Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ первичной структуры миникальцевых кинетопластных ДНК лейшманий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ первичной структуры миникальцевых кинетопластных ДНК лейшманий"

V, 1МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ км. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах, рукописи УДК 577.155.2

Фу Голян АН8ЛИЗ первичной структуры ' миникольцевых. кшэтопластных ДНК лойшмоний

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

Москва - 1594

Робота выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руковадитель - ведущий научный сотрудник,

доктор биологических наук А.А.Колесников Официальные оппоненты - КИРНОС Михаил Дмитриевич

доктор биологических наук КСЕНЗЕНКО Владимир Николаевич кандидат биологических наук Ведущая организация - Институт Общей генетики РАН

« СЬНрИ.ЛЛ 1994 г. в час. на заседании специализированного Совета Д.053.05.70

Защита диссертации состоится

при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ по адресу: 119899, Москва, МГУ, биологический _факультет.

Автореферат разослан ч/^у^/^-— 1994 г.

//.'

УччнчП секретарь сопота / /

кандидат химических наук у В.Н.Кеграманов

Актуальность проблемы: Анализ организации и первичной структуры митохондриальной (кинетопластной) ДНК жгутиковых простейших занимав'.' значительное мэсто среди исследований, посвященных изучению митохондриальной ДНК эукариот. Определяется это как необычностью организации самого генома, так и существенной социальной значимостью самих организмов. Кроме того, по современным представлениям нынешние флагеллята являются прямыми потомками предковых форм, давших начало всем эукариотическим царствам. Последнее обстоятельство дает основание для попыток проведения эволюционных, построений, для анализа возможных путей эволюции митохондркального генома эукариот.

Более, чем 20~ти летние исследования кинетопластной ДНК позволили сформулировать основные принципы ее организации, понять многие моменты ее функциональной нагрузки в клетке, выявить ряд уникальных биологических процессов, таких как репликация сложной многокомпонентной структуры и "уридиловое" редактирование. Вместе с тем, остается много невыясненных вопросов, включающих: чем определяется столь необычно большое количество кинетопластной ДНК в клетке; ограничивается ли функция миникольцевого компонента только кодированием "гидовой" РНН (гЛМ), необходимой для процесса редактирования; степень полиморфности индивидуальных компонентов ассоциата кпДНК; степень • и специфичность даворгирования (эволюции) индивидуальных генов (или определенных участков ДНК) как на видовом уровне, так и в пределах семейства и многие другие.

Цель и задачи исследования: Целью.настоящей работы являлось выяснение границ полиморфизма первичной структуры миникольцевых кинетопластных ДНК в пределах компактной, хорошо охрактеризобанной грушш трипаносоматид, с последующей целью оценить возможность использования молекулярных характеристик миникольцевых . ■ кпДНК для систематики кинетопластид и в таксономических построениях. В качестве группы были выбраны представители рода Ъе1аЬмт1а, и для сравнения предстаптель. нового рода РгоГеояолаз Ъгеи1со1а. В связи с этим ставились еле,дующие экспериментальные задачи:

1)Получить репрезентативную выборку рэкомбинантных плазмйд, несущих полноразмерные миникольцевые последовательности кпДНК.

2) Установить первичную структуру миникольцевых молекул всех основных видов рода, включая представителей обоих подродов; Lelahmnla и SauroLelsMania.

3) Провости сравнительную оценку полиморфности первичной структуры миникольцевых кцЦНК в пределах вида, подрода и рода.

Научная новизна и практическая ценность работы: В настоящей работе впервые определена первичная структура миникольцевых кцЦНК у представителей подрода SauroLelaTmarila: (S)L.gymnodactyH и (S)L.gultkl; у представителей подрода Leiahmania: L.major, L.tropica, L.infantum и у представителя рода Proteomonas; P.brevlcola. Всего установлена первичная структура 14 полноразмерных миникольцевых молекул ДНК.

Установлена организация и структура консервативной области миниколец у изученных трипаносоматид. Показано, что первичная структура КО имеет тенденцию к группоспецифичности и предложена консенсусная последовательность КО для трех груш лейшманий: SauroLesfmmia, лейшмании Старого Света и лейшмании Нового Света. Показано, что филогенетические связи, установленные на основании сравнения первичной структуры КО миниколец в основном логично согласуются с деревьями, построенными по другим таксономическим маркерам. Обнаружено, что последовательности "годовых" РНК. участвующие в процессе уридилового ■ редактирования, высоко консервативны у разных трипаносоматид, что открывает новые перспективы в изучении как механизма, так и эволюционирования редактирования у трипаносоматид. Предложена новая потенциальная поолэдоваталыюоть, возможно, учаотвупцая в регуляции транскрипции "гидовых" РНК.

Апробация работы! Представленные в ди'оовртвции результаты докладывались на конгрессе молодых китайских ученых по молекулярной биологии и биохимии (1993.Шанхай), на заседании Московского отделения протозоологиче ского общества РФ (1993,1994). Материалы направлены на 8 международный конгресс паразитологов (Измир, 1994)._

Материалы и методы: Для клонирования, субклонирования и последующего секвенирования исследуемой ДНК. были использованы векторы pBluscript KS+ и SK+. Использован штамм E.coll JM109. Для получения одаонитевых форм соответствующих плазмид применяли

г

фаг-помощник М13К07.

Выделение плазмидной ДНК. рестрикцию, лидирование, электрофорез проводили по руководству Sarabrook et al(1989). Компетентные клетки для трансформации готовили кальциевым методом или с использованием полиэтиленгликоля и димэтилсульфата (Chung, Miller, 1986>. Стратегия оекнэнирования была основана но получении долециокных производных плазмид с применением нуклеазы S1. Однонитевую ДНК выделяли по методу, рекомендованному в руководстве фирмы Stratagene. Нуклеотидаую последовательность JCHK определяли по методу Сэнгерв.

Для анализа нуклеотидной последовательности использовали пакет программ pcgene, а такие программы для ibm рс, любезно представленные F.Corpet, W.Pearson, Д.Г.Постовым и Р.Ф.Накиповим.

Результаты п их обсузденпа.

1.Анализ первичной структуры миникольцевой 1ШДНК Frotémonos brevlcolaiNBr)

Proteomonas breuícoJa' NBr) была выделена из Nab la brevls в северо-западном регионе России, и- была определена как представитель нового рода низших трипаносоматид (С.А.Подлипаев,1990).

Мы клонировали и секвенировали миникольцевые кпДНК Proteomonaa breulcola (NBr). Полная последовательность' нуклеотидоз NBr4l составляет 1477 нуклеотидов.

Миникольцо' NBr ' представляет собой димерного типа полинуклеотид с несовершенным прямым повтором в 200 п.н., ядрами которого- являются, универсальные блоки: Э'-атсассаасссс-з* и .5'-CAACGCCCCT-3*. Согласно литературным данным , эти блоки являются участками инициации репликации L и Н ueneft, соответственно. Orí Н цепи расположен в 83 нуклеотидах downstream от универсального додекамера (orí L цепи).

