Организация репликации генома теплокровных животных и человека

Ляпунова, Наталия Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Организация репликации генома теплокровных животных и человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Организация репликации генома теплокровных животных и человека"

АКАДЕМИЯ медицинских НАУК СССР ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

Л ¿2 /"1

На правах рукописи УДК 575:577.213.4

ЛЯПУНОВА Наталия Алексеевна

ОРГАНИЗАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ ГЕНОИА ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1989

Работа выполнена в лаборатории общей цитогенетики Института медицинской генетики АМН СССР

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Г.Д.Засухина доктор биологических наук, профессор Д.М.Спитковский доктор биологических наук А.П.Акифьев

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии АН СССР

Запета диссертации состоится " "_ 1969 г.

в час. мин, на заседании Специализированного ученого совета (Д 001.16.01) Института медицинской генетики АМН СССР по адресу: 115478, Москва, ул.Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан " "_1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

Л.Ф.Курило

.,■ :( ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

г п'.^Актуальноеть проблемы. За 30 лет изучения репликации генома эукариот накоплен обширный фактический материал. Имеется большое количество твердо установленных фактов. Они относятся к тагам вопросам, как определение длительности периода синтеза ДНК (у растений, разных групп животных, человека); последовательность репликации частей генома (поздняя репликация гетерохро-матина, связь дифференциальной окрашиваемости частей хромосом и времени их репликации); некоторые характеристики репликонов молекул ДНК (полирепликонность синтеза ДНК в клетках эукариот, скорость и направление движения репликативннх вилок).

Методами молекулярной биологии получены данные об энзимо-логии матричного синтеза ДНК в клетках эукариот. Установлены признаки сходства и различия с хорошо изученными в этом отношении прокариотами и низшими эукариот&чи. В последние годы появились экспериментальные подхода для изучения процесса инициации работы репликонов и времени репликации в 3 -периоде индивидуальных генов или известных фрагментов ДНК.

Тем не менее, в настоящее время не существует модели организации репликации сложной (с точки зрения упаковки ДНК в интерфазном хроматине) полирепликонной системы, какой является эукариотический геном. Более того, наряду с мало изученными вопросами, есть такие, при решении которых утвердились и вошли в научную литературу и учебники неверные положения, вводящие в заблуждение специалистов сменных областей и затрудняющие правильный поиск закономерностей реальной организации репликации генома. К ним относятся положения о кластерах множества мелких репликонов, неизменной скорости движения решшкативней вилкл в репликонах, работающих в разные отрезки времени э -периода и др. Совершенно ясно, что от того, как сформулирована модель, какие факты лежат в её основе, зависит в каком направлении должны вестись поиски экспериментальных подходов для ответа на нерешенные вопросы.

Цель и задачи исследования. Цель предлагаемой диссертационной работы - изучить закономерности репликации генома яивот-ных и человека и предложить модель организации репликации генома. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) изучить размеры единиц репликации (решшконов) и скорость движения реплинативных вилок в хромосомной ДНК некоторых животных и человека;

2) выяснить, существуют ли специализированные точки терминами движения вилок репликации ДНК;

3) провести анализ скорости движения решшкативных вилок

в репликонах, привадлеаащих разным фракциям хроматина и функционирующих в разное время в течение 3 -периода штотического цикла;

4) изучить связь между временем работы решшконов в ходе 3 -периода и транскрипционной активностью реплицирующейся ДНК;

5) изучить распределение актов инициации решшконов по ходу Б-периода.

Научная новизна работы. В работе получены ноше данные, которые позволили ответить на ряд вопросов об организации репликации генома высших организмов. Особое значение имеют полученные вами данные о размерах единиц репликации. В противоположность установившися представлениям о функционировании в ходе репликации генша теплокровных животных и человека кластеров мелких решшконов нями показано, что репликация осуществляется большими единицами репликации (в основном 50-500 мш), и отрезки молекул ДНК, входящие в индивидуальные структу^но-чбункциональ-ные блоки хроматина, формирующие эукариогическую хромосому, реплицируются путем работы одного или двух-трех решшконов. Установлено, что функционирование больших решшконов длится от 0,5 до 6 часов и более. При этом скорость движения вилки репликации остается постоянной на протяжении всего времени работы репликона. Показано, что средняя скорость движения решшкативных вилок увеличивается в ходе Б-периода, и это происходит вследствие постепенного уменьшения доли решшконов с относительно низкими скоростями движения вилок репликации и увеличения доли репликонов со средними и высокими скоростями. Впервые получены доказательства существования точек тер.ошацки решшконо: на молекулах ДНК и высказано предположение, что такие точки могут лежать на границах перемежающихся по длине хромосом разн структурно-функциональных блоков. Критический анализ метода ра диоавтографии молекул ДНК позволил водить методические причины

ошибок, возникающих, в первую очередь, при анализе размеров единиц репликации в геномах высших организмов.

На основе разработанного оригинального подхода к изучению гидролизуемости ДНКаэой I новосинтезированной ДНК в разите интервалы 3-периода, получены новые данные о репликации в начале э-периода транскрипционно активной ДНК, а в конце - нетра-нскрибируемой ДНК. Эти данные хорошо согласуются с большим комплексом фактов, полученных другими методами. Впервые получены данные о снижении скорости движения вилок репликации ДНК при действии на клетки алкилиругацего мутагена метилнитронитрозогуа-нидана (ШНГ) п об отсутствии влияния антибиотика блеомицина на движение вилок репликации. С использованием блеомицииа получены факты, свидетельствующие о сгруппированности актов инициации репликации в ходе Б-периода. Это позволило обосновать предположение о синхронном вступлении в работу репликонов, принадлежащих одноименным Стокам хромосом ( я , о , С-блоки, выявляете по длине хромосом дифференциальная! окрасками). На основе всей совокупности полученных нами фактов и накопленных в научной литературе данных предложена модель организации реплпкаци ДНК генома теплокровных животных и человека.

Научно-практическое значение работы заключается в том, что на основе предлозенвой модели можно объяснить ряд хорошо установленных фактов в организации з-периода: гетерогенность скоростей движения решппсативгшх вилок в индивидуальных клетках в каздый данный отрезок 3-фазы, неравномерность интенсивности синтеза ДНК по ходу б-периода; постоянство длительности <?-периода; корреляцию мевду длительностью э-периода у данного вида и средними скоростями движения вилок репликации и др. Вместе с тем, модель позволяет сформулировать задачи поиска генетических механизмов регуляции последовательности репликации частей генсма и выяснения молекулярных механизмов инициации работы репликонов. Знание закономерностей синтеза ДНК в ходе з-периода позволяет избежать ошибочных выводов при сравнении реп-ликативных свойств в клетках, полученных от доноров с генетическими дефектами и от нормальных индивидов. Самостоятельное значение могут иметь полученные в работе новые данные о механизмах действия на синтез ДНК апеллирующего мутагена МННГ (ко-

торий интенсивно используется для получения мутантных форм бактерий и растепий) и антибиотика блеомицина (противоопухолевого препарата, используемого в клинике).

Апробация работа. Материалы диссертации были представлены в виде докладов и стендовых сообщений на Х1У Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); на 1У Всесоюзном съезде генетиков и селекционеров ил. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982); на I Всесоюзном съезде Научного общества медицинских генетиков (Киев, 1984); на I съезде медицинских генетиков Украины (Львов, 1988); на У, УП, УШ и П Всесоюзных симпозиумах "Структура и функция клеточного ядра" (Новосибирск, 1975; Харьков, 1980; Цуцино, 1984; Черноголовка, 1987); на Х1У и ХУ Ежегодных конференциях Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 1984; Варна, 1988); на симпозиуме по медицинской генетике в Венгрии (Дебрецея, 1976); на 1У и У Всесоюзных симпозиумах "Молекулярное механизмы генетических процессов" (Москва, 1979,

1983); на Всесоюзном симпозиуме "Митотический цикл" (Ле1шнград, 1978); на 1У Совещании по структуре и функциям хршосом (Пувда-но, 1982); на У теоретическом сеыипаре по молекулярной генетике (Пуцино, 1976); на Всесоюзной шксле "Биолюминесценция и хемолю-минесцентный анализ" (Красноярск, 1985); на Всесоюзной симпозиума "Молекулярные механизмы репликации, репарации и рекомбинации в норме и при действии радиации у эукариот" (Пущино, 1983); на П рабочем совещании по вопросам строения и функционирования хромосом высших организмов (Пуцино, 1976) и на I рабочем совещании "Молекулярная биология матричного синтеза ДНК" (Гатчина,

1984).

Материалы были доложены на совместном заседании секции генетики Московского общества испытателей природы и МО ВОГиС им. Н.И.Вавилова (1979), в разные годы докладывались и обсувдались на научных семинарах Центрального института генетики АН ГДР (Гатерслебен).Института молекулярной биологии АН СССР и Института медицинской генетики АМН СССР. Полученные в ходе выполнения диссертационного исследования результаты опубликованы в 30 научных статьях и тезисах в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работа. Диссертация состоит из введения 4-х глав. Три главы посвящены изложению отдельных разделов эк-периментального материала. Каждая из них тлеет обзор литерату-и, изложение материалов и методов, результатов исследований и х обсуждение. 4-я глава содержит изложение гипотезы: модели ор-анизации репликации генома эукариотических организмов, и след-твий, вытекающих из модели. Текст завершается общими выводами списком цитированной литературы (437 названий отечественных и арубежных авторов). Диссертационная работа изложена на границах, включающих 55 рисунков и 20 таблиц.

Основные результаты, излаженные в диссертации, получены ри непосредственном участии автора. На разных этапах экспери-знтальныв исследования проводились совместно с Н.М.Хаитовой, •Н.Дулатовой и О.М.Лаврушиной, работавших под руководством ав-ора, а также с Ю.Б.Юровым. Всем им автор приносит глубокую бла-одарность.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Осуществление репликации хромосомной ДНК в клетках теп-окровных животных и человека репликонами, размеры большей час-г которых варьируют в пределах 50-500 мкм.

2. Увеличение средней скорости движения вилок репликации ходе s -периода.

3. Существование связи между транскрипционной активностью, порядком репликации частей генома.

4. Неравномерность распределения актов инициации решшко-зв на протяжении s -периода.

5. Гипотетическая модель организации репликации ДНК гено-

з человека и животных, основанная на изложенных выше положеня-IC.

СВОЙСТВА ЕДИНИЦ РЕПЛИКАЦИИ ГЕНОМА ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Большие молекулы ДНК, входящие в состав эукариотических эомосом представляют собой полирепликонные системы (Taylor t al. , 1957; lima-de-Faria , 1961). Единицы репликации, пи репликоны, представляют собой участки молекулы ДНК, репли-1рующиеся в результате одного акта инициации.

Рост новосинтезируемой полшгукле отидной цепи ДНК (элонгация решшкопа) осуществляется движением репликативной вилки. Изучению подлежит скорость-движения реплпкативных вилок, разме рн единицы репликации, согласованность работы репликонов во bj мени и др. Особое значение для решения этой грушш вопросов га от метод радиоавтографии молекул ДНК, разработанный Кэрноом до бактериальной ДНК ( Caima , 1962, 1963), а затем адаптированный дая изучения ДНК клеток высших организмов ( Caima , 1966; ШЬегшаа , Rigga , 1966, 1968).

