Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Жизненный цикл и морфология стадий развития жгутиконосцев Proteomonas brevicula

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Жизненный цикл и морфология стадий развития жгутиконосцев Proteomonas brevicula"

ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ОД

МАЛЫШЕВА Марина Николаевна

ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ И МОРФОЛОГИЯ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ЖГУТИКОНОСЦЕВ РРЮТЕОМОЫАЗ ВЯЕМОЛА (КШЕТОРЦОТЮА, ТВУРАМОБОМАТЮАЕ)

03.00.19 - паразитология, гельминтология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в Зоологическом институте РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат биологических наук А.О. Фролов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор K.M. Суханова

кандидат биологических наук, доцент А.А.Добровольский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт цитологии РАН

заседании диссертационного совета Д 002.63.02 по защите диссертаций на соискание степени доктора наук при Зоологическом институте РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 1 (факс: +812 114 04 44)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Зоологического института РАН

Автореферат разослан "J " апреля 1998г.

Защита состоится

1998 г. в 14 часов на

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

^Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Семейство Trypanosomatidae объединяет паразитических жгутиконосцев, многие из которых имеют большое практическое значение, являясь возбудителями опасных заболеваний человека, животных и растений. По данным ВОЗ ежегодно на Земном шаре от вызываемых трипаносоматидами заболеваний страдает более четверти миллиарда человек. Не удивительно поэтому, что на протяжении многих лет наибольшее внимание исследователей было уделено практически важным жгутиконосцам - трипа-носомам и лейшманиям. Гомоксенным трипаносоматидам - паразитам насекомых незаслуженно отводилось второстепенное место.

В последние годы ситуация в корне изменилась: гомоксенные жгутиконосцы привлекают к себе все большее внимание исследователей. Многие гомоксенные жгутиконосцы легко выделяются в культуру и успешно культивируются на искусственных питательных средах, что делает их удобным модельным объектом для решения многих вопросов, в том числе, имеющих практический выход, например, изучение действия ца трипаносоматид химиотерапевтических препаратов (Gottlieb et al., 1972). На протяжении ряда лет ведется работа по созданию банка культур гомоксенных трипаносоматид в лаборатории протозоологии ЗИН РАН. Использование лабораторных культур трипаносоматид позволило показать у них наличие генетических обменов (Белова 1985, 1986; Крылов и др. 1985, и др.), изучить жизненные циклы ряда видов гомоксенных жгутиконосцев (Фролов, 1987а, б и др.), а также внести существенный вклад в разработку систематики этой группы (Подпипаев и др., 1990; Kolesnikov et al., 1990). В последние годы полностью изменились представления о филогении трипаносоматид (Фролов, 1993; Vickerman, 1994). Это стало возможным, в том числе, благодаря всестороннему изучению гомоксенных трипаносоматид.

В 1990 году был описан новый род гомоксенных трипаносоматид - Proteo-monas Podlipaev, Frolov et Kolesnikov, 1990. На протяжении многих десятилетий система семейства Trypanosomatidae существенно не менялась и описание нового рода трипаносоматид - событие, в известной степени, знаменательное. Все исследования жгутиконосцев нового рода Proteomonas, втом.числе и описание рода, были выполнены на лабораторных культурах. Жизненный ци*п этих трипаносоматид не был изучен. Это определило цель и задачи настоящей работы.

Цель и задачи исследования

Цель данного исследования заключалась в экспериментальном изучении жизненного цикла жгутиконосцев Proteomonas brevicula.

В задачи исследования входило:

• Исследовать зараженность четырех видов хищных клопов сем. Nabidae го-моксенными трипаносоматидами в природе.

• Получить культуру жгутиконосцев Р. brevicula.

» В световом и электронном микроскопах исследовать морфологию стадий развития жгутиконосцев Р. brevicula в культуре и в хозяине.

• Экспериментальными методами расшифровать жизненный цикл Р. brevicufá.

Научная новизна

Описан новый для науки вид гомоксенных трипаносоматид. Впервые экспериментальными методами изучен жизненный цикл жгутиконосцев Proteomonas brevicula - одного из представителей нового рода гомоксенных трипаносоматид. С использованием светового и электронного микроскопов изучена морфология стадий развития жгутиконосцев Р. brevicula в культуре и кишечнике хозяина. Описан новый для гомоксенных трипаносоматид тип расселительных стадий - эндомастиготы.

Научно-практическое значение

Полученные в настоящей работе данные по жизненному циклу и ультраструктуре жгутиконосцев Proteomonas brevicula представляют интерес с точки зрения сравнительной морфологии и эволюции кинетопластид и подтверждают обоснованность выделения нового рода гомоксенных трипаносоматид паразитов кишечного тракта насекомых.

Результаты исследования могут быть использованы в курсах по зоологии, паразитологии и протистологии для студентов биологических специальностей в высших учебных заведениях.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены и доложены на втором Всесоюзном симпозиуме протозоологов «Экология морских и пресноводных простейших» (1989 г., Борок), на пятом делегатском съезде Всесоюзного общества протозоологов (1992 г., Витебск), на отчетных сессиях ЗИН РАН по итогам работ за 1996, 1997 г.г.

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав: обзор литературы, материал и методика, результаты, обсуждение, выводов и списка литературы. Работа изложена на 140 машинописных страницах и иллюстрирована 40 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 208 наименований (из них 157 на иностранных языках).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объектом данного исследования стала выделенная нами культура гомоксен-ных жгутиконосцев Proleomonas brevicula - паразитов кишечного тракта хищных клопов семейства Nabidae. На зараженность гомоксенными трипаносоматидами в природе были исследованы четыре вида клопов-набид: Nabis brevis Scholtz., Nabis ericetorum Scholtz., Nabicula limbata Dhlb. и Nabicula flavomarginata Scholtz.. Сбор насекомых проводили в периоды с 1986 по 1988 гг. и с 1993 по 1995 гг. (в Ленинградской и Псковской областях). В работе был также использован коллекционный материал: препараты го-моксенных трипаносоматид, паразитирующих в клопах семейства Nabidae, хранящиеся в лаборатории протозоологии ЗИН РАН (сборы 1983-1985 гг.).

Методика вскрытия насекомых. Насекомых вскрывали на предметном стекле в капле раствора стерильной питательной среды КГДЭ под бинокулярным микроскопом МБС-1 при увеличении х1б. Отпрепарированный кишечник клопа при помощи препаровальных игл разделяли на отделы: пищевод, средняя кишка, ректум, каждый из которых микроскопировали. Отдельно препарировали слюнные железы, мальпигиевы сосуды. В случае обнаружения жгутиконосцев, со всех участков кишечника хозяина приготавливались мазки. Мазки фиксировали 30 минут 96% этанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза (30 мин.) в 10% растворе основной смеси, приготовленной также на 96% этаноле (pH буфера 6.8).

