Противоречия морфологического и молекулярно-филогенетического подходов в систематике трипаносоматид

Костыгов, Алексей Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Противоречия морфологического и молекулярно-филогенетического подходов в систематике трипаносоматид
ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Противоречия морфологического и молекулярно-филогенетического подходов в систематике трипаносоматид"

На правах рукописи

КОСТЫГОВ Алексей Юрьевич

ПРОТИВОРЕЧИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО И МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОДХОДОВ В СИСТЕМАТИКЕ ТРИПАНОСОМАТИД

03.02.11 — Паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 I ЯНВ 2013

Санкт-Петербург 2013

005048924

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологический Институт Российской академии наук

Научный руководитель:

Фролов Александр Олегович, доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Скарлато Сергей Орестович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук, заместитель директора по научной работе и зав. лабораторией цитологии одноклеточных организмов

Кудрявцев Александр Александрович, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный университет, старший преподаватель кафедры зоологии беспозвоночных

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова.

Защита состоится «-19 гнргьрЦ/Я 2013 г. в Щ часов на заседании диссертационного совета Д 002.223.01 при Зоологическом институте РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Зоологического института РАН Автореферат разослан <г/3 »уКЬйр) 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Овчинникова Ольга Георгиевна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Семейство ТгурапоБотайске объединяет паразитических простейших, многие из которых имеют большое практическое значение. К этой группе относятся трипаносомы и лейшмании, вызывающие тяжелые заболевания у человека и домашних животных, а также фитомонасы, которые поражают культурные растения, нанося тем самым большой экономический ущерб. За последние годы накопилось немало данных о том, что считавшиеся ранее вполне безобидными гомоксенные паразиты насекомых также при определенных условиях могут заражать человека, животных и растения.

Способность трипаносоматид расти на аксеничных средах и быстро накапливать биомассу определяет их широкое применение в качестве модельных объектов в различных областях биологии. Кроме того у этих жгутиконосцев имеется ряд особенностей, изучение которых имеет общебиологическое значение. Среди них: необычная клеточная органелла - кинетопласт, редактирование РНК, полицистронная транскрипция большинства генов, транс-сплайсинг и другие.

Традиционная система семейства основана на соотнесении определенных морфотипов клеток, доминирующих в жизненном цикле жгутиконосцев, с конкретным таксоном родового уровня. В случае если один морфотип встречается у гомоксенных и гетероксенных трипаносоматид как, например, у Ьеркитюпаз и РЬ^отопав, для их разделения используются характеристики жизненного цикла.

В силу важности группы, трипаносоматиды одними из первых оказались в поле зрения молекулярных филогенетиков, и очень скоро выяснилось, что получаемые филограммы, категорически не соответствуют традиционной системе семейства. Так, к примеру, на данный момент, безусловно доказана полифилия четырех базовых родов гомоксенных трипаносоматид - СгИЫсНа, 11егрек)топа$, В1азХоспМ<Иа и ЬерЮтопаз. А вот симбионт-содержащие виды, представители которых согласно системе семейства принадлежат к трем различным родам (СгИЫсНа, НегреЮтопав и В1а$№сг'иЫ(ка), формируют на молекулярных деревьях монофилетическую кладу. Ситуация усугубляется тем, что в последнее время система стала наполняться новыми таксонами выделяемыми на основе одних только данных молекулярной филогении и без какого-либо дополнительного обоснования. Создаваемая таким образом химерная конструкция уже не способна объективно отражать истинное разнообразие группы и вступает в противоречие с основными принципами биологической систематики.

Таким образом, очевидно, что систематика сем. ТгурапоБотаМае переживает в настоящее время глубокий кризис. Для его преодоления, прежде всего, важно понять, из-за чего возникают противоречия между традиционным морфологическим и сравнительно новым молекулярно-филогенетическим подходами в систематике трипаносоматид, и попытаться их разрешить. Анализу этих вопросов и посвящена настоящая работа.

Степень разработанности темы исследования

Тема, рассматриваемая в настоящем исследовании, неоднократно затрагивалась в литературе посвященной систематике трипаносоматид. Однако в большинстве подобных работ содержится лишь констатация факта существования противоречий между морфологическим и молекулярно-филогенетическим подходами и отсутствует подробный анализ причин. Практически нигде до сих пор не были рассмотрены возможные пути выхода из данного конфликта, вместо этого обычно предлагали отказ от использования морфологических признаков как ненадежных и построение системы только на основе молекулярно-филогенетический подхода.

Настоящее исследование было призвано восполнить пробел в изучении упомянутой проблемы и продемонстрировать преимущество комплексного рассмотрения вопросов связанных с реконструкцией филогении и созданием системы трипаносоматид.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы было исследование причин противоречий между морфологическим и молекулярно-филогенетическим подходами к созданию системы трипаносоматид и определение вероятных путей преодоления этих противоречий. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

— выполнить ретроспективный анализ развития взглядов на систему трипаносоматид

— провести исследование коллекционного материала и природных изолятов гомоксенных трипаносоматид с целью расширения списка видов, включаемых в молекулярно-филогенетический анализ

— переисследовать те виды трипаносоматид, изоляция которых в культуру сопровождалась сменой морфотипов

— осуществить проверку гипотезы о монофилии цистообразующих трипаносоматид

— выполнить филогенетический анализ семейства с использованием генов 18S, 28S, мини-экзона, и HSP83

— исследовать известные примеры противоречий между современной системой трипаносоматид и результатами молекулярно-филогенетических исследований и выявить причины подобных противоречий

— определить вероятные пути преодоления противоречий между морфологическим и молекулярно-филогенетическим подходами к созданию системы трипаносоматид

Научная новизна

На светооптическом уровне исследованы природные изоляты 12 цистообразующих видов из родов. Blastocrithidia и Leptomonas (в том числе 7 ранее неизвестных), а также 22 лабораторные культуры до сих пор неописанных видов трипаносоматид из коллекции Зоологического института РАН, которые были выделены его сотрудниками.

Описан один новый для науки вид (СгИЫсНа с1ес1\'а) и обосновано перенесение другого вида (ЬерЮтопая паЫси1ае) в род Негрйотопав.

Продемонстрированы многочисленные ошибки допущенные исследователями, приводившие к несоответствию таксономического положения филогенетическому у различных видов трипаносоматид.

Обнаружено, что смешанные заражения разными видами трипаносоматид, ранее считавшиеся редким явлением, могут быть весьма частными у некоторых групп хозяев.

При помощи молекулярно-филогенетических данных подтверждена морфологическая гипотеза о монофилии цистообразующих трипаносоматид.

Предложена схема эволюции процесса формирования цистоподобных амастигот - фактически первый детально рассмотренный трансформационный ряд у трипаносоматид.

Впервые показано наличие филогенетической группы трипаносоматид, представители которой, несмотря на видимое отсутствие отличительных морфологических признаков, характеризуются редукцией редактируемого домена кинетопластного гена N08.

Впервые проведено тестирование гена Н8Р83 в качестве молекулярного маркера у трипаносоматид. Показано, что реконструкция филогении по данному гену может давать значительные искажения, у отдельных видов выявлены его вероятные псевдогены.

Предложен комплексный подход к построению системы трипаносоматид.

Теоретическая и практическая значимость работы

Данное исследование имеет важное теоретическое значение для изучения трипаносоматид, так как в нем продемонстрирована несостоятельность традиционной системы, предложены принципы построения новой и указаны типичные ошибки, допускаемые исследователями. Разработанные последовательности праймеров и полученные сиквенсы различных генов могут быть использованы в молекулярно-филогенетических исследованиях данной группы, а также для диагностических цепей в фаунистических работах по трипаносоматидам.

Настоящее исследование проводилось в рамках рассмотрения фундаментальной проблемы соотношения различных типов данных и их применимости для систематики. Результаты проведенного анализа противоречий между морфологическим и молекулярно-филогснетичсским подходами, в частности выявленные причины и предложенные пути выхода из конфликта, могут быть представлять интерес для подобных исследований в других группах эукариот. Приведенные в настоящей работе данные по особенностям эволюции белок-кодирующего гена ШР83 будут полезны для исследователей, подбирающих молекулярно-филогенетические маркеры для анализа дргугих групп протистов. Результаты исследования также могут быть использованы в курсах лекций по протистологии для студентов биологических специальностей вузов.

Методология и методы исследования

При написании настоящей работы в методологическом плане подбирались актуальные на данный момент методы, широко применяющиеся в зоологических исследованиях. К ним относятся:

— методы сбора материала и его первичной обработки (ловля и вскрытие насекомых)

— морфологические методы, связанные с приготовлением и микроскопическим исследованием временных препаратов и мазков клеток трипаносоматид

— методы молекулярной биологии, такие как выделение ДНК, ПЦР, гель-электрофорез и секвенирование ДНК, анализ состава последовательностей и проверка их на наличие химер

— молекулярно-филогенетические методы, связанные с выравниванием последовательностей и реконструкцией филогении.

Положения, выносимые на защиту

1. Главная причина конфликтов традиционной системы трипаносоматид с результатами молекулярно-филогенетических исследований состоит в том, что эта система изначально является искусственной.

2. Новая система этой группы должна базироваться исключительно на филогенетическом подходе и согласованных между собой разных типах данных (молекулярных и фенотипических).

3. Из всех молекулярных маркеров, которые до сих пор применялись для реконструкции филогении трипаносоматид, ген 18S рРНК обеспечивает наилучшие результаты как в плане разрешения родовых и надродовых групп, так и в плане соответствия другим типам данных.

Степень достоверности и апробация результатов

Основные результаты диссертационного исследования были представлены на Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), V и VI Европейских конгрессах по протистологии (Санкт-Петербург, 2007; Берлин, Германия, 2011), Всероссийской конференции молодых ученых "Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов" (Москва, 2008), Международном симпозиуме "Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetics" (Владивосток, 2009), Второй Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010), Всероссийской конференции молодых ученых «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 2010). Апробация исследования была также осуществлена путем выступления автора на отчетных сессиях Зоологического

института РАН в 2004, 2005 и 2010 годах и на семинарах лаб. молекулярно-генетической систематики. Кроме того, результаты диссертационной работы были включены в Отчеты по программам президиума РАН "Происхождение и эволюция биосферы" и "Научные основы сохранения биоразнообразия России" за 2007-2012 годы. Диссертация была обсуждена на совместном заседании лабораторий молекулярно-генетической систематики и протозоологии Зоологического института РАН.

Публикации

По теме исследования опубликовано 11 работ, в том числе 3 из них - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Струю-ура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 разделов (Обзор литературы, Материал и методы и Результаты и обсуждение) заключения, выводов, списка литературы и приложений. Общий объем составляет 201 страницу. Работа проиллюстрирована 42 рисунками и 12 таблицами. Список литературы содержит 338 источников, в том числе 42 русскоязычных.

Благодарности

Эта работа не была бы выполнена без содействия и помощи множества людей, которых мне бы хотелось поблагодарить.

Прежде всего, я глубоко признателен моему научному руководителю А.О. Фролову за терпеливость и отзывчивость в течение всего периода подготовки диссертации. Я благодарен М.Н. Малышевой за помощь в работе с лабораторными культурами и предоставление коллекционных микроскопических препаратов, О.В. Митевой и А. А. Кузьмину за помощь в сборе материала, A.A. Добровольскому за внимание и поддержку на всех этапах подготовки работы, B.C. Лебедеву за консультации по методам филогенетического анализа, A.A. Колесникову и Д.А. Маслову за предоставление образцов ДНК трипаносоматид.

Кроме того я хочу выразить признательность Е.В. Канюковой, Д.А. Гапону и покойному И.М. Кержнеру за профессиональное определение полужесткокрылых. Также я благодарен коллективу моей лаборатории и в особенности зав. H.H. Абрамсон за создание дружелюбной атмосферы.

Отдельно я хочу поблагодарить членов моей семьи, за веру в мои возможности, неиссякаемое терпение и воодушевление.

Настоящая работа была выполнена при финансовой поддержке программ президиума РАН "Происхождение и эволюция биосферы" и "Научные основы сохранения биоразнообразия России".

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В разделе рассмотрена история формирования существующей системы семейства Trypanosomatidae, ее современное состояние и принципы построения. Дана общая характеристика группы, включая морфологию, жизненные циклы, распространение и наличие у ее представителей генетического обмена. Проанализированы известные примеры противоречий молекулярно-филогенетических данных и традиционной системы трипаносоматид, и на основании их анализа выбраны объекты исследования. Также рассмотрены молекулярные маркеры, используемые при реконструкции филогении семейства, и обоснован выбор тех из них, которые применялись в настоящем исследовании.

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 2.1 Фаунистические сборы

Изучение фауны трипаносоматид полужесткокрылых проводили на материале, собранном с 2003 по 2009 год. Основная часть сборов была сделана в окрестностях ББС ЗИН РАН и МБС СПбГУ (респ. Карелия), и относительно небольшое количество насекомых было исследовано в Элисте, Казани, а также различных точках Ленинградской и Оренбургской областей. Всего было вскрыто 2753 клопа (относящихся к 68 видам из 17 семейств), из которых 523 оказались зараженными. Экстенсивность инвазии у разных видов варьировала в диапазоне от 0 до 100%.

При обнаружении трипаносоматид часть материала с предметного стекла помещали в пробирку для последующего выделения ДНК, а из оставшегося материала приготавливали тонкие мазки, которые окрашивали по Гимза для последующего изучения морфологии клеток.

2.2 Лабораторные культуры и архивные препараты

Культуры клеток трипаносоматид из коллекции ЗИН РАН, выращивали на среде BHI (Brain Heart Infusion) с добавлением гемина. Из культур приготавливали сухие мазки и выделяли ДНК. Клонирование клеток осуществляли на плотной среде (BHI+агар+гемин) путем высева капли культуры разведенной до конц. 500 кл/мл.

Всего в работе было использовано 29 лабораторных культур (морфология была изучена у 15 из них), и ДНК 5 культур отсутствующих в коллекции.

Для изучения морфологии жгутиконосцев из кишечника хозяина были использованы хранящиеся в коллекции Лаборатории протозоологии Зоологического типовые препараты Blastocrithidia gerricola, В. miridarum, Leptomonas nabiculae, L. occidentalis и изолята "Nfm2". Три архивных препарата с клетками Leptomonas oncopelti были использованы для выделения ДНК и последующей амплификации гена 18S рРНК.

2.3 ПЦР и секвенированне

Для амплификации и секвенирования использованных в работе генов 18S рРНК, 28S рРНК, 5S рРНК, мини-экзона, HSP83 применяли 6 опубликованных ранее так и 16 специально разработанных для настоящего исследования праймеров.

Также была предприняты попытки амплификации генов PFR1, EFla и топоизомеразы II, однако в связи с тем что в отношении многих важных групп трипаносоматид эти попытки были неуспешными, от этих генов пришлось отказаться.

Область ITS (ITS1-5,8S-ITS2) амплифицировали полностью или по частям. Благодаря изменчивости ПЦР-продуктов по длине оказалось возможным сравнивать образцы из фаунистических сборов между собой, а по наличию множественных продуктов судили о смешанном заражении.

Секвенированне всех образцов осуществляли напрямую на автоматическом секвенаторе ABI 3130. Полученные последовательности редактировали вручную и объединяли в контиги (общим числом более 200) в программе DNA Baser v. 2.8.

2.4 Филогенетический анализ

* Для филогенетического анализа в дополнение к полученным настоящей работе последовательностям, еще 117 сиквенсов были извлечены из базы данных Genbank. Выравнивание их проводили при помощи программы Muscle v. 3.8.31 и затем правили вручную в программе Bioedit 7.0.5.

Ненадежно выровненные позиции у набора данных по гену HSP83 были удалены вручную. В остальных случаях была применена программа Gblocks 0.91b.

В настоящей работе два набора данных были составными: по гену гена HSP83 (отдельные параметры для каждой из позиций кодона) и конкатенированный набор из генов мини-экзона и 5 S рРНК (отдельные параметры для каждого из генов). В остальных случаях, из-за различий результирующих филогенетических реконструкций по отдельным генам объединение разных генов в составные наборы данных не производили.

Подбор моделей эволюции осуществляли в программах Jmodeltest 0.1.1 для нуклеотидных данных и Treefinder (версия марта 2011 года) для аминокислотных.

Анализ методом максимального правдоподобия проводился в программах PhyML v. 3.0, RAxML v. 7.0.4 и Treefinder в зависимости от необходимых параметров анализа. Тестирование топологий проводили методом бутстрепа с использованием 1000 реплик.

Реконструкцию филогенетических деревьев по методу Байеса осуществляли при помощи программы MrBayes 3.2.1. Проверка данных на гетерогенность паттернов замен была осуществлена при помощи Disparity index test в программе Mega v. 5.10.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Характеристика обнаруженных видов цистообразующих трипаносоматид

Всего в ходе фаунистических исследований нам удалось обнаружить семь видов рода Blastocrithidia, в том числе четыре ранее описанных (В. miridarum, В. gerricola, В. inflata и В. raabei), пять видов цистообразующих представителей p. Leptomonas (включая описанного ранее L. jaculum), а также Leptomonas rigidus у которого, согласно литературным данным также наблюдали цистоподобные амастиготы. Оказалось что этот последний вид на самом деле не является цистообразующим, однако в тех же видах клопов, которые являются хозяевами L. rigidus, встречается другой лептомонас, формирующий цистоподобные амастиготы в ходе жизненного цикла. Таким образом, ранее признаки этих двух видов искусственно смешивались.

В настоящей работе не удалось обнаружить существенных отличий в способах формирования цистоподобных амасгагот у бластокритидий из наземных полужесткокрылых. Однако у лептомонасов отличия в процессе формирования цист были очень хорошо заметны. У одних видов цистообразование происходило в результате почкования на жгутике материнской особи, а у других - в результате равных (или почти равных) делений. Материнской особью могла быть как свободная промастигота, так и форма со жгутиком, видоизмененным в прикрепительную органеллу. Равные деления в ходе цистообразования могли осуществляться у клеток, объединенных в розетки или же у одиночных прикрепленных форм. Зрелые цисты либо сохраняли связь друг с другом, формируя группы по две, четыре или более клеток, либо располагались поодиночке.

3.2 Blastocrithidia miridarum и В. gerricola

Исследование культур KV1 и ВМ-33, которые до сих пор считались типовыми для Blastocrithidia gerricola и В. miridarum соответственно, показало, что в них содержатся клетки совершенно несвойственные бластокритидиям - хоано-, эндо- и брохомастиготы. Эти клетки достоверно отсутствуют в жизненном цикле В. miridarum, который был детально описан по результатам экспериментального заражения [Фролов, 1987]. Что касается В. gerricola, хотя ее жизненный цикл целиком не описан, однако известно что, как и у В. miridarum основным морфотипом у нее является эпимастигота, а расселительной стадией - цистоподобная амастигота, хотя процесс ее формирования происходит иначе [Фролов и др., 1997]. Таким образом, жгутиконосцы, присутствующие в так называемых типовых культурах обеих бластокритидий, не только не соответствуют диагнозу этих видов, но и не могут быть частью их жизненного цикла.

Набор морфотипов, которые встречаются в культурах KV1 и ВМ-33, соответствует диагнозу рода Wallaceina. Филогенетический анализ по генам 18S рРНК (Рисунок 1), 5S рРНК и мини-экзона подтвердил теснейшее родство жгутиконосцев этих культур со всеми описанными на данный момент представителями данного рода. Из всего этого следует, что обе обсуждаемые культуры содержат валласеин.

