Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурной реорганизации дивергентной области максикольцевой кинетопластной ДНК Leishmania major

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурной реорганизации дивергентной области максикольцевой кинетопластной ДНК Leishmania major"

На правах рукописи

Флегонтов Павел Николаевич

Исследование структурной реорганизации дивергентной области максикольцевой кинетопластной ДНК Leishmania major

03 00 03 - Молекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нат

ии344ВУБЗ

Москва 2008

003446953

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета имени M В Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук, профессор Колесников Александр Александрович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Крамеров Дмитрий Александрович Кандидат биологических наук Кульбачинский Андрей Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт общей генетики РАН

Защита состоится 11 вНуЯл^Ч^Л 2008 г. в fi" _ на заседании диссертационного совета Д 501 001 76 при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени АН Белозерского, ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени MB Ломоносова

Автореферат разослан « ^ » Ce&bVYbfidyLdi 2008 г Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

И А Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы:

Leishmania major - паразитическое простейшее, относящееся к группе Trypanosomatidae Все представители данной группы - моноксенные или дик-сенные паразиты, наиболее частыми хозяевами которых являются насекомые и позвоночные Многие виды вызывают тяжелые заболевания человека и домашних животных (кожный и висцеральный лейшманиозы, болезнь Чагаса, сонную болезнь) Для представителей группы Trypanosomatidae характерен целый ряд уникальных особенностей структуры и экспрессии как ядерного, так и митохондриального геномов В клетках трипаносоматид имеется единственная разветвленная митохондрия, содержащая специализированный ком-партмент в основании жгутика - кинетопласт Именно в этом компартменте находится митохондриальный геном, называемый также кинетопластным (кпДНК), и имеющий чрезвычайно сложную организацию Он представляет собой сеть из нескольких тысяч катенированных кольцевых молекул ДНК двух'типов максиколец и миниколец

В кпДНК присутствует множество классов миниколец, каждый из которых несет один или несколько генов гидовых РНК, необходимых для РНК-редактирования многих максикольцевых транскриптов Максикольца в кпДНК считаются гомогенными и содержат гены митохондриальных белков и рРНК, а также протяженную некодирующую область (обычно называемую дивергентной), состоящую из повторов и высоко вариабельную у различных видов В нескольких работах (Lee et al 1992, 1993, 1994) представление о гомогенности максиколец было подвергнуто сомнению на основании данных о появлении новых максикольцевых классов при выработке лекарственной устойчивости у некоторых видов Leishmania Эти результаты были объяснены амплификацией редких классов максиколец, не детектируемых в клетках дикого типа Однако данные работы не получили существенного развития

В нашей работе мы стремились проверить гипотезу о гетерогенности максиколец на примере одного из видов лейшманий, Leishmania major Мы пред-

положили, что процесс дифференциальной амплификации максикольцевых классов может происходить не только при выработке лекарственной устойчивости, но и в естественном жизненном цикле паразита при переходе с одной стадии цикла на другую Жизненный цикл Leishmania состоит из двух стадий, промастиготной и амастиготной Паразиты на промастиготной стадии развиваются в кишечнике насекомого (москита) и имеют активно работающую митохондрию В макрофагах позвоночных хозяев паразиты находятся на амастиготной стадии и имеют слабо развитую, малоактивную митохондрию В нашей работе клональные и неклональные культуры ряда штаммов L major проходили несколько вариантов модельного жизненного цикла, которые можно представить следующей схемой промастиготы в культуре —> амастиготы в экспериментальных животных (хомячках) / амастиготы в культуре / амасти-гото-подобные клетки в культуре —> промастиготы в культуре На каждой стадии цикла проводили оценку гетерогенности максиколец методами ПЦР

Цели работы:

1) Проверить гипотезу о присутствии нескольких классов максиколец в ки-нетопластном геноме Leishmania major

2) Определить, происходит ли дифференциальная амплификация классов максиколец при смене стадии жизненного цикла

Экспериментальные задачи:

1) Установить частичную последовательность дивергентной области макси-кольца и локализовать ее наиболее вариабельные фрагменты путем сравнения различных штаммов

2) Выбрать один вариабельный фрагмент дивергентной области, который мог бы служить маркером различных классов максиколец

3) Провести амплификацию маркерного фрагмента дивергентной области с помощью ПЦР в различных клонах и штаммах L major на всех стадиях модельных жизненных циклов, установить варианты маркерного фрагмен-

та, характерные для промастиготной и амастиготной стадий жизненного цикла

4) С помощью молекулярного клонирования ПЦР-продуктов и секвенирова-ния определить последовательность различных вариантов маркерного фрагмента

Научная новизна:

1) Впервые установлена последовательность фрагментов дивергентной области максиколец L major, а также ряда других видов Leishmania, произведен сравнительный анализ структур дивергентной области лейшманий, близкородственного вида Leptomonas seymouri и других трипаносоматид В дивергентной области выявлены консервативные последовательности и структурные мотивы, возможно имеющие функциональную нагрузку