Методика культивирования жгутиконосцев. Жгутиконосцев культивировали в стеклянных пробирках на искусственной питательной среде КГДЭ, содержащей гемин (25 мкг/мл). Культивирование осуществлялось в термостате при t=25° С с пересевами один раз в семь дней или в холодильнике при t=5° С с пересевами один раз в месяц, при таком режиме культивирования пробирка с жгутиконосцами на трое суток помещается в термостат при t=25° С, а затем в холодильник.

Клонирование жгутиконосцев Proteomonas brevicula на плотной агаризован-ной среде КГДЭ проводили по разработанной для гомоксенных трипаносоматид методике (Хаецкий, 1982).

Методы исследования жгутиконосцев в просвечивающем и сканирующем электронных микроскопах. Осажденных центрифугированием из культуры жгутиконосцев или кусочки кишечников клопов фиксировали 1.5%-ным глутаральдегидом в 0.1 M какодилатном буфере (1 час, 0' С), затем их промывали в трех сменах 0.1 M какодилат-ного буфера, содержащего 5% сахарозы и постфиксировали 2%-ным 0s04 (1 час, 0° С).

После этого для просвечивающей электронной микроскопии материал обезвоживали в спиртах возрастающей крепости (30%, 50%, 70%, 80% и 96%) и трех сменах пропипеноксида и заключали в смесь Аралдита с Эпоном. Полимеризацию проводили в течение двух суток при 60° С. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III, окрашивали водным раствором уранилацетата (1 час) и цитратом свинца (5 мин) и изучали в электронных микроскопах JEM-100 S и JEM-100 СХ.

Для сканирующей электронной микроскопии материал обезвоживали в серии спиртов возрастающей крепости и трех сменах ацетона, после чего проводили через критическую точку, напыляли слоем платины на установке Eiko-5 и изучали в микроскопе Hitachi S-570 SEM.

Методы исследования жгутиконосцев в световом микроскопе. Все рисунки в работе выполнены с рисовальным аппаратом РА-6, на микроскопе Jenaval фирмы Cgrl Zeiss Jena. Микрофотографии получены на микроскопе Jenaval, на пленке отечественного производства чувствительностью 32 ЕД. Измерение жгутиконосцев проводилось при помощи винтового окуляр-микрометра с ценой деления 0.1 мкм. Статистическая обработка выполнена на выборках п=27. Сравнение средних значений признаков проводилось по критерию Стьюдента при уровне значимости Р<0,01 (Лакин, 1980).

№

в

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ Зараженность клопов сем. Nabidae гомоксенными трипаносоматидами в природе. Показано, что наиболее часто у исследованных видов набид встречаются жгутиконосцы рода Proteomanas и Leptomonas nabicula.. Обнаружены также неспецифические трипаносоматиды, попадающие в кишечный тракт клопов-набид при поедании зараженных насекомых. Обычны случаи смешанной инвазии.

У видов зимующих в имагинальном состоянии зараженные гомоксенными трипаносоматидами взрослые осо(5и встречаются с момента выхода с зимовки вплоть до октября месяца (времени ухода на зимовку). Процент заражения у перезимовавших особей Nabis brevis - 10-20%. Экстенсивность инвазии к концу июля - началу августа постепенно нарастает, достигая уровня 5093% и остается неизменной до конца лета. В сентябре наблюдается некоторое снижение экстенсивности заражения до 22-66%. У Nabicula flavomarginata и Nabicula limbata, взрослые особи которых появляются в июле, также происходит нарастание инвазии к концу лета. Появившиеся из яиц личинки у всех исследованных видов не заражены трипаносоматидами. Заражение выявлено только у нимф последних возрастов. Различия в зараженности самцов и самок не обнаружены.

Жгутиконосцы рода Proteomonas были обнаружены у трех из четырех исследованных видов набид (за исключением Nabis ericetorum). У Nabis brevis, зимующегц в имагинальном состоянии, заражено до 20% вышедших с зимовки особей. Заражение выявлено только у взрослых особей и нимф последних возрастов. Экстенсивность инвазии нарастает и достигает максимума к концу июля - началу августа.

Культивирование жгутиконосцев Proteomonas brevicula. Культура жгутиконосцев Proteomonas brevicula, обозначенная нами NBr, была выделена из кишечника зимующей особи хищного клопа Nabis brevis Scholtz (Hemiptera, Nabidae). На окрашенном по Романовскому-Гимза мазке, выполненном с кишечника насекомого было обнаружено три хорошо морфологически различающихся типа клеток: промастиготы, мелкие овальные эндомастиготы с петлеобразно огибающим ядро жгутиком (тип () и крупные округлые эндомастиготы с коротким жгутиком и крупной вакуолью, расположенной рядом со жгутиковым карманом (тип II) (рис. 1 ). В культуре были обнаружены все три типа клеток.

Культура жгутиконосцев P. brevicula, очищенная от дрожжеподобных грибков, ведется на жидкой питательной среде КГДЭ с добавлением гемина. В результате клонирования исходной культуры P. brevicula на плотной среде КГДЭ было выявлено два типа правильных полусферических колоний: мелкие и крупные с диаметром колонии -

1

Рис. 1. Формы жгутиконосцев, обнаруженные кишечнике зимовапшего клопа Nabis brevis. 1 -промастиготы, 2 - мелкие эндомастиготы, 3 - крупные эндомастиготы

0.56±0.02 (0.32-0.95) мм и 1.89±0.00 (0.24-2.77) мм соответственно. Исследование жгутиконосцев в колониях показало, что они хорошо различаются по клеточному составу. Мелкие колонии образованы промастиготами, а крупные - эндомастиготами II типа.

При переводе клонов с плотной питательной среды на жидкую (по 50 клонов каждого типа) было обнаружено, что жгутиконосцы из мелких колоний представлены на жидкой среде промастиготами и эндомастиготами I типа, а из крупных колоний эндомастиготами II типа и промастиготами.

В результате десятикратного клонирования пяти клонов каждого типа с проверкой не менее 100 субклонов в каждом эксперименте изменения в клеточном составе колоний не были выявлены.

В результате клонирования исходной культуры Рго(еотопаэ Ьгем'си/а на плотной питательной среде было выделено два штамма жгутиконосцев, обозначенных как ЫВгА и ЫВгВ (производные крупных и мелких колоний, соответственно).

Сравнение двух штаммов жгутиконосцев Р. Ьгеу/си/з. Все сравнения двух штаммов жгутиконосцев Р. Ьгеу/си/а выполнены при культивировании на жидкой питательной среде.

Показано, что морфометрические показатели эндомастигот 1-го и 11-го типов достоверно различаются между собой по пяти из шести сравниваемых признаков. Различий в морфологии и морфометрических показателях промастигот из штаммов ШгА и ЫВгВ не обнаружено.