\"Blastocrithldia gerrico/a* KV1\ 'Blastocrithidia miridarum" BM331 Wallaceina podlipaevi Wallaceina brevicula Wallaceina Inconstans — Crithidia fasciculata —I"Blastocrithidia miridarum" ZM] Leptomonas podlipaevi Leptomonas seymouri — Leptomonas pyrrhocoris — Leptomonas costaricensis Leishmania major Leishmania donovanl

Endotrypanum monterogeii

1.0/1001-Herpetomonas samueipessoai

-Herpetomonas muscarum

Herpetomonas mariadeanei

I-Phytomonas sp. HART

-Phytomonas serpens

1.0/100 r Leptomonas rigidus

Leptomonas cof/osoma

Trypanosomatidae gen. sp. Eva Sergeia podlipaevi

Angomonas deanel

1.0/1001-Strigomonas culicis

~ Strigomonas oncopelti

1.0/100

Blastocrithidia gerricola

Blastocrithidia miridarum

1.0/1001 Г Blastocrithidia cyrtomeni 0.98/771Г Blastocrithidia largi 0.94/841 Blastocrithidia triatomae

■ Trypanosoma brucei

Trypanosoma pestanal Trypanosoma mega

Trypanosoma cobltis

Bodo uncinatus

■ Trypanoplasma borreii • Parabodo caudatus

0.05

Рисунок 1 — Филогенетическое дерево, реконструированное методом максимального правдоподобия по последовательностям гена 18S рРНК. Значения в узлах соответсвуют апостериорным вероятностям и процентам бутстреп-поддержки. Значения менее 0.5 или 50% соответственно заменены прочерками. Длина ветвей пропорциональна количеству замен. Ветви, укороченные вдвое, перечеркнуты двумя косыми чертами. Инверсией цвета шрифта и фона отмечены природные изоляты Blastocrithidia gerricola и В. miridarum, а обводкой -культуры, которые приписывались этим видам.

Филогенетический анализ, проведенный с использованием изолятов Blastocrithidia gerricola и В. miridarum, выделенных в ходе настоящей работы, продемонстрировал, что они близки к другим видам бластокритидий и значительно удалены от валласеин. Таким образом, на данный момент никакого противоречия между морфологическими и молекулярными данными в отношении этих видов не осталось.

Теперь, с учетом всех известных фактов понятно, почему такое противоречие имело место ранее. Присутствие на типовых препаратах В. gerricola и В. miridarum клеток, которые по морфологии можно отнести к валласеинам, указывает на то, что описание обоих видов было осуществлено на смешанном материале. Из литературы и из опыта настоящего исследования известно, что культивирование бластокритидий вызывает затруднения, а тех, что паразитируют в водомерках, вообще ни разу не удавалось выделить в культуру. В то же время разведение представителей рода Wallaceina на жидких и твердых искусственных средах осуществляется довольно легко. Отсюда вполне закономерно, что из смеси бластокритидий и валласеин, которые присутствовали в исходных изолятах, только вторые успешно размножались на искусственной среде. Полученные таким образом культуры были ошибочно идентифицированы как В. gerricola и В. miridarum и использовались под этими названиями в разнообразных исследованиях, в том числе и филогенетических. Таким образом, представления о конфликте морфологических и молекулярных данных возникли из-за того, что эти разные типы данных были получены на совершенно разном материале.

33 Leptomonas nabiculae

Мы изучили морфологию клеток в различных культурах и изолятах, выделенных из Nabis flavomarginatus: в исходном изоляте и в культуре Nfm2, в "типовой" культуре вида L. nabiculae D2, а также на типовых препаратах L. nabiculae и L. occidentalis. Морфология клеток гапантотипа Leptomonas peterhqffi, который был выделен из того же вида хозяина была подробно рассмотрена ранее [Малышева, Фролов, 2009]. Кроме того нами был проведен филогенетический анализ по гену 18S рРНК с участием культур D2 и Nfm2.

Все три вида p. Leptomonas, описанные из Nabis flavomarginatus (L. nabiculae, L. peterhoffi и L. occidentalis) a также изолят Nfm2 характеризуются наличием сходного спектра изменчивости промастигот, как по форме, так и по размеру. Дтя всех этих трипаносоматид характерно присутствие трех условных размерных категорий промастигот коротких (6—10 мкм), длинных (11—22 мкм) и гигантских (более 22 мкм). Проведенный нами эксперимент по клонированию культуры Nfin2 рассеял сомнения относительно того что столь разные по длине клетки могут принадлежать к одному виду.

Культура D2 по морфологии клеток отличалась от всех этих видов. Она была представлена, по большей части, характерными для p. Crithidia хоаномастиготами. На типовом препарате Leptomonas nabiculae подобные клетки отсутствовали. Из литературы известно, что при экспериментальном заражении клетки культуры D2 располагаются у хозяина на ректальных железах [Фролов, 1986]. Так как при изоляции кишечника насекомого-хозяина ректум не всегда оказывается на препарате, подобная топологическая

приуроченность данного паразита, обусловила его отсутствие на гапантотипе, который был сделан из той же особи насекомого-хозяина, что и культура D2. Таким образом, есть все основания полагать, что эта культура была выделена из насекомого со смешанным заражением. Содержащиеся в ней организмы не имеют отношения к L. nabiculae и были описаны нами как самостоятельный вид другого рода Crithidia dedva [Костыгов и др., 2011]. Такое таксономическое положение данного вида хорошо согласуется с его филогенетической близостью к типовому виду рода — С. fasciculata (Рисунок 2).

У изолята Nfrn2, L. peterhqffi и L. occidentalis были обнаружены весьма сходные по своим морфометрическим признакам опистомастиготы, а также эндомастиготы. На типовом препарате L. nabiculae эти морфотипы нам не удалось наблюдать. Вполне возможно, что, как и в случае с хоаномастиготами D2, та часть кишечника, в которой они должны были обитать, не попала на препарат. В отношении опистомастигот следует также добавить, что их доля среди общего числа клеток весьма мала, так что они могли не оказаться на мазке по случайным причинам.

На гапантотипах Leptomonas peterhoffi и L. occidentalis помимо палочковидных эндомастигот близких по размеру к опистомастиготам были еще и овальные. Их присутствие на типовом препарате Leptomonas peterhoffi, как было показано ранее, объясняется присутствием еще одного вида - Wallaceina podlipaevi [Малышева, Фролов, 2009]. То же самое, по-видимому, справедливо и для типового препарата L. occidentalis с тем лишь отличием, что мы не знаем, какой в данном случае вид оказался сопутствующим, так как соответствующая культура не сохранилась.

Leptomonas peterhoffi, L. occidentalis и L. nabiculae, a также изолят Nfm2 были выделены из одного хозяина (N. flavomarginatus) в одном и том же Северо-Западном регионе России. Вместе со всем вышеперечисленным это дает основания полагать, что эти трипаносоматиды относятся к одному виду. В связи с тем, что все три названия (Leptomonas peterhoffi, L. occidentalis и L. nabiculae) были опубликованы одновременно, у нас была возможность выбрать любое из них. Так как название L. nabiculae прежде использовали при описании ультраструктуры этого вида, мы предпочли сохранить именно его. Между тем наличие у данного паразита опистомастигот и его филогенетическое положение на дереве, реконструированном нами по гену 18S рРНК (Рисунок 2), указывают на необходимость перенесения L. nabiculae в род Herpetomonas, что и было нами сделано [Костыгов и др., 2011].

Сравнение сиквенса гена 18S рРНК культуры Nfm2, полученного в настоящей работе, с опубликованным ранее AF153043 [Merzlyak et al., 2001] показало, что последний имеет химерную природу. Начало химерной последовательности (до 226 п.н.) и ее конец (начиная с 1623 п.н.) практически неотличимы от сиквенсов Wallaceina brevicula и W. inconstans (AF153044, AF153045), но в то же время, отличаются от полученной нами. В средней части (397—1353 п.н.) оба сиквенса Nfm2 одинаковы, но отличаются от таковых у Wallaceina. Остальные фрагменты последовательности AF153043 консервативны для всех четырех сиквенсов. Именно химерный характер данной последовательности обусловил

неверное определение филогенетического положения культуры Nfin2 по гену 18S рРНК [Merzlyak et al., 2001], которое отличалось от того, что было определено по гену 5S рРНК.

imTCrithidia fasciculata

Crithidia dedva sp. nov. (D2)

'Leptomonas acus 1/991—Leptomonas tarcoles ■Wallaceina brevicula Wallaceina inconstans Wallaceina podlipaevi 1/I00rLeptomonas podlipaevi Leptomonas jaderae Leptomonas neopamerae Leptomonas seymouri 'Crithidia bombi

0.01

\ r~Crithidia abst

ш--LjCrithidia dea

]-P—Leptomon _________' I-rrithiHi* in

1/100

j~Crithidia permixta '-Critt

'rithidia sp. Cfm ■Crithidia abscondlta ■Crithidia deanei ATCC30255 Leptomonas bifurcata ■Crithidia insperata "Trypanosomatidae sp. ChlO ■Endotrypanum monterogei Leishmania donovani ijjjjifLeishmania major

'Leishmania tarentoiae J-"Leptomonas costaricensis ~—Trypanosomatidae sp. G755 ■Leptomonas barvae

1/1001-Herpetomonas samue/pessoai

0.99/76 V100

0.91/6S 1/80

Herpetomonas nabiculae (Nfm2)

Leptomonas cf. lactosovorans

_rHerpetomonas trimorpha

i™51-Herpetomonas ztiplika

гHerpetomonas muscarum —Herpetomonas megaseliae

~~Herpetomonas mariadeanei r—Phytnmnnns serpens

^00-Phytomonas sp. HART

■muui " 1'1°°r-Strigomonas oncopeltl

'rypanosomatidaesp. Eva Sergeia podlipaevi

_ 1MOOI

~Strigomonas culicis ~Angomonas deanei

I Trypanosomatidae sp. Wsd

I_rLeptomonas collosoma

WW—Leptomonas rigidus

0.98/62Г 1/99 L

lir

1/84 r

-Trypanosoma erur

~Blastocrithidia triatomae —Leptomonas jaculum

-Bodo uncinatus

-Trypanosoma mega

Trypanosoma cobitis

~Trypanosoma pestanai

Trypanosoma brucei

-Parabodo caudatus

' Trypanoplasma borreli

Рисунок 2 — Филогенетическое древо трипаносоматид, реконструированное по гену 18S рРНК с использованием метода Байеса. Числа в узлах обозначают Байесовы апостериорные вероятности и проценты бутстрепа (для ML) соответственно. Значения бутстрепа менее 50% обозначены прочерком. Длины ветвей даны в пропорции к количеству замен; у ветвей, перечеркнутых двойной чертой, длина сокращена вдвое. Масштабная линейка соответствует количеству замен на сайт. Виды, культуры которых исследованы в настоящем подразделе, обозначены инвертированным цветом шрифта и фона.

Таким образом, в этом подразделе удалось выявить основные причины противоречий, возникавших при изучении организмов, ранее относимых к одному виду Leptomonas nabiculae Podlipaev 1985. Смешанное заражение, имевшееся у насекомого-хозяина, привело к тому, что первоначально в культуру был выделен сопутствующий вид — Crithidia dedva. Из-за его ошибочного отождествления с L. nabiculae результаты исследований, которые проводились с использованием этой культуры, вводили в заблуждение относительно свойств первоначально описанного вида Отсутствие на типовом препарате L. nabiculae опистомастигот явилось причиной неверного определения родовой принадлежности этого вида И, наконец, противоречия между филогениями по разным генам были связаны с тем, что последовательность одного из них оказалась химерной.

3.4 Цистообразующие трипаносоматиды

В данном подразделе при была осуществлена проверка выдвинутой А.О. Фроловым гипотезы о единстве происхождения трипаносоматид, формирующих в ходе жизненного цикла цистоподобные амастиготы.

Результаты анализа по генам 18S и 28S рРНК, в общем, подтвердили монофилию исследуемой группы (Рисунки 3 и 4). Основная часть видов при этом подразделилась на «лептомонасную» и «бластокритидийную» подгруппы. Но возникли противоречия между двумя генами рРНК в отношении положения бластокритидий из водомерок (В. gerricola и В. inflatà). По гену 18S рРНК занимали "базальное" положение в группе цистообразующих, что хорошо согласуется с морфологической кладограммой Фролова [Фролов, 1997; Подяипаев, Фролов, 2000]. По гену 28S рРНК их клада была сестринской по отношению ко всем прочим трипаносоматидам, однако это положение не было поддержано бутстреп-тестом. Это объясняется тем, что выравнивание по этому гену содержало значительно меньше информативных позиций, чем в случае гена 18S, что вкупе с эффектом притяжения длинных ветвей обусловило значительное смещение бластокритидий из водомерок в сторону корня филогенетического дерева. Данный эффект наблюдался и при использовании гена 18S, однако в значительно меньшей степени, так как сохранившийся филогенетический сигнал препятствовал распадению клады цистообразующих трипаносоматид. Между тем для существования этой клады на дереве по гену 18S рРНК оказалось необходимо присутствие бластокритидий из наземных клопов. В их отсутствие оставшиеся группы (цистообразующие лептомонасы и бластокритидии из водомерок) не могли объединиться друг с другом.

Leptomonas sp. ex Saldidae, который по данным настоящего исследования часто встречается у клопов-прибрежников наряду с L. rigidus, занял место среди цистообразующих лептомонасов. Между тем сам L. rigidus, от которого его прежде не отличали, весьма далек от указанной филогруппы. Таким образом, предположение об ошибочном объединении характеристик двух совершенно разных видов лептомонасов, которое возникло при проведении фаунистических исследований в ходе настоящей работы, нашло свое подтверждение и в результатах молекулярно-филогенетического анализа.

0.94/-

0.98/76

0.98/60

0.99/93

0.83/66

1.0/76

r Wallaceina inconstans 0.98/911 Фасета brevicula |

1.0i7iN [ Wai,acelna podilpaevl I— Crithidia fasclculata

I-Leptomonas podilpaevl

I-Leptomonas seymourl

— Leptomonas pyrrhocorls

-Leptomonas costaricensis

r- Leishmania donovanl _P- Leishmania major

¡Ol-Endotrypanum monterogel

-Herpetomonas mariadeanel

-Herpetomonas muscarum

0.02

1.0/80

1.0/100

1.0/100 г

1.0/100.

0.99/72

// 1.0/100

— Herpetomonas nabiculae

I-Herpetomonas samuelpessoal

_t .0/100Herpetomonas trimorpha

I— Herpetomonas ztlpllka Phytomonas serpens -Phytomonas sp. Hart

— Strigomonas oncopeltl -Strigomonas cullcis

1.0/100 r

1.0/93 г

0.94/63

— Sergela podilpaevl Trypanosomatldae gen. sp. Eva

■ Angomonas deanel

1.0/1001

!>- Leptomonas сollosoma -к Leptomonas rlgldus 1B 0.96/861 Leptomonas rigidus 144SI

1.0/1001

0.80/51

1.0/100

1.0/100r Blastocrithidia inflata Blastocrithidia gerricola Blastocrithidia sp. ex Lygus

0.99/78

0.99/69

- Trypanosoma cruzl

I- Blastocrithidia mlridarum — Blastocrithidia cyrtomeni Blastocrithidia /arg/ Blastocrithidia trlatomaa Blastocrithidia sp. ex Pyrrhocorls I— Blastocrithidia sp. ex Adomerus Blastocrithidia raabei • Leptomonas sp. ex Stlctopleurus -Leptomonas ¡acutum

10/100 Г LePtomonas SP- Gerris —- |— Leptomonas sp. ex Saididae

O.87/5M—Г Leptomonas sp. ex Ulridae

0.99№— Leptomonas oncopeltl

1.0/97

0.97Я01-

Trypanosoma postanal -Trypanosoma brvcei

0.99/77 L

- Trypanosoma mega

-Trypanosoma cobltls

-Bodo uncinatus

■ Parabodo caudatus

1.0/100 L

- Trypanoplasma borre//

Рисунок 3 — Максимально правдоподобное дерево по гену 18S рРНК. Длина ветвей пропорциональна количеству замен. Ветви, укороченные вдвое, перечеркнуты двумя косыми чертами. Значения в узлах - апостериорные вероятности и проценты бутстреп-подцержки. Значения менее 50% заменены прочерками. Группа цистообразующих трипаносоматид выделена серым цветом фона.

0.92/-

Wallacelna brevicula

Crithldla fasciculata

4L 0.78/-

0.86/-

0.96/-

0.921-

0.97/59

0.81/50

Leptomonas seymourl Leptomonas pyrrhocoris Endotrypanum monterogel Leishmania donovant 1 о/ЮоГ ТгУРапosomatldae gen. sp. Wsd

—-г Leptomonas сollosoma

Leptomonas rlgldus

1.0/100 [— -Crithidia oncopeltl' ATCC 30264 ■■ Angomonas deanel

-Strlgomonas cutlets

Í .0/82i Herpetomonas nablculae

- Herpetomonas samuelpessoal

-Herpetomonas ztlptlka

• Phytomonas sp.

1.0/100

1.0/74

1.0/92

-Leptomonas sp. ex Stictopleurus

1.0/100 Г Leptomonas sp. ex Saldldae ^J— Leptomonas sp. ex Genis 0.57/631— Leptomonas sp. ex Mlrldae

1.0/931

0.79/79Г Blastocrlthldla trlatomae ШШ1- Btastocrithldla raabel L я

0.68/-1-

йЩ,-

0Ü7P-

- Blastocrithldia sp. ex Pyrrhocoris • Blastocrlthldla mlrtdarum

--Trypanosoma bruceI

• Trypanosoma cruz!

Trypanosoma rotatorlum

-Trypanosoma carassll

1.0/100 г Blastocrlthldla ¡nftata

L Blastocrithldia gerricola

0/94/56

0.96/69

Bodo saltans

• Trypanoptasma borrell

-Neobodo deslgnls

0.02

Рисунок 4 — Филогенетическое дерево, реконструированное методом максимального правдоподобия по последовательностям гена 28Б рРНК. Значения в узлах соответствуют апостериорным вероятностям и процентам бутстреп-поддержки. Значения менее 0.5 или 50% соответственно заменены прочерками. Длина ветвей пропорциональна количеству замен. Ветви, укороченные вдвое, перечеркнуты двумя косыми чертами.

Группу цистообразующих трипаносоматид объединяет множество морфологических признаков. Прежде всего это наличие у них уникальных по своему строению цистоподобных амастигот, давших название группе. Также у всех ее представителей полностью отсутсвуют элементы цитостом-фарингеального комплекса, с чем, по-видимому, связана сложность культивирования этих жгутиконосцев. Наконец, ундулирующая мембрана, которой морфологически соответствует более или менее протяженная зона десмосом между жгутиком и телом клетки, присутствует не только у бластокритидий, но и у цистообразующих лептомонасов. Однако у последних она сильно редуцирована, и располагается, в основном, внутри жгутикового кармана. У некоторых видов лептомонасов

из этой группы, как это было показано в настоящей работе, встречаются клетки с "носиком", по сути, представляющим собой сильно укороченную ундулирующую мембрану.

Таким образом, совокупность морфологических и молекулярно-филогенетических данных указывает на то, что цистообразующие трипаносоматиды - единая группа, в которой у части видов благодаря редукции ундулирующей мембраны подвижные клетки стали походить на лептомонасов.