Любопытно, • что консервативные блоки как бы делят миникольцо на равные части. Так, в миникольцах димерного Tima, включая и объект настоящей работы, консервативные районы расположен! под-углом 180° по карте кольцевой молекулы; находящиеся между ними две области гшервариабельной ДНК (около 70-80% от общей длины) имеют, таким образом, примерно равную протяженность." В тетрпмерном миникольцо Trypanosoma cruzl соответствующе

сегменты, содержащие консервативный район и область гипервариабельной ДНК, расположены через кавдые 90°, деля кольцо на 4 зоны симметрии. Какится логичным рассматривать блочность организации миниколец как следствие каких-то эволюционных событий , например, амплификации района, содержащеого "жизненно" вашше для ДНК участки инициации репликации. После гипотетической амплификации эволюция последовательностей ДНК консервативных и дивенгентных областей, очевидно, шла независимо. Если между консервативными районами у разных трипаносоматид имеется существенная и протяженная гомология, то их вариабельные области ' совершенно различны.

Сравнение отоеквенированного миникольца. NBr о шшикольцамя других трипаносоматид, последовательности которых установлены в настоящей работе и взята из GENBANK .(см. раз,да л 3), показали , что NBr в систематическом отношении близка к Crithiaia. В то Же время две особенности миниколец NBr напоминают Leishmania.

На рисунке 1А представлено сравнение первичных структур консервативных областей миникольцевой ДНК NBr41 и Ltl9. В позиции 1-18 показан консервативный участок, находящийся на растоянии -45 н.п. от CSB-З блока. Внутри этой последовательности имеется 12-членный фрагмент, комплементарный фрагменту из консервативной области миникольцевой ДНК Leishmania tarentolae (Ltl9>. Функция этой последавательности не ясна. Не исключено, что она является результатом рекомбинации. Кроме этого, в половине I NBr миникольца найден один возможный ген gPHK, который высокогомологичен gRPS4, описанному у L.tarentolae и локализованному в сходной позиции. (рисЛВ)

Весьма интересным и информативным оказалось сравнение нуклеотидного состава и профилей распределения различных нуклеотидов по L цепям миникольцевых кпДНК трипаносоматид. Обнаружено, что миникольцевая ДНК Р. brevlcolaiNBr) является самой GC богатой молекулой (51.5%). из. всех изученных кинетопластных ДНК. Для каждого таксона процент содержания AT "и СС нуклеотидов имеет определенную специфичность.

Суммируя накопленную к настоящему времени информацию о первичной структуре мини- и максикольцевых молекул кцДНК можно констатировать, что мевду этими двумя классами молекул имеется

значительно больше сходства, чем считалось до недавнего времени. Прежде всего это факт кодирования годовых РНК,, участвующих в

А . . ____________

ЫВг

I 5-

ИБг I

ИВг II Ш9

ИВг I

КВг II Ш9

КВг I

ИВг II Ш9

МВг I

ИВг II

Ш9

50

.СССТСАССССТАТСАААТ—САС-САААТССС—СААА"------ТСССС

II I I I I И II I II 1111. I I 1111 III И > I III

гаг II 5'.(ХСТСАСССОТАТААААТАССССССААЛСССССССАСССССССССТАССС ЗА :::::::::::: ртоАСССССССААТТТесАСААТТАССССССс 68 Ш9 - вАССАСТССССАТА.5' " ' ' '

ССТААТТТТСАССССТСТ

САААААССССАТТАТТАТАСАССААСССССААААССАССААААСАССССА 10 0 1м 1М I п I I I I IIп1мI I I IIпI I I I I I II I I I (мм

ССАААТСССЛСТТАТТАТАСАССААСССССАААЛССАССАААТССССССА --—С5В-3

118

ТтССССАТтО&СТАААЛТТГСААССССАТТССТСТАТСТСАСАСА 150 I мим I I I | I I I I I I I I I I I I I м I I I I I I м I I I м I

АААТССТСАТГГТСССССААААТТГСААССССАТТССТСТАТОТСАСАСА 13 8

ААААТсссслщтссдсс$тт ШШ£6К?сШдасМССАТТ'гп 168

С5В-2

СССАААЛТССАТСААССССССТАССССССССССТГТТСААТСССТААТТТ 200

I 1 I I I I I м I I I I I I и I I I I и I I I I I I I м I I I I I I I I I I I I : I I I I I

СССААААТССАТСААССССССТАССССССССССТТТТСААТСССТААТТТ 188

С«зттссд^-ед$дЯг£СЙ ¿ддтд лддсАссх А А А § £стггссс щ 227

-СЗЗ-1

ТССССССАТТТТССТССАТГТТСССССС-СССССАСССССАСАССССС.3' 250

I ! М I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I И I I I I I I I I I I I I I

ТССССОТАТТТТССТССАТТТТССССССТСССССАСССССАСАСССАТ.3' 235-ХттссдАТЩхтдсдтщ^тгдАдАтттттдссААТтстстддсс .з • 277

РоввШе т?НКА д«пе 1п ИВг- 5

АТ АТ АСААвАСК АСАСАССТ АСПХдТААСТССТ АСАХИ1 АТГАССАСТА 3 • III 111 и; I:I:I:IXX: : I I: и ; I м I I I; 111 : XX1 1 5' АТАЛАСА-СААСААААААСАТАСАСАААТСАТАСАСТСТТАААТАТА 3'

Рис.1.1 А) Сравнение первичных структур консервативных областей миникольцевой ДНК ИВгСКобеих КО, входящих в одну и ту же молекулу) и '1:191 ЪЛагеШо1ае). Двойной чертой подчеркнуты СЭВ-блоки; сплошной одинарной линией отмечен участок - 45 н.п. от сэвз блока, в котором указан 12-членный фрапонт, комплементарный фрагменту из КО Ш9; «-инвариантные нуклеотидн.

IВ >. Сравнение последовательности нуклеотидов предполагаемой еНКА из Р.Ъгви1ао1а и еНР34 из гагопЮХао. Обозначают: вертикальной чертой показаны идентичные нуклеотиды; двоеточием -С-Т и с-А транзиции; X - трансверсш.

редактировании максикольцевых транскриптов. Во вторых, обнаружение в дивергентной области (ДО) максикольцевых молекул кцДНК участков, кодирующих gFHK. В третьих, В ДО C.oncopeltl и T.brucel найдена последовательность GGGGTTGGTGT, которая идентична универсальному додекамеру (CSB-3) миниколъцевых ДНК, участвующему в репликации этих молекул.

Указанные факты позволяют говорить о возможном происхоздении макси- и миниколъцевых молекул кцДНК от общего предшественника. В настоящее время трудно сформулировать конкретные пути и механизмы, как шла эволюция этого предшественника. Нам представляется возможным предположить, что GC-обогащэние в миникольцевых молекулах кпДНК ' отражает более "примитивный" уровень организации. Более высокий процент GC характерен для макогенетитоокик, "ниршик" трипаноооматид. У дигвпатичеоких. видов уровень содержания СС коррелирует с уровнем урвдилового редактирования максикольцевых транскриптов. В частности, у T.brucel, для которых показано интенсивное редактирование тронокриптов—оамий низкий процент СС пар в миникольцевых ДНК. Интересно, что миникольцевые кпДНК различаются, по-видимому, и по кодирующей емкости: если у лейшманий в одном миникольце кодируется только одна гидовая РНК, то у T.brucei—три.

