Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ первичной структуры фрагмента консервативной области максикольцевой кинетопластной ДНК Crithidia oncopelti

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ первичной структуры фрагмента консервативной области максикольцевой кинетопластной ДНК Crithidia oncopelti"

г 110 9 0

а

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.155.2

. КИМ ГВАН ИР

АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ФРАГМЕНТА КОНСЕРВАТИВНОЙ ОБЛАСТИ МАКСИКОЛЬЦЕВОЙ КИНЕТОПЛАСТНОЙ ДНК СИГШГОГА ОНСОРЕШ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

С

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологик биологического факультета Московского государственного университета им М.В.Ломоносова.

Научный руководитель - ведущий научный сотрудник,-

кандидат биологических наук

A.А.Колесников

Официальные оппоненты - заведующий лабораторией ИМБ АН СССР,

доктор биологических наук П.М.Рубцов

- старший научный сотрудник, кандидат биологических наук

B.Н.Ксензенко

Ведущая организация • - Институт Общей генетики АН СССР

Защита диссертации состоится !* " '_ 1990 г.-

в _час. на йаседашш специализированного Совета Д.053.50.70

при Московском государственном университете им М.В.Ломоносова

С диссертацией мозшо ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу: 119899, Москва, МГУ, биологический факультет.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

_1990 г.

/' / /

В.Н.Каграманов

цел |

та^ДкТЗальность теш. Исследования кшетопластной Йокогйриальной) ДНК - кпДНК - трипаносоматид составляют важную пасть в современной молекулярной биологии и молекулярной разитологии. Достаточно упомянуть о таких ваших и еще до" ща не решенных проблемах, -как способ репликации слоядаой тологической структуры, состоящей из нескольких тысяч генированных молекул; способ компактизации такой структуры 1п регуляция экспрессии ее компонентов, включающая как эрдинированную . экспрессию миникольцвЕых и . максикольцеБых лекул в процессе "редактирования", так и дифференциальную гивность максикольцевых 'гонов на разных стадиях жизненного хла паразита. Сам процесс "редактирования" максикольцевых энскриптов представляет собой ранее не встречавшийся способ, эцессинга РНК. Очевидно, что установление первичной структуры лекул кцДНК представляет собой необходимую предпосылку решения ких задач.

Организация генов у паразитических простейших представляет и состоятельный интерес. В связи с неудовлетворительностью атериев,' используемых в систематике т'рипаноссматид, необходима зработка геносистематических критериев. Представляется лесообразным дополнить сведения о последовательности рибосомных К информацией пс белок-кодирующим генам. Кроме того, в связи, с явлением - в. дивергентной области', максиколъцевой молекулы ЦЫ<Иа опсореШ протяженных открытых рамок • считывания обходимо иметь информацию о кодовом словаре, используемом'этим ганизмом, для того, чтобы определить "вероятность кодирующей нкции у этих рамок. В связи с этим для детального анализа был' бран фрагмент . консервативной (кодирующей) области ксикольцевой молекулы, предположительно содержащий редактируемые последовательности.

Цель и задачи работы. Основной целью данной работы являлось ределение первичной структуры фрагмента консервативной области

руководстве работой принимал участие

учный сотрудник, кандидат биологических наук Д.А.Маслов,

максиколъиовой гаш-зтопластной ДНК Crlthidia oncopeltt, содежащего гени 4-o.t и 5-ой субъеданиц ИАШ-дегидрогеназы (ND5 и HD4) и субъэдпнкцн X цитохромоксидэзы (COI)

Экспериментальные задачи:

- провоста субклонирование исследуемой области;

- установить первичную структуру исследуемого участка;

- провести анализ полученной нуклеотидной последовательности.

/

Научная новизна. На осноЕе прочтения последовательности нуклеотидов фрагмента консервативной области максикольцевой ДНК длилой около 4 тысяч пар нуклеотидоВ (т.п.н.) установлена первичная структура генов ND4, ND5 и большой части гена coi. Определен кодовый словарь, используемый в этих генах. Определен уровень гомологии их первичной структуры с соответствующими генами из других организмов на нуклеотидаом и аминокислотном уровнях.. Установлены особенности нуклеотидного состава, . спецкфпчииа для кодирующих участков.и мекгенных'областей.

Материала и метода. -Для субклонирования и последующего соквеРЛфСЕ-зння исследуемой ДНК были использованы векторы pbiuo.'ioript ks(+), sk(-) и pTZi9R. Использовали штамм -E.coli ■ J.V109. Для получения однонитевых форм* соответствующих плазмид принаняли фаг-помощник М13К07.

Выделение плазмидной ДНК, рестрикцию, лигирование,. ололтрофорез поводили согласно руководству Маниатиса (1934).-Ксдасюиткне клетки для трансформации готовили кальциевым методом или с использованием полиэтиленглкколя и диметилсульфата (Chung, Milier, 1983). Стратегия соквеиирования была основана на-получении долепленных производных плазмид с применением нуклеаз Jüoin и si (Hcnikofí, 1934). Однонитевую ДНК .выделяли по методу, рекомендованному в руководстве фирмы Stratagene. Нуклеотидную последовательность ДНК определяли 'по . методу Сэнгера.

Для анализа нуклеотидной последовательности, использовали ■ пакет программ сепЪее (кооператив "Комби"), а также программы для ib:í ' pc, люСозко прздоставлэнныэ F.Corpet, V/.Реагзоп, Д.Г.Пестовим к Р.Ф.Накиповам.

Результаты и их обсувдение. 1. Определение последовательности фрагмента макскхольцзвой ЛД.

Исходным материалом для работы явился клон а.Со5, содержу HindIII-фрагмент Н2НЗ максикольцевоЯ ДНК (RíeЛ), клокировакш;; в векторе A.Charon8 (получен Д. А.Масловки). Фрагмент был бвдолск с помощью препаративного электрофореза и клонирован з векторе-pBluesoript KS(+) в обеих ориентациях для того, чтоби можно Скло секвенировать обе нити. Однако, только одна ориентация оказалась пригодной для последующей работы (та, где с сайтом огсгига пржогэ праймера соседствовал сайт Н2). Непригодность прожвслолэкзоЗ ориентации была связана с наличкам дополнительного сайта "неспецифического" отжига прямого праймера с пакуомо^ нитью ЛКК. На основе применения стратегии экзонуклэазного укорочен;:.- была прочитана почти полная последовательность клонированного фрагмента. Полное прочтение по этой нити било яевогмозк-зас из-за-сильной неспецифической терминацки во всех четырех типах реакции полимеризации, происходившей в двух участках, со дерганое блоки олиго-С.