Сравнение морфологических и молекулярно-филогенетических данных позволило оценить основные пути эволюции признаков в рассматриваемой груше. Несомненными признаками, присущими ближайшему общему предку цистообразующих трипаносоматид являются эпимастиготность, отсутствие цитостом-цитофарингеального комплекса, формирование цистоподобных амасгигот в результате деления отпочковавшейся от эпимастиготы промежуточной клетки и, наконец, наличие развитого гликокаликса на поверхности цист. Первый признак ввиду его распространенности за пределами данной группы является явно симплезиоморфным. Остальные - несомненные синапоморфии, хотя второй из них совершенно независимо возник у РкуЮтопач [Фролов, 1997].

Клада, которая включает в себя всех цистообразующих трипаносоматид за исключением В. getricola и В. т/1Ша, вне всякого сомнения, произошла от формы, которая имела эпимастиготы, жгутиковые цисты и способность закрепляться на клетках хозяина при помощи расширенного жгутика, то есть имевшая те же признаки, что и нынешние представители группы бластокритидий из наземных клопов. Последняя, таким образом, характеризуется исключительно плезиоморфными признаками.

Ближайший общий предок цистообразующих лептомонасов выглядел, по всей вероятности, подобно современному виду Ь. опсореЫ. Т.е. синапоморфными признаками для данной группы являются рудиментарная ундулирующая мембрана и редукция гликокаликса на поверхности цист. Дальнейшая эволюция цистообразования в этой группе была связана с тем что данный процесс стал осуществляться не у подвижных, а у прикрепленных форм и почкование сменилось палинтомическими делениями.

3.5 Исследование лабораторных культур

Из более чем четырех десятков культур трипаносоматид, содержащихся в коллекции лаборатории протозоологии Зоологического института РАН для настоящего исследования, прежде всего, представляют интерес те из них, что были выделены сотрудниками ЗИН. Именно по этой части коллекции (на данный момент 22 культуры), можно судить о том, какие виды из имеющихся в фауне России (и, в частности, в ее Северо-Западном регионе) могут быть культивированы в стандартных условиях.

Судя по лабораторным записям, при выделении большинства из этих культур в кишечнике хозяев наблюдались промастиготы или эпимастиготы. Однако, как показало настоящее исследование (морфологические и молекулярно-филогенетические данные), в основной своей массе эти культуры содержат представителей родов СпШсГш и ЖаПасета. По-видимому, здесь, как и в рассмотренных ранее случаях не обошлось без смешанных

заражений. Почти все эти культуры прежде считались представителями рода Leptomonas из-за того, что их морфологию внимательно не изучали. Хотя промастиготы в них и присутствуют, они не являются доминирующим морфотипом и всего лишь сопутствуют хоано-, эндо- и брохомастиготам, характерным для критидий и валласеин.

С морфологической и с молекулярно-филогенетической точки зрения валласеины являются подмножеством внутри p. Crithidia. Между тем все описанные виды рода Wallaceina, а также культуры F2, F5, F6, F7, F8, CL8, ВМ-33 и KV1 неотличимы по последовательностям гена 18S рРНК и мини-экзона, откуда следует, что, на самом деле, речь идет об одном единствешюм виде. Самостоятельность описанных видов валласеин была обоснована только их незначительным морфологическими различиями. Между тем для каждого из описанных видов данного рода существует только по одной культуре, и именно по этим культурам было произведено описание. Таким образом, признаки, отличающие эти виды, по сути, являются характеристиками индивидуальных изолятов. Суммируя все вышеизложенное, вполне закономерно отнести все культуры валласеин к единственному виду, признать вынесенный в диагноз рода признак видовым и, наконец, упразднить род Wallaceina.

Только у Leptomonas sp. PL и Leptomonas sp. Sld, которые были выделены, соответственно, из Saldulapallipes и Salda littoralis не содержалось никаких клеток кроме промастигот. Так что с точки зрения морфотипической концепции они являются типичными лептомонасами. И морфологически, и по последовательностям гена 18S рРНК, они неотличимы от описанного под названием Leptomonas rigidus ныне утраченного изолята 1В. Да и выделены были все эти культуры из одних и тех же хозяев (клопов-сальдид). Поэтому изоляты PL и Sld также должны быть отнесены к виду L. rigidus. Прежде филогенетическое положение культур PL и Sld по гену 5S рРНК было определено неверно, вероятно из-за кросс-контаминации образцов (они были идентичны по этим последовательностям валласеинам).

По формальным признакам несомненным лептомонасом также является выделенный А.О. Фроловым L. pyrrhocoris, у которого помимо промастигот описаны и эндомастиготы (обозначенные авторами как амастиготы) [Фролов, 1987, Votypka et al., 2012].

Однако проведенное в настоящей работе исследование культуры Wsd из Salda littoralis не позволило обнаружить в ней специфических эндомастигот с петлеобразной укладкой жгутика (брохомастигот), которые следовало бы ожидать, в связи с отнесением данной культуры к p. Wallaceina. Нигде до сих пор не было приведено ни одной фотографии брохомастигот в культуре Wsd, скорее всего информация об их присутствии в культуре была ошибочной. Между тем разнообразием типов клеток у данной культуры выше, чем у любой другой. Здесь и "универсальные" промастиготы, и разнообразные хоаномастиготы, и опистоморфы столь характерные для симбионт-содержащих трипаносоматид и опистомастиготы, являющиеся диагностическим признаком рода Herpetomonas и, наконец, бесполезные для систематики гомоксенных трипаносоматид обычные эндомастиготы. Тот же

самый набор морфотипов, кстати, характерен и для полученной от чешских коллег культуры ТгурХ. Удивительно, что оба этих изолята, характеризующихся большим набором вариантов клеток, в филогенетическом отношении весьма близки к совершенно однообразным с точки зрения морфологии Leptomonas rigidus и L. collosoma. Ничего общего для всей этой клады с морфологической точки зрения на данный момент обнаружить не удается, так как на ультраструктурном уровне до сих пор изучен только L. rigidus. Между тем данная группа характеризуется почти полной редукцией редактируемого домена гена ND8 — признак который отличает ее от все остальных исследованных в настоящее время видов семейства [Gerasimov et al., 2012].

Из двадцати двух обсуждаемых культур восемнадцать являются членами "медленно эволюционирующей клады", для которой недавно было предложено таксономическое название - Leishmaniinae [Jirkü et al., 2012]. Члены этого подсемейства относятся к пяти родам (Leptomonas, Crithidia, Wallaceina, Leishmania и Endotrypanum), из которых, по меньшей мере, три не являются монофилетическими. Судя по многочисленным работам, посвященным исследованию разнообразию трипаносоматид, в фаунистических сборах встречается множество видов, относящихся к другим (фило)группам, однако новые виды в последние годы описываются по большей части из сем. Leishmaniinae. Ведь в настоящее время описание новых видов предполагает выделение лабораторных культур, а представители этой группы, в большинстве своем, культивируются гораздо лучше прочих трипаносоматид.

Весьма вероятно, что во всех случаях, когда наблюдалась смена морфологии клеток при их переводе в культуру на самом деле происходило замещение основного компонента инвазии минорным. Ведь при множественных пересевах медленно размножающийся вид может легко потеряться, в то время как, критидии, чья численность достигает 106—107кл/мл за 3-5 дней продолжат плодиться дальше.

Как уже упоминалось выше, отождествление исходного заражения и полученной из него лабораторной культуры является источником последующих противоречий. Поэтому от исследователей требуется большая внимательность при использовании культур.

Исследование только тех видов, которые относительно легко поддаются культивированию, сильно ограничивает наши знания о разнообразии трипаносоматид. Безусловно, необходимо разрабатывать новые или адаптировать уже известные методы для "привередливых" видов трипаносоматид, так как наличие ваучерного материала весьма полезно для исследования этих объектов в самых разных областях. Однако в настоящее время при исследовании не поддающихся культивированию трипансоматид вполне можно работать непосредственно с клетками из зараженного хозяина, ибо молекулярные методы позволяют не только идентифицировать вид паразита, но и оценить вероятность того, что заражение смешанное. Дополнительная польза от изучения таких "диких" изолятов в том, что они не успели подвергнуться искусственному отбору, который невольно осуществляется при многолетнем культивировании. При этом испытывают давление

отбора естественного, который препятствует распространению нежизнеспособных в естественных условиях мутантных форм.

3.6 Использование белок-кодирующего гена HSP83

Использование в настоящей работе гена HSP83, также часто называемого HSP90, было обусловлено успешным применением данного молекулярного маркера в работах, посвященных филогении разных групп Euglenozoa, в том числе Kinetoplastida.

В настоящем исследовании было обнаружено, что у данного гена сильно выражено смещение нуклеотидных частот, которое приводит к артефактам при построении филогении. Главным образом это смещение присутствовало в третьей позиции кодонов, и именно оно способствовало объединению в одну кладу бластокритидий из наземных клопов и водомерок. Хотя формирование данной клады и является артефактом, тем не менее, само по себе значительно повышенное по сравнению с остальными трипаносоматидами содержание AT - нуклеотидов в третьей позиции может быть признаком, унаследованным бластокритидиями от общего предка. В пользу этого говорит и тот факт, что у части цистообразующих лептомонасов содержание А и Т также несколько выше чем у большинства прочих трипаносоматид.

Обнаруженное смещение нуклеотидного содержания в третьей позиции хорошо согласуется с ранее опубликованными исследованиями, в которых также отмечался этот феномен [Alonso et al., 1992; Alvarez et al., 1994]. Согласно их данным, суммированным по многим белок-кодирующим генам, наименьшее содержание GC - нуклеотидов было характерно для Trypanosoma brucei, а наибольшее - для лейшманий и Crithidia fasciculata. Между тем содержание GC - нуклеотидов в третьей позиции кодона гена HSP83 у бластокритидий еще ниже, чем у трипаносом. Согласно литературным данным у трипаносоматидных генов, характеризующихся высоким уровнем экспрессии, в третьей позиции кодона содержание GC нуклеотидов значительно больше, нежели у слабо экспрессирующихся генов [Alvarez et al., 1994; Нот, 2008]. Это объясняется тем что в генах с низким уровнем экспрессии используются кодоны, соответствующие более редким вариантам тРНК. Вполне возможно, что у бластокритидий сильное смещение в нуклеотидном составе гена HSP83, продуктом которого является один из шаперонов, связано с изменением активности, а, возможно, даже и функции данного гена.

Ситуация еще более осложняется наличием у Blastocrithidia miridarum и В. triatomae в последовательностях рассматриваемого гена множественных стоп-кодонов. Стоп-кодоны обычно являются одним из признаков псевдогенов. Хотя у разных групп простейших было обнаружено использование ТАА, TAG и TGA кодонов в качестве значащих, однако неизвестно ни одного случая, когда бы все три использовались в таком качестве одновременно.

Таким образом, несмотря на то, что многие группы трипаносоматид, выявленные при использовании других генов, обнаруживаются и на филогенетических деревьях по HSP83, данный молекулярный маркер оказался дискредитированным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе были рассмотрены противоречия, возникавшие и возникающие между традиционной системой трипаносоматид и молекулярно-филогенетическими реконструкциями, и выявлены причины их возникновения.

Наиболее важной причиной таких противоречий является методологическая несостоятельность традиционной системы. Систематика трипаносоматид сложилась в то время, когда знания об этой группе были ограничены тем, что можно было наблюдать в световой микроскоп, а в зоологической систематике все еще был широко распространен типологический подход. Однако в дальнейшем, несмотря на накопление данных по ультраструктуре, биохимии, генетике и молекулярной биологии трипаносоматид, а также возникновение новых подходов в биологической систематике, система трипаносоматид оставалась практически неизменной, как и прежде опираясь на небольшой набор светооптических признаков.

Применение методов молекулярной филогенетики должно было бы способствовать совершенствованию системы группы, предоставив возможность по-новому взглянуть на иерархию морфологических признаков. Однако несоответствия между молекулярно-филогенетическими данными и традиционной схемой классификации трипаносоматид привели к тому, что в сознании многих исследователей стало складываться впечатление о непригодности морфологии для построения естественной системы. Это дало им повод не искать способов разрешения противоречий, а классифицировать новые виды и выделять новые надвидовые таксоны исключительно на основе молекулярной филогении.

В настоящей работе была изучена группа цистообразующих трипаносоматид, которая из-за проблем с культивированием входящих в нее видов до сих пор не фигурировала в молекулярно-филогенетических исследованиях. Это единственная в семействе группа, существование которой впервые было обосновано исключительно на морфологических признаках, противоречащих традиционной морфотипической схеме классификации. Гипотеза А.О. Фролова о филогенетическом единстве цистообразующих представителей родов Blastocrithidia и Leptomonas нашла подтверждение в настоящей работе. Более того, филогения по гену 18S хорошо согласуется с морфологической кладограммой в том, что род Blastocrithidia оказывается парафилетическим относительно цистообразующих лептомонасов. Принципиально важно отметить, что данная гипотеза, так же, как и молекулярная филогения, идет вразрез с существующей системой. Точно так же обстоят дела и с симбионт-содержащими трипаносоматидами - филогруппой, которая поддерживается не только молекулярными, но и морфологическими признаками [Du et al, 1994; Freymuller, Camargo, 1981; Teixeira et al, 2011]. Эти примеры наглядно демонстрируют, что ограниченность традиционной системы трипаносоматид малым набором признаков, сложившимся еще на заре исследования данной группы, неминуемо должна была привести к ее дискредитации по мере накопления новых данных. Однако по иронии судьбы дискредитированными оказались морфологические признаки вообще.

Ориентированность исследований трипаносоматид на работу с культурами можно рассматривать как одну из косвенных причин противоречий между систематикой и филогенией. В случае с родом \Уа11асета индивидуальные признаки изолятов ранее интерпретировались как видовые, поэтому видовой признак - наличие брохомастигот - был повышен в статусе до родового. Данная причина конфликта действует только в рамках морфотипической концепции и потому с упразднением последней исчезнет сама собой.

Весьма важной причиной противоречий является ошибочное отождествление видов, относящихся к разным таксономическим и/или филогенетическим группам трипаносоматид. Такая ошибка может возникнуть по причине одновременного присутствия разных паразитов в одном и том же хозяине (смешанные инвазии) или в разных особях одного вида хозяев. Как было продемонстрировано в настоящей работе, это приводило к тому, что ошибочно объединялись характеристики, принадлежащие совершенно разным видам, в результате чего формировались виртуальные химерные объекты. Из рассмотренных в настоящем исследовании примеров такое было в случаях с В1а$МсгиЫсИа gerrico!a, В. ттс!агит, 11егре!отопа.ч паЫси1ае и Ьер1отопа$ rigidl<s. Дополнительным катализатором такой путаницы во многих случаях явилась традиция в обязательном порядке выделять лабораторные культуры для каждого вновь описываемого вида. Хотя в этой идее нет ничего дурного, однако стремление соответствовать данной традиции побудило некоторых исследователей выделять "типовые" культуры во что бы то ни стало даже дня тех трипаносоматид, которые невозможно культивировать. В настоящее время идентификация трипаносоматид уже не представляет серьезных трудностей благодаря использованию методов молекулярной биологии. Как было показано в настоящей работе, с их помощью можно также выявлять и смешанные заражения. Именно контроль материала при помощи молекулярных методов и является путем преодоления (или, если говорить о будущем, предотвращения) противоречий, обусловленных смешанными заражениями.

Необнаружение характерных морфотипов является еще одной причиной конфликта традиционной систематики и молекулярной филогенетики трипаносоматид. Такое имело место, например, у рассмотренного в настоящей работе НегреШтопаз паЫсиЪе. Разумеется, данная проблема должна уйти в прошлое с отказом от морфотипической концепции, однако ввиду того, что знание о наличии морфотипов все же имеет некоторое значение, следует тщательнее исследовать доступные изоляты видов.

Среди возможных причин конфликта морфологических и молекулярных признаков, есть и такие, которые связаны со спецификой молекулярно-филогенетических исследований. Одни из них обусловлены ошибками при получении последовательностей, а

другие определяются свойствами того или иного молекулярного маркера в плане филогенетического анализа К первой группе причин относятся создание молекулярных химер, как это было в случае с геном 18S рРНК Herpetomonas nabiculae, и кросс-контаминация в ПЦР, по всей вероятности, имевшая место в случае с культурами Leplomonas rigidus PL и Sld. Во второй группе находятся традиционные проблемы молекулярных маркеров, препятствующие реконструкции истинной филогении, такие как смещение нуклеотидного состава в изменчивых сайтах, сильное различие в темпах замен, эффект притяжения длинных ветвей, разрушение филогенетического сигнала и т.п.

Лабораторные ошибки в молекулярно-филогенетических исследованиях во многих случаях хорошо заметны по той причине, что, как правило, они приводят к противоречию между разными филогенетическими маркерами. Кросс-контаминация также приводит к появлению идентичных последовательностей у разных образцов, что не может не бросаться в глаза. К тому же практика использования отрицательных контролей в ПЦР должна минимизировать возможность подобных ошибок. Молекулярные химеры могут быть выявлены как невооруженным глазом при анализе выравнивания (если последовательности исходных вариантов имеют достаточные различия), или же с помощью специализированного программного обеспечения.

Особенности эволюции молекулярных маркеров, такие как смещение нуклеотидного состава, сильное различие в темпах замен, эффект притяжения длинных ветвей, разрушение филогенетического сигнала и пр. могут препятствовать реконструкции истинной филогении. В данной работе бьи обнаружен эффект притяжения д линных ветвей, который в той или иной мере был заметен на всех генах где присутствовали бластокритидии из водомерок. Меньше всего он был выражен на гене 18S рРНК Ген HSP83, который впервые был использован для реконструкции филогении трипаносоматид именно в настоящей работе, обнаружил значительное смещение нуклеотидного состава в третьей позиции кодона, смещение аминокислотных частот и значительные различия в паттернах замен. Более того, у бластокритидий из наземных клопов полученные последовательности представляли собой псевдогены. Все эти особенности дискредитируют данный ген как филогенетический маркер. Неудивительно, что широко используемый в молекулярной филогенетике ген 18S рРНК оказался лучшим из всех использованных в настоящем исследовании молекулярных маркеров. Однако ввиду того, что даже и на нем могут сказываться некоторые артефакты, необходимо расширять круг генов применяемых для филогенетического анализа у трипаносоматид.

Проблемы с реконструкцией филогении по молекулярным данным наглядно демонстрируют необходимость контроля получаемых результатов и использование фенотипических признаков призвано сыграть здесь не последнюю роль.

Теперь, когда выявлены недостатки существующей системы трипаносоматид и определена стратегия для построения новой, необходимо приступить к ее созданию.

выводы

1. Система сем. Trypanosomatidae сложилась в эпоху световой микроскопии а также доминирования типологического подхода в систематике, и с тех пор она практически не развивалась.

2. Все известные представители рода Wallaceina относятся к одному виду, который согласно морфологическим признакам и молекулярной филогении должен быть помещен в род Crithidia.

3. Представители "медленно-эволюционирующей клады", благодаря способности быстро расти на аксеничных средах, выделяются в культуры клеток чаще других трипаносоматид и в случаях со смешанным заражением способны вытеснять из культур другие виды.

4. Цистообразующие представители родов Leptomonas и Blastocrithidia составляют монофилетическую группу.

5. Из всех молекулярно-филогенетических маркеров, протестированных на данный момент, ген 18S рРНК обеспечивает наилучшее разрешение родовых и надродовых групп и в наименьшей степени провоцирует артефакты реконструкции филогении.

6. Результаты молекулярно-филогенетических исследований трипаносоматид вступают в противоречие не с морфологическим подходом как таковым, а с заложенной в основу системы этой группы концепцией морфотипов, которая ограничена небольшим количеством светооптических признаков.