2) Впервые продемонстрирована гетерогенность максиколец в кпДНК выявлено несколько стабильных вариантов дивергентной области, которые одновременно присутствуют в клональных культурах, т е , фактически, в одном ассоциате кпДНК Гетерогенность максиколец по выбранному маркерному фрагменту выявлена в большинстве штаммов, выделенных на Ближнем Востоке и в Африке, но лишь в немногих штаммах среднеазиатского происхождения

3) Обнаружены значительные изменения соотношения классов максиколец (в результате дифференциальной амплификации определенных классов) при переходе между стадиями жизненного цикла

4) На основании полученных нами результатов и ряда предшествующих работ сегодняшнее представление об организации кинетопластного генома нуждается в пересмотре Обнаружение различных классов максиколец и их избирательной амплификации в жизненном цикле лейшманий указывает на возможность реализации в кинетопластном геноме уникальных механизмов регуляции экспрессии и открывает большое поле для дальнейших исследований

Структура диссертации:

Диссертация состоит из четырех частей 1) обзор литературы, 2) материалы и методы, 3) результаты и обсуждение, 4) приложения

Работа содержит список цитируемой литературы (421 ссылок), ¿2 рисунков, £ таблиц Общий объем диссертации страницы

Апробация работы и публикации:

Результаты диссертации были представлены на регулярно проводящихся семинарах кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ, а также на международных конференциях XII международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2005, Москва, Россия, 2005, Third World Congress on Leishmamosis, Palermo, Италия, 2005, I2th International Congress of Protozoology, Guangzhou, Китай, 2005, llth International Congress of Parasitologists, Glasgow, Великобритания, 2006, XIV международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых JIo-моносов-2007, Москва, Россия, 2007, 5th European Congress of Protistology, Санкт-Петербург, Россия, 2007 По теме диссертации опубликовано 3 статьи

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клетки L major на промастиготной стадии культивировали при 25°С на жидкой среде 199 с солями Хэнкса с добавлением фетальной телячьей сыворотки (10%) Клонирование клеток проводили на той же среде путем лимитирующего разведения В ряде экспериментов промастиготные клетки культивировали на двухфазной среде агаризованной среде Novy-Nicolle-McNeal (NNN) с добавлением дефибринированной человеческой крови (20%) и среде 199 в качестве жидкой фазы Для трансформации промастигот в амастиготы и культивирования амастигот использовали среду 199 с солями Хэнкса с добавлением 10 или 20% фетальной телячьей сыворотки, обогащенную рядом витаминов, аминокислот, нуклеотидов, нуклеозидов, глюкозой и гемином Путем ступенчатого понижения рН среды (с 8 до 6 3, 5 7 и 3 7) и/или повы-

шения температуры (с 25 до 29 и 33°С) в последовательных пассажах добивались трансформации -100% промастигот в амастиготы Для получения внутриклеточных амастигот in vivo использовали заражение золотистых хомячков промастиготными культурами путем подкожной инъекции в ушные раковины

ДНК из всех образцов выделяли по стандартным протоколам ПЦР производили с использованием набора для реакций с «горячим стартом» («Изо-ген», Москва) ПЦР-продукты маркерного фрагмента разделяли электрофорезом в 2-3% агарозном геле высокого разрешения Для молекулярного клонирования ПЦР-продуктов использовали набор InsTAclone («Fermentas», Литва) и штамм XL1 Blue Е coli Для анализа последовательностей ДНК применяли программные пакеты VectorNTI 9 («Informax») и DNAStar 99 («Lasergene») Для выравнивания последовательностей использовали программу MEGA 3 1 (Kumar et al 2004), для построения филогенетических сетей программу Network 4 5 (fluxus-engineering com)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Характеристика вариантов маркерного фрагмента

На первом этапе работы мы определили последовательность фрагментов дивергентной области (ДО) максиколец ряда штаммов L major (а также L chagasi, L mexicana, L turamca), что позволило установить основные детали структуры ДО, выявить в ней относительно консервативные и вариабельные участки По нашим данным, ДО L major и других видов Leishmania, а также близкородственного моноксенного вида Leptomonas seymouri состоит из длинных вырожденных повторов двух типов (названных тип I и II) Данные повторы собраны в суперкластеры следующей структуры (тип 1)](тип II)n (рис 1)

Секвенирование ближайшего к гену 12S рРНК суперкластера, состоящего из одного повтора типа I и одного повтора типа II, выявило два дискретных варианта в различных штаммах L major, существенно отличающихся по по-

