Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Принципы структурной организации миникольцевых ДНК трипаносоматид

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Принципы структурной организации миникольцевых ДНК трипаносоматид"

М ' - I п

- J

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В, ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

УДК 577.155.2

ГЛАДКАЯ Лариса Алексеевна

принципы структурной организации миникольцевых днк трипаносоматид

03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФ ЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1988

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Ломоносова

на правах рукописи УДК 577,155.2

ГЛАДКАЯ ЛАШСА АЛЕКСЕЕВНА

ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИНИКОЛЬЦЕШХ ДНК ТИШАНОСОМАТИД

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 1988 '

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

ведущй научный сотрудник А.А.Колесников.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор К.Г.Скрябин; кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.С.Манькин.

Ведущая организация - Институт молекулярной генетики АН СССР

Защита диссертации состоится /" и^о-Л- рл 1988 г. в /Ц час. на заседании Специализированного совета Д.053.50.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

Автореферат разослан "10 " аи.Л'лГ^Л 1988 г.

Ученый секретарь Совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

■ <* г»

.а»*,, ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

^ Тдея I

1х*а.К'К'/ддьность проблемы.- На протяжении более-чем 20 лет, про-шедшБГсо"'времени, обнаружения специфической ДНК в митохондриях, не. ослабевает интерес к изучению уникальной генетической системы митохондрий. Компактность митохондриального генома, ограниченность кодируемой информации, простота выделения и очистки делают ми-тохондриальный геном удобной модельной системой для изучения фундаментальных биологических процессов. Именно при изучении митохондриального генома были сделаны такие принципиальные для молекулярной биологии открытия,как наличие белков, кодируемых ин-тронами и обеспечивающих интрамолекулярный сплайсинг, функциональная роль рекомбинационных процессов, особенности компактиза-ции малых геномов и неуниверсальность генетического кода.

Значительная дивергенция митохондриального генома по структуре и организации' противоречит консервативности набора митохондри-альных генов, отражающей четко ограниченную и общую для клеток всех эукариотических организмов функцию митохондрий. Такая диалектика организации свойственна всем изученным мтДЖ. Механизмы, лежащие в основе вариабельности митохондриального генома, различны у разных групп эукариот, что свидетельствует о различных путях эволюционирования мтДНК.

Особое место занимает в этом плане мтДНК простейших отряда К1де-Ьор1аз-Ы<1анеобычная организация которой вызывает всё возрастающий интерес у исследователей. Помимо кольцевой ДНК сравнительно большого размера, так называемой максикольцевой ДЩ, являющейся функциональным аналогом мтДНК других эукариот, кинето-пласг /уникальная гигантская митохондрия простейших/ содертаг огромное количество плазмид, так называемых миниколец, топологически, связанных в один большой ассоциат. Пока совершенно неясно, какую функцию выполняет миникольцевая ДНК, хотя имеется уже довольно много сведений о её структуре. Изучение организации такой чрезвычайно сложной топологической структуры, процессов её '. репликации и сборки несомненно представляет большой теоретический интерес.

2. Цель и задачи исследования.. Данная работа является частью комплекса исследований, проводимых на кафедре молекулярной биологии

В руководстве работой принимал участие кандидат биол. наук, научный сотрудник Д.А.Маслов

МГУ, целью которых является выяснение структурной и функциональной организации митохондриального генома паразитических жгутиковый простейших семейства трипаносоматид. Задача настоящей работы - изучение структурной организации миникольцевых ДНК.

3. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований охарактеризованы ассоциаты кинетопластной ДНК трех видов трипаносоматид. Показано, что миникольца Crithidia oncopelti имеют нехарактерную для трипаносоматид выраженную гетерогенность по размеру. Миникольца всех трех видов гетерогенны по последовательности оснований. Показано, что миникольца в составе ассоциата соединены не только посредством катенирования, но и за счет, по-видимому, белковых связок. В Д-векторах клонированы полноразмерные миникольцевые последовательности видов с.oncopelti и

. С.fasciculate . Обнаружено, что эти последовательности обладают способностью рекомбинировать в гесА+ штаммах E.coli , что характерно для инвертированных повторов. Определены частичные первичные структуры миниколец мажорного и минорного классов с.fasciculate и миникольца одного из классов с.oncopelti . Проведен анализ полученных последовательностей. Обнаружены последовательности, потенциально способные образовывать вторичную структуру типа тРНК. Эти последовательности оказались гомологичными у двух изученных видов трипаносоматид. Предложена вторичная структура района начала репликации у разных видов трипаносоматид. Проанализированы открытые рамки считывания как на полученных автором последовательностях, так и на других известных миникольцевых последовательностях. Обнаружено сходство доменной структуры пептидов, потенциально кодируемых Н-нитыо консервативной области миниколец трех родов: Crithidia , Trypanosoma и Leishmania .

