Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофоретические кариотипы низших трипаносоматид

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Электрофоретические кариотипы низших трипаносоматид"

р Г Б ОД

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ЛКЛДР.МЛИ ПАУК

Нп правах рукописи

СОМОВА Наталья Владимировна

эляктрофоретичкскип кариотш/ы т гшшх

ТРИПА! [ОСОМАТ1Щ (03.00.25 - клеточная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

СА11КТ-11Н1 ЫЧЛ 14 |Ч<Л

1'иоотн выполнена и Институте ннгологии РАН

Научный руководитель -киидидат биологических наук, старший научный сотрудник С/Х^клрлато.

Офшшллын.к- ошюиетъи докчор биологических наук , профессор И.Р.Гшижкая, кыииьин биокогнчсскнч на)к С.А.11о;ицшаеи. Ведущее учреждение - Институт эвотющюнной фшиолоти и биохимии , имени И.М.Сеченова РАН.

Зшнши состоится 1995 ( <\ 13 чт ол па мяо.-линии

Днсссрчгииюнною совет Д 00?. 7.1.01 при Илиигчь .ииожмни 1'ЛНпо щцжсу: 194064, С.-Штсрбур!, Тихорецким пр., 4

С дисссршшсй можно тняюнип <я н бнбпиоккс Пнспт га ипиишнш 1'АП.

Лкюрефсраг рачослаи

Ученым секретарь Диссс1>1ацпо1П1<ч о сокеш

/ьчпор онояо! ичпкпх ил »к- . ( 1) Мпслргпн

© ¡!нСП1|>1 ШНОМ1Щ Г М1

ОНЩЛЯ Х.М'ЛК'ПИ'ИС ГИКЛ 1'ЛЬОТЫ I

/\ктуал:),111)с[).1!р(>б.'_1см1.1. Изучение карноишо» животных и растений -одна in центральных задач современной клеточной биологии (1'айков, IV/8; Raikov, 1982). r)in исследования позволяют оцсшнь филогенетические отношения между разными |руппами организмом, проследить ход видообразовании и пути расселения пидов. Кроме того, пшишя о кариотинах многих организмов патал для ислиитскоП и

сельскохозяйственной практики человека. Описание хромосомною набора обычно нроводят на смтоогггическом )| з.тектронно-микроскоиическом уровнях на стадиях поздней профазы щи метафазы, когда хромосомы достигают наибольшей степени ашрализащш.

Однако среди низших зукарноз, и прежде всего простейших, ecu. немало видов, хромосомы которых слабо сппршшзуютси или вовсе i спирализуюгся на всех стадиях клеточного цикла. Ноззому изучение индивидуальных хромосом и кнриогиион в целом у таких организмов традиционными цитологическими методами затруднено. К их числу относятся и жгутиконосцы семеме-]п.з Trypanosomatidae. В то время, исследование карнотнпов грипаносоматнд имеет практическое значение, так как все они являются паразитами и многие их виды вызывают опасные заболевания человека и домашних животных.

Метод пульс-злектрофоре за иредосгавил новые возможности для анализа кяриотмпон многих организмов, Зга методика позволяет фракционирован, молекулы ДНК размерим ог нескольких десятков до нескольких миллионов пар нуклеошдов (пн). 11 настоящее время общепринят, чго по числу выявляемых методом нульс-злектрофорсза размерных фрлкннЛ ядерных молекул ДИК можно судии, о числе хромосом у целою ряза нинних зукярти и, в том числе, у зрштиосомашд (Van d<r I'lotp с| л1 , |«Я4) Число, размерные и HHi.fe хярнкюрнешкп злек1рофоре1Нчс<к-||% фрпнппН хромосомном ЛПК" оргл/тзмя принят ппзышиь »декгрофорпнчп ким карнотипом данною организма.

Ло nocjityuieiо времени при исследовании узикопошгп сечсГн шп Trypanoiomnliibe шрвоочере зное шшмлинс уделялось ицчмпно >ТСКГрофор1 1ЦЧЦ Ml' КарНОМПЮВ |<Ч1р01'С<'ПЦМ\ (If ПМПоШПТ В 1П1ЧМ ЖИЧ1СННОМ IIIII 1И1, V * о Ц|( |\| I (ЧЦНИЮ! evlil I П I in р" / M/'<'''■ ' "

Leishmania (Vom tier Ploeg et al„ 19Я"; 1989; Majiwn et al., 1985; Oibson et al., 198S; Oibson, Horst, 19X(i; Oil-son, Miles, 19X6; Engman et al., 1987; Mosakc et al., 19R8; Dickm, Gibson, ¡989: Aymerich, Gollenberg, 1989; Bard, 19S9; liastien, 1990, 1991\ Henriksson et al., 1990), многие виды которых патогенны для человек« и домашних жинотнык. Исследованию же тсктрофоретическнк кцрмопшон обширной ipyiijii.i низших ГОМОК1СШ1ЫХ (т.е. имеющих в споем жм'шенном цикле одного хозяина) трипаносоматид из родов Crithidia, Blastocrithidia. Lepiomonas, Herpetomonas, Rhynchoidomonas и Proleomonas, наразширующнх, главным обраюм, г> кишечнике насекомых, уделялось нш внимания (Van der Plocg et al., 1984; Aymcrich, Goldenberg, 19X9; Скарлато и др., 1990; Подлнпаев и др., 1991). В то же время, изучение кариопшов низших тршшюсоматид важно для понимания структуры и эволюции хромосом в пределах всего семейства Trypanosomatidac. Кроме того, эти жгутиконосцы являются удобным модельным объектом для изучения организации г енома примитивных одноклеточных зукарнот, они легко культивируются in vitro и безопасны для человека.