следовательности повтора типа II На основании этих результатов именно данный суперкластер был выбран как маркер для дифференциации различных классов максиколец В маркерный фрагмент были включены 3'-конец повтора типа I, повтор типа II, а также консервативная последовательность непосредственно перед геном 12S рРНК (рис 1) «Привязка» маркерного фрагмента к гену 12S рРНК была важна для его точной локализации в ДО Для достижения максимальной специфичности амплификацию маркерного фрагмента проводили по двухстадийной схеме вначале амплифицировали длинный фрагмент дивергентной области (около 4 т п н ), используя праймер к 5'-концу повторов типа I (наиболее консервативная последовательность в ДО) и праймер к 5'-концу гена 12S рРНК Затем продукты ПЦР очищали с помощью наборов QIAquick («QIAGEN») и во второй стадии проводили амплификацию маркерного фрагмента (длиной 0,3-1,5 т п н) Схема проведенных экспериментов и примеры полученных ПЦР-продуктов приведены на рис 1

Были исследованы 26 клональных культур из выделенного в Израиле штамма LRC-L952, полученные путем двухступенчатого лимитирующего разведения, а также неклональные культуры 38 штаммов, выделенных в различных географических регионах Амплификация маркерного фрагмента в большинстве культур, как клональных, так и неклональных, дает несколько продуктов различных длин (см рис 16, в) С помощью секвенирования ПЦР-продуктов, полученных из различных клонов штамма LRC-L952 на обеих стадиях жизненного цикла, выявлено 20 вариантов маркерного фрагмента Наблюдаемые вариации длины маркерного фрагмента связаны с количеством повторов типа II (от одного до пяти) и с различиями в последовательности повторов (длина повтора 200-300 п н ) Варианты маркерного фрагмента были названы «moho-, ди-, три-, тетра- и пентамерными» в соответствии с числом повторов типа II Многократное секвенирование наиболее распространенных вариантов маркерного фрагмента в различных клонах и штаммах (номера последовательностей EU588992-EU589047 в GenBank) показало стабильное

* §

& 5 £ ig"

m

3 со о

i I s ?z 5

г 1 S ill

Ю

м.

Рис. 1. Схема экспериментов. Показана также структура известных фрагментов дивергентной области штамма LRC-L952 на промастиготной стадии, ломаной линией отмечено положение маркерного фрагмента. Заштрихованными стрелками показаны повторы типа I, темными стрелками и светлыми прямоугольниками - GC- и АТ-богатые части повторов типа II, соответственно, а. Электрофорез продуктов первой реакции амплификации DRF-DRR43. Образцы из различных пассажей промастиготной культуры штамма LRC-L464 после инкубации при 4°С. Слева направо: пассажи 5, 6, 7, 8, 9, 10, восстановленная промастиготная культура, маркер GeneRuler 1 kb ladder («Fermentas»), 6. Электрофорез продуктов второй реакции амплификации xDRR3rev-DRR270. Слева направо: пассажи 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, восстановленная промастиготная культура, маркер 100 bp ladder («Изоген»). в. Результаты молекулярного клонирования продуктов xDRR3rev-DRR270 из восстановленной промастиготной культуры. Слева направо: варианты маркерного фрагмента длиной 235, 300, 375, 450, 573, 375, 573, 300, 375, 642 п.н., маркер 100 bp ladder («Изоген»).

наследование данных вариантов в популяциях L major Большинство вариантов маркерного фрагмента были выявлены в неизменном виде в независимых клонах, а также в штаммах, весьма далеких от штамма LRC-L952 по генетическим данным (Elfari et al 2005)

Выравнивание повторов типа II, присутствующих в исследованных вариантах маркерного фрагмента, представлено на рис 2 Выравнивание выявляет консервативные и вариабельные участки повтора типа II, протяженные де-леции/инсерции, а также укороченные с одного из концов повторы Филогенетическая сеть (рис 3), построенная на основании данного выравнивания, показывает разделение повторов типа II на иерархические подгруппы (на основании характерных однонуклеотидных полиморфизмов и деле-ций/инсерций) А (под-подгруппы а, а*, а'), В (b, b*, b'), Е (е, е*, е')

Расположение повторов различных подгрупп в исследованных вариантах маркерного фрагмента представлено на рис 4 Варианты обозначены следующим образом согласно числу повторов и их принадлежности к определенным подгруппам mono 1, mono 1 truncated (укороченный), mono 2, mono" 3, di 1, di 2, di 3, tri 1, tri 2, tn 2 truncated, tetra, penta Мономерные варианты содержат повтор подгруппы В (300 и 320 п н - mono 1, 235 п н - mono 1 truncated с делегированной 3'-концевой частью), или подгруппы Е (375 п н -mono 2), или подгруппы А (452 п н - mono 3) Димерные варианты, содержащие копии подгрупп В и Е, обозначены как di 1 (вариант длиной 573 п н имеет структуру Ь'е, 642 п н - be*), содержащие А и Е копии - di 2 (648 п н - ае\ 681 п н - ае) Только небольшое число стабильных моно- и димерных вариантов широко представлены в различных штаммах и клонах Данные по разнообразию тримерных и более длинных вариантов нельзя считать исчерпывающими Скорее всего, разнообразие длинных вариантов существенно превышает разнообразие коротких

Рис 2. Выравнивание повторов типа П (52 последовательности, 375 выравниваемых знаков). Наиболее консервативные (почти инвариантные) позиции обозначены желтым. В полиморфных сайгах аллели, специфичные для определенных групп последовательностей, выделены фиолетовым, светло-зеленым, темно-зеленым, темно-синим и коричневым.

