Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана"

005060783

На правах рукописи

Жиренкина Екатерина Николаевна

Особенности очага висцерального лейшманноза в Папском районе Наманганской области Узбекистана

03.02.11 - паразитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 0 МАЙ 2013

Москва-2013

005060783

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Понировский Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

Черникова Евгения Анатольевна, доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры тропической медицины и паразитарных болезней медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Довгалёв Анатолий Семёнович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой тропических и паразитарных болезней факультета профилактической медицины и организации здравоохранения ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « // » июня 2013 года в // часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.12 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦМБ Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан « ^ » __ 2013 года.

Ученый секретарь //V

диссертационного совета Фролова Александра Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Висцеральный лейшманиоз (BJI) среди других лейшманиозов Старого Света является наиболее опасным заболеванием: при отсутствии вовремя поставленного диагноза и специфического лечения, как правило, развитие болезни приводит к смерти пациента. BJ1, вызываемый Leishmania infantum (синонимы: средиземноморский лейшманиоз, детский лейшманиоз), в Старом Свете распространен, главным образом, в странах Средиземноморья, Ближнего и Среднего Востока, Закавказья и Центральной Азии. Несмотря на то, что лейшманиозы зарегистрированы в 98 странах, только из 33 стран поступают сообщения о местных случаях заболевания, что связано с отсутствием обязательной регистрации больных лейшманиозами в большинстве стран.

В первой половине прошлого века Узбекистан занимал лидирующее положение по числу заболевших висцеральным лейшманиозом среди республик СССР. Однако к концу 60-х годов XX столетия в результате проведенных мероприятий заболеваемость снизилась до спорадических, единичных случаев (Исаев JI.M. и соавт., 1966). В настоящее время основной очаг ВЛ находится в Папском районе Наманганской области Узбекистана (Maroli М. et al., 2001). Всего с 1987 по 2009 гг. зарегистрировано 95 случаев В Л в 9 населенных пунктах этого района (Коваленко Д. А. и соавт., 2011). Возобновление заболеваемости ВЛ в Республике Узбекистан показало необходимость изучения современного распространения случаев ВЛ среди людей, выявления резервуара инфекции и переносчиков с использованием актуальных методов исследования.

Цель диссертационной работы: изучить особенности очага ВЛ в Папском районе Наманганской области Узбекистана с применением классических паразитологических и современных молекулярно-биологических методов.

Задачи исследований:

1. Обследовать детей до 15 лет в 5 населенных пунктах Папского района

Наманганской области Узбекистана, где случаи ВЛ регулярно регистрируются в последние годы.

2. Обработать клинические образцы, полученные при обследовании людей, методом ГТЦР, предварительно адаптировав его для выявления 1 паразита в 0,1 мл образца материала.

3. Изучить видовой состав и выявить эпидемически опасные виды москитов.

4. Определить факторы, способствующие функционированию паразитарной системы ВЛ в данной местности.

Научная новизна результатов исследований

Впервые на территории Содружества Независимых Государств (СНГ)

обследован очаг ВЛ с применением современного метода молекулярной

диагностики, позволившего получить прежде неизвестные факты об

эпидемиологии заболевания.

Выявлен значительный процент ПЦР-положительных реакций у

практически здоровых детей, свидетельствующий о бессимптомном

носительстве и опровергающий прежнее представление о ВЛ у детей как только

об острой инфекции с быстро развивающимися клиническими симптомами.

Этот факт позволяет считать ВЛ оппортунистической инфекцией.

ДНК лейшманий была обнаружена в крови обследованных детей, что

позволяет использовать образцы периферической крови при скрининговых

обследованиях населения эндемичных по ВЛ территорий, предполагает

пересмотр роли человека как источника инфекции при ВЛ, заставляет

ужесточить правила безопасности инъекций и сопутствующих процедур.

Практическая значимость результатов исследования

Результаты исследований используют при проведении мероприятий по

эпидемиологическому надзору в Узбекистане.

Материалы исследований включены в циклы лекций кафедры

тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ГБОУ ВПО Первый

МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава РФ, а также используются в практике

4

проведения учебных курсов по паразитарным болезням на базе НИИ медицинской паразитологии им. Л.М.Исаева Министерства здравоохранения Республики Узбекистан и клиники института.

Внедрение материалов исследований в практику Материалы исследований включены в справочное пособие «Методики клинических лабораторных исследований». Т. 3. Под ред. В.В. Меньшикова, 2009.

Положения, выносимые на защиту

1. В населенных пунктах Папского района Наманганской области Узбекистана висцеральным лейшманиозом болеют дети, в основном до 3-х лет, что делает эти очаги сходными с другими очагами Средиземноморского ВЛ. Отличительной чертой является значительный процент детей, в крови которых обнаружена ДНК возбудителя ВЛ, без клинических проявлений бессимптомных носителей инфекции, исследованных специально адаптированным (для обнаружения до 1 паразита в 0,1 мл клинического образца) методом ПЦР.

2. Очаги ВЛ в Папском районе Наманганской области в настоящее время являются синантропными, возбудитель циркулирует внутри населенных пунктов, основными источниками инфекции являются поселковые собаки, переносчиком - Phlebotomus longiductus.

Апробация результатов исследования Материалы диссертации были доложены: на коллоквиуме отдела молекулярной паразитологии Института микробиологии и гигиены Медицинского Университета Шарите, г. Берлин, май 2008 г.; на коллоквиумах ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, февраль 2010 г., июнь 2012 г.; на VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика - 2010», г. Москва; на заседании специализированной комиссии НИИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М.Сеченова, 19 марта 2013 года.

5

Личный вклад автора

Лично автором оптимизирован режим амплификации, проведено исследование 234 клинических и 380 биологических образцов методом ПЦР на наличие ДНК возбудителя висцерального лейшманиоза, приготовлены постоянные препараты и проведено видовое определение москитов. Выполнен анализ полученных данных, описание района исследований, определение природных и социальных факторов в становлении и функционировании очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана, обобщение материалов и литературных данных, а также статистическая обработка результатов.

Публикации

По материалам исследований опубликовано 5 работ в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 163 источника, из которых 82 на русском языке. Работа проиллюстрирована 11 таблицами и 14 рисунками.

Благодарности

Работа выполнена в рамках проекта ШТАБ (№ 05-1000008-8043) «Борьба с висцеральным лейшманиозом в Узбекистане путем создания системы эпиднадзора с использованием новейших иммунологических и молекулярно-биологических методов».