Цель д.зядачн исследования. Цель настоящей раЗогы заключалась в том, чтобы изучить в сравнительном плане элсктрофоретическис (молекулярные) кариоишы ^шзншх гомоксенных грнпаносоматид и оцсшгп. значение полученных данных для последующих исследований в области современной кариологии икариосисгематикн. Были поставлены следующие задачи.

1. Определить оптимальные условия выделения и фракционирования интактных хромосомных молекул ДНК у низших трипаносомптид с помощью метода иульс-электрофорсза.

2. Определить число п размеры хромосомных молекул ДНК у представителен родов l.eptomonas, Crilhiclia, Blastocrithidia и Proteomonas.

3. 11сслсдов:ш, внутривидовую изменчивость злсктрофорстичсских кариопшов у некоторых низших 1ринаносоматид.

4. Оценить возможность использования злсктрофорстичсских кариотнпов для уточнения систематического положения и филогенетических связен организмов в пределах семейства Trypanosomatidac.

5 С помощью гибридизации по Саузсрну определить хромосомную локализацию i сноп рРПК у исследуемых видов низших грнпаносоматид.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование молекулярных кариотипов низших юноксспт./х ipitn:inocouuiii;x методом электрофореза в системе ТАГЕ (Transverse Alternating Field Electrophoresis -электрофорез в поперечно-переменном поле) при вертикальном положении геля. Попользованный п настоящей работе вариант пульс-электрофореза отличался более высокой разреипюшей способностью но сравнению с другими его модификациями, применявшимися ранее дач анализа злектрофоретнчсских кариотипов даяиой группы организмов. Это позволило получить наиболее точные, на настоящий момент, сведения о числе хромосом и размерах хромосомных молекул ДНК у гомоксенных трипалосоматид.

Из 11 исследованных видов низших трипалосоматид у Leptomonas mycophihu (штамм SV69cf). Leptomonas sp. (штамм cfmlS), Crilhidia luriliae (штамм CLAA), Crilhidia sp. (штамм C4), C.oncopelti (штамм COM) и Blasto crilhidia miridarum (штамм ЗМГ»Х) электрофоретические кпрнотиим изучены впервые.

Впервые исследована хромосомная локалтапия генов рнбосомных 1'НК у нескольких видов низших трипалосоматид (Crilhidia fascintlata, C.luciliue, C.oncopelti, Leptomonas petfrhoffi, L.myr.ophilm, Prolenmonas inconstnns и P.brevicula).

Научи о-нр !U<*n! ч с ск а я ценноегь pmvubi, Предлагаемое исследопание вносит значительный вклад в ссвременную филогению и систематику трипаиосомптид. Полученные данные о кариоптах 11 видов нтших трипалосоматид из родов Crilhidia, BlastocrUhidia, Leptomonas и Рroteomimas могут быть использованы для установления филогенетических священ внутри семейства Trypanosomas Jae. Выявленный внутримидовоК полиморфном злектрофорстичсских кариотипов низших тринпиосомлтид помитяп заключил* что электрофорегическне к.фногипы не moi ут служшь в кячеопе стабильных видовых признаков у этих Ж1у1иконосцев. Полученные зияния являются необходимой основой для дальнейших рчбог п облисш клеючжч« и молекулярной биочопш rannmx трнпяносомпшд - удобных м«'miui обм-тггов для игеледрипнич организации гг|»омч кчеюк ни«них »«vxpiioi Апробация работы. Мпернязы диссертации были пдаптим in И

ПгО 'Ч'ЧНОМ ОЖН"«1|УЧР П1> еярпоги! 1Г-Ч(1МЧ ( I'li Гчч i'MJ4 !. |'1'Ч( (lil '

Всесоюзном съезде протозоологов (Витебск, 1992), на XI Симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (С.-Петербург, 1993), на IX Международном конгрессе протозоологов (Берлин, 1993) и на научных семинарах лаборатории шггологии одноклеточных организмов Института литологии РАЛ (С.-Петербург. 1994. 1995) и Санкт-Петербургского отделения Общества протозоологов при РАН (С.-Петербург, 1990).

1!хбл(гка1(И([, По теме Диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на /страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего f^TS работ. Материалы диссерташш иллкнггрированы /Г рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве о()ъсюов игсяедова1щя были взяты 23 клона низших гомоксеиных тринаносоматнд, относящиеся к 11 видам из родов Crithidia, Hlaslocriihidia, Leptomonas и Proleoinonas. Из них 10 клонов штамма cfmlS Lepiotnonas sp. были получены из Банка культур простейших лаборатории протозоологии Зоологического института РАН. Остальные клоны былн выделены из штаммовых культур (по одному от каждого штамма), полученных там же. Список и происхождение всех исследованных культур жгутиконосцев предсташгены в таблице 1.