Рис. 3. Филогенетическая сеть повторов типа II, построенная по методу М.1 (избыточные связи удалены с помощью метода МР). Длины ветвей не отражают генетические расстояния между последовательностями. Подгруппы повторов обозначены заглавными буквами у соответствующих базальных узлов. Позиция каждого повтора внутри соответствующего маркерного фрагмента отмечена крупным шрифтом.

<11 1 642 ь е *

топа 2 375 е *

топо 1 300 Ь

топо 1 320 Ь

топо 1 1игипс 235 Ь'

<и 1 573 Ь' е

1:г1 1 888 ь Ь' е

1200 ъ Ь' ь е

репЪа 1470 ь а' а' Ь7" е

<11 3 514 ъ а'

£ лг1 2 963 а' Ъ' е

йеЪга 1158 ь а' Ь е

tetra 1200 а* а' Ь' е'

топо 3 452 а*

1263 а Ь* Ь' е'

Ьг1 2 983 а Ь* е'

<И 2 648 а е

Ъг1 2 888 а Ь* е

Ьг1 2 617 а Ъ*

Ьгипс

<11 2 681 а е

Рис. 4. Структура исследованных вариантов маркерного фрагмента. В левой колонке приведены названия вариантов маркерного фрагмента, в средней - их длины в п.н., в правой -входящие в них повторы типа II. Общие структурные элементы выделены прямоугольниками.

Глава 2. Динамика максикольцевой популяции в жизненном цикле

Полученные нами результаты однозначно свидетельствуют о присутствии нескольких вариантов маркерного фрагмента и, соответственно, нескольких классов максиколец в клональных культурах штамма LRC-L952 (рис 5а, б, в) Так как в клетке лейшманий имеется только один ассоциат кпДНК, наши результаты говорят о наличии нескольких классов максиколец в одном ассо-циате Для большинства клонов (20 из 26) был характерен следующий набор классов mono I300+320, mono 2, di 1573+642, di 2, tri, tetra, penta (рис 5a) Тот же набор классов был характерен для исходной неклональной культуры штамма LRC-L952

Во многих образцах варианты маркерного фрагмента имели заметно различную интенсивность полос, т е, вероятно, присутствовали высоко-копийные (мажорные) и низкокопийные (минорные) классы максиколец (рис 5) Следует отметить, что «невидимость» какого-либо варианта маркерного фрагмента по результатам электрофоретического анализа ПЦР-продуктов не обязательно свидетельствует об отсутствии его в данном образце По результатам молекулярного клонирования (см рис 1в) в некоторых образцах были обнаружены очень редкие варианты маркерного фрагмента с частотой порядка 1-2 на 40-80 молекулярных клонов, причем эти варианты не выявлялись при электрофорезе исходной смеси ПЦР-продуктов Таким образом, соответствующие классы максиколец, вероятно, имеют частоту порядка одной копии на ассоциат [если учесть, что число максиколец в ассоциате кпДНК обычно оценивается около 50 (Lukes et al 2005)]

Промастигото-амастиготная трансформация в случае штамма LRC-L952 почти всегда сопровождалась изменением частоты определенных классов максиколец Изменения могли включать «исчезновение» всех мажорных классов и их замещение за счет амплификации ранее минорного класса Наблюдались также менее значительные изменения, например, «появление» или «исчезновение» одного или двух минорных классов

Рис. 5. Результаты амплификации маркерного фрагмента в различных моделях жизненного цикла, а. Штамм LRC-L952, идентичные ПЦР-паттерны в клональных промастиготных культурах ЗАЗ-7Н1 и аберрантный паттерн у клона 7Н12. б. Штамм LRC-L952, амплификация мономерных вариантов маркерного фрагмента у амастигот клона I0A2 и частичная реверсия к исходному паттерну при амастигото-промастиготной трансформации; вариабельность ПЦР-паттернов в выборке амастиготных образцов клона 4В4; схожие паттерны у амастигот данного клона (хомяк 2 ухо 2, хомяк 3 ухо 1 - h2 е2, h3 el) и промастигот клона 10А2 (рш). в. Штамм LRC-L952, вариабельность ПЦР-паттернов в выборке амастиготных образцов клона 11 A4; переход к типичному для промастигот паттерну при амастигото-промастиготной трансформации в этом клоне, схожие паттерны у амастигот клона И A4 (hi е2) и промастигот клона 12А2; ДНК хомяка служила отрицательным контролем (neg control), г. Штамм LRC-L357, высокая вариабельность ПЦР-паттернов в образцах амастигот из хомяков, слева направо: prom -исходная промастиготная культура, образцы из хомяков № 1-9. д. Штамм LRC-L952, клон 15G3, изменение ПЦР-паттерна у амастигот в культуре и реверсия к исходному паттерну при восстановлении промастиготной культуры: образцы 1 -4, пассажи 1-9 (pas 1-9), чистые промастиготы (рт), смешанная культура (am/pm) или амастиготы (am), е. ПЦР-паттерны у штаммов из различных географических регионов: Средней Азии (5ASKH, Р, промастиготы и амастиготы Isv T-03h, Isv T-44g), Африки (LEM2983, L1PA538, LPN162, LPS13, GLC7) и Саудовской Аравии (JISH-233, JISH-244, SABIR-1).