Выражаю глубокую признательность всем участникам проекта ЕЧТАБ за

плодотворную, совместную работу, а также медицинскому персоналу

Папского района Узбекистана, предоставившему образцы для наших

исследований. Выражаю признательность руководителю проекта - доктору

Габриеле Шониан за предоставленную возможность стажировки в Институте

микробиологии и гигиены Медицинского Университета Шарите (Берлин,

6

Германия) и работы по определению зараженности москитов молекулярным методом. Особую благодарность выражаю Стрелковой Маргарите Витальевне за постоянное внимание к моей работе на всех ее этапах.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объем исследований. Сбор материала проводили во время экспедиционных выездов в июле и ноябре 2007, в марте и сентябре 2008 гг. В качестве обследуемого контингента были выбраны дети до 15 лет в пяти населенных пунктах Папского района Наманганской области: Чодак, Олтинкан, Гулистан, Чоркесар, Хонобад. Дополнительно в обследование были включены пациенты двух больниц. Всего исследовано 234 образца: 3 - пунктата костного мозга, 9 - венозной крови и 222 - крови из пальца. Все образцы на предметных стеклах (объем материала ~ 0,1 мл).

Энтомологические наблюдения проводили в 4-х из 5-ти обследованных населенных пунктов. Всего отловлено 7671 москит. На наличие ДНК L. infantum в москитах исследовано 380 самок 5 видов: P. angustus, Р. keshishiani, P. longiductus, P. papatasi, P. sergenti.

Методы исследований. С клиническими образцами проводили амплификацию области ITS1. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора DNA Purification Kit (Promega, USA). Для составления реакционной смеси пользовались наборами PCR-core («Изоген», Россия). Использовали праймеры: LITSR (CTG GAT CAT ТТТ CCG ATG) и L5.8S (TGA TAC CAC TTA TCG CAC TT), синтезированные фирмой «Syntol», Россия. Амплификацию проводили на программируемом термоциклере Терцик-М («ДНК-технология», Россия). Режим амплификации: 94°С - 5 мин; (92°С - 20 сек; 50°С - 30 сек; 65°С - 90 сек) х45 циклов. ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле.

Обработка клинического материала проходила в два этапа: на первом все образцы исследовали с помощью родоспецифичных праймеров LITSR-L5.8S с целью обнаружения ДНК лейшманий. На втором этапе исследовали только

7

положительные образцы, используя секвенирование для видовой идентификации. Секвенирование амплифицированного фрагмента позволило выравнять по БЛАСТ (BLAST - Basic Local Alignment Search Tool) фрагменты длиной 320 п.н. как L. infantum.

Мазки костного мозга человека также исследовали методом световой микроскопии в соответствии со стандартной методикой (МУК 4.2.735-99.).

Москитов отлавливали в жилых и хозяйственных помещениях на «липучки», а также световыми ловушками и эксгаустером. Листы полупергамента (20x30 см), смазанные касторовым маслом («липучки») развешивали в помещениях вечером по методике Н. М. Расницыной (1973), снимали утром. Из отловленных москитов готовили препараты по общепринятой методике (Петрищева П. А., 1961) и определяли, используя морфологические признаки и определительные таблицы (Артемьев М. М., Неронов В. М., 1984).

Для определения зараженности самок москитов лейшманиями проводили амплификацию с праймерами LITSR/L5.8S, предварительно выделив суммарную ДНК фенол-хлороформным методом, результаты визуализировали в УФ-трансиллюминаторе.

Статистическая обработка результатов. Для определения достоверности различий качественных признаков использовали таблицы сопряженностей с вычислением значения критерия х2- Расчеты проводили с помощью статистического пакета Statgraphics 5.0.

ОПИСАНИЕ РАЙОНА ИССЛЕДОВАНИЙ

Узбекистан - государство в Центральной Азии, граничит с Киргизстаном на северо-востоке и востоке, с Казахстаном на севере и северо-западе, с Таджикистаном на юго-востоке, с Туркменистаном на юго-западе, и на юге - с Афганистаном. Материал для наших исследований был собран в Папском районе Наманганской области Узбекистана, расположенном на востоке страны.

Поселок (кишлак) Чоркесар (41°2'24"с.ш., 70°54'36"в.д.) находится на

юго-восточном склоне Кураминского хребта на границе скалистых гор и

8

холмистых предгорий. Население поселка распределено вдоль сезонной реки Ингичка-сай, стекающей с гор в южном направлении. Вдоль горной реки Чодаксай (Кудаксай) расположены поселки Хонобад (40°54'00"с.ш., 70°47'24"в.д.), Чодак (40°57'00"с.ш., 70°45'36"в.д.), Олтинкан (40°56'00" с.ш., 70°45'00"в.д.) и Гулистан (41°3'00"с.ш., 70°42'36"в.д.). Расстояние между поселками 3-6 км, Хонобад-Чоркесар - 20 км.

Климат - резко континентальный, годовое количество осадков - 350-450 мм, при этом с мая по сентябрь выпадает 5-12,2% от их годового количества. Дефицит воды для орошения и небольшое количество выпадающих атмосферных осадков, недостаток плодородных почв делают невозможным посев зерновых культур и развитие садоводства и огородничества на больших площадях. Население живёт за счёт выращивания садово-огородной продукции на своих приусадебных участках (площадью 50-1500 м2), отгонного скотоводства и ремесленного дела.

С удалением от населенных пунктов, а, следовательно, и водного источника, растительность становиться более скудной, состоящей в основном из эфемеров полупустынного типа. В окрестностях населенных пунктов нередки волк (Canis lupus), лисица (Vulpes vulpes), барсук {Meies nieles), дикобраз (Hystrix hirsutirostris).

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК L. infantum В МАЗКАХ КРОВИ На начальной стадии работы были проведены специальные опыты с целью оптимизации режима амплификации для обнаружения минимального числа паразитов в препарате. Из 7-10 дневной культуры штаммов L. infantum (MHOM/KZ/75/MarzDzha) и L. donovani (MHOM/IN/8O/DD8) готовили препараты на предметных стеклах, смешивая паразитов и кровь людей, никогда не выезжавших в очаг В Л. Мы использовали разведение 100, 10 и 1 промастигота на 0,1 мл крови. Препараты крови на предметном стекле высушивали при комнатной температуре. Оценивали: количество вносимой ДНК, разную температуру отжига праймеров, число циклов амплификации.

9

В результате тестирования 80 образцов был выбран режим, позволяющий обнаруживать ДНК одной клетки паразита в препарате.

ОСОБЕННОСТИ ЭПИДЕМИОЛОГИИ ВИСЦЕРАЛЬНОГО ЛЕЙШМАНИОЗА В ПАПСКОМ РАЙОНЕ НАМАНГАНСКОЙ ОБЛАСТИ

УЗБЕКИСТАНА

Распространение случаев висцерального лейшманиоза в населенных пунктах Папского района. Первые случаи заболевания ВЛ в Папском районе были зарегистрированы еще в 1987 г. (Фузайлов Ю.М., 1989), ранее в этих населенных пунктах случаи заболевания никогда не регистрировались. Однако если в период с 1987 по 2000 гг. число случаев колебалось от минимальных значений - 0 до максимальных - 5 случаев заболевания в год (всего за этот период зарегистрировано 20 случаев), то с 2001 г. наблюдается ежегодный рост случаев заболевания (всего 75 случаев ВЛ). Кроме того, за последние 9 лет более чем в два раза выросло и количество населенных пунктов, где был зарегистрирован ВЛ. Распределение случаев ВЛ по населенным пунктам представлено в таблице 1.