Сущность метода в модификации lark ot al. (1971) состоит в том, что предварительно инкубированные с 3Н-тимидином 8Н-Т клетки лизируют на поверхности помытого желантиной предметного стекла и вязкий раствор, содержащий полноразмерные молекулы хромосомной ДНК, протягивают вдоль стекла. После промывки и высушивания препарат покрывают жидкой фотоэмульсией, до 7-9 кес. экспонируют в темноте и проявляют. Достоинство этого метода заключается в наглядности и возможности прямого микрос! пгческого анализа на радиавтографах участков молекул ДНК, вки чивших в процессе репликации радиоактивную матку в заданном p¡ жиме. Вместе с тем, интерпретация результатов наблюдений допускает заметный субъективизм, т.к. за треками радиоавтографа е< следователь не видит самих молекул ДНК.

К концу 70-х годов, когда мы начинали нашу работу, сложились определенные представления о репликонах в ДНК геномов животных и человека. В основе лежали данные, полученные Хюберла' вом и Риггсом (1968), дополненные исследованиями других автор (см. обзоры Callan , 1972; Edenberg , Hubenaan , 1975; Hand 1978, 1979 и др.). Согласно этим представлениям репликация ДН высших эукариот осуществляется в репликонах, объединенных в кластеры (тандемы, серии). Каждый кластер содержит 10-15 и более решшконов. Основная масса репликонов имеет размеры 15-10 мкм при средних значениях 30-50 шел. В кластере репликоны нач наст функционировать относительно синхронно. В подавляющем бо льшинстве случаев репликация молекул ДНК в пределах одного ре ликона осуществляется двумя вилками репликации, движущимися в противоположные стороны от точки инициации репликации.

цняя скорость движения вилки репликации зависит от темпера-а, в клетках теплокровных животных она составляет 0,6-0,8 /глин. Исходя из этих данных, время, необходимое для заверяя функционирования кластера репликонов не должно превышать

Вместе с тем в цитогенетике к этилу времени было установ-о, что существует определенная последовательность реплика-участков хромосом, показано, что чередующиеся по длине хро-ом r , g и С-блоки реплицируются как единое целое, причем чале реплицируется ДНК в R -блоках, затем G , а в конце S _ ы в С-блоках ( stubblefild , 1975; Захаров, Еголина, 1976). о высказано предположение, что кластеры репликонов должны тветствовать сегментам ДНК отдельных блоков хроматина (stub-.fild , 1975). Однако было показано, что репликация сешен-ДНК, заключенных в отдельных блоках хромосом длится до 3-4 Это означало, что в пределах каждого блока должны последо-'ельно функционировать несколько кластеров репликонов. Тогда никает вопрос: как регулируется последовательность рошшка-г мастеров? Одновременно возникали сомнения в методическом рсоде к определению размеров репликонов, как расстояний межцентрами соседних репликонов в кластерах. При краткой (30— мин.) инкубации клеток с 3Н-Т, которая, как правило, испо-ювалась при изучении репликации ДНК в клетках теплокровных зотных, на радиоавтографах возникают в основном короткие т-ше треки (5-100 мкм). Поскольку диаметр зерен серебра в фо-эмульсии равен 0,5-1 мкм, а диаметр молекулы ДНК 2 нм, под тейно расположенными треками зерен серебра может лежать бо-пое число латерально слипшихся молекул. Если в таком пучке ажется больше, чем одна меченая молекула ДНК, то принадлежа-з им короткие меченые фрагменты будут лежать на одной линии восприниматься как кластеры. При длительности метки 2 ч и бо-з наблюдаются непрерывно меченые длинные треки, что интер-этировали как слияние конец-конец завершивших фунхционирова-э соседних репликонов.

Принципиальное отличие нашего экспериментального подхода стояло в том, что мы анализировали параметры репликонов на диоавтографах молекул ДНК после длительного (в течение 2-6 ч)

двухфазного (сначала высокой, а затем низкой удельной акти! ности) включения 3Н-Т в клетки в период синтеза ДНК. Это по зволяло нам отбирать для анализа только такие меченые фра п.! ты, которые заведомо принадлежали одной молекуле ДНК. Мы им четкие критерии для того, чтобы отличить треки одной мечено молекулы от треков, лринадленавдах двум или более латерально слипшимся меченым молекулам ДНК.

Все эксперименты выполнены на псревиваеглых культурах к ток человека и некоторых грызунов.

Для меченья молекул ДНК в течение всей ^ -фазы нспольз вали 3Н-Т с удельной активностью 0,7 ТБк/ммоль (19,8 кюри-шоль, "Изотоп", СССР), в концентрации 11,7 МБк/мл (300 мкю мл). В опытах с двухфазной меткой клетки сначала ишсубирова. с 3Н-Т высокой удельной активности: 1,6-1,8 ТБк/ммоль (45—5( юори/ммоль, Amersbaa , Англия) при концентрации 3,7-7,4 МБк/ мл (100-200 мккюри/мл), а затем с 3Н-Т низкой удельной актш ности - 185 ГБк/моль (5 кюри/ммоль, Amerehara , Англия), rai se при концентрагаи 3,7-7,4 МБк/мл. Двухфазная метка позволь ла на радиоавтографах прослеживать направление движения вале репликации (ЕР), анализировать скорость движения BP (Ск BP), изучать терминацию работы BP и оценивать размеры решшконов. Длительность последовательной инкубации клеток с 3Н-Т высокс и низкой удельной активности определялась задачами зкепериме та и указана при изложении результатов исследований.

В предварительных опытах мы установили, что размеры осн '.ной массы меченых фрагментов на радиоавтографах молекул ДНК включавших метку в течение всего s -периода, варьируют в пр делах 200-750 паял (ср.знач. около 400 мкм). В редких случаях удавалось наблюдать непрерывные меченые молекулы длиной до 1,0-1,5 тыс. мкм.

Размер единиц тюшшкации. Презде всего мы провели измер ние единиц репликации на контрольных препаратах, полученных после однофазной инкубации клеток с 3Н-Т в течение 30 или 60 мин. Для измерения расстояний между центрами соседних мечены: фрагментов (метод Хюбермана-Ригса) мы выбирали тандемы из 3-: и более фрагментов. Результаты измерений представлены на рис. 1(А,Б). При длительности метки 30 мин. основная масса измере-

пий составила 10-70 мкм при среднем значешш около 30 мкм; в вариантах с введением метки в течоило 60 мин. измеренные расстояния между центрами меченых фрагментов в тандемах варьировали от 10 до 120 мкм, при среднем значении около 40 мкм. Тагам образом, полученные в наших экспериментах результаты хорошо соответствовали данным, ранее полученным другими авторам при такой но постановке опыта и методе измерения (см. обзоры Edenbors, Hubeiraan , 1975; Hand, 1975, 1978).

Результаты измерений расстояний глекду точками инициации соседних рошшсонов при двухфазной мет?со 30+150 мин и 60+120 мин., приведены в виде гистох'ромгл на рис. I В,Г. В обоих вариантах опыта эти величины варьируют в пределах от 40 до 240 шсм, при этом большая часть измерений попадает в область 80100 дал, а среднее значение - около 130 мкм. Доля таких меченых молекул от всех пригодных дая лпаляза невелика. Она но превышает 3-5$.

Распределение размеров симметричных одиночных репликонов приведено на рис.1Д,Е. Величины таких единиц репликации варьируют от ЕО до 320 мкм при среднем значении 120 мкм. Частота гстрачаекестк уакпс гечепих фигур таксе невелика (до 5-7/1).

Наконец, еще одна возможность оценки размеров репликонов заключается е кзмэреш'л фрагментов, водуцих однонапрзвленгпй синтез ДНК. Это наиболее часто ветре чаюпзтеся на препаратах информативные фрагменты. Размер таких меченых молекул оказывается 40-200 мкм (рио.1 S,3) при среднем из качении НО -icm. Ее-ли принять, что это половинки стлметричных рзшшконов, го роп-ликон должен иметь размер (2 • НО + х) мкм, где х - размер участка, реплицировавшегося до начала введения метет. Следовательно, в этом случае мы должны принять, что средний размер ед'ниц репликации заметно больше 220 мкм.

Таким образом, во всех вариантах измерения единиц репликации при длительной (3 ч) двухфазной метке молекул ДНК в асинхронной культуре клеток человека мы получили результаты, при-н-ципиально отличные от результатов, опубликованных к настоящему времени другими авторами. Этот вывод был в дальнейшем подтвержден во многих опытах цри анализе размеров единиц репликации в клетках человека и грызунов (китайский хомячок, пашен-

{? О' 5 о

03 02

Н Й

01 02 01

о о в

-СТ" а 1 р

в Г—1П 7 г

д £

ГС.." 7

Рис Л. Четыре подхода к оценке размера единиц репликации на цримере ге-патоцитов человека. А и Б - расстояния между центрами соседних меченых

fpaIíлeнтoв после 30 и О мин однофазной метки. В и Г - расстояния между точками инициации репликации соседних реп-ликонов'после двухфазной метки. Д и Е - размеры одиночных симметричных репликонов. К и 3 - размеры фрагментов ДНК с однонаправленным синтезом. Режим двухфазной метки 30+150 мин (В.Д, Ж) или 60+120 мрн (Г, Е,3)

Длина, мш

ная полевка, крысовидный хомячок). В табл. I суммированы данные о размерах репликонов в эмбриональных клетках человека, инкубированных с 3Н-тимидином в течение 6 ч (двухфазная метка I + 5 ч).

Таблица I

Размеры единиц репликации в эмбриональных клетках человека, меченных I + 5 ч.

Измеряемые фрагменты на радиоавтографах молекул Число измерений X + БЕ

... ^ 800 154+6

л. 283 321+15 (70 + 670)*

1- 76 157+23 (50 4- 450)

скобках указаны крайние значения

Совокупность наших экспериментальных данных позволила сделать следующие выводы: I) репликация ДНК клеток человека осуществляется в репликонах, размеры которых варьируют в пределах от 40 до 670 мкм (осн. масса 50-500 мкм); 2) в сравнительно небольшом числе случаев отрезки молекул ДНК длиной 2001500 мкм могут реплицироваться путем одновременной работы 2 или 3 единиц репликации, размеры таких репликонов чаще всего около 80-150 мкм; значительно чаще репликоны встречаются как отдельные единицы; 3) кластеры (тандемы) мелких решшконов, описанные в работах многих авторов (см. цит.выше обзоры) являются методическим артефактом, связанным с использованием краткой инкубации клеток с 3Н-Т и анализом коротких треков на препаратах, что не позволяет отличать треки, принадлежащие одиночным молекулам ДНК, от треков, принадлежащих двум или более слипшимся латерально молекулам ДНК.

Скорость движения вилок репликации. На радиоавтографах молекул ДНК скорость движения ВР (Ск ВР) можно определить по длине фраплентов молекул ДНК, меченных за определенное время. Если производить измерения длины фрагментов в опытах с однофазной меткой, то в анализ будут попадать разнородные по величине фрапленты, в зависимости от того, принадлежат ли они ре-пликонам, начавшим синтез ДНК до введения метки в культуру, одновременно с начало?.! инкубации или несколько позже (callan, 1974). Дополнительное увеличение вариабельности может происходить за счет случайных слияний отдельных меченых фрагаентов при продольном слипании молекул ДНК, которым эти фраплентн принадлежат. Вероятность этого источника ошибок тем больше, чем больше время включения метки.