2. Анализ первичной структуры миниколъцевых кпДНК Lelahmnla gymnodactylI, L.guliM, L.tropica, L.Infantum, и L.rnjor

Исходя из того, что одна из основных целей работы, являлась оценка видоспецифичности первичной структуры консервативной области миникольцевых кпДНК, ыы определили первичную структуру , полноразмерных молекул для 5 видов лейшманий (всего 13 миниколец). Определение последовательности проведено для двух представителей подрода SauroLe IаЫапI а: (S)L.gymnodactyli (клоны Grl9,Gr20) и (S)L.gullkU№OH 3214); .и трех представителей подрода leishmanial l.mjor (клоны Х-2Э-9; Х-23-12; Х-23-13; Х-23-16 >; L.tropica (клопы 32AsH2; 32AsTiT; К-27-36; К-27-40); и L.Infantum (клоны 1054-1 и 1054-3). С учетом последовательностей, определенных другими авторами, мы . получили возможность щюанолизировать первичную структуру 22-х полноразмерных миникольцевых молекул лейшманий.

б

2.1. Общая оценка структуры миникольцевых кпДНК лейшманий Сравнение последовательностей четко показывает, что у всех

изученных молекул' прослеживается единый план организации. Прежде всего тлеется консервативная область (miKO), протяженностью 156-166 нуклеотидов, гомология которой у разных видов составляет от 80 до 100%. Такие как у других тршаносоматвд miKO содержит три универсальных блока CSBl, CSB2 и CSB3. Анализ распределения отдельных нуклеотидов по цепи показывает, что они расположены не равномерно, .а показывают четко выраженную доменную структуру. Смысловая нагрузка такого распределения нуклеотидов по цепи в настоящево время не ясна и, очевидно, будет более понятна поело ■Полного выяснения функции(й) шпшкольцевых кпДНК.

У воэх . аиаливировашихоя молакул в границах ralKO прослеживается участок с регулярно чередующимися а или т тракташ, способный формировать изгиб( bent). Он располагается на расстоянии около 20 нуклеотидов от блока csb-1.

2.2. Консервативная область миникольцевых кдДНК лейшманий Консервативная 'Область миникольцевых молекул кпДНК,

включающая обе универсальные последовательностп, укэ достаточно давно привлекает внимание исследователей. Определяется это в первую очередь тем, что, по-видимому, mlKO обеспечивает регуляцию репликации- этого класса молекул и ,в конечном счете, репликацию всего ассоциата- кинетопластной ДНК. Можно считать установленным присутствие, в mlKO' трех высококонсервативных блоков, получивших название. CSB-блоков (Ray,1989>. в состав CSB-1 и CSB-3 входят уш-шерсальные последовательности, участвующие в инициации репликации Н- и L-цепи молекулы, соответственно, gggcgt и GGGGTTGGTGTA. Сравнение -блоков CSB-1 и сзв-з из миникольцевых молекул различных трипаносоматид показывает их высокую консервативность, Этого нельзя сказать о блоке CSB-2, который консервативен в миникольцевых ДНК у видов, принадлежащих к одному роду, но значительно дивергирует у видов из разных родог. До. недавнего времени имелась ограниченная информация о размерах консервативной области и о степени полиморфности последовательности нуклеотидов ml КО в пределах вида для большинства родов

трипаносоматид.

Одной из задач настоящей работы являлось уточнение структуры КО у широкого круга представителей рода Leishmania.

Для определения границ miKO мы анализировали по 2 миникольца L.lnfant'ff?. (изолят 1054), L. tropica (изоляты 32Ash и К-27), по 4 миникольца L.major Сизолят Х-23) и L.(S)gymnodactylI(изолят Gr2). Результаты анализа показали, что miKO у Leishmania имеет протяженность около 170-180 нуклеотидов. Внутривидовая гомология miKO очень Еысокая (практически полная идентичность).

При сравнении первичной структуры КО у миниколец разных ■ видов лейшманий обращают на себя внимание несколько моментов. 1) Высокая степень гомологии менщу видами прослаивается только на участке в 110-120 нуклеотидов. Область, прилегащая к блоку CSB-1 с 5'конца различается у разных групп лейшманий (в частности, у представителей двух подродов: SauroLelehmnla и Leishmania). Z) Инвариантны© поолздовательнаоти КО лойшмвпий каш ыэокольно больший размер , чем CSB-блоки, идентифЕщированныэ P36M(Ray,. 1989), а именно:

Lei CSB-1 CGTAGGGGCGTTCT »Общий CSB-1 AgGGGCGTTC

Lei CSB-2 ATGCAGAAACCCCGTTCA. »CSB-бЛОКИ ПО Рею

«Общий CSB-2 CCCCGTTC •

Lei CSB-3 AaaCTPjjGGGGTTGGTGTAAAATAG "Общий CSB-3 GGGGTTGGTGTA

3) Использование наименования консервативная область требует терминологического уточнения. Под собственно миникольцевой консервативной областью, следует подразумевать только непрерывный • участок последовательности миникольцевой молекулы, имевший высокую степень гомологии на уровне вида и включающий все консервативные (инвариантные) блоки. Участок se высоко гомологичный у разных видов (или груш видов) скорее мокно называть консервативным районом рода. Во многих работах определение границ ml КО проводили на основании сравнения последовательности нуклеотидов миникольцевых кпДНК из разных видов (иногда дажо разных родов), что на наш взгляд не является . корректным. Такое определение может быть проведено только по сравнению последовательности миникольцевых молекул из одного вида

тршшносоматид. ( В противном случае может оказаться так, что консервативной областью придется считать только 2 блока csb-i и СЗВ-З, если сравнивать мишшольца из лейшмании и трипаносом рыб.» Исходя из последнего положения можно отметить, что в результате нашей работы можно считать установленной протяженность и организацию КО у следующих видов: (S)Lelähmnla gymuxktotyll Lelahmnla troptca Leishmania major

Leishmania Infantum ,,

Proioomonas hravlcola

2.3. Сравнительный анализ участков (генов), кодирующих gRMA

Работами грушш Л. Симпсона показано, что у L.tarentolae гош gRNA находятся в вариабельной части молекулы на расстоянии около 1Б0 нуклоотидов от границы mlKO. Одна мишгкольцоввя молекула кпДНК у дейшманий кодирует только одну гидовую РНК.

f/ы провали пнплиа опродолошшх нами поолэдовотелыюотей о цель» идентгфщкровать участки возможного кодирования ßlWA. Анализ проводили следующим обрезом. С помощью программы pcgeme анализировали последовательности нукпеотидов мииикольцевых молекул на присутствие участков, внсокогомологичшх последова-телъностям уя:е идентафицироианных ранее 17-ти гидовых РНК лейаманий. В результате анализа мы нашли, что миникольцовые ДНК Grl3, Gr20 и 10343 содержат последовательности потенциальных трвнскриптов, сходных с последовательностями gLtl9, gMURF4-u и gRPsa.