Таблица 1. - Распределение больных висцеральным лейшманиозом по населенным пунктам в Папском районе Наманганской области в 19872009 гг. _

Наименование населенного пункта Число больных Всего

1987-2000 гг. 2001-2009 гг. Число больных Процент(%)

Чодак 8 35 43 45,3

Чоркесар 2 14 16 16,8

Олтинкан 7 6 13 13,7

Гулистан 3 1 4 4,2

Хонабад - 4 4 4,2

Янгиобад - 10 10 10,5

Маданият - 2 2 2,1

Янгиер - 2 2 2,1

Голиб - 1 1 1,1

Всего 20 75 95 100

Наибольшее число случаев заболевания отмечено в кишлаках: Чодак - 43 (45,3%), Чоркесар - 16 (16,8%), Олтинкан - 13 (13,7%) и Янгиобад - 10 (10,5%). Анализ повозрастной заболеваемости свидетельствует, что 78,95% больных ВЛ - это дети от 0 до 3 лет.

Среди обследованных методом ПЦР детей было выделено 4 группы.

Группа детей, больных висцеральным лейшманиозом. Эту группу составили 4 ребенка с симптомами ВЛ: лихорадкой и гепатоспленомегалией. Возраст двух больных девочек - 8 лет, одного мальчика - 1 год, другого мальчика - 2 года. У всех детей диагноз ВЛ был подтвержден обнаружением лейшманий в мазках костного мозга и положительной ПЦР. У 3-х из 4-х больных ВЛ посев на культуру дал положительный результат. У 1 ребенка для исследования методом ПЦР были взяты 2 образца: пунктат костного мозга и кровь из пальца. В образце крови ДНК лейшмании не обнаружена, а образец костного мозга был положительный.

Этот опыт показывает, что при использовании ПЦР в диагностике ВЛ надежнее использовать не кровь, а мазок костного мозга. Но, если такая возможность отсутствует, необходимо проводить ПЦР реакции одновременно на нескольких, но не менее чем на двух, препаратах крови от одного больного. Использование нескольких препаратов крови повышает вероятность обнаружения лейшманий, особенно при малом их количестве.

Ретроспективная диагностика. Среди обследованных детей были 13 человек, переболевших ВЛ в разное время в прошлом. Во время болезни все дети прошли курс лечения глюкантимом. На момент обследования дети выглядели здоровыми. Однако у 6 (46,2%) реакция ПЦР была положительная. Положительной была реакция у 3-х из 8 детей, выздоровевших менее года назад, а также по 1 ребенку спустя 2, 7 и 10 лет после выздоровления. Анализ возраста переболевших детей показывает, что 1 (7,7%) ребенок переболел в возрасте до года, 10 (76,9%) детей в возрасте 1-3 года и по 1 ребенку в возрасте 7 и 12 лет.

Среди переболевших были дети из одной семьи: 2 сестры, проживающие

11

в кишлаке Олтикан, перенесшие заболевание в 2000 и 2007 гг. соответственно. Старшая сестра перенесла заболевание в возрасте 3 лет, а младшая - в возрасте 2, временной период между этими случаями ВЛ - 7 лет, на момент исследования они обе оказались ПЦР-положительные. В этой семье было 9 детей в возрасте от 2 до 11 лет, из которых помимо 2 переболевших ВЛ девочек, было обследовано еще 5 человек, все из них оказались ПЦР-положительными.

По данным некоторых авторов лейшмании после лечения исчезают не сразу. В пунктате селезенки, лимфатических узлов и подвздошной кости у 6,1% вылеченных больных могут быть паразиты сразу после курса лечения. Через 1,5-2 года после лечения лейшмании обнаруживали у 3,5% больных (Лю Мэ-ань, Тан И-Ши, Чжан Яо-Джоу, цитата по П.А. Петрищевой, 1961). По данным наших исследований ДНК паразитов может сохраняться в периферической крови до 10 лет после излечения. Возможно предположить и повторное заражение, которое не развивается в болезнь на фоне имеющегося иммунитета или поддерживаемого регулярным подзаражением. Гипотезу о возможном повторном инфицировании людей ВЛ выдвигал ряд авторов (Горбунова Л.А., 1977; Титова И.В., 1983; ШуйкинаЭ.Е., 1984).

Группа детей, находящихся на лечении в больницах с различными диагнозами. 27 детей находились на лечении в больницах с различными диагнозами: ОРВИ, ОКИ, ранний сепсис, ревматизм, пиелонефрит, анемия, отит, гепатит, температура неясного происхождения. От 18 пациентов на исследовании была кровь, взятая из пальца, от 9 - из вены. И в тех, и в других образцах были ПЦР-положительные. ПЦР-положительная реакция на ВЛ была у больных с диагнозом ОРВИ, анемия, анемия+пиелонефрит, пиелонефрит и ОКИ. Такие диагнозы как ОРВИ и анемия имеют ряд общих симптомов с ВЛ.

Известно, что возбудитель ВЛ обладает иммунносупрессивным

действием, т.е. может создавать благоприятные условия для заражения,

развития и более тяжелого течения сопутствующей инфекции. Вполне вероятно

12

допустить, что у исследованных нами детей, госпитализированных в больницах, течение основного заболевания протекало на фоне заражения возбудителем ВЛ. К сожалению, у нас не было возможности получить более точные данные о лабораторных исследованиях этих детей и результатах лечения.

Группа практически здоровых детей. В эту группу вошло 190 человек. На момент обследования все дети этой группы чувствовали себя хорошо, у них не наблюдалось симптомов каких-либо заболеваний. Среди детей этой группы оказалось 85 (44,7%) ПЦР-положительных. Распределение ПЦР-положительных детей среди практически здоровых по 5 населенным пунктам было приблизительно одинаковым (таблица 2).

Таблица 2. - Распределение обследованных здоровых детей на наличие ДНК L. infantum по населенным пунктам

Кишлак Число обследованных ПЦР- положительные ПЦР- отрицательные

Чодак 51 24 (47,1% ±2,1%) 27

Гулистан 36 11 (30,6% ±2,1%) 25

Олтинкан 75 38 (50,7% ±2,1%) 37

Чоркесар 5 2 (66,7% ±2,1%) 3

Хонобад 23 10 (43,5% ±2,1%) 13

Итого 190 85 (44,7%) 105 (55,3%)

Анализ повозрастного распределения ПЦР-положительных среди обследованных здоровых детей показывает, что во всех возрастных группах процент был высок. Однако в группе детей в возрасте от 0 до 3 лет ПЦР-положительных было немного меньше, чем в группах 4-7 и 8-15 лет (таблица

3).