'Грипаносомапщ культивировали на жидкой питательной среде лри 25"С. Дет выделения ДНК трипаносоматнд собирали центрифугированием в начале стацнонярноП фазы роста (па 3-й или 6-ые сут. культивирования) при копцен грации клеток 107108 в 1 мл.

Приготовление препаратов хромосомнойДНК проводили по стандартной методике путем деиро гепнилациц целых клеток, сплавленных с агароэой (flmilh ct а!, И>8Я) Лгарозные блоки инкубировали в растворе для лгпротешппяшш г irporcHiunoii К (!-? мг/м.ч) Iин проказой И (5 мг/мл) при Vi"f п т'чнше 'Я '1.

II):ii.r■•гччскчрофп'с :<()<.MocoMiioii ДНК проводили на аппарате The i?'Mflir>c S>;tcm (HuUn.-ui Itntiuinrnts, t.'lIIA) ч/и» ни аналогичном

Таблица 1. Список н происхождение исследованных штаммов нчниих

трипаносоматид

Вид Штамм Хозяин Место и год ЛтЧ)а-

выделения Т)рПЫ)1

■ штамма; источник

кем выделен

СгНЫсНа от ЦНр1сга Штаммы -

/азаси1а(а получены иа

каф.

С. ШНае СЬАА ¡Лр'ега ыол.биоя. -

Московского

^нив.

С. опсореМ СОМ Нст1р1«а от д.б.н. Л.А. -

Колесникова

СтНМ<Иа зр. С4 Оегг« Ленинград- • -

тСозси- екая обл.,

1е1Ыи$ Г.агг., 1987,

НегЫргега С.А.Подли-

НУСН

Ртыеотопщ гкл, /.о. Са1осо№ Псковская Подтшаеп и

¡псопыат гкм зсх»ииа1т Р., обл., 1986 др., 1990

Нет1р1ега

Р.ЬтЫси1а , ^гА, ШгВ №ЬЬ Ьго\Ц Пскопская Фролов,

ЙЬок/., обл., 1986 Малышева,

1 1еп)1р1сгА 1989

ЩаМосп- змпх ¡_уеосоп.'> Псковская Поддинясп,

1Ы<На 1исопн!ч М.- обл.. 1986 Фролов, 19Я7

гт'гШгит О., Иашрюгп

Ьер1отвпаз 101 №Ыси1а Ленинград- 1 Годштпсп,

ре1ггНс£?1 Пачотаг- ская обл., 1985

£нт1й ХЪокг, 1480

I НепнрТега

и РИуЮсопз 8р., Лсниш-р ад- <Ьроло»,

¡пусорИИт Иетфгст ская обл., Скар.'глто,

198!! 1991

К.паЫги1ае ИаЫсЫа Лсишпрад- Подлштгп.

Пауотаг- я:ач обп.. 1985

- ггшпы лЬоН:»,

1Гс»»1р1сга

1.ер1опюгш с(т15 Нр.ЫгчЫ Пскоисктч -

(КЛОИ1.1 гГт! - Птгтя! - обл.. 195И,

сГтХ) А ').фр»*'1оо

______________[Цяпфига 1

аппарате, сконструированном сотрудником Фнэнко-техиического института 1'ЛН С.С.Протасооым. Длительность электрофореза - 24 или 40 ч при продолжительности импульса 100 ыш 150 о и напряжении 140-300 В или 45 ч при напряжении 240 В м комбинировании разных продолжительностей импульса (35 с в течение 10 ч, 150 с в течение 17 ч и 200 с в течение 18ч);

еще ОД1П1 варнаит - 140 ч при напряжении 40 или 50 В и продолжительности импульса 1 ч. Электрофорез проводили при температуре 12-!4°С. Для определения размеров хромосомной ДНК низших тришшосоматпд в качестве маркера использовали препарат ДНК дрожжей Saccharomyc'es cerevisiae.

Элскдэрпсрспос хромосомной ДНК на нитроцешполозкые фильтры осуществляли в аппарате The GcncLine System (Beckman Instruments, США) в течение 2 ч при У 5 В и температуре 13°С.

ОФридизацню. хромосомной _ ДНК трипаносоматид с меченным ИР зондом к генам рРНК (фрагмент клонированной рибосомной ДНК лрожжеК Saccharomyczs cerevisiac) проводили согласно стандартной методике (Маниатис, 19S4). Введение метки в зонд осуществляли методом "ник-трансляшш" с использованием [а-иР] дсзоксинуклеозщприфосфатов и ДНК-полимеразм I E.coli.

РЕЗУЛЫ АТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика полученных злектрофореграмм низшие •дм щ а; ю соШШЩ

Эхспсрименгцльно установлено, что наилучшее разделение хромосомных молекул ДНК низших трипалосоматид досшгасгся при длительности электрофореза 24 или 40 ч, продолжительности импульса 100 или 150 с и напряжении 140, 170, 220 или 300 В. Элсктрофорпрамчы различных видов жгутиконосцев, полученные при этих условиях, содержали от 9 до 18 зон хромосомнтлх молекул ДНК размером от 350 до несколько больше 1500 т.и.н. (тебя.2, рис.1-3). Ни у одного из видав не было обнаружено мини-хромосом - молекул ДНК размером менее 200 т.п.п., выделенных у ряда высших трштлиосомятид (Van der l'loeg el ni., 1984;

Таблица 2. Электрофоретические кариотипы низших трнпаносоматнд из родов Crilhiciia, Proleomonas, Biaslocrithiúia и Leplomonas.

