Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репликация ДНК в клетках человека при наследственных заболеваниях с повышенной чувствительности к ионизирующей радиации

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Репликация ДНК в клетках человека при наследственных заболеваниях с повышенной чувствительности к ионизирующей радиации"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

Из права* рукописи

НЕРГАДЗЕ Соломон Георгиевич

УДК 577. 213. 2 :616-0. 53.1 ¡577. 346

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ С ПОВЫШЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ИОН ИЗ ИР У »fflF.fi РАДИАЦИИ 03.00.25 - КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

Санкт-Петербург 19Э1

Работ? выполнена в Институте цитологии АН СССР

Научный руководитель -Кандидат биологически» наух, научный сотрудник Л.С.БАРЕНФЕЛЬЛ

Официальные оппоненты: иоктор биологически* наук, профессор В, Е. КОМАР Кандидат биологически* наук 8. М. БОЖКОВ

Ведущее учреждение - С.-Петербург ския государственный университет, биолого-почвенный факультет.

ЛО . §£tifi$>J „ 1991 г, ф Нт

Защита состоится n<v " ^■«""»у'-' « 1991 г. ч. на засе-

дапи специализированного совета Д. 002. 73.01. при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь сп 1иапизированного совета

«S» « 1991 г.

кандидат биологических наух- П.Н.ПИСАРЕВА

^^— Институт цитологии АН СССР

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ«

Актуальность проблемы. Человечество постоянно подвергается воздействию низких доз ионизирующей радиации и радиоми::лтиков из внешней среды в результате все возрастающего применения радиотерапии, ис ользова-ния ядерной энергии, приводящей к загрязнение окружающей среди. 8 настоящее время доказано, что критическоп мишень» действия иснизирурцеп радиации на клетку является ДНК при сохранении важности роли повреждений других клеточных структур лл;: судьбы облученной клетки (Пелевин« и др., 1085). Важнейшим доказательством этого являются данные по облучению ядра и цитоплазма кпеток микропучками частиц (okada, 1970; Окала, 1Э74-), а такие наличие повышенной чувствительности к облучению у мутантов прокариот и эукариот с дефектами репарации радиационных повреждении ЛНК (Жестяников, 1979, 1985). Первичные повреждения ЛИК, индуш жеванные ионизирующей радиацией, рчпарируются с помощью целой системы механизмов репарации, обеспечивающих стабильность генетического материала клетки (Жестяников, 1979, 1985; Тоиилин, 1933). Нереггрированние или неправильно репарированние повреждения ДНК могут привести к таким биологическим последствиям, как мутагенез, канцерогенез и летальные события (Хгнсон, Комар, 1935). Реализация же повреждений в значительной мере связана с процессом репликации ДНК.

Изучение механизма подавления репдихативного синтеза ЛНК в облученных клетках человека остается одной из актуальных проблем радиобиологии на протяжении последних нескольких десятилетий. Ло середины 70-х годов основные исследования в этой области были направлена на изучение влияния облучения ив пул экзогенных предшественников и на активность (ерментов, участвующих в репликации ЛНК. Результатом многолетних нсс-педования явился вывод о том, что повреждением «ферментов репликации щи ферментов биосинтеза предшественников ЛНК нельзя объяснить подав-тение репликации в облученных клетках (Комар, Хансон, 1980). Исследов-1ния ватанабе Iwatanabe, 1974) опровергли имеющееся ранее утверждение, ITO уменьшение включения в ЛНК радиоактивного тимидина может быть выз-(ано изменением размзра пула предоественников. В последние годы интен-:ивио развивается идея о том. что подавление синтеза ДНК ионизирующей •адиациея может быть связано с нарушением регуляции репликации и нару-шниями структурной организации репликации ДНК в клетке (Painter, 986; Сынзыныс и др. 1990).

Цель исследования состояла в развитии и углубления представлений о елликации ЛНК как в норме, так и после облучения ионизирующей рэдиа-ией клеток человека при наследственных заболеваниях с клиническими имлтомами принадлежности к группа п зышеиного риска г.о признакам ге-етичесхой нестабильности. Зто представлялось неооходимим, ncci.ольку о кастояаего времени а ргтп попагвпи, что а интактних клетках

больных с повышенной Чувствительность» к ДНК-тропным агентам механизм репликации ДНХ не отличается от такового в интвктных клетка» здорового человека. Конкретными задачами работы было: 1. Получить ха рактеристики репликации на уровнях контроля инициации и элонгации син теза ДНК в кластерах репликонов и регуляции 'включения" расположении рядом друг с другом кластеров как в нор» , так и после облучения иони зируюмей радиацией. 2. Сопоставить характер репликативньп проиессо ЛИК в норме и после облучения в клетка* людей при наследственных забо леваниях с разной чувствительностью хромосом к ионизируюашп радиации независимо от чувствительности по критерию выживаемости. 3. Изучит репликатиание прцессы в разных типах клеток - Фибробласгах и лнмяоци тах, поскольку именно последние обычно используют в цитогенетически исследования*, а это важно для проводимых в работе сопоставлений.