Результаты измерения размера меченых фрагментов в контрольных вариантах опыта на клетках эмбриональных гепатоцитов человека (однофазная метка) приведены на рис. 2а,б. В вариантах опытов с длительностью метки 30 и 60 мин.»соответственно, средние размеры фрагментов составляют 18 и 36 мкм; коэффициент вариации 31 и 40$.

В опытах с двухфазной меткой для определения СкВР модно выбирать такие интенсивно меченые фраплентн, в которых синтез ДНК шел в течение всего времени инкубации клеток с 3Н-Т высо-

Рис. 2. Распределение частота встречаемости разных по размеру меченых фрагментов молекул ДНК после 30 (а,в) или 60 (б,г) мин включения 3Н-Т в гепатоцитах человека .

(а,б) - опыт с однофазной меткой; (в,г) - опыт с двухфазной .меткой (выбор фрагментов "с селекцией"). В каждом варианте по 20Ö измерений.

селекцией"). Такие фрагмен-реплицировавшимся участком молекулы ДЕК, а с другой - слабомеченным. На рис. 2 б,г дано распределение таких мечееых фрагментов ДНК. При длительности инкубации с высокоактивным 3Н-Т 30 и 60 мин. средние значения как и в вариаьтсх опыта с однофазной меткой, составляют 18 и 36 шм, однако вариабельность результатов в этом случае значительно меньше, коэффициент вариации 11%. Таким образам, в эмбриональных гепатоцитах человека удвоение молекул ДНК протекает со средней скоростью 36 икм/ч(или 0,6 мкм/мин) в одной вилке репликации. Такие же результаты были получены при изуче нии культур клеток эмбриональных и постнаталышх фибробластов человека.

Аналогичные данные были получены и для клеток китайского хомячка. При измерешш меченых фрагаентов после 30 и 60 мин. инкубации с 3Н-Т высокой удельной активности (в эксперименте с двухфазной меткой) средние значения составили соответственн 25 и 50 мкм. Это означает, что средняя скорость удвоения моле кул ДИК в одной вилке репликации в метках китайского хомячка составляет 0,8 мкм/мин.

Полученные шали данные о средней СкВР в клетках человека и китайского хомячка хорошо согласуются с данными многих других авторов, полученных как раньше, так и позже проведенных нами исследований (см. обзор Kapp , Painter , 1982).

Гетерогенность скорости движения BP в отдельных реплико-нах. На радиоавтографах молекул ДНК из асинхронных популяций

кой удельной активности (метод "с ты с одной стороны ограничены уже

теток встречаются как отдельно лежащие, так и массивы меченых элекул, характеризующихся заметными различиями СкВР. По гисто-эаммам, приведенным на рис. 2(в,г).можно отметить, что несмо-ря на использование метода отбора (селекции) интенсивно мече-¡х учаоткоп молекул для определения СкВР,' размеры меченых за дао и то же время фрагментов сильно различаются. В клетках че-эвека размеры меченых фрагментов варьируют от 7 до 30 мкм при 3 мин. включения метки и от 15 до 60 мкм при 60 мин. Это соот-этствует различиям СкВР от 0,2 до I мил/мин (или от 12 до 60 ш/час). В клетках китайокого хомячка СкВР в разных реплико-эх варьирует в диапазоне от 0,3 до 1,3 мкц/мии (или от 18 о 80 мкм/час). На рис.3 приведено несколько примеров симмет-1чных меченых фрагментов молаул ДНК, отражающих работу двух илок репликации в одном решшконе. .

Обращают на себя внимание 3 факта: I) явно выраженные раз-вчия СкВР в разных репликонах; 2) высокая степень симметрии кВР в половинках одного репликона; 3) сохранение СкВР, свой-твенной данному репликону, на протяжении всего времени функ-ионлрования репликона. Это выражается в том, что размер сла-омечей~ых участков, образовавшихся за 2 часа, во всех приве-енных на иллюстрации случаях примерно в 2 раза больше, чем нтенсивно меченых участков, образовавшихся за I час. На рис.3| оказан рвшшкои, в котором в соответствии с протоколом меченья 30 + 150 млн) размеры интенсивно и слэбомеченых участков в обо-х половинках репликона составляют 20 и ПХккм, т.е. на протя-ении как первых 30 глин, гак и последующих 150 мин, цепь ДНК еплицировалась со скоростью 40 мкм/ч.

одт>9летер?9 мтш лвтаявд рр з ардз слторстргр <?Щ-

еза ДНК. Чтобы выяснить, с чем может быть связано существова-зе репликонов с разными СкВР, мы исследовали изменение средой СкВР в ДНК, реплицирующейся в разное время в течение 3 -[ериода.

Чтобы иметь возможность изучать клетки синхронно проходяще 5-фазу, использовали свойство диплоидных клеток относите-сьно синхронно проходить первый з-период после пересева стаци->нарной культуры на свежую среду. Выбор такой эксперименталь-юй модели определялся тем, что для изучения репликации ДНК в :одэ э -периода необходимо проведение опытов на интактной кле-

i i

Рис. 3. Радиоавтографы молекул ДНК из культуры клеток диплоидных фиоробластов человека.-Примеры одиночных симметричных репликоуов. ■ Та-е) - решшконы с одного препарата, режим включения двухфазной метки 60 + 120 мин; (t ) _ метка 30 + 150 мин.

точной системе, поскольку при воздействиях на метаболизм, цр меняемых дда синхронизации клеток (ФД7, избыток тимидина, ме татрексат и цр.) возникают существенные изменения в протекании процессов репликации (увеличение числа точек инициации репликации, смещение времени репликации порций репликонов и др.).

На рис. 4 приведена динамика синтеза ДНК в культуре пос ватальных фибробластов человека (штамм ШГ 65S) после nepect ва стационарной культуры на свекую среду (Рис.4). Можно ви-

, , ....,, . • . 1 i. <•■.;■.■■ • • . . \

. Л—i/ÍT.t

f . тп\ r •!. •

Рис. 4. Динамика синтеза ДНК в постнатальных флброблас-тах человека (штамм ИМГ-65Э) после пересева стационарной культуры. А: I - процент меченых клеток; 2 - суммарная радиоактивность клеток (шд/мин); 3 - ыитотичес-кии индекс. Б: доля клеток меченых в начале з -фазы (сплошная линия) и в конце з -фазы (пунктирная линия) в процентах от общего числа меченых клеток.

югъ, что включение 3Н-Т в клетки, определенное методом яид-юстной сцинтилляции, начинается на 15-16 ч после пересева. 1роцепт клеток, вступавших в s -фазу, и общая интенсивность включения 3Н-Т быстро возрастают, достигая максимума на 2226 ч. На 26 ч. появляются первые митозы (рис.4А). На рис.4Б показано изменение среди меченых клеток доли клеток с распределением метки, характерным для начала и конца s -фазы. Первые характеризуются диффузным распределением грзпул серебра над ядром, вторые - локализацией метки над глыбкамз хроматина. Можно видеть, что доля первых постепенно уменьшается, а доля вторых возрастает,начиная с 22 ч. Следовательно, мы имеем дело с относительно синхронным прохождением s -периода способными к пролиферации клетками. В трех вариантах данного опыта клетки, ■ выращенные в пенициллиновых флаконах, инкубировали с 3Н-Т высокой удельной активности в течение 30 или 60 мин, а затем -низкой удельной активности (150 или 120 мин), начиная с 18, 20 и 22 ч после пересева культур.

На радиоавтографах молекул ДНК измеряли размеры интенсив во меченых фрагментов и по ним определяли СкВР. Результаты представлены на гистограммах (рис.5). Бее гистограммы условно разделены на 3 части. Слева заштрихована доля меченых фрагмен тов, образовавшихся при СкВР менее 30 мкм/ч; заштрихованная часть гистограммы на правом фланге соответствует доле фратаен тов, росших со СкВР выше 50 мил/ч. Можно видеть, что деля фра тоентов, росших с низкими (менее 30 мкм/ч) скоростями, уменьшается со временем, составляя на 18, 20 и 22 час субкультивирования соответственно 43, 19 и 1%. Одновременно возрастает д ля фрагментов, образовавшихся при СкВР больше 50 мкм/ч, составляя 4, 15 и 43$. Описанные закономерности хорошо воспроизводятся в параллельных вариантах опыта (рис. 5 А,Б), различающихся только длительностью инкубации клеток с высокоактивным 8Н-Т. Хорошо совпадая в двух параллельных вариантах опыта, ср дние СкВР увеличиваются, составляя на трех последовательных отрезках s -периода примерно 30,40 и 50 мкм/ч.

Аналогичные результаты получены в двух других опытах, пр веденных на культурах эмбриональных фиброблаотов человека.

Таким образом, вопреки заключению Каппа и Пайнтера (1982 о неизменности средней СкВР в репликонах, работающих на развы отрезках S -фазы, мы на основании 3-х независимых серий экспе риментов, можем сделать вывод: средняя СкВР в репликонах возрастает по мере продвижения клеток по s -периоду. Причем это увеличение определяется постепенным уменьшением доли решш'ко-нов, ведущих.синтез ДНК с относительно низкими скоростями, и увеличением количества решшконов с высокими скоростями.

Параллельный анализ радиоавтографов молекул ДНК и интерфазных ядер позволяет заметить корреляцию между увеличением доли решшконов о высокими СкВР и долей клеток, в которых реп ликация протекает преимущественно в компактных глыбах гетеро-хроматнна. На этом основании возникло предположение, что репл коны с высокими скоростями репликации принадлежат генетически инертному гетерохроматину, реплицирующему в конце s -периода.

Тепминашя репликации молекул ДНК в отдельных репликонах Этот вопрос остается плохо изученным. Не вызывает сомнения, ч в ряде решшконов, точки инициации которых расположены на не-

Рис.5. Распределение размеров меченых фрагментов ДНК, образовавпшхся в точение 30 (А; или 60 (Б) мин инкубации клеток (фибробласты человека) с высокоактивным 3Н-Т при двухфазной метке. I - клетки метили на 18 ч после пересева; П - на 20 ч, Ш - на 22 ч. Заштрихованная часть гистограмм на левом фланге включает фрагменты со СкВР менее 30 мгал/ч, на правом фланге -более 50 мкм/ч. В каждом варианте измерено по 100 фрагментов.

о й « ¿0 Длина, пхп

'больших расстояниях на одном отрезке молекулы ДНК и работа ВР в которых осуществляется одновременно, терминация происходит в результате слияния движущихся навстречу друг другу ВР. Сторонники мелких репликонов, считают, этот механизм тер-мизации основным, если не единственным. Вместе с тем, коль скоро решшкативными единицами на уровне хромосом являются н, с С-блоки, перемежающиеся по длине хромосом и реплицирующиеся в разное время в течение з-периода, следует предположить, что по крайней мере на границах этих блоков додзиш существовать точки тер.шнации репликации. Сопоставляя размер меченого за определенное время фрагмента ДНК со скоростью движения в нем ВР (рис. 6), мы строили поля точек так, что точки расположенные вблизи биссектрисы представляли меченые фрагменты, "рост" которых продолжался в течение всего времени инкубации клеток с 3Н-Т со скоростью, определенной по размеру интенсивно меченого участка каждого фрашента. Точки,смещенные влево от биссектрисы, соответствовали репликонам, "рост" которых закончился раньше прекращения включения 3Н-Т в клетки, т.е. это - терминированные репликоны. На рис.7 показана терминированность репликонов при длительности инкубации 6 ч в зависимости от СкВР.

