Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния нуклеиновых кислот и некоторые биомедицинские приложения метода

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния нуклеиновых кислот и некоторые биомедицинские приложения метода"

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНВГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ СССР

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.345

СОКОЛОВ Константин Викторович

СПЕКТРОСКОПИЯ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И НЕКОТОРЫЕ БИОМЕДИЦЙНСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ МЕТОДА.

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Маг.кпя - 1СИЭ

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени инженерно-физическом институте..

Научный руководитель доктор химических наук И.Р. НАБЙЕВ

Научный консультант кандидат технических наук, доцент И.М. ДМИТРИЕВСКИЙ

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук,

профессор В.З. ПАЩЕНКО

кандидат химических наук A.M. СУРИН

Ведущая организация

Государственный оптический иститут им. С.И. Вавилова.

Защита состоится <<*ЛР>>//j-l/^ql.¿Л 1992 г. в / '^ часо] на заседании специализированного совета К.053.05.68 по защите диссертаций на соискание ученой ' степени кандидата физико-математических наук при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119899. Москва, Ленинские горы, биологический факультет, ¿¿^f.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан <</^>> 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук, доцент . Б.А. ГУЛЯЕ1

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Для решения фундаментальных и прикладных задач современной биофизической химии, молекулярной биологии я генной инженерии необходимо иметь структурно-функциональную информацию об изучаемых биообъектах. Традиционные высокоинфорыативные методы инфракрасной спектроскопии (ИК), спектроскопии комбинационного рассеяния (ЮР) и кругового дихроизма (КД) далеко не всегда обладают необходимой для исследования сложных биологических систем чувствительностью и селективностью.

Появившаяся в начале 00-х годов новая разновидность метода КР - спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния света (ГКР) позволила существенно расширить возможности исследования биомолекул с помощью физических методов анализа. Метод ГКР позволяет резко снизить количество исследуемого вещества, а также в ряде случаев проводить селективный анализ отдельных компонентов в надмолекулярных комплексах. Однако, несмотря на значительные успехи в применении спектроскопии ГКР к исследованию структуры водорастворимых и мембранных белков, фермент-субстратнкх взаимодействий, физико-химических свойств молекул на заряженной границе раздела и т.д., потенциальные возможности метода остаются до конца не реализованными. В основном это связано с отсутсвием универсальных воспроизводимыми и стабильными во времени экспериментальных систем, позволяющих получать спектры ГКР от широкого класса биообъектов в нативном состоянии. Кроме того, для решения задач, связанных с исследованием единичных живых клеток, локальных изменений конформации ДНК, анализа сложных биомедицинских экстрактов и т.д., необходимо увеличение чувствительности и селективности существующих методак получения спектров ГКР.

Поэтому в настоящее время весьма актуальной становится разработка новых экспериментальных систем, позволяющих реализовать большие потенциальные возможности спектроскопии ГКР, что может значительно увеличить объем и качество информации о структурно-функциональных связях в изучаемых биологических системах In vitro и in vivo, а также позволит проводить анализ с использованием пикограммовых количеств вещества.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Основной целью настоящего исследования является разработка новых методических подходов, позволяющих увеличить селективность и чувствительность спектроскопии ГКР, и их

- г ~

применение к детектированию участков дестабилизации двойной спирали ДНК, идентификации входящих в их состав нуклеотидных оснований, анализу структуры комплексов противоопухолевых препаратов с ДНК In vitro и In vivo, изучению распределения противоопухолевых лекарств в единичной живой раковой клетке, а также анализу биомедицинских экстрактов из хрусталиков глаз человека и животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В настоящей работе впервые

1. Разработана новая экспериментальная система для получения спектров ГКР биомолекул - "активированный" гидрозоль металла -обеспечивающая селективность анализа сложных биомолекул и надмолекулярных комплексов.

2. По данным спектров ГКР предложены структурные модели комплексов противоопухолевых препаратов 4'0-тетрагидропиранил-доксорубицина и аклациномицина с их мишенью (ДНК).

3. Получены спектры ГКР от ядра и цитоплазмы единичной живой клетки. Обнаружено наличие промежуточной мишени для противораковых лекарств в цитоплазме клетки.

4. Изучены спектры ГКР микропроб взятых из хрусталиков здорового человеческого глаза и глаза человека больного катарактой. Установлено, что при развитии катаракты в хрусталике происходит накопление производных тирозина и триптофана при уменьшении относительной концентрации производной аденина.

5. Разработана новая экспериментальная система TKF-активные поверхности на основе ядерных фильтров. Продемонстрирована их "Заменимость в аналитических приложениях и фундаментальных структурно-функциональных исследованиях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Разработанная методика получения спектров ГКР на преагрегированных гидрозолях серебра и обнаруженный эффект "активации" гидрозоля анионами С1~ применимы для исследования вторичной структуры уникальных природных нуклеотидных последовательностей, а также изучения связи меаду первичной нуклеотидной последовательностью и вторичной структурой ДНК.