4. Научно-практическая ценность работы.. Относительно простое устройство бактериальных плазмид делает их удобной модельной системой для изучения процессов регуляции репликации ДНК. Даже сложный репликативный аппарат бактериальной хромосомы может быть проанализирован посредством использования маленьких oric плазмид. Аналогичной широко распространенной удобной модельной системы для эукариотических клеток нет. В настоящее время только два объекта претендуют на роль простых модельных систем, позволяющих изучать молекулярные механизмы координации процессов репликации

ДНК с жизненным циклом эукариотической клетки - это дрожжевые 2 мкм плазмиды и миникольцевые ДНК триланосоматид. ТЪпологи-чески связанный миникольцевой ассоциат,возможно, также окажется удобной моделью для изучения молекулярных механизмов компак-тизацин и декомпактизации геномов в процессе репликации.

Жгутиковые простейшие семейства трипаносоматид являются возбудителями тяжелых заболеваний человека и животных.- Всестороннее изучение их организации на молекулярном уровне может привести к созданию высокоэффективных препаратов для борьбы с трипаносоматидными заболеваниями.

5. Апробация работы.- Материалы диссертации были представлены на III и 1У Всесоюзных съездах протозоологов в 1982 /Вильнюс/ и 1986 /Ленинград/ гг. Работа неоднократно обсуждалась на заседаниях кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ.

6. Публикации. По материалам исследований опубликовано 5 печатных работ.

МЕТОДУ

Кинетошгастную ДНК выделяли по методу Маслова /Маслов с соавт., 1982/. Трансформацию клеток Б.coli плазмидами, заражение клеток E.coli фагами, выделение плазмидной и фаговой ДНК, обработку ДНК рестрикционными эндонуклеазами, электрофорез, гибридизацию ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах, мечение и лигирова- • ние ДНК проводили по стандартным методам /Маниатис с соавт., 1984 г./ Для приготовления электронномикроскопических препаратов использовали метод Дэвиса / Davis e-t al.,1971 /. Получение набора субклонов, содержащих направленные делеции исходного участка, проводили по методу, описанному в работе / Henikoff,. 1984/' Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили по методам Максама и Гилберта /Махаш & Gilbert, 1977 / и Сэнгера /Hattori, 1986 /. Для анализа нуклеотидных последо- • вательностей использовали пакет прикладных программ для IBM PC, любезно присланный авторами / ■ /. Для построения

профилей гидрофобности продуктов трансляции нуклеотидных последовательностей была использована программа, написанная И.А.Ад-жубеем-на основе опубликованной ранее / /.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Анализ структуры ассоциатов Cгithidia опсореИ:х, Сг1гь1<11а Хаа-с!си3^а и Ъер-Ьоиопаа реавоа! , 1»1. Электронномикроскопический анализ.

К моменту начала наших исследований среди низших трипаносома-тид сравнительно хорошо были изучены только миникольцевые молекулы с.£аас:1сиЭ^а » о миникольцахс.опсоре11;1 было известно очень мало. Ранее в нашей лаборатории было показано только, что ассоциат кпДНК С.опсоре11;1 характеризуется ярко выраженной гетерогенностью миниколец по размеру. Поэтому начать нашу работу мы решили с детального анализа ассоциатов кпДНК низших трипаносома-тид С.опсореЗЛ! ,С.Хавс±си1ага и Ь.реввоа!.

Внешний вид ассоциатов всех трех исследованных видов оказался более-менее одинаков и представлял собой полусферу. Электронная микроскопия ассоциатов, разрушенных продавливанием через иглу шприца, позволила провести статистический анализ длин кольцевых и линейных молекул, получающихся при такой обработке. На рис.1 даны гистограммы распределения длин жжкольцевш молекул исследованных наш видов. Видно, что миникольца с.опсоре1-ы распределяются по длине на четыре основных класса, в отличие от мини-колец двух других исследованных видов.

Помимо, миниколец в гидродинамически "рассыпанных" ассоциатах были обнаружены кольца большего размера. Часть из них являются максикольцами, однако большую часть представляют кольца промежуточного размера - олигомеры миниколец. Процент и степень оли-гомеризации были разными у трёх исследованных нами видов. Наиболее часто олигомеры встречались у С.1авс1си:1^а , причем степень олигомеризации достигала 9-10; у ь.реааоа! наиболее часто встречались димеры, более крупные олигомеры попадались сравнительно редко. Очень редкими были олигомеры у с.опсореШ .