Для прочтения второй нити фрагмент бал к.лонирозан в соответствующей ориентации в векторах pBiuescript sk(-) и pTzigR, в которых секвенирование проводили с обратным праймером. Трочтение значительной части последовательности этой нити, зключающей все недостающие участки, позволило воссоздать полную тоследовательность интересующей области. Хотя не вся полученная тоследовательность была определена со двум цепям, практически саждая нуклеотидная позиция была идентифицирована • на основе шзависимого прочтения, как минимум, двух разных делзцисЕшх

фоизводных.

В итоге была определена последовательность длиной 4200' [уклеотидов. Стратегия секвенирования проиллюстрирована на Рис.1.

. Анализ полученной последовательности.

.1. Наличие генов coi, ND4 и ND5 в секвенирозанной области.

Ранее (Muhieh et al. 1983, Маслов с соазт. 1934) óns.o оказано, что у разных трипаносокатид в консервативной области асположение генов является колинеаршм. Сравнение кекткмькш«: элекул - L.tarentolae и T.brucei на нуклзотндном урси-у-эдтвердило этот вйвод. • Сопоставление определенной: яю«г эследовательности из O.onccpeltl с этими объектами кетсдсм

. 3

CONSEBVANVE I(Q)ON

ЖТГ

лее* t и ■ i ■ тт: 'f __¡£_

и) u) Ml IJ3 , M YJ <BJ2 yj

■.".I 1 ¡ж

ИЗ i

Рис. 1. Рестриктазная карта максикольцевой ДНК и стратегия секвенирования. А: Расположение фрагмента, клониро-■ ванного в составе Л.С06 на максикольцевом геноме. В: Генетическая и рестриктазная карта анализируемого участка. Стратегия секвенирования показана стрелками. Е - Ввр1, Н - Н1п<Ш1, В - ВатН1, и - Б<1и1, М - Мзр1, °У - ЕсоКУ, в - ВбШ.

НсОД

Рис. 2. Сравнение после вательностей максикольи вых фрагментов из трех трипаносоматид методом dot-matrix. Программа RUSTEM (Р.Ф.Накипов). А и Б: C.oncopeltl vs l.tarentolae, В и Г: T.brucel vb C.oncopelti Размер окна/число совпадений: 21/18 (А и В), 31/21 (Б и Г)

2

it-matrix при величине сканирующего окна 21 и числе совпадений

1 выявило наличие гомологии с кодирующими участками генов coi, >4 и ND5 (Рис.2, А, В). Диагональ, соответствующая гомологичным юледоватэльностям, однако, не является сплошной, прерываясь в икгенных областях.

Поиск открытых рамок считывания показал, что в 1оледовательности фрагмента Н2НЗ присуа-лвуют три протяженные 1мки, расположение которых соответствует расположению участков К, гомологичных к вышеупомянутым генам из L.tarentolae и brvcel. На Рис.3 показаны результата транслирования ализируемой -последовательности. Оказалось, что, как и у двух утих трипаносоматид, ориентация гена COI противоположна по авнению с генами ND4 и ND5. Для "нередактируемых" генов ипаносоматид характерно наличие триплета ATG в начале рамки и непрерывность. Сохранение этих свойств показывает, что и у oncopeltl транскрипты генов coi, ND4 и ж>5 не подвергаются дактировашпо.

2 Геномная организация генов coi, ND4 и ND5.

Как и другие штохондриальные гены трипаносоматид, гены coi,

4 и ND5 С.oncopeltl не содержат интронов и не перекрываются, концевая часть гена coi оказалась расположенной за пределами квенированного фрагмента. Определенная нами часть содержит 340 иплетов, что соответствует &2% полной длины. Ген расположен на шлементарной нити максикольцевой ДНК по отношению нити, на торой расположено большинство других генов. Ген ND4 кодирует '

5 аминокислот, транскрибируется в том же направлении, что и ген. 5, а также ранее определенный ген 12s рРНК. Ген ND5 кодирует

3 аминокислот.

Для того, чтобы выяснить вопрос о том, обладают ли пирующие участки последовательности какими-либо- чертами, пичающими их от ■некодирукищх, было исследовано распределение июотид.ов по- одной из нитей ДНК. Приведенные на Рис.4 зультата показывают, что наиболее отличительной чертой эйсерных участков является наличие в них дискретных G-богатых и богатых кластеров нуклеотидов. При этом G-богатыо кластеры ируживаются непосредственно перед 5'-концом гена ND5, а также > другой нити) гена coi. Ген ND4 с двух .сторон ограничен' 5огатыми кластерами. В пределах самих генов обнаруживается

5

G

COI

N'D5

1

A

»M lúo ioA ¡Í-4íi'J¿ (»uiijüiiiClilíM jiwli^d

c. 4. Графический анализ распределения нуялеотидов вдоль нити ДНК. представленной нз Рис.3. ЩЯгракма roo (Д.Г.Пестов). волпчина окна 100, паг 20. Пунктирная-линия соответствует среднему значению. Ось ОХ -длина в п.н., OY - процентное содержание.

ч_______

coi

иол UOS

Р

Рис. 5. Графический анализ асимметрии GC-состава в мак-сккольцевой ДНК С.опсореШ (С.o.j, L.tarentolae (L.t.), Т.bruceI (т.ь.) в области генов COI, ND4. ND5. Ось OY разность между содержанием G и С (в %). Остальные параметры как на Рис.4.

' у V

" W"> »"««»íTfi» .Т»-! |"»Гíl» ñ'J ÍTJTúá «Д Iti""^"

которое обогащение кодирующей нити тямидинами, несколько бсш» льно проявляющееся в «случае гена coi.