Полученные данные о структуре комплексов противоопухолевых препаратов с ДНК важны при сравнительном анализе биологической активности различных лекарств.

Метод получения спектров ГКР от ядра и цитоплазмы единичной живой клетки может быть успешно применен для исследования

клеточного метаболизма, структуры сложных биомолекул и надмолекулярных комплексов in vivo Перспективны приложения микроспектроскопия ГКР в медицине при определении резистентности раковых клеток из тканей индивидуальных пациентов к различным противоопухолевым лекарствам.

Обнаруженный эффект накопления производных тирозина и триптофана при развитии катаракты у человека может быть использован при разработке новых систем экспресс-диагностики заболевания, а также при изучении механизмов его возникновения.

Новая технология получения ГКР-активных поверхностей может найти широкое применение при изготовлении высокочувствительных детекторов в приборах новых поколений.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ,ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Автор защищает

1. Метод получения спектров ГКР от субпикограммовых количеств нуклеиновых кислот.

2. Эффект "активации" гидрозоля анионами 01 Возможность его применения для селективной регистрации веществ в сложных смесях или отдельных компонентов в надмолекулярных комплексах и сложных биомолекулах.

3. Структурные модели комплексов противоопухолевых препаратов 4'0-тетрагидропиранил-доксорубицина и аклациномицина с ДНК.

4. Метод получения спектров ГКР от ядра и цитоплазмы единичной живой раковой клетки. Возможность изучения этим методом распределения противоопухолевых лекарств в ее составе.

5. Технологию получения новых ГКР-активных поверхностей на основе ядерных фильтров и их применимость в аналитических приложениях и фундаментальных структурно-функциональных исследованиях.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ- РАБОТЫ. Основные результаты работы докладывались на II Всесоюзном семинаре "Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине" (Тарту, 1989), IV Всесоюзной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния света (Ужгород, 1989), III и IV Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Римини, 1989; Йорк, 1991), XII Международной конференции по Раман спектроскопии (Колумбия, 1990), III Международной конференции по спектроскопии лазерного рассеяния и диагностики биологических объектов (Москва, 1990), V Еврофизической летней школе по структуре и конформационной

динамике биомакромолекул (Высокие Татры, 1990), VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация содержит 143 стр. машинописного текста, включая список литературы (88 наименований) I таблицу и 41 рисунок. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Первая глава представляет собой литературный обзор теоретических моделей эффекта и экспериментальные методики получения спектров ГКР, ' а также аналитические и структурно-функциональные приложения метода в спектроскопии нуклеиновых кислот и медицине.

В настоящее время все теоретические модели, объясняющие эффект ГКР, можно разделить на две группы "электромагнитные" и "химические". "Электромагнитные" модели основаны на факте возрастания вблизи поверхности металла электромагнитных полей падающего и рассеянного на частоте KP излучения. "Электромагнитные" механизмы усиления являются относительно дальнодействующими и характеризуются расстояниями значительно превышающими атомные размеры.

"Химические" модели основаны на том факте, что для адсорбированной на металлической поверхности молекулы необходимо р~-"*матривать поляризуемость системы молекула-металл. При этом усиление KP может быть связано с появлением новых возбужденных состояний, обусловленных переносом заряда между адсорбированной молекулой и металлом. Существуют и другие механизмы "химического" усиления KP, которые основываются на возможности модуляции колебаниями адсорбированных молекул различных характеристик поверхностной электронной плотности, что приводит к появлению "неупругого" рассеяния света электронами металла. К таким моделям относятся эффект сил изображения (Eirima and Metiu, 1978), возбуждение электронно-дырочных пар (Otto, 1989) и неупругое рассеяние Ми (Moskovlts, 1985). Все "химические" механизмы являются короткодействующими и проявляются, когда расстояние между молекулой и металлом становится порядка атомных размеров.

Общепринято мнение, что и "химический" и "электромагнитный"

механизмы дают вклад в эффект ГКР. Однако вопрос об относительном вкладе каждого из них в общий коэффициент усиления сечения КР, наблюдаемый в различных экспериментальных системах, а также о природе реально существующих "химических" мехатшзмов остается до конца не выясненным.

Во второй главе рассмотрены методики приготовления ГКР-активных экспериментальных систем и получения спектров ГКР, а также экспериментальная установка для макро и микроспектроскопии КР.

В третьей и четвертой главах изложены основные результаты

настоящей работы.

I. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ.

В работе использованы и усовершенствованы два типа ГКР-активных экспериментальных систем:

1. системы малых по сравнению с длиной волны падающего света изолированных металлических частиц в коллоидах и

2. ГКР-активные металлические поверхности с однородными и регулярными по размеру "шероховатостями".