Научная новизна. 1) В настоящей работе впервые прямым методом («иб роавторадиогра$гия) проведено широкое исследование репликации ДНК поел облучения ионизирующей радиацией клеток при большом спектре наследст венных заболеваний с нарушениями нормальной работы тех или иных меха низмоз жизнедеятельности клетки. 21 Впервые в клетках больных с повы шенной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации - атакси телеангиектазиг, синдром Дауна, синдром базальноклеточного невуса пигментная ксеродера в йорме, чувствительной к ионизирующей радиаци (ПК II), - обнаружено изменение структурной организации репликаци ДНК, заключающееся в уменьшении частоты активации кластеров репликоно в ходе репликации ДНК. Обнаружена корреляция этого дефекта с хромосом ной нестабильностью, индуцируемой ионизирующей радиацией. 3) Впервь прямым методом показано, что в клетках здорового человека и больных нормальной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации (класси ческая пигмг чная ксеродерма и синдром Кокейна) облучение подавляв инициацию репликации на уровне целого кластера при наличии радиацисн ного повреждения лишь в одном из репликонов, что приводит к ре^коч замедлению скорости роста цепей ДНК. Т.е., иони.ируюшая радиация клетках здоровых людей, при классической ПК и СК вызывает дефект реп ликации ДНК, аналогичный исходно существующему в интактных клетках щ синдромах хромосомной нестабильности. 40 Показано, что замедленна скорость продвижения вилки репликации в интактных клетках при ПК II сочетании с уменьшением частоты одновременно реплицирующихся кластере репликонов, способствует возникновению находящихся рядом полностью частично реплицированньк кластеров, что подтверждает репликативн! модель CXQ (Painter, 1980).

Практическая значимость. Гслученные результаты позволяют выдели! ряд наследственных болезней человека - СД, AT, СБКН, ПК II и, возмои но, синдром Блума - в отдельный новый класс со следующими общими свс

яствами: хромосомная нестабильность, индуцируемая ионизирующей радиацией, преждевременное старение, иммунная недостаточность, повышенный уровень канцерогенеза, замедленные рост нитей ДНь вследствие уменыген-ного числа одновременно функционирующих кнастеров, сочеташипсн с удлинением S-вазы, отсутствие подавлен* ионизи; уьмей радиацией синтеза ДНК на уровне целых кластеров.

Полученные результаты могут быть полезны при разработке критериев для выявления групп людей повышенного канцерогенного риска и при нормировании радиационной опасности, а также для корректировки методов радиационной терапии. Поскольку гетерозигогы по генам, определявшим синдромы хромосомной нестабильности, встречается в популяции с частотой около 3%, выявление принадлежности ' к этой группе имеет важное практическое значение.

АщгоЬтщя_р,\боты. Основные результаты работы доложены и обсуждены ka: V Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси, 1988). syap. "Transfer and expression of genes involved in ША repair, recombination and replication" (chekhoslovakia, 1989), 1 Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), Республиканской кон«еренции молоды* Ученых (Бакуриани, 1900), Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы радиационной биологии и радиационной генетики" (Обнинск, 1S90), 7-th "TIHAHY" Simposium on Radiation chemistry, (Hunaajy, 1990), Всесоюзном координационном совесании "Генетические последствия загрязнения окру-маюшел среды мутагенными «акторами" (Самарканд, 1М0). ' По материалам данной работы опубликовано 8 работ.

£тРУ.ктура _и_ jp6 гсм_р а б£>ту. Диссертация состоит из введения, обзора Литературы, описания методов исследования, результатов и обсуждения, Закг.вчения, выводов и списка литературы. Работа изложем на 106 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка, 1 таблицу и список Литературы из 178 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И MEТОЛЫ

Лииин_кл81рк. В работе, были использованы асинхронные культуры Фиб-робластов кожи здоровда лпдей - эмбриональные (ЗФ), постнатапьные (ПН) • и больны* с синдромом Дауна (СД), синдромом• tJззльноклеточного неау-сч (СБХН), атаксией телеангиектазиел (AT), синдромом Кокейна (CK), классической пигментной хсеродермоя (ПК), ^игмен^ой хсеродермоч в борме, чувствительной к иокизкруыцшр. радиации (ПК II), а va к же культу-, ры лимфоцитов здоровы* людей (Норм. 1, Норм, 2) и от 7 Сольных с синдромом Дауна (СД-1, СД-2.....СД-7).

Условия культивирования. ФиброОласы еыражиаал.. на покровных стек-пах. помекенных в пл&стнковые чашки Петри, на среде Игла с доба' тгнигм 10% сыворотки крупного рогатого скота и ЗУ. п у tu. л иной сыворотки челове-

ка. Эксперименты проводились на клетка«, находящихся в экспоненциальной «азе роста, на 3 - 7-м пассажах.

Лимфоциты здоровых людей и больных с синдромом Дауна культивировали в среде RP"*I с побэлением 25'/. сыворотки крови плода крупного рогатого скота. Для стимуляции лимфоцитов к делению в культуру in utírc добавляли фитогемагглютикин «ирим Difeo Р в концентрации 0,01 мл на 5 мл культуральной среды и 0, 4 мл цельной крови.

Условия облучения. Клетки облучали на аппарате РУМ-17 (13 «А, 200 V, Фильтр 0,5 cu) в дозе 5 Гр при модности дозы 0,95 Гр/мин.

Фиброзвторадиогpagua. Через 30 мин после облучения клетки одновременно с интактньии клетками импульсно метили ^Н-тимидином (6 х 10"6 м, уд. акт. 0,78 х 10б мБк/ммоль),в течение 10, 20, 30. 60, 120 и 165 мин при 37°с. 8 конце импульсной метки с целью получения более отчетливых треков клетки быстро отмывали холодным раствором ssc, содержащем 1 х 10"4 М холодного тимипина, покровное стекло с клетками помещали ка конец предметного стекла, клетки лизировали 17. -ним раствором sds, ДНК распределяли по стеклу без механических воздействий (3-5 предмеьных стекол на один образец). Препараты высушивали на воздухе, промывали 1 раз Ю/.-н0я ТХУ, 2 раза 5Х-н0п ТХУ, 2 раза 96Х-ным этанолом, покрывали ядерной эмульсией типа М и проявляли через 4-6 мес.

Анализ препаратов проводили на анализаторе изображения "Magíscan -2ar" фирмы Joece-ioebi при помощи програмного пакета "Lines".