1000 bp

500 bp bp

100 bp

Картина изменений максикольцевой популяции не имела принципиальных отличий в различных вариантах модельного жизненного цикла (рис. 56, в, г, д). Аналогичные изменения частоты классов максиколец наблюдались не только у амастигот in vivo, но также и у амастигот in vitro в условиях, напоминающих таковые в макрофаге (см. Материалы и методы). Более того, явные изменения в максикольцевой популяции наблюдались после длительной инкубации (1-4 мес.) промастиготных клеток при 4°С. В этих условиях многие клетки претерпевали трансформацию в амастигото-подобные формы (рис. 6). Наблюдаемые перестройки кпДНК могут теоретически происходить как в результате отбора классов максиколец в кинетоласте, так и в результате отбора определенных клеточных линий. При низкой температуре клетки не делятся и не подвергаются лизису за время эксперимента, следовательно, в данном случае любые изменения представленности классов максиколец на уровне клеточной популяции фактически «заморожены». Поэтому наблюдаемые изменения необходимо объяснить на уровне внутрикинетопластной популяции максиколец.

Рис. 6. Микрофотография культуры Leishmania major LRC-L952, инкубированной в течение месяца при 4°С в среде 199 (сканирующий конфокальный микроскоп Leica TCS SP5). Шкала = 10 мкм. Типичные промастиготные клетки редки (единственная клетка в поле зрения отмечена черным треугольником). Наиболее часто встречаются округлившиеся промастиготы со жгутиком и амастигото-подобные клетки без жгутика (отмечены черными и белыми стрелками, соответственно).

Выше шла речь о промастигото-амастиготной трансформации Обратная, амастигото-промастиготная, трансформация в большинстве случаев также сопровождалась увеличением и/или уменьшением содержания (амплификацией и/или элиминацией) определенных максикольцевых классов Опять же, аналогичные изменения максикольцевой популяции наблюдались в жизненных циклах с участием амастигот in vivo, in vitro, а также амастигото-подобных клеток при низкой температуре Однако мы не можем однозначно говорить о внутрикинетопластной природе наблюдаемых в данном случае изменений, потому как получение клональных культур амастигот было невозможно по техническим причинам Культуры амастигот, и особенно культуры при 4°С содержали небольшой процент промастигот (см рис 6) Переведение культуры в благоприятные условия могло приводить к размножению этих остаточных промастигот, маскируя эффект истинной амастигото-промастиготной трансформации

На второй промастиготной стадии во многих случаях происходила амплификация классов, ставших редкими или «исчезнувших» по результатам ПЦР на амастиготной Это говорит о том, что «невидимость» какого-либо класса по результатам ПЦР не означает его полную элиминацию из ассоциа-та кпДНК, о чем мы уже говорили выше Таким образом, промастигото-специфические классы максиколец могут персистировать на амастиготной стадии в небольшом числе копий (видимо, до одной копии на ассоциат), а затем вновь амплифицироваться на следующей промастиготной стадии В целом, можно сказать, что при возвращении на промастиготную стадию наблюдалась тенденция к восстановлению исходного «промастиготного» набора классов максиколец (рис 56, д) Однако мы говорим лишь о тенденции, а не о строгой закономерности, поскольку восстановление исходного набора иногда было неполным или не происходило вовсе (рис 5в)

Изменение копийности классов максиколец было быстрым, занимая обычно один пассаж в культуре (7-14 дней) Наилучшим примером может служить промастигото-амастиготная трансформация в культуре (рис 5д)

Культуры, выделенные из очагов поражения у хомяков, также претерпевали перестройки кпДНК уже в первом пассаже одновременно с морфологической трансформацией из амастигот в промастиготы (рис 56, в) После этого набор максикольцевых классов обычно оставался стабильным на протяжении последующих пассажей В некоторых случаях стабилизация набора достигалась только на втором пассаже, иногда наблюдались флуктуации копийности классов в ряде пассажей