Таблица 3. - Результаты обследования различных возрастных групп здоровых детей на наличие ДНК L. infantum

Возрастная группа Всего ПЦР + ПЦР -

0-3 года 43 16 (37,2%) 27

4-7 лет 66 33 (50 %) 33

8-15 лет 81 36 (44,4%) 45

Всего 190 85 (44,7%) 105

Следует отметить, что у 85 детей из 190 практически здоровых, у которых обнаружена ДНК L. infantum, иммунный ответ методом ИФА установлен лишь у 4 (4,7%). Известно, что у некоторых детей, особенно младших возрастных групп, иммунный ответ на внедрение возбудителя не развивается или имеются лица с низким уровнем антителообразования (Шуйкина Э.Е., 1989). Возможно, методом ПНР диагностируются дети до развития IgG. Следует отметить два момента: использованная нами модификация ПЦР обнаруживает ДНК L. infantum, но не распознает ее жизнеспособность. Известно, что ДНК сохраняется достаточно продолжительное время, до года (Riera С. et al., 2004). Наши наблюдения за здоровыми, но ПЦР-положительными детьми, свидетельствуют, что никто из них не заболел лейшманиозом в течение второго года наших исследований.

Считается, что болезнь у детей протекает в острой форме, симптомы болезни и осложнения нередко нарастают стремительно. Бессимптомное носительство чаще отмечали у взрослых. Такое положение объясняют особенностями иммунитета: незрелого, не способного противостоять паразитам у детей и компетентного, способного защитить от лейшманиоза у здоровых взрослых. Полученный в наших исследованиях материал о значительном числе ПЦР-положительных среди здоровых детей заставляет усомниться, что у детей болезнь всегда протекает остро и свидетельствует, что бессимптомное носительство возможно у детей всех возрастных групп, в том числе и младших.

Обследование детей разного пола на наличие ДНК L. infantum. Среди обследованных 104 мальчиков и 86 девочек значительное преобладание ПЦР-положительных было среди девочек - 59,3% против 32,7% у мальчиков. Эти различия статистически достоверны (х2=13,48; р<0,001).

Выявленные различия между девочками и мальчиками среди ПЦР-положительных, возможно, определяются различной степенью контакта детей с москитами. По каким-то причинам в обследованных населенных пунктах москиты нападали на девочек активнее, чем на мальчиков. Это нельзя объяснить особенностями одежды, т.к. девочки в сельской местности Узбекистана носят более закрытую одежду. Одним из объяснений может быть предположение, что девочки проводят больше времени в доме, где на них нападает P. longiductus - классический эндофил и очень агрессивный в отношении человека вид москита (Дергачева Т.И. и соавт., 1988; Стрелкова М.В., Дергачева Т.И., 1986), а мальчики больше времени проводят на улице и более подвижны.

Обследование детей на наличие ДНК L. infantum в присутствии или отсутствии в семье собаки. ПЦР-положительные дети были обнаружены в семьях, где были собаки и там, где собак не было. При этом число ПЦР-положительных детей было практически одинаковым: у 43 ПЦР-положительных детей собака живет во дворе, у 42 ПЦР-положительных собаки во дворе нет.

Таким образом, присутствие собаки в непосредственной близости от детей не сказывалось на возможность заражения BJI (х2=0,0002; р=0,99). Такой неожиданный вывод, по-видимому, можно объяснить большим количеством собак в целом в обследованных населенных пунктах, а также близким расположением соседних домов, в том числе тех, в которых были собаки, и возможностью для москитов преодолевать это расстояние.

РОЛЬ ПРИРОДНЫХ И СОЦИАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ В СТАНОВЛЕНИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ СИНАНТРОПНЫХ ОЧАГОВ

ВИСЦЕРАЛЬНОГО ЛЕЙШМАНИОЗА В ПАПСКОМ РАЙОНЕ НАМАНГАНСКОЙ ОБЛАСТИ УЗБЕКИСТАНА

Формирование активных очагов ВЛ в Наманганской области Узбекистана зависело от целого ряда факторов, благоприятных для возникновения и дальнейшего функционирования этих очагов.

В исследованиях, касающихся ВЛ, неоднократно отмечалось, что значительная часть очагов сосредоточена в слабо возвышенных районах, в пределах от 300 до 600 м. Это объясняется тем, что, с одной стороны, данная зона больше всего заселена людьми, с другой, - выше 600 м наблюдается постепенное снижение численности москитов (Карапетян P.M., Багдасарян А.Б, 1972; Маруашвили Г. М., 1968). Население пяти обследованных нами поселков проживает значительно выше, на высоте 780-1300 м над уровнем моря, и достаточно многочисленно (суммарно более 41 тыс. человек). Это связано с горнодобывающим производством в поселках Чодак и Чоркесар в прошлом. В настоящее время предприятия закрыты, и местное население, в основном, занято животноводством.

Ежегодно с апреля и до конца октября большая часть крупного и мелкого рогатого скота с сопровождающими их людьми и собаками откочевывает в среднегорья и высокогорья, где имеются богатые кормом альпийские луга. В ноябре скот возвращается в поселки и до марта животные находятся в хозяйственных помещениях на территории усадеб. Характерной особенностью построек для скота является наличие мощной подстилки из навоза, достигающей местами 10-20 см и более, которая годами не утилизируется и является прекрасным субстратом для развития преимагинальных стадий москитов.

Глинобитные стены и крыши жилых и хозяйственных построек служат

надежной защитой от прямого воздействия солнечных лучей и повышенной

температуры воздуха в дневное время летом не только для людей, но и

16

москитов. Следует также отметить, что местное население спит в домах, ночные температуры - +14...17°С. Обычно в одной комнате спит несколько человек, при этом не применяется защита от укусов москитов: защитные сетки на окнах, пологи для сна или инсектициды для внутренней обработки помещений или построек для скота. В некоторых домах эксгаустером было собрано до 112 экземпляров москитов. Большое количество спящих людей в одной комнате без отпугивающих и защитных средств привлекают москитов как источник питания.

Наибольшее влияние на распространение москитов, по мнению ряда исследователей, занимающихся их экологией и фенологией, оказывают температура и влажность воздуха и субстрата, где развиваются преимагинальные стадии (Долматова A.B., Демина H.A., 1965; Малхазова С.М., Неронов В.М., 1983; Петрищева П.А., 1961). Москиты встречаются лишь в тех местах, где не менее 50 дней (продолжительность развития одной генерации) температура не падает на длительное время ниже 20°С. Большинство видов не активны при температуре ниже 15°С и быстро погибают при температуре выше 39°С (Малхазова С.М., Неронов В.М., 1983). В исследованных очагах среднемесячные температуры июля - 24,5°С, июня - 23°С и августа - 22°С, влажность воздуха в летние месяцы 30-40%. Эти условия вполне благоприятны для выплода и обитания многих горных нетермофильных видов. Однако в фауне обследованных населенных пунктов зарегистрированы и типичные равнинные виды.