60 50 40

■СП 1 30 > 20

10 0

.. ий-"

Рис. 6. Корреляция между скоростью движения вилки репликации ДНК ( V ) и длиной меченых фрагментов (I ), образовавшихся в течение 3 ч инкубации клеток человека с зН-тимидином

20 ¿0 60 80 100 120 КО 160 180 1.МКМ .

ао

Я -

О И 33 НО Я 60 Ю Скорость движения ВР, ИКЫ/«

Рис.7. Зависимость терлинированности радиоавтографов молекул ДНК (РАМ ДНК) от скорости движения вилок репликации (В] Эмбриональные клетки человека инкубировали с меченым тими-дином в течение 1+5 ч (двухфазная метка). Фрагменты считал! терминированными, если В 6А (см.схему справа внизу) и не-терминированными, если В=6А. Варианты опыта: I - начало инкубации клеток с меченым тимидином на 15 и 18 ч после пересева, 2 - на 21 и 24 ч, 3 - на 27 и 30 ч, 4 - на 33 и 36 ч, В каждом из 4-х вариантов по 200 измерений.

Можно заметить, что чем выше СкВР, тем больше доля терминированных решшконов, и при включении метки в течение 6 ч терми-рованы пракигчески все репликоны, СкВР в которых 40 мкм/ч и более. Доля терминированных решшконов, полученная в разных опытах, как и следовало ожидать, оказалась тем выше, чем длительнее было включение 3Н-Т: при общей длительности мечения ДНК 2 ч терминированы около 25$ проанализированных фрагментов, при 3 ч - ок. 40$, при 5ч- ок. 60$, а при 6 ч - до 80$. В делом полученные данные позволяют сделать вывод о существовании; на молекулах ДНК точек терминации решшконов. Поскольку ранее ш привели доказательства в пользу того, что большая часть ДНК в клетках отвотных и человека реплицируется большими одиночными рэпликовами, мы должны признать этот способ завершения работы репликативных вилок преобладающим.

Таким образом, в результате исследования репликации ДНК генома человека и грызунов методом радиоавтографии молекул ДНК, мы получили подтверждение представления о полирепликонном характере процесса, о двунаправленное™ движения репликативных вилок от точки инициации репликации, о средней скорости движения репликативных вилок в клетках теплокровных животных и человека. Вместе с тем, полученные нами данные в корне изменяют представления о размерах единиц репликации. Ми нашли, что основная масса реплшшпов имеет размер 50-500 мхм и лишь в сравнительно небольшом проценте случаев образуются группы из 2-3 решшконов, одновременно функционирующих на одном отрезка молекулы ДНК. Полученные на'ли данные об увеличении средней скорости движения решппсативных вилок по мере прогрессии Б -периода, такяе вносят, изменения в сложившиеся представления о неизменной скорости движения репликативных вилок на протяжении

б-фазы. Изменения долены быть внесены и в представления о способе тершгаации функционирования решшконов. В противополо-аность утвердившейся точке зрения, что основной способ это -слияние соседних, движущихся навстречу вилок репликации, наши данные свидетельствуют о том, что значительная часть репликонов завершает функционирование, когда решшкативные вилки доходят до специализированных точек на молекулах ДНК, терминирующих репликацию.

СООТНОШЕНИЕ РЕПЛИКАЦИИ И ТРАНСКРИПЦИИ ДНК В ШТО-ТИЧЕСКОМ ЦИКЛЕ ЭУКАРИОТИЧЕСШ КЛЕТОК .

Для того, чтобы установить время репликации тотальной фракции транскрипционно активной ДНК в культуре клеток, мы ис пользовали метод гидролиза этой ДНК с помощью ДНКазы1. Работа была начала в 1978 году, вскоре после того, как был обнарджан феномен гиперчувствительности транскрипционно активной ДНК в составе хроматина к действию ДНКазы1 (\»е1п*гаиЪ, , СгошИпе, 1976). Наше внимание было сосредоточено на изучении чувствитв' льности к гидролизу ДНКазой1 фракций ДНК, реплицировавшихся в разные отрезки времени по ходу Б -периода. ДНКазой1 обрабатывали выращенные на покровных стеклах клетки, включавшие 3Н-Т в определенные отрезки з-фазы и фиксированные на тех же стеклах. Такой прием позволял нам на одних и тех же клетках определять чувствительность новосинтезированной ДНК' к ДНКазе1, а затем на радиоавтографах изучать пролпферативные характеристики данной культуон. Предварительно установили, что в наших экспериментальных условиях сохраняется специфичность гидролиза ДНК в составе хроматина фиксированных клеток, установленная в работах наших предшественников ( *е!^гаиь, СгошИпэ , 1976), изучавших хралатин и ядра, выделенные из нефиксированных клеток.

Рис. 8 характеризует степень синхронности прохождения первого периода синтеза ДНК после пересева стационарной культуры клеток крысовидного хомячка. Синтез ДНК начинается на 10-м часу. Постепенно процент меченых клеток возрастает до 6070. При этом с 10 до 20 ч. доля клеток с рисунком метки, соответствующим началу 13 , снижается с 50 до Ъ%, а затем снова начинает возрастать, что свидетельствует о появлении клеток, вступивших во второй цикл репликации. С 16 ч. заметно увеличивается доля клеток с меткой, локализованной в глыбках гетеро-хроматина (конец 8 ), составляя к 20-24 ч. более 40$ всех меченых клеток. Обработку ДНКазой1 в течение 5 мин проводили на препаратах, фиксированных на 11-22 часах после пересева культур клеток. Результаты, приведенные на рис. 9А, суммируют данные, полученные в трех независимых опытах. Можно видеть, что

Рис. 8. Динамика синтеза ДНК в культуре диплоидных клеток крнсовядного хомячка после пересева стационарной культуры. А: I - процент меченых клеток после краткой инкубации с меченым ткмидином; 2 - суммарная радиоактивность клеток на препарате; 3 - митотический индекс, прсшлле. Б: доля клеток, меченых в начале э-периода (сплошная линия) и в конце Б-периода (пунктирная линия) среда всех меченых клеток. Открытые и зачерненные кружки - данные из двух независимых экспериментов.

ч;

Рис.9. Гидролиз ДНКазой1 новосинтезированной ДНК по ходу

з -периода в культурах диплоидных клеток крысобидного хомячка ТА) и человека (Б). Разными значками обозначены данные, полученные в независимых экспериментах

на 10 часу, когда значительная часть новосинтезированной ДНК принадлежит клеткам, находящимся в начале Б -фазы ( ВЭ ), гидр лизуется около 205? меченой ДНК. На 21-22 ч. (ьз), когда репликация осуществляется преимущественно в структурном гетерохром тине, доля гидролизуемой ДНК резко снижается, составляя всего около 2%. Дополнительная 15-ти минутная обработка тех же препаратов ДНКазоЙ1 в еб -ДНК привела к гидролизу еще 12% ДНК, увеличив общее количество гидролизованной ДНК до 30$. В то же время, в 13 -ДНК дополнительная обработка практически не увел чила долю гидролизованной ДНК. После промывки в ТХУ удалилось всего около 0,6% меченой ДНК (табл.2).

Таблица 2

Сравнение устойчивости к ДНКазе1 новосинтезированной ДНК в клетках щюсовидного хомячка, инкубированных с 3Н-ти-мидином в течение 30 мин. в начале (ЕЭ ) ив конце ( ЬЭ ) 3-периода

Длительность обработки ДНКазой1, мин. Радикс активность препаратов, ' от контроля)

11-12 ч. пересева после 21-22 ч пос ле пересева

0 100,0 100,0

5 82,5 97,0

20 70,3 96,4

Аналогичные результаты были получены в культуре клеток г плоидных постнатальных фибробластов кожи человека. В этих кле тках з-фаза начиналась на 16-ом часу. В Еэ находились 75$ клеток, к 26 ч доля их снижалась до 25$. ьэ - клетки в заметном количестве появлялись на 22 ч и на 26 ч составляли около 4С$ меченых клеток. На 18, 22 и 26 ч при 5 мин обработки ДНК азойГ гидролиз ованной оказалось примерно 50, 20 и 155? нобосш тезированной ДНК, соответственно (рис. ЭБ). Таким образом, в этой серии опытов мы также обнаружили уменьшение доли быстро-гидролизуемой ДНК по мере продвижения процесса репликации по Б -периоду. Дополнительные данные о различиях в чувствитель-

гости к ДНКазе1 ДНК, реплицирующейся в начале 3 -периода, были юлучены при изучении кинетики переваривания ДНКазой1 новосин-гезированной ДНК на 18 и 26 ч. после пересева клеток. Приведенные в табл. 3 результаты показывают, что при увеличении времени гидролиза до 20 мин на 18 ч удаляется до 70$ метки, в то

Таблица 3

Кинетика гидролиза ДНКазой1 новосинтезированной ДНК в начале и в конце з -фазы клеток человека (штамм 747)

Длительность обра- Оставшаяся суммарная радиоактивность ботки клеток препарата, %

ДНКазой1, мин. -1-

18 ч после пересева ; 26 ч после пересева

0 100,0 100,0

I 99,7 -

2 82,4 96,4

3 81,3 93,2

5 45,7 84,4

7 61,7 -

10 56,0 77,4

15 26,3 -

20 29,6 82,1

время как на 26 ч увеличение времени гидролиза до 20 мин не приводит к дополнительному увеличению ТХУ-внмываемой фракции ДНК.

Таким образом, проведенные наш эксперименты по изучению чувствительности к ДНКазеХ новосинтезированной ДНК клеток кры-совидного хомячка и человека показали, что ДНК, реплицирующаяся в начале з -периода обладает значительно большей чувствительностью к ДНКазе1, чем ДНК, реплицирующаяся в конце Б -периода.

В настоящее время тлеются доказательства того, что участки хромосом, выявляемые как о -отрицательные (иле й ) полосы в метафазе, являются ранними репликантами. Кроме того, разными методами (гибридизация НК ±п вии , выявление мутаций генов в связи с включением в ДОК БДУ. гибридизация ДИК известных генов и нетранскрибируемых повторов с £3 и ¿¿-ДНК, анализ проявле-

»щл генов цри Х-аутосомных транслокациях.и др.), а также в результате нашего исследования чувствительности к ДНКазе1 ново-синтезированной ДНК в разные отрезки Б -фазы, показано, что в первой половине э -фазы реплицируется ДНК транскрибируемых генов. Сопоставление этих двух групп фактов позволяет заключить,4 что в Я -блоках метафазных хромосом сосредоточена в основном генетически активная (транскрибируемая) ДНК генома, и этот признак следует рассматривать как общее фундаментальное свойство организации эукариотической хромосомы.