Обнаруженные особенности могут иметь функциональное oimeir/o

в том случае, если они являются эволюционно консервативными у трипаносоматид. Рис.5 показывает, что дифференциальные профилг GC-состава из трех трипаносоматид. обнаруживают удивительное сходство в наличии и расположении G- и С-кластеров. Вместе с 'том,как следует из множественного и попарных выравниваний (данные но приводятся), в этих участках не наблюдается заметной гомологии последовательностей нуклеотидов. Таким образом, возможно, решающим в функциональном плане оказывается сам факт наличия подобных кластеров.

Сходным образом на основе сопоставления полученных наш: данных с опубликованными в литературе было' установлено, чтс Т-обогащение кодирующей нити свойственно всем митохондриалыши белок-кодирущим генам трипаносоматид (за исключением интенсивно редактируемых). Это свойство может быть использовано для идентификации новых кодирующих последовательностей, в частности, в дивергентной области максикольцевой ДНК.

Моию заметить вместо с тем и некоторое различие е ' организации нуклеотидной последовательности между генами, расположенными на разных нитях. Сравнения, выполненные не Рис.2,Б,Г при величине, окна 31 и числе совпадений 21, показывают наличие множества сайтов неспецифического сходства в пределах генов HD4 и ND5 и между шага. Детальный анализ показывает, чтс большинство из них расположено в участках, занятых короткими гомополимерными последовательностями. В пределах гена coi степень сблоченности одинаковых нуклеотидов оказывается меньшей.

2.2 Уровень эволюционного консерватизма генов COI, ND4, ND5.

На таблице 1 представлены результаты определения "гомологии", выраженной, как относительное содержание идентичных аминокислот и нуклеотидов, в исследуемых генах из трипаносоматид и из ряда других организмов. Величины были получены на основе построения оптимальных выравниваний программой align (w.Pearaon). Данные показывают, что наиболее консервативным среди исследуемых генов является ген coi, гомологичный на 80s среди трипаносоматид. Оубьединицы гонов ND проявляют меньший уровень эволюционного консерватизма. Эта тенденция проявляется еще более ярко при сравнениях генов из C.oncopcltl с генами Uetazoa. В то время как гены coi гомологичны на 41-435 (на уровне аминокислот), уровень гомологии генов N1)4 и nd5 опускается до значений, не намного

превышающих достоверные. В этих условиях большое значение приобретают другие критерии оценки близости генов.

Таблица 1

Относительное содержание (5S) идентичных аминокислот (нуклеотидов) в генах coi, ND4 и ND5

Организм COI I 1Ш4 ЩГ

L. tarentolae 80, ,3 (79,0) 73, ,0 ID CO > 74,6 (78,8)

T.brucel 78, ,2 (78,4) 64, ,8 (74,9) 69,8 (77,2)

D.melanogaster 40, ,7 (58,3) 22, ,0 (55,1) 22,6 (52,8)

СCOI - yakuba)

Я.sapiens 42, ,7 (51,2) 1 9 : ,7 (42,9) 19,1 (41,0)

Среди этих критериев важным и часто используемым (особенно при сравнении структуры мембранных белков) является профиль их гидропатии. Отражая идентичность функций родственных белков, наличие и- расположение гидрофобных/гидрофильных доменов часто оказывается более консервативным признаком, чем сама первичная структура. На Рис.6 представлены профилии гидропатии исследуемых белков из C.oncopeltt и других организмов. Налицо определенное сходство профилей, выражающееся в сохранении большинства гидрофобных доменов у трипаносоматид по сравнению с Uetazoa. Это сходство особешю ярко выражено у coi, где по сути не наблюдается различий в число и расположении гидрофобных домэнов. Среди отличий в случае ND5 заметны следующие: домен III представлен у трипаносоматид двумя доменам; слабо выраженные "у Uetazoa N-концевые домены XVII и XVIII у трипаносоматид представлены тремя хорошо различимыми доменами.

Другим важным свидетельством правильности идентификации генов может служить наличие инвариантных аминокислот в соответствующих позициях. На Рис.7 представлены результаты множественного выравнивания аминокислотных последовательностей COI, ND4 и ND5 из ряда эукариотических организмов с помодьп программы миътАЫК (P.Corbet). Порядок взагаорпспо.лс;:.-".'л последовательностей на выравнивашш определяется на осноь-. и::; предварительного иерархического кластерирования, и, nwi-.::,', каждая последовательность соседствует с наиболее влппенип к г-

СОI N04 N05

Рис.6. Сравнение профилей гидропатии митохондриальных белков. Римскими цифрами обозначены отдельные гидрофобные до-мо!Ш. СО - С.опсореШ, ЬТ - ЪЛагепЮХаз, ТВ - Т.Ъггхсе1, ш - í).meгanogaзíeг, РУ - Ь.уакиЬа, из - Н.8ар1епз.

v«» епешмт i cf*>'»»iftn»e

I • «II in

IT ♦•fViCt-»Ctr.»»>'<HIOtcnL»*lLS!¡rVOTifr»(.rTB1.RU)LIOCeil.rC0T'.Pr«l't!13»«:LlK»f APIHT«f*'-:;i.VeTI'íf>¥KACFI rfvrPHH""M."rv«Tl AirOC*

IB »TPtCl¥TIJI»0H*l»lfllC,VlL*AJl<,GPt<mT4t.rieLei.6l leCCVlFOPrePT*n.iTC«CllMvf AMltf ITWJcrim»r»*¥Cft'!>*VrPal»f*.''r*4M0~.-0<:t.

o K*k,:r:t.,,cijy5(¡if»¡rcHrvj.LV»ii."Wi^TiT3Lr [BtrneiiGcevLfceYevTKvLmne'-VMvrAf ]»-PVHWot.v*Y»»pvu^<4'i"vrim*f,fuiP.,MFf«vo¡'«-.»i.