В 4-х обследованных нами населенных пунктах Папского района Наманганской области обнаружено 10 видов москитов, из них 8 относятся к роду Phlebotomus (4 подрода: подрод Phlebotomus - Р. papatasi; подрод Paraphlebotomus - Р. sergenti, Р. nuri, Р. caucasicus, Р. alexandri; подрод Larroussius - Р. keshishiani, подрод Adlerius - Р. longiductus, Р. angustus) и 2 к роду Sergentomyia (подрод Parrotomyia - S. sumbarica, S. grecovi). Во всех сборах в летний период отмечается наличие доказанного переносчика возбудителя BJI - Р. longiductus. Однако индекс обилия (количество особей на 1

17

липучку) этого вида незначителен (0,04 - 0,5). Р. ¡ongiductus является эндофилом, т.е. топически тесно связан с жильем человека, активно нападает на человека и, по-видимому, на собак. Оба эти фактора, безусловно, повышают эффективность P. longiductus как переносчика.

На большей части территории ареала ВЛ Старого Света переносчиками L. infantum являются представители подродов Larroussius и Adlerius (Артемьев М.М., Неронов В.М., 1984; Killick-Kendrick R., 1990), поэтому не исключена возможность участия в передаче возбудителя ВЛ в данном регионе других представителей этих подродов, например, P. angustus и P. keshishiani. При отлове на светоловушку доля Р. longiductus, Р.angustus, Р. keshishiani составляла 15-51,9% от числа отловленных москитов, что подтверждает известную закономерность о привлечении на искусственный свет представителей подрода Larroussius и несколько меньше москитов подрода Adlerius (Артемьев М.М., Неронов В.М., 1984), что повышает их эпидемическую опасность.

С целью изучения зараженности самок москитов возбудителем ВЛ было исследовано 380 самок москитов 5 видов: P. papatasi, P. sergenti, Р. keshishiani, Р. longiductus, Р. angustus. Москитов собирали на липучки в июле 2008 г. в хозяйственных помещениях. Однако ДНК лейшманий не была обнаружена. Вероятнее всего отрицательный результат можно объяснить двумя причинами. Первая причина - низкий процент (0,1 - 3,7%) зараженных лейшманиями москитов в природе, что отмечают многие исследователи (Карапетян P.M., Багдасарян А.Б., 1972; Kato Н. et al., 2010), вторая причина - небольшое число (120) исследованных москитов, вероятных переносчиков - Р. keshishiani, Р. angustus, Р. longiductus.

Рост эпидемической напряженности в очагах ВЛ в этом регионе, видимо, происходил по мере увеличения числа зараженных собак непосредственно в населенных пунктах, о чем свидетельствует кривая случаев ВЛ с 1987 по 2009 гг. (рисунок 1). Кривая заболеваемости до 2000 г. характеризуется подъемами и спадами, отсутствием больных в отдельные годы. Такая кривая больше

18

характерна для очагов, где источником инфекции являются дикие животные, топически и трофически удаленные от людей. Начиная с 2000 г. число случаев заболевания значительно увеличивалось, что характеризует постоянное присутствие источника инфекции в непосредственной близости от объектов заражения, т.е. собак.

Рисунок 1, - Число случаев заболевания ВЛ в Папском районе.

Во всех поселках много собак: они живут во дворах усадеб на привязи или свободно, часть животных перемещается свободно по поселку, имеются и бездомные. Ветеринарная служба не ведет надзор за животными и не проводит отлов и отстрел больных животных. Местное население не информировано о причинах и условиях распространения ВЛ и не знает признаки лейшманиоза у собак. Отказ животных от еды и питья хозяева объясняют старостью животных, остальным признакам заболевания не придают значения.

Из 162 обследованных в рамках нашего проекта собак у 42 (25,9%) зарегистрированы клинические признаки ВЛ в виде облысения, иногда изъязвления на коже, а также различных дерматитов вокруг глаз и ушных раковин, похудания, увеличения селезенки. Из 42 собак с клиническими признаками заболевания антитела к возбудителю ВЛ ИФА выявлены у 26 (61,9%). Среди 120 внешне здоровых собак положительная реакция на ВЛ обнаружена у 26 (21,6%). Во всех 4 населенных пунктах процент

сероположительных среди собак с внешними признаками болезни и среди внешне здоровых был высоким - 32%. Образцы крови 4 лисиц и 1 кота показали отрицательный результат (Коваленко Д.А. и соавт., 2011).

Обследованные очаги BJI Папского района в настоящее время следует отнести к синантропным, где циркуляция возбудителя осуществляется внутри населенных пунктов. Даже если допустить возможность заражения BJI собак, используемых на пастбищах, от лисиц и шакалов, скорее всего в настоящее время такие собаки не играют значительной роли в поддержании циркуляции возбудителя среди поселковых собак.

В 2009 г. был идентифицирован возбудитель ВЛ из Узбекистана и Таджикистана как L. infantum, представляющий самостоятельный кластер наиболее широко распространенного зимодема MON-1 (Alam M.Z. et al., 2009). Восемь штаммов лейшманий, выделенных от собак в Узбекистане, были идентичны идентифицированным от людей в изучаемой области (Kovalenko D.A. et al., 2011).

Таким образом, все вышеперечисленные факторы способствуют устойчивому функционированию данных очагов. Очаги Наманганской области относятся к средней эпидемической опасности (3-14 случаев заболевания на 10 тыс. жителей) (Малхазова С.М., 1975; Малхазова С.М., Неронов В.М., 1975). Заболеваемость средиземноморским висцеральным лейшманиозом в синантропных очагах остается стабильной на протяжении многих лет, если не проводить уничтожение больных собак и переносчиков. Положительный опыт борьбы с синантропными очагами ВЛ в СССР свидетельствует о возможности контроля за такими очагами и тем самым предупреждения заболеваемости ВЛ и смертности среди детей, проживающих в данной местности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оценивая особенности очага ВЛ в Папском районе Наманганской области Узбекистана, отличающие его от других очагов ВЛ, следует отметить:

Первой отличительной чертой очага ВЛ Папского района является его точный «возраст» и история формирования. Первые случаи ВЛ среди людей

20

отмечены в 1987 г., до этого в Папском районе В Л никогда не регистрировали. Таким образом «возраст очага» в настоящий момент составляет 26 лет. Эти годы можно условно разделить на два периода. Первые 13 лет случаи В Л среди людей регистрировали не каждый год, в небольшом числе и ограниченных населенных пунктах, что явно указывало на небольшое число зараженных собак в поселках и позволяло предполагать что заражение людей возможно и от диких животных. С 2000 года по настоящее время, т.е. следующие 13 лет, случаи ВЛ среди людей регистрируются ежегодно, чаще и в большем числе населенных пунктов, что свидетельствует, что возбудитель ВЛ в настоящее время поддерживается популяцией поселковых собак.

Второй отличительной чертой очага ВЛ Папского района является высотное расположение населенных пунктов с значительной численностью проживающего в них населения. Прежде все известные очаги ВЛ располагались не выше 600 м над уровнем моря, а очаг Папского района расположен на высоте 780-1340 м над уровнем моря. Этот факт в значительной мере определяет видовой состав москитов, преобладают горные нетермофильные представители, а также продолжительность активности москитов и сезона передачи возбудителя ВЛ.