Это позволяет нам с большим основанием утверждать, что все особенности релликонов, которые могут быть установлены для ДНК, реплицирующейся в ЕЗ , являются характерными для транскрипци-онно активной ДНК, а свойства репликонов, выявленные для заявляются характерными для гетерохроматической фракции генома.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНГИБИТОРОВ СИНТЕЗА ДНК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ РЕПЛИКАЦИИ ДНК В КЛЕТКАХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

Следующая задача нашего исследования состояла в изучении распределения актов инициации репликонов во времени по ходу з-периода. Нам представлялось весьма важным найти ответ на вопрос: происходит ли инициация новых репликонов постоянно в течение Б-периода или существуют некоторые ограниченные интервалы времени, в которые осуществляется сгруппированная инициация большого числа репликонов. В промежутках между такими интервалами синтез ДНК (определяемый по включению 3Н-Т должен был бы происходить в основном за счет элонгации молекул ДНК в функционирующих репликонах. Дая осуществления такого исследования мы должны были найти такие агенты, которые при определенных условиях достаточно эффективно повреждали бы инициацию репликонов не затрагивая другие параметры репликации (элонгацию, СкВР).

Это должны быть агенты, непосредственно взаимодействующие с молекулами ДНК в живой клетке и вызывающие определенные повреждения её. Как правило, агенты, повреждающие ДНК, обладают выраженным либо мутагенным, либо канцерогенным, либо цитоста-

гистическшл действием. Большинство известных мутагенов и многие цитостатики подавляют синтез ДНК. Наблюдаемое снижение зинтеза ДНК может определяться либо ингибированием актов инициации репликонов, либо снижением скорости движения решшкати-вных вилок, либо остановкой функционирующих вилок, либо сочетанием этих событий.

Мы остановили наш выбор на двух агентах: монофункциональном алкилирующем мутагене N-метил— И' -нитро- и-нитрозогуанв-дине (МННГ) и антибиотике с выраженным цитостатическим действием - блеомицине (БЛМ). Оба эти вещества активно используются с практическими целями (первый для получения мутантов у растений и бактерий, второй - в онкологических клиниках). Поэтому достаточно хорошо изучены свойства их молекул, механизмы взаимодействия с ДНК, в том числе и с ДНК в хроматине живых клеток. Кроме того, было известно, что проявление эффектов МННГ в клетке связано с процессом репликации ДНК и, как и для других монофункциональных алкилирующих агентов предполагалось, что подавление включения 3Н-Т определяется преимущественной ин-гибицией актов инициации репликонов. В отношении БЛМ было обнаружено врыаженное проявление радиомиметических свойств, что выражалось в спектре хромосомных аберраций, в специфической реакции клеток от пациентов с атаксией-телангиэктазией. Общепринятой точкой зрения на влияние ионизирующего излучения на репликацию ДНК является преимущественное (если не исключительное в определенном диапазоне доз) подавление актов инициации.

Нами было проведено комплексное исследование влияния МННГ и БЛМ на репликацию ДНК в клетках человека и некоторых грызунов (китайский хомячок, пашенная полевка). Изучены воздействия разных доз в широком диапазоне концентраций этих веществ и длительности воздействия на клетки в асинхронных и парасинхро-нных культурах, что позволило выбрать оптимальные режимы воздействия. Особенно важно для нас было изучить влияние МННГ и БЛМ на скорость движения репликативных вилок с использованием метода радиоавтографии молекул ДНК.

Действие МННГ на синтез ДНК в клетках грызунов. В табл. 4 и 5 приведены данные о влиянии МННГ на скорость движения вилок репликации в клетках пашенной полевки и китайского хомячка. Разница в использованных концентрациях МННГ (50 и 100 мкм для

Таблица 4

Влияние МННГ на скорость движения вилки репликации ДНК в клетках пашенной полевки

Кощ. МННГ. Средняя скорость движения репликатив-ной вилки* Общая интенсивность

мкМ мкм/ч достоверность отличия от контроля % к контр. синтеза ДНК (% к контролю) Э9Е

0 41,28+0,85 п = 638 100 100

50 35,55+0,58 п = 751 р^0,001 86 50

100 26,57+0,50 п - 782 р<: 0,001 64 25

х средние значения из двух опытов с длительностью метки 30 и 60 мин.

^определена по концентрационной кривой

пашенной полевки и 5 и 10 мкМ для китайского хомячка) связана с установленными нами различиями в чувствительности к МННГ этих клеточных линий. Результаты наших исследований показали, что при действии МННГ.наблюдается снижение скорости движения репликативных вилок. Уровень снижения зависит от действующей концентрации мутагена и коррелирует с общей интенсивностью ин-гибиции. Вместе с тем, снижение скорости движения репликативных вилок только частично определяет общее снижение включения 3Н-Т. На основании приведенных ниже рассуждений мы попытались оценить какая доля общего подавления синтеза ДНК может определяться повреждением актов инициации и остановкой функционировавших вилок репликации.

Известно, что длительность периода синтеза ДНК в клетках китайского хомячка равняется 7 ч. Это значит, что в асинхронной культуре клеток в течение I ч (время присутствия мутагена в среде) в работу должны включиться около 14$ общего числа

Таблица Ь

Влияние МННГ на скорость движения вилки репликации ДНК в клетках китайского хомячка

Конц. МННГ, мкМ

Средняя скорость движения вилки репликации ДНК

мнМ/ч

достоверность отличия от контроля

$ к контр.

Общая интен сивность синтеза1 ДНК (в % к контролю)

0 39,99+1,30 100 100

а = 251

5 41,45+1,49 р?0,01 104 87

п = 202

39,59+1,20 а = 210

р<0,01

репликонов (и столько же репликонов должны закончить свою работу) . Если предположить, что в присутствии ШНГ в среде ни в одном новом репликоне не начнется синтез ДНК, то общее включение 3Н-Т может снизиться не более, чем на 14$. В опыте при действии ШНГ в концентрации 5 мкМ мы получили снижение на 13$ (табл.5). Таким образом, можно предположить, что при концентрации МННГ 5 мхМ в клетках китайского хомячка подавление синтеза ДНК происходит в основном за счет ингибищш точек инициации репликонов. В другом варианте опыта (10 мкМ МННГ) подавление актов инициации и СкВР могло обеспечить лишь 25$-ное уменьшение включения 3Н-Т в клетки. В действительности оно снизилось на 57$. Значит мы должны предположить, что около 30$ включения 3Н-Т ингибируется за счет остановки вилок репликации. Если эти рассуждения распространить на клетки пашенной полевки (3 -период 5,5 ч), то получатся данные, представленные в табл. 6: при концентрации ШНГ 50 и 100 мкМ помимо подавления актов инициации (около 17$ их должно было вступть в работу в течение I ч) и снижения СкВР (на 14 и 36$) около 20$ снижения синтеза в обоих вариантах опыта следует объяснить ос-

Таблица 6

Вклад разных факторов (в процентах) в уменьшение включения зн-тимидина в ДНК клеток, обработанных МННГ в течение I ч

Клетки китайского Клетки пашенной Параметр хомячка полевки

Концентрация МННГ_

5 мкМ 10 мкМ 50 мкМ 100 мкМ

Общее подавление вклю-

чения 3Н-тимидинак(ОП) 13 57 50 75

В том числе за счет:

а) подавления инициации®5 14 14 17 17

б) снижения скорости дви-к жения вилки репликации^ 36

(ВР) 0 II 14

в) остановки вилок репликации /ОП-ТИР+ВР)/ 0 32 . 19 22

х I) данные из табл.4 и 5

определено на основе длительности Э-фазы (см.текст).

тановкой вилок репликации. Таким образом, проведенное нами комплексное изучение синтеза ДНК в клетках животных и человека при действии МННГ позволило показать, что в снижении включения 3Н-Т участвуют все три фактора: снижение СкВР, ингибиция актов инициации решшконов и остановка части работающих ВР. При этом вклад в подавление синтеза ДНК каждого из трех факторов разный при разной степени общего снижения включения 3Н-Т и различается г клетках разного происхождения.

Из приведенных данных ясно, что МННГ нельзя было использовать для решения стоявшего перед нами вопроса о распределении инициации решшконов в ходе Б-периода.

Изучение скорости движения ВР в клетках, обработанных бдрогяпшном. Как было отмечено выше, ШЫ больше других химических агентов обладает радиомииетическии действием. Зто должно проявляться в характере подавления синтеза ДНК. Однако до

сих пор не было показано, как это сделано в случае радиации, что БЛМ не влияет на скорость движения БР. Мы изучили с помощью метода радиоавтографии молекул ДНК СкВР при действии на клетки БЛЛ. В I серии опытов клетки эмбрион.мьного легкого человека инкубировали с высокоактивным 3Н-Т (50 мккюри/мл) в течение 30 или 60 мин в контрольном варианте и после инкубации с БЛМ в концентрации 20 мкг/мл в течение 2 ч. Во П серии ЁЛМ не удаляли из среда и 3Н-Т вносили в культуры на 30 или 60 мин по прошествии I часа после начала инкубации клеток с БЛМ. После проявления радиоавтографов (темновая экспозиция 3 мес., эмульсия " И£огс1 " К-5, Англия) были измерены длины меченых фрагментов молекул ДНК. Результаты приведены в табл. 7. Можно видеть, что во всех 8 вариантах опыта и контроля скорости движения вилок репликации практически одинаковы. Значит скорость движения вилок репликации не изменялась при действии БЛМ в концентрации 20 мкг/мл в течение 1-2 ч. В то же время общее включении 3Н-Т, определенное сщштилляцпонным методом в параллельно поставленных культурах на тех же сроках, оказалось сниженным на 35 и 36$ соответственно после I и 2 ч воздействия БЛМ. Таким образом, все подавление синтеза ДНК можно отнести за счет ингибиции актов инициации, поскольку опыт был поставлен на начале волны синтеза ДНК, когда в контрольных культурах происходит увеличение включения 3Н-Т.

Действие блеог.тацпна в разные интервалы времени синхроцрой волны синтеза ДНК. В соответствии с задачами нашего исследования был изучен характер подавления синтеза ДНК блеомицином по ходу з-периода, для чтобы выяснить, существуют ли интервалы времени, в которые проявляется повышенная чувствительность синтеза ДНК к бл'еомицину при синхронном прохождении клетками Б-периода. Для этого опыты проводили на первой волне синтеза ДНК после пересева на свежую среду стационарной культуры диплоидных клеток эмбрионального легкого человека.

В первом опыте была изучена динамика включения 3Н-Т в клетки, обработанные БЛМ в течение 2-х часов в начале 3-периода, с последующей заменой среды на среду, не содержащую БШ. В этом опыте клетки инкубировали с БЛМ (20 мкг/мл) на 21-23 и 21-26 часах после пересева, когда, как показывает включений 3Н-Т в контрольных культурах начинается вступление клеток в

Таблица 7

Размеры меченых фрагментов и скорость движения вилок репликации ДНК в контрольных и обработанных бпеоми-цином (20 мкг/мл) клетках

Инку- Число Ср.размер мече- Ср.скорость

Вариант бация изме- ных фрагментов движения,

с зн-т, рений (± БЕЙ), дел.„ ВР (+81М)

мин окулярн.шкалы^ мкм

1.Контроль-1 30 200 5,5*0.10 33,9+1,04

2.Контроль-1 60 225 11,6+0,25 36,6+0,78

З.БЛМ-1 30 200 6,0+0,14 37,2+0,86

4.БЛМ-1 60 200 12,0+0,31 37,2+0,96

5.Контроль-П 30 200 6,1±0,16 37,5+1,00

б.Контроль-П 60 200 П,7+0,26 36,3+0,81

7.БЛМ-П 30 250 12,1+0,39 37,5+1,21

к - I деление шкалы = 3,1 мкм

з-период (рис.10). Присутствие БЛМ в сриде с 21 по 23 ч полностью ингибирует прирост включения 3Н-Т, а следовательно, и вступление репликонов в репликацию. После удаления БЛМ из среды включение 3Н-Т в опыте возрастает со скоростью почти такой ;."е, как в контроле (рис.10, кривые I и 3, в интервале 23-27 ч). Скорость прироста-во втором варианте опыта (обработка БЛМ на 23-25 ч опыта) несколько меньше, чем в контроле. Тем не менее, напрашивается предположение, что из репликации оказываются выключенными только те акты инициации, которые были"гото-вы" к вступлению в работу в период присутствия ЕЖ в среде. Такую "готовность" можно предотавить себе, например, как возникновение шпилечных структур из палиндромов, свойственных сайтам инициации (см. напр., обзор Кав1 , 1979). Возможно, в структуре шпилек имеются однонитевые петли, особенно легко допускающие интеркаляцию молекулы БШ со всеми вытекающими отсюда последствиями. Исходя из этого мы поставили опыт, в котором БЛМ был внесен в параллельные культуры на 15, 18, 21 и 24 ч. и находился в среде в течение всего опыта в каждом варианте.