Сравнение кривых роста обоих штаммов также демонстрирует четкие различия между ними (рис. 2). У штамма ЫВгА максимум численности клеток в культуре достигается на 4-е сутки и составляет 4x107 клеток/мл, жгутиконосцы штамма ЫВгВ достигают максимума численности на 6-е сутки с показателем численности - 1.2х108 клеток/мл.

В штамме ЫВгВ соотношение промастигот и эндомастигот колеблется в зависимости от возраста культуры (рис. 3). При этом максимум численности эндомастигот приходится на 24-48 часов после пересева (до 70%), затем их численность постепенно снижается. В штамме ЫВгА независимо от возраста культуры абсолютное большинство клеток представлено эндомастиготами, промастиготы встречаются крайне редко (1-5 клеток на мазок).

Показано, что эндома-стиготы штамма ЫВгВ способны переносить высушивание. Максимальное время сохранения жизнеспособности мелких эндомастигот в эксперименте составило 11 суток. Крупные эндомастиготы штамма ШгА и промастиготы обоих штаммов погибали сразу после высушивания мазка.

Цикл развития жгутиконосцев Рго1вотопа$ Ьгву1си1а в лабораторной культуре. Как было показано выше, соотношение про- и эндомастигот в штамме ШгВ на разных этапах развития культуры закономерно изменяется. Это позволило выдви -

Рис. 2. Кривые роста штаммов №гВ и Ь'ВгЛ па жидкой среде КГДЭ. По оси ординат -концентрация клеток (107), на осп абсцисс -время культивирования (ч).

нуть предположение о возможном чередовании морфологических форм и цикличности развития жгутиконосцев в культуре. Для доказательства данной гипотезы были проведены два параллельных эксперимента (оба с тремя повторами, давшими идентичные результаты).

Первый эксперимент заключался в наблюдении за отдельной особью Рго1еотопа8 Ьлемси/а. Наблюдения показали, что процесс деления у этих жгутиконосцев связан с закономерными и последовательными изменениями их морфологии. Были отмечены следующие состояния жгутиконосцев: 1) подвижная промастигота с длинным свободным жгутом; 2) подвижная форма с двумя укороченными свободными жгутами, находящаяся в состоянии деления; 3) образовавшиеся в результате деления две малоподвижные или неподвижные мелкие клетки, способные выпускать наружу и втягивать внутрь клетки свободную часть жгута, - эндомастиготы 1-го типа; 4) формы, переходные от эндо- к про-мастиготам и 5) две подвижные промастиготы. Весь цикл от промастиготы до промастиготы занимает в среднем 24 часа.

Второй эксперимент был связан с попыткой добиться относительной синхронизации культуры жгутиконосцев штамма ЫВгВ. Жгутиконосцев в течение 96 часов культивировали в стандартных условиях, но под слоем стерильного вазелинового масла. Через каждые 6 часов культуру микроскопиро-вали и готовили сухие мазки, на которых проводили подсчет клеток. В течение первых 48 часов жгутиконосцы нормально делились (доля делящихся клеток по отношению к неделящимся составляет примерно 3%). Позднее, через 48-96 часов, рост культуры прекращался, достигнув

максимума численности - 10е клеток/мл. Через 96 часов около 99% клеток в культуре представлено промастиготами, делящихся клеток и эндомастигот было менее 1%. На этом -этапе культуральнуго жидкость со жгутиконосцами, с помощью стерильного шприца, переносили из-под масла в стерильную пробирку. Мазки с этой культуры делали через каждые 15 минут. Было обнаружено, что в течение первых 2 часов происходят изменения в строении промастигот, связанные с их подготовкой к делению: ядро и кинетопласт располагаются рядом друг с другом и постепенно мигрируют к заднему концу клетки, повышается базофильность цитоплазмы. Вслед за этим начинается процесс деления. Максимум численности делящихся жгутиконосцев приходится на период 3-3,5 часа. В это время появляются первые эндомастиготы; через 6 часов около 99% клеток представлено эндомастиготами.

Сопоставление результатов обоих экспериментов позволяет утверждать, что в культуре Р. Ьгеу/'сц/а развитие носит циклический характер и сопровождается закономер-

"эндомасгиготы - -

■ ■ -промастиготы

Рис. 3. Соотношение числа промастигот и эндомастигот в штамме N1^]}. По оси ординат - доля от общего числа клеток в культуре (%); по оси абсцисс - время культивирования (ч)

ным чередованием морфологических форм, а именно, про-, эндомастигот и переходных форм от эндо- к промастиготам.

Изменения культуры и штаммов жгутиконосцев Р. ЬгвУ1си1а при длительном культивировании. Было обнаружено, что при длительном (в течение года и более) раздельном культивировании двух штаммов Р. ЬгеУ1си1а происходят изменения в их клеточном составе. В штамме МВгЛ появляются мелкие эндомастиготы и увеличивается количество промастигот, но по процентному содержанию продолжают преобладать крупные эндомастиготы. В штамме ШгВ в небольшом количестве появляются крупные эндомастиготы. Таким образом, в обоих штаммах появляются все типы клеток присущие стволовой культуре ЫВг, т.е. по терминологии принятой в генетике происходит реверсия штаммов к исходному типу культуры. Повторное выделение "чистых" штаммов ЫВгА и ЫВгВ и их последующее раздельное культивирование в течение года дало тот же результат (привело к реверсии штаммов). Однако при клонировании таких "ревертировавших" штаммов жгутиконосцев на плотной питательной среде получали только один тип колоний: крупные полусферические у штамма ЫВгА и мелкие полусферические у штамма ЫВгВ. Кроме того, "ревертировавшие" штаммы, как будет показано ниже, сохраняли различия своих инвазионных свойств.

После трех-четырех лет культивирования изменения произошли и в стволовой культуре МВг. При клонировании на плотной питательной среде мы по-прежнему получаем два типа колоний, однако, их клеточный состав изменился. В крупных полусферических колониях (штамм МВгД) высеянных на жидкую питательную среду увеличилось количество промастигот и появились (в незначительном количестве) мелкие эндомастиготы. В мелких полусферических колониях появились крупные эндомастиготы.

Ультратонкое строение РгМеотопав Ьгву'юиЫ в культуре

Ультратонкое строение крупных эндомастигот штамма ЫВгА. Крупные эндомастиготы имеют округлую форму тела. Клетки покрыты плазматической мембраной, которую подстилает спой субмембранных микротрубочек. Характерно наличие крупных складок мембраны, которые формируют на переднем конце 3-5 своеобразных "губ", окружающих отверстие жгутикового кармана.. Отличительной чертой крупных эндомастигот является налчиена поверхности плазматической мембраны мощно развитого слоя структурированного гликокаликса. Жгутиковый карман имеет сложную и весьма постоянную форму. Жгутиковый карман подстилают две группы микротрубочек: 1 - лента из 4 тесносбпиженных микротрубочек кинетосомапьного корешка и 2 - восемь цитостомапьных микротрубочек. Цитостом-цитофаренгальный комплекс "редуцированного типа" (Рго1оу, Кагроу, 1995).