Статистическую обработку результатов проводили с помошыо програмного обеспечения "Magiscan^AR" (програмкыя пакет "Results"). Различие между параметрами распределений оценивали по критериям Фишера и Колмогорова-Смирнова (»-критерия) на уровне достоверности Р<0. 001.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Наследстьенные болезни человеха, которые составили предмет настоящего исследования, можно разделить на две группы 1) болезни с повышенной чувствительностью хромосом к ионизирующей падиации, независимо от чувствительности по критерию выживаемости, 2) болезни с нормальной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации. В первую группу входят атаксия-телеангиэктазия, синдром Дауна, синдром базальноклеточ-ного невуса, пигментная ксеродерма в форме, чувствительной к ионизирующей радиации. Во вторую группу можно включить классическую пигментную ксеродерму и синдром Кохейна.

Репликация ДНК в Фибробластах здоровых людей и больных с разной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации. Фибробласты здоровых людей и больных исследуег ами наследственными заболеваниями, находящиеся в экспоненциальной вазе роста, импульсно метипи ^Н-тимидином в течение 10, 20, 30, 60, 120 и 165 мин. На полученных фиброаеторадиог-

равах измеряли длину меченых фрагментов, размер промежутков между ними, а также длину нитей ДНК (сумму длин ">ексв и промежутков, танде.чно расположенных на одной прямой!.

Величины меченых в интервале 10 - 20 мин «рагментов ДНК позволяют оценить скорость продвижения вилки репликации, по скорости прироста меченых треков можно также судить о слиянии соседних реплнциругчихся репликонов в пределах кластера. Использование длительных экспоз i-ций клеток с 3Н-тимидином (до 165 мин) позволяет получить характеристики репликации на уровне инициации синтеза ДНК сразу в нескольких кластерах репликонов, расположенных рядом друг с другом.

На рис.1 представлены гистограммы распределения длин треков ДНК в зависимости от продолжительности импульсного мечения в интактных и облученных Х-лучами (5 Гр) клеках здоровых людей и при исследуемых болезнях. Видно, ч.то с увеличением времени инкубации клеток в среде с ^Н-тимидином во всех случаях уменьиаегся доля коротких «рагментов ДНК и появляются длинные »рагменты, что является результатом слияния соседних репликонов. При всех интервалах импульсного мзчения на гистограммах распределения длин треков присутствуют короткие (около 5 мкм) врагменты ДНК, что можно объяснить асинхронностью культур клеток. Этим же, по-видимому, объясняется и то, что величины промежутков между »рагментами ДНК при всех интервалах импульсного течения остаются на одном уровне (в пределах 10 - 25 мкм) и достоверно не отличаются друг от друга (Р<0. 001, данные не приводятся). При 10 мин и 20 >'ин импульсного мечения характер распределения длин йрагментов ДНК в необяученны* »ибробластах здоровых людей и при всех заболеваниях одинаков. Это, по-э.шимому, указывает на одинаковую скорость продвижения вилки репликами. Исключение составляет ЛХ II. Видно, что при 1С мин импульсном ме-<ении почти вся еьйсрка меченых «рагментов варьирует в пределах до 5 *км,и даже при 20 мин н 30 мик импульсном мечении длина подавляющего Ьольшинства измеренных фрагментов не преныиаит 11 мкм. Это, по всей (ероятности, является следствием значительного уменьшения скорости фодвижения вилки репликации в глегках при ПК II.

- Обнаружено существенное различие в paciipeiei.jiiHM длин треков при |родолжительних интервалах (60 - 1S5 мин) импульсного мечения в хлет-ах здоровых людей н больных, отнесенных ко группе (ПК и СК) с одой стороны, и больны*, отнесенных к 1-я группе (СБКН, СД, AT и ПК ТГ)' с другой. В клетка» 1-п группы заболеваний слабее выражен процесс меньиеиия доли коротких «рагментов ДНК и увеличения доли длинных рагментов, интенсивно происходящий в остальных г..лах клеток. Это, по-илимсму, является следствием дотульсовт инициация, когда 3Н- «мидин кяючается в уже частично реплицировавшиеся кл^терь! репликонов, что ожет говорить о 1еньв;еп частоте инициации кластеров репликонов а

so-

ts-'

Ш1

itohtjxwib Ие=6.С4 (5.35-6.15)

50-

25-

He.-8.BS (6.3-1-9.48)

L

5ft-75-

Hc=10.91 (10.33-11.54)

I

50-

Z5- i

Ис=Н.38 C3.SS-lE.ei

Ik*-

ПН . 5 Гр.

ПвгЗ.ЗЗ (3.59-4.28)

«1=7.82 (7.43-в.33)

Не=8.29 (7 53-8.75)

-líítto

Нс=Г.8В (9.55-11 .Вв)

(7.1Z-8.Z1)

30

Контроль iî0--4.65 (4.61-4.g0)

Иг,3.35 (В.91-9.85)

L.

Не=13.В4 (12.35-14.77)

Ис=20.М (16.S3-22.Kji

ffftlfon

Э5 5' Гр.

Пг=4.ЭВ m.14-1.cs)

Hi.~G.7G (S.33-7,35?

iL

Ик7.39

f1ir=lt .05 (10.04-12.09)

L

ПК

Контроль

HcS.Zl (4.80-5.63)

ГК 5 Гр.

F] №.-=5.CE (5.33-8.44)

1 !

Kc;7.E9 i7.ZQ-B.Z7)

L

Не.С.23 (5.73-S.S3)

Ис,1в.ЗЗ (16.ЭБ-20.33)

iL

Пс=10.50 (17.50-Z1.75)

iL

ib

111

№»11.90 (11.Z5-1Z.Z7

Пс-11.52 (10.63-13.61

CK

Контроль

Не=Э.2Э (3.02-4.43)

i ..=0.53 (fl.lB-9.B4)

№.--9.40 (8.78-3.84)

Mcsl3.ee

(13.e-14.G0)

к

ПеИЭ.25 (17.13-Z2.Z3)

I

ГЬ*

Éh*.