На рис.2 и 3 представлено сравнение последовательностей идентифицированных , нами в мииикольцевых кпДНК и последовательностей гидовых РНК.

Обращает на себя внимание то, что наблюдается практически полная идентичность сравниваешх последовательностей, хотя принадлежат они разным видам. В случае L.tarentolae ни-) и L.gymnodactyll (Grl9) Мы имеем дело с близкородственными видами из подрода Saurotelalmmta , и высокая степень. гомологии первичной структуры (70.6%) но выглядит столь уж неожиданной (рис. 3). Хотя общеизвестным фактом считается гетерогенность порвичиой структуры

м

IEI5HMIA ( КЕМ WORLD)

ноша 7gm7agaat7tataaantgataaaaactagctcaaaatcg7actacccgacat6cctcteggtaggggcgnctec6aaatcbc-aaaaat!

bra a!tcataaaaa-tgg6ggaaaatcstac7cccceacatgcc7ctgggtagggecgtictsggaaaaccg-aaaaat:

guv 777ataaaaatgag7ccaaaatcgticcacccgacatgcc7ctggg7aggggcgttctgcaaaa7c6c6-t7t7i(

per ttgaiaaaaaciagcicaaaatcgia:taeccgacatgcctctsggtaegggc6ticiecgaaatcec-aaaaat

pan ttatcaaaaanagcteaaaalcgiaccaccceacatgccteteggtaggggcgttctecgaaaaccs-aaaaati holkex gcctgaaaa7cgtcggaatngtca8aaaaggggcagaaatcgtagcatggagtagccctcgeggtagsgec6nct6cgaat7t-cgaaaaat

Ш5КШ1А ( OLD KGitt.fi)

Idoktnc AACTITA-CI

•H010541 CC-6AAAA7C77GAAATTTAGTCGAAAAA76CECAAAAATC67AECATGGAGT-«Н010543 E6-AAATCGGGTCAAAAAATGGCCAAAAAEGGCCAAAAATCGTAGACIG6A5T-«H032ASH CGTEAAAATGGECAAAAAAG7CGAAAAA7AG6GGSAATT7CGAAAC7TG-AG7 «№2738 CCT6AATTC66CrAAAAArGGCCAAAAAT-GGGGGAATTrCCAAACATEGAGT-Kktnc GCA7G7AG7

HOLAE CCAAAAATGGG-CGGAAAATCECAhAAAACAECTAAAATTCCAAECAGETAGT-laetkenc AAACCTAG!

GS7EC77C6GGTA3GGGC877CT5CGAAAA7-CSAAAAA7 AGC--TCCGGG7AGG66C6TICTGCAAAAAT-BEAAAAA1 AGC--TCC66STAG6GGC6TTCTEEAAAAAT-CGAAAAAT -AEC-7CCGEGIAGGG6CSTTCTGCAAAATC-SCGAAAA1 AGC--TCCE65TiGGGGCG:rCTGCAAAArC-6CGAAAAr -AGCCCTCCG6S7A65GGCSTTCTGC6AAATT-CSAAAAA: AECC-1CCGGGTAGSGSCGTTCTCCEAAA7C-CEAAAAA7 -AGCCCITCGGGTAEGGGCGTTCT6CGAAAAT-GSAAAAA ■GICCCGT-GGGTAGEGECGTICTEC5AAA1T-C6AAAAA1 6TCCCGC-66GTAGGGGCSTtCTGC6AAAAC-C6AAAAA 67CK6C-GSG7AEGGGCG77G76CSAAAA7-CGAAAAA1 ETEGSEC 6EG7MSEGCETIC7ECGAAAAG-IEAAAAA

UalHAY) EGESTCAAAAAAT-GCCCGAAAmCAAACTTTTCTG-

«H0X2J9 6GAITTTrSTCGAAAAATA6CTGAAAAAI-6CCCAATfICCCAAACrTIICTG-

»HEI2J12 GAJITTSlSiCSAAAAA—GCT6AAAAA7AGGCCAAITTCCCAAACTII7C7G-I

liakenc , AACTI7TCTE

GAUROLE1SHM1A

Iatikenc CTITTTAG-ETCCCTC-AGGTAGSEGCETTCTGCAAAA-C-CGAAAAA

#HM21< CGA7AAAA7CCCCAAAAA7CCCCAAAAA7AGCCCAAAA7CCCAAAC7Tr7C7S-67CCC7C-AES7ASSSGCS77C7CC6AAAAC-CSAAAAA

•H0GB19 CCAAAAA7TCACCAAAAA7GGGC/MAAAA7GCCAAAAATCCCAAAC7TTT7AE-G7C:CTC-A5G7AGSGGCGT7C7CCGAAAAC-CGAAAAA

H0L711 CCCAAAAATETCAAAAAA7AG6CAAAAAAT6CCAAAAATCCCAAACnTTTAG-ETCCCTC-AGGTAGGBGCGTTCTCCGAAAAC-CGAAAAf

LU5A ■ CAAAAAATGCCAAAAATTGCCCAAACTT7T7TAGB7CCCIC-AGGTA6GGG:GmaCCGAAAC-CGAAAAA

LtB( CAAAAAATECCAAAAATCCCAAACITTTIAE-ETCqCTC-fiGGTAEGGGCGTTTTCCEAAAAC-CGAAAAf

UD3 CAAAAA TGCCCAAAATCCCAAACFT7TTAG-G7CCC7C-AGG7flG6GGCG77CTCC6AAAAC-C6flAAAA

Б)

con L.N.K. can L.O.».

. COM Ssur

Ail7NNRAAAAASNPPSR№AAArCSTiCRACCCGAC7GCCTCT—CGG7AGSGGCG7fC7ECGAAA7CCGAAASA7 A.WSA!iN!ffl!i'iAAAAASKSH!li)-AAaiRI(NAojlltt!itinii6TAGcc!Mlii!cSGSTAGSGGCG77CTECPAAAsrliiaAAAA fiSSAINllCcAAAAATKNCAAAiAAI—GCCAAAAATCECAfifiCITTI7aGGTCCC7C-AG6tSGE6GCGTTS7CCGAAAACCGAAAiA

Рисунок 5. Сравнение последовательности нуклеот консервативной области " миникольцевых гажетопластных „'.-..йшманий.

А) Собственно сравнение первичных структур. Выпавши проводили по консервативным блокам CSB1 и CSB3.

ВJ Консенсусная последовательность по отдельным гр: лейшманий: L.N.W. - Новый Свет, L.O.W. - Старый Свет, Sa SauroLelslimnla.