Спектры ГКР получали на КР-спектрометре с тройным монохроматором и с фотоэлектронной регистрацией сигнала. Для возбуждения использовали ионные лазеры на аргоне и смеси аргона и криптона. Для получения спектров ГКР с пространственным разрешением КР-спектрометр был состыкован с микроскопом. Использование конфокального микроскопа позволило достигать пространственного разрешения порядка одного кубического микрона <Рирре1з ег а1., 1990),

Гидрозоли серебра готовили восстановлением нитрата серебра цитратом натрия. Для получения высокоинтенси'вных спектров ГКР гидрозоль преагрегировали растворами солей

перхлората или сульфата натрия, после чего добавляли исследуемое вещество. Именно такая методика приготовления гидрозоля обеспечивает рекордные чувствительности метода спектроскопии ГКР - позволяет детектировать спектры от пикограммовых количеств биомолекул. "Активация" гидрозоля серебра хлоридом натрия приводит к резкому возрастанию специфичности проявления эффекта ГКР по отношению к химической природе изучаемого соединения.

Другая экспериментальная система, использованная в настоящей работе для получения спектров ГКР биомолекул, представляет собой твердые ГКР-активные поверхности. Поверхность серебра, на которой сформированы регулярные по форме, а в идеальном случае и по расположению неоднородности микронного и субмикронного размеров должны быть ГКР-активны при преимущественной реализации электромагнитного механизма усиления. В работе была разработана технология приготовления нескольких типов таких структур и оптимизированы параметры неоднородностей для получения максимальных (до ~ 1С)5) коэффициентов усиления.

Поверхности с регулярными по форме и размерам неоднородностями готовили путем снятия реплик с ядерных фильтров. В качестве матрицы использовали полиэтилентерефталастовые пленки (ПЭТФ) толщиной 10 мкм. Пленки облучали ионами Аг, Со или Хе с энергией ~ I МэВ/нуклон до получения поверхностной плотности

О ТП О

треков 10 - 10 см и проводили химическое травление в водном растворе щелочи. На поверхности пленок в местах образованных ионами треков возникали поры конической формы. В зависимости от времени проведения химического травления высота пор варьировала в пределах от 0,1 до 3 мкм и отношение высоты к диаметру основания от I до 10. Затем методом термического напыления в вакууме пленки покрывали слоем серебра толщиной ™ 1000 8. На серебро олсктролитически наносили слой меди для получения механически прочной структуры, после чего исходную полимерную пленку удаляли.

Получаемые ГКР-активные структуры представляют собой ^"^»¡оложенные на поверхности серебра регулярные по форме и размерам остроконечные выступы конической формы, которые полностью воспроизводят структуру пор в ядерном фильтре (рис.1 ). Эти структуры обеспечивают увеличение сечения КР на 4-5 порядков, являются воспроизводимыми и стабильными во времени.

В работе оптимизированы условия получения спектров ГКР различных типов биомолекул на островковых пленках серебра, полученных методом термического напыления в вакууме. Толщину слоя напыленного на стеклянные пластинки варьировали от 30 до 200 8. Получаемые ГКР-активные поверхности обладают поглощением в видимой и близкой инфракрасной областях, соответствующим возбуждению продольных коллективных электронных резонансов в островках металла (Ritchie and Chen, 1982). Спектральное положение, ширина и интенсивность разонанса зависят от массовой

' Рис.I Один из типов 1'КР-активных поверх ностей на основе ядерных фильтров.

толщины пленки, скорости напыления металла и т.д.

Для получения спектров на ГКР-активных поверхностях использовали две методики. В случае молекул с низким квантовым выходом флуоресценции ГКР-активную пленку помещали в кювету с раствором исследуемого образца и спектры ГКР регистрировали при фокусировке лазерного луча на поверхности пленки, находящейся в контакте с раствором. Для молекул с высоким квантовым выходом флуоресценции такая методика неприемлема из-за сильного экранирования сигнала ГКР флуоресценцией молекул, не адсорбированых на металлической поверхности. В этом случае каплю раствора исследуемого образца наносили на ГКР-активную поверхность и через 1-2 минуты удаляли фильтровальной бумагой.

II. СПЕКТРЫ ГКР НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ КОМПОНЕНТОВ.

Изучение нуклеиновых кислот является весьма перспективным приложением спектроскопии ГКР при исследовании биомолекул. Большие потенциальные возможности, заложенные в методе, могут позволить регистрировать спектры ГКР от пикограммовых и субпикограммовых количеств нуклеиновых кислот для обеспечения конкурентноспособности метода с традиционными аналитическими методиками биотехнологии и генной инженерии; детектировать локальные изменения структуры нуклеиновых кислот; изучать структурные особенности комплексов нуклеиновых кислот с другими

биомолекулаии.

Экспериментальная система для получения спектров ГКР, основанная на использовании "активированного" или "неактивярованного" нитратного золя, по-видимому, является оптимальной для изучения конформации нуклеиновых кислот. В этой системе были получены спектры ГКР нуклеотидов и ДНК из тимуса теленка при использовании I мкл адсорбата в концентрации до Ю-7 мг/мл, что соответствует Ю-13 г. исследуемого вещества. "Неактивированные" гидрозоли позволяет регистрировать спектры от всех нуклеотидных оснований. "Активирование" нитратного гидрозоля приводит к возникновению на мицеллах серебра высокоспецифичных сайтов хемосорбшш, обладающих повышенным сродством к аденину (рис.2).