CK

5 Гр.

Ке=5.45 (5.80-5.88)

О

Ис=Е.70

(6.23-7.27) g а

с

CKJ

X

и*=о.зз ~ (7.8ь-з.и> 5

о

Не=10.4Б (Э.44-11.75) =

О ЧО

Пс=12.18 (11.21-13.42

О (VI

zb 40 60 88

20 40 е0 80

. Л л

20 40 60 80 20 40 60 со И НО Т Г « ? л

20 40 со

tV К

s

5

1Л

\£>

z0 48 68 80 28 10goqi zb1sesbb

50-25-

UbÄH Контроль

tte.-4.ea (4.0-5.25)

иькн 5 Гр.

ПеЕ.Н (S.M-6.S2)

сд

Контроль

tte=5.24 (4.27-6.8)

сд

5 Гр.

Иег4.01 l4.ea-5.36)

CU.

AT Контроль

(le=3.71) (Э.39-1.10)

i

AT 5 Гр.

Ка=3.91 (Э.56-4.23)

ПК II Контроль

tte=2.24 (2.23-2.27)

ПК II 5 Гр.

№»2.3 (2.20-2.47)

50-

Hes7.43 (Б .33-8.31)

tb=7.8£ 0.18-8.74)

ь.

L

IVuB.48 (7.E3-3.S2)

L

tk-.ам

17.38-B.SE)

Не =7.33 (Ь.94-7.79)

L

fâ

п île-6.60 g (6.19-7.IB)

■SX.

tfc*4.13 (3.87-4.58)

lte=5.83 (4.13-5.11)

L

о

OJ

se-

• 23-

fcS.73 (8.61-19.23)

Пю11.82 (10.44-1Z.94)

Alikw,

t¿ 58-f

¿ 25-R=t

He=12.8 (9.72-14.IB)

ikrf.

5D-2S-

nc=lC.Z5 (14.29-17.21)

ibbv

He=7.30 (6.56-8.23)

lte-.10.48 (9 .EQ-12 .B1 )

L

HcilO.47 (9.42-11.62)

пг-е.вз

(V.51-10.75)

Псиг.чз (io.3S-i3.et)

Ik

tV--8.63 (8.03-3.31)

Ht=0.4O

(7.94-9.83) =

Hc-.10.fl7 (9.33-12.17)

(11.51-13.37)

tte=11.66 (10.98-12.69)

L

«Cill.33 U1.12-1Z.95

L

tic=liTT3

(18.19-12.24)

L

1

Bb.

lu

o i

VO !

HcHB.O (7.81-18.82)

Г»;19.Ь0 117.1Г-21.2)

Ге=1Ь.88 (1S.Ü-19.31)

tlc=12.92 (11.73-14.19

ПС=13.93 (3.37-t?.Z7)

BfclZ.BS ■ CU .41-15.12:

ГЫБ.35 ..4.5Б-10.72)

Пс=13.СЭ (ll.CS-15.01)

iL,

Ik., toi

1ь

W.

o cu

1Л

ко

-¡-"'."4W-T- ■ ■■ 1 ■ ... I .. ..)... ... ■

20 40 БВ Ш 20 40 СО СО 20 43 СО СО 20 40 СО ) го '0 M "О ■' 23 '.Я Ы> СО

Дл и н 2 i р б :■; о в («км) Рис.1 IVîCrorpaiîMU распределения длив ¿тапхнгов ДНК при резной продолхитслькоста импульсного иечевип Н-тпккдином в фиброблзстах здоровых люде.'; и больнкх с СЕКН, Сй% AT, ПК II, CK И ПК.

4Ü БВ Л : 2В 40 БО

клетках 1-й групп» больных.

В опытах по исследованию действия ионизируете 1 радиации обнаружено, что в интервале импульсного мечения 10 - 30 мин характер расп[ ¡деления длин треков в «ибробластах всех исследуемых типов, за исключением ПК 11, одинаков и не отличается от такового в соответствующих необлу-ченнья контролях (рис.1). В клетках при ПК II и после облучения сохраняется необычный характер распределения длин меченых врагментов, имевший место до облучения. При увеличении времени импульсного мечения до 60 - 165 мин в клетках здоровых людей и больных, отнесенных ко 2-й группе, после облучения длинные треки (до 100 мим), присутствующие в соответствующих интактных клетках, не появляются, доля же коротких Фрагментов ДНК оствется на высоком уровне. При интервалах импульсного мечения 60 - 165 мин характер распределения длин фрагментов в облученных «ибробластах при заболеваниях 1-й группы, остается таким ае, как до облучения и, следовательно, становится похожим на таковое в облученных клетках здоровых людей и больных 2-й группы. Таким образом, после облучения различие в распределении длин треков, которое имело место в необлученных клетках больных 1-й группы, с одной стороны, и здоровы* г злей и больных 2-й группы - с другой, исчезает.