В кпДНК всех трех видов были обнаружены репликативные формы миниколец, имеющие 9-структуру. Как стало сейчас ясно, для миниколец трипаносоматид характерен механизм репликации по Кэрн-су. Исследованные нами виды были типичными в этом плане. Впервые были обнаружены реплицирующиеся по 6-типу олигомеры миниколец. ,

Теперь о топологии ассоциата и характере связей миниколец друг с другом. Во всех исследованных нами видах, "ободок" ассо-

{ [. Л '¡я

: '! (• Ч ц» • щ

0.33

0.43

Г 1

0.« 0.6«

<1 йп

В

¡¡л

ii

.пнШ

. 'Н.ЧЩН «8 -ШЩКЩ!

ЩЩь

П-и

щ

и

0,43

Рис.1 Гистограммы распределения длин миникольцевых молекул А: с.опсоре1-М. , измерено 300 молекул; Б: С.Гаас1си3^а , измерено 96 молекул; В: Ь.реввоа1 , измерено 474 молекулы. По оси абсцисс отложена длина миниколец в микрометрах, по оси ординат - число молекул соответствующей длины. Вверх отложены кольцевые молекулы, вниз - линейные. В качестве ■ стандарта использовали кольцевые молекулы рвй 322.

циата представлял собой цепь миникольцевых розеток. Предполагается, что розетки представляют собой результат катенирования нескольких миникольцевых молекул. Связь между розетками осуществляется за счет молекул, одновременно входящих в состав двух соседних структур. Розетки можно обнаружить не только на периферии ассоциата, однако структурированность центральной

части выражена менее ярко по сравнению с краями. Хорошо выраженная розеточная структура ассоциата характерна именно для "низших" трипаносоматид - родов crithidia и Lept отстав > Б то время как у "высших" трипаносоматид - родов Trypanosoma и Leish-maniaрозеточная структура выражена не так явно.

На примере структуры мелких фрагментов ассоциатов мы попытались проанализировать характер связи между миникольцами. Ясно, что часть миниколец действительно связана друг с другом с помощью катенирования /рис.2/. Такой способ связи хорошо объясняет тот факт, что с помощью топоизомеразы II типа можно успешно рассыпать ассоциат. Однако, значительная часть миниколец связана за счет какого-то другого типа связи, назовем его "контактным" типом. Природа таких связей неясна, наиболее вероятны пептидные связки, так как при дополнительной мягкой фенольной обработке щЦНК, ассоциаты частично рассыпаются. ТЬт факт, что далеко не все миникольца связаны друг с другом посредством катенирования, подтверждается и достаточно частым обнаружением Х-образных молекул при обработке ассоциатов рестриктазами. Участие белков в упаковке ассоциата вообще можно считать бесспорным. Так ассоциаты кпДНК, выделенные мягким способом, без обработки какими-либо де-протеинизирующими агентами, представляют собой плотные ДНК-белковые образования. Недавно появилась работа / Silver et al.,1987/ в которой авторам удалось из свободных миниколец собрать структурированный ассоциат с помощью одного лишь спермидина, без участия топоизомераз.

Рис.2 Схемы электронномик-роскопических фотографий миниколец с.опсоре11;1 . Способы связывания - А: катени-рование ; Б: "контактный" тип связи.

Характер связи максиколец с ассоциатом миниколец никем детально не изучался. Нам удалось найти несколько примеров крепления максиколец посредством катенирования.

1.2. Рестрикционный анализ- структуры ассоциатов- кпДНК.-

Параллельно, с электронной микроскопией анализ молекулярного состава ассоциатов проводился также с помощью рестриктаз. Обработка ассоциатов кпДНК рестриктаз шли, узнающими гексануклеотид-ные последовательности, приводит к выщеплению целых кольцевых и линейных молекул. На рис.3 в качестве примера показаны результаты расщепления рестриктазаыи кпДНК С.1авс1си3^а .

Рис.3 Электрофоретический анализ продуктов расщепления кпДНК С.:Са8с1си1а-Ьа различными рестриктазами: а - кпДНК, обработанная фенолом ; б - нативная кпДНК ? в - кпда, расщепленная ЕсоЫ , Г - ВвтН1 , Д -Н1пс1111 , е - СГг11 , Ж -ЭаКЛ . Цифровые обозначения: I - нерас-щепленная кпДНК, остающаяся на старте; 2 - зоны миникольцевых олигомеров; 3 - кольцевая ре-лаксированная форла миниколец; 4 - линейная форма; 5 - кольцевая суперскрученная форда.

Свободные кольцевые молекулы появляются в результате расщеп-' ления колец , первоначально удерживающих их в составе ассоци-ата. Ни один из ферментов, узнающих гексануклеотидные последовательности, не расщепляет все жнико ль цевке молекулы, входя- ■' щие в ассоциат. При расщеплении кпДНК парами рестриктаз наблюдается аддитивное увеличение интенсивности миникольцевых зон, фрагментов миниколец при этом, как правило, не образуется,- Эти данные позволяют заключить, что как и в случай большинства исследованных трипаносоматид, миникольца с.опсореИ;! , С.Таас1си-

и ь.резаоа! гетерогенны по последовательности оснований.. При электрофоретическом анализе ассоциатов, мягко обработанных фенолом /дорожка а на рис.3/, появляются зоны, подвижность- ко-<

а б в г д е ж

торых соответствует подвижности кольцевых' молекул, что ещё раз подтверждает, что обработка фенолом не является причиной механического разрыва миниколец при встряхивании, а высвобождает целые кольцевые молекулы за счёт удаления пептидных связок.