Bra Штамм Диапа- Число Число Число Число Оценка

зон длин зон зон. зон, зон. чнсяа

хромо- хромо- содер- содер- со дер ■ хро-

сомны* сомных жащих жащих жапшх мосом

ДНК ДНК, вы- ДНК ДНК ДНК в

(т.п.н.) явленных олиоП доух более карио-

на карио- хромо- хромо- даух •тилс

граммах сомы сом хромо-

сом

Crilhiciia CFA 580-бопее 15 10 hs 0 20

fasciculate 1500 .......

C.tucíliae tCLÄA~ 580- более 14 10 3 1 20

1500

C.onco- COK 540-бопее 16 11 4 1 23

pelli 1500

Crilhiciia C4 350-более 16 7 7 г 19

sp. 1500

Proleomo- ZKA, 580-более 11-12 5-6 6 0 17

nas ZKB, 1500

inconstans ZKM

P.brevi- NBrA, 580-болсе 14 4 10 о . 24

cula NBrB 1500

Blasto- ЗМБХ 520-более 9 б г i 16

c.rithidia 1500

mir ¡darum

Leptotno- 101 700-бойее 16 14 г 0 18

nas pf.ter- 1500

L.myco- rSV69cf 370-1400 " 14 8 5 i ?Л

philus

Unabi- dir 565-более Г»7 13 г 2 25

culae 1500

Lep/omo- cfm!5 '6Ö0-1500 12-13 4-5 's 0 ?»

nas *p. (клоны

cfml,

cfmX; ......... ¡ ■

Gibson, ИоЫ, 1986; Engnmn tt a!., 1987; Masake el al., 1988; Dickin, Oibson, 1989).

В литературе указывалось, что крупные хромосомные молекулы ДНК (больше 1500 т.и.н.) можно рапелять, используя большие длительность электрофореза и продолжительность импульс«, а также низкое напряжение электрического ноля (Smith et al,, 1988; Van der Ploeg et а!, 19i>9). Н нашей работе при длительности электрофореза 140 ч, продолжительности импульса 3600 с и напряжении 40 или 50 В самые медленные фракции хромосомных молекул ДНК трипаносоматнд выявлялись на уровне ил» несколько выше маркерной отметки 1500 т.и.н. Следовательно, размер наиболее крупных хромосомных молекул ДНК у низших трипаносоматнд может лишь незначительно превышать 1500 т.и.н.

Путем 1ш>ри;и131щи|| хромосомных молекул ДНК Trypanosoma brucei с теломерными зондами (ССС'ГАА)п и другими высокоиоигоряющимпея последовательностями показано, что зоны и а элехтрофореграммах трипаносоматнд содержат шггоктные молекулы ДНК целых хромосом (Van der Ploeg et al., 1984). На этом оснсвашш принято считать, что число зон па электрофорараммах соответствует числу хромосом п ядрах у этих жгутиконосцев.-Однако такой подход осложняется тем, что выделяемые на электрофорараммах зоны окрашиваются с различной интенсивностью (см. рис. 1-3). Поэтому при ouemee числа хромосом мы исходили иэ предположения, что каждая из слабо окрашенных зон соответствует одной хромосоме, а интенсивно окрашенные зоны содсржаг молек>лы ДНК двух и более хромосом. Действительно, при использовании различных режимов нульс-злсктрофореэи некоторые из интенсивно окрашенных зон удавались разделять на цяс-гри слабо окраиглшыс зоны. В результате общее число хромосом устанавливали нл основании ачалнза нескольких шгктрофорегрямм.

На каждой т полученных в настоящем исследовании злектрофоретрамм н-тоюрое количество ДНК тдгрчанчщось г» юне старта и нспосрслсвепио под ciapuxtoit о чем спил-клыплуют окрашенные

6рчмнс1ым эшлигм цопт п отгчгциыт ранои.чх Ряпес были ичяпоплено. •по ot'iioniiNf'i часп, ocrcjoiiiri о'-о minnpir мшгрипзп сосптччнч мини И Man in о п.чи V iiiifi 1ч.п!.гикчЧ ..Uli' (От 'let PI«-, е et ;il , lux I)

Наши данные по локализации гсиоп рибосомных РНК, а также исследования других авторов, применявших специфические юиди к leimM "домашнею хозяйства" грипяно^оматнд (Gibson, Пот, l?Sö; Van der l'lotg et ai., i'!84; Engman etai., 1987; и др.; показывают, что некоторая чпеть хромосомных молекул ДНК (наряд)' с юшетоиллстнон /IHK) также может задерживаться на стар - е.

Элсктрофоретическне. кпрнртипы зртштазматидрола/УЛО'иНа Среди низших зриппносоматпд ролл Crilhidia злгктрофоретичесгие кариотииы исследованы у жутнкопосцсв четырех видов: C.fasciculuta (штамм Cl'A), C.luciliae (uituum С1.ЛЛ), C.oncopeUi (шгамм COM) и Crithidia sp. (штамм C4) (табл.2, рис.1).