CI PS*«!, r87<»li»010TLTr tP0*W*OIVCTOl»!L!VAPLOm><3í. Л100041 ГНУ !П *МАГ 11) РРI» IP it I 11 GAPS l АГГ'В If К1» РкП 1 ГГА1 J'.Ct

.-Я * Fit.! ML MTsHSMOTtT! LrC»V4ü»lCTiL8l,LieAÍLOepC«. . 1ХСИГЧ1 IVKTI VTARAJ» 1 1 FFIV ! PI П Ih.FC. ни: V?L 11S «f С л» t С P I brf > ? »4 I i'f'i.J t.L

t<C S.aT'lí'iiO :G''LTL¡rAirf':LLCTiT3rL If</L^',!'íriir!á. 1 С-к.«Г< i Г' £.»Wrí'HTi'(([ K«!*frft.Li>r-iff-LU.

rj .. /эгаь. rsrsH<;r>icn,TFire4!in»>HTc»8T4írtFLAwrat)eiwyiK"ui.T*»» !ТАИ)Л*1ггвУ.<рмкльси1^*Р1иа?ррМАрРИ*!»;эт t.t'rin.u.i,

r~ m lí murcie iTu.r» o ct su.jb it(.a ra i w a тттк* mrf *np кого* r, l í¿

: i» se te «t se to то it* г* loo ко «¿o

8 * • If »

l.T «>t.fLT>;>-"P<H¿»rri.TVTLie4,'?a'4SLAi-C'F»íU'«*W.LCI3ail.i43J*LL(m ГГСаВКГТвПЛИВ1.Г1У»и.тП tUTtPVi fc'-^TLí ^D'íHPffTJT'OYY'H'.COI.> I T8 \-'.on.Tf,,:yfi»CVTLTPTLH,IL,PIÍ,V5U'"UfIIPt!»»'Lei0Sim»t«**OI t IT С I: 111 IT? FX l «ТТ. Г! WGAU ТВ ILLi JTU,Vl.ASCVTl.l.LCr».«r«3)'"n>VVi.i5 oi.irtf а « «CLI.TCCC^UWTKr!'TCI>:rF''b.-r^í.íCKrr»-ríV5LW'Bír( KXlieilX'n.rcri'íCmrun.-nmxaLITlLlLtlTtrti. чИ.ГТьПСГРГГШТцтук^ЫКи.ЬП

í-í fr3aCir-^*CT<JrfTirrri&e*«b!«r.VB/:>L»irMBI30»SaLL<V4«rirTl»>'t'HTPCI1!l f!ri.»!.rt3«AT*ITA»UXLai.P»1.i-l*IIHLl.!PI.4rtHBfr?7*'^C14>Jl.re

on«* t iig ctovt tvfl cria ito itolsl «milcjiirmi * ■ l> к rtn» uuíuíu«:t и.тсг*?хтсг в *.->"л|>?г1рч

к« »»в is* i«o it • н» m te* sit sit tsa c««

» # VI fit »til

7» ЛГ*ГРС UPETTlIILF VFOLV41I t8TT3'»C »Fná»A!> I TF.IU.L 1ЯПЛКРУ*АЯЬ?ГГТ*С1<0ТОеЯ4ТРСЯТГ'ГС.те1РТС I ILfKWI ТЙП.ПГ-К' 1ГГ»I CO в: 7w-fri-»M>tlíTm!PVrüllOT«>»fm.<.f4C T??StMrr4MILI»JierfTW»RMWÍTrKSTrTIA,frtMTTfT.U;U,rCItl.r*>frT9FLr7rFlltri¡* , ВТ Г ' FWFFOHPgrT !(.! tPttf GI !SH I 1WKIC* IETF" Д 1-й! HAI1.Í 1CL1 GFJ VWH trTVIlODTRi YFTS1T 111 А'ГТШ JFEV1 ЛТкЖ! eLBTTIí'í Hwi

WC их rvry-'írí/TH IIPC'tnnrjíJA^tlíS, r*GTlGKy»Arí«niC!l.OFJ»W3I,.10inTCLOn>T»ArrriATT,IIlVPTCUIFOWl.»rCTVaIBL7

Г! H'f FCHPFTT tt. tWCFC. i Í37 | У ft К Vil ÜHtTAMI Щ tCF yuAKbhfTVC е>Т1В*ГГТПАТ lift PTClí P V *T tí

!5t 1-KS IT* ZDS 29* 30 9 11« 31* 33« Itl )«•

Рис.7. Множественные выравнивания белковых продуктов генов coi (А), ШЭ4 (Б), ND5 (В) из митохондрий трипаносоматид - G.oncopelti (00), LAarentoloo (I/P) ♦ Т.Ъгисэ1 (ТВ); насекомых - В.усйшЬа (DYu'D.melanogcister (dm); человека (HS); грибов - И.сгазза (по), A.ansteloóaml (М); растения O.bertertana (ОЕ) и хлоролластов N.tabacm (ciot). Програша multalin, таблица весов - таблица частот аминокислотных замен • Dayhofí, "gap penalty" - 8. Звоздочкоа (») отмечены идентичиие а?шюкислоты. Позиции, занятые-инвариантныш гистидинами, .обозначены знаком (»).Над выравниваниями знаками (=) и римскими цифрами обозначены участки, составляющие гидрофобные домены (Рис.6).

I II

LT «fKf !.. .... LH......................CHP ICLFLlYTLIPU'ra.FCL........AUlf NYI Y!*IY. ... .L*TIKLWT. IXf WÜLI VfFLlfUA ML46V

IB HLALK .. ..Lie...................INPlLLIVTttriTIMVS PC 1.........eiEIMYVVVlIT.....LBY 181.ИГ. УРГИС11ИТ1LIFLL3 . ÍICV8T

CO RFÏFT......VIL......................ILrIHLrwBHLU.CJtó». FSP.........ACDIHNVY1KVT.....LHTIMiaP. IPPMGLI VFFIWU.T. *( I V»f

DH KI.KIJ .. -FH.LPL............ХРГСГШ..ЯХПМУвН. I..7ГIIF1.FLL.la......BPINYMBEISTF.....LOCOILSYOLILLSLUICSLILLA. .НИИ .