- В спектрах ГКР нативной ДНК из тимуса теленка, адсорбированной на "неактивированном" и "активированном" гидрозолях, кольцевые дыхательные колебания нуклеотидных оснований в области 600-800 см-1 практически не проявляются, тогда как тепловая денатурация двойной спирали приводит к резкому увеличению интенсивности этих колебаний (рис.3). Интересно отметить, что в спектре ГКР денатурированной ДНК, адсорбированной на "неактивированном" гидрозоле, присутствуют только колебания пуриновых оснований аденина и гуанина и не проявляются колебания меньших по размеру пиримидиновых оснований цитозина и тимина. Специфичность "активированного" золя проявляется в процессе денатурации ДНК в виде увеличения сигнала аденина при полном сггутствии симметричных колебаний колец других нуклеотидов. На основании полученных результатов сделан вывод о ярко выраженном короткодействующем механизме усиления сечения КР в используемых систзмах.

Для исследования применимости разработанных методик получения спектров ГКР к регистрации локальных изменений структуры двойной спирали была использована плазмида рАО 3, образующая в сверхспирализованной форме крестообразную структуру в участке нуклеотидной последовательности, богатом АТ-парами. Для идентификации этого участка дестабилизации двойной спирали, образованного пятью парами нуклеотидных оснований, на фоне около 2000 пар нуклеотидов в форме стабилизированной двойной спирали мы использовали "активированный" гидрозоль. Резкое увеличение сигналов аденина для сверхспирализованной плазмиды, по сравнению

1500

1ооо

500 ДV, СМ_^

Рис.2 Спектры ГКР эквимолярной смеси дезоксирибонуклеотидов аденина, тимина, гуанина и цитозина, адсорбированных на "неактивированном" (I) и "активированном" (2) гидрозолях серебра. Концентрация каждого компонента смеси - 5хЮ_6 М.

Рис.3 Спектры ГКР денатурированной (1,3) и нативной (2,4) ДНК из тимуса теленка, адсорбированной на "активированном" (1,2) и "неактивированном" (3,4) гидрозолях серебра. Концентрация денатурированной ДНК - Ю-4 мг/мл, нативной ДНК - Ю-3 мг/мл. На вставке показана электронная микрофотография комплекса гидрозоля с ДНК. Масштаб 1000 8.

Ыхх*эоО

Jfffic-O

£ "

itöö ifeö 500 AVfCM-I

Рис.4 Спектры ГКР сверхспиралиэованной (I) и релаксированной (2) форм плазмидн рАО 3, адсорбированной на "активированном" гидрозоле серебра при концентрации

10 3 мг/мл.

с ее линейной формой, однозначно свидетельствует в пользу появления при сверхспирализации участка дестабилизации двойной спирали (рис.4).

III. ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРУ КОМПЛЕКСОВ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ С ДНК in vitro МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ГКР.

Рассмотренные выше методы получения спектров ГКР на основе "активированного" и "неактивированного" гидрозолей серебра были применены к изучению структуры комплексов новых противоопухолевых препаратов с ДНК. Использовали серию лекарств - производных антрапиклинов - доксорубицина (D0X), аклациномицина (АСМ) и 4'0-те трагидропиранил-доксорубицина (IHP-D0X) (рис.5).

Спектры ГКР противоопухолевых лекарств с оптимальным отношением сигнала к шуму получены при концентрации 1(Г8 М. Нормальные резонансные спектры этих соединений могут быть получены при концентрации не меньшей Ю-4 М при очень высоком вкладе фоновой флуоресценции. Эффект ГКР сопровождается мощным тушением флуоресценции, позволяя расширить круг молекул, которые могут быть изучены с помощью этого метода. Кроме того,

Ой 111 10

»1 5П 61 т!

,0 О 08 О саз

о ,вг 8

вох -II: -а ТНР-БОХ

-■'-О

»3- й

АСН -I, -шся3 -»г: свгсз}

: -СН3

V свз;

Рис.5 Структурные формулы противоопухолевых препаратов.

Рис.6 Спектры ГКР ЬОХ (I) и комплекса БОХ/ДНК (2). адсорбированных на гидрозоле серебра. Концентрация свободного СОХ - 4x10 М, концентрация БОХ в комплексе с ДНК -8x10 ® М. Молярное отношение (пары нуклеотидных оснований) /лекарство - 750/1. Мощность лазера (514,5 ни) -5 мВт.

-1-1-1- т

1500 1000 МО А\1, см

сверхвысокая чувствительность. ГКР для этого класса молекул позволяет получать спектры вплоть до концентраций на уровне Ю-10 М п разработать экспресс-метод детектирования микроколичеств противоопухолевых лекарств.

|!,| рис.6 приведены спектры ГКР молекулы ПОК и ее комплекса с

ДНК из тимуса теленка. Основные отличия, связанные с образованием комплекса, проявляются в уменьшении относительных интенсивностей линий 1217 см-1 - синфазного деформационного колебания ОН- групп, 1312 см-1 - деформационного колебания (С-0)- груш и 1445 см-1 -скелетного колебания кольца сильно связанного с деформационными колебаниями (С-ОН)- групп.