На рис.2 представлена зависимость средней длимы треков ДНК от времени импульсного мечения в интактных и облучение «ибробластах здоровых людей и при исследуемых наследственных заболеваниях. Видно, что эта зависимость в клетках здоровкх людей и при заболеваниях 2-я группы близка к линейной,ло крайней мере до 120 мин, тогда как в клетках больных 1-й группы, начиная с 30 мин (время, достаточное для синтеза кластера реплмконов) наблюдается загиб кривых в сторону уменьшения средней длины врзгментов ЛИК. Совладение средней длины «рагиентов в клетках здоровых людей и при всех болезнях, за исключением ПК II, в интервале 10 - 30 можно интерпретировать как отсутствие различия в скорости элонгации ЙКК в пределах репликона, т.е. в скорости продвижения вилки репликации и, возможно, в скорости слияния репликонов и пределах кластера как в норме, так и после облучения, В клетки* при ПК II средние длины треков, и следовательно, скорость продвижения вилки репликации остаются более низкими, как это бьшо и до облучения. В интервале 60 - 165 мин кривые зависимости ср дней «лины треков от времени импульсного мечения в интактнкз клетках и при заболеваниях 1-й' группы отличаются от всех остальных с высоким уроанем достоверности (Р<0,001). Средние длины «рагмеитов ДНК в облученных «ибробластах здоровых людей совпадают с таковым» • облученных «ибробластах всех больных.

При больвой скошенности распг?лелений значения средних арифметических можно использовать для эмпирической оценки значимости различий при

5025-

ПН

Контроль Не=еэ.г (58.2-70.7)

ПН 5 Гр. Не=49.2 (47.6-51.1)

ПК Контроль Не=61.2 (58.4-64.7)

1Ы03

ПК 5 Гр. Не=42.9 (33.0-48.3)

N=88

СК

Контроль Нс=51.4 (48.5-58.9)

к

г:=55

СК 5 Гр. Ие=49.0 (44.6-о5.0)*

№■¡75

5025-

Пе=132.5 (121.7-284.В)

Ие=86 .7 (83.3-99.1)

Ж

Ие=124.В (117.5-i36.fl)

N=56

5025-

Ке=163.5 (142.1-218.6)

I

■гГ^Щ^ШрЕЬр .

Ме=88.2 (00.8-97.53)

Ме=148.5 (143.7-158.0

50-

25-

Не:204.0 (193.4-239.4)

Ие=127.0 (123.8-138.8)

-Й

I

Не=Б9.2 (63.9-77.2)

И=87

Не=136.1 (122.7-161.5)

К=1В4

Не=В2.7 (53.9-75.0)

К=1?4

Не=163.3 (37.5-126.7)

^Тя— ч [

Не=161.97 (155.8-171.3)

Ие=61.7 (54.6-87.14)

83 160 240 320 80 160 240 32В 80 160 240 320 80 160 240 320 80 160 248 320

Длина нитей (и км)

80 160 240 320

53-1

25-

50-

25-

СБКН Контроль

Ме=36.3 (34.0-46.1)

Ие=70.0 (65.7-76.2)

50 25-

50-25-

Ме=130.В (125.3-139.6)

Ие=131.0 1124.5-142.5)

СБКН 5 Гр.

Не=50.5 (46.9-56.6)

к.

«е=126.Э (123.7-13?.2)

Не=128.й (123.0-135.5)

Ие=12?.5 (Ш .6-135.8)

СД Контроль

Ме=35.Э (32.3-46.В)

Ме=57.2 (52.5-64.7)

Ме=91.1 (82.8-188.2) .

Ие=35.5 (32.1-46.1)

Ие=84.6 (88.8-50.3)

Пе=33.3 (82.3-119.5)

165'

Л1

Контроль

Не =62.9 (58.7-6?.?)

Не=105.8 (96.3-118.9)

Ие-Ш.З (124.7-137.3)

5 Гр.

Не=51.6 (47.5-57.7)

X ас Я

О

1Ь_

Не=95.в (89.2-103.5)

о ю

Ие=132.1 (120.8-145.5)

в к X

о

ГУ

1Л 40

м

168 248 ¿22 ¡' 80 1БВ 246 328 ВО 160 248 320 | 83 1Б2 248 328 8С 16В 240 320 - СО (60 248 328 Д Я В Я 8 И 1/1:4 е й > (МКи) Рис.5. Гистограммы распределения длин вихеЯ ДНК при разной продолжительности ишульсвого квчечай ^Й-Тпмамаои а фибробластах здорового человеке'и больных о СБКН, СД, АТ, ШС 11, СК в ПК.

повии большого числа измерений. В настоящих опытах это число латочно велико, в каждой пробе было измерено около 300 треков. Тем менее, по распределениям длин треков были построены кривив «улятивных частот, позволяющие определить величину мелиым. Характер 1вых зависимости длин треков от времени мечения, построенных с юльзованием величин медиан, был таким же, как и при использовании »чений средних арифметических. Т.о., анализ полученных данных зволяет предположить, что в клетках больных 1-Я группы уменьпение :дних длин и значений медиан длин фрагментов ДНИ является следствием ■о, что реже происходит активация новых групп единиц репликации, чем бибробластах здоров«,« доноров и при болезнях 2-й группы. На рис.3 представлены гистограммы распределения длин нитей ДНК в гактных фибробластах здоровых людей и больных, а также после пучения в дозе 5 Гр. При 10 мин импульсном мечении во асех :сматриваемых случаях максимальная длина нитей составляет примерно 3 мкм (длина кластера). При увеличении продолжительности мечения до мин, когда кластеры репликонов, иступившие в репликации незадолго введения метки или вскоре после ее введения, должны завершить 1ликацию, в интактных клетках здорового человека и при болезнях 2-й /ппы появляются нити ДНК, в 3.5 раза превышающие длину кластера, *да как в необлученных клетках больных 1-й группы длина нитей не лигает и двойного размера кластера. При увеличении времени мечения 120 мин и и 165 мин в интактных клетках здорового человека л иьных 2-й группы, в отличие от больных 1-й группы, появляются 'кигй, ( длиной до 400 мкм. Эти результаты позволяют предполагать, что ^ эблученных клетках больных 1-й группы число одновременно акционирующих кластеров репликонов значительно меньше, чем в клетках зрового человека и больных 2-й группы.