к 3,0

i'--

i2,0 '

i 1,5 I

" 1,0

1 0,5

! Рис. 10. Динамика вклы-I чения меченого толщина ! в клетки эмбрионального ' легкого человека поело I удаления блеомшоша из • среда. Время внесения и удаления блеомицина указано стрелками. Каждая точка - среднее из 4-х независимых определений, указаны доверительные интервалы. I и 2 - два варианта опыта, 3 - контроль.

20 22 24 26 28 30 ЕРШ ПОСЛЕ ШИЕШ КШОК, ч

На протяжении опыта с интервалом в 30 или 60 мин по 4 культуры в параллельных лунках инкубировали с 3Н-Т, чтобы определить суммарную интенсивность синтеза ДНК. Результаты этого опыта приведены на рис. II. В случав, когда ЕШ присутствовал в среде с 15 по 21 час, включение ЭН-Т оставалось на исходном уровне (рис. II,A-I). Во второй серии БЛМ находился в среде с 18 по 21,5 ч., когда в контрольной культуре продолжается вступление в работу новых репликонов. В присутствии БЛМ прирост включения 3Н-Т полностью ингибируется, и на протяжении последующих часов наблюдается спад включения 3Н-Т, что может быть объяснено постепенной тер,санацией уже работавших репликонов (рис. II.A-2). Эти же рассуждения полностью применимы к интервалу с 21 по 24,5 ч. В это время в контрольной культуре наблюдается второй пик, возможно отражающий вступление новой порции репликонов в работу. Этот пик не проявляется в обработанных БЛМ культурах (рис. II.A-3). На 24-26,5 ч в контрольных культурах осуществляется синтез ДНК в решшконах гетерохроматических участков генома. Возможно, что ингибиция актов инициации этих репликонов отражается в резком подавлении включения 3Н-Т на 2425 опыта (рис. II.A-4).

Результаты этого опыта позволяют сделать следующие выводы:

I) длительное присутствие БШ в питательной среде оказывает неодинаковое воздействие на синтез. ДНК в разные интервалы времени синхронного s-периода; 2) в присутствии БШ в среде в новых порциях репликонов не начинается синтез ДНК, что подтвер-вдает предположение о влиянии БШ на инициацию репликации; 3) постепенное снижение включения 3Б-Т отражает завершение элонгации решшконов, вступивших ранее в работу, и для разных реп-ликонов это время составляет от одного до нескольких часов.

На рас. II,Б показано снижение включения 3Б-Т в четырех вариантах опыта в процентах от контроля. Можно видеть, что во всех случаях имеется интервал времени, когда происходит резкое подавление синтеза ДНК (крутая составляющая графика). Ш полагаем, что это связано с' обогащением определенных интервалов S-периода шицпацвями новых репликонов, которые ингибируются блеомицином. Более пологая составляющая может определяться в основном элонгациями и постепенными терминациями решшконов. -В вариантах 2 и 3 в первые полчаса эффект ингибиции синтеза ДНК отсутствует. Проекция крутых участков кривой на ось або-цисс дает четыре интервала времени по ходу s-периода (рис.11, Б), которые,1 по-видимому, характеризуются инициацией групп решшконов. (Эти интервалы времени соответствуют Ii3,5-I8; 18,5-19,5; 21,5-22,5; 24-25 ч). Заметим, что отрезки времени I, П и Ш соответствуют восходящим участкам включения 3Н-Т в контрольной кривой (рис. II,А-5). Надо полагать, что четвертый пик на участке 24-25 ч не проявился в данном опыте из-за цре-обладания актов терминации в репллконах, инициировавшихся на 21-22 часах, над инициацией новой порции репликонов.

Таким образом, на основании экспериментальных фактов и проведенных рассукдений, мы получили данные в пользу неравномерного распределения актов инициации решшконов в ходе синхронного периода синтеза ДНК и выделили на протяжении десятичасового s-периода клеток человека четыре дискретных отрезка времени, в которые осуществляются сгруппированные инициации порций решшконов. В промежутках происходит преимущественно элонгация и термднация решшконов. Эта события определяют неравномерность суммарной интенсивности синтеза ДНК в течение

Б-периода, которую наблюдали исследователи, изучавшие синтез .¡¿¡¡К в синхронных диплоидных культурах клеток ( Klevecz, Kapp,

s 1

et и

к •

я J >

s ,«

ь ч 1 1 .

s ;«

я: ' i i

яз

X о

ег п

а & i

« к я

m «

ил

Время после пересева клеток (час)

Рис. II. Динамика включения Н-тимидина в клетки эмбрионального легкого человека в присутствии йдеоыи-ццна (20 мкг/мл) в среде в разные интервалы синхронного • 3-периода в абсолютном (А) и относительном (Б) выражении. А - стрелками указано время внесения йиеомишша в четыре варианта опыта (1-4), 5 - контроль. Каждая точка - среднее из 4-х независимых определений. Указаны доверительные интервалы.

1973; Kapp Pointer . 1977, 1982; Дулатова, Ляпунова, 1985). Мн можем предполагать, что каждая порция раздельно инициирую- -вдахся реплик онов принадлежит ДНК определенных фракций хроматина, выявляющихся на метафазных хромосомах как r , g и С-блоки при соответствующих дифференциальных окрасках. В многочисленных работах цатогенетическими методами установлено, что существует определенная последовательность вступления в репликации ДНК: сначала в н , затем в G и в конце s -периода - в скобках (zakha- . rov , Egolina , 1976 и др.). ВЬцрление в нашем эксперименте четырех групп решшконов может означать, что либо н , либо о -блоки должны быть подразделены на две подгруппы, отличающиеся функциональными, структурными и, как следствие, решшхатгвными свойствами.

Клесте о тем, установление факта существования на протяжении s-периода сгрушшрованности актов инициации решшконов и интервалов времени, в течение которых происходит в основном элонгация и терминация синтеза ДНК в решшконах,1 не согласуется с широко распространенными представлениями об .организации репликации ДНК в клетках человека д еивотных в кластерах (тандемах) мелких (в среднем 30-50 мкм) реплик он ов (Hand , 1978). Чтобы бил обеспечен непрерывный синтез ДНК, необходимо постоянно на протяжении s -периода включение в работу новых кластеров решшконов, что противоречит нашим данным. Более правдоподобным является представление о больших решшконах (50-500 мкм), существование которых обосновано в наших работах' с 'Ю.В.'Юровыы (Yurov, Liapimova , 1977; Ляпунова, 1985). Действительно, если группа репликонов инициируется в течение ограниченного интервала времени, а затем осуществляется элонгация цепей со скоростью 0,5-ü,ь ыкмДшн, то терминация решшконов разного размера (50-500 мкм) должна прои' ходить постнпенно в течение 1-6 часов".

Таким образом, установленный нами на основе анализа воз-дей ствия БШ на синтез ДНК на протяжении S-периода, факт сгру-ппированности актов инициации порций решшконов, позволяет обосновать выбор из двух альтернативных гипотез решшконной организации генома животных и человека. Это, в свою очередь, важно дак гК>орыулировки задач изучения генетической регуляции последовательной репликации ДНК в структурно и функционально различных частей генома.

МОДЕЛЬ ОРГАНИЗАЦИИ РЕШШКАЦИИ ДНК ГЕНОМОВ ЖИВОТНЫХ .

И ЧЕЛОВЕКА (ГИШША)

Задача этого раздела работы - на основе собственных данных и данных критического анализа литературы, предложить,схему организации репликации ДНК генома человека и теплокровных животных и обсудить некоторые следствия, вытекающие из развитых представлений.'

Чтобы описать репликации ДНК генома во времени, надо охарактеризовать (I) размер единиц репликации (решшконов), (2) скорость движения вилок репликации (СкВР), (3) положение то чей инициации (ТИР) и терминации (ТТР) регашкавд на молекуле ДШ; (4) согласованность работы решшконов во времени.

Известно, что в гаплоидных геномах большинства теплокровных животных и человека содержится около 3,5 пкг (или около 90 см) ДНК. В клетках человека она организована в 23' парах хромо-' сом. На каждую хромосому приходится молекула ДНК дайной 2-6 см. Универсальным свойством хромосом большинства высших животных является чередование по их длине блоков хроматина с контрастными свойствами. В ранней профазе митоза в гаплоидном наборе хромосом человека удается определить 2000-3000 отдельных й , « и С-блоков ( ГШ113 , 1979; Вак еЬ а1"., 1981). Это значит, что средний блок содержит отрезок молекулы ДНК длиной всего около 300-450 шеи. Репликация ДНК осуществляется в фазе, длительность 'которой в разных клетках соматических тканей теплокровных животных (кро^е ранних эмбриональных) составляет. 6-10 ч.

' Репликация ДНК генома человека мажет быть описана следующим образом (гипотеза). Репликация отрезков молекул ДНК, соответствующих' отдельным структурно-функциональным блокам осуществляется большши (до нескольких сотен микрон) .одиночными решшконами или синхронно работающими группам из 2-3 решшконов. В начале з-периода происходит инициация решшконов во воех к -блоках хромосом. В последующие 3-4 ч 3 -периода осуществляется элонгация и постепенная терминация первой порции репликонов ( 3 . На 3-4 часу 3.-периода инициируются решш-коны в ^-блоках хроматина ( ^^ в конце з-периода (на 6-7 часу) в репликацию вступаю^ С-блоки (3 3). Терминация решшконов внутри блока (в случае, если работает не один, а два-три

решшкона) осуществляется слиянием встречных ЕР. На границах разноименных блоков {R , G , С), реплицирующихся в разные отрезки s-фазы (Sj.,^2» S3)* BP останавливаются , доходя, до специализированных точек терминации репликации.

Описанные события изображены на схемах (рис. 12 и 13). В первом случае (рис. 12) представлена репликация на уровне линейных молекул ДНК, во втором (рис. 13) - на уровне метафаэ-ной хромосомы. В связи с предложенной схемой должны быть прокомментированы некоторые положения.

Основными посылками предложенной модели являются: (I) сгруппированная инициация больших порций репликонов в ограниченные отрезки s -периода; (2) существование решшконов больших размеров, таких, что для завершения репликации их с известными скоростями движения ВР требуется до 2-4 и более часов.