Необходимо также обратить внимание на то, что перестройки кпДНК зачастую шли по одному пути во всех клетках какого-либо образца, например, происходила амплификация определенного максикольцевого класса (рис 56, г, д) Однако в различных образцах, принадлежащих к одному клону или штамму, во многих случаях перестройки шли по разным путям (рис 56, в) Данная «когерентность» перестроек в одном образце свидетельствует о том, что дифференциальная амплификация максикольцевых классов не является абсолютно случайным процессом, иначе в различных клетках амплифициро-вались бы различные классы, и общий набор классов в образце не претерпевал бы существенных изменений

Таким образом, вырисовывается следующая картина изменений кпДНК Можно выделить несколько достаточно стабильных комбинаций (наборов, паттернов) максикольцевых классов и описать «перестройки» кпДНК в терминах чередующихся стабильных паттернов Определенные наборы классов являются промастигото- или амастигото-специфическими Амастиготная стадия характеризуется достаточно большим разнообразием возможных паттернов максиколец, в отличие от промастиготной стадии, где в большинстве случаев встречается один характерный паттерн Число мажорных классов обычно ниже на амастиготной стадии т е на данной стадии происходит преимущественная амплификация одного или двух классов, присутствовавших на промастиготной стадии

Изменения кпДНК (названные в работах Lee et al транскинетопластиди-ей) в жизненном цикле могут быть достаточно широко распространены среди

трипаносоматид Pacheco et al (1995) выявили транскинетопластидию в кло-нальных культурах промастигот L brazihensis после пассажа в хомяках В данном случае были изучены в основном рестрикционные паттерны минико-лец, при этом было обнаружено несколько стабильных паттернов (шизоде-мов) Многие клоны имели идентичные шизодемы на первой промастиготной стадии, но приобретали различные шизодемы после пассажа в хомяках, другие, наоборот, приобретали идентичные шизодемы на второй промастиготной стадии Таким образом, должен существовать механизм, генерирующий определенные шизодемы в различных клонах Очевидно, что подобная картина - несколько стабильных паттернов кпДНК, чередующихся в жизненном цикле - очень напоминает полученные нами результаты По некоторым данным, транскинетопластидия может присутствовать не только в роде Leishmania, но и у Trypanosoma cruzi (Alves et al 1993, 1994, 1996, Bogliolo and Godfrey 1987)

Глава 3. Внутривидовое разнообразие наборов максикольцевых классов

Обсуждавшиеся выше результаты были получены на выделенном в Израиле штамме LRC-L952 Два других израильских штамма L major, LRC-L357 и LRC-L464, также демонстрировали типичные изменения кпДНК в жизненном цикле, однако каждый штамм имел свои особенности Например, в случае штамма LRC-L464 амастигото-специфический (для штамма LRC-L952) класс mono 3 был одним из мажорных на промастиготной стадии, в случае штамма LRC-L357 часто наблюдалась амплификация тетрамерных классов на амастиготной стадии (рис 5г) Все штаммы из Средней Азии имели только один мажорный класс, mono 3, на обеих стадиях жизненного цикла (рис 5е) Исследование маркерного фрагмента не выявило существенных изменений кпДНК в жизненном цикле среднеазиатских штаммов Мы не можем сделать вывод, что перестройки кпДНК вовсе не характерны для данных штаммов, так как мы исследовали только короткий фрагмент ДО, выбранный на основании его вариабельности у израильских штаммов Не исключено, что

у среднеазиатских штаммов отличия между классами максиколец локализуются в других фрагментах ДО По данным скрининга маркерного фрагмента, среднеазиатские штаммы образуют отдельную гомогенную группу, что хорошо согласуется с результатами Elfari et al (2005) и Al-Jawabreh et al (2008), полученными с использованием генетических маркеров в ядерном геноме Ближневосточные и африканские штаммы (рис 5е) образуют две отдельные группы, не столь гомогенные, как среднеазиатская, и имеющие ряд общих черт друг с другом, что также согласуется с предшествующими результатами (Elfari et al 2005)

Глава 4. Генерация разнообразия классов максиколец

В ассоциате кпДНК многих клонов присутствует около 10 вариантов маркерного фрагмента (mono I300+320, mono 2, mono 3, di 1573+642, di 2, tri, tetra, penta) Точное число максиколец в кпДНК L major не известно Согласно исследованиям других трипаносоматид, это число должно быть около 50 (К1е-isen et al 1976, Shapiro and Englund 1995) Наблюдаемое разнообразие классов уже является достаточно большим для популяции размером 50 молекул Более того, неизвестно, делится ли каждый класс максиколец, выявленный при анализе маркерного фрагмента, на подклассы в результате вариабельности других участков максикольца