После облучения характер распределения длин нитей ЛНК в зробластах больньи 1-й группы практически не отлнчавтея от такового ) необлученного контроля, тогда как в клетках здорового донора и чьных 2-й группы происходят существенные изменения: в интерзэле 1ения 60 - 165 мин максимальная длина нитей уменьшается в 2 раза, гдовательно, облучение Х-лучами в дозе 5 Гр приводит к уменьшению :ла одновременно Функционирующих кластеров репликонов до урозкя, зактерного для необлученных клеток больньи 1-й группы. Это херово 1но на рис.4, где представлена зависимость средней длины нитей ДНК продолжительности импульсного мечения.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что в пученных клетках только здоровых людей и при классической ПК и СК, эисходит подавление репликации на уровне сразу целых кластеров, 8 зультате этого число одновременно функционирующих кластеров

репликонов становится одинаковым в необлученных клетках больных с повышенной чувствительность» хромосом к ионизирующей радиации и в обличенных клетках этих же больных и здоровых доноров.

Репликация ДНК в лимфоцитах здорового человека и больных с синдромом Дауна. Лимйоаиты периферической крови как объект исследования репликации ДНК методом фиброавторадиографии используются сравнительно редко, так как работа с ними требует особых методических модификаций. Основной смысл использования в качестве объекта данных исследований лимфоцитов крови заключается в том, что именно эти клетки обычно используют в цитогенетических исследованиях. Это важно для настоящей работы, поскольку одним из ее аспектов является установление корреляции между особенностями репликации ДНК в норме и при действии ионизирующей радиации с одной стороны, и хромосомной нестабильностью, индуцируемой ионизирующей радиацией, - с другой.

Лимфоциты здоровых людей и больных с СЛ импульсно метили 3Н-тимиди-ном в течение 20, 30. 60, и 120 мин и на фиброавторадиографах измеряли длину меченых фрагментов и расстояния между центрами соседних треков,

Рис.5. Зависимость средней длины фрагментов ДНК от времени импульсного мечения 3Н-тимидином в лимфоцитах здоровых людей и бот чьи с синдромом Дауна.

неположенных на одной прямой '(1111Р).

Величины НИР в лимфоцитах при СД существенно не отличаются от аковых в лимфоцитах здоровых людей (табл.1). Совпадение средних длин рис.5) и медиан длин треков ДНК (табл. 1) в лимфоцитах здоровых людей

I больных с СД (СД-1, СД-2..... СД-7) при коротких временах

1мпульсного мечения (до 30 мин), при одинаковых 11IIP, по-видимому, квзывает на одинаковую скорость продвижения вилки репликации и корость слияния репликинов в кластере. Средние длины и медианы длин ученых фрагментов ДНК в лимфоцитах всех больных с СД, за исключением 1ИНИИ СД-3, при временах импульсного мечения 60 мин и 120 мин ущественно меньше с высоким уровнем достоверности (Р<0.001), чем в ормальных лимфоцитах, что при одинаковых 1ШР может указывать на 1тсутствие в лимфоцитах больных с СД последовательной активации ледуюших один за другим кластеров репликонов, имеющей место в ;им«оцитах здороаых людей.

Таким образом, в лимфоцитах больньи с СД обнаружен такой же дефект еплнкации ДНК, как и в фибробластах при СБКН, СД, ПК II и AT.

ОБСУЖДЕНИЕ

Репликация ДНК в клетках млекопитающих запрограммирована таким бразом, что инициация начинается синхронно а группе репликонов, азываемой кластером, запускаемых в определенной последовательности, оторая сохраняется в ряду клеточных поколений. Запускание каллой руппы контролируется инициатором, специфичным для данной группы, корость синтеза ДНК меняется на протяжении S-Фазы, что связано, лавным образом, с изменением числа одновременно функционирующих групп еплихонов, причем скорость продвижения вилки репликации не играет уиественной роли в этом процессе (Полииук, 1986). Согласно этой мсде-и, последовательность событий, определяющих продолжительность S-фаэы, вязана с последовательностью запускания групп репликонов, и задер«ка нициации в следующих одна за другой группах единиц репликации может ривестн к удлинению S-Фазы (Jasny, Tamm, 1979). Длина репликона в летках человека составляет 20 - 30 мкм при скорости продвижения рен-икативной вилки 0.4 - 0.7 мкм/мин, данные о длине кластера варьирует т 70 до 350 мкм и больше (Сынзыныс и др., 1990).

В Фибробластах больных с СБКН, АГ и ПК 11, а также в Фибробластзх и имФоцитах больных с СД, с повышенной чувствительностью хромосом к онизирующей радиации, независимо от чувствительности по критерию ыживаемости, обнаружен новый, неизвестный ранее дефект репликации ПК, заключающийся в существенно уменьшенной скорости роста цепей ДНК интактичх клетках, что, как свидетельствуют данные настоящей работы, Оусловлено уменьшением числа одновременно функционирующих соседних

Табл. 1. Значения медиан (ранг) длин треков ДНК и UUP при разню временах импульсного мечения ^Н-тимидином в лимфоцитах здоровых людей вольных с СЛ.

"Линии клеток

Норм. 1.

Норм. 2.

СП-1.

СД-2.

СД-з.

СП-4.

СД-5.

СВ-б.

СД-7

тег

"Время меченин "Тмик)

"ЗнК

"Ж

г и е н т Ii

НО-

(мкм)

Ж

(9

ш.

4-8)

6. 31 (5.92-6. S3)

(5.71^.07.)

7. 7$ (7.32-8. 22)

6.15 (5.79-6. 64)

7, 75 (7. 3>-8. 23) 8.66 (8. 41-9.0)

8.65 (8. 37-9.01)

Норм. 1. Кор.... 2. СД-1 СД- г. СД-з. СД-4. СД-5.

СД-6. СД-7

(30,

34.32 |. 33-38. 4£

42)

|-£3. 16)

9- 2с. 231 22 3 (El. 02-25.54)

(16. j (15.!