В экспериментах с нативной и денатурированной ДНК показано, что в используемой для получения спектров ГКР системе реализуется короткодействующий механизм усиления. Это означает, что колебания атомных группировок, удаленных от поверхности серебра на растояние свыше 5 8, не усиливаются. Образование комплекса противоопухолевого препарата с ДНК заключается в интеркаляции хромофорной части лекарства внутрь двойной спирали (Wang et al., 1987). Интеркалированные хромофорные группировки удалены от поверхности двойной спирали и, следовательно, металлической поверхности на расстояние свыше 5 8, что должно приводить к уменьшению относительной интенсивности соответствующих линий в спектре ГКР комплекса. Наблюдаемое в спектре ГКР комплекса D0X с ДНК уменьшение относительных интенсивностей линий, связанных с колебаниями (С-ОН)- групп однозначно свидетельствует об их интеркаляции внутрь двойной спирали ДНК. Вывод полностью согласуется с полученными ранее данными рентгеноструктурного анализа (Wang et al., 1987).

На основе сравнения спектров свободных и интеркалированных лекарств, t так же предложенных ранее моделей интеркаляции Н-деоксикарминомицина (DCM) (Smulevich and Pels, 1986) и DOX (Wang et al.,1987) были построены модели комплексов АСМ и THP-DOX с ДНК (рис.7).

Рис.7 Структурные модели интеркаляции АСМ и THP-D0X внутрь двойной спирали ДНК в сравнении с предложенными ранее моделями интеркаляции DOX (Wang et al., 1987) и DCM (Smulevich and Fels, 1986).

DOX/ДНК

DCM/ДНК

ТНР-ЮХ/ДНК

Анализ структуры комплексов противоопухолевых препаратов с ДНК In vitro является первым шагом в изучении механизмов воздействия лекарств на раковые клетки. Исследование распределения и специфических взаимодействий противоопухолевых лекарств в живой раковой клетке может стать одним из наиболее перспективных приложений спектроскопии ИФ в медицине.

IV. СПЕКТРОСКОПИЯ ГКР ЖИВЫХ РАКОВЫХ КЛЕТОК С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ ПРЕПАРАТАМИ В ЯДРЕ ИЛИ ЦИТОПЛАЗМЕ.

В работе впервые были получены спектры ГКР от живых клеток, а также от клеток, содержащих противоопухолевые препараты в ядре либо в цитоплазме. Эксперименты проводили на линии эритробластов человека К562 с использованием противоопухолевого лекарства доксорубицина (D0X).

Были получены спектры ГКР от популяции живых раковых клеток, инкубированных с гидрозолем серебра в течении 30 мин при комнатной температуре (рис.8, спектр 3). Наиболее характерной чертой наблюдаемого спектра является проявление полосы 743 см-1 дыхательного колебания аденинового кольца. Эта полоса не проявляется в спектрах ГКР клеток не инкубированных с гидрозолем. Полученный результат свидетельствует о том, что гидрозоль проникает внутрь клетки (по-видимому, за счет эндоцитоза, поскольку тесты с использованием витальных красителей показали сохранение целостности клеточной мембраны после инкубации клеток с гидрозолем).

Спектр ГКР живых раковых клеток, обработанных D0X в течение I часа при 37° С, отмытых от лекарства вне клетки, и инкубированных с гидрозолем в течении 30 мин. при комнатной температуре (рис.8, спектр I), очень сильно отличается от спектра предварительно необработанных лекарством клеток, инкубированных 30 мин при комнатной температуре с комплексом гидрозоля серебра и D0X (рис.8, спектр 2).

Спектр ГКР клеток, обработанных D0X, практически не отличается от спектра комплекса ДНК и DOX in vitro (рис.Б, спектр 2). Это свидетельствует о том, что структуры комплексов DOX/ДНК in vitro и in vivo совпадают. В то же время спектр клеток не обработанных лекарством, но инкубированных с комплексом гидрозоля с D0X сильно отличается как от этих спектров, так и от спектра

Рис.8 Спектры ГКР популяции живых клеток, обработанных DOX и инкубированных с гидрозолем (I); необработанных лекарством клеток, инкубированных с гидрозолем, содержащим D0X, (2) и необработанных клеток, инкубированных с чистым гидрозолем (3).

Явозб.= 514'5 т-

ГКР свободного D0X, адсорбированного на гидрозоле серебра (сравн. рис.6, спектр I и рис.8, спектр 2). Это означает, что в цитоплазме клеток существует промежуточная мишень для D0X, отличная от мишени в клеточном ядре (ДНК).