Некоторые рестриктазы /дорожка е на рис.3/ фрагментируют миникольца, образуя набор, нестехиометрических зон, отражающих гетерогенность популяции миниколец. Очень хорошо гетерогенность-выявляется при расщеплении кпДНК рестриктазами, узнающими тет-рануклеотидные последовательности.

Кроме зон, соответствующих мономерным миникольцевым молекулам, наблюдаются зоны, образованные минихольцевыми олигомерами. Для более четкого выявления олигомерных зон у С.ГаасХсиЗ^а мы использовали гибридизацию ЕсоЫ перевара кпДНК с.*аво1си]^а с меченой ^Р кпДНК С.1ис111ае , которая является подвидом C.íaacieulata /рис.4/. На дорожке А видна ярко выраженная оли-гомеризация миниколец С.*авс1си1а*а . Миникольца самой с.1и-с111ае практически не образуют олигомеров - дорожка Б.

А В

^ Рис.4 Автограф /схема/ продуктов гибридиза-

w ции меченой ^Р кпДНК С.1ис111ае с ЕооВ1

переварами: I- кпДНК С.:Га8с1си1ага, 2- кп,ЩК С.ХиоШае .

2. Клонирование миниколец С.опсореИ;! и С.;Гаас:1_си:1^а .

Для дальнейшего более детального изучения было решено получить ряд клонированных в плазмидных векторах миникольцевых последовательностей. Одаако, неожиданно оказалось, что получить полноразмерные миникольцевые вставки в плазмидных векторах, а

также в векторах на основе фага ЩЗ , невозможно. Имеющиеся в литературе данные соответствуют нашим результатам. Хорошо клонируются- только небольшие по размеру миникольца'"высших" три-паносоматид. В случае же "низших" триланосоматид даже клоны ■ содержащие только половину миникольца оказывались нестабильными.

Известно, что последовательности, содержащие "неудобные" для E.coli гены, можно успешно клонировать в лямбдовых векторах, так как при литическом пути развития фага накопление угнетающих E.coli продуктов экспрессии рекомбинантной встройки роли не играет. Использование фага лямбда в качестве, вектора и в нашем случае оказалось успешным. Используя векторный фаг АХШ /получен от В.И.Ксензенко, Пущино/ мы получили ряд клонов, содержащих полноразмерные миникольцевые встройки c.faa-ciculatа и С.oncopelti , линеаризованные по EooRl- сайту. Из 4-х основных классов миниколец C.oncopelti проклонировались только миникольца размером 1900 пар нуклеотидов. Неясно, чем объясняется этот факт, возможно, тем, что не все классы линеаризуются EcoRI.

При выделении полученных рекомбинантных фагов в препаративных количествах мы неожиданно столкнулись ещё с одной трудностью. Методы, основанные на концентрировании частиц фага путем центрифугирования в градиенте плотности csCl или глицерина, в нашем случае не работали. После центрифугирования мы не наблюда-• ли зоны фага в центрифужной пробирке, хотя количество внесённых фаговых частиц было достаточным для образования чёткой зоны.' Надо отметить, что титр фага в культуре был очень высоким и почти всегда достигал 10^ БОЕ/мл. В контрольной пробирке с векторный" фагом зона фага всегда была хорошо видна. Попытки просто осадить фаг высокоскоростным центрифугированием при 100 тыс. g в течение 4-х часов также не увенчались успехом. Из полученных результатов следовало единственно возможное объяснение этого феномена : наши рекомбинантные фаги имели гетерогенную, аномально низкую плавучую плотность. Эта гетерогенная плотность могла быть вызвана сорбцией каких-то белков или коротких пептидов на фаговую частицу в нестехиометрических количествах. Если это действительно так, надо было,'искать альтернативный

метод концентрирования и очистки фаговых частиц, не зависящий от- шготносгных свойств. Мы применили метод , основанный на сорбции фаговых частиц на ДЕАЕ-целлюлозе за счет отрицательно заряженных групп на белковом чехле фага Л . Все опробованные нами рекомбинантные фаги были успешно получены этим методом, за исключением одного, содержащего мажорный миникольцевой класс с.fasciculate . Для этого фага подобрать подходящий метод очистки не удалось.