"ti ' II V 1 мкм

PR ' (24. 9&-31.45)

24. 35 (23.10-26.10)

24.0 (22.38-27. 44)

49)

13.0 (12. 33-13.

14. 76 (14.31-15.44)

11.15 (10. 71-11.78)

9.16 (8.74-9.73)

12. 9$ (11. 89-14.86)

6. 97 (6. 60-7. 41)

6.92 (6. 41-7.54)

8. 54 (7. 97-9.35)

10. 75 lSLg3-H,9gl_

19. 25 .25-20. 55)

(18

15. 04 (14.43-15.80) 10. 68 (10. 01-11.52)

9 58 (8. 76-10. 59)

13. 52 (13. |l-1.4. 08)

laosLiE.Jii-

38. o3 (32.60-41.34)

24. 30 (22. 34-29. 49)

27. 73 (25.35-29.95)

$0. 78 „ 128.83-32.96)

32. 29 (31.24-34.15)

44)

21. 25 (19. 4S-24

19. 38 „ (17.38-23. 01)

29.15 (27.70-32. 76)

26. 95 (24.90-31.04)

31.88 30. 50-34.

34.75 31. 95-

17)

(

(24.

40.13)

26.25

-29.25) JO. 45 (29.56-32.11)

28 25 (26. 46-31.69)

2 (

(24. 9i

19)

кластеров репликонов по сравнению с таковым в клетках здоровых людей, т.е. Hupyssu процесс последовательной активации кластеров. Это, вероятнее всего, явпяечся причиной значительного увеличения продолжительности S-вазы в клетках больных при AT (Scott, Zampetti-Bosseler, 1982 Ö; Hanavalt, 1986) и СД ( Kaina et al., 1977) по сравнении,с таковой в кл^гках здорового чеповяка. 6 кпетквх при CK и кпассичесхой ПК, не отличпюиихс.. от клеток здоровых людей по хромосомной чувствительное-

ти к действию ионизирующей радиации, процесс репликации не отл' чается от такового в клетка« здорового человека. Таким образом, прослеживается корреляция обнаруженного нами дефекта репликации ДНК с хромосомной чувствительностью к ионизирующей радиации.

Ранее имелись данные об иного характера аномалиях репликации ДНК в клетках человека вне повреждающего воздействия ионизирующей радиации:, в клетка* больных с синдромом Блума замедлено продвижение вилкг репликации (Hand, German, 1977, Kapp, 1982), в клетках больно с сиидромом Вернера уменьшена частота инициации репликации ДНК в предела» кластера при неизменной скорости роста цепей ДНК I Takeuchi et al., 1Э82), s клетках больных с базальнохлеточной карциномой нарушено ».лияиие репликонов в пределах кластера (Heenen, Galand, 1980).

Известно, что не все репликоны в клетке человека в одинаковой мере чувствительны к ингибируювему инициацию репликации ДНК действию ионизирующей радиации ; примерно в 30% репликонов инициация репли«ации но подавляется яри облучении в довольно высоких дозах (Painter, Young, 1976; Toimach, сгопез, 1977). Сейчас эта ситуация объяснима, поскольку стало очевидным, что репарабельность повреждений хроматина млекопитающих и роль этих повреждений в таких биологических последствия* для клетки, как выживаемость, мутагенез, злокачественная трансформация, зависят не только от типа повреждения, но, в большой степени, от локализации его в геноме и от Функционального состояния ДНК в данном сайте [ Hanawalt, 1986). Упаковка ДНК в хроматине и ее доступность для радиационного повреждения и репарации являются одним из главных факторов, определяющих радиочувствительность клеток (Nackerdien et al., 1989). В соответствии с этим представляется возможным, что в какой-то части генома подавление ионизирующей радиацией инициации репликации происходит на уровне отдельных репликонов. В остальной части генома в клетках здорового человека и при наследственных заболеваниях 2-й группы облучение в дозе 5 Гр, индуцирующей, как известно, один однонитевоя разрыв

субъединицу ДНК размером 10^ Да, подавляет инициации? репликами на уровне целых кластеров репликонов, в результате чего сильно уменьшается скорость роста цепей ДНК. А в клетках больных 1-й группы уменьшения ; частоты одновременно Функционирующих кластеров репликонов после облучения не наблюдается, так как оно уже уменьшено в интактньп клетках. Следовательно, облучение клеток здорового человека и больных 2-й группы приводит к нарушению репликации ДНК, которое по своему характеру 5налогично дефекту репликации ДНК в интактных клетках больных с С6КН, СЛ. AT и. ПК II. В этом смысле клетку больных при названных патологиях «ожно рассматривать как природную модель облученной клетки здорового 1еловека.

Данные настоящей работы показывают, что в клетках при ПК II не

только измз1 зна структурная организация кластеров репликонов, но и prjKo замедлена скорость продвижения випки репликации. Ранее в нашей лаборатории были получены цитогенетические данные о чрезвычайно высокой частоте спонтанных СХО в клетках при ИК II (Andriadze et al., 1897). Репликативная модель СХО основана на предположении, что -двуни-тевые разрывы ДНК, необходимые для обменов, возникают на границе двух кластеров репликонов, из которых один реплицирован полностью, а другой частично (Painter, 1980). Разрывы, образующиеся вследствие зависимого от топоизомеразы суперскручивания ДНК, приводят к рекомбинационным обменам между нитями ДНК е этих двух соседних кластерах. Удлинение периода существования частично реплицированных кластеров репликонов должно привести к увеличению частоты спонтанных СХО. Такая ситуация создается, по-видимому, в результате сочетания двух . молекулярных дефектов, обнаруженных в клетках при ПК II: 1) замедление скорости продвижения вилки репликации, 2) замедление скорости роста цепей ДНК вследствие менызего числа одновременно реплицирующихся кластеров репликонов.