Третьей отличительной чертой очага Папского района является большой процент ПЦР-положительных случаев среди практически здоровых детей, причем всех возрастных групп. Такое значительное бессимптомное носительство существенно отличает очаг ВЛ в Папском районе от других известных очагов.

ВЫВОДЫ

1. В процессе исследования составлена характеристика очага В Л Папского района Наманганской области Узбекистана средней эпидемической опасности. Выделяя особенности очага, следует отметить высотное расположение (7801340 м над у. м.) с значительной численностью проживающего населения (более 41 000 человек), историю становления как синантропного, большой

процент ПЦР-положительных случаев (44,7%) среди обследованных практически здоровых детей, причем всех возрастных групп.

2. В обследованном очаге BJI обнаружено 10 видов москитов, типичных горных нетермофильных представителей, из них 8 относятся к роду Phlebotomus и 2 к роду Sergentomyia. 3 вида являются основными или потенциальными переносчиками L. infantum.

3. Значительный процент ПЦР-положительных реакций у практически здоровых детей свидетельствует о бессимптомном носительстве и изменяет прежнее представление о BJI у детей только как об острой инфекции с быстро развивающимися симптомами.

4. Обнаружено присутствие ДНК возбудителя BJI в периферической крови детей спустя 7 и 10 лет после клинического выздоровления.

5. Доказано присутствие ДНК лейшманий в периферической крови обследованных детей, что требует ужесточить правила безопасности инъекций и сопутствующих процедур.

6. ПЦР в нашей модификации позволяет выявлять 1-2 клетки возбудителя BJI в клинических образцах, что дает возможность использовать эту реакцию не только в диагностике, но и популяционных эпидемиологических исследованиях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При диагностике висцерального лейшманиоза целесообразнее использовать препараты костного мозга, но в случае невозможности их получения из-за состояния пациента, а также при скрининговых эпидемиологических обследованиях населения в эндемичных по BJI регионах, можно использовать препараты крови на предметных стеклах.

Необходимо ужесточить правила безопасности инъекций и сопутствующих процедур у пациентов в странах эндемичных по BJI, а также у лиц, побывавших в этих странах в период передачи возбудителя.

В синантропных очагах BJI необходим мониторинг зараженности собак и численности москитов-переносчиков. На ветеринарную службу возлагается

22

уничтожение или лечение больных BJI собак и отлов бродячих. Органам санитарно-эпидемиологического контроля рекомендуется проведение противомоскитных обработок в домах и хозяйственных постройках.

Важным аспектом является просветительская работа с местным населением о необходимости применения индивидуальных защитных средств от нападения кровососущих насекомых, а также улучшения санитарных условий в хозяйственных постройках - утилизация навоза и тем самым уничтожение мест выплода москитов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Понировский E.H., Стрелкова М.В., Гончаров Д.Б., Жиренкина E.H., Черникова Ю.А. Висцеральный лейшманиоз в странах Содружества Независимых Государств (СНГ): итоги и основные направления дальнейшего изучения // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2006. -№4.-С. 25-31.

2. Баранец М.С., Дарченкова H.H., Понировский E.H., Жиренкина E.H. Распространение и эпидемиологическое значение москитов (Diptera, Psichodidae, Phlebotominae) Кавказа // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2011. - № 2. - С. 10 - 15.

3. Коваленко Д.А., Насырова P.M., Пономарева В.И., Фатуллаева A.A., Разаков Ш.А., Понировский E.H., Стрелкова М.В., Жиренкина E.H., Морозов E.H., Джаф Ч., Банет Г., Шнур Л., Варбург А., Шониан Г. Висцеральный лейшманиоз у людей и собак в Папском районе Наманганской области Узбекистана: сероэпидемиологические исследования // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2011. - № 3 - С. 32 - 37.

4. Жиренкина E.H., Понировский E.H., Стрелкова М.В., Морозов E.H., Флегонтов П.Н., Колесников A.A., Пономарева В.И., Насырова P.M., Коваленко Д.А., Фатуллаева A.A., Разаков Ш.А., Шнур Л., Джаф Ч, Банет Г., Варбург А., Шониан Г. Особенности эпидемиологии висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана, выявленные при

23

обследовании детей методом ПЦР // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2011. -№3 - С. 37-41.

5. Понировский E.H., Жиренкина E.H., Стрелкова М.В., Баранец М.С., Фатуллаева A.A., Пономарева В.И., Коваленко Д.А., Насырова P.M., Разаков Ш.А., Шониан Г. Видовой состав и эпидемиологическое значение москитов (Díptera, Psychodidae, Phlebotominae) в очагах висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2012. - № 3 - С. 34 - 38.

Подписано в печать. 13.05.2013. Формат А4/2 Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №0117-2 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жиренкина, Екатерина Николаевна, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201357104

На правах рукописи

Жиренкина Екатерина Николаевна

ОСОБЕННОСТИ ОЧАГА ВИСЦЕРАЛЬНОГО ЛЕЙШМАНИОЗА В ПАПСКОМ РАЙОНЕ НАМАНГАНСКОЙ ОБЛАСТИ УЗБЕКИСТАНА

03.02.11 - Паразитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Е. Н.

Список сокращений.......................................................................4

Введение........................................................................................5

Глава 1. Паразитарная система висцерального лейшманиоза в Старом Свете (Обзор литературы)..............................................................10

1.1. Характеристика возбудителя L. infantum......................................10

1.1.1. Особенности биологии и морфологии возбудителя..................10

1.1.2. Биохимические свойства..................................................10

1.1.3. Антигенные свойства......................................................11

1.1.4. Молекулярно-генетические свойства...................................12

1.2. Характеристика резервуара и переносчиков..................................13

1.2.1. Доказанные и потенциальные позвоночные хозяева................13

1.2.2. Доказанные и потенциальные виды переносчиков..................15

1.3. Распространение висцерального лейшманиоза..............................16

1.3.1.Распространение очагов в Старом Свете................................16

1.3^.Распространение висцерального лейшманиоза в Узбекистане.... 18

1.4. Особенности клинического течения............................................18

1.4.1. Классическое течение заболевания.....................................18

1.4.2. Бессимптомное носительство инфекции...............................19

1.4.3. Смешанные с висцеральным лейшманиозом инфекции............20

Глава 2. Материалы и методы исследований.....................................23

2.1. Объем исследований.........................................................23

2.2. Методы исследований........................................................24

Глава 3. Описание района исследований..........................................34

Глава 4. Оптимизация условий полимеразной цепной реакции для обнаружения ДНК L. infantum в мазках крови...................................38

4.1. Методы диагностики, видовой идентификации и скрининговых исследований лейшманиозов............................................................38