• ■> • • É •• «••■ •« I

US BLSLI____VPTIIL............LPLTWLSUBl ÍMHfTTTR5..LIJOIIPLLP. FM......Ц1NNNLT3C3FT.....rsSDPLTTFLLILTTMXFLniUMRIiL&ei J

AA HTLLLL.. LIPliei..CrmtQJ.. YGLSLlaaiBIXSIALTTeiialWSLIürtL. ГОРВЗСОРИГ USHT« ierro IT. .LaTUOLeiTPIU-niIWUHXII.WWiee СТ.ИТ ÏT«rTL^r TT»TrPwUÏ I IVY F F1 JíAÜLlf fí-PIIGWS» I »WTT 1С 1С lLriXLTTTArCT5Pí4SD[>PLiaLílOTT«I I FFTFWltLa IDOLS IGP ILLTGFITTUTLAA МРГТВО

I

оопя я К L 2 I L I L I t II LDL L X L L » в

j ir to »» «o •« ta te t% •« 10« ti* ist

III «IT * I

LT 11 ТУТ.. lîïiirlr irrürn.I ILI fOFttCr* IL7E3LFFP ICrV8LFF«P»»RPI РА 1 PTLf irS3L33 ! ВС 111С П П РВЛииП-йЛР ID 1С.....IFBSLTLeLTVWILLP 1НГ

Та IK TFT. ■ IVtlI TUT i T irTTLI I tLDO PHC FM lA/ESLFFPICLL3LFTIIFmiIlfIPAIFYLllF33VSSVVC 11 ICI IVI8BM1 IML4AF (VVC.....TTOBLTSAIPIlflLLFIKP

CO SITre. .IVCTTtririEVVI'IILieKrvCrHiLrDaLri'PIcrVSLrrHritMluriFtlPn.flVUSIdaiHCIIIICIIIIPtlPin.liLQSPIBIC.....FFBSLTLilTlWILLFIHF

Da B»W'írfLFUaUILLLLt.ILTP3BlRLrirYLPPMia.JPTLFLILtn«TOPeBI eàeLTLLFÎTLLWLPILieirm.. .aKIeSIMPTLia......KPWaTDLLTr.CUCAF

КЗ Г-StIÍLTLá IL I3La LSI. 1 ITFT ATEL I llTIFP BTTLIPTLAT ITÍ*«G»K<PESU,*»5TYFLrTTI. V'iSLPt-LI ALIT7B -.. rTLASLBILU.n.TAQ«LÍ H3XAX«1.I«L. ATTIAP

U tXYLS. .ГТЧ lM.LLrTLLLàVTLVLQVLLFTIFTT2lLPPLFLLISLFe.fi&VITB*srTL7LTTU^BLT>aX& .. ft 1 WOTTör ölLe.... UXTWTVTOLFLTTOIT I Ut

m ma • a «■» •••••• • •••• • «

CUTT BULPS.. FL.. KLACT3G4 IG3F&38DLLLf FI KWELKL1F VTLLLCBM. CQSLYBATU1 ILYTAQCSVPLLBQVLeLALTeBlfKPTLNf ET8V____»aflYP »TLI11ГТ JGFPIAF

cou ? 2. I Г » Г ( П9 t Г UN A FTL TT > LI I I Я F S L I LTI4F

>3« 140 150 1С« IT* II« »00 tO* flO «I* 11* I**

»I « • Vit fill «IX •

LT 3IKYPI WFKVWLPFI.HVEVXTFIJ ILLJUir^T IGFFQLTIPLFLSFaeLS (UFt.CFtDSLVHLCLT'LilTLL

та AÎSTP I^F4VWXPEHHVEVMTEK3YLLA3IVÎ.IICFFGVYEFLPIAFJ(T 18IVPLCFI OTVIVLOLVf IAIÖLIFIJOYEX11 A*W31 ItfTQ IGLILLVIOfD ILFVeLLIVCBLABlIJI

CO i;iTP I VPLrfW! POflilvOVHTDiUVLL*âTVLKKFFGTPKFLFLt/a4rai№l^VIUa*NLeLTFLfltSLt^U(TII 11 ANW? IHTGMLILLWtOICLLFIOILFFCaLeBI II

DM :»i:PIPLVKLVl.rtAHVEAPV3e3IlL4GítLTLCCrOIL6*IS. FLeLiaLIYBrvuIBIBLVCGVtVBLVCLMTOLIALIАУЗвУАИ 1СITLMLLÎITYwCLCOTTTLI (AHSIC

НЛ 1VK IPtTGMlI.WLPVAliVRAP l AC31LLAAVLLKLQOYO1 IRL TL. ILMFLTIU (AYPPLVL3LWC11 ITBSICLaeTOLISLI AYöSlaH IALVVTA IL ЮтМГТв AVILI IAUQLT

AA A<4TPT.fl.H7UlLIA¡(VtSPLSea 11 LAC IVLKUSLYGIFHLlLPLLPI A3LBYTYIIYVIGVltI1 YAflPOTLÏT IDHEtlâTBBVSHAA'Te ICAF8HTIQ0Itiie lALOUAKiFf

CLlT A'IUP JIPLBTWLPDTHGEAHYSIC HLLAO Jt-LAUGITGLIB IMILLPHAKSIPOPXLHIWTIOI1YAALTBlAeiNULEB I АТвв*8МИвР1 I 1018SLT0TÛLMQALLQII89CFI

сова AVK P1PLN MLP BVK BILLA I*LC в TO В (ЛВС t 4 L • б (I lâTSSV It LU If « LAM

2ft6 269 270 SOO til >00 >1* 12* 1*0 9«0 »I III

X XI III Hit

LT вАГН'ИНУСУИТ. DNYGVRIPLHLISPFO. 181WU3LPL0S FLP« lOFPPMLLP TIDIFU-TOLIВ Li... ?. Г IT ICCPf 11VLAVPL331 Т***С1ЛРТ8Р JUtDITLBLDLTl....

ТВ flf PHFl TI CYNT. Cnï'jïil I FULL ISP Рв. 1S1 WltS LP LCLPLPV IDFPFMLLF TVD IF IL VGL 191в.....FJ TI 18РГ1 1TLT1PLS81 »ITHCLÄFT8PVW-MTLAL0V8I. . . .