WftftTA6CCC6Mftfl-TC6C6TITTTTBGCCTCCCC6T——8САСАЙТТА666ВТТЕБТ6ТЙЙТЙТЙБТБ353СВС5САСС0:6ЙСТСБ

АНАЙТССССС-ИАМТТСБСБТТТТТТБЕССТСССС----6TGCACAATTAGEG5TTGGT6TAATATi3TGGSCEGtGCACTCTC5CTGAGG.15.CTAE5CCTCT

ЧЙДЙТЕТСССБ-ЙЯЙЙТСЙСБТТТТТТБСССТСССЕ----STSCflCfiftTTfiGBSGTTGGTE7ftftTfiTflBTGGGCCGC3CACCCCGfiCCGG6.15.CTAGGCCTCT

AAAATAECCCG-AAAATCGCEHTTTTGECCTCCCC----GTSGACAATTAGEGSTlSSTETAeTATiGTEGEGCGCSCACCCCEACICESS.15-.TETESCCTCT

MAATAGCCCG-AAAATCACGnTTTTEGCCTCCCC----STGCftCftSTTftEGGGTTGGTSTftftTftTAGTCGGGCGCGCftCTCTGSftTIGGf. I3.CTAGGCCTCT

lAAAATCC-ACESAAAAT-ECCAnTTTEECCTCGGEEC--GTGCA-AACTEE56ETTGEIGTAAAATAGG-CCGSGlSEETCCTE3A(TT

ЯДЛЙЙТСББССААЙЛАТ-БССДААААТСЕБЁТС£СП1СДС0С5Е£ЙЛДСТСБ£БЕТТЕВТБТЯЛАДТЙЕЕЕССБ357Б5ТБССТЕСЙАД7 lAAAATTG-GCCAAAAAi-ECCAITTIC-GGGCICEEASC—C6TCAC7CTEG8GBTI5GIGTAfAATSGGGCCGSGiGE-ICCTEGfiHI iAAATTS-GCCGASAAT-G:CATTTTC-GGGGTCGSA£5--CSTCAC7CTEGGGGTTGGTGTAAAATA3G5CC5ESTGGGTCCTGGAA»i |АйвД1СС-ССИЙААА1-ЕССА1ТТТГ-Е5СС1СЕ5А5С--ЕГ6САААСТЕЕ5ЕЕ7ТЕ5Г5:ААААТ«66ССЕ65ТСЕ5ГССГЕЕА«ГТ SAAATCG-TEAAAASAT-GGCATT1TT-GGGCTCG!A6G—CTGCAAACTGGGSSTTGSTGTAAAATAGGTGGGGGTGG-TECTSGAAIT lTTTTTES-ECGGAAAAT-GCCATinT-EGGCTCGSA38--CTGCAAACTSGEGGnGGTG!AAAiTAGGGCCGGGTC-B-TCCGGGASTT AAATT5S-6CCAAAftAT-GCCAITrTC-GGGCTCSGA5S—CGTCeAACI-GGSGrTGGTGTAAAArAGG-CCGGGIGGA-CCGSEAeri lAAAAAGCCECAA?AA!GSC-ATTTTGTESE6TC6GAG'i—CGTCAAACTEGEESTTGGTGTAiAATATTECEGSETE£TTCGAGSA1T6

ATTTTTEGCCGAAAATTCCCATTTTTEEGCTCEEAEGCGGG----AAACTAGGGGTT5BT61AAAATAEGEC-G6GTGGGTGGAAIIAAA

UTTITGGCCEGASSAT-GCCATTITIEGGCTCCSGEGCEGS----AAACTAGEEETT6GT6TAiAATAGT-GTGSGTGGSTCESEEMTT

ITTITEGCCGAAAATT-GECAITTTTGÖGCTCCEGGGC6E5----AAACTAGGSSTTGGTGTAAAATAGG-CEBESIEGGGAGEGGAATT

ITAATTTCCCCAAAAAT-GCCATTTGTEECCTCGAGEGTGES----AAACTAGEGGTTEETGIAAAAIAEGECCGtATBG—ACGG5A-TT

TAATTTDCC-AAAAATCGCTATTTTTAGGATmCEGES-----AAAACTAGGGGTTGSiGTAAAATAGGS-CTEGCCCTCECCCEG-CT

lASAAATECCCAAAATC-ECGATITTTGAEATTTICEG-----ETEAAACTAGEGETTEGTGTAAAATAEGSGCGEG—CACCCECEGECT

AAAATCGTCCAAAAIC-GCCAITTTTTCGATITTCGT-----ETEAAACTAGGEGTTEGTGTAAAATAEGGGCGEG—CACCCCGGEGCT

lAAAATEEECCAAAATC-GCCATTTTJTCAATTTTCET-----EIEAAAETAGEGETTEGTGiAAAAIAEGEGIfiES-GCTCCCEGSEE-T

AAAATTCGGCEAAAATTCECCATTTnCGAATTITCGT----ETEAAACTAGEGGTTGGTGTAAAATAGGGSTGE-CECACGCEGES

ITTTTtT-ECCAAA'ATCEECATTTTT-CEATTTTCET-----STGASACTAGGGETTEGTGTAAAATA5GGGTGGS-GCTCCCC66S

шт-всшмквттттптвт—втеааасга5ебб7тебтсгаааатасбббтб£5-5стс£:с-сс5

AAATKHCCCePflAftAT—CPCBTITTTTEECCTCCCCqrCTECftCftftTTAGGSSSTTEGTGTAflTftTftETS6GHCBCECACRCRGPNT. 22. EGCCTCT

\ifiSti;"'-!c-!:fAAfiAT-ECCATTTniGGcTCooiG?rcat-cAASCT-PEEEGTTE6TSTAAAATAEG»cNGEGTGEntl«iWHillli(iaIT (ТППI "

WAAäTt!!ÜCCAAS',ATcrECCAIITTTtNEAIITTEEtaoST-GAflACTA-EGEETT5ETGTAAfii!AEGESRG66llc'ICCCCEG8

!означония: HO'lvia - L.vlannla; BRA - L.braalHenala; GUY -■guanenala; PER - Z-.peruvlana; PAN - L.pcmamenaia; ldokenc -.donovani; H010541, H010543 - L.Infantum; H032ASH, H0K2738, ;kenc - L.tropica; HOlae, laetkeno - l.aethloplca; lnsa, HOX239, 1X2312 lmkenc - l.major; ladkenc - L.aälerl; H03214 - l.gullkl; 'GR19 - L.gymnodactylt; H0LT19, Ltl54, LtB4, LtD3 .tarentolae. Дефис - делеция для удобства выравнивания, адздочкой отмечены последовательности, определенные в настоящей кЗоте. В консенсусных последовательностях: R - пиримидин, Р -грин, N - любой нуклеотид, малыми буквами указан ^имущественный нуклеотид.

Ii

миникольцевых кдДНК, входящих в состав даже одного и того se ассоциата кпДНК. Факт идентичности последовательностей гидовых РНК у разных штаммов и видов отмечен и другими автораки, в частности, для ряда видов африканских Трипаносом. (Stuart 1993). Обнаруженное явление ставит перед исследователями вопрос о консервативности генов гидовых РНК и соответственно о механизмах» контролирующих эволюционную консервативность этой последовательности.