Жгутик короткий и никогда не выходит за пределы жгутикового кармана, параксиальный тяж отсутствует. Дистальный конец жгутика сильно расширен и наподобие пробочки закупоривает жгутиковый карман. Мембраны жгутика и жгутикового кармана формируют десмосомоподобные контакты. Около жгутикового кармана расположена крупная вакуоль. Обе структуры разделены тонкой цитоплазматической перегородкой.

Митохондрион хорошо развит, отдельные его ветви могут образовывать значительные вздутия со множеством пластинчатых крист. Капсула кинетопласта компактная. В цитоплазме отмечено наличие комплекса Гольджи, липидных включений и гли-косом.

Ядро часто имеет сложную форму. Как правило, ядерная оболочка образует глубокие впячивания, в которых могут присутствовать липидные включения. По пери -

ферии интерфазмого ядра располагается пристеночный хроматин. Ядрышко, повторяя форму ядра также может быть весьма сложной формы.

Ультратонкое строение мелких эндомастигот штамма МВгВ. Мелкие эн-домастиготы имеют овальную форму тела. Снаружи клетка покрыта трехслойной плазматической мембраной, которая формирует мелкие складки. Гликокапикс на поверхности плазматической мембраны отсутствует. Жгутиковый карман может быть широким мешковидным, в котором петлеобразно уложен жгутик или же длинным и узким. Узкий каналовидный карман вместе со жгутиком огибает ядро. Жгутик полностью помещается внутри жгутикового кармана и образует на своем конце бульбовидное расширение, до конца которого доходит аксонема. В области этого расширения формируются десмо-сомоподобные контакты мембран жгутика и жгутикового кармана. Жгутиковый карман подстилают две группы микротрубочек. С одной стороны - проходит лента из 4 тес-носбшженных микротрубочек кинетосомального корешка, с другой 5-8 цитостомаль-ных микротрубочек. Цитостом-цитофаренгальный комплекс «редуцированного типа».

Жгутик имеет типичное для трипаносоматид строение: во внутрижгутиковом матриксе располагается аксонема, параллельно которой проходит слабовыраженный параксиальный тяж. Хорошо развитый митохондрион с пластинчатыми и трубчатыми кристами располагается по периферии клетки. Диаметр трубчатых крист около 40 нм, ширина пластинчатых крист 20-22 нм..

Ядро снаружи окружено типичной двумембранной ядерной оболочкой с немногочисленными ядерными порами. Форма ядра обычно округлая или овальная. Интерфазное ядро имеет одно компактное ядрышко. По периферии ядра, под внутренней ядерной мембраной располагается пристеночный хроматин.

Цитоплазма содержит многочисленные рибосомы. Характерно наличие нескольких свободных от рибосом зон: субмембранная цитоплазма с расположенными в ней микротрубочками, области вокруг кинетопласта и кинетосомы и вокруг комплекса Гольджи.

Особенности ультратонкой организации мелких эндомастигот, подвергшихся высушиванию. Материал для этой части работы готовили следующим образом: брали трехдневную (содержащую максимальное количество мелких эндомастигот) культуру жгутиконосцев Р. Ь№1си!а (штамм ЫВгВ) осаждали центрифугированием, культуральную жидкость сливали, с помощью фильтровальной бумаги удаляли остаток жидкости, а отцентрифугированный осадок высушивали на воздухе. Через 24 часа подсушенный осадок фиксировали, по описанной выше методике. В качестве контроля, была зафиксирована трехдневная культура жгутиконосцев штамма ЫВгВ с жидкой среды.

В результате высушивания ультратонкая организация жгутиконосцев заметнб изменилась. Произошло уплотнение цитоплазмы - повысилась ее электронная плотность, в результате чего внутренние структуры клетки стали хуже дифференцироваться.: не выявляется комплекс Гольджи и мембраны эндоплазматического ретикупу-ма. Увеличилось количество липидных включений. Зона светлой субмембранной цитоплазмы исчезла, а субмембранные микротрубочки подстилают наиболее плотные слои цитоплазмы, которые заходят в промежутки между ними. Жгутики таких эндомастигот никогда не выходят наружу и плотно закрывают своей расширенной апикальной частью отверстие жгутикового кармана. В апикальную часть жгутика аксонема не заходит. Между мембранами расширенной части жгутика и жгутикового кармана образуются дес-мосомы. Значительно увеличилась плотность митохондриалыюго матрикса. Измени-

лась структура кинетопласта - нити ДНК располагаются рыхло, в результате чего кине-топласт приобрел сетчатый вид. В ядрах, подвергшихся высушиванию эндомастигот происходит сильная конденсация хроматина, занимающего значительную часть объема ядра.

Ультратонкое строение жгутиковых форм. Жгутиковые формы: промастиготы и переходные формы от про- к эндомастиготам, имеют сходное ультратонкое строение. Друг от друга они отличаются взаиморасположением ядра и кинетопласта и формой жгутикового кармана. Поверхность жгутиконосцев покрыта плазматической мембраной, которую подстилает слой субмембранных микротрубочек. Поверхностная мембрана формирует мелкие складки и иногда тонкие филоподиеподобные выросты, на концах которых часто образуются пузырьки. Гликокаликс отсутствует.

Жгутик имеет типичное для трипаносоматид строение. Жгутиковый карман подстилают две группы микротрубочек. Цитостом-цитофаренгальный комплекс "редуцированного" типа. Рядом со жгутиковым карманом располагается вакуоль, отделенная от него тонкой цитоплазматической перегородкой.

Хорошо развитый разветвленный митохондрион располагается по периферии клетки. Кристы двух типов: пластинчатые - около 20-22 нм в ширину и трубчатые - диаметром около 40 нм. В капсуле кинетопласта встречаются оба типа крист, но преобладают пластинчатые. Комплекс Гопьджи имеет типичное строение в виде стопки уплощенных цистерн и располагается рядом со жгутиковым карманом. В районе жгутиково го кармана, а иногда и в самом кармане, часто можно обнаружить мультимембранные образования. В цитоплазме присутствуют многочисленные включения липидной природы и гликосомы. Помимо крупной вакуоли, граничащей со жгутиковым карманом, могут встречаться и более мелкие вакуоли, которые располагаются в задней части клетки. Ядро обычно неправильной формы. Интерфазное ядро имеет типичное для трипаносоматид строение.

Митоз Р. brevicula. Показано, что митоз протекает по типу закрытого ортоми-тоза. Митотическое веретено формируют 20-25 микротрубочек, которые образуют один компактный пучок. Микротрубочки веретена заканчиваются на внутренней мембране ядерной оболочки, центры организации микротрубочек не обнаружены. На сериях срезов митотического ядра Р. brevicula насчитывается всего четыре кинетохора. Ядрышко в процессе митоза не диспергируется полностью, а лишь фрагментируется.

Жизненный цикл жгутиконосцев Proteomonas brevicula.

Экспериментальное заражение клопов из рода Nabis разными штаммами Р. brevicula. Заражали три вида клопов из сем. Nabidae: Nabis brevis Scholtz., Nabicula limbata Dhlb. и Nabicula flavomarginata Scholtz.. В экспериментах использовали имаго и нимф клопов гретьего-четвертого возрастов. Собранных в природе насекомых рассаживали в отдельные чашки Петри, снабженные поилками. Клопов кормили культурами персиковой (Myzodes persicae) и гороховой (Acyrthosiphon pisum) тли. Насекомые проходили карантин не менее 7 суток. В течение этого времени, ежедневно, экскременты клопов микроскопировали с целью возможного выявления стадий развития трипаносоматид. Для заражения использовали клоны штаммов NBrA и NBrB, полученные при клонировании на плотной питательной среде, а также стволовую культуру NBr. Для заражения клопов суспензию клеток жгутиконосцев Р. brevicula наносили на поверхность поилки. Время заражения отсчитывали с того момента, когда насекомые пили или хотя бы зондировали поверхность поилки.

Заразить клопов жгутиконосцами Рго>еопюпаз Ьгеу/си1а из штамма 1МВгА не удалось. Через 24 часа и на более поздних сроках (72, 144 и 216 часов) после начала эксперимента живых жгутиконосцев не удавалось обнаружить ни в фекалиях, ни в кишечнике хозяев.

Из 28 особей клопов подвергшихся заражению жгутиконосцами штамма ЫВгВ, у 20 насекомых наблюдалось развитие инвазии. Жгутиконосцы были обнаружены только в кишечном тракте клопов. Результаты экспериментов контролировали двумя способами: микроскопированием экскрементов зараженных насекомых и микроскопировани-ем содержимого их кишечника (после вскрытия). Контроль осуществляли через 2, 24, 48, 120, 144,168 и 216 часов после заражения.

2 часа: жгутиконосцы обнаружены в передней кишке, зобе и тонком кишечнике. По морфологии обнаруженные жгутиконосцы не отличались от культуральных форм, которыми заражали насекомых.

24 часа: жгутиконосцы обнаружены в зобе, тонком кишечнике и задней кишке. В зобе и тонком кишечнике - единичные промастиготы. Основная масса жгутиконосцев сконцентрирована в задней кишке, все жгутиконосцы неприкрепленные.

48 часов: жгутиконосцы обнаружены только в задней кишке. Численность жгутиконосцев небольшая. Единичные промастиготы прикреплены к стенке ректума. Прикрепленные жгутиконосцы по форме не отличаются от неприкрепленных.

120 часов: все жгутиконосцы сконцентрированы в задней кишке. Подавляющее большинство жгутиконосцев прикреплено к стенкам ректальных желез. Прикрепленные жгутиконосцы имеют округлую форму.

144 часа: жгутиконосцы обнаружены только в задней кишке. Численность жгутиконосцев высокая. Большая часть жгутиконосцев прикреплена к стенкам ректальных желез.

168 часов: большинство трипаносоматид прикреплено к стенкам ректальных желез. Поверхность ректальных желез полностью покрыта "ковром" из жгутиконосцев. На мазках обнаружено небольшое количество промастигот и мелких эндомастигот.

216 часов: жгутиконосцы локализованы только в задней кишке, большинство прикрепленные, округлой формы. Довольно большое количество мелких эндомастигот.

В фекалиях клопов жгутиконосцы появлялись в первые сутки после начала эксперимента. В течение шести суток с момента заражения во внешнюю среду с экскрементами клопов выводились только промастиготы. На седьмые - восьмые сутки в экскрементах зараженных клопов появлялись мелкие эндомастиготы.

Две особи N. ПтЬа1а были заражены стволовой культурой Р. ЬгеуюШа (ЫВг), Каких-либо различий в заражении клопов стволовой культурой Р. бгем'си/а (ЫВг) и штаммом МВгВ не обнаружено.

Все три вида клопов-набид одинаково успешно заражались жгутиконосцами Р. Ьгеи'си/а из штамма ЫВгВ. Вне зависимости от видовой принадлежности и возраста хозяев развитие паразитов в них протекало сходным образом, и на 7-8-е сутки после начала эксперимента в ректуме появлялись расселительные стадии - мелкие эндомастиготы.

Локализация жгутиконосцев в кишечнике хозяина и морфология стадий жизненного цикла в сканирующем и просвечивающем электронных микроскопах.

Через 48 часов и на более поздних сроках заражения все жгутиконосцы сконцентрированы в ректуме клопов-хозяев. В ректуме можно наблюдать как прикрепленных, так и неприкрепленных жгутиконосцев. Прикрепленные жгутиконосцы обычно имеют округ-

лую форму. Однако, на начальных этапах заселения ректума (вторые-третьи сутки заражения) обычны удлиненные формы, практически не отличающиеся от неприкрепленных промастигот. Прикрепленные жгутиконосцы локализуются, главным образом, на поверхности ректальных желез. Интересен способ прикрепления жгутиконосцев к кутикулярной выстилке ректума. Основание свободной (выходящей из жгутикового кармана) части жгутика слегка вздуто и плотно прилегает к субстрату, а его дистальная часть, также прилегающая к поверхности ректальной железы, формирует отростки различной протяженности и диаметра. В месте контакта с кутикулой плазмалемма жгутика формирует зональную полудесмосому. Внутрижгутиковый матрикс ундулиподии, выполняющей прикрепительную функцию, имеет тонкофибриллярную структуру. Параксиальный тяж у прикрепленных жгутиконосцев не выявляется. У свободных промастигот и мелких эндомастигот параксиальный тяж имеется. Аксонема следует вдоль всей длины прикрепленного к кутикулярной выстилке ректума жгутика.

Наружный слой плазматической мембраны протеомонад, находящихся в рек-туме клопов, значительно толще внутреннего. Субмембранные микротрубочки расположены в свободной от рибосом специализированной зоне цитоплазмы. Наружная мембрана как прикрепленных, так и неприкрепленных жгутиконосцев формирует глубокие складки. Складки расположенных рядом жгутиконосцев могут заходить друг в друга, однако, какие-либо специализированные контакты между плазмалеммами разных особей не обнаружены. На поверхности прикрепленных жгутиконосцев формируется мощный слой структурированного гликокапикса. В местах скоплений жгутиконосцев гликокаликс близлежащих особей сливается, заполняя пространство между клетками. Здесь также встречается тонковолокнистый матрикс, который часто ассоциирован со жгутиками Рю!еотопа5 Ьгвуюи/а и в большом количестве присутствует внутри жгутиковых карманов паразитов. Неприкрепленные промастиготы и мелкие эндомастиготы лишены гликокаликса и имеют ясно выраженную продольную складчатость. Отсутствует гликокаликс и у прикрепленных форм на ранних сроках заражения, когда промастиготы только начинают закрепляться на поверхности ректальных желез и еще не образуют больших скоплений.

Жгутиковый карман прикрепленных протеомонад в своей проксимальной части имеет сложное ретортовидное сечение, в дистальной части сечение жгутикового кармана имеет округлые очертания. Жгутиковый карман подстилают две, расположенные напротив друг друга, группы микротрубочек. Рядом со жгутиковым карманом располагается крупная вакуоль и ассоциированная с ней сеть каналов и мелких вакуолей. По периферии клетки расположен разветвленный митохондрион. Митохондриальные кристы двух типов: трубчатые и пластинчатые.

В большом количестве в цитоплазме прикрепленных жгутиконосцев присутствуют гликосомы и липидные включения. Интерфазное ядро имеет типичное для трипаносоматид строение. Снаружи ядро покрывает двумембранная ядерная оболочка с ядерными порами. На внутренней мембране расположен пристеночный хроматин. Ядрышко обычно занимает в ядре центральное положение. У прикрепленных жгутиконосцев ядро и кинетопласт расположены на одном уровне и сдвинуты к заднему концу клетки.

Способ передачи инвазии. Как было показано выше место локализации жгутиконосцев Р. ЬгеУ-1'си!а в клопах-набидах ограничено задним отделом кишечника - рек-тумом, в котором происходит формирование расселительных стадий. Поэтому мы

предположили наличие у Ргх^еотопаг ЬгеУ1си1а контаминативного способа передачи инвазии.

Для подтверждения контаминативного способа передачи инвазии был проведен следующий эксперимент. Неэараженных клопов пересаживали в садки, в которых перед этим (не менее 7-8 суток) содержались искусственно зараженные особи. Поилки в этих садках заменяли на новые, т.к. по нашим наблюдениям некоторые гомоксенные трипаносоматиды могут выживать в воде в течение суток и более. Таким способом были заражены два клопа из четырех, использованных в эксперименте. Уже через сутки после помещения насекомых в садки, где раньше содержались зараженные клопы, в их фекалиях были обнаружены жгутиконосцы. В дальнейшем у этих насекомых наблюдалось типичное для Р. ЬгвУ1си1а развитие инвазии. Насекомые были вскрыты на седьмые и восьмые сутки после помещения их в "зараженный" садок. Ректальные железы обеих особей были покрыты "ковром" протеомонад. На мазках, выполненных с ректума, были обнаружены мелкие эндомастиготы.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

Основываясь на результатах наших исследований, цикл развития жгутиконосцев Р. Ьгвуюи!а в хозяине можно представить следующим образом (рис. 4). Инвазионные стадии - мелкие эндомастиготы попадают в пищеварительную систему клопов-хозяев при питании последних на зараженном субстрате. В лабораторных условиях роль инвазионных стадий вероятно могут выполнять не только мелкие эндомастиготы, но и промастиготы Р. brevicula. Однако промастиготы в отличие от эндомастигот не выдерживают даже кратковременного подсыхания субстрата (Фролов, Малышева, 1992), поэтому в естественных условиях заражение клопов промастиготами крайне маловероялю.

В первые 2-24 часа после заражения в передних отделах кишечника происходит трансформация мелких эндомастигот в промастиготы. Последние транзитом проходят среднюю кишку клопов-хозяев и сосредоточиваются в ректуме. Здесь жгутиконосцы прикрепляются к кутикулярной выстилке ректальных желез и интенсивно размножаются, постепенно заселяя все новые участки ректума. В течение первых шести суток в результате делений образуются, по-видимому, только промастиготы. На седьмые сутки в ректуме зараженных клопов появляются мелкие эндомастиготы. Таким образом, по крайней мере часть клеток Рго1еотопаз Ьгеу1си1а начинает на этом этапе делиться с образованием мелких эндомастигот так, как это происходит в лабораторной культуре штамма МВгВ (Фролов, Малышева, 1989). С этого момента мелкие эндомастиготы и начинают выводиться во внешнюю среду, где до одиннадцати суток могут сохранять инвазионность и служить источником заражения новых хозяев.

Большой интерес представляет вопрос о природе двух морфологически четро различающихся штаммов Р. Ьгеу'юШа и их месте в жизненном цикле жгутиконосцев. Стадии, морфологически сходные с эндомастиготами из штамма ЫВгА, обнаружены в микропопуляциях паразитов, заселяющих поверхность ректальных желез клопов. Ими являются прикрепленные промастиготы. То, что в лабораторной культуре жгутиконосцы представлены эндомастиготами, а не промастиготами, вероятно, следует объяснить отсутствием необходимого субстрата для их прикрепления. Тот факт, что крупные эндомастиготы не могут заражать новых хозяев и не выделяются в культуру из экскрементов зараженных клопов, указывает на то, что это, вероятнее всего, узкоспециализированные стадии, выполняющие о жизненном цикле паразитов функцию их эндогенной

агломерации и, возможно, создающие определенные условия в кишечнике хозяина необходимые для образования расселительных стадий. Только после того как численность жгутиконосцев в ректуме клопов хозяев достигает определенной критической величины, в популяции протеомонад появляются стадии, характерные для жгутиконосцев из штамма МВгВ. С этого момента во внешнюю среду начинают выводиться мелкие эндомастиготы - стадии развития Р. Ьгвуки1а, наиболее приспособленные для переживания неблагоприятных условий (Фролов, Малышева, 1992). Эти жгутиконосцы легко выделяются в культуру из экскрементов клопов и способны заражать новых хозяев. У трипаносоматид, формирующих высокоспециализированные расселительные стадии -цистоподобные амастиготы, наблюдается сходная структура цикла развития с той разницей, что обе фазы цикла обычно пространственно разобщены (МеЫЬот е( а!., 1979; Тюэгеп е1а!., 1995, 1989Ь; Фролов и др., 1991).