Факторами, обеспечивающими инициацию массы решшконов, могут быть: (I) различия структуры фракций хроматина и доступность их ДНК белкам-инициаторам репликации (БИ); (2) различия самих БИ и их способность инициировать потенциальные точки инициации репликации (ТИР) только в определенных фракциях ДНК; (3) различия в количестве БИ (при их однородности) в начале, ' середине, конце s -периода (кацример, в результате'ква-нтированной транскрипции одних и тех же генов), и одновременно различия в свойствах ТИР в разных фракциях ДНК. Например, одни ТИР - в транскрибируемом хроматине - легко инициируются и для их включения в работу достаточно немногих молекул БИ; другие - в € и С-блоках хроматина - труднее инициируются и требуют большего количества БИ. Каждое из этих предположений -требует экспериментальной проверки. В настоящее время имеются указания как на существование различий в.молекулярной структуре ТИР (ARS I и ARS 2 последовательности в геноме дрожжей, Pangman e't al. , 1983), так и на присутствие в цитоплазме в разные отрезки времени s -периода разных ЕИ у миксомицета Ehy-earum polycepbalua (Wille, Kauffman , 1975).

Возможно, что взаимодействие БИ и ТИР молекул ДНК в начале s -периода определяется или облегчается присутствием РНК-' полимеразы (или специфической конформацией транскрибируемой ДНК). Тогда' с этим может быть связана репликация в начале s_

Рис. 12. Схема репликации участка молекулы ДНК, формноукь иего 3 блока (-G.K ,С) (I) ила какого-то одного блока при большем масштабе (II). На схеме I показаны 7 состояний молекулы ДНК. В Gl рисками обозначены потенциальные точки шшциацаи решщкацаи. влечение отдельных из них в работу (указаны стрелкам) - случайное собцтде. Вначале (sl) инициируются оешшкош в К-блоках, затем (°2 ) в G-блоках, в конце' - в СС-блоках. ВР останавливаются, • доходя до точек гарминации репликации (TP) на границах блоков, или пои слиянии ВР соседних репллконов в пределах одного блока (на схеме I -f случае Р--блоха ц на схеме 116-2,3). На схема IIa показаны -1 последовательные варианта расположения меченых фрагментов на .молекуле ДНК при функционировании одной точка инициации, . -

на схеме Пб - 5 ва-оиантов ши шункциониоовании двух точек инициации. Обозначения: тонкие липни* одиночные - молекулы ÄiiK до репликации; двойные - после оепдикации; жирные .танца - интен-елв'.чая метка на радиоавтогоафах; точечные - слабая метка.

sc:'. : ' Ь-

а-£

Рис.13. Схема организации репликации хоомосош в течение 3-пе-риода. Горизонтальными линиями показано тшсло решшконов, с помощью которых рсшшциоувтся отдельные функциональные блоки по длине'хромосомы и время, в течение которого функционирует репликон. Остальные объяснения в тексте.

периода транскрибируемой части геноца. Процесс репликации это!, части âiK идет параллельно о транскрипцией (см. Nagl , 1Э87). Можно предположить, тао конкуренция между этими'процессами является причиной относительно низкой скорости движения BP в начале 3-периода.

' В любом случае модель предполагает, что начало репликации ДНК в готовой к вступлению в s-фазу клетке определяется появлением белка-инициатора. Репликация следующих порций реп-ксшок, принадлежащих G и С-блокам хромосом, связана с синтезом MpfiK и появлением нового БИ (или новой порции того же БИ). •

На основе модели можно понять связь между средней скоростью движения BP и длительностью s-периода. Нами было замечено, что у теплокровных животных увеличению средней скорости движения вилки репликации сопутствует сокращение S-периода. Можно предположить, что инициация новой порции решшконов происходит после завершения работы основной массы решшконов предыдущей порции (это может быть связано, например, с высвобождением достаточного количества молекул репликативных комплексов). Показано, что размеры единиц репликации не различаются, например, в клетках человека и китайского холш чка, а ср. СкВР у китайского хомячка несколько выше, чем у человека (0,8 и 0,6 мкм/шш, соответственно), оначит, завершение репликации каждой фракции репшасоноз требует меньшего времени, в результате сокращаются интервалы между вступлениями в работу 3-х фракций (sj, s2 31 s 3) и сокращается S-период..

В работе приведены доказательства увеличения средней скорости движения BP в ходе s-периода. То,что активно транскрибируемая ДНК реплицируется в начале S-периода с относительно низкими скоростями движения BP, мажет иметь большой генетический смысл, так как чем ниже скорость полимеразной реакции, тем меньше вероятность ошибок репликации. Напротив, цри больших скоростях репликации можно ожидать повышенную вероятность ошибок. Возможно, это является одной из причин высокой изменчивости н/хслеотадного состава ДНК гетерохроматина и гетерогенности еа даже у родственных видов.

Согласно наиим данным, скорость движения BP остается по-

зтоянной в течение всего времени работы данного реплик она [вплоть до 5-6 ч, т.е. большей части S-фазы). Это начет слу-щть аргументом в пользу того, что СкВР определяется скорее гарактером хроматина, в составе которого находится решшкон, чем внутриядерными условиями, такими, как пул нуклеотидов или количество ферментов и других молекул, участвующих в репликации. Согласно имеющимся данным, количество предшественников и активность компонентов решщкатнвного комплекса заметно изменяется в ходе периода синтеза ДНК. Схема решшкации гея о;..а (см. рис.13) предполагает возможность частичного перекрывания времени работы решшконов, принадлежащих разным фракциям хроматина. Этим может объясняться то, что в каздый отрезок s-фазы ш находим решшконы, СкВР в которых варьирует в широком диапазоне. "Приведенные рассуждения подтверждаются наблюдениями Ю.Б.Црова, который изучил СкВР в релликонах из одиночных клеток человека и показал, что в пределах одной клетки существуют решшконы с разной СкВР, хотя диапазон различий меньше, чем в ткани в целом (Yurov , 1980).

Модель позволяем интерпретировать хорошо установленный факт неравномерности интенсивности синтеза ДНК в ходе s-пери-ода человека и животных и проявление трех (иногда четырех) пиков включения 3II-T (Klevecz , 1959; Klevecz, Kapp , 1973; Kleveca et al. , 1974,1975; Kapp et al. , 1979; Kapp, Paintor, 1977,1982; Holmqnist et al. , 1982 и мн.др.). Действительно, одновременное включение в репликацию большой порции решшконов размером 50-500 ыкм должно выражаться в резком увеличении включения 3ii-T, а постепенная терминация решшконов в зависимости от ах размеров -.в спаде интенсивности общего синтеза, йшци-ация новол порции вызывает новый подъем и т.д. Три, как правило, выраженных пака соответствуют репликации ДНК в в , о , С-блоках хромосом. 4-ый подъём нередко выявляющийся в виде сравнительно небольшого пика (выраженного как "ступенька" на левом фланге 1-го пика в начале S ) макет отражать самую раннюю репликацию относительно небольшой порции наиболее активно транскрибируемых генов (таких, как гены оРНК; гистонов и монет быть некоторых других).'

Сотрудником кафедры общих проблем управления Механико-ма-

тематического факультета ?ЯТ им. Ы.В.Ломоносова, Г.Ю.Дапковым и студентом-дипломником И.В.Гончаровш на основе совокупности наших данных была построена стохастическая модель динамики синтеза ДНК в клетках человека, и в машинном эксперименте получены хорошо выраженные 3 пика (были заданы условия для репликации 3-х фракций хроматина) интенсивности общего синтеза ДНК, весьма похожие на полученные в опытах на метках (см. цитированные вше работы). Авторы пришли к выводу, что полученный ш. результат делает проверяемую гипотезу весьма вероятной и дает основания дая предпочтения этой схемы организации репликации генома человека в сравнении со схемой Хюбермана-Рпгса (Гончаров, дипломная работа, МГУ, М., IS87).

Предложенная модель реплшсации генома человека и жквотнт позволяет интерпретировать все многообразие рисунков мечених молекул ДНК на радиоавтографах после разных режимов введения метки.

Некоторое с~е.ттетвгя, уытекатгте из молола;. Предложенная модель репликации генома человека и животных, позволяет уточнить задачи поиска генетических механизмов регуляции последовательности функционирования реиликопов. Представления о существовании кластеров келквх решшконор, работа которых завор-пается за 20-60 мин, заставляют предполагать присутствии в каждом кластере "внутренних часов" - специфических последовательностей, контролирующих время репликации участков ДНК в S — периоде. Только так мат.но объяснить известные факты о сохранении в череде клеточных поколений последовательности репликации определенных частей генома и конкретных генов. Такие предположения но раз высказывались разными авторами (см. например, Goldman et ai. , 1984; Calza et al. , 1984). Согласно нашим представлениям, достаточно предположить существование всего трех (четырех) разных типов БИ, появляющихся в клетке в разное время, либо разные свойства ТИР в трех (четырех) фракциях хроматина. Следовательно, внимание должно быть сконцентрировано на выяснении вопросов, существуют ли различия сайтов инициации во фракциях ДНК Н , G и С-блоков хромосом? Есть ли разные формы белков-инициаторов, изменяется ли их количество в клетке в разные отрезки S-фазы? Выяснение вопроса, сколько

ТИР работает в каждом цикле репликации генома, может помои, разрешении спора о размерах единиц репликации. Алътернативш.о гипотезы (Хюберглана-Риггса и наша) предполагают различия на порядок величин: при среднем размере решшкона 30 шал следует сшадать в гаплоидном геномо до 30 тис. репликонов (посколыц общая длина молекул ДНК - S00 ООО мкм), против 3,5 тыс. по нашил представления;.! (если средний размер решшкона 250 мкм). При этом число одновременно работающих ЕР (а, следовательно, и количество репликатпвных комплексов) должно различаться лгл j. немногигл более чем вдвое. Дело в тем, что по схеме Хюбермана-Риггса одновременно должны работать порции примерно по 3 тыс. репликонов. Чтобы обеспечить непрерывность синтеза каждый час должны инициироваться новые 3 тыс, репликонов, тогда за 10 ч 5-периода осуществиться репликация всей ДНК. Согласно насей модели, в каждый момент можно обнаружить на геном окаю I2C0 работающих репляконов. Новые порции репликонов включаются всего в 3 приема (если оставить з стороне сравнительно небольшую 4-ю порцию в самом начато S ), и общее число репликонов не превышает 3,5 тыс. Таким образом, если будут разработаны экспериментальные подходы для определения общего числа ТИР, включающихся в работу на протяжении всего з-периода, и числа репликатпвных вилок, работающих в ядре одновременно - могут быть полугены новые данные для проверки предложенной модели.

Другое следствие связано с установленным нами фактом уве-личе1шя средней скорости движения BP в ходе s-периода. Этот момент должен учитываться при сравнении СкВР в клетках разного происхождения, например, от пациентов с разнили формами наследственной патологии и от здоровых доноров.

При сравнительном изучении СкВР в разных линиях клеток надо иметь уверенность в том, что либо в сравниваемых популяциях клеток синтез ДНК протекает асинхронно, либо что они находятся в одинаковой стадии 5 -фазы. Это может быть обеспечено либо цитологическим контролем клеточной популяции, либо параллельным анализом динамики синтеза ДНК в культуре, характеризующим прохождение клеток по s -периоду.