4.2. Оптимизация режима амплификации....................................40

4.3. Оценка воспроизводимости метода.......................................45

Глава 5. Особенности эпидемиологии висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана......................46

5.1. Распространение случаев висцерального лейшманиоза в населенных пунктах Папского района................................................46

5.2. Группа детей, больных висцеральным лейшманиозом...............47

5.3. Ретроспективная диагностика...............................................48

5.4. Группа детей, находящихся на лечении в больницах с различными диагнозами..................................................................................49

5.5. Группа практически здоровых детей......................................51

5.6. Обследование детей разного пола на наличие ДНК L. infantum.....53

5.7. Обследование детей на наличие ДНК L. infantum в присутствии

или отсутствии в семье собаки..........................................................53

Глава 6. Роль природных и социальных факторов в становлении и функционировании синантропных очагов висцерального лейшманиоза в

Папском районе Наманганской области Узбекистана........................55

Заключение..................................................................................70

Выводы......................................................................................74

Практические рекомендации.........................................................75

Список литературы......................................................................76

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

BJI - висцеральный лейшманиоз

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

К+ - контроль положительный

К- - контроль отрицательный

к ДНК - кинетопластная ДНК

КЛ - кожный лейшманиоз

мРНК - митохондриальная РНК

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная РНК

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита человека т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

INTAS - The International Association (ИНТАС) - фонд для поддержки сотрудничества между странами СНГ и странами ЕС UNAIDS - совместная национальная программа по ВИЧ/СПИД

Актуальность проблемы. Лейшманиозы широко распространены в мире, риску заражения ежегодно подвергается около 350 млн. человек. Несмотря на то, что лейшманиозы зарегистрированы в 98 странах, только из 33 стран поступают сообщения о местных случаях заболевания, что связано с отсутствием обязательной регистрации больных лейшманиозами в большинстве стран.

Висцеральный лейшманиоз (BJI), вызываемый L. infantum (синонимы: средиземноморский лейшманиоз, детский лейшманиоз), в Старом Свете распространен, главным образом, в странах Средиземноморья, Ближнего и Среднего Востока, Закавказья и Центральной Азии. ВЛ среди других лейшманиозов Старого Света является наиболее опасным заболеванием: при отсутствии вовремя поставленного диагноза и специфического лечения BJI, как правило, приводит к смерти пациента. Группой риска являются дети, особенно младших возрастных групп.

В первой половине прошлого века Узбекистан занимал лидирующее положение по числу заболевших BJI среди республик СССР. Однако к концу 60-х годов XX столетия заболеваемость BJI снизилась до спорадических, единичных случаев [21]. Это произошло в результате уничтожения бродячих и больных BJI собак, начатого в Ташкенте в 1925 г. под руководством Н.И.Ходукина и в 1932 г. в Самарканде под руководством Л.М.Исаева, а также длительных и широкомасштабных противомалярийных мер по снижению численности комаров в городских и сельских местностях, приведших одновременно к снижению численности москитов. По данным официальной статистики с 1920 по 1985 гг. в республике было зарегистрировано 6112 случаев В Л [1], ас 1960 по 1987 гг. - только 108 случаев заболевания [53].

В настоящее время основной очаг ВЛ находится в Папском районе Наманганской области [134]. Первые случаи В Л в Папском районе были

зарегистрированы в 1987 г. [77], ранее в этих населенных пунктах случаи заболевания не были отмечены. Всего с 1987 по 2009 гг. зарегистрировано 95 случаев BJI в 9 населенных пунктах этого района [30]. Возобновление заболеваемости BJI в Республике Узбекистан показало необходимость изучения современного распространения заболевания среди людей, выявления резервуара инфекции и переносчиков с использованием актуальных методов исследования. Международный фонд INTAS поддержал заявку 4-х стран - Узбекистана, России, Германии и Израиля на выполнение совместного проекта «Борьба с висцеральным лейшманиозом в Узбекистане путем создания системы эпиднадзора с использованием новейших иммунологических и молекулярно-биологических методов» («Control of visceral leishmaniasis in Uzbekistan by creating a comprehensive surveillance system, integrating recently developed immunological and molecular biological techniques, 2007-2009), (№ 05-1000008-8043). В обязанности российских исследователей входило:

• совместные полевые исследования, включая отлов москитов,

• лабораторная обработка части полученных образцов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР),

• видовая идентификация москитов,

• анализ полученных результатов.

Цель диссертационной работы: изучить особенности очага В Л в Папском районе Наманганской области Узбекистана с применением классических паразитологических и современных молекулярно-биологических методов.

Задачи исследований: 1. Обследовать детей до 15 лет в 5 населенных пунктах Папского района Наманганской области Узбекистана, где случаи BJI регулярно регистрируются в последние годы.

2. Обработать клинические образцы, полученные при обследовании людей, методом ПЦР, предварительно адаптировав его для выявления 1 паразита в 0,1 мл образца материала.

3. Изучить видовой состав и выявить эпидемически опасные виды москитов.

4. Определить факторы, способствующие функционированию паразитарной системы ВЛ в данной местности.

Научная новизна результатов исследований:

1. Впервые на территории Содружества Независимых Государств (СНГ) обследован очаг ВЛ с применением современного метода молекулярной диагностики, позволившего получить прежде неизвестные факты об эпидемиологии заболевания.

2. Выявлен значительный процент ПЦР-положительных реакций у практически здоровых детей, свидетельствующий о бессимптомном носительстве и опровергающий прежнее представление о ВЛ у детей как только об острой инфекции с быстро развивающимися клиническими симптомами. Этот факт позволяет считать ВЛ оппортунистической инфекцией.

3. ДНК лейшманий была обнаружена в крови обследованных детей, что позволяет использовать образцы периферической крови при скрининговых обследованиях населения эндемичных по ВЛ территорий, предполагает пересмотр роли человека как источника инфекции при ВЛ, заставляет ужесточить правила безопасности инъекций и сопутствующих процедур.

Практическая значимость результатов исследования: Результаты исследований используют при проведении мероприятий по эпидемиологическому надзору в Узбекистане.

Материалы исследований включены в циклы лекций кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава РФ, а также используются в практике

проведения учебных курсов по паразитарным болезням на базе НРШ медицинской паразитологии им. Л.М.Исаева Министерства здравоохранения Республики Узбекистан и клиники института.

Внедрение материалов исследований в практику:

Материалы исследований включены в справочное пособие «Методики клинических лабораторных исследований». Т. 3. Под ред. В.В. Меньшикова, 2009[47].

Положения, выносимые на защиту:

1. В населенных пунктах Папского района Наманганской области Узбекистана висцеральным лейшманиозом болеют дети, в основном до 3-х лет, что делает эти очаги сходными с другими очагами Средиземноморского ВЛ. Отличительной чертой является значительный процент детей, в крови которых обнаружена ДНК возбудителя ВЛ, без клинических проявлений -бессимптомных носителей инфекции, исследованных специально адаптированным (для обнаружения до 1 паразита в 0,1 мл клинического образца) методом ПЦР.