Получив очищенные фаговые частицы, мы решили проверить нашу гипотезу о нестехиометрической сорбции дополнительных белков и проверили состав белков фаговых чехлов рекомбинантного фага я R9 » содержащего миникольцо C.oncopelti и векторного фага /рис.7/.

Рис.7 Схема электрофореза белков фаговых чехлов. А - векторный фаг Д XIII ; Б - ре-комбинантный фаг Аид , Стрелкой справа отмечен дополнительный белок весом около 17000 дальтон.

Действительно, среди белков чехла рекомбинантного фага был обнаружен дополнительный белок с молекулярным весом около 17000 дальтон. Поскольку системы вектор -хозяин в случае рекомбинантного и векторного фагов были идентичными за исключением миникольцевой встройки, можно предположить, что синтез этого пептида каким-то образом направляется миникольцевой встройкой. Отметим, что все наши рекомбинантные фаги и из с.опсоре1^ и из С^аас1с10^а обладали гетерогенной плотностью.

Интересно, что хотя ранее в некоторых работах отмечалась лёгкость клонирования миникольцевых молекул в А-векторах, в последующем ни в одной работе не использовались такие клоны. Возможно, исследователи столкнулись с такой же проблемой выделения рекомбинантных фагов, как и мы.

3. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных • миникояец.

Следующим этапом нашей работы было определение нуклеотидных последовательностей клонированных миниколец. Вначале была определена нуклеотидная последовательность большого Smal - фрагмента мажорного миникольца C.fasciculata , клонированного по тупым концам в pUCi9 • Рекомбинантная плазмида была названа pmcfl. С помощью метода однонаправленного укорочения экзонуклеазой III E.coli был получен набор делеционных производных плазмиды pnßfl , отличающихся друг от друга по длине на 150-200 нуклео-тидов. Первичная структура встроенного фрагмента ДНК была определена на основе прочтения концевых перекрывающихся последовательностей производных плазмид и последовательностей некоторых рестрикционных субфрагментов. Анализ определённой последовательности длиной 1371 нуклеотид будет обсуждаться позднее.

Далее было предпринято секвенирование миникольцевых последовательностей, находящихся в составе фага А . Для этого мы суб-клонировали фрагменты миникольцевой последовательности из реком-бинантного фагаЯНЭ , содержащего миникольцо С.oncopeltj. Предварительно, чтобы выбрать стратегию субклонирования и секвениро-вания била построена рестрикционная карта миникольцевой встройки. На рис.8 показана рестрикционная карта миникольцевой встройки C.oncopelti , там же показаны полученные субклоны и стратегия секвенирования. Все фрагменты были клонированы по тупым концам с достройкой концов фрагментом Клёнова. Центральный фрагмент клонировать не удалось. Все остальные фрагменты прочитаны полностью. Прочитанная последовательность составила 1051 нуклеотид.

Так как во время работы вышла статья наших американских коллег, в которой дается полная нуклеотидная последовательность мажорного миникольцевого класса C.fasciculata / Sugisalci & Ray , 1987/, мы решили определить первичную структуру минорного миникольца C.fasciculata с целью их сравнения. Построить точную рестрикци-онную карту миникольцевай встройки фагаЯИ22 не удалось, гак как почти все имеющееся в нашем распоряжении рестриктазы либо вовсе не расщепляли последовательность, либо фрагментировали её слишком мелко. Ориентировочная карта миникольцевой встройки ÄR22 дана на рис.9, там же показаны полученные клоны и стратегия еек-

ICBM

-+-V-T

A YH X

ц . V . ',

AM

ТЕТ-

РИС. 8 Рестрикционная карта миникольцевой встройки с.опоореХ-М. рекомбинантного фага Яеэ. Обозначения: А(А1и1), Б(ВерХ), С(С1г1 I), Е(ЕооЫ), Н(Н1а11), М(Мвр1), Х(ХЬо1), Х(ХЪа). Сплошные чёрные линии под картой - клонированные фрагменты. Пунктирные стрелки - направление и длина прочитанных участков.

К U iL) (l) FD

, ц . . , , , ,i . , ,l , .11 ,

Рис.9 Рестрикционная карта миникольцевой встройки с.faeoiculata рекомбинантного фага Дй22. Обозначения: D(Eco47 1), F(Cfr10 I), K(Kpnl), I>(Cfr13 I), R(EcoRI), U(Sau3A).

Сайты в скобках предположительные. Над рестрикционной картой показан кластер из трёх совершенных повторов. Стрелками указана ориентация крайних 'повторов. Сплошные чёрные линии под картой - клонированные фрагменты. Пунктирные стрелки - направление и длина прочитанных участков.

венирования. Не все фрагменты удалось клонировать. В последовательностях трёх неперекрывающихся фрагментов была обнаружена

идентичная часть длиной 225 нуклеотидов. По-видимому, эти три совершенных повтора образуют кластер. Два крайних повтора в кластере инвертированы друг относительно друга. Ориентация внутреннего повтора неизвестна.