Рис. 4. Схема жизненного цикла жгутиконосца 1'го1сотопах Ьге\чси1а (по: Малышева, Фролов, 1995 с изменениями)

1 - жгутиконосцы, прикрепленные к кугакулярной выстилке ректума клопа-хозяина^ - неприкрепленная промастигота, 3 - делящаяся нромастигота, 4 - мелкие эндомастиготы (расселительные стадии)

У Proteomonas brevicula в культуру могут быть выделены одновременно два хорошо различающиеся по морфологии штамма жгутиконосцев, ко1;орые соответствуют разным стадиям их жизненного цикла. Оба штамма в течение достаточно длительного времени могут раздельно культивироваться, сохраняя свою индивидуальность. В то же время у другого вида из рода Proteomonas (P. inconstans), имеющего сходный цикл развития в культуре, жесткой изоляции штаммов, подобных штаммам NBrA и NBrB у Р. brevicula, не происходит (Подпипаев и др., 1990). В качестве гипотезы, объясняющей этот феномен, мы рассматриваем возможность опосредованного влияния на паразитов некоторых особенностей биологии их хозяев. В частности, культура P. brevicula была выделена из кишечника зимующей особи Nabis brevis. Вполне возможно, что наличие двух хорошо морфологически и физиологически обособленных штаммов жгутиконосцев объясняется особыми условиями среды их обитания в этот период, которая можеу обладать теми или иными селективными свойствами. Примером ярко выраженногр влияния физиологического состояния хозяина на особенности развития гомоксенных трипаносоматид служит паразит-хозяинная система, объединяющая комаров и крити-дий (Clark et al., 1964).

Жизненный цикл с двумя морфологически различающимися линиями клеток и с двумя различными типами эндомастигот описан у некоторых видов лейшманий, в частности у Leishmania chagasi в кишечнике москита Lutzomyia longipalpis (Lainson, Shaw, 1988).

Исследования зараженности клопов семейства Nabidae в природе показали, что представители именно этого семейства являются специфичными хозяевами для жгутиконосцев рода Proteomonas. В пользу этого свидетельствует факт нахождения в природе перезимовавших зараженных набид (до 10-20%). При неспецифической инвазии гомоксенные трипаносоматиды переживают в насекомом не более 10 суток (Фролов, 1987в). По-видимому протеомонасы, по крайней мере в пределах семейства Nabidae широко специфичны, благодаря чему достигается высокий уровень инвазии. Возможно в природе встречаются случаи и неспецифической инвазии насекомых жгутиконосцами рода Proteomonas, в частности второй известный из этого рода вид - Р. inconstans, описан из растительноядного клопа Calocoris sexgutatus представителя семейства Miridae (Подлипаев и др., 1990). Не исключено, что в этом случае имело место неспецифическое заражение.

Непрерывность цикла P. brevicula обеспечивается благодаря тому, что некоторые виды набид зимуют в имагинальном состоянии и зараженные особи нормально переносят зимовку.

Наши исследования показали, что упьтраструктура крупных эндомастигот э основном сходна с ультраструктурой большинства изученных стадий жизненных циклов трипаносоматид, однако есть и ряд характерных особенностей не отмеченных у других гомоксенных трипаносоматид.

Сильно развитый структурированный гликокаликс, обнаруженный нами у крупных эндомастигот штамма NBrA и у промастигот, прикрепленных к стенке ректума клопов-хозяев, не имеет аналогов среди кинетолластид, а скорее напоминает гликокаликс некоторых амеб. До недавнего времени считалось, что наличие мощных поверхностных гликопротеиновых комплексов характерно только для кровяных форм трипа-носом (Vickerman, Preston, 1976). В настоящее время гликокаликс, или, как его часто называют, фибриллярный матрикс, обнаружен у нескольких видов трипаносом и лейшманий в кишечнике насекомых-переносчиков (Heywood, Molyneux, 1985; Walters et al.,

-161987, 1989; Mungomba et al., 1989; Sacks et al., 1994). У гомоксенных трипаносоматид гликокаликс слабо изучен и описан лишь у нескольких видов (Вгоокег, 1976; Souto-Padron et al., 1980; Tieszen et al., 1985; Горбунов, 1992). Гликокаликс лейшманий в кишечнике насекомых-переносчиков выполняет несколько функций, в частности способствует прикреплению промастигот к стенкам кишечника москитов (Sacks et al., 1994). Возможно у гомоксенных жгутиконосцев, в том числе и у P. brevicula, он выполняет ту же функцию.

Мелкие эндомастиготы отличаются от всех, до сих пор описанных у трипаносоматид морфологических форм, характерной петлеобразной укладкой жгутика. В отличие от крупных эндомастигот, у мелких эндомастигот жгутик весьма подвижен он может появляться из отверстия жгутикового кармана и опять втягиваться в карман. Благодаря такой подвижности жгутика и кинетопласта, а также изменениям формы жгутикового кармана, мелкие эндомастиготы могут легко трансформироваться в промастиготы.

Ультратонкое строение мелких эндомастигот, подвергшихся высушиванию, имеет ряд сходных черт с ультраструктурой специализированных расселительных стадий других гомоксенных трипаносоматид из родов Leptomonas и Blastocrithidia: цис-топодобных амастигот (Schaub, Pretsch, 1981; Reduth, Schaub, 1988; Tieszen et al., 1989b; Фролов, Скарлато, 1990). Ультратонкое строение мелких эндомастигот, подвергшихся высушиванию, также обнаруживает некоторое сходство со свободноживу-щими расселительными стадиями некоторых гомоксенных трипаносоматид из водных насекомых (Малышева, Фролов, 1993). Так например, у тех и других происходит резкое увеличение электронной плотности цитоплазмы, вследствие чего исчезает выраженная дифференцировка цитоплазмы и перестает выявляться ряд органелл. Резко возрастает количество липидных включений. Сходные изменения происходят в организации поверхностных структур, ядерного аппарата и кинетопласта.

Таким образом, изменения в организации эндомастигот, подвергшихся высушиванию, во многом сходны с изменениями, которые происходят с гомоксенными три-паносоматидами в процессе формирования всех типов расселительных стадий. Это позволяет нам рассматривать эндомастиготы как особый тип расселительных стадий гомоксенных трипаносоматид, присущий только представителям рода Proteomorias. В отличие от "цист" других трипаносоматид, эндомастиготы рода Proteomonas постоянно образуются в ходе клеточных циклов эндогенной агломерации паразитов. При этом они способны выполнять две функции: либо вновь включаться в процесс размножения, либо, попадая во внешнюю среду и сохраняя при этом жизнеспособность, служить источником инвазии новых хозяев.

Цитостом-цитофаренгальный комплекс у всех форм P. brevicula редуцированного типа и представлен небольшой ямкой, расположенной на стенке жгутикового кармана и группой цитостомальных микротрубочек, которые уходят вглубь цитоплазмы и подстилают стенки жгутикового кармана. Ранее цитостомальные микротрубочки, подстилающие жгутиковый карман, рассматривались как специфические присущие только роду Proteomonas микротрубочки и были ошибочно включены в диагноз рода (Подлипаев и др., 1990). Две группы микротрубочек, армирующие жгутиковый карман описаны и у представителей других родов, например у Leptomonas nabicula и Herpetomonas muscarum (Шагпина и др., 1995; Frolov, Karpov, 1995).

Изученный нами жизненный цикл жгутиконосцев Proteomonas brevicula существенно отличается от жизненных циклов представителей других родов гомоксенных

трипаносоматид. В частности от всех известных родов гомоксенных трипаносоматид род Proteomonas отличается наличием в их жизненном цикле эндомастигот с характерным петлеобразно уложенным жгутиком, которые являются специфическими характерными только для этого рода расселительными стадиями. Кроме того от жгутиконосцев родов: Leptomonas, Blastocrithidia, Herpetomorias и Rhynchoidomonas протеомонасы отличаются по месту локализации в хозяине. Лептомонасы и бластокритидии как правило заселяк?т весь кишечник хозяина и могут поражать мальпигиевы сосуды, лептомонасы обнаружены еще в гемолимфе. Жгутиконосцы рода Herpetomorias также встречаются в мальпигиевых сосудах, а представители рода Rhynchoidomonas являются специфическими паразитами мальпигиевых сосудов двукрылых. Отличие жизненного цикла Proteomonas brevicula от жизненных циклов других гомоксенных трипаносоматид еще раз подтверждает обоснованность выделения нового рода - Proteomonas (Подлипаев и др., 1990).

ВЫВОДЫ

1. Из хищного клопа Nabis brevis описан новый для науки вид трипаносоматид - Proteomonas brevicula.

2. Выделена, адаптирована к искусственной питательной среде и передана в коллекцию культур ЗИН РАН безбактериальная культура трипаносоматид P. brevicula.

3. Экспериментальными методами изучен жизненный цикл P. brevicula в клопах семейства Nabidae. Заражение хозяев осуществляется мелкими безжгутиковыми формами - эндомастиготами. Мелкие эндомастиготы транзитом проходят передние отделы кишечника хозяина и в среднем кишечнике трансформируются в промастиготы. Через 24 часа промастиготы достигают ректума и прикрепляются к поверхности ректальных желез, при этом промастиготы принимают округлую форму, а на их поверхности формируется мощный слой гликокаликса. После чего наступает фаза эндогенной агломерации: прикрепленные округлые жгутиконосцы интенсивно делятся, заселяя всю поверхность ректальных желез. На 7-8 сутки в задней кишке появляются мелкие безжгутиковые формы, которые выводятся во внешнюю среду и осуществляют заражение новых хозяев.

4. Мелкие безжгутиковые формы - эндомастиготы представляют собой новый тип расселительных стадий гомоксенных трипаносоматид. Попадая во внешнюю среду мелкие эндомастиготы не формируют на своей поверхности защитной оболочки, но тдм не менее могут длительное время (до 11 суток) переносить высушивание.

5. Из кишечника клопа в культуру выделяются два штамма жгутиконосцев р. brevicula, которые могут быть разделены при клонировании на плотной питательной среде по форме колоний. Эти штаммы обозначены как NBrA - производные крупных колоний и NBrB - производные мелких колоний. Оба штамма длительное время могут культивироваться независимо друг от друга.

6. Жгутиконосцы штамма NBrA представлены в культуре неподвижными крупными эндомастиготами и промастиготами, количество которых составляет менее 1% от общего числа особей. Крупные эндомастиготы делятся с образованием себе подобных форм. Деления промастигот не обнаружены. По строению жгутика и жгутикового кармана, по наличию крупной вакуоли, граничащей со жгутиковым карманом и по мощно развитому гликокаликсу крупные эндомастиготы соответствуют прикрепленным к стенкам ректальных желез хозяина, интенсивно делящимся жгутиконосцам.

-187. Жгутиконосцы штамма NBrß проходят в культуре цикл связанный с чередованием промастигот и мелких эндомастигот. По расположению ядра и кинетопласта, по строению жгутикового кармана и расположению жгутика мелкие эндомастиготы штамма NBrB соответствуют формам, которые появляются в ректуме хозяина на 7-8 сутки и выводятся во внешнюю среду.

8. На примере жгутиконосцев P. brevicula впервые показано, что в культуру из кишечника насекомых могут быть выделены одновременно несколько морфологически различных, способных размножаться независимо друг от друга стадий жизненного цикла одного вида трипаносоматид.

9. Разработан метод относительной синхронизации культуры жгутиконосцев P. brevicula, который позволяет получать до 90% от общего числа особей жгутиконосцев, находящихся на одной стадии развития.

10. Исследован митоз у P.brevucula. Показано, что он протекает по типу закрытого внутриядерного ортомитоза без конденсации хромосом и связан с расхождением четырех пар кинетохоров.

11. Чередование в жизненном цикле Р. brevicula двух типов эндомастигот и промастигот среди трипаносоматид до настоящего времени было известно только у некоторых представителей рода Leishmania из кишечника москитов-переносчиков.

12. Выявленные особенности ультратонкого строения и уникальность жизненного цикла жгутиконосцев Р. brevicula подтверждает обоснованность выделения нового рода гомоксенных трипаносоматид - Proteomonas.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Подлипаев С.А., Фролов А.О., Малышева М.Н. Культивирование низших трипаносо-

матид//В кн.: Экология морских и пресноводных простейших. Тез. докл. II Все-союзн. симп. Протозоологов. Ярославль. 1989. С. 55.

2. Фролов А.О., Малышева М.Н. Описание Crithidia allae sp.n. и Crithidia brevicula sp.n.

(Protozoa, Trypanosomatidae) из хищного клопа Nabis brevis Scholtz (Hemiptera, Miridae)// Зоол. журн. 1989. Т. 68, вып. 7. С. 5-10.

3. Фролов А.О., Малышева М.Н. Цикл развития паразитического жгутиконосца Crithidia

brevicula (Trypanosomatidae) в лабораторной культуре// Цитология. 1989. Т. 31, №8. С. 971-973.

4. Фролов А.О., Малышева М.Н. Электронно-микроскопическое исследование эндома-

стигот Crithidia allae (Trypanosomatidae)// Зоол. журн. 1990. Т. 69, вып. 6. С. 510.

5. Малышева М.Н. Гетероморфизм клеточных популяций в лабораторных культурах

низших трипаносоматид// Труды V Всесоюзного съезда протозоологов. Витебск. 1992. Цитология. 1992. Т. 34, №4. С. 92

6. Фролов А.О., Малышева М.Н. Эндомастиготы - особый тип расселительных стадий

трипаносоматид рода Proteomonasll Паразитология. 1992. Т. 26, вып. 4. С. 351-354.

7. Малышева М.Н., Фролов А.О. Свободноживущие расселительные стадии трипаносоматид из водных насекомых// Паразитология. 1993. Т. 27, вып. 4. С. 296-300.