7. Дополнительными причинами противоречий между молекулярными и морфологическими данными служат методические ошибки, допускаемые при работе с трипаносоматидами а также артефакты собственно филогенетического анализа.

8. Противоречия между молекулярной филогенией и существующей системой трипаносоматид принципиально неразрешимы ввиду искусственного характера последней. При разработке новой таксономии необходимо осуществлять взаимную проверку филогенетических гипотез, предлагаемых при использовании молекулярных и фенотипических признаков трипаносоматид.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Костыгов, А. Ю. Leptomonas jaculum (Leger, 1902) Woodcock, 1914: лептомонас

или бластокритидия? / А. Ю. Костыгов, А. О. Фролов // Паразитология. — 2007.

— Т. 41, —N2, —С. 126—136.

2. Костыгов, А. Ю. Исследование причин конфликта таксономии и молекулярной

филогении трипаносоматид на примере Leptomonas nabiculae Podlipaev, 1987 / А.

Ю. Костыгов, М. Н. Малышева, А. О. Фролов // Паразитология. — 2011. — Т. 45.

— №6, — С. 409—424.

3. Gerasimov, Е. S. From ciyptogene to gene? ND8 editing domain reduction in insect

trypanosomatids / E. S. Gerasimov, A. Yu. Kostygov., Shi Yan, A. A. Kolesnikov //

Europ. J. Protistol. — 2012. — V. 48. — P. 185—193.

Работы опубликованные в других изданиях

1. Костыгов, А. Ю. Изучение разнообразия трипаносоматид полужесткокрылых в районе Белого моря / А. Ю. Костыгов // Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых (17-21 апреля 2006 г., Пущино). — 2006. — С. 197.

2. Митева, О. А. Филогенетическое положение Blastocrithidia gerricola (Kinetoplastida, Trypanosomatidae). / О. А. Митева А. Ю. Костыгов // Материалы Международной научной конференции "Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов" (9-11 декабря 2008 г. Москва). — 2006. — С. 232-234.

3. Костыгов, А. Ю. Биоразнообразие гомоксенных трипаносоматид в Карелии: генотипирование по рРНК / А. Ю. Костыгов // Материалы Всероссийской конференции молодых ученых «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 14-17 сентября 2010 г.). — 2010. — С. 5-7.

4. Kostygov, A. Y. Genetic diversity of insect trypanosomatids in subarctic and Northwest Russia revealed by UP-PCR typing / A. Y. Kostygov, E. P. Slisarenko, P. A. Merkulov, S. A. Podlipaev // Protistology. — 2004. — T. 3. —№ 4. — P. 257—264.

5. Kostygov, A. Yu. Leptomonas jaculum (Leger 1902) Woodcock 1914: a leptomonas or a blastocrithidia? / A. Yu. Kostygov, A. O. Frolov // Protistology. — 2007. — V. 5,—№ 1,— P. 41.

6. Kostygov, A. Yu. Reciprocal support of morphological characters and molecular data in trypanosomatid phytogeny / A. Yu. Kostygov, A. O. Frolov // Abstracts of the international conference "Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetics" (Vladivostok, 2009) — 2009. — P. 34.

7. Kostygov, A. Yu. Cyst-forming trypanosomatids: molecular phylogeny recruits morphology to challenge taxonomy / A. Yu. Kostygov // Abstracts of the II Moscow international conference «Molecular phylogenetics MolPhy-2» (May 18-21, 2010, Moscow). —2010. —C. 119.

8. Kostygov, A. Yu. Cyst-forming trypanosomatids and general issues in systematics of Trypanosomatidae family / A. Yu. Kostygov, A. O. Frolov // Abstracts of the VI European Congress of Protistology (Berlin, July 25-29, 2011) —2011. — P. 79-80.

Подписано в печать 11.01.13 Формат 60х84'/)б Цифровая Печ. л. 1.5 Тираж 100 Заказ 02/01 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костыгов, Алексей Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 История изучения трипаносоматид.

1.2 Современное состояние системы трипаносоматид.

1.3 Распространение.

1.4 Жизненные циклы.

1.5 Морфологическая характеристика.

1.6 Генетический обмен.

1.7 Кризис в систематике трипаносоматид.

1.8 Выбор объектов исследования.

1.9 Молекулярные маркеры, применяемые в филогенетике трипаносоматид

2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1 Фаунистические сборы.

2.2 Лабораторные культуры и архивные препараты.

2.3 ПЦР и секвенирование.

2.4 Филогенетический анализ.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Характеристика обнаруженных видов цистообразующих трипаносоматид

3.1.1 Результаты.

3.1.1 Обсуждение.

3.2 Blastocrithidia miridarum и В. gerricola.

3.2.1 Морфология клеток на типовых препаратах и в культурах.

3.2.2 Филогенетический анализ.

3.2.3 Обсуждение.

3.3 Leptomonas nabiculae.

3.3.1 Морфология клеток в исходных изолятах и в культурах.

3.3.2 Сравнение последовательностей и филогенетический анализ.

3.3.3 Обсуждение.

3.4 Цистообразующие трипаносоматиды.

3.4.1 Результаты.

3.4.2 Обсуждение.

3.5 Исследование лабораторных культур.

3.5.1 Морфология клеток в культурах.

3.5.2 Филогенетический анализ.

3.5.3 Обсуждение.

3.6 Использование белок-кодирующего гена HSP83.

3.6.1 Результаты.

3.6.2 Обсуждение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Противоречия морфологического и молекулярно-филогенетического подходов в систематике трипаносоматид"

Актуальность темы исследования

Жгутиконосцы семейства Trypanosomatidae издавна привлекают внимание исследователей. В первую очередь это связано с тем, что именно к этой группе относятся важные в медико-ветеринарном отношении паразиты человека и животных Trypanosoma и Leishmania, являющиеся возбудителями таких заболеваний как сонная болезнь, кала-азар, болезнь Чагаса, кожный лейшманиоз и многих других. Также в это семейство входят и жгутиконосцы рода Phytomonas, вызывающие тяжелые заболевания культурных растений (масличной и кокосовой пальм, кофе, маниоки и др.) и наносящие тем самым большой экономический ущерб [Camargo, 1999].

Представители остальных родов этого семейства паразитируют, главным образом, в насекомых. Их способность расти на аксеничных средах и быстро накапливать биомассу привела к тому, что их широко применяют в качестве модельных объектов в цитологических, биохимических и молекулярно-биологических исследованиях. Аксеничные культуры гомоксенных трипаносоматид из насекомых также находят применение в биотехнологической промышленности при производстве эукариотических белков. Кроме того трипаносоматиды рассматриваются как возможное средство биологического контроля над численностью переносчиков опасных болезней [Schaub, 1990]. Все это в значительной степени определяет актуальность настоящего исследования.

Большой интерес представляет паразитическая агрессивность группы и предполагаемая высокая скорость образования новых паразито-хозяинных систем. Так уже описано несколько случаев, когда трипаносоматиды, являющиеся гомоксенными паразитами насекомых, поражали растения, животных и человека [Morsy et al., 1988; Conchon et al., 1989; Dedet et al., 1995; Pacheco et al., 1998; Boisseau-Garsaud et al., 2000; Fiorini et al., 2001, Marin et al., 2007].

Трипаносоматиды обладают рядом особенностей, изучение которых имеет общебиологическое значение. Среди них необычная клеточная органелла кинетопласт, редактирование РНК, полицистроиная транскрипция большинства генов, транс-сплайсинг и другие.

Наряду со всем выше изложенным необходимо отметить, что систематика семейства чрезвычайно консервативна, запутана и ненадежна [Momen, 2001]. Десять общепринятых родов трипаносоматид выделяются на основании наличия у них тех или иных морфотипов клеток, определяемых при помощи светового микроскопа (про-, эпи-, хоано-, трипо-, описто-, эндо- и амастиготы) и количества хозяев, вовлеченных в их жизненный цикл. Бурный расцвет электронно-микроскопических исследований, революционизировавший представления о системе протистов вообще, практически никак не отразился на систематике трипаносоматид, несмотря на то, что было получено значительное количество новых данных.

Между тем новейшие молекулярно-филогенетические исследования трипаносоматид дали результаты, противоречащие традиционным представлениям о систематике этой группы. Так, например, была показана полифилия четырех родов гомоксенных трипаносоматид из насекомых - Crithidia, Herpetomonas, Blastocrithidia и Leptomonas [Merzlyak et al. 2001, Podlipaev et al., 2004]. При этом симбионт-содержащие виды трипаносоматид, относящиеся к трем разным родам оказались филогенетически близкими [Hollar et al., 1998]. Было обнаружено, что два наиболее важных с практической точки зрения вида трипаносом - T.brucei и T.cruzi - разделены значительным генетическим расстоянием, сравнимым с теми, что разделяют любые два из остальных родов трипаносоматид [Hannaert et al., 1998; Hughes, Piontkivska, 2003; Hamilton et al., 2004], а представители рода Endotrypanum на филогенетических деревьях заняли место среди лейшманий [Croan, Ellis, 1996].

Все эти факты порождают закономерные сомнения в обоснованности принятой системы и наводят на мысль о необходимости ее пересмотра. Однако для этого, прежде всего, важно понять, из-за чего возникают противоречия между традиционным морфологическим и сравнительно новым молекулярно-филогенетическим подходами в систематике трипаносоматид, и попытаться их разрешить. Анализу этих вопросов и посвящена настоящая работа.

Степень разработанности темы исследования

Тема, рассматриваемая в настоящем исследовании, неоднократно затрагивалась в литературе посвященной систематике трипаносоматид. Однако в большинстве подобных работ содержится лишь констатация факта существования противоречий между морфологическим и молекулярно-филогенетическим подходами и отсутствует подробный анализ причин этих противоречий. Практически нигде до сих пор не были рассмотрены возможные пути выхода из I данного конфликта, вместо этого обычно предлагали отказ от использования морфологических признаков как ненадежных и построение системы только на основе молекулярно-филогенетический подхода.

Цель и задачи работы

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: выполнить ретроспективный анализ развития взглядов на систему трипаносоматид провести исследование коллекционного материала и природных изолятов гомоксенных трипаносоматид с целью расширения списка видов, включаемых в молекулярно-филогенетический анализ переисследовать те виды трипаносоматид, изоляция которых в культуру сопровождалась сменой морфотипов осуществить проверку гипотезы о монофилии цистообразующих трипаносоматид выполнить филогенетический анализ семейства с использованием генов 18S, 28S, мини-экзона, и HSP83 исследовать известные примеры противоречий между современной системой трипаносоматид и результатами молекулярно-филогенетических исследований и выявить причины подобных противоречий определить вероятные пути преодоления противоречий между морфологическим и молекулярно-филогенетическим подходами к созданию системы трипаносоматид

Научная новизна

На светооптическом уровне исследованы природные изоляты двенадцати видов цистообразующих трипаносоматид (в том числе семи ранее неизвестных), относящихся к родам Blastocrithidia и Leptomonas, а также 22 лабораторные культуры всех до сих пор неописанных видов трипаносоматид, содержащихся в коллекции Зоологического института РАН и выделенных его сотрудниками.

Описан один новый для науки вид (Crithidia dedvà) и обосновано перенесение другого вида {Leptomonas nabiculaé) в род Herpetomonas.

Обнаружено, что смешанные заражения разными видами трипаносоматид, которые ранее считались редким явлением, могут быть весьма частными у некоторых групп хозяев.

Впервые проведено тестирование гена НБР83 в качестве молекулярного маркера у трипаносоматид. Показано, что реконструкция филогении по данному гену может давать значительные искажения, у отдельных видов выявлены его вероятные псевдогены.

Предложен комплексный подход к построению системы трипаносоматид.

Теоретическая и практическая значимость работы

Настоящее исследование проводилось в рамках рассмотрения фундаментальной проблемы соотношения различных типов данных и их применимости для систематики. Результаты проведенного анализа противоречий между морфологическим и молекулярно-филогенетическим подходами, в частности выявленные причины и предложенные пути выхода из конфликта, могут быть представлять интерес для подобных исследований в других группах протистов. Приведенные в настоящей работе данные по особенностям эволюции белок-кодирующего гена НЭР83 будут полезны для исследователей, подбирающих молекулярно-филогенетические маркеры для анализа других групп протистов.

Результаты исследования также могут быть использованы в курсах лекций по протистологии для студентов биологических специальностей вузов.

Методология и методы исследования

При написании настоящей работы в методологическом плане подбирались актуальные на данный момент методы, широко применяющиеся в зоологических исследованиях.

К ним относятся: методы сбора материала и его первичной обработки (ловля и вскрытие насекомых) морфологические методы, связанные с приготовлением и микроскопическим исследованием временных препаратов и мазков клеток трипаносоматид методы молекулярной биологии, такие как выделение ДНК, ПЦР, гель-электрофорез и секвенирование ДНК, анализ состава последовательностей и проверка их на наличие химер молекулярно-филогенетические методы, связанные с выравниванием последовательностей и реконструкцией филогении.

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Основные результаты диссертационного исследования были представлены на Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2006), V и VI Европейских конгрессах по протистологии (Санкт-Петербург, 2007 и Берлин, Германия, 2011), Всероссийской конференции молодых ученых "Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов" (Москва, 2008), Международном симпозиуме "Modern achievements in population, evolutionary and ecological genetics" (Владивосток, 2009), Второй Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, 2010), Всероссийской конференции молодых ученых «Биоразнообразие: глобальные и региональные процессы» (Улан-Удэ, 2010).

По теме исследования автором подготовлены и опубликованы четыре статьи в рецензируемых изданиях из них две в российских и две в международных журналах. Кроме того, результаты диссертационной работы были включены в Отчеты по программам президиума РАН "Происхождение и эволюция биосферы" и "Научные основы сохранения биоразнообразия России" за 2007-2012 годы. Апробация исследования была осуществлена путем выступления автора на отчетных сессиях Зоологического института РАН в 2004, 2005 и 2010 годах и на семинарах лаборатории молекулярно-генетической систематики. Диссертация была обсуждена на совместном заседании лабораторий молекулярно-генетической систематики и протозоологии Зоологического института РАН и представлена к защите.

Благодарности

Прежде всего, я глубоко признателен моему научному руководителю Александру Олеговичу Фролову.

Я благодарен Марине Николаевне Малышевой за помощь в работе с лабораторными культурами и предоставление коллекционных микроскопических препаратов, Ольге Владимировне Митевой и Андрею Алексеевичу Кузьмину за помощь в сборе материала, Андрею Александровичу Добровольскому за внимание и поддержку на всех этапах подготовки работы, Владимиру Станиславовичу Лебедеву за консультации по методам филогенетического анализа. Кроме того я хочу выразить признательность Елене Владимировне Канюковой, Дмитрию Александровичу Гапону и покойному Изяславу Моисеевичу Кержнеру за профессиональное определение полу жесткокрылых.

Также я благодарен сотрудникам и аспирантам моей лаборатории: Михаилу Владимировичу Фокину, Татьяне Викторовне Петровой, Семену Юрьевичу

Бодрову, Екатерине Николаевне Мельниковой и в особенности заведующей Наталье Иосифовне Абрамсон за создание дружелюбной атмосферы.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Паразитология", Костыгов, Алексей Юрьевич

ВЫВОДЫ

4. Цистообразующие представители родов Leptomonas и Blastocrithidia составляют монофилетическую группу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе рассмотрены разнообразные конфликтные ситуации, возникавшие и возникающие между традиционной системой трипаносоматид, основанной на концепции клеточных морфотипов [Hoare, Wallace, 1966] и молекулярно-филогенетическими реконструкциями, и выявлены причины их возникновения.

Методологическая несостоятельность традиционной системы является наиболее важной причиной таких конфликтов. В самом начале изучения трипаносоматид, когда знания об этой группе были ограничены тем, что можно было наблюдать в световой микроскоп, основанная на морфотипах классификация была единственным возможным способом упорядочить знания о разнообразии этих жгутиконосцев. Типологический подход тогда был широко распространен в зоологической систематике, так что в тот период принципы систематики трипаносоматид вполне соответствовали духу времени. С тех пор прошло много лет, за которые знания об этой группе обогатились данными электронной микроскопии, биохимии, генетики и молекулярной биологии, а биологическая систематика за это время претерпела весьма значительное развитие, обогатившись новыми подходами. Между тем система трипаносоматид до недавнего времени оставалась неизменной, как и прежде опираясь на небольшой набор светооптических признаков. Все прочие данные практически не влияли на нее.

Использование молекулярных признаков в систематике началось в то время, когда на смену типологии пришел филогенетический анализ, для которого они оказались наилучшим материалом в силу своих особенностей (легкость установления гомологии, простота количественной оценки различий, возможность использования биологически оправданных моделей эволюции и пр.). Неудивительно, что многие исследователи охотно переключились на более удобный для работы материал, ведь помимо всего прочего генные последовательности дали возможность оперировать с большим количеством элементарных признаков, и при этом для получения данных не требовалось экспертного знания по конкретной группе организмов.

Естественно было ожидать, что применение новых методов будет способствовать совершенствованию системы группы, предоставив возможность по-новому взглянуть на иерархию морфологических признаков. Однако эти ожидания не оправдались. Многочисленные несоответствия между данными молекулярной филогенетики и традиционной схемой классификации трипаносоматид привели к тому, что в сознании многих исследователей стало складываться впечатление о непригодности морфологических признаков для построения естественной системы. Это дало им повод не искать способов разрешения противоречий, а классифицировать новые виды и выделять новые надвидовые таксоны на основе одних только данных молекулярной филогении [Podlipaev et al., 2004b; Svobodova et al., 2007; Zidkova et al., 2010; Teixeira et al., 2012].

На общем фоне, случаи, когда морфологические и молекулярно-филогенетические исследования удачно дополняют друг друга, выглядят как исключения. Так, проведенный А.О. Фроловым филогенетический анализ кинетопластид, выполненный с использованием морфологических признаков, оказался довольно успешным в плане того, что позволил, в частности, обосновать монофилию рода Trypanosoma и группы цистообразующих трипаносоматид [Фролов, 1997; Подлипаев, Фролов, 2000]. В молекулярно-филогенетических работах вопрос о филогении трипаносом не удавалось окончательно разрешить еще в течение нескольких лет, и лишь совсем недавно в этом вопросе была поставлена точка [Leonard et al, 2011]. Что касается цистообразующих трипаносоматид, именно обнаружение у них морфологических синапоморфий явилось стимулом для молекулярно-филогенетического исследования данной группы. И, согласно результатам настоящего исследования, гипотеза, сформулированная исключительно на основании морфологических признаков, хорошо согласуется с молекулярными данными. Принципиально важно отметить, что данная гипотеза, так же, как и молекулярная филогения, идет вразрез с существующей системой. Точно так же обстоят дела и с симбионт-содержащими трипаносоматидами - филогруппой, которая поддерживается не только молекулярными, но и морфологическими признаками [Би е! а1, 1994 а, Ь; РгеутиПег, Сатащо, 1981; Те1хека е! а1, 2011]. Эти примеры наглядно демонстрируют, что ограниченность традиционной системы трипаносоматид малым набором признаков, сложившимся еще на заре исследования данной группы, неминуемо должна была привести к ее дискредитации по мере накопления новых данных. Однако по иронии судьбы дискредитированными оказались морфологические признаки вообще.