4. Анализ миникольцевых последовательностей C.onoopelti и С,1asciculata .

Анализируя полученные данные, мы сравнили три известные мини-кольцевые последовательности с.tasciculata /рис.10/. Из рисунка видно, что определённые наш последовательности очень близки к последовательности из статьи американских авторов. Во всех трёх последовательностях обнаруживаются два консервативных прямых повтора длиной около 200 нуклеотидов, содержащих orí репликации Ни L- нитей. Их взаимное расположение и ориентация идентичны у мажорного и минорного классов миниколец C.fascioulata . Идентично также расположение, так называемого, участка "bent DNA" высококонсервативного участка, содержащего специфическую последовательность нуклеотидов, вызывавшую жесткий изгиб спирали ДНК. В такой последовательности короткие поли A-тракты, длиной 4-7 нуклеотидов повторяются с периодичностью равной периоду спирали ДНК, то есть через каждые 10 - II нуклеотидов. Эта периодичность и обусловливает изгиб спирали ДНК. Единственным обнаруженным отличием минорного класса миниколец от мажорного является наличие кластера протяженных совершенных повторов /разделение миникольцевых классов основано на небольших различиях в размерах,-минорные кольца несколько меньше/.

Интересно, что по обе стороны от участка изогнутой спирали расположены последовательности нуклеотидов, которые, находясь в однонитевой форме, способны принимать крестообразную вторичную структуру. На рис.НА показана вторичная структура, обнаруженная слева от участка изогнутой спирали, а на рис.IIB - справа от этого участка. Очень похожие структуры могут быть сложены и из последовательностей, фланкирующих область "beut DNA" в двух других известных миникольцевых последовательностях. Следует отметить, что тесная ассоциация участка со сходной вторичной структурой в виде клеверного листа и участка изогнутой спирали была обнаружена нами также и в последовательности нуклеотидов максикольцевой

ori

HU A RS

98

m 13 cfk ibb м 13 cfk isa

am

M H L Y _A_X

pmcf 1

ori M HR L

к Ли аа

Рис.10 Схемы трёх известных миникольцевых последовательностей С.fasciculate : верхняя схема - последовательность из статьи / Sugisaki & Ray, 19В7 /, средняя схема - последовательность Smai- фрагмента миникольца мажорного класса из рекомбинантной плазмиды pmCfl , нижняя схема - последовательность миникольцевой встройки минорного класса из ре-комбинантного фага Ай22. Зачернённые участки - области высокой гомологии, заштрихованные участки - области сравнительно низкой гомологии, белые участки - негомологичные области. Показаны ori Н-и Ь-нитей, области изогнутой спирали ДНК. Знаками а и л отмечены делеции и вставки соответственно, цифрами обозначен их размер в нуклеотидах. Сайты рестрикции обозначены: A(AluI), Е(Есо24 I), H(Hinfl), K(Kpnl), M(MluI), H(HruI), R(EcoRI), RS(Rsal), S(StuI), x(xhol), Y(Xbal). Illillilllll - кластер повторов.

ДНК C.oncopelti . Функциональная роль подобного комплекса структурных элементов остаётся невыясненной. В мтДНК ряда позвоночных сходные структуры были обнаружены в местах инициации и терминации синтеза Д-петли / Brown, 1986/. Авторами было выдвинуто предположение об участии крестообразных структур в контроле инициации синтеза Н-нити мтДНК. Необходимы дальнейшие исследования, в частности, поиск транскриптов миникольцевой ДНК, для того , чтобы прояснить вопрос о роли найденных структур.

В определённой последовательности C.oncopelti длиной 1050 . пар нуклеотидов обнаружен консервативный участок длиной примерно 150 пар нуклеотидов гомологичный консервативным участкам С.fasciculate и содержащий ori репликациин- и L- нитей. Уровень гомологии составил 5W. Внутри этого участка, между двумя, ori репликации лежит сайт для рестриктазы Cfn I , которая выщепляет-максимальное число миниколец всех четырёх классов из ассоциата c.oncopelti . Этот факт свидетельствует о том, что данный участок есть у всех или почти у всех миниколец, причем этот участок один, так как расщепления миниколец на пары фрагментов не наблюдается.

Найдена также последовательность, гомологичная последовательности из миникольца с.fasciculate , способной образовывать тРНК подобную структуру. Уровень гомологии этих последовательностей

ттбсс 6 т

С 6

• "с сс

Й-Т

6т т бТйТИбТб ТТТЙ6Й66 т

А £ 1> СЙТЙТСЙС ЯЙНТСТС й е Т-ЙТ8 6С„6

Т-й

ТТСЯТЯС-66С8ТЙ6

А

6ТТТ

6 т

Т 6 с-е

С-6

А 6-с Тс 661ТЙ-ТС'66 т Т

вт т тб^сбб йбибет • т ? 111-1 ШП т 6 Г, 6 ПСбВТС тстсс.