В связи с этим возникает несколько гипотез о характере вариабельности полных последовательностей максиколец Во-первых, можно предположить, что различия между классами максиколец сосредоточены исключительно в исследованном маркерном фрагменте, и истинное число классов составляет порядка 10 Данное предположение не лишено оснований, так как именно во фрагменте ДО перед геном 12S рРНК должен находиться промотор, с которого идет транскрипция этого и других нижележащих генов (Бессолицына, 2004) В работе Го (Го, 2005) на родственном Leishmania виде Lep seymouri также показано присутствие в клональных культурах двух вариантов фрагмента перед геном 12S рРНК

Вторая гипотеза заключается в следующем только некоторые классы максиколец стабильно наследуются в жизненном цикле, например, несущие моно- и димерные варианты маркерного фрагмента Другие варианты (более длинные) генерируются de novo при переходе между стадиями жизненного цикла за счет рекомбинации коротких «базальных» вариантов Наш анализ позволяет разбить исследованные варианты маркерного фрагмента на стабильные «строительные блоки», например, пары повторов BE или АВ Эти блоки выделены прямоугольниками на рис 4 Однако мы не выявили явных следов рекомбинации на основании выравнивания копий повторов (рис 2) Поэтому можно сделать вывод, что окончательная проверка гипотезы о ре-комбинационном происхождении ряда классов максиколец требует анализа большего числа вариантов маркерного фрагмента

Третья гипотеза число максиколец в кинетопласте существенно превышает 50 молекул, соответственно, верхний предел числа стабильно наследуемых максикольцевых классов увеличивается Прямые оценки числа максиколец у L major отсутствуют Более того, не исключено, что некоторые максикольца присутствуют в кинетопласте вне ассоциата в свободном виде (Колесников, личное сообщение) Последняя возможность никогда не была строго опровергнута Данное предположение могло бы объяснить отсутствие результатов, говорящих о гетерогенности максиколец, в ранних работах на кпДНК (например, Borst et al 1976, de la Cruz et al 1984, Kleisen et al 1976, Kolesmkov et al 1984, 1988, Maslov et al 1984, Muhich et al 1983, 1985), так как все эти работы проводились на очищенных ассоциатах

Формирование гибридных ассоциатов кпДНК при половом процессе также может быть одним из механизмов генерации разнообразия классов максиколец Однако имеющиеся на сегодняшний день результаты не говорят в пользу этой гипотезы При скрещиваниях клонов Т brucei максикольца наследуются от обоих родительских клонов, однако после ряда пассажей всегда остается только один класс максиколец за счет случайной сегрегации классов при репликации кпДНК (Gibson et al 2008, Turner et al 1995) При этом ми-

никольца всегда наследуются от обоих родительских клонов (Gibson et al 2001, 2008) Наследование максиколец от одного родительского клона также показано для Т cruzi (Gaunt et al 2003) Таким образом, в случае Trypanosoma spp есть некоторые основания утверждать о гомогенности максиколец за счет случайной сегрегации при делении Вопрос о наследовании кпДНК при половом процессе видов Leishmania остается неизученным Хотя из природных популяций были выделены гибридные штаммы Leishmania [включая межвидовые гибриды (Ravel et al 2006)], половой процесс ни разу не был продемонстрирован в лабораторных условиях, возможно, из-за его чрезвычайно низкой частоты (Victoir and Dujardin 2002)

Глава 5. Возможная роль гетерогенности максиколец в регуляции экспресии генома

Промастиготы и амастиготы лейшманий живут в заметно различающихся условиях, в том числе и в отношении доступности кислорода, поэтому экспрессия митохондриального генома отличается на этих стадиях Мы не можем исключать, что дифференциальная амплификация классов максиколец участвует в регуляции экспресии кинетопластного генома

ДО, вероятно, является регуляторной (контрольной) областью, содержащей промоторы, сайты инициации репликации и другие функциональные элементы Следовательно, можно высказать гипотезу о том, что классы максиколец с различной структурой ДО отличаются на уровне экспрессии генов Как мы уже отмечали, маркерный фрагмент может играть ключевую роль в транскрипции гена 12S рРНК, так как он, возможно, включает промотор этого гена ДО должна содержать не только промоторы, но и сайты инициации репликации, при этом варианты ДО могут служить маркерами для селективной амплификации максиколец, несущих различные варианты кодирующей области [вариабельность последовательности кодирующей области максиколец была продемонстрирована Lee et al на L mexicana (Lee et al 1992b)]

На основании наших результатов и предшествующих данных по трански-нетопластидии вырисовывается новая картина структуры кинетопластного генома Эта картина включает 1) стабильно присутствующую гетерогенность не только мини-, но и максиколец, 2) изменения в мини- и максиколь-цевой популяциях (транскинетопластидию) при выработке лекарственной устойчивости и в жизненном цикле, 3) возможно, изменения в экспрессии генома за счет чередования классов максиколец с различными профилями экспрессии

ВЫВОДЫ

1) Максикольца гетерогенны в кинетопласте Leishmania major, различия между классами максиколец затрагивают, по крайней мере, ближайший к гену 12S рРНК кластер повторов в дивергентной области Гетерогенность по исследованному фрагменту дивергентной области наблюдается у штаммов, выделенных на Ближнем Востоке и в Африке