CO SATnFIItVGfHY OFGlti IPLimSPFO ■ V91WOLFLOHFYLISIF. FTVTFTIB1FILYGLI9LS.....FIT 11CFTV J VLB Vf VMITIT1С1Л TYSFWrtBIT I BLU.T I----

DM SüCLÍ'CLAHVSY KBL(>5HB ILf KXOI.LNF 5P3 ITLUUFLLI)5AMIAAPPTUILL0Kt8LLMBI VSUSUIBIILLBFLBPf BAAYTLTLTBF9<iHGXLfMVT3FBMII BSTLL2,. . .

»3 S'lLLPCLKhSHf. fclíTKSSll IL34GL4TLLPL1 AFVWLLASLAHLAU'i'T in.LCtLBVLVTmwBKl'IU.LTCLalLVl ALTSLTIFTTJ .....

AA LP 1С AGG I LTOtodTUL ITTYBGnA4VWlF8VLf F ILSLe*8CrPLTLJÍP ieEFB8LT0VTraHPLLeVLA8Te 1*РвААТТХРВТ*в JVPGGBY81 Т/ТХШвВТТМЖП... ■ CLMT CAALFPLAGTTT. BiUKLVTLDBBGCX AlPИP^Ы^ИГ38F8llA8LALMBвCPVAELI VFFCIITOeïTL. LJPeilITPVMA16aiLTPIT3L8W

con* 99 LF AG T DI 0 BI L в PI • LTL LB Г 1 Г 11 LR 11 « IF FL BIT L F • 1

S70 JSO BOO «00 «1* «10 «ЭО «40 «»О ««0 ОТО «оо

LT MITLYFIT31IVILFPTLITLLF

ТВ ЮI ТУРв! 1013TIVFTTFITLLI

' СО MZI rLTPITáSMTKlPVfLlTLLP

OB U.HWLP^Pt.1 ILKKEâriLML

ИЗ . .PlKU3PIl.LL3LJIPO)ITGFM

AA U.*PrVLIVLPatTPAP(Lr>GLrr8VS....8LIr8ta

СНГ BKLVL3191 FLPVZei4ITPDFVL3LAV&KVIVIL8HTFTk

со *» I LL

«90 »00 010 020

MDB DHYDftOCC*Aai М00И1Т » COMFABIOOM

I ff

tr ii>w>THfrTwrafic»irriciniiijrMLa'rvLCirt»>OTirBcrcuieiTOTgrwct... .lii«u>rcFi*c»ftci»orTiyitTi.»pi»rcft»ry»rvvi»t»i)m.L*prr

eo 4 »nrr гиьррuorпдттпх»hllbfulb 1штт.»иттиг зггс итеьтотстткт...., i lhlblcf » гнвутсиот г i lfm n.«Fcr it»T«r vvhtt tua.» err

tb «TtlirLTf IHfOf lboarhrobbnjfmu»L»«iiritlctiir»FL»W«»CLmrTTTem.. .. . iucu>fCf IMLT»VC8CrTHri»CLUH»fCrlVFYirTTnrrDl»U.aBrL

. и icBt.arvNtitisuen................ULTP..tuwttfP»....... .....Ma.v*u*tiifinrLrDwiuxpisrviii»8i«irT«KKTt»Mimi>pi

m !Timni.mnmiwiLt.TLfw*E*Tmvoit*eTFii*vminwi*wiii»*flNiniimiA*m*T

■e wui. i ILттняп. цояшщщищтшашютити... rwmwwiuiHmLttMCimi IMLTBITB итмвшх-ЫМЬГТ

• té • ••••• •••••• ..... •• •• ••• ••• •• *•• • •••••• ••••••• ••• ••

мм «Li r L ■ I rf m i t ra • 4 i i r if i « i rr n i w

I I* »• !• M M •• H M •• IM II« IS«

iw » n »II

IT lirwyrVlXIMrriLJTVrLT*TCewCLi^Lr*yrViaTTWnnàIJCyerU^]«XVaSnXlJ.rFtttT1-MM. TC<ITTТП-TTV.. . .evOTir. . . . 1 Tf 1 TFLLLTCOrTTBT eo «1ГМИГ«(«1«Р*1иттТАГе«Ы»иАРВт1«ТП1Т«ГР4иГОГСЯРГ18К1втХШГТ1ГГГиТ« ТЯП«ГТГТ¥П.....С«ГТГ. ...Т*ГИкПХ11С&ГГиТ T» llWnTCWUIUIWTIWt№L»tf«Wllff¥T»WlliWfUrfl«IWDTUirif»Il>lM». гсепттлгг... .СМОТТТ.. . . îrSICUKICimiT

• «•• t I •• ••• • • ■ • •••• t • • • • • ••

m ип1гпв11ш»1г«.гашя«ввьв1»ш1л»1т.гш1вт«*в1итмл«1»»шх«1».«ипгашшт. .tnui......iwnr.. ,«ж.ио«.»|ц»1тжи

••• • • •• ••••• • ••• • •

ш miritTtiiinuiu«fiGm4uini.iNiwuiMfruiwnm!<»itfiuuwiwiiMifMimM.......im....mu..iii»ww

•« • ••••*•« а •••••••• а • •

ВС СТШ^ТТШтТТМВШЖ»С1*М»0»С1Т11»ВТ*ГО1А4»ВВ0МШ,ТИ1Т^Г1Т1««ГТ»Ц^^.....ÎIIMI,...iTU<ICUHUtIU

им in « u • t ттпл м> tier i á l « ur mot» il n • T l i lu. j t»

IS« 1*0 IM IM IT« III IM f«« IIB tt« »• t««

• • »III II Ж • IT

IT «WLlimfUMM» IFXA1, I BAATLTTCO IIL1BMFHC FOfWCTFTBL lgM30L IUTWHX »TT» ГРУНТ» âfBT 1COI8P3 ИГССШ LOLTTOCLF FC T WTI *T Lf I TL«»

eo «гаи I ЛР£А>ФСЖ1 PT8*lIlJUITLT^e 1СЧ VLQÏ

• ••• • ■ ••••• • ■«• • •• • > • • •• а

M •ttrsat^mAArrrTSALVMeuvTMvnxiaraiiLmMA^tu.uaLTtriMuuitm

• •*• •• ••«• • •• ••••• ••• I • • • • • ••• • •• «•••••• • *• • ••• ••• •• • a

a auKBrwi^AiROTrraALUMTivTMimiBrviuianimrauiiTTUMK^

MM- * «LI MLP im«rTrva4UBAm<f*U| U В ГВ L В LT IX Г» KB »«m ВША re > lie BATTU Lf I •

im «•• m te» - m в m m m s»« «4« «h se*

• ail Bill il*

IT WIRPPPeLWVKTf. FTVfCCC ILkVM.LiPAILMBCBI.Hn.CefVCKM.l.LCLLM.TVFmLEn.CTeLi^ll'TTV ITHTCLLPfkCPVflCPC.........LTVTLP........

«0 ViBLTPeLeBWCTT. FITPCOCVLAMLL»TâLLK>CSUIfUCfTCI«LLLfTL)CVftf HPILDPLFVCIff lFrTVITBTfLLrfLCfrrVCK.........LiFCLF........

T* MIBI rrOLBOUCTf. FBTfCOCTLABUtl »âlUWCB IwrLCCrfCTIWU. «I IIB ШГПИ ItW-F 111 IF 1FfTH ITTFILF ГУМТГКГС.........LVDCLF........

•• •• • • • • • •• ••• •• a •••• • a >•'

M 11—IMBOOIBLIBOLB IBlBIFtTBACFOTBHUlX« IfFUCFT»«»! Ib. II».. В! WHf ПГПТТТ»тТТ»Т»тУТТ» ГТШЛ...........MM..........

•••• «i ••••• ••• •«••«• t • • t M •

- m iiBUHMiniMiu..TinTiiHTiiniLMiPfitarmMii.ni..шпишшпшкшшишптга...........m.........

»• ••• ••• • •• • • ••••••• •••• ••••• ••• •

ВС »IU»WW8HfHWM..TlfinW.lllllt»tHnilWIMIflL. ШТ«»|»»ОТ1П1и||ЩППИ*П|.ПТ>Ш>«1Т1>Т1»1ШМ.тяП«« MM • tt и ••• • и M •• (•••••• •• • fl •• •* • IM* • •

ос ишминитити, .>1тт*шшж^1агт»цут»гот1ь.ЦАтт»«итАПяж»»»цтвттвгв1ьпт»гтвш..........г«*..........

мм 1ш «в в ««L m i au m «rom il u. p r r r т ttbf ь rt t l l-

BTB •«• 1Й 4M «1« III «ВО «4« «M M« 4TB «BB

IT ni XTII IT .....U^riCCt»»eTFe!I!!!tT*r»UJrTLDFl.»WIFWTCLrefTLníarr»X....*......âLFTTFI IB IHFT1LMV1F.............ТТГШ.....

eo .......LveroccLiTcrui.....LTucyiiiFTTiKFt.nm— мдмцапягт..........мтпшшттпепг.............nra....,

• ••• •• •••• ••• • ■ MiMHi • • •••••• «••• • ••••

та .......LLFBTBCcivTCLit.....iTKtuimion.drmiKTramirTwni..........iinrnniwiineiir.............rrrw.....

• • •• • t •

m ......вшивел Ilm no.....ui»tto«btlm.iFrrrTt.icL»i.TiBU.Tir»ci*«........«lrotx.»L«»imaaufirou....... mn.....

• ••• - « •••• • u •

и ......nim«nuiriM.s.......umFr-rn .rnnii..imrwnmmii......lutrr..lsutumxtltkuiw..lctttfo....i

• • • • • ••• •••

ос ......iiLicwirtriuin.......iuaiaeLrTerucmpciSMMeLnacueLeroM.......bffibi.iLKLituiTionmwnn.....гттто.....

DMA L LOI Airier Г * I П f I Г « TI

400 IM »I« BIO BS« »M BIO MO M« Itl Kl

.. IftCIMrrVIVFUtTMnrr.....IrrrVTTICmrr. . tCWIWMLTimTWLrrCirrOl....................LFItfl

••• ••« •» • • • • ••• •• « • *• 4 •

..fBCINLFVtlFLIICTTrwa.....LfOCWTTACFFtT. .LLLrTWMFTITTlTVLCTCLFFCL....................U.IL»!

..............IDCUC-FMtFFTlHLTVre». ... IFCCVTFTCB11Г..■LLFTWWFVITFBTMLCTCLPFCI..................LWILVy

. IWirr......IttTBUFTMJn««L»VC8rPM...HirrFaMIILTM. .L«lT*rri>Ll«MO<.KITLU.rTr..................MILILLtl............Ц

ILfiFTTB......ITWIIFTLBL. LTBASLFU..« ..LULTWLnLLFB.TlMMISTBIITBTMet IKLTFUFF................FPLILTU............ LI

•• • m ••• • • •••• •••• •

LFarFNMrLTBLFTMTt TBL VL0LeMITBlLM<10IILlXPF0LKI*LIIMÍCBIkftLSTSlVTITáLFI LVOV ILTVFTFIBIXBQetOULBLFIUXBLTMT&MIWStCKHt • ••••• «

......... . ,CBâT«r......TTMBOOL......BSOGMWFBOLTV. BL« IВ MN «К TATBWVDBBR.............................................

OB

последовательностями. Уровень совпадений между трипаносоматида:; и соседствущей с ниш дрозофилой является наименее высоким и всех приведенных на выравниваниях, меньшим, в частности, че между человеком и грибами. Тем не менее, несмотря на очевидны различия, все последовательности из трипаносоматид демонстрирую наличие инвариантных аминокислот или консервативных замен Выравнивание COI (Рис.7А) показывает присутствие все инвариантных гистидинов. Будучи наиболее консервативным сред анализируемых белков, coi обладает наибольшим числом идентичны: аминокислотных позиций. Протяженные ■ высокогомологичны! последовательности встречаются в составе каждого гидрофобноп домена, причем особенно, длинные расположены в районе v-v: доменов и vil домена.