С-6П6 от

1*Н

с-е

тттбббс-бебббттт

Рис.11 Вторичные структуры ДК миниколец С.£аас1си2^а А - слева от участка изогнутой ''спирали , Б - справа от него.

Рис.12 Вторичная структура ДОК мини-С т кольца С .'опсореИ;!

в участке, гомологш-ном С,£авс1еиД^а.

т-я

G Я Т Т

T-R .т"6

т-я ТС _в Т-Я Ат л

т-я л т°

рр Г Т т Qflfl6BTfi

TGCGGflfiTGC GGHGTTB % I iiiiii • ■ ■ ■ ■ • т

от TCTnflCG TCTCAGo. .я ИТ " с "CfljflG

Т-6 fl_ ft Я-Т Т я-т я-т

AGGTTTGT-flGCGTflG

составляет 5®», то есть равен уровню гомологии участков ori рел> ликации. На рис.12 показана вторичная структура, которую способен образовывать этот участок. Межвидовая гомология последовательностей, способных образовывать тРНК подобные шпильки, косвенно подтверждает важную функциональную значимость обнаруженных структур. Структуры типа "bent ША" в определённой последовательности миникольца C.oncopelti нет.

Анализируя последовательности, расположенные меязду двумя ori репликации / н-и Ь- нитей/ в каждом консервативном повторе мини-колец с.fasciculate , мы обнаружили, что эти последовательности потенциально способны образовывать шпилечную структуру. Сравнительный анализ консервативных участков всех опубликованных мини-кольцевых последовательностей разных видов трипаносоматид позволил обнаружить подобные шпилечные структуры во всех миникольцах. На рис.13 представлены результаты анализа. Интересно, что верхушечная и боковые петли этих структур оказались гомологичными, хотя остальная часть проявила довольно низкую гомологию. Анало-

Т.Ьгисе! Т.сгиг! Т. 1еи151 С.опсореШ СЛа5Ыси1а*а ЫагепЫае

ТСС

Й с

А 6

го»"1

тцсйс-6

Ш

й-т й-т Й 6 С-6

ссс

С 6

с т

Т-Й

с с

тВСй-Т о т

Й-Т Й-Т

я-т 6 6 с т

С-6

6-е е-с 6 й 6 Й 1-Й Т-Й

сс

с с т

6-т

й-т й-т й-т 6-т Й 6 Я 6 6 6 6-С 6-С т-й т-й т-й т-й т-й т-й

Т

сст с т

С Й Т-Й Т с Т-Й

с т

Й-Т

«ей

«'Я

6-е е-с 6 й 6-т 6-т

с т т т

Т-Й

т-е т с 6 6 С-0 Й-Т й-Т

с с с с

А 6 Й-Т

сй66-с йтйб Й Т-Й Т-Й Т-Й Т"й

с т й с 6 й с-6 Т-6 Й-Т Й-Т Й-Т Й-Т 6-Т

с т

6-С

ее с с Й 6 Й-Т

Й-Тпй 6-СййЙ

йт 6-е "с 6-е

Т-Й Й Й Й Й Й й Й Й Й-Т 6-С С-6

Рис.13 Шпилечные структура, обнаруженные между ог! репликации н-иь- нитей ДНК.

гичныа палиндромныа. структуры также свойственны районам оrl из мтДНК дрожжей, млекопитающих и растений / Wahleichner & Wolsten-hoim, 1987 /. Интересно сопоставить эти данные с данными по обнаружению миникольцевого транскрипта у T.brucei. Обнаруженный транскрипт длиной 200 нуклеотидов перекрывается именно с консервативной областью, содержащей ori репликации. Следует отметить, что в течение длительного времени не удавалось обнаружить транскрипцию миникольцевой ДНК, поэтому кодирующую функцию миниколец считали маловероятной. Однако, обнаружение транскрипта миникольца Т.Ъгисе! и данные другой работы, где было найдено, что рекомби-нантная плазмида со вставкой миникольцевого фрагмента из c.fasci-culata направляет синтез гибридного белка в E.coli , сыворотка к которому иммунореактивна к антигенам из кинетопласта /Shlomai & Zadok, 1984 /, делают кодирующую функцию миниколец вполне вероятной. Наши данные по обнаружению белка с молекулярным весом 17000 дальтон, синтез которого направляется миникольцевой вставкой C.oncopelti, также свидетельствуют в пользу-этого предположения.