Таким образом, единственным путем преодоления основного противоречия между морфологическим и молекулярным подходами в современной систематике трипаносоматид является отказ от концепции морфотипов и построение новой системы группы на филогенетической основе. При этом, необходимо расширять круг анализируемых признаков, не ограничиваясь морфологией клеток, но использовать также данные молекулярной и клеточной биологии, биохимии, генетики. В сущности, простейшие, у которых клеточные функции одновременно являются функциями целого организма, не являются типичными зоологическими объектами. В этом смысле они гораздо ближе к прокариотам, систематика которых уже давно использует большой комплекс фенотипических признаков. Следует отметить, что в поисках компромисса микробиологи разработали для прокариот многофакторную (ро1ур1ш8ю) таксономию, сочетающую в себе как фенотипические так и молекулярные (генотипические) признаки [Уапёатте е! а1., 1996]. Такой комплексный подход, по-видимому, имеет замечательные перспективы и для систематики трипаносоматид.

Другой важной причиной конфликтов является ошибочное отождествление видов, относящихся к разным таксономическим и/или филогенетическим группам трипаносоматид. Такая ошибка может возникнуть по причине одновременного присутствия разных паразитов в одном и том же хозяине (смешанные инвазии) или в разных особях одного вида хозяев. Как было продемонстрировано в настоящей работе, это приводило к тому, что ошибочно объединялись характеристики, принадлежащие совершенно разным видам, в результате чего формировались виртуальные химерные объекты. Из рассмотренных в настоящем исследовании примеров такое было в случаях с Blastocrithidia gerricola, В. miridarum, Herpetomonas nabiculae и Leptomonas rigidus. Дополнительным катализатором такой путаницы во многих случаях явилась традиция в обязательном порядке выделять лабораторные культуры для каждого вновь описываемого вида. Хотя в этой идее нет ничего дурного, однако стремление соответствовать данной традиции побудило некоторых исследователей выделять "типовые" культуры во что бы то ни стало даже для тех трипаносоматид, которые невозможно культивировать. При этом они не предпринимали никаких попыток удостовериться в том, что клетки культур соответствуют описанным видам.

В настоящее время идентификация трипаносоматид уже не представляет серьезных трудностей благодаря использованию методов молекулярной биологии. Как было показано в настоящей работе, с их помощью можно также выявлять и смешанные заражения. Именно контроль материала при помощи молекулярных методов и является путем преодоления (или, если говорить о будущем, предотвращения) противоречий, обусловленных смешанными заражениями.

Ориентированность исследований трипаносоматид на работы с культурами также можно рассматривать как одну из косвенных причин противоречий между систематикой и филогенией. Согласно традиции для каждого нового вида достаточно исследовать только одну культуру. При этом разные культуры трипаносоматид, имеющие морфологические отличия друг от друга принято считать разными видами. Между тем популяционные исследования многих паразитических простейших продемонстрировали у них высокий уровень клональности [Tibayrenc et al., 1990; Tibayrenc, Ayala, 2002]. Отсюда следует, что отдельные изоляты трипаносоматид с большой вероятностью представляют собой клоны, поэтому исследователям легко впасть в заблуждение приняв индивидуальные различия клонов за межвидовые. Причем с течением времени ввиду искусственных условий в культуре могут происходить дополнительные изменения, которые будут приводить к возникновению новых различий.

В случае с родом Wallaceina индивидуальные признаки изолятов ранее интерпретировались как видовые, поэтому видовой признак - наличие брохомастигот - был повышен в статусе до родового, что внесло еще большую путаницу в систематику трипаносоматид. Между тем морфологически валласеины близки к критидиям, а их филогенетическая близость к типовому виду рода Crithidia однозначно указывает на то место в системе, куда их должно поместить.

Ввиду того, что рассмотренная конфликтообразующая причина действует только в рамках морфотипической концепции, переход систематики трипаносоматид на новую методологическую основу (см. выше), позволит в дальнейшем избегать подобных проблем.

Несмотря на то, что старая морфотипическая система трипаносоматид уже себя дискредитировала, все же, с некоторыми оговорками и уточнениями, некоторые филогенетические группы могут быть охарактеризованы с использованием морфотипов. Так трипомастиготы присутствуют у всех представителей рода Trypanosoma и очень редки за его пределами. Следует отметить, что такой ультраструктурный признак, как прерывающееся в месте выхода жгутика кольцо микротрубочек тубулеммы делает трипомастиготы трипаносом уникальными. Эпимастиготы, классические и трансформированные за счет редукции ундулирующей мембраны в псевдопромастигот характерны для группы цистообразующих трипаносоматид. В других группах эпимастиготы если и встречаются, то как на это уже было указано ранее, они отличаются либо наличием эндосимбионтов, либо разрывом в кольце микротрубочек тубулеммы. Опистомастиготы, если их отличать от опистоморф, присутствуют у большинства видов рода Herpetomonas и за его пределами встречаются лишь у некоторых пока еще неописанных видов (культуры Wsd и ТгурХ).

Таким образом, исследование того или иного вида на предмет наличия у него тех или иных клеточных морфотипов может быть полезным не только с точки зрения изучения эволюции морфологических признаков, но иметь некоторую, пусть и ограниченную, диагностическую ценность.

Необнаружение характерных морфотипов является еще одной причиной конфликта традиционной систематики и молекулярной филогенетики трипаносоматид. Такое имело место, например, у рассмотренного в настоящей работе Herpetomonas nabiculae. Разумеется данная проблема должна уйти в прошлое с отказом от морфотипической концепции, однако ввиду того, что знание о наличии морфотипов все же имеет некоторое значение, следует тщательнее исследовать доступные изоляты видов, не ограничиваясь рассмотрением нескольких десятков клеток.

Среди возможных причин конфликта морфологических и молекулярных признаков, есть и такие, которые связаны со спецификой молекулярно-филогенетических исследований. Они подразделяются на те что связаны непосредственно с получением последовательностей и на те, что определяются свойствами того или иного молекулярного маркера в плане филогенетического анализа. К первой группе причин относятся создание молекулярных химер, как это было в случае с геном 18S рРНК Herpetomonas nabiculae, и кросс-контаминация в ПЦР, по всей вероятности, имевшая место в случае с культурами Leptomonas rigidus PL и Sld. Во второй группе находятся традиционные проблемы молекулярных маркеров, препятствующие реконструкции истинной филогении, такие как смещение нуклеотидного состава в изменчивых сайтах, сильное различие в темпах замен, эффект притяжения длинных ветвей, разрушение филогенетического сигнала и т.п.

Артефакты молекулярно-филогенетических исследований во многих случаях лучше заметны по той причине, что, как правило, они приводят к противоречию между разными филогенетическими маркерами. Поэтому использование разных маркеров является одним из рецептов, позволяющих избежать подобных проблем. Кроме того кросс-контаминация приводит к появлению идентичных последовательностей у разных образцов, что не может не бросаться в глаза, особенно если другие данные, будь то молекулярные или морфологические противоречат этому. К тому же практика использования отрицательных контролей в ПЦР должна минимизировать возможность подобных ошибок. Молекулярные химеры могут быть выявлены как невооруженным глазом при анализе выравнивания (если последовательности исходных вариантов имеют достаточные различия), или же с помощью специализированного программного обеспечения.

Проблемы самих молекулярных маркеров выявлять сложнее. И здесь сравнение их между собой очень важно, а в том случае, если между ними выявляются противоречия, совершенно необходимо их сопоставление с фенотипическими данными. Безусловно обязательным является применение в филогенетическом анализе корректных моделей, учитывающих особенности того или иного молекулярного маркера. Также большую пользу могут принести различные манипуляции с набором анализируемых таксонов, т.е. их добавление и удаление.

В настоящей работе было использовано несколько молекулярных маркеров: гены 18S и 28S рРНК, мини-экзона, 5S рРНК и HSP83. Еще три белок-кодирующих гена из-за трудностей с амплификацией были отвергнуты в самом начале исследования. Наилучшее разрешение и наибольшее соответствие фенотипическим данным продемонстрировал самый популярный в филогенетических исследованиях ген 18S рРНК, который благодаря своей высокой консервативности лучше других сохраняет филогенетический сигнал. Однако эффект притяжения длинных ветвей сказывается и на нем, хотя в меньшей степени, чем на других генах. Такие короткие маркеры, как гены мини-экзона и 5 S рРНК имеют слишком малую длину, поэтому в них содержится недостаточно данных для полноценной реконструкции филогении. Кроме того их использование ограничено невозможностью их амплификации у ряда видов, а-фрагмент гена 28S рРНК сходен с геном 18S рРНК по длине, однако филогенетический сигнал в нем слабее из-за более сильного контраста между вариабельными и консервативными областями. Ген HSP83 оказался весьма проблематичным из-за значительных межвидовых различий по нуклеотидному составу и наличия у бластокритидий последовательностей похожих на псевдогены. В плане разрешающей способности он был сравним с геном 28S рРНК, однако по указанным выше причинам давал искажения.

Неудивительно, что широко используемый в молекулярной филогенетике ген 18S рРНК оказался лучшим из всех использованных в настоящем исследовании молекулярных маркеров. Однако ввиду того, что даже и на нем могут сказываться некоторые артефакты, необходимо расширять круг генов применяемых для филогенетического анализа у трипаносоматид. Проблемы с реконструкцией филогении по молекулярным данным наглядно демонстрируют необходимость контроля получаемых результатов и использование фенотипических признаков призвано сыграть здесь не последнюю роль.

157

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костыгов, Алексей Юрьевич, Санкт-Петербург

1. Колесников, А. А. Молекулярные параметры кинетопластной ДНК трипаносоматид как таксономический признак / А. А. Колесников // Цитология.1993. — Т. 35. — № 3. — С. 24—38.

2. Колесников, А. А. Редукция редактируемого домена митохондриального гена А6 (субъединица 6 АТФазы) у трипаносоматид / А. А. Колесников, Е. М. Мерзляк, Е. А. Бессолицына, А. В. Федяков, Г. Шониан // Мол. Биол. — 2003. — Т. 37. — № 4. — С. 637—642.

3. Костыгов, А. Ю. Исследование причин конфликта таксономии и молекулярной филогении трипаносоматид на примере Leptomonas nabiculae Podlipaev, 1987 / А. Ю. Костыгов, М. Н. Малышева, А. О. Фролов // Паразитология. — 2011. — Т. 45. — № 6. — С. 409—424.

4. Крылов, М. В. Исследование наличия генетического обмена в жизненном цикле Crithidia oncopelti (Protozoa, Kinetoplastmonada) / M. В. Крылов, А. Г. Самовар, С. А. Подлипаев, А. С. Хаецкий // Тр. Зоол. ин-та АН СССР. — 1985а.1. Т. 129, —С. 4—25.

5. Крылов, М. В. Один ли вид содержится в культуре С. oncopelti (Kinetoplastmonada, Trypanosomatidae)? / М. В. Крылов, С. А. Подлипаев, А. С. Хаецкий, JI. М. Белова, А. О. Фролов, Б. Я. Ниязбекова // Зоол. журн. — 19856. — Т. 64.—С. 165—171.

6. Малышева, М. Н. Жизненный цикл и морфология стадий развития жгутиконосцев Proteomonas brevicula (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) : автореф. дис. .канд. биол. наук : 03.00.19 / Малышева Марина Николаевна. — СПб., 1998.18 с.

7. Малышева, М. Н. Описание Wallaceina vicina sp. п. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) из клопа-водомерки Gerris rufoscutellatus Latreille, 1807

8. Hemiptera: Gerridae) / M. H. Малышева, А. О. Фролов // Паразитология. — 2004.

9. Т. 38. — № 5. — С. 470—476. ,

10. Малышева, M. Н. Образование цистоподобных клеток жгутиконосцев Leptomonas oncopelti в средней кишке клопа Oncopeltus fasciatus / M. H. Малышева, A. О. Фролов, С. О. Скарлато // Цитология. — 2006. — Т. 48. — № 9.1. С. 723—733.

11. Малышева, M. Н. Проблема идентификации культур гомоксенных трипаносоматид и описание нового вида Wallaceina podlipaevi sp. п. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) / M. H. Малышева, A. О. Фролов // Паразитология. — 2009. — Т. 43. — № 6. — С. 502—515.

12. Подлипаев, С. A. Blastocrithidia raabei rostrata паразит клопа Coreus marginatus / С. А. Подлипаев // Зоол. Журн. — 1988. — Т. 47. — С. 1407—1411.

13. Подлипаев, С. А. Каталог мировой фауны простейших семейства Trypanosomatidae (Protozoa) / С. А. Подлипаев // Труды ЗИН РАН. — 1990. — Т. 217, — 177 С.

14. Подлипаев, С. А. Трипанозоматиды насекомых и растений : Фауна, систематика и биология : дис. . д-ра. биол. наук : 03.00.19 / Подлипаев Сергей Анатольевич. — СПб., 1999. — 278 с.

15. Подлипаев, С. А. Специфичность гомоксенных трипаносоматид / С. А. Подлипаев//Паразитология.—2003.—Т. 37.—№ 1. — С. 3—17. ,

16. Подлипаев, С. А. Описание и лабораторное культивирование Blastocrithidia miridarum sp. п. (Mastigophora, Trypanosomatidae) / С. А. Подлипаев, А. О. Фролов II Паразитология. — 1987. — T. 21. — Вып. 4. — С. 545—552.

17. Подлипаев, С. A. Proteomonas inconstans п. gen., п. sp. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) паразит клопа Calocoris sexguttatus (Hemiptera: Miridae) / С. A. Подлипаев, А. О. Фролов, А. А. Колесников // Паразитология. — 1990. — Т. 24.1. С. 339 — 345.

18. Подлипаев, С. А. Сравнительное определение количества ДНК и молекулярные кариотипы у низших трипанозоматид из клопов Северо-Запада СССР / С. А. Подлипаев, М. В. Филатов, Р. А. Пантина // Паразитология. — 1991.

19. Т. 25. — № 3. — С. 250—257.

20. Подлипаев, С. А. Филогения трипаносоматид: молекулярный и морфологический подходы / С. А. Подлипаев, А. О. Фролов // Паразитология. — 2000.—Т. 34. — №3, —С. 169—182.

21. Самовар, А. Г. Генетические обмены между особями трипаносоматид Crithidia oncopelti / А. Г. Самовар // Цитология. — 1993. — Т. 35. — № 3. — С. 39—58.

22. Самовар, А. Г. Исследование наличия генетического обмена у Crithidia oncopelti (Trypanosomatidae) с помощью маркеров лекарственной резистентности / А. Г. Самовар, М. В. Крылов // Паразитология. — 1987. — Т. 21. — № 6. — С. 705—711.

23. Скарлато, С. О. Ультраструктура гигантских многоядерных клеток паразитических жгутиконосцев Crithidia oncopelti / С. О. Скарлато, M. Н. Малышева // Цитология. — 1987. — Т. 29. — № 12. — С. 1337—1342.

24. Скарлато, С. О. Особенности организации хромосомного аппарата жгутиконосцев Crithidia sp. / С. О. Скарлато, Н. В. Сомова, Ю. М. Розанов, Б. Н. Кудрявцев, H. Н. Бобылева, А. О. Фролов // Цитология. — 1998. — Т. 40. — № 11. — С. 991—1005.

25. Фролов, А. О. Жизненный цикл Leptomonas nabiculae (Kinetoplastida Trypanosomatidae) в клопах Nabicula flavomarginata (Hemiptera, Nabidae) / A. O. Фролов // Матер. 10-й конф. Укр. об-ва паразитологов. — Ч. 2. — Киев: Наукова думка, 1986. —С. 289.

26. Фролов, А. О. Жизненный цикл Leptomonas pyrrhocoris Z. (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) / А. О. Фролов // Зоол. журн. — 1987a. — T. 66. —№ 1. — С. 5—11.

27. Фролов, А. О. Жизненный цикл Blastocrithidia miridarum Z. (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) / A. О. Фролов // Зоол. журн. — 19876. — T. 66. — № 5. — С. 655—661.

28. Фролов, А. О. Происхождение трипаносоматид / А. О. Фролов // Паразитология. — 1993. — Т. 27. — № 2. — С. 97—107.

29. Фролов, А. О. Новая гипотеза происхождения трипаносоматид : дис. . д-ра. биол. наук : 03.00.19 / Александр Олегович Фролов. — СПб., 1997. — 265 с.

30. Фролов, А. О. Класс Kinetoplastidea Honigberg, 1963 / А. О. Фролов // В кн.: Протесты. — Ч. 1. — СПб : Наука, 2000. — С. 211—256.

31. Фролов, А. О. Описание Crithidia allae sp.n. и Crithidia brevicula sp.n. (Protozoa, Trypanosomatidae) из хищного клопа Nabis brews Scholtz (Hemiplera, Miridae) / А. О. Фролов, M. H. Малышева // Зоол. журн. — 1989а. — Т. 68. — Вып. 7.— С. 5—10.

32. Фролов, А. О. Цикл развития паразитического жгутиконосца Crithidia brevicula в лабораторной культуре / А. О. Фролов, М. Н. Малышева // Цитология.19896. — Т. 31. — № 8. — С. 971—975.

33. Фролов, А. О. Локализация и способы закрепления жгутиконосцев Blastocrithia miridarum в пищеварительном тракте клопов Adelphocoris guardripunctatus / А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Паразитология. — 1988. — Т. 22,—№6, —С.481—487.

34. Фролов, А. О. Электронно-микроскопическое исследование жгутиконосцев Leptomonas jaculum: из средней кишки Nepa cinerea / А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Паразитология. — 1989. — Т. 23 — № 5. — С. 383—389.

35. Фролов, А. О. Структура розетковидных клеточных ассоциатов у низших трипаносоматид / А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Цитология. — 1990а. — Т. 32.5,—С. 455—461.

36. Фролов, А. О. Дифференцировка цистоподобных клеток паразитического жгутиконосца Leptomonas mycophilus in vitro / А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Цитология. — 19906. — Т. 32. — № 10. — С. 985—992.

37. Фролов, А. О. Морфология цистоподобных клеток у жгутиконосца Leptomonas jaculum / А. О. Фролов, С. О. Скарлато, Е. Г. Шаглина // Цитология. — 1991, —Т. 33.—№ 10,—С. 55—58.

38. Фролов, А. О. Описание Leptomonas mycophilus sp.n. (Trypanosomatidae) -паразита клопа Phytocoris sp. (Miridae) / А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Паразитология. — 1991. — Т. 25. — № 2. — С. 99—103.

39. Фролов, А. О. Тонкое строение и механизмы адаптации низших трипаносоматид в полужесткокрылых насекомых / А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Цитология. — 1995. — Т. 37. — № 7. — С. 539—560.

40. Фролов, А. О. Необычный способ формирования инвазионных стадий у Leptomonas rigidus (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) / А. О. Фролов, С. А. Подлипаев // Паразитология. — 1996. — Т. 30. — № 6 — С. 473—477.

41. Шаглина, Е. Г. Ультраструктура паразитического жгутиконосца Leptomonas nabiculae из клопа Nabicula flavomarginata / Е. Г. Шаглина, А. О. Фролов, С. О. Скарлато // Цитология. — 1995. — Т. 37. — № 1—2. — С. 159—165.

42. Юрченко, В. Ю. Миникольцевая кинетопластная ДНК Trypanosomatidae / В. Ю. Юрченко, А. А. Колесников // Мол. Биол. — 2001. — Т. 35. — № 1. — С. 3— 13.

43. Adl, S. M. The New Higher Level Classification of Eukaryotes with Emphasis on the Taxonomy of Protists / S. M. Adl, A. G. B. Simpson, M. A. Farmer, R. A. Andersen et al. // J. Euk. Microbiol. — 2005. — V. 52. — № 5. — P. 399—451.