Возвращаясь к сравнению последовательностей гидовых РНК следует отметить, что для gMURF4-II обнаруживаются 4 транзиции G-A тл. одна С-Т. Очевидно, такие транзиции но влияют на процесс редактирования, т.к. спаривание и и G в мРНК вполне допустимо при А

gCR?0 . 5' TCTAAACCAACAAATAAATAAATGTCCAGAATACAACATATTAAC Э'

I I I I I I I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I ; ; ; ; I I I I I I I I I I I I I I ;

gMURF4-II TATAAACCAACAAATAAATAAATGTCAGAGATACAACATATTAAT

в *

CLGYLYLVRM mRNA 3" GUCuAuuuGGuAuGUUUAuAuuuuGUGCiUIauuuAuutiAAUA 5' gl 054 3 5' CACATAAACCATACAGATATAAAATACGTGTGAAATAAGTTAT 3' и 11111111i 1111 11 x: i 11x < : i i * i; i ; ; i и i : ; i 11

gRPSÔ 5' CACATAAACCATACAGACGTAATACACGTATACAATAGAT-AT 3' mRNA 3' CUGuAuuuGGuAuGUUUUUAuuAuGUGCGUAuuuuAuiniA-UA 5' CtCVLFLVRM

Рис.2. Сравнение последовательностей нуклеотидов генов гидоеых РНК. Обозначения: вертикальной чертой показаны идоитичные нуклеотиды; двоеточием - С-Т и G-A транзиции; X - трансверсии. Заглавными буквами обозначены кодируема- геномом нуклеотиды; строчными - доставляемые в процессе редактирования.

(A). Сравнение gGr20 из L.gymriodactyll и gliURF4-II из L.tarentolae.

(B). Сравнение gl0543 из L.lnfantm_K gRPSS из L.tarentolaa. Показаны последовательности шРНК и Ёыведенные аминокислотные последовательности. Стрелкой показана мутация в аминокислотной последовательности.

Рис.3 Выравшшание нуклеотидных последовательностей двух миникольцевых ДНК GrigiL.gymodactyll) и Lti9i Ь. tarent оХсш). Область, содержащая "х'ены" гидовой РНК показана с разрядкой. Обозначения: идентичные нуклеотиды обозначены вертикальной чертой или точкой; тире - делеции, необходимые для лучшего выравнивания. Регулярно повторенные поли А<Т) тракты подчеркнуты волнистой череой(~>. Тонкой линией подчеркнута область кодирующая gPHK, и последовательности ССААТ и TAGTTGTA (предполагаемые Л.Сшпсоном регуляторные участки). Толстой линией подчеркнута 18н последовательность (предполагаемый наш регуляторный участок), сзвз - подчеркнут двойной чертой.

GR19 TACACCAACCCCTAGTTTCACACGAAAATCGAAAAAATGGCGATTTTGGA -50

LT19 .............................T...................С -50

CSB-3 • • GR19 CGATTTTTGAACGGGGTTTCTGCATCGATTTTTCGGTTTTCGGAGAACGC -100 LT19 .........................GC....................... -100

GR19 CCCTACCTGAGGGACCTAAAAAGTTTGGGATTTTTGGCATTTTTTGCCCA -150 LT19 ................................................T. rl50

IMM4V W>V«VIVW IMVWMAHV

GR19 TTTTTGGTGAATTTTTGGTGTCACCGTTGCACCATCCAG-CCAACTCTGC -199 LT19 .....T.AC.T____G. .AA.TCT.TCC. .GT.CA.A. .С____T.T. ■ . -200

MIVtVIVM WWW

GR19 ACATTTTGCATTGTTTGGCAACAGG—AGTATCTCCTAGAATGTACTGTC -247 ' i и i i i it i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i

LT19 AT-TTTTGCAATGTTTGGCAACAGGTGAGTAGCACGATAGTTGTACTGTT -249

GR19 TAAACTTTATCTCTGGCATCTAGTCTAGATTAAATTAAATAACATTCCAC -297

I и i i i 11 i i i I II i i i i i i i 11 i i i i i 11 i 11 i i i I ; ix: i

LTS9 TAAACTTTATCGATAGCGTCTAGTCTAGATC—-TTAAATAACAT¿CAGC -296

-----gfiNA

GR19 AAAATAACAATGCGATTAAAATAAAAAATATATAAAATATAATTCTAGTG -347

II 11 ::X1111 i ; i ; i i ; i i : i : и 111 i i 111 i i 11 i i i

LT19 AAAACGCCAATGTGGTTGAAGTGAAAAATATATATC-TCTACTGTAAATT'-34?

GR19 ACTGATAGTATCCTACCACTAGACTTTAC--CAAGCCTATGGTTGACAC- -394

LT19 .AA.....A........-...CTG.CG,.TC.TCT..A.C..G.T..C.A -394

GR19 TCTCGGCCACCGGATACTATAGTAGGCTAT-GCATATCCTATACGTTACC -443

LT19 .G.A...T.......С.....С. .T.TC.CC..........GCT...... -444

GRJ9 GTTTAGTCTATGCCTGTCTTATCGACATACCCCATACTCAC-ATATATAT -492

LT19 ACC. . .G____A.G..............TG.. .С. .T.T. .T......GG -494

GR19 TA-TATAATTGATGATTGGGCTATCCTATATTTAACCCTAACCT-ATCCA -540

LT19 • ..A.....G.T'.. A. —.....-.AAG.GGCA..-...C.G...C.A-.GT -540

GR19 AGCCACACAGTTAACACAACGCGTAGTAGCCAACGC---AACGCATCGCG -567.

LT19 .T___________G. —T.TC.A.GC.G..T.T...CCG.GT.TG.. A.. -585

GR19 GTTAATGCCACGGTTCTGCCCACAACC—ATCGCAGGTTACCACCACAAC -635

LT19 T.GTCCAA...A.C-.ACA____CG.TGT......T.CGC.T.A..-..G -633

GR19 CGCATAAACACCCACCCATACGAAACTA-TCAAAGGTCGGTAGGGGCCCT -684

LT19 TC. .AGC. . .TAA. .T.T. .AAT.T.A.A. .C.TCT.T............ -683

gr19 tgtgt-ccacaccccaccgctatgcatacgcttacaacagccctacctgg -733

lt19 ..ga.G...gt.ta...gc...ca..ag.c.a.g..G-.c..T..t.ctc -732

GR19 ccgtcttgaagcctaaatc-ctcacatctaaagcccaaaaagttagaaag -782

LT19 a.. .g.. ag.T. .-.....T.c.............ac----T.......T -781

GR19 TCAAAAATATACGGGGTAGGAGGCCTGTTTTTGCAGCCCCTAATTAAAAC -832

LT19 С..............TC.........AA.....ACCGGT. . .GCCTG.GG -831

GR19 CCCTAAAATACCCCTGAGAGCCCCGGGGTGCCCG-CCCCTATTT -875

LT19 G. .CG. .T.T. .AGA-.TTA........A----CA......... -874

образовании гибрида между гГША и шИМА. Между последовательностями гИРБв (I.ХагепЬсЛозч и 0543ЧЛп/апгт), выявляется 5 транэиций А-с и 2 т-с, и кроме того, две трансверсии т-с и А-т (рис 2). В результате первой замены с на.Т происходит замена фениланина на тирозин.