Для выяснения возможности получения спектров ГКР от индивидуальных клеточных компонент, либо взаимодействующих с ними лекарств, были проведены измерения на отдельной клетке с использованием микроспектроскопии ГКР.

Спектры . ГКР отдельных живущих клеток получали на KP-спектрометре, совмещенном с микроскопом Olympus ВН-2 (Япония). Полученная установка позволяет достигать пространственного

о

разрешения Л мкм .

Основной проблемой при применении микроспектроскопки KP к изучению биомолекул является высокая плотность энергии при фокусировании лазерного луча до микронных размеров, что может

вызывать фоторазрушение образца. В наших экспериментах увеличение сечения КР за счет адсорбции на гидрозоле серебра позволило понизить мощность возбуждающего излучения до ~10 мкВт и сократить время регистрации сигнала до ~2-3 мин. Тестирование клеток после эксперимента с помощью витальных красителей показало, что в этих условиях не происходиг разрушения образца. Увеличение времени эксперимента до 10-20 мин либо мощности до ~10 мВт приводило к нарушению целостности клеточной мембраны.

Были получены спектры ГКР от единичной клетки, обработанной доксорубицином, при фокусировании лазерного луча на ядро или на цитоплазму одной и той же клетки. Оказалось, что эти спектры полностью соответствуют спектрам ГКР популяций клеток с D0X в ядре (см. рис.8, спектр I) или в цитоплазме (см. рис.8, спектр 2), соответственно. Полученные результаты подтверждают наше предположении о наличии в цитоплазме промежуточного переносчика, осуществляющего транспорт лекарства в клеточное ядро.

VI. АНАЛИЗ СПЕКТРОВ ГКР БИОМЕДЖЩНСКИХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ХРУСТАЛИКОВ ГЛАЗ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ.

Высокая чувствительность спектроскопии ГКР в сочетании с молекулярной селективностью, обусловленной адсорбционными свойствами ГКР-активной поверхности, может найти широкое применение в анализе сложных многокомпонентных смесей. В настоящей работе метод спектроскопии ГКР впервые эффективно использован для анализа биомедицинских экстрактов. Были проанализированы спектры ГКР адсорбированных на гидрозолях серебра микропроб из хрусталиков здорового человеческого глаза (рис.9, спектр 2) и хрусталиков глаз людей больных катарактой (рис,9, спектр 1). Для получения спектра ГКР достаточно иметь ~

о

10 мкл экстракта из хрусталика.

Для идентификации наблюдаемых в спектрах ГКР отличий проведено хроматографическое разделение экстрактов и получены спектры ГКР и масс-спектры отдельных хроматографических фракций.

В спектрах ГКР экстракта из хрусталика здорового человеческого глаза и его хроматографических фракций проявляются линии 725, 1338 и 1456 см-1, соответствующие дыхательному и скелетным колебаниям аденинового кольца. Спектры ГКР дают только две соседние фракции из хроматограммы экстракта, что

1

Рис.9 Спектры ГКР экстрактов из хрусталиков глаза человека больного катарактой (1) и

здорового человеческого глаза (2). = 514,5 нм.

'возб.

2

üV,cM-1

свидетельствует о наличии не более двух производных аденина, дающих вклад в спектр ГКР.

В случае экстракта из хрусталика больного человеческого глаза в спектрах ГКР большинства фракций проявляются полосы 1165 и 1585 см-1, а также 762 и 1013 см-1, характерные для колебаний фенольного кольца тирозина и индольного кольца триптофана, соответственно, и отсутствуют полосы, характерные для аденина. В масс-спектрах этих фракций наблюдаются интенсивные пики фенола (91 и 107 дальтон) и индола (130 дальтон).

Полученные данные свидетельствуют о том, что при развитии катаракты в хрусталике происходит накопление производных ароматических аминокислот тирозина и триптофана, сопровождаемое уменьшением относительной концентрации производных аденина.

VII. ГКР-АКТИВНЫЕ ПОВЕРХНОСТИ НА ОСНОВЕ ЯДЕРНЫХ ФИЛЬТРОВ И ОСТРОВКОВЫХ ПЛЕНОК СЕРЕБРА. ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМОЛЕКУЛ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ.

С целью расширения возможностей применения спектроскопии ГКР в биологии была разработана новая экспериментальная система -ГКР-активная поверхность с регулярными неоднородностями на основе ядерных фильтров, обладающая высокой стабильностью и высокими

коэффициентами усиления КР (рисЛ). Такие поверхности оказались исключительно перспективными для аналитических приложений. Были получены спектры от нескольких пикограмм в пробе лизоцима, некоторых аминокислот и нуклеотидов, причем вид спектров ГКР практически не отличается от спектров водных растворов соответствующих соединений. Это означает, что в данной экспериментальной системе реализуется преимущественно электромагнитная, дальнодействутмцая компонента механизма усиления КР. Очевидно, что в этом случае теряет актуальность вопрос о нарушении конформации молекул при адсорбции, поскольку вклад в сигнал ГКР молекул непосредственно адсорбированных на поверхности металла оказывается весьма небольшим. Таким образом, разработанная система может быть эффективно использована как для аналитических приложений, так и - для фундаментальных структурно-функциональных исследований макромолекул.