Действительно, при синдроме Дауна, например, замедлена скорость роста цепей ДНК, а скорость продвижения вилки репликации не изменена. При этом не наблиается повышения уровня спонтанных СХО. С другол стороны, известно, что УФ-свет является сильным индуктором СХО именнс вследствие блока реппикативных випок, но уровень СХО остается все-таки более низким, чем уровень спонтанных СХО в клетках при ПК II и синдроме Бл"ма (СБ). Пайктеру для объяснения высокого уровня спонтанньа СХО при СБ в рамках его репликативной модели, приходится делать допущение, что скорость продвижения вилки репликации замедлена лишь в части репликонов, что нам представляется маловероятным. Т.к. в настоящей работе установлена корреляция второго из двух обсуждаемых молекулярнь;. дефектов с хромосомной нестабильностью, можно ожидать, что подобный дефект со временем будет выявлен и при СЕ, поскольку эте самм яркий представитель "синдромов хромосомной нестабильности". Полученные данные подтверждают реллихативную модель образования СХО.

ВЫВОДЫ

1. Г.ри наследственных заболеваниях человека с повышенной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации - AT, СД, СБКН и ЯК II -впервые обнаружено изменение структурной организации репликации ДКК, заключающееся в меньшем числе одновременно реплицирующихся кластеро! peí ликонов.

2. При н; злсдственных заболеваниях человека с нормальной чувствительности к ионизирующей радиации - СК и клаг-ическая ПК - скоросп

роста цепей ДНК такая *е, как в клетка* здоровых людей. Т. о., обнаруженное в настоящей работе изменение структурной организации кластеров репликонов, коррелирует с хромосомной нестабильностью.

3. Впервые в интактньа клетках при ПК II обнаружено значительное замедление скорости продвижения репликативной вилки. При всах других заболеваниях этот параметр репликации такой же как и в хлетках здорового человека.

4. Скорость продвижения репликативной вилки не изменяется после облучения ионизирующей радиацией (5 Гр) клеток всех исследуемых типов.

5. Ионизирующая радиация (5 Гр) подавляет инициацию репликации ДНК в клетках здорового человека и больных с нормальной хромосомной чувствительностью к ионизирующей радиации (классическая ПК и CK) на уровне целых кластеров репликонов, что приводит к резкому уменьпенкв скорости роста цепей ДНК.

6. Ионизирующая радиация (5 Гр) не изменяет число одт-ргменно реплицирующихся кластеров репликонов и, следовательно, не влияет на скорость роста цепеп ДНК в клетках больных с синдромами хромосомной нестабильности (СБКН, СД, AT И ПК IT). Т.о., в клетках указанных больных исходно существует дефект репликации ДНК, подобный возникающему в клетках здоровых людей после облучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. БаренФельд Л. С., Нергадзе С. Г., Плеская Н. М., Михельсон ЕГ. К Андреева Л. Ф., Бильдин В.Н. Нарушение репликации ДНК в необлученных клетках при синдроме базально-клеточного яевуса ч действие ионизирующей радиации. // Цитология. - 1989. - т. 31. - с. 775-783.

2. БаренФельд Л. С., Нергадзе С. Г., Андреева Л. Ф., Плескам Н.М., Радиорезистентный синтез ДНК при генетических болезнях человека: новое объяснение. // Доклад - I Всесоюзный радиобиологический съезд. Москва. 21-27 августа. - 1989г. - с. 90-92.

3. БаренФельд Л. С., Нергадзе С. Г., Плескач Н. М., Михельсон В. М., Бильдин В.Н. Аномалии в процессинге ДНК при наследственных болезнях человека с повышенной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации и признаками преждевременного старения. //Материалы v Всесоюзного съезда геронтологов и гериатров. Тбилиси. 1989г. 22-25 ноября, с. 314-31

4. Barenfeld L. S. , Nergadze S. G. , Mikhelson V. M. , Pleskach U. M., Andreeva L. F. , Bildin V. N. Radioresistant DNA synthesis in genetic disorders is a consequence of a marked reduction in the number of simultaneous operating groups of replicón in uniradiated cells. Symp. "Transfer and expression of genes involved in DNA. repair, recombination and replication", Smolenic Castl, Febr. 27 - March 2, 1939. Che-

khoälovakia,

5. Баренвеяьд Л. С.. Нергадзе С.Г. , Андреева Л. Ф., Плескам D.M. Дьг:.:теие ионизирующая радиации на репликации ДНК в клетках здорового

».человека и больного с синдромом Дауна. // Цитология. - 1989. - т. 21. * - с. 1377-1384.

6. Нергадзе С. Г., Патарая Л. Л., Махарадзе Т.Д., Лукина Н. Ю. Метод «иброаегорадиогрвфни ДНК модифицированный для синхронных культур человека. /Дез. докл. республиканской конференции молодых ученых, 1990 г. 1-5 апреля. Бакуриани. Республика Грузия, (груз. )

, 7. Баренфельд П. С., Нергадзе С. Г., Л. Ф.. Плескач Н. М., Михельсон Б. М. Взаимосвязь между замедленной скорость» продвижения вилки репликации и высэким уровнем спонтанных СХО при Пигментной Ксеродерме в Форме Ii. Тез. Докл. Всесоюз. Кон®. "Акт. прсбл. рад. биол. и рад. цнт. " Обнинск. 1990.

8. Нергадзе С. Г., Плескач Н. М., Андреева Л. Ф., Баренфельд Л. С. Репликация ДНК при наследственных болезнях человека с повышенной чувствительностью хромосом к ионизирующей радиации. //Всесоюз. науч. кон®. "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами", Самарканд. 1990.