2) Классы максиколец представлены различным числом копий, их можно условно разделить на преобладающие и редкие

3) Переход между стадиями жизненного цикла в большинстве случаев сопровождается изменением частоты определенных максикольцевых классов

4) Можно выделить амастигото- и промастигото-специфичные, а также неспецифичные для определенной стадии наборы максикольцевых классов Во многих случаях при амастигото-промастиготной трансформации наблюдается восстановление набора классов, характерного для предшествующей промас-тиготной стадии

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Flegontov Р N , Strelkova М V , Kolesnikov А А (2006) The Leishmama major maxicircle divergent region is variable in different isolates and cell types Molecular and Biochemical Parasitology 146, 173-179

2) Flegontov P N, Guo Q , Ren L , Strelkova M V , Kolesnikov A A (2006) Conserved repeats in the kinetoplast maxicircle divergent region of Leishmama sp and Leptomonas seymouri Molecular Genetics and Genomics 276,322-333

3) Flegontov P N , Kolesnikov A A (2006) Radically different maxicircle classes within the same kinetoplast an artefact or a novel feature of the kinetoplast genome9 Kinetoplastid Biology and Disease 5, 5 http //www kinetoplastids com /content/5/1/5

4) Флегонтов П H (2005) Реорганизация контрольной области митохондри-ального генома Leishmama major при переходе паразита из аэробной в анаэробную фазу жизненного цикла Сборник тезисов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2005, Москва

5) Flegontov Р N, Guo Q, Ren L, Strelkova M V, Kolesnikov A A (2005) Structural changes in the Leishmama major maxicircle divergent region accompany promastigote-amastigote transition Abstracts of the Third World Congress on Leishmaniosis, Palermo, Italy, p 301

6) Guo Q, Ren L, Flegontov P N, Kolesnikov A A (2005) The kinetoplast maxicircle control region has highly variable sequence but conserved overall structure Abstracts of the 12th International Congress of Protozoology, Guangzhou, China, p 73

7) Flegontov P N , Strelkova M V , Pomrovsky E N , Zhirenkina E N , Kolesnikov A A (2006) The maxicircle control region of Leishmama major is composed of several distinct highly conserved domains Abstracts of the 11th International Congress of Parasitologists, Glasgow, UK

8) Герасимов E С , Флегонтов П H (2007) Гетерогенность максикольцевого генома промастигот Leishmama major Сборник тезисов XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007, Москва

9) Flegontov Р N , Gerasimov Е S , Zhirenkina E.N , Pomrovsky Е N , Strelkova М V , Kolesnikov А А (2007) The kinetoplast genome of Leishmama major contains several maxicircle classes undergoing differential amplification at the amastigote stage Materials on the V European Congress of Protistology Protistology 5,29

Подписано в печать 03 09 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 75 п л Тираж 100 экз Заказ № 750 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Флегонтов, Павел Николаевич

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Митохондриальные геномы: anything goes

Перестройки в митохондриальных геномах

Kinetoplastida - аберрантная группа эукариот

Митохондриальные геномы Euglenozoa

Структура кинетопластного генома

Ассоциат кинетопластной ДНК трипаносоматид

Миникольца

Максиколъца

Дивергентная область максиколец

Варианты организации кпДНК

Репликация кинетопластного генома

Механизм репликации

Поддержание разнообразия классов миниколец

Новые данные о разнообразии гРНК

Сегрегация мини- и максиколец после полового процесса

Жизненные циклы трипаносоматид

Trypanosoma brucei

Trypanosoma cruzi

Leishmania spp.

Культивирование амастиготной формы лейгиманий

Транскинетопластидия - перестройки кинетопластного генома

При выработке лекарственной устойчивости

В жизненном цикле

Цель работы

Экспериментальные задачи

Материалы и методы

Исследованные штаммы

Культивирование и клонирование промастигот

Культивирование амастигот

Работа с экспериментальными животными

Выделение тотальной ДНК

Выделение кинетопластной ДНК

Электрофорез ПЦР-продуктов

Клонирование ПЦР-продуктов

Секвенирование и анализ последовательностей

Результаты и обсуждение

Характеристика вариантов маркерного фрагмента

Динамика максикольцевой популяции в жизненном цикле

Клональные культуры промастигот

Жизненный цикл с амастиготной стадией in vivo: неклональные культуры

Жизненный цикл с амастиготной стадией in vivo: клональные культуры

Жизненный цикл с амастиготной стадией in vitro: клональные культуры

Амастигото-подобные клетки при 4°С: клональные и неклональные культуры

Обсуждение: геномные сдвиги в максикольцевой популяции

Внутривидовое разнообразие наборов максикольцевых классов

Генерация разнообразия классов максиколец

Возможная роль гетерогенности максиколец в регуляции экспрессии генома

Выводы