В настоящей работе были оптимизированы условия получения спектров ГКР, а также исследованы механизмы усиления КР на островковых пленках серебра. С этой целью были получены спектры возбуждения ГКР для молекул трех различных классов I) аденина, нативной и денатурированной ДНК - молекул с молекулярной полосой поглощения только в ультрафиолетовой области спектра; 2) ШХ и флавинадениндинуклеотида (РАБ) - молекул, имеющих электронный переход с малым сечением поглощения в видимой области спектра и 3) р-каротина - молекулы, имеющей электронный переход с большим сечением поглощения в видимой области спектра, адсорбированных на островковых пленках серебра с максимумами поглощения в диапозоне от 450 до 660 нм.

Рис.10 Спектры возбуждения ГКР аденина, адсорбированного на островковых пленках серебра с максимумами поглощения 520 нм (щтрих-пунктир-ная линия) и 660 нм (пунктирная линия). Спектры поглощения островковых пленок изображены непрерывными линиями.

чоо

5оо еоо 700

длина волны (ни) Спектры возбуждения ГКР,

полученные для аденина (рис.10),

хорошо согласуются с электромагнитной теорией усиления KP, однако отсутствие сигналов нуклеотидов в спектре ГКР нативной ДНК, а также усиление только колебаний аденинового кольца в спектре денатурированной ДНК не может быть объяснено в рамках только электромагнитной теории. Противоречат ее предсказаниям и результаты, полученные для молекул FAD и DOX. Спектры возбуждения ГКР этих соединений оказались связанными с профилем поглощения островковых пленок при полном отсутствии резонансных свойств в области молекулярных полос поглощения FAD и D0X.

Полученные результаты свидетельствуют о реализации в случае неокрашенных молекул (аденина и ДНК), а также молекул FAD и D0X, имеющих электронный переход с малым сечением поглощения в видимой области спектра, "химического" механизма усиления KP. Причем для этого механизма характерны соответствие профиля возбуждения ГКР профилю поглощения островковой пленки и "нечувствительность" к молекулярным электронным переходам. Такими свойствами обладают механизмы усиления KP, которые основываются на возможности модуляции колебаниями адсорбированных молекул различных характеристик поверхностной электронной плотности металла.

В случае ß-каротина максимум в спектре возбуждения ГКР находится в области максимального перекрытия профилей поглощения молекулы и островковой пленки. Проявление в спектре возбуждения ГКР электронных переходов ß-каротина и плазменных резонансов островковой пленки указывает на реализацию классического электромагнитного усиления.

Таким образом для молекул, принадлежащих к первым двум из рассмотренных классов, проявляется "химический" механизм усиления KP. В этом случае максимальные коэффициенты усиления получены на островковых пленках с максимумом поглощения ~ 520 нм. Для таких пленок расстояние между отдельными островками не превышает их размеров (Sennet and Scott, 1950), а взаимодействие отдельных островков между собой дает дополнительный вклад в усиление локального электромагнитного поля (Yoshlda et al., 1971).

Для молекул, принадлежащих к третьему классу, основной вклад в усиление KP может давать электромагнитный механизм. В этом случае максимальные коэффициенты усиления достигаются в области перекрывания профилей поглощения молекулы и островковой пленки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ диссертации заключаются в следующем

1. Разработана новая методика получения спектров ГКР на преагрегированных гидрозолях серебра, позволяющая получать спектры ГКР от долей пикограмм нуклеиновых кислот и их компонентов.

2. Обнаружен эффект "активации" гидрозоля анионами С1~, позволяющий селективно регистрировать вещества в сложных смесях или отдельные компоненты в надмолекулярных комплексах и макромолекулах.

3. Проанализированы спектры ГКР комплексов противоопухолевых препаратов доксорубицина (DOX), 4'0-тетрагидропиранил-доксорубицина (THP-D0X) и аклациномицина (АСМ) с ДНК in vitro. На основании спектральных данных впервые предложены структурные модели комплексов THP-DOX/ДИК и АСМ/ДНК.

4. Впервые получены спектры ГКР от ядра и цитоплазмы единичной живой клетки, изучено распределение и специфические взаимодействия противоопухолевого препарата доксорубицина в ее составе.

5. Изучены спектры ГКР биомедицинских экстрактов из хрусталиков здорового человеческого глаза и глаз людей больных катарактой. Установлено, что при развитии катаракты происходит накопление в хрусталике производных тирозина и триптофана при уменьшении относительной концентрации производной аденина.

6. Разработан новый тип ГКР-активных поверхностей на основе ядерных фильтров, а также оптимизированы условия получения спектров ГКР на островковых пленках серебра. Продемонстрирована применимость новых ГКР-активных поверхностей в аналитических приложениях и фундаментальных структурно-функциональных исследованиях.