Поиск открытых рамок считывания в последовательности миникольцевой вставки pmCfi показал, что исследуемая последовательность потенциально способна кодировать набор полипептидов, самый длинный из которых состоит приблизительно из 200 аминокислот. Предполагается, что триплет tga кодирует триптофан. Неопределённость в отношении длины презумптивных полипептидов связана с тем, что инициаторными кодонами помимо atg в кинетопласте мохут быть триплеты, кодирующие лейцин и изолейцин.

Сравнение последовательностей различных миниколец C.iascicula-ta показывает, что за исключением областей изогнутой спирали и прямых консервативных повторов, дивергенция последовательностей сопровождается значительным числом вставок-делеций, нарушающих фазу считывания. Подобный тип эволюции нехарактерен для митохонд-риальных кодирующих последовательностей. Поэтому при трансляции, если таковая происходит, должен действовать механизм коррекции сдвига рамки, подобный обнаруженному в случае некоторых макси-кольцевых генов /Benne et al., 1985 /, либо функция миникольцевых полипептидов и не предполагает протяженной гомологии последовательностей аминокислот. В отношении второго предположения обнаружился интересный факт при анализе профилей гидрофобности пре-

зумптивных полипептидов, кодируемых открытыми рамками считывания, расположенными в консервативных участках миниколец различных групп трипаносоматид /рис.14/. Во всех случаях прослеживается сходная доменная структура, несмотря на отсутствие гомологии в первичной структуре пептидов.

А Рис.14 Профили гидрофоб-

ности пептидов, потенциально кодируемых Н-нитью консервативных областей:

А -Б -В -

Т.Ьгисе1

С.1авс1си1аЪа

1>.£агеггЬо1ае

ВЫВОДЫ.

X. Методами электронной микроскопии и рестрикционного анализа охарактеризованы ассоциаты кпДНК трёх видов трипаносоматид: с.опооре!« , с,1азс1си3^а и ь.реавоа! . Показано, что мини-

кольца C.oncopeiti имеют нехарактерную для трипаносоматид выраженную гетерогенность по размеру. Миникольца всех трёх видов гетерогенны по последовательности оснований. Показано, что мини-кольца в составе ассоциата соединены не только посредством кате-нирования, но и за счет, по-видимому, белковых связок.

2. В Л-векторах клонированы полноразмерные миникольцевые последовательности видов С.fasciculate и C.oncopeiti. Обнаружено, что эти последовательности обладают способностью рекомбинировать в гесА+ штаммах E.coli, что характерно для инвертированных повторов.

3. Определены частичные первичные структуры миниколец мажорного и минорного классов С.fasciculate и миникольца одного из классов C.oncopeiti.

4. Проведен анализ полученных последовательностей, а/ Обнаружены последовательности, потенциально способные образовывать вторичггую структуру типа тРНК. Эти последовательности гомологичны у двух изученных видов трипаносоматид С.fasciculate и C.oncopeiti.

б/ обнаружен кластер из трёх повторов длиной 225 пар нуклеотидов в минорном классе миниколец с.fasciculate . в/ Предложена вторичная структура района ori репликации у разных видов трипаносоматид. г/ Проанализированы открытые рамки считывания как на полученных нами последовательностях, так и на других известных мишколь-цевых последовательностях. Обнаружено сходство доменной структуры пептидов, потенциально кодируемых Н-нитью консервативной области миниколец трёх родов: Crithidia , Trypanosoma и Leishmania .

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Маслов Д.А., Энтелис Н.С., Метт И.Л., Резепкина / Гладкая/ Л.А., Колесников А.А., Зайцева Г.Н. Организация ДНК кинетопласта низших трипаносоматид. В кн.: Современные проблемы протозоологии / материалы III съезда Всесоюзного общества протозоологов/ / Ред. Полянский ¡С.К., Вильнюс : Ин-т зоологии и паразитологии АН ЛитССР, 1932, с.223.

2. Колесников А.А., Маслов Д.А., Резепкина /Гладкая/Л.А., Зайцева Г.Н. Характеристика кинетопластной ДНК Leptomonas pessoai . - Мол. биология., 1984, т.18, РЗ, с.591-598.

3. Резепкина /Гладкая/Л.А., Маслов Д.А., Колесников А.А. ДНК ки-

нетопласта Crithldia oncopelti. Выявление принципов структурной организации миникольцевых молекул ДНК. - Биохимия, 1984, т.49, №3, с.444-454.

4. Резепкина /Гладкая/Л.А., Колесников A.A. Ассоциат кинетопласт-ной ДНК претерпевает реорганизацию в процессе роста культуры

Crithldia oncopelti. Совр.пробл.протозоологии. Материалы 1У' съезда Всесоюзного об-ва протозоологов., Л.."Наука", 1987, с.27.

5. Маслов Д.А., Резепкина /Гладкая/Л.А., Колесников A.A. Некоторые элементы структуры миникольцевой кинетопластной ДНК Crithldia fasciculata . - Мол.биология, 1988, т.22, Р6, с.