Среди изученных видов крцгидий, только у C.fasciculuta и C.luciliae отмечены сходные .лектрофорешчеосие кариотииы. V згих видов на элехтрофореграммах выделено по десять слабо окрашенных зон. содержащих молекулы ДНК одной хромосомы, и пять (у C.fasciaihta) нлч три (у C.luciliae) более интснснвьо окрашенные зоны, которые включают молекулы ДНК, по крайней мере, двух хромосом. У C.luciliar одна зона, cj дя но относительной шггенсивности се огршиипания, можс! содержать молекулы ДИК трех-чеп.|рех хромосом близких размеров. Кирнопшы CJascicuiata и ('.ЫсШае включают, по нашим опенкам, одипчковое число хромосом - 20 (табл.2).

Элсктрофореграммы е'.олгорр/»' и Crithidia sp. существенно отличаются но числу зон и по размерам составляющих их хромосомных молекул ДНК от • злекгрофореграмм C.fascictdüta и С lur iliac (рис. I, табл. 2). У обоих видов присутствуют интенсивно кжрашеннме зоны, содержащие до четырех хромосом Как c;k,iJi" из ;ыишых 1аил. 2, обшее количество '<рочосом у C.onroprUi согпшляст 2.?, а у Crithidia sp. - 29.

Исследование злектрофоретичсского клрнотнна тонпашчомагкл штамма С4 прсдстапляло особый интерес, 1ак как его систематическое положение в настоящее время окончягеп.ио не установлено < 'ледугг отметить, 'по хотя жгутмконошеп зтою тгпмма по ряду признаков относчт К роду Crilhidirt, О.'ГНЗГО по чн>лу Vp'M^COM /?')) ОНИ ЧтЧШС'ТЬИО чтлпчаюгем Ol "лз ) lill.• 1ичlun ipt" ,tp\ niv n< f т^дорлич» г ti /.iimoiip.ii'pii'

1 г s ч s « -t л

Рис.1. Элеэтрофорсграммы низших трипаносоматид родов Crithidia и Leplomonas.

A. I - Crilhidia fasciculata (штамм CFA), 2 - C.oncopelti (штамм COM), 3 -C.luciliae (штамм CLAA), 4 - Leplomonas pelerho/fi (штамм 101), 5 -L.mycophilus (штамм SV69cf), На дорожке 6 - элекхрофореграмма дрожжей Saccharomyces ccrevisiae (штамм 334).

B. 1 - Leplomonas nabiculae (штамм d2T), 2 - Crithidia sp. (штамм C4). Пульс-электрофорез проводили в течение 40 ч при продолжительности импульса ISO с (А, Б). Стрелками с числами указано положение ДНК соответствующих, дшш (т.п.н.).

видов критндий. Близкое число хромосом (26) выявлено нами лишь у одной из лептомонад - L.mycophHus (табл.2). Обращает внимание и тот факт, что жгутиконосцы штамма С4 и жгутиконосцы L.mycophilus сходны по размеру самых маленьких выделенных у них молекул ДНК - 350 т.п.н, и 370 т.п.н., соответственно (табл.2).

Элясгрофоретические кариотипы трипаносоматидрода Leptomonas Среди лептомонад электрофор'"ические кариотипы исследованы у [.ермтопах ре1ег1ю/Л (штамм 101), L.»:ycopllilus (штамм 8У69сГ) и ипаЫЫае (штамм с12Т) (таОл. 2, рис. 1).

У ¡-..ре/егко/Т! среди 16 зон хромосомных молекул ДНК 14 зон пкчк члюз молекулы ДНК одной хромосомы. Две зоны содержат молекулы

ДНК не менее двух хромосом г.зждая. Всего, но нашим данным, в ядре у Ь.ре1егНо£Ц может содержаться 18 лрсмосом.

У Ь.тусор.ННих "э 14 зон хромосомных молекул ДНК восемь з^и, судя по относительным интеисивностям их окрашивания, могут включать молекулы ДНК одной хромосомы. Пять зон содержат молекулы ДНК, по крайней мере, двух хромосом, а одна зона может быть образована молекулами ДНК шести-восьми хромосом. Общее число X]" мосом у Ь.тусорЫШсоставляет 26.

У Ь.паЫси!ав 13 зон из 17 содержат молекулы ДИК одной хромосомы каждая. Две интенсивно окраше!шые зош.1 включают молекулы ДНК двух хромосом, тогда как две наиболее интенсивно окрашенные зоны могут содержать молекулы ДНК четырех хромосом каждая. Всего в кариотине у 1*паЫси1ае выделено 25 хромосом.

Эяестрофоретнчесуис кариотипы трипаносоматидрода Рго{еотппа\

Недавно па основании целого ряда признаков был выделен новый род низших тринаиосоматид - Ргаеоп-япа.ч (Подлинней, 1990). В настоящее время этот род объединяет два вида - Р.тсог&ст и Р.ЬгепЫа. С помощью метода пульс-электрофореза нами были исследованы кариотипы трех штаммов Р.шсопхыпя (2,КА, /КБ, ХКМ) и двух штаммов г.Ьи:.:ги1а (ЫВгА, ЫВгВ) (таол.2, рис.2).