44. Alexeieff, A. Sur le genre Leptomonas Kent / A. Alexeieff // C. R. Séan. Soc. Biol. — 1911. —V. 71. —P. 455—458.

45. Alexeieff, A. Notes sur les Herpetomonadidae / A. Alexeieff // Arch. Zool. Exp. Gen. (Notes et Revue). — 1912. — V. 9. — №. 2. — P. 29—38.

46. Alonso, G. Trypanosomatidae codon usage and GC distribution./ G. Alonso, P. Guevara, J. L. Ramirez // Mem Inst Oswaldo Cruz. — 1992. — V. 87. — № 4. — P. 517—523.

47. Alvarez, F. Evolution of codon usage and base contents in kinetoplastid protozoans / F. Alvarez, C. Robello, M. Vignali // Mol. Biol. Evol. — 1994. — V. 11.5,—P. 790—802.

48. Alvarez, F. The analysis of protein coding genes suggests monophyly of Trypanosoma / F. Alvarez, M. N. Cortinas, H. Musto // Mol. Phylogenet. Evol. — 1996.

49. V. 5. — Iss. 2. — P. 333—343.

50. Alves, A. M. Genomic variation in Trypanosoma cruzi clonal cultures / A. M. Alves, D. F. de Almeida, W. M. von Kruger // Parasitol Res. — 1996. — V. 82. — Iss. 5,— P. 410—415.

51. Anderson, B. A. Ultrastructure of Trypanosoma lewisi: flagellum, microtubules and kinetoplast / B. A. Anderson, R. A. Ellis // J. Protozool. — 1965. — V. 12. — P. 483—499.

52. Barry, J. D. Why are parasite contingency genes often associated with telomeres? / J. D. Barry, M. L. Ginger, P. Burton, R. McCulloch // Int. J. Parasitol. — 2003. — V. 33,—Iss. 1.—P. 29—45.

53. Bastin, P. Inside and outside of the trypanosome flagellum: a multifunctional organelle / P. Bastin, T. J. Pullen, F. F. Moreira-Leite, K. Gull // Microbes Infect. — 2000,—V. 2,—P. 1865-1874.

54. Bastin, P. Paraflagellar rod is vital for trypanosome motility / P. Bastin, T. Sherwin, K. Gull // Nature. — 1998. — V. 391. — P. 548.

55. Belli, S. I. Chromatin remodelling during the life cycle of trypanosomatids / S. I. Belli // Int. J. Parasitol. — 2000. — V. 30. — № 6. — P. 679—687.

56. Berriman, M. The genome of the African trypanosome Trypanosoma brucei / M.

57. Berriman, E. Ghedin, C. Hertz-Fowler et al. // Science. — 2005. — V. 309 (5733). — P. 416—422.

58. Beverley, S. M. Gene amplification in Leishmania / S. M. Beverley // Annu Rev. Microbiol. — 1991. —V. 45 — P. 417—444.

59. Bingle, L.E. A novel GFP approach for the analysis of genetic exchange in trypanosomes allowing the in situ detection of mating events / L. E. Bingle, J. L. Eastlake, M. Bailey., W. C. Gibson // Microbiology. — 2001. — V. 147. — Pt. 12. — P. 3231—3240.

60. Boothroyd, J. C. Transcripts coding for variant surface glycoproteins of Trypanosoma brucei have a short, identical exon at their 5' end / J. C. Boothroyd, G. A. Cross // Gene. — 1982. — V. 20. — P. 281-289.

61. Borst, P. Molecular basis for trypanosome antigenic variation / P. Borst, G. A. Cross // Cell. 1982. — V. 29. — Iss. 2. — P. 291—303.

62. Borst, P. Kinetoplast DNA of Trypanosoma evansi / P. Borst, F. Fase-Fowler, W. C. Gibson // Mol. Biochem. Parasitol. — 1987. — V. 23. — P. 31-38.

63. Brandäo, A.A. The heterogeneity of choanomastigotes-shaped trypanosomatids as analysed by their kDNA minicircle size: taxonomic implications / A. A. Brandäo, A. Miranda, W. M. Degrave, M. A. Sousa // Parasitol. Res. — 2000. — V. 86. — P. 809— 812.

64. Breglia, S. A. Phylogeny of phagotrophic euglenids (Euglenozoa) as inferred from hsp90 gene sequences / S. A. Breglia, C. H. Slamovits, B. S. Leander // J. Euk. Microbiol. — 2007. — V. 54. — № 1. — P. 86—92.

65. Brooker, B. E. Flagellar attachment and detachment of Crithidia fasciculata to the gut wall of Anopheles gambiae / B. E. Brooker // Protoplasma. — 1971a. — V. 73. — P. 191-202.

66. Brooker, B. E. The fine structure of Crithidia fasciculata with special reference to the organelles involved in the ingestion and digestion of protein / B. E. Brooker // Z. Zellforsch Mikrosk Anat. — 1971b. — V. 116. — № 4. — P. 532—63.

67. Burreson, E. M. Multiplication of Trypanosoma pacifica (Euglenozoa: Kinetoplastea) in English sole, Parophrys vetulus, from Oregon coastal waters / E. M. Burreson, E. Karlsbakk // J. Parasitol. — 2007. — V. 93. — № 4. — P. 932—933.

68. Bütschli, O. 1878. Beitrage zur Kenntniss der Flagellaten und einiger verwandten Organismen / O. Bütschli // Zeitschr. f. Wiss. Zool. — 1878. — Bd. 30. — S. 205— 281.

69. Bütschli, O. Protozoa (in Bronn's Klasse und Ordn. des Thierreichs, Mastigophora) / O. Bütschli. — 1884. — Bd. 1. — Abt. 2. — S. 785—864.

70. Camargo, E. P. Phytomonas and other trypanosomatid parasites of plants and fruit / E. P. Camargo // Adv. Parasitol. — 1999. — V. 42. — P. 29—112.

71. Camargo, E.P. Enzymes of ornithine-arginine metabolism in trypanosomatids of the genus Phytomonas / E. P. Camargo, S. Silva, I. Roitman, W. de Souza, J. V. Jankevicius, M. Dollet // J. Euk. Microbiol. — 1987. — V. 34. — № 4. — P. 439-441.

72. Cano, M. I. Telomere biology of trypanosomatids: more questions than answers / M. I. Cano // Trends Parasitol. — 2001. — V. 17. — № 9. — P. 425^29.

73. Castresana, J. Selection of conserved blocks from multiple alignments for their use in phylogenetic analysis / J. Castresana // Mol. Biol. Evol. — 2000. — V. 17. — P. 540—552.

74. Chang, K. P. Ultrastructure of symbiotic bacteria in normal and antibiotic-treated Blastocrithidia culicis and Crithidia oncopelti / K. P. Chang // J. Protozool. — 1974. — V. 21,—P. 699—707.

75. Chatton, E. Coexistence d'un Leptomonas (Herpetomonas) et d'un Trypanosoma chez un muscide non vulnérant, Drosophila confusa Staeger / E. Chatton, E. Alilaire // Comp. Rend. Soc. Biol. — 1908. —V. 64. — P. 1004-1006.

76. Chimelli, L. Trypanosomiasis / L. Chimelli, F. Scaravilli // Brain Pathol. — 1997. — V. 7. — № 1,—P. 599—611.

77. Clark, T. B. A comparative study of kinetoplast ultrastructure in the Trypanosomatidae / T. B. Clark, F. G. Wallace // J. Protozool. — 1960. — V. 7. — P. 115—120.

78. Clark, T. B. The transmission of Crithidia fasciculata Léger 1902 in Culiseta incidens (Thomson) / T. B. Clark, W. R. Kellen, J. E. Lindegren, T. A. Smith // J. Protozool. — 1964. — V. 11. — P. 400-402.

79. Claus, C. Lehrbuch der Zoologie / C. Claus, K. Grobben. — Marburg in Hessen : Elwert, 1905. —955 s.

80. Clayton, C. E. Life without transcriptional control? From fly to man and back again / C. E. Clayton // EMBO J. — 2002. — V. 21. — № 8. — P. 1881—1888.

81. Croan, D. G. Evolution of the genus Leishmania revealed by comparison of DNA and RNA polymerase gene sequences / D. G. Croan, D. A. Morrison, J. T. Ellis // Mol. Biochem. Parasitol. — 1997. —V. 89. № 2. — P. 149—159.

82. Cupolillo, E. A revised classification for Leishmania and Endotrypanum / E. Cupolillo, E. Medina-Acosta, H. Noyés, H. Momen, G. Jr. Grimaldi. // Parasitol. Today.2000. — V. 16,—№4.—P. 142—144.

83. Deane, M. P. Trypanosoma cruzi: vertebrate and invertebrate cycles in the same mammal host, the opossum Didelphis marsupialis / M. P. Deane, H. L. Lenzi, A. Jansen // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 1984. — V. 79. — № 4. — P. 513—515.

84. Detke, S. DNA amplification in arsenite-resistant Leishmania / S. Detke, K. Katakura, K.P. Chang//Exp. Cell Res. — 1989. — V. 180.—№ 1,—P. 161—170.

85. Docampo, R. The acidocalcisome / R. Docampo, S. N. J. Moreno // Mol. Biochem. Parasitol. — 2001. —V. 33. — P. 151-159.

86. Docampo, R. Acidocalcisomes conserved from bacteria to man / R. Docampo, W. de Souza, K. Miranda, P. Rohloff, S. N. Moreno // Nat Rev Microbiol. — 2005. — V. 3,—№3.—P. 251—261.

87. Doflein, F. Die Protozoen als Parasiten und Krankheitserreger nach biologischen Gesichtspunkten dargestellt / F. Doflein. — Jena : Verlag von Gustav Fisher, 1901. — 298 s.

88. Dollet, M. The internal transcribed spacer of ribosomal RNA genes in plant trypanosomes {Phytomonas spp.) resolves 10 groups / M. Dollet, N. R. Sturm, D. A. Campbell // Infection, Genetics and Evolution. — 2012. — V. 12. — Iss. 2. — P. 299— 308.

89. Donovan, C. Kala-azar in Madras, especially with regard to its connexion with the dog and the bug (Conorrhinus) / C. Donovan // The Lancet. — 1909. — V. 177. — Iss. 4499.—P. 1495—1496.

90. Du, Y. 16S ribosomal DNA sequence identities of beta-proteobacterial endosymbionts in three Crithidia species / Y. Du, G. McLaughlin, K. P. Chang // J. Bacteriol. — 1994a. —V. 176. № 10. — P. 3081—3084.

91. Dunkerly, J. S. On some stages in the life-history of Leptomonas muscae-domesticae, with some remarks on the relationships of the flagellate parasites of insects / J. S. Dunkerly // Quart. J. Micr. Sei. — 1911. — V. 56. — P. 645—655.

92. Dunkerly, J. S. Flagellata and Ciliata. A Biological Survey of Clare Island in the County of Mayo, Ireland and of the Adjoining District / J. S. Dunkerly // Proc. Roy. Irish Acad. — 1913,— V. 31, — Sect. 1—3. — Pt. 61—62. — P. 1—20.

93. Duszenko, M. Intracellular transport of a variant surface glycoprotein in Trypanosoma brucei / M. Duszenko, I. E. Ivanov, M. A. Ferguson, H. Plesken, G. A. Cross//J. Cell Biol. — 1988,—V. 106. —№ 1.—P. 77—86.

94. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput / R. C. Edgar // Nucl. Acids Res. — 2004. — V. 32. — № 5. — P. 1792— 1797.

95. El-Sayed, N. M. The genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease / N. M. El-Sayed, P. J. Myler, D. C. Bartholomeu et al. // Science. — 2005a.—V. 309 (5733).—P. 409^15.

96. El-Sayed, N. M. Comparative genomics of trypanosomatid parasitic protozoa / N. M. El-Sayed, P. J. Myler, G. Blandin et al. // Science. — 2005b. — V. 309 (5733). — P. 404—409.

97. Evans, D. A. Recent observations on the behaviour of certain trypanosomes within their insect hosts / D. A. Evans, D. S. Ellis // Adv. Parasitol. — 1983. — V. 22.1. P. 1—42.

98. Faria-e-Silva, P. M. Proliferative opisthomastigote forms in Herpetomonas roitmani (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) / P. M. Faria-e-Silva, M. J. Soares, W. de Souza // Parasitol. Res. — 1996. — V. 82. — № 2. — P. 125-129.

99. Ferguson, M. A. J. The surface glycoconjugates of trypanosomatid parasites / M. A. J. Ferguson // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. — 1997. — V. 352 (1359).1. P. 1295—1302.

100. Fernandes, A. P. Evolution of nuclear ribosomal RNAs in kinetoplastid protozoa: perspectives on the age and origin of parasitism / A. P. Fernandes, K. Nelson, S. M. Beverley // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. — 1993. — V. 90. — № 24. — P. 1160811612.

101. Flegontov, P. N. The Leishmania major maxicircle divergent region is variable in different isolates and cell types / P. N. Flegontov, M. V. Strelkova, A. A. Kolesnikov // Mol. Biochem. Parasitol. — 2006. — V. 146. — № 2. — P. 173—179.

102. Franchini, G. Sur un flagellé de lygaeide (Crithidia oxycareni n. sp.) / G. Franchini // Bulletin de la Société de Pathologie Exotique. — 1922. — V. 15. — № 1.1. P. 113—116.

103. Franco, A. M. Characterization of Endotrypanum (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), a unique parasite infecting the neotropical tree sloths (Edentata) / A. M. Franco, G. Jr. Grimaldi // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 1999. — V. 94. — № 2.1. P. 261—268.

104. Frasch, A. C. The kinetoplast DNA of Trypanosoma equiperdum / A. C. Frasch, S. L. Hajduk, J. H. Hoeijmakers, P. Borst, E. Brunei, J. Davison // Biochim. Biophys. Acta. — 1980. — V. 607. — P. 397-410.

105. Freymuller, E. Ultrastructural differences between species of trypanosomatids with and without endosymbionts / E. Freymuller, E. P. Camargo // J. Protozool. — 1981, —V. 28,—P. 175—182.

106. Jobb, G. TREEFINDER: a powerful graphical analysis environment for molecular phylogenetics / G. Jobb, A. von Haeseler, K. Strimmer // BMC Evolutionary Biol. —2004.—V. 4. — № 18,—P. 1—9.

107. Gadelha, C. Cryptic paraflagellar rod in endosymbiont-containing kinetoplastid protozoa / C. Gadelha, B. Wickstead, W. de Souza, K. Gull, N. Cunha-e-Silva // Euk. Cell. — 2005. —V. 4. — №. 3. — P. 516-525.

108. Gadelha, C. Flagellar and ciliary beating in trypanosome motility / C. Gadelha, B. Wickstead, K. Gull // Cell Motil. Cytoskeleton. — 2007. — V. 64. — P. 629-643.

109. Gerasimov, E. S. From cryptogene to gene? ND8 editing domain reduction in insect trypanosomatids / E. S. Gerasimov, A. Yu. Kostygov., Shi Yan, A. A. Kolesnikov // Europ. J. Protistol. — 2012. — V. 48. — P. 185—193.

110. Gibbs, A. J. Crithidia familiaris n. sp. in Cenaeus carnifex Fabr. (Hemiptera) / A. J. Gibbs//Parasitology. — 1950. —V. 40. — № 3-4. — P. 322—327.

111. Gibbs, A. J. Crithidia sandoni sp. nov. in Holopterna alata (Hemiptera) / A. J. Gibbs//J. Parasitol. — 1951.—V. 37, — №6, — P. 587—593.

112. Gibson, W. Kinetoplast DNA minicircles are inherited from both parents in genetic hybrids of Trypanosoma brucei / W. Gibson, L. Garside // Mol. Biochem. Parasitol. — 1990. —V. 42. — № 1. — P. 45—53.

113. Gibson, W. Genetic exchange in Trypanosoma brucei: selection of hybrid trypanosomes by introduction of genes conferring drug resistance / W. Gibson, H. Whittington // Mol Biochem Parasitol. — 1993. — V. 60. — № 1. — P. 19—26.

114. Gibson, W. Kinetoplast DNA minicircles are inherited from both parents in genetic crosses of Trypanosoma brucei / W. Gibson, M. Crow, J. Kearns // Parasitol Res.— 1997,—V. 83.—№5,—P. 483—488.

115. Gibson, W. Analysis of a cross between green and red fluorescent trypanosomes / W. Gibson, L. Peacock, V. Ferris, K. Williams, M. Bailey // Biochem Soc Trans. — 2006. — V. 34. — Pt. 4. — P. 557—559.

116. Gibson, W. The use of yellow fluorescent hybrids to indicate mating in Trypanosoma brucei / W. Gibson, L. Peacock, V. Ferris, K. Williams, M. Bailey // Parasit. Vectors. —2008. —V. 1. —№ 1, —P. 4.

117. Gillies, C. A new species of Leptomonas parasitizing the macronucleus of Paramecium trichium / C. Gillies, E. D. Hanson // J. Protozool. — 1963. — V. 10. — №4.—P. 467—473.

118. Görtz, H. D. Leptomonas ciliatorum n. sp. (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) in the macronucleus of a hypotrichous ciliate / H. D. Görtz, J. Dieckmann // J. Euk. Microbiol. — 1987.—V. 34. — № 3. — 259-263.

119. Greslin, A. F. An analysis of the macronuclear actin genes of Oxytricha / A. F. Greslin, S. H. Loukin, Y. Oka, D. M. Prescott // DNA — 1988. — V. 7. — P. 529— 536.

120. Haag, J. The molecular phylogeny of trypanosomes: evidence for an early divergence of the Salivaria / J. Haag, C. O'hUigin, P. Overath // Mol. Biochem. Parasitol. — 1998,—V. 91,—№ 1,—P. 37^9.

121. Haimeur, A. Gene amplification in Leishmania tarentolae selected for resistance to sodium stibogluconate / A. Haimeur, M. Ouellette // Antimicrob Agents Chemother.1998. — V. 42. — № 7. — P. 1689—1694.

122. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. / T. A. Hall // Nucl. Acids. Symp. — 1999.1. Ser. 41, —P. 95—98.

123. Hannaert, V. Comparison and evolutionary analysis of the glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from different Kinetoplastida / V. Hannaert, F. R. Opperdoes, P. A. Michels // J. Mol. Evol. — 1998. — V. 47. — № 6. — P. 728—738.

124. Hey wood, P. Fine structure of Trypanosoma cyclops in non-cellular culture / P. Hey wood, D. Weinman, M. Lipman // J. Protozool. — 1974. — V. 21. — P. 232—238.

125. Hindle, E. What is the genus Leptomonas Kent? / E. Hindle // Parasitology. — 1912,—V. 5.—P. 128—134.

126. Hoare, C. A. Morphological and taxonomic studies on mammalian trypanosomes. X. Revision of the systematics / C. A. Hoare // J. Protozool. — 1964. — V. 11. — P. 200—207.

127. Hoare, C. A. Developmental stages of trypanosomatid flagellates: a new terminology / C. A. Hoare, F. G. Wallace // Nature. — 1966. — V. 212. — P. 1385— 1386.

128. Hollar, L. A phylogenetic view on the genus Phytomonas / L. Hollar, D. A. Maslov // Mol. Biochem. Parasitol. — 1997. — V. 89. — № 2. — P. 295—299.

129. Hollar, L. Monophyly of endosymbiont containing trypanosomatids: phylogeny versus taxonomy / L. Hollar, J. Lukes, D. A. Maslov // J. Euk. Microbiol. — 1998. — V. 45. — № 3. — P. 293—297.