Основные результаты изложены в четырнадцати работах

1. Nabiev I.R., Eiremov R.G., Sokolov K.V. Surface-enhanced Raman studies oi membrane proteins and nucleic acids: topography and secondary structure of blomolecules. - In: Spectroscopy of Biological Molecules. State of the Art. / Eds. A.Bertoluzza, C.Fagnano, P.Monti. Bologna: SEE, 1989, p. 1T-20.

2. Воронич В.E., Гачко Л.Н., Маскевич С.А., Набиев И.Р., Подтынченко С.Г., Соколов К.В. Исследование спектров гигантского

КР пирувата и производных тиамина. IV Всесоюзная конференция по спектроскопии комбинационного рассеяния света. Тезисы докладов, Ужгород, 1989, с.138-139.

3. Nablev I.R., Sokolov K.V., Voloshin O.N. Surface-enhanced Raman spectroscopy of biomolecules. III. Determination of the local destablllzation regions In the double helix. - J.Raman Spectrosc., 1990, v.21, N 6, p.333-336.

4. Гачко Г.А., Кивач Л.Н., Маскевич С.А., Соколов К.В., Подтынченко С.Г. Спектроскопические исследования специфических взаимодействий пировиноградной кислоты в модельных системах. -Журн. приклада, спектроскопии, 1990, т.52, N 5, с. 818-824.

5. Maskevlch S.A., Sokolov K.V., Kivach L.N., Chumanov G.D., Streckal N.L., Nablev I.R. Surface-enhanced Raman spectroscopy of cocarboxylase and pyruvate complexes. - In: Proc. of the XII International Conference on Raman spectroscopy. Columbia. / Eds. J.R. Durlg and J.P. Sullivan. Chichester, Hew York, Brisbane, Toronto, Singapore: John Wiley & Sons, 1990, p. 300-301.

6. Nablev I.R., Sokolov K.V., Hodorchenko P.V. Determination of the local destablllzation regions in the DNA double helix as probed by surface-enhanced Raman spectroscopy. - Ibidem, 1990, p. 318-319.

7. Sokolov K.V., Manfalt M., Nablev I.R. Surface-enhanced Raman studies of nucleic acids and their complexes with anti-tumour drugs. - In: Structure and conformational dynamics of biomacromoljcules. Europhysics Conference abstracts. / Eds. K. Bethge and G. ТЬотаз. EPS, 1990, v. 14H, p. 98-99.

8. Маскевич С.А., Соколов К.В., Кивач Л.Н., Подтынченко С.Г., Стрекаль Н.Д., Ходорченко П.В. Спектры гигантского комбинационного рассеяния и структура адсорбированных на поверхности серебра тиамина, тиаыиндифосфата и пирувата. -Биоорган, химия, 1990, т. 16, N 11, с. 1552-1562.

9. Заявка на А.с. СССР N 4683200/31-25, положит, решение от 26.02.90. Способ распознавания структуры и ингредиентов вещества./ Куделина И.А., Кузнецов В.И., Нчедлишвили Б.В., Набиев И.Р., Олейников В.А., Соколов К.В., Иестаков В.Д. /

10. Nablev I.R., Sokolov K.V.. Efremov R.G., Chumanov G.D. Surface-enhanced Raman spectroscopy In the structural studies of biomolecules. State of the art. - In: laser Applications in Life Sciences. / Eds. S.A. Akhmanov, M.Yu. Poroshina, N.I. Koroteev,

B.N. Toleutaev. Proc. SPIE. 1991, v. 1403, p. 85-92.

11. 0leynlkov 7.A., Nabiev I.R., Sokolov K.V., Hodorchenko P.V., Mchedlishvily B.V. Polynuclear тетЬгапез аз a substrate for obtaining surface-enhanced Raman scattering lilms. - Ibidem, 1991, v. 1403, p. 164-166.

12. Sokolov K.V., Lutsenko S.V., Nabiev I.R., Hie S., Yu N.-T. Surface-Enhanced Raman Analysis of Biomedical Eye Ьепз Extracts. - Appl. Spectrosc., 1991, V.45. H 7, p.1143-1148.

13. Nabiev I., Sokolov K., Morjanl H., Manfalt M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy of Nucleic Acids and Antltumour Drugs/Nucleic Acids Complexes in vitro and in living Cells. - In: Spectroscopy of Biological Molecules. / Ed3. R.A. Hester and R.B. Girling. York: Bookcraft Ltd.. 1991, p.345-348.

14. Ходорченко П.В., Соколов К.В., Набиев И.Р. Исследование структуры нуклеиновых кислот методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния света. VII Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. Тезисы докладов, Харьков. 1991, с.249-250.

Подписано к печати

Формат 60x90/16. Усл. печ. л. "// 6'' Уч.-нзд.л. Тираж

100 экз. Заказ № J6QÜ

Ордена 'Знак Почета* издательство Московского университета. 103009, Москва, ул. Герцена, 5/7. Типография ордена 'Знак Почета* издательства МГУ. 119899, Москва, Ленинские горы.