Ил ^текзрофорегрпммах РЛпсотгап* выделено II (штаммы ХКА, ХКМ) ига» 12 (штамм 7.КВ) зон хромосомных молекул ДНК размером от 580 до более 1500 т.п.н. (рис. 2). Электрофореграммы Р.ЬгепЫа (пттаммы ЫВг<\ и. NБrB) содержали по 14 зон молекул ДНК того же диапазона длин (рис. 2).

Электрофореграммы штаммов 7,КА и ХК.М оказались идентичными. У каждого нз этих штаммов юн ела' > окрашенных зон из 11 включают молекулы ДНК одной хромосомы каждая. Шесть других, шненснано окрашенных зон, содержат молекулы ДНХ, по крайней мере, двух хромосом.

Электрофорегр.змма штамм 1 7.КВ отличается от таковых у штаммов 1?КЛ и 7.К М лгщп. наличием одной дополнительной слабо ограшпщоА зоны хромосомных молекул ДИК размером около 1300 тл и. Как пи.чю из рис.?. ноявкюше ззой зоны ил -лппроф^рарпмме пппмма 7.КВ сопровождайся

1 г з ч е е »

но ■vte гы

ws

№0

Pwc.Z. Здектрофореграммы низших тршшюсоматид родов Proteomonas и Blasiocrilhiciia.

I - Proteomonas inconstans (цпамм ZKA), 2 - P.inconslans (штамм ZKB), 3 -P.inconslans (штамм ZKM), 4 - P.brevicula (штамм NBrA), 5 - P.brevicula (штамм NBrB), на дорожке б - элехтрофореграмма дрожжей Saccharomyces cerevisiae (штамм 334), 7 - Blast ocrithidia miridarum (штамм ЗМБХ). Пульс-электрофорез проводили в течение 40 ч при продолжительности импульса I50 с. Стрелками с числами указано положение ДНК соответствующих длин (т.п.н.).

снижением относительной интенсивности окрашивания зоны молекул ДНК размером около I500 т.п.н. Из этого следует, что присутствие дополнительной зоны хромосомных молекул ДНК на электрофорсграмме штамма ZK.B, по-видимому, связано с изменением размера одной из его хромосом.

По нашим оценкам, каждый из трех штаммов P.inconslans содержит в кариотипс по 17 хромосом.

Штаммы NBrA и NBiВ имеют сходные элсктрофореграммы. У каждого из них среди [4 зон четыре слабо окрашенные зоны, вероятно, включают молекулы ДНК одной хромосомы, а десять интенсивно окрашенных зон содержат молекулы ДНК, по крайней мерс, двух хромосом. Общее число хромосом у Р brrxiaila сосзавляст 24.

Д" и< лллип о времени нрок'омонад ошосили к роду Crilhidia. В связи с мим iin'cpfuTi lor '|mki, 'но н у нрогеомннпд, и у двух видов крнтшшй

(CJascicvIata и C.luciliae) нямч выделены хромосомные молекулы ДНК одпнлкооого диапазона длин - от 580 т.л.н. до несколько бо.гыне 1.5 м:ш н.н. Однако по числу зон на злехтрофорараммах зпг >гаугико/юсны различаются (табл.2).

Олектрофоретнчсаашкарнотшгт^ ß/astorrilhidia

nnriiidrum

Среди низших грипаносоматид рода Blrutorriihic'in

элсктрофорсшческий карнопш исследован у жгутиконосцев одного вида -ß.miridarum (штамм ЗМБХ). ЭлсктрофорС1рамма B.mirit/arum содержит девя1Ь зон хромосомных молекул ДНК размчюм от 520 до иескол!.ко более 1500 т.п.н. (рис. 2). Судя по присутствию на ней двух зон, включающих молекулы ДНК двух хромосом, и одной зоны, вюгычаюшей молекулы ДНК до шест» хромосом, ее карнотип содержит всего 16 хромосом. Следоваг ьно, жгутиконосцы B.miridarum отличаются от всех остальных исследованных нами видов низших трипаносоматид как по числу хромосом, так и по размерам хромосомных молекул ДНК (табл. 2).

Внутривидовой полиморфизм ЭдЧСКЛХЗофорСТИЧССК!^ KajJHOTVlllqB

JjipJonjoiiussjK

С целью изучения внутривидовой изменчивости члатрофоретическне карнопшы бьши исследованы у десяти клонов гршгопосомяшя Leptomonas sp. (cfrnl - cfmX). Все десять клонов были нылепенм из одаого иппмма - cfml5, полученного из китечннка лесного клопа Nnblcula flavomniginata. На злектрофореграммах у различных клонов Leptmwnas .г/г. выделено по 12-13 зон хромосомных молекуд ДНК йаб.ч. 2, рлс. 3).

У ссми клонов ¡л'рттопах sp. (cfml, cfmll. cfmlll, cfintV, cfmYMI, < CmlX н cfmX) при всех нснодьзоншшых >слоштх фракционирования ДНК не выявлено о птичий на члгкзрофорнраммах. У кахиш'О из hid клоноп, но крайней nq>e, восемь mntiicimno окрашенных зон содгргжщ мпчеку.чн ДНК дчух хромосом, а чел.гре слябо окряпютые 'оны нклгощлт моч.-wm i ДНК одной хромосомы

1Ц 1ач

ri( /Я щ «» J? ^ ^ <

Рис.3. Электрофореграммы клонов Leplomonas sp.