2. Очаги ВЛ в Папском районе Наманганской области в настоящее время являются синантропными, возбудитель циркулирует внутри населенных пунктов, основными источниками инфекции являются поселковые собаки, переносчиком - Phlebotomus longiductus.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были доложены:

- на коллоквиуме отдела молекулярной паразитологии Института микробиологии и гигиены Медицинского Университета Шарите, г. Берлин, май 2008 г.,

- на коллоквиумах ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, февраль 2010 г., июнь 2012 г.,

на VII Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика - 2010», г. Москва, 24-26 ноября 2010 г.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 5 работ в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 163 источника, из которых 82 на русском языке. Работа проиллюстрирована 11 таблицами и 14 рисунками.

Благодарности

Выражаю глубокую признательность всем участникам проекта ГЫТА8 за плодотворную совместную работу, а также медицинскому персоналу Папского района Узбекистана, предоставившему образцы для наших исследований. Выражаю признательность руководителю проекта - доктору Габриеле Шониан за предоставленную возможность стажировки в Институте микробиологии и гигиены Медицинского Университета Шарите (Берлин, Германия) для определения зараженности москитов молекулярным методом. Особую благодарность выражаю Стрелковой Маргарите Витальевне за постоянное внимание к моей работе на всех ее этапах.

Глава 1. ПАРАЗИТАРНАЯ СИСТЕМА ВИСЦЕРАЛЬНОГО ЛЕЙШМАНИОЗА В СТАРОМ СВЕТЕ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Характеристика возбудителя L. infantum

1.1.1. Особенности биологии и морфологии возбудителя

В соответствии с классификацией, разработанной специальной комиссией Международного общества протозоологов [129], возбудителя висцерального лейшманиоза относят к царству Animalia, подцарству Protozoa, типу Sarcomastigophora Honigberg et Balamuth, 1963, подтипу Mastigophora Diesing, 1866, классу Zoomastigophorea Calkins, 1909, отряду Kinetoplastida Honigberg, 1963, подотряду Trypanosomatina Kent, 1880, семейству Trypanosomatidae Doflein, 1901, роду Leishmania Ross, 1903, виду L. infantum Nicolle, 1903.

Возбудитель проходит две стадии развития: в организме человека или позвоночного животного - внутриклеточная, неподвижная, безжгутиковая -амастигота, в организме переносчиков и в культуре - подвижная, свободноживущая, жгутиковая - промастигота. В световом микроскопе в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, амастиготы лейшманий представляют собой круглые или овальные тельца размером 2-3 мкм. Всегда четко видны: серовато-голубая цитоплазма, хорошо окрашенное ядро, красного или красно-фиолетового цвета, кинетопласт, окрашенный более интенсивно, чем ядро, в темно-фиолетовый цвет, иногда виден внутриклеточный участок жгута. Промастиготы имеют длину 10-30 мкм, ширину до 5 мкм, жгут - около 20 мкм. Ядро располагается в средней утолщенной части, кинетопласт в переднем конце, от которого отходит длинный свободный жгут [27; 54; 66; 75].

1.1.2. Биохимические свойства

Показатели электрофоретической подвижности изоэнзимов являются одним из важнейших таксономических признаков лейшманий [20; 108].

Для L. infantum характерен широкий полиморфизм. В настоящее время этот вид включает в себя 31 зимодем, из которых 30 были обнаружены у людей [149]. Некоторые из них вызывают только висцеральные проявления (например, MON-27, 28, 72, 77, 187), другие, напротив, кожные (например, MON-11, 29, 33, 78, 111) [97; 149; 150; 151].

Наиболее распространенным зимодемом является MON-1, который регистрируют более чем в 30 странах мира (примерно 70% всех выявленных штаммов) [110]. Особенно широко этот зимодем встречается в Португалии (96,7%), в Южной Франции (88%), в Италии (более 50%), в Испании (4458%) [96; 99; 115; 119; 137; 151]. Коинфицирование ВИЧ/ВЛ в 50-73% случаев связано с этим зимодемом [88; 89; 150]. Однако при выделении возбудителя от москитов лишь в 18% случаев обнаруживают зимодем MON-1 [137].

Идентификация методом изоэнзимного электрофореза штаммов, выделенных от больных ВЛ людей на территории Азербайджана, Грузии, Казахстана, Крыма и Туркмении, позволила отнести их к L. infantum [2; 38; 72; 159].

Три из четырех изолятов, выделенных в Туркмении от собак, имели большое сходство с изолятами от людей, но ни один из них не был идентичен ни одному из 8 изолятов от больных ВЛ людей. Изоэнзимный профиль четвертого штамма от собаки ИОЛ-5 (MCAN/ASH/90/IOL-5) отличался от всех маркерных штаммов и исследованных изолятов [38]. 1.1.3. Антигенные свойства

Антигенные свойства каждого вида лейшманий достаточно стабильны, и с помощью серологических методов можно успешно дифференцировать и идентифицировать различные их виды [58; 71]. Для серологической идентификации видов лейшманий ранее применяли тест Ногуши, тест Адлера, тест Оухтерлони, реакцию пассивной гемагглютинации [66], экскреторный фактор и иммуноферетиновый тест [8].

Так, при помощи модифицированного теста Адлера [65; 67] проведено сравнительное изучение штаммов лейшманий, выделенных в Грузии от больного BJI ребенка и от собаки из того же очага. Идентичные друг другу штаммы от ребенка и собаки были квалифицированы как самостоятельный серотип L. donovani s. I. Он отличался в антигенном отношении от штаммов возбудителей BJI из Туркменистана (MHOM/SU/64/VL) и Азербайджана (MHOM/SU/78/B-1), а также от возбудителей кожного лейшманиоза L. major (MHOM/SU/73/5-Ash - выделенного в Туркменистане и MHOM/SU/86/9MB - выделенного в Узбекистане) и L. tropica (MHOM/SU/72/K-27 выделенного в Азербайджане) [8]. 1.1.4. Молекулярно-генетические свойства

Известно, что геном L. infantum содержит 36 хромосом в ядре и кинетопластную ДНК [163].

Кинетопластная ДНК может быть изолирована как единая целая структура. Электронно-микроскопическое изучение ДНК кинетопласта выявило наличие двух слоев мини-колец [66]. Мини-кольца составляют основную массу ассоциата (85-95% по оценкам разных авторов). Размер мини-кольцевых молекул L. infantum 850 п. н. Все мини-кольцевые молекулы ДНК содержат консервативную и вариабельную области.

Макси-кольцевые молекулы кДНК представляют минорный компонент ассоциата. Размеры молекул варьируют у разных видов от 20 до 40 т. п. н., у L. infantum 26 т. п. н. [31]. Эти изменения размера содержатся в их вариабельных областях, в то время как содержание кодирующей области и порядок генов остаются теми же [157]. Можно считать установленным, что макси-кольцевые ДНК являются истинными аналогами митохондриальной ДНК эукариот.