Сравнение уже упоминавшихся 1119 и Сг19 также показывает 6 А-с и з с-т транзиции и один сдвиг1 позиции Т, в результате которого изменяется кодируемая аминокислотная последовательность в отредактированной мРНК(рис.З). В случае ¿РНК, кодируемой Ш9 и Сг19, еще не идентифицирована соответствущая мРНК, подвергающаяся редактированиюг •

Ранее сообщалось (Згиги et.al.1991), ' о двух последовательностях, возможных регуляторных участках траскршщии еРНК у ЬЛагвпШае. Это соответственно ссаат в позиции -95 и ссатасттста в позиции -35 в 5' Фланкирующей области гена еРНК миникольцевых кцДНК. При сравнении юрвичных структур миникольцевых ДНК 1119 и Сг19 мы не обнаружили гомологии (или сходных мотивов) в соответствующих позициях (рис 3), также. Как и в других лейшманиалышх миникольцевых ДНК. На основании сравнения мы предполагаем, что регуляторную роль может играть последовательность в позиции -20 (рис. 3 и 4, подчеркнуто жирной линией). В большинстве миникольцевых последовательностей выявляется мотив из 18 нуклеотидов (рис. 4), но он прослеживается не у всех. Последнее, обстоятельство не дает оснований для строгого утверждения о возможной. функциональной значимости данного мотива, однако на наш взгляд его участие в регуляции транскрипции еРНК 'возможно. Известно, что миникольцевые ДНК различающиебя по первичной структуре "представлены в ассоциате различным числом' копий. При описании миникольцевых ДНК активно используются термины мажорный класс и минорный класс молекул. Последние могут присутствовать в ассоциате. в чрезвычайно малом количестве копий. Маслов и др., показал, что не наблюдается корреляции между количеством еРНК и числом копий соответствующих миникольцевых матриц. Это позволяет выдвинуть предположите о различной силе промоторов, обеспечивающих стабильный уровень транскрипции еРНК (Маслов и др. 1992). Это и может быть одной из причин, определяющих трудность идентификации общих регуляторных

последовательностей в миникольцевых молекулах разных классов. Мояно предполагать, что у родственных видов регуляциия транскрипции гРНК, кодируемых мажорными классами молекул, осуществляется с участием сходных консервативных функциональных последовательностей, как у Ltl9 и Grl9. Consensus................TACTNNaTANcTTTATNT '■

Grl9 TACACCAACCCC..240..TACTGTCTAAACTTTATCT CTGCCATCTAGTCTAGATTAAA

Ltl9 TACACCAACCCC..242..TACTGTTTAAACTTTATCG ATAGCGTCTAGTCTAGATC

Gr20 TACACCAACCCC..247..TACAACCTACACTTTACAT ATCTATATGAATGTTAAACCCTATC

10541 TACACCAACCCC..259..CACTTAACAAACTTAATAT CGCATАТСAAAACTTAACAC.

10543 TACACCAACCCC..260..TACTCCAAAGACTTTATCT AAAGTATCAAAATAATAT

3214 TACACCAACCCC..245..TACTCTATATCATTTGTGC GCTAGATTTGTATCATGAAAA '

32Astl TACACCAACCCC..268..TATACAAAATCGTTTACCT CTATCATCAAAAACTAACCTC

X2312 TACACCAACCCC..223..TACTCTA ACATTTTATAT AAGTTAAATTTACGTAAGATT

Ltb4 TACACCAACCCC..236..TCCTAGTTGTACTTTCGAA GATTTCCCACACTATCTTACAAGGGTC

Ltl54 TACACCAACCCC..284..TACTGTCTCTATTCTACTG CATACATTAACTTAAT

Ltd12 TACACCAACCCC..271..TCTTACATCTATGTCGCTT CAGAGGCGTGTTCCCATCCCT

«TTAAATAACATTCCACAAAATAACAATGCGATTAAAATAAAAAATATATA*

«TTAAATAACATCCAGCAAAACGCCAATGTGGTTGAAGTGAAAAATATATA«

«TCTAAACCAACAAATAAATAAATGTCCAGAATACAACATATTAAC«

"AAAAGTAAAATAAAATGAACGAAAAAATAATTGTTATAATTACTAGCTATATTATGA"

•CACATAAACCATACAGATATAAAATACGTGTGAAATAAGTTAr«

"TAAACACAAACCAAATAGGGAAGAAGAGAAAGATAAAATTACGTCGAGCTAA"

"AAAATACATCAACTATATACAAAAATGACAAGATAAAAATTATGTATATAGTAATAG"

"AGCGCTCATACCGATAAAGATAGCATGAATACACGTAATATATGTAATAATCTATGACAA"

»CATCGAAAATCATAAACAACAATGAGAGCGATCAGAGAAATATAACAAACATTGATAACACTACGACGAT*

»ATAAAACACAACAAAAAACATAGAGAAATCATAGAGTGTTAAATATA*

«CTATCTTTAGCAGGTAAAGACAGAGAGATCAAAACACTATTCGT*

Рис .4. Сравнение первичной структуры 11 "генов". гидовых РНК и 5'фланкирующей области миникольцевых ДНК лейшманий. Показана локальзация генов относительно CSB3 ( подчеркнут двойной'чертой). Одинарной чертой подчеркнут предполагаемый регуляторный участок. Идентифицированные гены gRNA отмечены »...*. предполагаемые гены gRNA - последовательности Ltl9,LtB4,Ltl54 и Ltd 12

определены в группе Л.Ст.шсона.

3. Систематический анализ

Сравнение первичной структуры консервативных областей итншкольцевых ДНК лейшманий показывает, что вполне возможно ©формулировать консенсусную последовательность, причем таких консенсусов будет три (рис. 5). Первый отражает общность последовательности «1К0 у 8аиго1е1з1тт1а. второй и третий - у „тейшани;! Старого л Нового Свата ооответотвенно. Сопоотввлэтга консенсусов показывает определенные особенности организации КО у указанных трех групп лейшманий. Прежде всего обращает на себя

внимание значительная вырожденность 5'-концевой части КО у лейшманий Старого Света. mlKO зауролвйшмакйй выглядят очень консервативными. Для всех трех групп характерна значительная вырожденность последовательности mlKO между CSB2 и CSB3. В 5'-концевой части КО у зауролейшманий и лейшаний Старого Света четко просматривается мотив, способный формировать изгиб (чередование олиго А блоков). Подобный мотив вырожен гораздо слабев в случае лейшманий Нового Света.

Проведенное . сравнение показывает определенную груштоспецифичность организации КО. Это обстоятельство свидетельствует в пользу возможности использования данного геносистематического параметра для целей систематики и таксоаогши трипаносоматид.

Мы предприняли попытку установить филогенетические связи между тринаносоматидами по организации (структуре) КО миникольцевых молекул ДНК. Анализ проводили с помощью программы PCGENE. Итоговая филограмма представлена на рис.6.