Пульс-электрофорез проводит: в течение 24 ч при продолжительности импульса 100 с (А, Б), в течение 24 ч при продолжительности импульса 150 с (С), в течение 40 ч при продолжительности импульса 100 с (Д). На элопрофореграммах А, Б и С можно сопостпшггь электрофоряические кариотипы всех 10 исследовании* клонов Leplomonas sp. Стрелками с числа»'!! указано положение Д1IK соответствующих длин (ти н.).

Электрофореграммы трех других клонов (cfmV, cfmVJ и cfniVll) содержат по одной дополнительной, слабо окрашенной soné молекул ДНК. У клона cfmV эта зона расположена в районе маркерной отметки 991 l.iui., у клона cfir.VI - на уровне маркерной отметки 1285 т.п.и., а у клона dmVII дополнительная зона находится несколько выше маркерной отметки 1285 т.н.н.

У клона cfm VII появление дополнительной слабо окрашенной зоны сопровождается снижением относительной интенсивности окрашивания другой, расположенной рядом, зоны хромосомных молекул ДНК (рис.ЗА,Г>) и, по-видимому, является следствием изменения размера одной из хромосом в кариопте этого клена. Присутствие дополнительных зон на злекгрофореграммах клонов cfmV и cfmVI не сопровождается заметным изменением относительных интенснвиостеЛ окрашивания или электрофоретических подвижностей других зон (рис.ЗБ,С,Д). Обычно такое изменение электрофореграммы у одного из близкородственных клонов спязывшот с появлением в его кариотипе дополнительной, третьей копни какой-либо из хромосом.

Число хромосом у всех исследованных клонов Lsptomonas sp. равно 20 (табл. 2).

Таким образом, по нашим оценкам, в кариотнпах различных видов низших трткшосоматид содержится от 16 до 29 хромосом. Наименьшим числом хромосом 06) характеризуются жгутиконосцы B.miridarum (ппамм ЗМБХ), наибольшим (29) - жгутиконосцы Crithidia sp. (штамм С4). Самые-маленькие хромосомные молекулы ДНК (350 т.п.н.) обнаружены у Crrlhiiiia sp. (нгтамм С4). У большинства видов размер самых крупных хромосомных молекул Д11К составляет несколько больше 1500 т.п.н.

До появления метола пульс-электрофореза о числе хромосом у трипаноеоматид сулили по ко.тичеству выявляемых в м1ггозс электроннопч-щых бляшек, которые, на основании цитохимических и морфоло! песких данных, рассматривались как кннетохоры (Vickeinian, Preston. '470: Я'Чял, 1983: Rolan et al., 1985; Peterson,. Woo, IW;

Tncmcr ч а!.. I'W; Skarlnlo et al., 1987: Скарлато и др., 1990). Обращает н.з себя кшш.-шчг ь>1 флк:, что с помощью метода пульс-злогфофореза г. ядра*

у трипаносоматид выявляется значительно больше хромосом, чем было установлено palies электронно-микроскопнчески на оаювшши подсчета юшетохороподобных бляшек.

Так, судя по числу бляшек, в ядре у Crithidia fascicvlata может находиться лишь 5 хромосом (Solan, 1983), тогда как электрофорез позволял выделить у этого вида 20 хромосом (табл.2). У tilaslocríthidia triatomae, по данным электронной микроскопии, содержится 3 хромосомы (Solari, 1985), а у B.miridarwn по результатам исследований методом пульс-электрофореза - 16 хромосом (табл.2). Такое несовпадение результатов в определении численности хромосом даумя разными методами согласуется с гипотезой, но которой у трипаносоматид лишь часть хромосом имеет кинстохоры и сегрегирует в митозе при их участи (Skarlato, 1989). В соответствии с этой гипотезой, остальные хромосомы жгутиконосцев разделяются случайно или при помоши вытягивающейся интактной ядерной оболочки.

В настоящее время мноте исследователи пришли к выводу о диплоидности ядерного генома трипаносоматид (Lanar et al., 1981; Borst et al., 1982). Вместе с тем, на основании анализа электрофоретических кариотипов рядом авторов выекпзывалбеь предположение об плеунлоидностн'Ошсомни по одним хромосомам и моно- или подисомии по /ipyiKM хромосомам) некоторых видов трипаносоматид (Van der Plocg et al., 1984; 1989; Bard, 1989; Bestien et al., 1990). В данной работе присутствие на кариогроммах у всех жгутиконосцев зон хромосомных молекул ДНК с различными относительными нлтемсивногтямн окрашивания также свндетеш.сгауст о возможной анеунлоидности трипаносоматид.