Несмотря на низкий уровень гомологии в случае ND4 (Рис.7Б), здесь также можно продемонстрировать наличие инвариантны? гистидинов, среда которых два, расположенные в IX и X доменах, возможно, пршгамают участие в связывании простатической группы . Расположенный в IV домене инвариантный глутамзт в случае C.oncopeltt оказался.заменен на аспартат - пример функционально эквивалентной замены. Прослеживается еще целый ряд идентичных или консервативно замещенных, позиций,, сгруппированных, как правило, в тех же доменах, что и упомянутые инвариантные аминокислоты. Сказанное в отношении ND4 применимо и -к KD5 (Рис.7В). Наиболее высокий уровень консерватизма здесь демонстрирует центральный участок, занятый доменами Ylli-xili. Здесь же расположены и все инвариантные аминокислоты. _____

Совокупность представленных данных на наш взгляд убедительно свидетельствует в пользу правильной идентификации исследуемых генов,

2.3 Особенности кодового словаря.

Таблица 2 представляет сводку• абсолютной частоты использования кодонов в трех генах C.oncopeltl.

Таблица была составлена на основе - транслирования нуклоотидных последовательностей с использованием генетического кода, единственным отличием которого -от универсального кода является транслирование кодона toa, как кодона для. триптофана.

Основанием для такого допущения является появлише этого кодона в тех местах, где в соответствующих генах из других

Таблица 2

юльзование кодонов в митохондриалышх генах C.oncopeltt

.'TT Phe 215 TCT Ser 21

:то Phe U - TOO Ser 5

?ТА Leu 123 TCA Ser 24

:TG Leu 38 TCG Ser 7

:тт Leu 22 CCT Pro 11

:тс Leu 2 CCC Pro 1

'ТА Leu 12 CCA Pro 5

¡TG Leu 7 CCG Pro 0

TT lie 54 ACT Thr 28

ТС lie 10 ACO Thr 2

ТА He 83 ACA Thr 11

те Met 66 ACO Thr 4

тт Val 40 GCT Ala 15

тс Val 11 GCC Ala 5

ТА Val 34 GCA Ala 17

IG Val 19 GCG Ala 4

TAT Туг 77 TGT Cye 55

TAC Туг 12 TGC Суэ 12

TAA --- 3 TGA Trp 26

TAG --- 0 TCG Trp 7

CAT His 15 CGT Arg 7

CAC His 6 CGC Arg 1

CAA Gin 8 CCA Arg 3

CAG Gin 0 CGG Arg 0

AAT Asn 34 AGT Ser 25

AAC Asn 5 AGC Ser 9

AAA Lys 16 AGA Arg 6

AAC I¿rs 6- AGG Arg 2

GAT Азр . 35 GGT Gly. 52

GAC Aep 6 GGO Gly 1

GAA Glu 14 GGA Gly 12

GAG Glu 1 GGG Gly 3

зкизмов стоит триптофан. Так, в определенной недовательности гена coi кодон tga встречается 5 раз, причем в с случаях он расположен в позиции, соответствующей »риантному триптофану. Подтверадением этому выводу является ш и то, что tga кодирует триптофан в большинстве >хондриальных систем ■ за исключением высших растений. Других гонений от универсального кода не обнаруживается.

Наиболее часто используемыми в пределах кодоновых семейств тстся кодоны, оканчивающиеся на Т или А. Это свойство ярко ■ вляется на примере семейств tcn, ста, ach, gtn и ggn. енее-часто используемыми являются кодоны, оканчивающиеся на {екоторые из них (ccg, cag и cgg) вообще не используются в генах. В целом следует отметитьчто наблюдаемые номерности использования кодонового словаря в -кинетошгасте аносо.латид сходны с обнаруженными в митохондриях Hetazoa и эв. .

Обобщая полученные сведения можнй сказать, что исследованные обладают оптимальным соотношением консерватизма и 1чивости для того, чтобы служить пригодными филогенетическими зрами, как в близкородственных, так и в отдаленных роениях. Проведенные исследования -создают необходимую основу

для дальнейшего изучения организации генетического аппарата митохондрий трипаносоматид.

Выводы

На основе определения нуклеотидной.последовательности длиной 4200 нуклеотидов из консервативной области максикольцевой кинетопластной ДНК C.oncopeltl можно'сделать следующие выводы:

1. Колинеарность расположения генов COI, ND4 и ND5 у трипаносоматид подтверждает.ся на нуклеотидном уровне.

2. Гены coi, ND4 и ND5 из C.oncopeltl при сравнении с соответствующими генами из других трипаносоматид проявляют высокую консервативность своей организации, заключающуюся в 80%-ной гомологии первичной структуры, а также сходной ориентации на максикольцевой ДНК.

3. Несмотря на относительно низкий уровень сходства первичной структуры белковых продуктов исследуемых генов и соответствующих генов из других эукариот можно констатировать факт наличия инвариантных аминокислот и сходства профилей гидропатш.

4. В мекгенных областях у •C.oncopeltl расположены характерные G- и с-богатые кластеры. Их наличие и расположение являются консервативной чертой у трипаносоматид.

5. Отличием генетического .кода у C.oncopeltl и у других трипаносоматид от универсального является кодирование кодоном tga триптофана. Особенностью кодового словаря является предпочтительное использование кодонов, оканчивающихся на Т или А.

'Список работ по материалам диссертации: Ким Гван Ир, Д.А.Маслов, А.Горват, А.А.Колосников // руктурная-организация генов 4 и Б.субъединкц МАШ-догидрогеназы субъединицы I цитохромсксидазы из кинетоплзсгов Crithldia copeltl - Молекулярная биология (в печати)

Kim Gwang II, D.A.Iiaslov, A.Horvath, A.A.Kolesnikov // cleotide sequence-of the genes for NADH dehydrogenase subunits and 5 and cytochrome oxidase subunit I iron kinetoplasts oi ypanosomatid Crlthldia OTlCOpeltl - Nucleic Acids Research (in ess)

Нуклеотидная последовательность, определенная в настоящей боте, зарегистрирована в Гейдельбергском банке нуклеотидных следовательностей (EKBL Data Library, accession No.' ).

Подписано в печать ID.09.9Cr. Заказ 629 ■ Формат 60x90/16 Ткрал ICO

' Москва. Типография ВЛСХНИЛ