Отметим в заключение, что, несмотря на то, что основной использованный в нашей работе подход к изучению репликации ДНК высших эукариот - метод радиоавтографии молекул ДНК - за 2 де-

сятилетия позволил существенно заполнить брешь между нашими знаниями о закономерностях репликации ДНК на уровне хромосом и интерфазного фцра, с одной стороны, и молекулярными механизмами репликации ДНК, с другой, много вопросов остаются еще открытыми. Мы надеемся, что предложенная нами модель репликонной организации генома принесет пользу в окончательном решении этой важной проблемы генетики высших организмов, и в тш числе - человека.

ВЫВОДЫ

1. Репликация ДНК гендаа теплокровных животных и человека осуществляется путем функционирования единиц репликации (репли-конов), размер основной массы которых лежит в пределах 50-500 мкм. Поскольку известно, что в геноме человека содержится 2-3 тыс, структурно-функциональных блоков, выявляемых на цитологических препаратах хромосом как И, с и С-блоки, и каждый индивидуальный блок содержит в среднем молекулу ДНК длиной 300450 мкм, репликация ДНК в пределах одного блока осуществляется одним или двумя-тремя решшконами.

2. Отдельные репликоны функционируют б течение от 0,5 до 6 ч (основная масса - 3-4 ч). Это время определяется размером репликона и скоростью движения репликативных вилок. В разных репликонах клеток человека скорость движения репликативных вилок варьирует в пределах 0,2-1,0 мкм/мин (ср.знач.О,6 мкм/мин), а в клетках китайского хомячка - 0,3-1,2 мкм/мин (ср.знач. 0,8 мкм/мин). Скорость движения вилки репликации сохраняется постоянной в течение всего времени функционирования данного репликона .

3. Е течение б -периода значение средней скорости движения вилок репликации возрастает. Это связано с постепенным уменьшением доли репликонов с низкими скоростями движения репликативных вилок и увеличением - с высокими.

4. На молекулах ДНК существуют точки терминации репликации, доходя до которых решткативные вилки.прекращают функционирование. Предполагается, что точки терминации могут быть локализованы на границах между соседними структурно-функциональны-^ ми блоками хромосом.

5. Акты инициации репликонов распределены на протяжении

S-периода неравномерно. В ходе 10-часового s-периода клеток человека существуют 4 дискретные интервала времени, в которье происходит сгруппированная инициация порций решшконов. Предполагается, что в промежутках между этими интервалами осуществляется элонгация молекул ДНК и терминация решшконов.

6. На основе анализа гидролизуемости новосинтезированной ДНК ДНКазой1 получены новые доказательства связи транскрипционной активности фракций хроматина с порядком их репликации: чем выше транскрипционная активность ДНК, тем ран£ше эта ДНК реплицируется в з-периоде.

7. Предложена модель репликонной организации генома теплокровных животных и человека,согласно которой в течение s-no-риода в трех или четырех дискретных интервала времени сгруппировано и последовательно осуществляется инициация функционирования решшконов, принадлежащих одноименным структурно-функциональным блокам ( r , и, С-блоки хромосом; возможно, что

R или G-блоки с этой точки зрения должны быть подразделены на 2 фракции). В течение 2-4 ч после инициации осуществляется элонгация ДНК больших (50-500 мкм) репликонов и постепенная их терминация. На основе модели легко объяснить такие факты как неравномерность интенсивности сиптеза ДНК на протяжении s -периода, зависимость между средней скоростью движения вилок репликации и длительностью 3 -периода и др. Модель позволяет сформулировать конкретные задачи изучения генетической регуляции порядка репликации частей генома я механизмов инициации решшконов .

Список оабот. опубликованных по теме диссертации

1. Зосимовская А.И., Ляпунова H.A. Продолжительность митоза и отдельных периодов митотического цикла в первичной культуре эмбриональных фибробластов человека //Цитология.- 1966.-Т.8. № 2.- С.208-215.

2. Юров Ю.Б., Ляпунова H.A.Скорость репликации ДНК и размеры решшконов в диплоидных клетках человека // У Всес.симпоз, "Структура и функции клеточного ядра".Тезисы сообщ.- Новосибирск, 1975.- С.133-134.

3. Liapunova N.A., Yurov Yu.B. Molecular cytogenetic analysis of DKA replication in human cells //Syrap. Med.Genetics, De-brecen-Hajdúszoboszló, 1976. Abstracts. S.L. - P.30-31.

4. LpoB Ю.Б., Ляпунова H.A. Скорость репликации ДНК и размеры решшконов в диплоидных клетках человека // Молек.биол.-1976.- Т.10, № 5,- C.I085-I093.

5. Yurov Yu.B., Liapunova H.A. The unite of DNA replication in the mammalian chromosomes: evidence for a large size oí replication units // Chromosome. - 1977. - V. 60, N0 1,-P.253-267.

6. Ляпунова H.A., Хаитова H.M. Зависимость длительности периода синтеза ДНК от скорости движения вилки репликации в культурах клеток млекопитающих и человека // Доклады АН СССР.- 1977.- Т.236, №4.- С.994-996.

7. Ляпунова H.A., Хаитова Н.М. Увеличение скорости репликации молекул ДНК в ходе s-периода в диплоидных клетках человека // Х1У Международный генетический конгресс. Тезисы секционных докладов, 4.1. М.: Наука, 1978.- С.368.

8. Хаитова Н.М., Ляпунова H.A. Различная скорость репликации ДНК по ходу s-периода в эмбриональных фибробластах человека // Общая и медицинская генетика. Ташкент, 1979. - С. 1218.

9. Ляпунова H.A., Хаитова Н.М. Некоторые черты организации репликации генома млекопитающих в ходе s-периода // 1У Всес. симп. "Молекулярные механизмы генетических процессов".М., 1979.- С.20-21.

10. Ляпунова H.A., Хаитова Н.М. Репликация ДНК активных генов в геноме млекопитающих в начале s -периода // Доклады АН СССР.- 1979.- Т.244, ií 4.- C.9S7-ICGQ.-

11. Хаитова U.M., Япьира Г.С., Ляпунова H.A. Организация репликации генома млекопитающих: данные о высокой скорости репликации ¿HK в репликонах структурного гетерохроыатина // Цитология.- 1980.- Т.22, № 6. - С.640-645.

12. Хаитова Н.М., Ляпунова H.A. Чувствительность новосинтези-рованной ДНК в культуре диплоидных клеток человека к действию ДНКазы I // Тезисы УП Всес.симп. "Структура и функции клеточного ядра". Харьков, 1980.- С.178-179.

. Ляпунова H.A., Юров Ю.Б. Ропликационная организация гонома эукариот // Докл. М01ТП. Сер. "Общая биология". М.: Наука, IS8I. - С.90-93.

. Ляпунова H.A., Дулатова Ш.Н., Берндт Б. Влияние метилни-тронитрозогуанидина на репликацию ДНК в культуре клеток пашенной полевки // 17 съезд ВОГиС им. Н.И.Вавилова. Тезисы докладов. Кишинев: Штиинца, IS8I. - С.119.

. Ляпунова H.A. Организация репликации генома высших организмов // IУ съезд ВОГкС пм.Н.И.Вавялова. Гезясц скмио;.. докладов. М..-Наука, 1982. - С.28-30. Ляпунова H.A., Хаитова Н.М. К репликации гонома млекопитающих // Молекулярные механизмы генетических процессов. М.:Наука, 1382.- С.49-55.'

Ляпунова H.A. Репликация ДНК хромосом человека в норме и патологии // I Всесокз. съозд медицинских генетиков. Тезисы докладов. !.!., ISB3.- С.206-207.

¡. Дулатова Ш.Н., Лаврушяна О.М., Ляпунова H.A. Влияние предобработки низкими дозами мутагена (МННГ) на ход восстановления синтеза ДНК, поврежденными высокими дозаг.зд мутагена // I Зсес. съезд медицинских генетиков. Тезисы докладов. М., 1983.- С.110.

3. Ляпунова H.A., Дулатова Ш.Н. Различие чувствительности синтеза ДНК по ходу 3 -периода к действию алкллирующего мутагена метилнитронлтрозогуанидина // Инфорл. бюлл. Совета по проблемам радиобиологии, 1983.- Вып. 28. - С.57-58,

Э. Ляпунова H.A., Дулатова Ш.Н. Снижение скорости движения вилки репликации при действии метилнитронитрозогуанидина// У Всес. симп. "Молекулярные механизмы генетических процессов". Тезисы'докладов. М.: Наука, 1983.- С.37.

1. Дулатова Ш.Н., Ляпунова H.A. Влияние метилнитронитрозогуанидина (МКНГ) ка синтез ДНК в культуре клеток человека и животных // Х1У Ежегодная конференция Европейского общества по мутагенам внешней среды. М., 1984.- С.136,137.

2. Ляпунова H.A. Репликация. БМЭ.- Т.22.1984.-С.203-205.

3. Ляпунова H.A., Лаврупшиа О.М., Дулатова Ш.Н. Использование блеомицинэ для демонстрации сгруппир'ованности актов инициации репликации ДНК в s-фазе митогического цюсла в

культуре клеток человека // УШ Всес. сига. "Структура и функции клеточного ядра". Тезисы докладов. Пущино, 1984.' С. 269-270.

24. Ляпунова H.A. Реплкконная организация генома высших орга низмов. Критический разбор фактов и гипотеза // Биополимеры и клетки.- 1985.- T.I, № 5. - С.277-283.

25. Дулатова Ш.Н., Ляпунова H.A. Действие метилнитронитрозог анидива (ШШГ) на синтез ДНК в клетках гшвотннх и челове ка. Подавление синтеза ДНК в асинхронных и синхронных кз льтурах клеток // Молекул.генетика, микробиол,, вирусол, 1985.- № 9.- С.23-27.

26. Ляпунова H.A., Юров Ю.Б. Доказательства существования т< чек терминации репликации ДНК, полученные методом радиоавтографии молекул ДНК клеток человека // IX Всес. симп "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка, 191 - С.236.

27. Лаврушина О.М., Ляпунова H.A. Подавление синтеза ДНК в льтуре клеток человека противоопухолевым антибиотиком б омицином // I съезд медицинских генетиков УССР, Тезисы докладов. Львов, 1988.- С.148-149.

28. Liapunova H.A., lavrushina О,M. Effect of antituaor ап1 biotic bleomycin (В1ш) on DNA replication in human celJ XVIII Ann. Mooting EEMS. Varna, 1988.- P.

29. Ляпунова H.A., Лаврушина O.M., Терехов C.M. Влияние бл? мицина на синтез ДНК в клетках человека: доказательств! сгруппированности актов инициации решшконов в s-пери» // Молек. генетика.- 1989.- № I.- С.34-39.

30. Ляпунова H.A., Дулатова Ш.Н. Действие метилнитронитроз. гуанидина на синтез ДНК в клетках животных. Снижение с: рости движения вилки репликации ДНК после действия МНН Молек. генетика.- 1989.- № 2.- С.

участок множительной техники

ПОДП.К ПЕЧАТИ 14.3.89 Л - 16204 3AK.223 ТИРАЖ 100

Информация о работе

Ляпунова, Наталия Алексеевна
доктора биологических наук
Москва, 1989
ВАК 03.00.15

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Организация репликации генома теплокровных животных и человека ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Организация репликации генома теплокровных животных и человека"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Организация репликации генома теплокровных животных и человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика