторов. Это увеличивает точность измерений по сравнению с обычными методами оптической микроскопии и дает возможность установить реальное количественное распределение соединения и его комплексов в клеточных компартментах, изучить динамику их накопления и удержания в клетках. За счет этих своих преимуществ метод КОМИРСИ является хорошим дополнением к традиционным методам флуоресцентной микроскопии и ЛСКМ.

Разработаны основы применения метода КОМИРСИ для изучения локализации и молекулярных взаимодействий флуоресцирующих противоопухолевых соединений в живых раковых клетках. Метод предоставляет уникальную возможность идентификации по спектрам флуоресценции комплексов и микроокружения/состояпия противоопухолевого соединения в интактных клетках и измерения с ЗМ субмикронным пространственным разрешением количественных карт (спектральных изображений) распределения этого соединения и его комплексов в клетках.

Методом КОМИРСИ исследованы накопление, распределение и взаимодействия МИТО, эффективного противоопухолевого препарата, в эритроидных лейкозпых клетках человека К562, в синхронизованной культуре клеток К562 на различных фазах клеточного цикла, а также в клетках с множественной лекарственной устойчивостью K562R. С использованием модельных экспериментов по изучению влияния на спектры эмиссии флуоресценции МИТО взаимодействий с молекулярными мишенями, кислотности среды, гидрофобности микроокружения, концентрации и других факторов, моделирующих состояние МИТО в клетке, подобран набор модельных спектров, позволяющий описать внутриклеточные состояние и взаимодействия МТК. Обнаружен и по спектрам флуоресценции идентифицирован НХМ, метаболит, образующийся в результате окислительного действия ряда внутриклеточных ферментов.

Проведен количественный анализ накопления и дозо-зависимого внутриклеточного распределения МИТО, его комплексов с гидрофобными клеточными структурами, с нуклеиновыми кислотами, а также НХМ в живых клетках К562. Охарактеризованы области гетерогенного накопления этих комплексов и состояний МИТО в клетках. Изучены особенности взаимодействия МИТО в S-, G2- и М- клетках синхронизированной культуры клеток К562. Целыо этих экспериментов было выяснить, как внутриклеточные молекулярные взаимодействия МИТО, регистрируемые методом КОМИРСИ, зависят от стадии клеточного цикла: происходит ли фазо-зависимое изменение внутриклеточной концентрации МИТО, внутриклеточное перераспределение или предпочтительное накопление определенных комплексов МИТО-мишень. Обнаружено, что МИТО вызывает остановку клеточного цикла клеток в митозе на стадии анафазы. Охарактеризованы молекулярные взаимодействия МИТО, блокирующие завершение анафазы. Проведен сравнительный количественный анализ накопления и локализации МИТО и его комплексов в чувствительных К562 и резистентных K562R клетках. Выявлены и охарактеризованы факторы (уменьшение внутриклеточной концентрации МИТО, изменение его внутриклеточной локализации и резкое снижение содержания МИТО в комплексах с ДНК и другими мишенями), отвечающие за снижение цитотоксического эффекта в резистентных клетках. Проведено сопоставление полученных данных с данными других биохимических и цитологических методов и дан их анализ с точки зрения механизмов цитотоксичности МИТО.

Результаты, полученные для МИТО, демонстрируют уникальный потенциал метода КОМИРСИ применительно к разработке и изучению новых цитостатиков, а аналитические возможности метода способны обеспечить количественную оценку эффективности различных способов преодоления МЛУ и новых подходов к избирательной доставке противоопухолевых соединений в раковые клетки.

Метод КОМИРСИ интенсивно использовался в исследованиях безметалыюго сульфированного фталоцианина H2PCS2.4 в клетках и срезах тканей животных. В результате этих исследований удалось доказать ошибочность мнения о неэффективности безметального сульфированного фталоцианина, как ФС, и охарактеризовать молекулярные, клеточные и тканевые свойства H2PCS2.4, лежащие в основе противоопухолевого фотодинамического эффекта с использованием НгРсЗг^. В настоящее время препарат па основе этого ФС, разрабатываемый ФГУП ГНЦ НИОПИК под название Фталасенс, находится на стадии клинических исследований.

Исследованы свойства новой группы ФС с поглощением в ближней ИК-области (708-746 нм) - ЦИХЛ-производных. На примере пятнадцати производных с различными боковыми заместителями введенными в пиррольные кольца A, D и имидный цикл детально изучена возможность за счет изменения структуры заместителей варьировать ключевые параметры, определяющие фотодинамическую активность ФС в раковых клетках. Установлено, что наибольшего внутриклеточного проникновения и активности ЦИХЛ-производных удается достичь, обеспечив стабилизацию мономерной формы в водной среде с помощью 0,002-0,01 % эмульсии Кремофора. Показано, что внутриклеточное накопление ЦИХЛ-производных происходит в цитоплазме в мопомерпой форме связанной с липидными клеточными структурами. При облучении светом липид-связанные ЦИХЛ-производные не образуют гидроксил-радикалов, но характеризуются высокими квантовыми выходами генерации синглетного кислорода, которые варьируются от 0,73 до 0,35. Показано, что эффективность генерации синглетного кислорода не зависит от положения длинноволнового максимума поглощения в диапазоне 665-746 нм, а определяется влиянием боковых заместителей. Обнаружено, что, варьируя структуру заместителей, можно управлять внутриклеточной локализацией ЦИХЛ-производных, усиливая их накопление либо в аппарате Гольджи и ЭР, либо в липидных каплях, клеточных органоидах, ответственные за хранение нейтральных липидов и стериновых эфиров. Оба типа клеточной локализации обеспечивают высокую фотоцитотоксичность, которая по данным МНИОИ им. П.А. Герцена для наиболее активных соединений в 50 раз выше, чем у хлорина рб, и в 150 раз выше, чем у применяемого в клинике препарата Фотогем. При неудачных комбинациях заместителей активность падает в сотни раз, главным образом, из-за неспособности этих производных проникать в раковые клетки.

Нами показано, что с помощью боковых заместителей можно в широком диапазоне варьировать скорость клеточного накопления и выведения ЦИХЛ, а также коэффициент их внутриклеточного накопления. Установлено, что такие механизмы проникновения в клетки, как активные (АТФ-зависимые) типы транспорта, кавеолярный и клатрин-опосредованный эндоцитоз, не играют существенной роли в интернализации ЦИХЛ-производпых, а вклад пассивной диффузии выявлен только для нейтральных гидрофобных соединений. Установлено, что для обоих типов клеточной локализации механизм фотоиндуцированной гибели клеток меняется в зависимости от дозы света и внутриклеточной концентрации ЦИХЛ-производных. При условиях вызывающих гибель около 50% клеток доминирует апоптоз, в то время как 100% гибель клеток сопровождается некрозом.

Продемонстрирована возможность создания на основе ЦИХЛ-производных высокоэффективных ФС. По данным МНИОИ им. П.А. Герцена ФДТ с 13,15-[N-(3-гидроксипропил)]циклоимидом хлорина рб (соединение 1) и метиловым эфиром 13,15-[Ы-(3-метокси)]циклоимида хлорина рб (соединение 5) обеспечивает значительный противоопухолевый эффект на мышах с привитой подкожно лимфомой Р388. Наибольший эффект достигнут при дозе 4 мкмоль/кг, когда облучение выполняли через 1,5 ч после инъекции ФС. Согласно анализу срезов ткани методом КОМИРСИ эта временная задержка соответствует максимальному накоплению 1 и 5 в опухолевых клетках (отношение накопления в опухоли к накоплению в коже — 8-10). Облучение опухоли через 15 мин после введения соединения 1 в дозе 1 мкмоль/кг обеспечивает эффективную сосудистую фотодинамическую терапию опухоли, тогда как соединение 5 не подходит для этого. Установлены взаимосвязи между тканевым распределением соединений 1 и 5 и эффективностью ФДТ при различных временных задержках между введением ФС и облучением опухоли светом.

Детально, с акцентом на взаимосвязи между структурой и активностью исследованы 10 новых ИК-ФС, циклоимидных производных бактериохлорипа

ЦИБХЛ) с различными 13,15-N- заместителями и заместителями 3-ацетил группы. Исследованные ЦИБХЛ поглощают свет в области окна прозрачности биологических тканей (780-830 им) и обладают высокой фотостабилыюстью при длительном облучении светом. Наиболее активные производные в 300 раз более фотоцитотоксичны в отношении клеток А549 и HeLa, чем применяемый в клинике Фотогем (данные МНИОИ им. П.А. Герцена), благодаря заместителям, которые, как показано нами, улучшают внутриклеточное накопление (коэффициент накопления 8-13) и обеспечивают эффективную фотоиндуцированную генерацию синглетного кислорода (квантовый выход 0,54-0,57). Заместители предопределяют усиленное накопление ЦИБХЛ во внутриклеточных липидных каплях, аппарате Гольджи или обеспечивают смешанное накопление в липидных каплях и аппарате Гольджи раковых клеток. Липидные капли и аппарат Гольджи - критические мишени, высокочувствительные в ЦИБХЛ-опосредованному фотоиндуцированному повреждению. Конфокальный флуоресцентный анализ срезов опухолевых тканей мышей выявил особенности тканевого распределения ЦИБХЛ и, в частности, их способность накапливаться в опухоли и окружающей соединительной ткани. Учитывая короткодействие синглетного кислорода, эти свойства ЦИБХЛ являются предпосылкой для эффективной противоопухолевой ФДТ и надежным основанием для разработки препарата.

Врачи МНИОИ им. П. А. Герцена, применяющие ФДТ для лечения рака, считают целесообразным проведение исследования методом КОМИРСИ накопления и распределения ФС в пробах тканей пациентов для повышения эффективности терапии. Эти исследования ведутся в настоящее время.

Результаты разработки метода КОМИРСИ находят широкое применение в исследованиях БАС в ИБХ РАН и успешно используются в совместных научных исследованиях с МНИОИ им. П. А. Герцена, ФГУП ГНЦ «НИОПИК», МГАТХТ им. М.В. Ломоносова и Институтом иммунологии.

Исследования с применением метода КОМИРСИ, проведенные под моим научным руководством, стали основой для двух магистрских и двух кандидатских диссертаций; готовится к защите третья кандидатская диссертация.

Изложенные в диссертации результаты могут быть использованы в работе лабораторий, занимающихся исследованиями БАС с применением методов оптической микроскопии и ЛСКМ, а также представляют интерес для лабораторий и фирм, разрабатывающих ФС.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Феофанов, Алексей Валерьевич, Москва

1. Taylor D. L., Wang Y.-L. Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture. Part B. San Diego:1. Acad. Press, 1989.

2. Pawley J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Plenum Publishing, 1990.

3. McLean Grogan W., Collins J. M. Guide to flow cytometry methods. Marcel Dekker, 1990.

4. Andrews P. D., Harper I. S., Swedlow J. R. To 5D and Beyond: Quantitative Fluorescence

5. Microscopy in the Postgenomic Era. Traffic 2002, 3,29-36.

6. Kohler A. Mikrophotographische untersuchungen mit ultraviolettem Iicht. Z. wiss. Mikroskop.1904,21, 129-165.

7. Murphy D.B. Fundamentals of light microscopy and electronic imaging. Wiley-Liss.

8. Swedlow J.R., Sedat J.W., Agard D.A. Deconvolution in optical microscopy. In: Jansson PA, editor.

9. Deconvolution of Images and Spectra, 2nd edn. New York: Academic Press, 1997, 284-309.

10. McNally J.G., Karpova Т., Cooper J., Conchello J.A. Three-dimensional imaging by deconvolutionmicroscopy. Methods 1999, 19, 373-385.

11. Shaw P.J. Computer reconstruction in three-dimensional fluorescence microscopy. In: Shotton D.,editor. Electronic Light Microscopy. New York: Wiley-Liss, Inc., 1993.

12. Агроскип JI.C., Королев H.B. Микроскоп-спектрофлуориметр для ультрафиолетовой области. Биофизика 1961, 6, №1, 478-485.

13. Максимовский Л.Ф. Схема микроскопа спектрофлуориметра. Цитология 1964, 6, №2, 255-256.

14. Ягупов А.С., Прокофьев А.Я. Установка для изучения спектров флуоресценции отдельных клеток. Цитология 1966, 8, №4, 569-572.

15. Камипир Л.Б., Хруст Ю.Р., Емельянова Л.А., Долгов А.И. Микроспектрофлуориметр для регистрации люминесценции в видимой области. Вестник АН СССР, 1966, 8, 127.

16. Морозов Ю.Е., Фукс Б.Б. Простой цитоспектрофлуориметр. Архив патологии 1968, №4, 8687.

17. Розанов Ю.М., Селиванов Г.В., Боровиков Ю.С. Установка для исследования спектров флуоресценции биологических микрообъектов. Цитология 1969, 11, №7, 910-915.

18. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. Москва: Наука 1978.

19. Olson R.A. Rapid scanning microspectrofluorimeter. Rev. Scient. Instrum. 1960, 31, 844.

20. Loeser C.N., West S.S. Cytochemical studies and quantitative television fluorescence and absorption spectroscopy. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1962, 97, 346.

21. Runge A. A recording microfluorospectrophotometer. Science 1966, 156, 1499.

22. Pearse A.G.E., Rost F.W.D. A microspectrofluorimeter with epi-illumination and photocounting. J. Microsc. 1969, 89,312-328.

23. Kohen E., Kohen C., Thorell B. Rapid automatic microspectrofluorometric study of intracellular energy metabolism. Exper. Cell. Res. 1976, 101,47-54.

24. Blais J., Amirand C., Ballini J.P, Debey P., Foultier M.T, Patrice T. Photofrin-induced fluorescence in progressive and regressive murine colonic cancer cells: correlation with cell photosensitivity. J. Photochem. Photobiol. B. 1995,27,225-231.

25. Reyftmann J.P., Kohen E., Morliere P., Santus R., Kohen C., Mangel W.F., Dubertret L., Hirschberg J.G. A microspectrofluorometric study of porphyrin-photosensitized single living cells I. Membrane alterations. Photochem. Photobiol. 1986, 44, 461-469.

26. Shah К., Gadella T.W. J.r, van Erp H., Hecht V., de Vries S.C. Subcellular localization and oligomerization of the Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptor kinase 1 protein. J. Mol.Biol. 2001,309,641-655.

27. Feofanov A., Sharonov S., Valisa P., Da Silva E., Nabiev I., Manfait M. A new confocal stigmatic spectrometer for micro-Raman and micro-fluorescence spectral imaging analysis. Design and applications. Rev. Sci. Instrum. 1995, 66, 3146-3158.

28. Sharonov S., Chourpa I., Valisa P., Fleury F., Feofanov A., Manfait M. Confocal spectral imaging analysis. European Microscopy and Analysis. 1994,11,23-25.

29. Sharonov S., Nabiev I., Chourpa I., Feofanov A., Valisa P., Manfait M. Confocal 3D- scanning laser Raman/SERS/ fluorescence microprobe. Spectral imaging and high- resolution applications. J.Raman Spectroscopy. 1994,25,699-707.

30. Sharonov S., Chourpa I., Morjani H., Nabiev I., Manfait M. and Feofanov A. Confocal spectral imaging analysis: a new concept for studies of spatial distribution of antitumor drugs within living cancer cell. Anal. Chim. Acta. 1994, 290, 40-47.

31. Millot J.M., Pingret L., Angiboust J.F., Bonhomme A., Pinon J.M., Manfait M. Quantitative determination of free calcium in subcellular compartments, as probed by Indo-1 and confocal microspectrofluorometry. Cell. Calcium. 1995, 17,354-366.

32. Berg R.H. Evaluation of spectral imaging for plant cell analysis. J. Microscopy 2004, 214, 174181.

33. Mellors R.C., Hlinka J. The cellular localization of material after administration of the carcinogen P-naphthylamine: fluorescence microscopy of epithelial cells of bladder. Cancer. 1952, 5, 242248.

34. Kohen E., Kohen C., Hirschberg J.G. Microspectrofluorometry of carcinogens in living cells. Histochemistry. 1983,79,31-52.

35. Salmon J.M., Kohen E., Kohen C., Bengtsson G. The effect of intracellular oxygen on the metabolization of benzo(a)pyrene and benzo(k)fluoranthene. A microspectrofluorometric analysis in single living cells. Histochemistry. 1974, 42, 75-84.

36. Salmon J.M., Kohen E., Kohen C., Bengtsson G. Microspectrofluorometric study of benzo(a)pyrene metabolization in benzo(a)pyrene-grown single living cells. Histochemistry. 1974, 42, 85-98.

37. Salmon J.M., Kohen E., Kohen C., Bengtsson G. A microspectrofluorometric approach for the study of benzo(a)pyrene and dibenzo(a, h)anthracene metabolization in single living cells. Histochemistry. 1974,42,61-74.

38. Lahmy S., Salmon J.M., Viallet P. Microspectrofluorometric comparison of benzo(a)pyrene and dibenzo(c,h)acridine metabolism in single living 3T3 fibroblasts. J. Histochem. Cytochem. 1987, 35, 197-201.

39. Moreno G., Salet C., Kohen C., Kohen E. Penetration and localization of furocoumarins in single living cells studied by microspectrofluorometry. Biochim. Biophys. Acta. 1982, 721, 109-11.

40. Gigli M., Doglia S.M., Millot J.M., Valentini L., Manfait M. Quantitative study of doxorubicin in living cell nuclei by microspectrofluorometry. Biochim. Biophys. Acta. 1988, 950,13-20.

41. Millot J.M., Rasoanaivo T.D., Morjani H., Manfait M. Role of the aclacinomycin A-doxorubicin association in reversal of doxorubicin resistance in K562 tumour cells. Br. J. Cancer. 1989, 60, 678-684.

42. Abdellaoui K., Boustta M., Vert M., Morjani H., and Manfait M. Metabolite-derived artificial polymers designed for drug targeting, cell penetration and bioresorption. Eur. J. Pharmac. Sciencies. 1998, 6, 61-73.

43. Millot J.-M., Sharonov S., Manfait M. Scanning microspectrofluorometry of rhodamine 123 in multidrug-resistant cells. Cytometry. 1994, 17, 50-58.

44. Jacquot J., Maizieres M., Spilmont C., Millot J.M., Sebille S., Merten M., Kammouni W., Manfait M. Intracellular free Ca2+ dynamic changes to histamine are reduced in cystic fibrosis human tracheal gland cells. FEBS Lett. 1996, 386, 123-127.

45. Maizieres M., Kaplan H., Millot J.M., Bonnet N., Manfait M., Puchelle E., Jacquot J. Neutrophil elastase promotes rapid exocytosis in human airway gland cells by producing cytosolic Ca2+ oscillations. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1998, 18, 32-42.

46. Sebille S., Millot J.M., Maizieres M., Arnaud M., Delabroise A.M., Jacquot J., Manfait M. Spatial and temporal Mg2+ signaling in single human tracheal gland cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996,227,743-749.

47. Thomas J., Millot J.M., Sebille S., Delabroise A.M., Thomas E., Manfait M., Arnaud M.J. Free and total magnesium in lymphocytes of migraine patients effect of magnesium-rich mineral water intake. Clin. Chim. Acta. 2000, 295, 63-75.

48. Pereira M., Millot J.M., Sebille S., Manfait M. Inhibitory effects of extracellular Mg2+ on intracellular Ca2+ dynamic changes and thapsigargin-induced apoptosis in human cancer MCF7 cells. Mol. Cell. Biochem. 2002, 229, 163-171.

49. Kohen E., Kohen C., Reyftmann J.P., Morliere P., Santus R. Microspectrofluorometry of fluorescent photoproducts in photosensitized cells. Relationship to cellular quiescence and senescence in culture. Biochim. Biophys. Acta. 1984, 805, 332-336.

50. Chernyaeva E.B., Vardanyan A.G., Koroteev N.I., Kamalov V.F., Lobanov O.V., Mironov A.F., Rumyanzeva V.D. Laser picosecond microspectrofluorometry of haematoporphyrin in cells and liposomes. J. Photochem. Photobiol. B. 1991, 10, 239-248.

51. Morlet L., Vonarx V., Foultier M.T., Gouyette A., Stewart C., Lenz P., Patrice T. In vitro and in vivo spectrofluorometry of a water -soluble meta-(tetrahydroxyphenyl)chlorin (m-THPC) derivative. J. Photochem. Photobiol. B. 1997, 39, 249-257.

52. Rousset N., Vonarx V., Eleoue S., Carre J., Bourre L., Lajat Y., Patrice T. Cellular distribution and phototoxicity of benzoporphyrin derivative and Photofrin. Res. Exp. Med. 2000, 199, 341-357.

53. Jacobson I. W., Simpson D.M. The fluorescence spectra of pterins and their possible use in the elucidation of the antipernicious anemia factor. Biochem. J. (London) 1946, 40, 3-14.

54. Kohen E., Thorell B. Kohen C., Salmon J.M. Studies on metabolic events in localized compartments of the living cell by rapid microspectrofluorimetry. In: Advances in biological and medical physics. Acad. Press, 1974, 15, 271-297.

55. Kohen E., Kohen C., Hirschberg J.G., Wouters A.W., Thorell В., Westerhoff H.V., Charyulu K.K. Metabolic control and compartmentation in single living cells. Cell. Biochem. Funct. 1983, 1, 316.

56. Bondza-Kibangou P., Millot C., Dufer J., Millot J.M. Microspectrofluorometry of autofluorescence emission from human leukemic living cells under oxidative stress. Biol. Cell. 2001,93,273-280.

57. Millot C., Bondza-Kibangou P., Millot J.M., Lallemand A., Manfait M. Autofluorescence spectroscopy of malpighian epithelial cells, as a new tool for analysis of cervical cancer precursors. Histol. Histopathol. 2003, 18, 479-485.

58. Верболович H.A. Миоглобип и его роль в физиологии и патологии животных и человека. Москва: Медгиз, 1961.

59. Peng, Q., Berg, К., Moan, J., Kongshaug, M., and Nesland, J. M. 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: principles and experimental research. Photochem. Photobiol. 65, 235-251, 1997.

60. Карнаухов B.H. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. Москва, Наука, 2001.

61. Rabaste F., Sancelme M., Delort A.-M., Blais J., Bolard J. Intracellular pH of Candida albicans blastospores as measured by laser microsectrofluorimetery and 31P-NMR. Biochem. Biophys. Acta. 1995, 1268,41-49.

62. Brigui I., Djavanbakht-Samani Т., Jolles В., Pigaglio S., Laigle A. Minimally modified phosphodiester antisense oligodeoxyribonucleotide directed against the multidrug resistance gene mdrl. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, 747-754.

63. Zimmermann Т., Rietdorf J., Pepperkok R. Spectral imaging and its applications in live cell microscopy. FEBS Let. 2003, 546, 87 -92.

64. Filatov A.V., Shmigol I.В., Sharonov G.V., Feofanov A.V., Volkov Y. Direct and indirect antibody-induced TX-100 resistance of cell surface antigens. Immunol. Lett. 2003, 85, №3, 287295.

65. Feofanov A., Grichine A., Shitova L., Karmakova Т., Yakubovskaya R., Egret-Charlier M., Vigny P. Confocal Raman microspectroscopy and imaging study of theraphthal in living cancer cells. Biophys. J. 2000, 78, 1, 499-512.

66. Feofanov A., Grichine A., Shitova L., Karmakova Т., Yakubovskaya R. Intracellular distribution and states of a new anticancer agent teraftal as investigated with confocal Raman imaging technique. Asian J. Spectrosc. 1999, 3, 23-31.

67. Водовозова E. Л., Назарова А.И., Феофанов А.В., Холоденко P.B., Пазыпина Г.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Ю.Г. Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы человека. Биологические мембраны. 2004, 21, №1, 5364.

68. Feofanov A.V., Sharonov G.V., Astapova M.V., Rodionov D.I., Utkin Yu.N., Arseniev A.S. Cancer cell injury by cytotoxins from cobra venom is mediated through lysosomal damage. Biochem. J. 2005 ,390 (Pt 1), 11-18.

69. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "Kindling Fluorescent Protein" riddle. J. Biol. Chem. 2003, 278, №9, 7215-7219.

70. Feofanov A., Charonov S., Kudelina I., Fleury F., and Nabiev I. Localization and molecular interactions of mitoxantrone within living K562 cells as probed by confocal spectral imaging analysis. Biophys. J. 1997, 73, 3317-3327.

71. Filyasova A., Kudelina I.A., Feofanov A.V. A spectroscopic study of interaction of tetrasulfonated aluminum phthalocyanine with human serum albumin. J. Mol. Struct. 2001, 565-566, 173-176.

72. Feofanov A., Charonov S., Fleury F., Kudelina I., Nabiev I. Confocal spectral imaging analysis of intracellular interactions of mitoxantrone at the different phases of cell cycle. Anticancer Res. 1999, 19,5341-5348.

73. Mewes K., Blanz J., Ehninger G., Gebhard R., Zeller K.-P. Cytochrome Р-450-induced cytotoxicity of mitoxantrone by formation of electrophilic intermediates. Cancer Res. 1993, 53, 5135-5142.

74. Galanina О., Feofanov A., Tuzikov А.В., Rapoport Е., Crocker P.R., Grichine A., Egret-Charlier М., Vigny P., Le Pendu J., Bovin N. Fluorescent carbohydrate probes for cell lectins. Spectrochimica Acta. 2001, 57, 2285-2296.

75. Forouhar F., Huang W.N., Liu J.H., Chien K.Y., Wu W.G., Hsiao C.D. Structural basis of membrane-induced cardiotoxin A3 oligomerization. J. Biol. Chem. 2003, 278, 21980-21988.

76. Wang L.H., Rothberg K.G., Anderson R.G. Mis-assembly of clathrin lattices on endosomes reveals a regulatory switch for coated pit formation. J. Cell. Biol. 1993, 123, 1107-1117.

77. Haugland R.P. Handbook of fluorescence probes and research products. Edition 8. 2001 Molecular Probes Inc., Eugene, USA

78. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z., Traganos F., Melamed M. R. Interaction of a new antitumor agent, l-4-dihydroxy-5,8-bis-[2-(2-hydroxyethyl)-amino.ethyl]amino]-9,10-anthracenedione, with nucleic acids. Biochem. Pharmacol. 1981,30,231-240.

79. Reszka K., Kolodziejczyk P., Lown J.W. Horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of mitoxantrone: spectrophotometric and electron paramagnetic resonance studies. J. Free Rad. Biol. Med. 1986, 2,25-32.

80. Bors W., Saran M., Lengfelder E., Michel C., Fuchs C., Frenzel C. Detection of oxygen radicals in biological reactions. Photochem. Photobiol. 1978, 28, 629-638.

81. Blum A. Grossweiner L.I. Singlet oxygen generation by hematoporphyrin IX, uroporphyrin I and hematoporphyrin derivative at 546 nm in phosphate buffer and in the presence of egg phosphatidylcholine liposomes. Photochem. Photobiol. 1985, 41, 27-32.

82. Usui Y., Kamogawa K. A standard system to determine the quantum yield of singlet oxygen formation in aqueous solution. Photochem. Photobiol. 1974,19, 245-247.

83. Petyaev I.M., James V.H. Micellar acceleration of oxigen-dependent reactions and its potential use in the study of human low density lipoprotein. Biochimica. et Biophysica Acta. 1997, 1345, 293-305.

84. Weng M., Zhang M.-H., Shen T. Electron transfer interaction between hypocrellin A and biological substrates and quantitative analysis of superoxide anion radicals. J Chem. Soc., Perkin Trans. 1997, 2, 2393-2397.

85. Takahashi M., Furukawa Т., Nikkuni K., Aoki A., Nomoto N. Efficient introduction of a gene into hematopoietic cells in S-phase by electroporation. Exp. Hematol. 1991,19,343-348,

86. Ehninger G., Schuler U., Proksch В., Zeller K.-P., Blanz J. Pharmacokinetics and metabolism of mitoxantrone. A review. Clin. Pharmacokinet. 1990, 18, 365-380.

87. Faulds D., Balfour J.A., Chrisp P., Langtry H.D. Mitoxantrone. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic potential in the chemotherapy of cancer. Drugs. 1991, 41, 400-449.

88. Smith P. J., Morgan S. A., Fox M. E., Watson J. V. Mitoxantrone-DNA binding and the induction of topoisomerase II associated DNA damage in multi-drug resistant small cell lung cancer cells. Biochem. Pharmacol. 1990,40, 2069-2078.

89. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z. Interactions of antitumor agents ametatrone and mitoxantrone (Novatrone) with double-stranded DNA. Clinical Pharmacol. 1985, 34, 4203-4213.

90. Kapuscinski J., Darzynkiewicz Z. Relationship between the pharmacological activity of the antitumor drugs ametantrone and mitoxantrone and their ability to condense nucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, 83, 6302-6306.

91. Roberts R. A., Cress A. E., Dalton W. S. Persistent intracellular binding of mitoxantrone in a human colon carcinoma cell line. Biochem. Pharmacol. 1989, 38, 4283-4290.

92. Но С. K., Law S. L., Chiang H., Hsu M. L., Wang С. C., Wang S.Y. Innhibition of microtubule assembly is a possible mechanism of action of mitoxantrone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 180,118-123.

93. Бурштейн E.A. Люминесценция белковых хромофоров (модельные исследования). Серия Биофизика . 1976, Т.6. Под ред. Ю.А. Владимирова, ВИНИТИ, Москва.

94. Reszka К., Hartley J.A., Kolodziejczyk P., Lown J. W. Interaction of the peroxidase-derived metabolite of mitoxantrone with nucleic acids. Evidence for covalent binding of I4C-IabeIed drug. Biochem. Pharmacol. 1989, 38,4253-4260.

95. Saenger W. Principles of Nucleic Acid Structure. Springer-Verlag, New York. 1984.

96. Bhalla K., Ibrado A.M., Tourkina E., Tang C., Grant S., Bullock G., Huang Y., Ponnathpur V., Mahoney M.E. High-dose mitoxantrone induces programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukaemia cells. Blood. 1993, 82, 3133-3140.

97. Sumner A.T. Inhibitors of topoisomerase II delay progress through mitosis and induce a doubling of the DNA content in CHO cells. Exp. Cell. Res. 1995, 217, 440-447.

98. Downes C.S., Mullinger A.M., Johnson R.T. Inhibitors of DNA topoisomerase II prevent chromatid separation in mammalian cells but do not prevent exit from mitosis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1991,88,8895-8899.

99. Dougherty T. J., Gomer C. J., Henderson B. W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. Photodynamic therapy. J. Natl. Cancer Inst. 1998,90,889-905.

100. Brasseur N., All Н., Langlois R., Wagner J. R., Rousseau J., van Lier J. E. Biological activities of phthalocyanines-V. Photodynamic therapy of EMT-6 mammary tumors in mice with sulfonated phthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1987, 45, 581-586.

101. Sonoda M., Krishna С. M., Riesz P. The role of singlet oxygen in the photohemolysis of red blood cells sensitized by phthalocyanine sulfonates. Photochem. Photobiol. 1987, 46, 625-631.

102. Evensen J. F., Moan J. A test of different photosensitizers for photodynamic treatment of cancer in a murine tumor model. Photochem. Photobiol. 1987, 46, 859-865.

103. Abernatey C.D., Anderson R.E., Kooistra K.L., Laws E.R. (Jr) Activity of phthalocyanine photosensitizers agains human glioblastoma in vitro. Neurosurgery. 1987, 21, 468-473.

104. Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol. 1991, 53, 859870.

105. Brasseur N., Ali Н., Autenrieth D., Langlois R., van Lier J. E. Biological activities of phthalocyanines- III. Photoinactivation of V-79 Chinese hamster cells by tetrasulfophthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1985,45, 515-521.

106. Langlois R., Ali H., Brasseur N., Wagner J.R., van Lier J. E. Biological activities of phthalocyanines-IV. Type II sensitized photooxidation of L-tryptophan and cholesterol by sulfonated metallo phthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1986,44, 117-123.

107. Spikes J. D. Phthalocyanines as photosensitizers in biological systems and for the photodynamic therapy of tumors. Photochem. Photobiol. 1986,43, 691-699.

108. Kraljic I., El Mohsni S. A new method for the detection of singlet oxygen in aqueous solutions. Photochem. Photobiol. 1978, 28, 577-581.

109. Boyle R.W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol. 1996, 64, 469-485.

110. Margaron P., Gregoire M.-J., Scasnar V., Ali H., van Lier J. E. Structure-photodynamic activity relationships of a series of 4-substituted zinc phthalocyanines. Photochem. Photobiol. 1996, 63, 217-223.

111. Миронов А.Ф. Разработка сенсибилизаторов второго поколения на основе природных хлорофиллов. Росс. хим. журн. 1998, 42, №5, 23-35.

112. Sternberg E.D., Dolphin D., Bruckner C. Porphyrin-based photosensitizers for use in photodynamic therapy. Tetrahedron. 1998, 54,4151-4202.

113. Лукьянец E.A. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии. Росс. хим. журн. 1998, 42, №5, 9-16.

114. Oseroff A.R., Ohuoha D., Hasan Т., Bommer J. C., Yarmush M. L. Antibody-targeted photolysis: selective photodestruction of human T-cell leukemia cells using monoclonal antibody-chlorin e6 conjugates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986, 83, 8744-8748.

115. Borland C. F., McGarvey D. J., Morgan A. R., Truscott T. G. Laser flash photolysis of purpurins: novel potential photosensitizers of interest in photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B. 1988,2,427-434.

116. Morgan A. R., Garbo G. M., Truscott T.G. Photophysical and photochemical properties of purpurins. Proc. Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1988, 847, 172-179.

117. Zweytick D., Athenstaedt K., Daum G. Biochim. Biophys. Acta. 2000,1469, 101-120.

118. Gederaas O.A., Holroyd A., Brown S. В., Vernon D., Moan J., Berg K. 5-Aminolaevulinic acid methyl ester transport on amino acid carriers in a human colon adenocarcinoma cell line. Photochem. Photobiol. 2001, 73, 164-169

119. Peklmans L., Helenius A. Endocytosis via caveolae. Traffic. 2002, 3, 311-320.

120. Rothberg K.G., Heuser J. E., Donzell W.C., Ying Y.S., Glenney J.R., Anderson R.G. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 1992, 68, 673-682.

121. Rodal S.K., Skretting G., Garred O., Vilhardt F., van Deurs В., Sandvig K. Extraction of cholesterol with methyl-beta-cyclodextrin perturbs formation of clathrin-coated endocytic vesicles. Mol. Biol. Cell. 1999, 10, 961-974.

122. Subtil A., Gaidarov I., Kobylarz K., Lampson M. A., Keen J. H., McGraw Т. E. Acute cholesterol depletion inhibits clathrin-coated pit budding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 6775-6780.

123. Sofer A., Futerman A.H. Cationic amphiphilic drugs inhibit the internalization of cholera toxin to the Golgi apparatus and the subsequent elevation of cyclic AMP. J. Biol. Chem. 1995, 270, 1211712122.

124. Liscovitch M., Lavie Y. Sphingoid bases as endogenous cationic amphiphilic "drugs". Biochem. Pharmacol. 1991,42, 2071-2075.

125. Marzo I., Susin S.A., Petit P.X., Ravagnan L., Brenner C., Zamzami N., Kroener G. Caspases disrupt mitochondrial membrane barrier function. FEBS Lett. 1998, 427, 198-202.

126. Skulachev V. P. Cytochrome с in the apoptotic and antioxidant cascades. FEBS Lett. 1998, 423, 275-280.

127. Kramer B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 2001, 21, 4271-4277.

128. Cramer P., Ruevekamp M., Oppelaar H., Dalesio O., Baas P., Stewart F.A. Foscan uptake and tissue distribution in relation to photodynamic efficacy. Br. J. Cancer. 2003, 88, 283-290.

129. Kelleher D. K., Thews O., Scherz A., Salomon Y., Vaupel P. Perfusion, oxygenation status and growth of experimental tumors upon photodynamic therapy with Pd-bacteriopheophorbide. Int. J. Oncol. 2004,24, 1505-1511.

130. Rovers J. P., de Jode M. L., Rezzoug H., Grahn M. F. In vivo photodynamic characteristics of the near-infrared photosensitizer 5,10,15,20-tetrakis(m-hydroxyphenyl) bacteriochlorin. Photochem. Photobiol. 2000, 72, 358-364.

131. Mironov A. F., Grin M. A., Tsiprovskiy A. G., Kachala V. V., Karmakova T. A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R. I. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring. J. Porphyr. Phthalocya. 2003, 7, 725-730.

132. Mironov A. F., Grin M. A., Tsyprovskiy A. G. Synthesis of the first N-hydroxy cycloimide in the bacteriochlorophyll a series. J. Porphyr. Phthalocya. 2002, 6, 358-361.

133. Mironov A.F., Kozyrev A. F., Brandis A. N. A. S. Sensitizers of second generation for photodynamic therapy of cancer based on chlorophyll and bacteriochlorophyll derivatives. Proc. SPIE. 1922,204-208.

134. Chen Y., Grahm A., Potter W., Morgan J., Vaughan L., Bellnier D. A., Henderson B.W., Oseroff A., Dougherty T. J., Pandey R. K. Bacteriopurpurinimides: highly stable and potent photosensitisers for photodynamic therapy. J. Med. Chem. 2002, 45, 255-258.

135. Chen Y., Sumlin A., Morgan J., Gryshuk A., Oseroff A., Henderson B.W., Dougherty T. J., Pandey R.K. Synthesis and photosensitizing efficacy of isomerically pure bacteriopurpurinimides. J.Med. Chem. 2004,47,4814-4817.

136. Baumler W., Abels C., Karrer S., WeiB Т., Messmann H., Landthaler M., Szeimies R.M. Photo-oxidative killing of human colonic cancer cells using indocyanine green and infrared light. Brit. J. Cancer. 1999, 80, 360-363.

137. Woodburn K.W., Fan Q., Kessel D., Luo Y., Young S.W. Photodynamic therapy of B16F10 murine melanoma with lutetium texaphyrin. J. Invest. Dermatol. 1998, 110, 746-751.

138. Mito K. Photodynamic efficiency of macrophage activity using a photosensitizer, lumin, with near-IR laser light for photoimmunotherapy of a cancer. Front. Med. Biol. 1996, 7, 81-92.

139. Soncin M., Busetti A., Biolo R., Jori G., Kwag G., Li Y.S., Kenney M.E., Rodgers M.A. Photoinactivation of amelanotic and melanotic melanoma cells sensitized by axially substituted Si-naphthalocyanines. J. Photochem. Photobiol. Biol. 1998,42,202-210.

140. Mironov A.F., Grin M.A., Tsiprovskiy A.G., Kachala V.V., Karmakova T.A., Plyutinskaya A.D., Yakubovskaya R.I. New bacteriochlorin derivatives with a fused N-aminoimide ring. J. Porphyr. Phthalocya. 2003, 7,725-730.

141. Nichols M. G., Foster Т. H. Oxygen diffusion and reaction-kinetics in the photodynamic therapy ofmulticell tumor spheroids. Phys. Med. Biol. 1994,39,2161-2181.

142. Pogue B.W., Ortel В., Chen N., Redmond R.W., Hasan T. A photobiological and photophysical-based study of phototoxicity of two chlorins. Cancer Res. 2001,61,717-724.

143. Georgakoudi I., Nichols M. G., Foster Т. H. The mechanism of Photofrin photobleaching and its consequences for photodynamic dosimetry. Photochem. Photobiol. 1997,65, 135-144.

144. Chen L.B. Fluorescent labeling of mitochondria. In: Wang Y.-L., Lansing TD, eds. Fluorescent microscopy of living cells in culture. Part A. San Diego: Academic Press, Inc. 1989, 103- 123.

145. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta. 1998, 1363, 100-124.