130. Holwill, M. E. The motion of Strigomonas oncopelti / M. E. Holwill // J. Exp. Biol. — 1965. —V. 42. — P. 125-137.

131. Holwill, M. E. J. Micromanipulation of the flagellum of Crithidia oncopelti / M. E. J. Holwill, J. L. McGregor // J. Exp. Biol. — 1974. — V. 60. — P. 437-444.

132. Holwill, M. E. J. Control of flagellar wave movement in Crithidia oncopelti / M. E: J. Holwill, J. L. McGregor // Nature. — 1975. —V. 255. — P. 157—158.

133. Holwill, M. E. J. Effects of calcium on flagellar movement in the trypanosome Crithidia oncopelti / M. E. J. Holwill, J. L. McGregor // J. Exp. Biol. — 1976. — V. 65.1. P. 229-242.

134. Honigberg, B. M. A contribution to systematics of the non-pigmented flagellates / B. M. Honigberg // Progress in Protozoology / Eds. J. Ludvik, J. Lom, J. Vavra. — New York and London: Academic Press, 1963. — P. 68.

135. Horn, D. Codon usage suggests that translational selection has a major impact on protein expression in trypanosomatids / D. Horn // BMC Genomics. — 2008. — V. 9.2.—P. 1—11.

136. Hughes, A. L. Molecular phylogenetics of Trypanosomatidae: contrasting results from 18S rRNA and protein phylogenies / A. L. Hughes, H. Piontkivska // Kinetoplastid Biol. Dis. —2003,—V. 2, —№ 1,—P. 15.

137. Ivens, A. C. The genome of the kinetoplastid parasite, Leishmania major / A. C. Ivens, C. S. Peacock, E. A. Worthey et al. // Science. — 2005. — V. 309 (5733). — P. 436—^142.

138. Jirku, M. New species of insect trypanosomatids from Costa Rica and the proposal for a new subfamily within the Trypanosomatidae / M. Jirku., V. Y. Yurchenko, J. Lukes, D. A. Maslov // J. Euk. Microbiol. — 2012. — V. 59. — № 6. — P. 537—547.

139. Kallinikova, V. D. The kinetoplast as a cell organelle / V.D. Kallinikova // Int. Rev. Cytol. — 1981. —V. 69. —P. 105—156.

140. Keeling, P. J. Widespread and ancient distribution of a noncanonical genetic code in diplomonads / P. J. Keeling, W. F. Doolittle // Mol. Biol. Evol. — 1997. — V. 14. — P. 895—901.

141. Kent, W. S. Infusoria as parasites / W. S. Kent // Pop. Sci. Rev. N. S. — 1880a. — V. 4.—P. 293—309.

142. Kent, W. S. A manual of the Infusoria / W. S. Kent. — London, 1880b. — Pt. 1—3, —433 p.

143. Killick-Kendrick, R. Ultrastructural observations on the attachment of Leishmania in the sandfly / R. Killick-Kendrick, D. H. Molyneux, R. W. Ashford // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. — 1974b. — V. 68. — P. 269—281.

144. Kramer, J. P. Herpetomonas muscarum (Leidy) in the haemocoel of larval Musca domestica / J. P. Kramer // Entomological News. — 1961. — V. 72. — P. 165—166.

145. Kumar, S. Disparity index: a simple statistic to measure and test the homogeneity of substitution patterns between molecular sequences / S. Kumar, S. R. Gadagkar // Genetics. —2001,—V. 158,—P. 1321—1327.

146. Lafont, A. Sur la presence d'un parasite de la classe des flagellés dans le latex de Y Euphorbia pilulifera / A. Lafont // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1909. — V. 66. — P. 1011-1013.

147. Lainson, R. Evolution, classification and geographical distfibuition / R.Lainson, J. J. Shaw // The Leishmaniasis in Biology and Medicine / W. Peters, R. Killick- Kendrick (eds). — New York: Academic Press, 1987. — V. 1. — P. 1—120.

148. Laird, M. Blastocrithidia n.g. (Mastigophora: Protomonadina) for Crithidia (in part), with a subarctic record for B. gerridis (Patton) / M. Laird // Can. J. Zool. — 1959. — V. 37. — № 5. — P. 749—752.

149. Landweber, L. F. Phylogenetic analysis of RNA editing: a primitive genetic phenomenon / L. F. Landweber, W. Gilbert // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1994. — V. 91. —№ 3. —P. 918—921.

150. Lanotte, G. Fusion cellulaire chez les Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) / G. Lanotte, J.-A. Rioux // Comptes rendus de l'Académie des sciences. — 1990. — Série 3 (Sciences de la vie). — V. 310. — № 7. — P. 285—288.

151. Lee, S.Y. Transkinetoplastidy: a novel phenomenon involving bulk alterations of mitochondrial kinetoplast DNA of a trypanosomatid protozoan / S. Y. Lee, S. T. Lee, K. P. Chang // J. Protozool. — 1992. — V. 39. — № 1. — P. 190—196.

152. Léger, L. Sur la structure et le mode de multiplication des Flagellés du genre Herpetomonas Kent / L. Léger // Comp. Rend. Soc. Biol. — 1902a. — V. 54. — № 14.1. P. 398—400.

153. Léger, L. Sur la forme grégarinienne de Herpetomonas / L. Léger // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1902b. —V. 54. — № 14. — P. 400—401.

154. Léger, L. Sur un flagellé parasite de Y Anopheles maculipennis. / L. Léger II Compt. Rend. Soc. Biol. — 1902c. —V. 54. — P. 354—356.

155. Léger, L. Sur un nouveau flagellé des tabanides / L. Léger // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1904a. — V. 57. — P. 613—615.

156. Léger, L. Sur les affinités de Y Herpetomonas subulata et la phylogénie des trypanosomes. / L. Léger II Compt. Rend. Soc. Biol. — 1904b. — V. 57. — P. 615— 617.

157. Léger, L. Selenococcidium intermedium Lég. et Dub. et la systématique des sporozoaires / L. Léger, O. Dubosq II Arch. Zool. Exp. Gen. — 1910. — V. 5. — P. 187—238.

158. Leonard, G. Resolving the question of trypanosome monophyly: a comparative genomics approach using whole genome data sets with low taxon sampling / G. Leonard, D. M. Soanes, J. R. Stevens // Infect. Genet. Evol. — 2011. — V. 11. — № 5.1. P. 955—959.

159. Liang, X. H. Trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation / X. H. Liang, A. Haritan, S. Uliel, S. Michaeli // Eukaryot Cell. — 2003. — V. 2. — № 5. — P. 830—840.

160. Linder, J. C. A novel model for fluid secretion by the trypanosomatid contractile vacuole apparatus / J. C. Linder, L. A. Staehelin // J. Cell Biol. — 1979. — V. 83. — № 2,—P. 371-382.

161. Lipa, J. J. Blastocrithidia raabei sp.n., a flagellate parasite of Mesocerus marginatus L. (Hemiptera, Coreidae) / J. J. Lipa // Acta Protozool. — 1966. — V. 4. — P. 19—28.

162. Lom, J. The fine structure of the fish trypanosome, Trypanosoma danilewskyi: 1. Presence of a cytopharyngeal complex in bloodstream trypomastigotes / J. Lom, J. J. Paulin, E. Nohynkova // Protistologica. — 1980. — V. 16. — P. 365—373.

163. Lopez-Estrano, C. Exonic sequences in the 5' untranslated region of alpha-tubulin mRNA modulate trans splicing in Trypanosoma brucei / C. Lôpez-Estrano, C. Tschudi, E. Ullu // Mol. Cell Biol. — 1998. — V. 18. — № 8. — P. 4620—4628.

164. Lukes, J. Analysis of ribosomal RNA genes suggests that trypanosomes are monophyletic / J. Lukes, M. Jirkû, D. Dolezel, I. Krâl'ovâ, L. Hollar, D. A. Maslov // J. Mol. Evol. — 1997. — V. 44. — № 5. p. 521—527.

165. Lukes, J. Kinetoplast DNA network: evolution of an improbable structure / J. Lukes, D. L. Guilbride, J. Votypka, A. Zikovâ, R. Benne, P. T. Englund // Eukaryot. Cell. — 2002. — V. 1. — № 4. — P. 495—502.

166. Lwoff, M. Le pouvoir de synthèse des trypanosomides des culicides / M. Lwoff // Compt. Rend. Soc. Biol. Paris. — 1935. — V. 119. — P. 969—971.

167. Lwoff, M. Recherches sur le pouvoir de synthèse des flagellés trypanosomides: mono-graphie de l'Institut Pasteur / M. Lwoff. — Paris: Masson, 1940. — 213 pp.

168. Lwoff, M. Recherches sur la morphologie de Leptomonas oncopelti Noguchi et Tilden et Leptomonas fasciculata Novy, McNeal et Torrey / M. Lwoff, A. Lwoff // Arch. Zool. Exp. Gen. — 1931,—V. 719.—№ 1,—P. 21-37.

169. Maga, J. A. Genetic dissection of the Leishmania paraflagellar rod, a unique flagellar cytoskeleton structure / J. A. Maga, T. Sherwin, S. Francis, K. Gull, J. H. LeBowitz // J. Cell Sci. — 1999. — V. 112. — P. 2753-2763.

170. Mair, G. A new twist in trypanosome RNA metabolism: cis-splicing of pre-mRNA / G. Mair, H. Shi, H. Li, A. Djikeng, H. O. Aviles, J. R. Bishop, F. H. Falcone,

171. C. Gavrilescu, J. L. Montgomery, M. I. Santori, L. S. Stern, Z. Wang, E. Ullu, C. Tschudi//RNA. — 2000. — V. 6,—№2. —P. 163—169.

172. Marín, C. Biochemical characterization of a trypanosomatid isolated from the plant Amaranthus retroflexus / C. Marín, C. Fernández-Ramos, E. Entrala, J. M. Quesada, M. Sánchez-Moreno // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 2000. — V. 95. — № 5.1. P. 641—647.

173. Marin, C. Herpetomonas spp. isolated from tomato fruits (Lycopersicon esculentum) in southern Spain / C. Marín, S. Fabre, M. Sánchez-Moreno, M. Dollet // Exp. Parasitol. — 2007. — V. 116.— Iss. 1.—P. 88—90.

174. Martin, D. S. A light and electron microscopic study of Trypanosoma fallisi n.sp. in toads {Bufo americanus) from Algonquin Park, Ontario / D. S. Martin, S. S. Desser // J. Protozool. — 1990. — V. 37. — P. 199—206.

175. Martinez-Calvillo, S. Transcription initiation and termination on Leishmania major chromosome 3 / S. Martinez-Calvillo, D. Nguyen, K. Stuart, P. J. Myler // Eukaryot. Cell.— 2004.—V. 3.—№2, —P. 506—517.

176. Maslov, D. A. Evolution of RNA editing in kinetoplastid protozoa / D. A. Maslov, H. A. Avila, J. A. Lake, L. Simpson // Nature. — 1994. — V. 368 (6469). — P. 345—348.

177. Maslov, D.A. Evolution of Parasitism in Kinetoplastid Protozoa / D. A. Maslov, L. Simpson // Parasitology Today. — 1995. — V. 11. — № 1. — P. 30—32.

178. Maslov, D. A. Two new species of trypanosomatid parasites isolated from Heteroptera in Costa Rica / D. A. Maslov, V. Y. Yurchenko, M. Jirkû, J. Lukes // J. Euk. Microbiol. —2010, —V. 57. —№2,—P. 177—188.

179. McCulloch, I. An outline of the morphology and life history of Crithidia leptocoridis, sp. nov. /1. McCulloch // Univ. Calif. Publ. Zool. — 1915. — V. 16. — № 1,—P. 1—22.

180. McCulloch, I. Crithidia euryophthalmi, sp. nov., from the hemipteran bug, Euryophthalmus convivus Stal / I. McCulloch // Univ. Calif. Publ. Zool. — 1917. — V. 18,— №5,— P. 75—88.

181. Mehlhorn, H. Electron microscopic studies on Blastocrithidia triatomae Cerisola et al. 1971 (Trypanosomatidae) / H. Mehlhorn, G. A. Schaub, W. Peters, A. Haberkorn // Tropenmed. Parasitol. — 1979. — V. 30. — № 3. — P. 289—300.

182. Merzlyak, E.M. Monogenetic trypanosomatids: comparison of the ND8 editing gene / E. M. Merzlyak, M. Yu. Zakharova, A. A. Kolesnikov // Europ. J. Protistol. — 2001, —V. 37. — №2,—P. 233—240.

183. Mesnil, F. Sur un hématozoaire nouveau (Endotrypanum n. gen.) d'un édenté de Guyane / F. Mesnil, E. Brimont // Compt. Kend. Soc. Biol. — 1908. — V. 65. — P. 581—583.

184. Meyer, F. UGA is translated as cysteine in pheromone 3 of Euplotes octocannatus / F. Meyer, H. J. Schmidt, E. Plumper, A. Hasilik, G. Mersmann, H. E. Meyer, A. Engstrom, K. Heckmann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1991. — V. 88. — P. 3758—3761.

185. Michels, P.A. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae new data and views / P. A. Michels, V. Hannaert, F. Bringaud // Parasitol. Today. — 2000. — V. 16. — № 11. — P. 482—489.

186. Minchin, E. A. Investigations on the development of trypanosomes in tsetse flies and other Diptera / E. A. Minchin // Quart. J. Microsc. Sc. — 1908. — V. 52. — P. 159—260.

187. Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens / P. L. Mitchell // Neotropical Entomology. — 2004. — V. 33. — № 5. — P. 519—545.

188. Molyneux, D. H. The biology of Trypanosoma and Leishmania, parasites of man and domestic animals / D. H. Molyneux, R. W. Ashford. — London : Taylor, Francis, 1983,—294 p.

189. Molyneux, D. Morphology, ultrastructure and life cycles. / D. Molyneux, R. Killick-Kendrick // The leishmaniases in biology and medicine / eds: W. Peters, R. Killick-Kendrick. — London : Academic Press, 1987. —V. 1. — P. 121—176.

190. Momen, H. Some current problems in the systematics of trypanosomatids / H. Momen // Int. J. Parasitol. — 2001. — V. 31. — № 5—6. — P. 640—642.

191. Nicoli, R. M. Recherches systématiques sur les trypanosomides I. Le genre Nematodomonas n. gen. / R. M. Nicoli., A. Penaud, P. Timon-David // Bull. Soc. Zool. Fr. — 1971a. — V. 96. — № 4. — P 405—415.

192. Nicoli, R. M. Recherches systématiques sur les trypanosomides II. Le genre Malacozoomonas n. gen. / R. M. Nicoli., A. Penaud, P. Timon-David // Bull. Soc. Zool. Fr. — 1971b. — V. 96. — № 4. — P. 415—419.

193. Noguchi, H. Comparative studies of herpetomonads and leishmanias. I. Cultivation of herpetomonads from insects and plants / H. Noguchi, E. B. Tilden // J. Exp. Med. — 1926. — V. 44. — P. 307—325.

194. Novy, F. G. On the cultivation of Trypanosoma lewisi / F. G. Novy, W. J. MacNeal // Contributions to Medical Research. — Ann Arbor: George Wahr, 1903. — P. 549—577.

195. Novy, F. G. The trypanosomes of mosquitoes and other insects / F. G. Novy, W. J. MacNeal, H. N. Torrey // J. Infect. Dis. — 1907. — V. 4. — P. 223—276.

196. Overath, P. Endocytosis and secretion in trypanosomatid parasites-tumultuous traffic in a pocket / P. Overath, Y.-D. Stierhof, M. Wiese // Trends Cell Biol. — 1997.1. V. 7, —P. 27-33.

197. Page, A. M. A new species of Rhynchoidomonas Patton, 1910 (Kinetoplastida: Trypanosomatina) from Operophtera brumata (Lepidoptera: Geometridae) / A. M. Page, E. U. Canning, R. J. Barker, J. P. Nicholas // Syst. Parasitol. — 1986. — V. 8. — P. 101—105.

198. Parsons, M. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes / M. Parsons, T. Furuya, S. Pal, P. Kessler // Mol. Biochem. Parasitol. — 2001. — V. 115.1.— P. 19—28.

199. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose / M. Parsons // Mol. Microbiol. — 2004. — V. 53. — P. 717—724.

200. Patton, W. S. The life cycle of a species of Crithidia parasitic in the intestinal tract of Gerris fossarum Fabr. / W. S. Patton // Arch. Protistenk. — 1908a. — V. 12. — P. 131—146.

201. Patton, W. S. Inoculation of Dogs with the Parasite of Kala Azar {Herpetomonas Leishmanial donovani) with some Remarks on the Genus Herpetomonas / W. S. Patton //Parasitology. — 1908b. — V. 1.—P. 311—313.

202. Patton, W. S. Rhynchomonas luciliae, nov. gen., nov. spec. A new flagellate parasitic in the malpighian tubes of Lucilia serenissima Walk. / W. S. Patton // Bull. Soc. Pathol. Exot. — 1910a. — V. 3. — P. 300—303.

203. Patton, W. S. Rhynchomonas luciliae, nov. gen ; nov. spec. A new flagellate parasitic in the malpighian tubes of Lucilia serenissima Walk. (Note of correction) / W. S. Patton // Bull. Soc. Pathol. Exot. — 1910b. — V. 3. — P. 433.

204. Paulin, J. J. The chondriome of selected trypanosomatids. A three-dimensional study based on serial thick sections and high voltage electron microscopy / J. J. Paulin // J Cell Biol. — 1975. — V. 66. — № 2. — P. 404^13.

205. Peacock, C. S. Comparative genomic analysis of three Leishmania species that cause diverse human disease. / C. S. Peacock, K. Seeger, D. Harris, et al. // Nat Genet. — 2007. — V. 39. — № 7. — P. 839—847.

206. Peng, P. L.-M. The Cultivation of Blastocrithidia triatomae Cerisola et al., 1971 / P. L.-M. Peng, F. G. Wallace//J. Euk. Microbiol. — 1981. —V. 28. — P. 116-118.

207. Peng, P. L.-M. The cysts of Blastocrithidia triatomae Cerisola et al., 1971 / P. L.-M. Peng, F. G. Wallace // J. Protozool. — 1982. — V. 29. — P. 464^167.

208. Pimenta, P. F. Stage-specific adhesion of Leishmania promastigotes to the sandfly midgut / P. F. Pimenta, S. J. Turco, M. J. McConville, P. G. Lawyer, P.V. Perkins, D. L. Sacks // Science. — 1992. — V. 256 (5065). — P. 1812—1815.

209. Podlipaev, S.A. Leptomonas rigidus sp. n. (Trypanosomatidae) a parasite of Saida littoralis L. (Hemiptera: Heteroptera) / S. A. Podlipaev, M. N. Malysheva, A. A. Kolesnikov // Acta Protozool. — 1991. —V. 30. — P. 121—127.

210. Poinar, G. Jr. Early Cretaceous trypanosomatids associated with fossil sand fly larvae in Burmese amber / G. Jr. Poinar // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 2007. — V. 102. — № 5. — P. 635—637.

211. Poinar, G. Jr. Evidence of Vector-Borne Disease of Early Cretaceous Reptiles / G. Jr. Poinar, R. Poinar // Vector-Borne and Zoonotic Diseases. — 2004a. — V. 4. — №4.—P. 281—284.

212. Poinar, G. Jr. Paleoleishmania proterus n. gen., n. sp., (Trypanosomatidae: Kinetoplastida) from Cretaceous Burmese amber / G. Jr. Poinar, R. Poinar // Protist. — 2004b.—V. 155,—№3. p. 305—310.