Исследование эдектрофоретических кариотзтов низших трипаносоматид является перспективным для систематики сем. Trypanosomatidae. В то же время, показанный в настоящей работе внутривидовой полиморфизм элехгрофоретичегких кариоишов низших грппаносомнтид на примере Proteomonas mronxlnis и Isptomonas пр. вмегге с данными литературы (Van der l'loeg et al, 1984; CHhson, Mile?, I9R6; linnrran ct n!., 1987: Hastien et al. 1990; Подлипясв н др . 19ч1) евнлетельсгвугг о.том, «по молекулярные карнотнпы не Moiyr был. исиолмопяим п качестве стпбилын •IX Р1ТДОПМХ ffpiUMflKOB. Tltf, HC* f f/»r?#tf *f Д/ЧШМ1-', СрггШ Í^H'X иияммон /'iotamuman incMwwm нипммп (УК \, 7KM) мчпог

одинаковые элекзуофореграммы. Однако, электрофорсфамми третьего штамма P.inconsins (ZKB) отличается от первых двух (ZKA, ZKM) присутствием по крайней мере одной дополнительной зоны хромосомных молекул ДНК размером около 1300 т.п.н. Среди десяти клонов Leptomonas sp. у семи клонов (cfml, cfmll, cfmlll, cfmlV, cfmVIII, cfmlX, cfniX) нами обнаружены идентичные электрофорешческие <сарнотипы, тогда как три других клона Leplomonas sp. (cfmV, cfmVI, cfniVII) имеют отличающиеся кариотипы.

Локализация генос рпбосомных РНК у низших тринаиосоматид У высших трнпаиосоматид (нредставчтелсй рода Trypanosoma) последовательности, кодирующие рРНК, были выявлены среди хромосомных молекул ДНК размером не менее 1500 т.п.н. (Van dcr Ploeg et al., 1984; lineman et al., 1987). Методом гибридизации no Оаузсрну в настоящей работе была исследована локализация генов рРНК у Pro'eomonas mconslans, P.brevicvla, Crithidia fasdculala, C.luciliae, C.oncnpelti, Leptmncnas peterhofjl и L.mycophilus. Последовательности. гомологичные последовательностям генов рРНК, обнаружены нами во фракциях наиболее крупных молекул ДНК размером несколько больше 1500 т.п.н. Такое сходство хромосомной локализации генов рРНК у низших и высших зрнпаносоматид подтверждает генетическое родство различных групп жгутиконосцев семейства Trypanosomalidne. Кроме тога, факт гибридизации зонда к генам рРНК дрожжей с хромосомными молекулами ДНК низших грнпаносочятид свидетельствует о, по крайней мере, частичной гомологии -нуклеотидных лоследовате;п>ностей рибосомных генов дрожжей и зрнпаносоматид.

ВЫВОДЫ

I. Определены о1Ш!ма;гмтые условия фракционирования инзакзцых хромосомных мозскул ДНК низших триианосомятид методом пульс-■<лп-"грофореза. Наилучшее разделение большинства хромосомных мотскул ДНК шпншх ipiit!;iHoro;inrir,! получено при длительности злпггрофореза

24 или -10 ч, продолжительности импульса 100 или 150 с и напряжении 140, 170, 220 шш 300 П.

2. В ядрах 11 видов низших гомоксенных трипаносоматид из родов Leptomonas, Crilhidta, tílastocrilhidia и Proleomonas выявлено от 16 до 29 (у Большинства видов - 20-25) хромосом с размером хромосомных молекул ДНК от 350 до несхолько больше 1500 т.п.н.

3. Ни у одного нз изученных видов низших трипаносоматид не обнаружены так называемые мини-хромосомы (ядерные ДНК размером менее 200 т.п.н.). Тем самым подтвержден тезис о том, что мини-хромосомы являются специфическим элементом ядерного генома лишь некоторых представителей рода Trypanosoma.

4. Выявлен внутривидовой полиморфизм элехтроформнческих кариотнпов у жгутиконосцев Proleomonas inconstant и Leptomonas sp. Это затрудняет использование электрофоретнческих кариотнпов в качестве видовых признаков у низших трипаносоматид.

5. С помощью гибридизации но Саузерну установлено, что теш.1 рибосомных РНК низших трипаносоматид локализуются на крупных хромосомах с размером молекул ДНК 1500т.п.н.'и несколько больше.

Ошсокрабог, опубликованных до теме диссертации;

1. Марахова (Сомова) H.H., Скарлято С.О., Фролов А.О., Цуладзе A.M. Полиморфизм молекулярных кариотнпов низших трипаносоматид // Цитология. 19«1. Т 33, №10. С,59-66.

2. Марахова (Сомова) II.В., О.прлато С.О. Электрофоре!нческие карпопшы и локализация рибосомных генов у низших гринаносомагид II Пнтолошя. 1992. Т.34, Ш. С.94.

3. Марахова (Сомова) Н.В., Скврнато С.О. Вприябелыюсгь злекгрофорешчсских •, кариотпноп у '»аумпсоиоснгп-трнпяносомптнд. 01Н0СЯПП1ХГЯ к разным родам, вилам и клонам Ц Цщолотя. 1993. Г.Э5, №10. С* 82-ЯЗ.

4 Mapnvmn (Сомопп* И В., Скпрчшо ('.<">., Фртов А.<\ Мо.чп^упярныг трпотны тпптх (рппяжчоммн'Л II пртч нсгомптгя Огсно'шоночпмх жпшчиьп. г\ I! , 1 <><>.? Т.?. (МОД

5 Skíulato S.O., Bobjlcva N.N., Maralchova (Somova) N.V. Cliromokoraes of the lower trypanosomatids //Abslr. IX Itilern. Oongr. Protozool. Berlin, 1993. V. 119.

6. CoMOitH H.B. Элскгрофоретичсские кариотины ничн/их ipi'iiaiiocoMaTiw // Генетика. 1994. T.30 (приложение). С. 150.