Из представленной филограммы видно, что при использовании в качестве генетического маркера последовательности нуклеотидов КО миникольцевых ДНК, анализируемые организмы сгруппировались, б основном, в хорошем соответствии с филограшами, построенными по другим маркерам. Интересным является группирование L.Infantum (возбудитель висцерального лейшманиоза, Старый Свет), L.mexlcana (возбудитель висцерального лейшманиоза, Новый Свет) и L.troplca Сантропонозный кожный лейшманиоз, Старый Свет). ■ Нам представляется, что такое объединение является вполне -логичным, если учитывать определенное сходство изоферментных спектров, . случай когда висцеральный лейшмайюз вызывает типичный возбудитель антропонозного кожного лейшманиоза L.troplca и наоборот кожный лейшманиоз вызывается типичным возбудителем висцерального лейшманиоза L.infantum и др.. Компактную группу составляют все изученные представители подрода SauroLeishmanla.

Еще один интересный момент в филограмме - это группирование трипаносоматид с мультимерной организацией миникольцевых кцДНК.' Если в случае представителей родов Crlthidla и Froteomonaa это выглядит естественно, то объединение б один кластер только триианосом, имеющих мультимерно организованные • миникольца

л е.

I U

Dendrogram of the albjnment.-

UO10541 H01ÜS43 HOLMEX H032ASH H0K2738 HOLAE H0X239 H0X2312 И03214 M0GR19 HOLT19 ' HOLMIA HOOF IIOCO HONBRI

HOTCRU HOTLEU H0TH2. H0TB51 HOIEQ HOTEU HOTCOG

Ряс. б-' Дендрограммэ кинэтопластных ДНК, полученная при сравнении первичной структуры консервативных областей миниколъцевых молекул Обозначения: ПЗ"- КО одной молекулы.

.вш - КО из разных изолятов одного вида Е23 - КО из разных миникольцевых ДНК. одного изолята Н0Ю541 - Leishmania Infantum(настоящая работа) Н0Ю543 Leishmania Infantum.(настоящая работа) HDLMEX - Leishmania mexlcanaiRogers,\98ö) H032ASH - Leishmania troplcaiнастоящая работа) Н0К2738 - Leishmania tropica(настоящая работа) HOLAE - Leishmania aetnloplca^ Schoone,l99l) H0X239 - Leishmania majori настоящая работа) HOX2312 - Leishmania major(настоящая работа) H03214 - Leishmania gutikl(настоящая работа) HOGRl9 - Leishmania gymnodactylKнастоящая работа) H0LT19 - Leishmania TarentolaeiSturm,1990) KOLVIA - Leishmania vlannlaide Bruijn,l992> HOCF - Crlthldla fa3clculata(.UacjiOB и др.1988) НОСО - Crlthldla oncopelti (Pestov,1990) HONBRI - Proteomonas brevlcola(Hacwman работа) HONBRII - Protemono8 brevlcola(настоящая рвбота) HOTCRU - Trypanosoma cruziiGonsales,1986) HOTLEW - Trypanosom lewlsUPonzi., 1984 ) H0TH2 - Trypanosoma sp.pf-C9(Барон и др.1993) H0TB51 - Trypanosoma bruceU Jasmer, 1986 ) HOTEQ - Trypanosoma equlperdumiBarrois,1981 > HOTEV - Trypanosoma evanei<Ou,Y-C.,1991) HOTCOG - Trypanosoma corcgoZense<Naslr,1987)

(Т.сгигЦ Т. 1еи>1з1 и Г.зр.Грибы;), позволяет предполагать наличие общих принципов организации первичной структуры у мультимерных миникольцевых кпДНК. Однако, в настоящее, время анализ этих принципов лимитируется ограниченным количеством миникольцевых кдЦНК, для которых определена полная первичная структура. Это направление требует продолжения исследований.

ВЫВОДЫ

1). Веб изученные к настоящему времени миникольцевые ДНК кинетопласта лейшманий организованы по единому плану и включают: консервативную область протяженностью 170-180 п.н. и вариабельную область протяженностью от 400 до 720 п.н.. Консервативная область (КО) содержит три инвариантных участка, идентичные у миниколец всех лейшманий:

CSB-l GGTAGGGGCGTTCT CSB-2 ATGCACAAACCCCGTTCA CSBr3 AaaCTPuGGGGTTGGTGTAAAATAG Локализация всех CSB блоков идентична для всох лейшманий.

Вплотную к 5'концу КО примыкает последовательность' потенциально способная формировать изгиб спирали ДНК.

2). Во всех изученных миникольцевых последовательностях нуклеотидов идентифицированы участки кодирующие потенциальные гидовые РНК (gRNA). Ряд выявленных- . gRNA идентичен по послеловотелыюоти гидовым РНК из L.tarentolae. Выявлений практически идентичных гидовых РНК у разшх•видов лейшманий и у представителя низших трипаносоматид P:brevicola, позволяет предполагать высокую степень консервативности генов гидовых РНК у трипаносоматид в целом.

3). Можно предполагать, что . консенсус возможного регуляторного участка "генов" гидовой РНК у лейшманий имеет вид ТACTNNaTANAcTTTATNT.

4). Последовательность нуклеотидов КО лейшманий показывает высокую степень гомологии'по трех группам:

SauroLelsfmmla Leishmania Старого Света Leishmania Нового Света.

Опыт сравнения первичной структуры КО (участок 200 нуклеотидов) показывает, что данный параметр является полезным для использования в таксономии и систематике трипаносоматид.

3). Миникольцевые кпДНК Proteomonaэ Ъгеи1со1а имеют размер 1467 нуклеотидов и организованы по мультимерному принципу: в одной молекуле имеются две практически идентичные ■ КО, расположенные строго симметрично. Полученные данные подтверждают предположение, что первичная структура миникольцевых молекул кцДНК с размером более 1300 п.н. организована по мультимерному' принципу. Изученные миникольцевые ДНК имеют самый большой из известных для этой группы молекул С£ состав(51.5%).

Список работ по материалам диссертации:

1. Guollang Fu, Alexander A.Kolesnikov, The•sequenfce analysis of mlnlcircle klnetoplast DNA from five species of Trypanosomatlds // The Summer Conference for Young ■ Chinese Researchers In Biochemistry and Molecular Biology, - Shanghai, 1993, p.66-67

2. А.А.Колесников, Голян Фу , Миникольцевые кинетопластные ДНК лейшманий, сравнительный анализ первичных структур //Молекулярная биология, 1994,(в печати)

3. Guollang Fu, Alexander A.Kolesnikov, Mlnlclrcles of different trypanosomatlds encode similar gRNAs // Mol.Blochem.Parasltol,., 1994, tin press»

4. Guollang Fu, Alexander A.Kolesnikov Nucleotide sequence of mlnlcircle klnetoplast DNA from lower trypanosomatld Proteomonas brevtcola. //Nucleic Acids Res. 1994, (In press)

Определенные в данной работе последовательности нуклеотидов направлены в GenBank.