213. Poinar, G. Jr. Fossil evidence of insect pathogens / G. Jr. Poinar, R. Poinar // J. Invertebr. Pathol. — 2005. — V. 89. — № 3. — P. 243—250.

214. Poisson, R. Leptomonas naucoridis n.sp. parasite intestinal de Naucoris maculates Fabr. / R. Poisson // Ann. Parasitol. — 1925a. — V. 3. — № 1. — P. 28—34.

215. Poisson, R. Un nouvel Herpetomonas coelomique, Herpetomonas mercieri n.sp., parasite de la cavité generale des larves de Simulium L. / R. Poisson // Arch. Zool. Experiment. Gener. — 1925b. — V. 64. —№ 1. — P. 57—62.

216. Porter, A. The life-cycle of Herpetomonas jaculum (Léger) parasitic in the alimentary tract of Nepa cinerea / A. Porter // Parasitology. — 1912. — V. 2. — № 3.1. P. 367—391.

217. Posada, D. jModelTest: phylogenetic model averaging / D. Posada // Mol. Biol. Evol. — 2008. — V. 25. — P. 1253—1256.

218. Preston, M. The form and function of the cytostome-cytopharynx of the culture forms of the elasmobranch haemoflagellate Trypanosoma raie Laveran et Mesnil / M. Preston//J. Protozool. — 1969. —V. 16. — P. 320—333.

219. Prowazek, S. Die Entwicklung von Herpetomonas / S. Prowazek // Arbeiten aus dem Kaiserlichen Gesundheitsamte. — 1904. — V. 20. — P. 440—452.

220. Pullen, T. J. Protein targeting of an unusual, evolutionary conserved adenylate kinase to a eukaryotic flagellum / T. J. Pullen, M. L. Ginger, S. J. Gaskell, K. Gull // Mol. Biol. Cell. — 2004. — V. 15: — P. 3257-3265.

221. Ridgley, E. Calmodulin-binding properties of the paraflagellar rod complex from Trypanosoma brucei / E. Ridgley, P. Webster, C. Patton, L. Ruben // Mol. Biochem. Parasitol. — 2000. — V. 109.—P. 195-201.

222. Riera, C. Congenital transmission of Trypanosoma cruzi in Europe (Spain): a case report / C. Riera, A. Guarro, H. E Kassab, J. M. Jorba, M. Castro, R. Angrill, M. Gâllego, R. Fisa, C. Martin, A. Lobato, M. Portüs // Am. J. Trop. Med. Hyg. — 2006.

223. V. 75. — № 6. — P. 1078—1081.261. de Rijk, P. RnaViz2: an improved representation of RNA secondary structure / P. de Rijk, J. Wuyts, R. de Wächter // Bioinformatics. — 2003. — V. 19. — № 2. — P. 299—300.

224. Riou, G. F. Characterization of the molecular components in kinetoplast-mitochondrial DNA of Trypanosoma equiperdum. Comparative study of thedyskinetoplastic and wild strains / G. F. Riou, J. M. Saucier // J. Cell. Biol. — 1979. — V. 82. —248-263.

225. Riou, G. Absence of kinetoplast DNA in a late antigenic variant of Trypanosoma equiperdum / G. Riou, T. Baltz, M. Gabillot, R. Pautrizel, // Mol. Biochem. Parasitol. — 1980.—V. 1,—P. 97-105.

226. Rodhain, J. Notes sur des formes Leptomonas constituant une culture d'une trypanosome dans l'intestin de Pangonia / J. Rodhain, J. Bequaert, C. Pons, F. Vandenbranden // Bull. Soc. Path. Exot. — 1911. — V. 4. — P. 528—531.

227. Rogers, W. E. Two new subspecies of Herpetomonas muscarum (Leidy, 1856) Kent, 1880 / W. E. Rogers, F. G. Wallace // J. Euk. Microbiol. — 1971. — V. 18. — P. 645-649.

228. Rohloff, P. Acidocalcisomes and the contractile vacuole complex are involved in osmoregulation in Trypanosoma cruzi / P. Rohloff, A. Montalvetti, R. Docampo // J. Biol. Chem. — 2004. — V. 279. — V. 50. — P. 52270—52281.

229. Ronquist, F. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models / F. Ronquist, J. P. Huelsenbeck // Bioinformatics. — 2003. — V. 19. — P. 1572— 1574.

230. Rosypal, A. C. Transplacental transmission of a North American isolate of Leishmania infantum in an experimentally infected beagle / A. C. Rosypal, G. C. Troy, A. M. Zajac, G. Frank, D. S. Lindsay // J. Parasitol. — 2005. — V. 91. — № 4. — P. 970—972.

231. Rosypal, A.C. Non-sand fly transmission of a North American isolate of Leishmania infantum in experimentally infected BALB/c mice / A. C. Rosypal, D. S. Lindsay // J. Parasitol. — 2005. — V. 91. — № 5. — P. 1113—1115.

232. Sacks, D. L. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis / D. L. Sacks, S. Kamhawi // Annu. Rev. Microbiol. — 2001. — V. 55. — P. 453-483.

233. Sandon, H. The composition and distribution of the protozoan fauna of the soil / H. Sandon. — Edinburgh : Oliver and Boyd, 1927. — 237 p.

234. Schaub, G. A. Membrane feeding for infection of the reduviid bug Triatoma infestans with Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) and pathogenic effects of the flagellate / G. A. Schaub // Parasitol Res. — 1990. — V. 76. — № 4. — P. 306— 310.

235. Schaub, G. A. Ultrastructural studies on the excystment of Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) / G. A. Schaub, T. M. Pretsch // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. — 1981. —V. 75,—P. 168—171.

236. Schenkman, S. A novel cell surface trans-sialidase of Trypanosoma cruzi generates a stage-specific epitope required for invasion of mammalian cells / S. Schenkman, M.-S. Jiang, G. W. Hart, V. Nussenzweig // Cell. — 1991. — V. 65. — P. 1117—1125.

237. Schnaufer, A. Natural and induced dyskinetoplastic trypanosomatids: how to live without mitochondrial DNA / A. Schnaufer, G. J. Domingo, K. Stuart // Int. J. Parasitol. — 2002. — V. 32. — Iss. 9. — P. 1071-1084.

238. Senn, G. Der gegenwartige Stand unserer Kenntnisse von den flagellaten Blutparasiten / G. Senn // Arch. Protistenk. — 1902. — V. 1. — P. 344—354.

239. Shaw, J. J. The haemoflagellates of sloths / J. J. Shaw // London School of Hygiene and Tropical Medicine Memoir. — London : H.K. Lewis and Co. Ltd., 1969.13 — 132 p.

240. Silver, L. E. Organized packaging of kinetoplast DNA networks / L. E. Silver, A. F. Torri, S. L. Hajduk // Cell. — 1986. — V. 47 — P. 537-543.

241. Simpson, L. A base called J / L. Simpson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998.

242. V. 95. — № 5. — P. 2037—2038.

243. Simpson, L. RNA editing and the mitochondrial cryptogenes of kinetoplastid protozoa / L. Simpson, J. Shaw // Cell. — 1989. — V. 57. № 3. P. 355—366.

244. Simpson, L. Evolution of RNA editing in trypanosome mitochondria / L. Simpson, O. H. Thiemann, N. J. Savill, J. D. Alfonzo., D. A. Maslov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2000. — V. 97. — № 13. — P. 6986—6993.

245. Simpson, A. G. The evolutionary history of kinetoplastids and their kinetoplasts / A. G. Simpson, J. Lukes, A. J. Roger // Mol. Biol. Evol. — 2002. — V. 19. — № 12. — P. 2071—2083.

246. Simpson, A. G. Protein phylogenies robustly resolve the deep-level relationships within Euglenozoa / A. G. Simpson, A. J. Roger // Mol. Phylogenet. Evol. — 2004. — V. 30. — № 1,—P. 201—212.

247. Souto-Padron, T. The surface charge of trypanosomatids / T. Souto-Padron // An. Acad. Bras. Cienc. — 2002. — V. 74. — № 4. — P. 649-675.

248. Souto-Padron, T. Cysteine proteinase in Trypanosoma cruzi: immunocytochemical localization and involvement in parasite-host cell invasion / T. Souto-Padron, O. E. Campetella, J. J. Cazzulo, W. de Souza // J. Cell Sci. — 1990. — V. 96.—P. 485—490.

249. Stamatakis, A. RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses with thousands of taxa and mixed models / A. Stamatakis // Bioinformatics. — 2006. — V. 22. — Iss. 21. — P. 2688—2690.

250. Steinert, M. The existence of a cytostome and the occurrence of pinocytosisin the trypanosome, Trypanosoma mega / M. Steinert, A. Novikoff // J. Biophys. Biochem. Cytol. — 1960. — V. 8. — P. 563—569.

251. Stevens, J. R. The ancient and divergent origins of the human pathogenic trypanosomes, Trypanosoma brucei and T. cruzi / J. R. Stevens, H. A. Noyes, G. A. Dover, W. C. Gibson // Parasitology. — 1999. — V. 118. — Pt. 1. — P. 107—116.

252. Stiles, J. K. Genomic organization, transcription, splicing and gene regulation in Leishmania / J. K. Stiles, P. I. Hicock, P. H. Shah, J. C. Meade // Ann. Trop. Med. Parasitol. — 1999. —V. 93. — № 8. — P. 781—807.

253. Stothard, J. Genetic diversity and genetic exchange in Trypanosoma cruzi: dual drug-resistant "progeny" from episomal transformants / J. Stothard, I. Frame, M. Miles // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. — 1999. —V. 94. — Suppl. 1. — P. 189—193.

254. Sugrue, P. Flagellar wave reversal in the kinetoplastid flagellate Crithidia oncopelti / P. Sugrue, M. R. Hirons, J. U. Adam, M. E. Holwill // Biol. Cell. — 1988. — V. 63. —Iss. 2.—P. 127-131.

255. Swindle, J. Trypanosomatid genetics / J. Swindle, A. Tait // Molecular biology of parasitic protozoa. — Oxford : Oxford University Press, 1996. — P. 6-34.

256. Tait, A. Genetic exchange in Trypanosoma brucei / A. Tait, C. M. Turner // Parasitol Today. — 1990. — V. 6. — № 3. — P. 70-75.

257. Takata, C. S. A. Encystment and excystment of a trypanosomatid of the genus Leptomonas / C. S. A Takata, E. P. Camargo, R. V. Milder // Eur. J. Protistol. — 1996.1. V. 32. — № 1. — p. 90—95.

258. Teixeira, M. M. G. Trypanosomatidae: a spliced-leader-derived probe specific for the genus Phytomonas / M. M. G. Teixeira, M. G. Serrano, L. R. Nunes, M. Campaner, G. A. Buck, E. P. Camargo // Exp. Parasitol. — 1996. — V. 84. — № 3. — P. 311— 319.

259. Teixeira, M. M. New data from old trypanosomatid preparations / M. M. Teixeira, M. G. Serrano, E. P. Camargo // Parasitol. Today. — 2000. — V. 16. — № 6.1. P. 261—263.

260. Tetley, L. Differentiation in Trypanosoma brucei: host-parasite cell junctions and their persistence during acquisition of the variable antigen coat / L. Tetley, K. Vickerman // J. Cell Sci. — 1985. — V. 74. — P. 1-19.

261. Tibayrenc, M. A clonal theory of parasitic protozoa: the population structure of Entamoeba, Giardia, Leishmania, Naegleria, Plasmodium, Trichomonas and

262. Trypanosoma, and its medical and taxonomical consequences / M. Tibayrenc, F. Kjellberg, F. J. Ayala // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1990. — V. 87. — № 7. — P. 2414-2418.

263. Tibayrenc, M. The clonal theory of parasitic protozoa: 12 years on / M. Tibayrenc, F. J. Ayala // Trends in Parasitology. — 2002. — V. 18. — Iss. 9. — P. 405—410.

264. Tieszen, K. L. Ultrastructure of cyst formation in Blastocrithidia familiaris in Lygaeus pandurus (Hemiptera: Lygaeidae) / K. L. Tieszen., D. H. Molyneux., S. K. Abdel-Hafez // Z. Parasitenk. — 1985. —V. 71. — P. 179—188.

265. Tieszen, K. L. Host-parasite relationships and cysts of Leptomonas lygaei (Trypanosomatidae) in Lygaeus pandurus (Hemiptera: Lygaeidae) / K. L. Tieszen., D. H. Molyneux., S. K. Abdel-Hafez // Parasitology. — 1989. — V. 98. — P. 395—400.

266. Turner, C. M. R. Trypanosoma brucei inheritance of kinetoplast DNA maxicircles in a genetic cross and their segregation during vegetative growth / C. M. R. Turner, G. Hide, N. Buchanan, A. Tait // Exp. Parasitol. — 1995. — V. 80. — P. 234— 241.

267. Uribe, C. Crithidia ortheae n. sp. from reduviids of the genus Orthea / C. Uribe // J. Parasitol. — 1926. —V. 12. — P. 199—202.

268. Vandamme, P. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics / P. Vandamme, B. Pot, M. Gillis, P. de Vos, K. Kersters, J. Swings // Microbiol. Rev. — 1996. —V. 60. — P. 407^38.

269. Vickerman, K. Polymorphism and mitochondrial activity in sleeping sickness trypanosomes / K. Vickerman // Nature. — 1965. — V. 208 (5012). — P. 762—766.

270. Vickerman, K. The diversity of the kinetoplastid flagellates / K. Vickerman // Biology of the Kinetoplastida / edited by W. H. R. Lumsden, D. A. Evans. — London, New York, San Francisco: Academic Press, 1976. — V. 1. — P. 1—34.

271. Vickerman, K. DNA throughout the single mitochondrion of a kinetoplastid flagellate: observations on the ultrastructure of of Cryptobia vaginalis (Hesse, 1910) / K. Vickerman // J. Protozool. — 1977. —V. 24. — P. 221—233.

272. Vickerman, K. The evolutionary expansion of the trypanosomatid flagellates / K. Vickerman // Int. J. Parasitol. — 1994. —V. 24. — № 8. — P. 1317—1331.

273. Vickerman, K. Comparative cell biology of the kinetoplastid flagellates / K. Vickerman, T. M. Preston // Biology of Kinetoplastida. — London : Academic press, 1976.—V. 1,—P. 35—130.

274. Victoir, K. How to succeed in parasitic life without sex? Asking Leishmania / K. Victoir, J. C. Dujardin // Trends Parasitol. — 2002. — V. 18. — № 2. — P. 81—85.

275. Vivanti, A. Sulla Crithidia inflata n. sp. parassita nel tubo digerente del Hydrotrechus najas. Struttura e ciclo de sviluppo / A. Vivanti // Atti. acad. naz. Lincei Rend. Classe sci. fis. mat. e nat. — Series 5. — 1917. — V. 26. — P. 132—140.

276. Votypka, J. Cosmopolitan distribution of a trypanosomatid Leptomonas pyrrhocoris / J. Votypka, H. Klepetkovâ, V. Y. Yurchenko, A. Horâk., J. Lukes, D. A. Maslov//Protist. —2012,—V. 163,—№4,—P. 616—631.

277. Wallace, F. G. Flagellate parasites of mosquitoes with special reference to Crithidia fasciculata Léger, 1902 / F. G. Wallace // J. Parasitol. — 1943. — V. 29. — №3.—P. 196—205.

278. Wallace, F. G. The trypanosomatid parasites of insects and arachnids / F. G. Wallace//Exp. Parasitol. — 1966. —V. 18. — № 1. — P. 124—193.

279. Wallace, F. G. Two new species of flagellates cultivated from insects of the genus Gerris / F. G. Wallace, T. B. Clark, M. I. Dyer, T. Collins // J. Euk. Microbiol. — 1960. — V. 7. — Iss. 4. — P. 390-392.

280. Wallace, F. G. Flagellate Parasites of Water Striders with a Description of Leptomonas costoris, n. sp. / F. G. Wallace, S. R. Todd, W. Rogers, // J. Euk. Microbiol. — 1965. — V. 12. — Iss. 3. — P. 390-393.

281. Wallace, F. G. Guidelines for the description of new species of lower trypanosomatids / F. G. Wallace, E.P. Camargo, R. B. McGhee, I. Roitman // J. Protozool. — 1983. — V. 30. — P. 308—313.

282. Webster, P. The flagellar pocket of trypanosomatids / P. Webster, D. G. Russell // Parasitology Today. — 1993. — V. 9. — Iss. 6. — P. 201-206.

283. Wenyon, C. M. Protozoology / C. M. Wenyon. London : Bailliere, Tindall and Cox, 1926,—V. 1.

284. Wilson, K. Amplification of the inosinate dehydrogenase gene in Trypanosoma brucei gambiense due to an increase in chromosome copy number / K. Wilson, R. L. Berens, C. D. Sifri, B. Ullman // J. Biol. Chem. — 1994. — V. 269. — № 46. — P. 28979—28987.

285. Woodcock, H. M. The haemoflagellates: a review of present knowledge relating to the trypanosomes and allied forms / H. M. Woodcock // Quart.J. Microsc. Sc. — 1906.—V. 50.—P. 151—231.

286. Woodcock, H. M. Observations on coprozoic flagellates / H. M. Woodcock // Phil Trans Roy Soc B. — 1916. — V. 207. — P. 375-412.

287. Wuyts, J. The European database on small subunit ribosomal RNA / J. Wuyts, Y. Van de Peer, T. Winkelmans, R. De Wachter // Nucleic Acids Res. — 2002. — V. 30. — № 1, —P. 183—185.

288. Yurchenko, V. Y. Morphological discordance of the new trypanosomatid species phylogenetically associated with the genus Crithidia / V. Y. Yurchenko., J. Lukes., M. Tesarovâ et al. // Protist. — 2008. — V. 159. — № 1. — P. 99—114.

289. Zotta, G. Sur la culture en milieu N. N. N. du Leptomonas pyrrhocoris / G. Zotta // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1912a. — V. 84. — P. 822—824.

290. Zotta, G. Sur un flagellé du type Herpetomonas chez Pyrrhocoris apterus (Note préliminaire) / G. Zotta // Ann. Scient. Univ. Jassy. — 1912b. — V. 7. — P. 211—223.

291. Zotta, G. Sur la transmission experimental du Leptomonas pyrrhocoris Z. chez des insectes divers / G. Zotta // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1921. — V. 85. — P. 285— 287.

292. Zotta, G. Emploi de la substance cérébrale comme milieu de culture pour le Leptomonas pyrrhocoris / G. Zotta // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1923a. — V. 88. — №4.—P. 281—283.

293. Zotta, G. Culture du Leptomonas pyrrhocoris en milieux d'organes stérilisés / G. Zotta // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1923b. — V. 88. — № 4. — P. 283—285.

294. Zotta, G. L'action favorisante de la "catalase" du foie de veau sur le développement du Leptomonas pyrrhocoris en culture / G. Zotta // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1923c.—V. 88,—P. 1351—1352.

295. Zotta, G. A propos de l'action favorisante du sang sur le développement du Leptomonas pyrrhocoris dans le bouillon glucose / G. Zotta // Compt. Rend. Soc. Biol. — 1923d. — V. 88,—P. 913—915.

296. Zwickl, D. J. Increased taxon sampling greatly reduces phylogenetic error. / D. J. Zwickl, D. M. Hillis // Syst Biol. — 2002. — V. 51. — № 4. — P. 588—598.200

Информация о работе

Костыгов, Алексей Юрьевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.11

Диссертация

Противоречия морфологического и молекулярно-филогенетического подходов в систематике трипаносоматид - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы