Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика транскрипции в митохондриях жгутиковых простейших

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика транскрипции в митохондриях жгутиковых простейших"

На правах рукописи

Бессолицына Екатерина Андреевна

Характеристика транскрипции в митохондриях жгутиковых простейших

03.00.03 - Молекулярная биология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии Биологического факультета Московского государственного университета им. МБ. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор биологических наук, профессор Колесников Александр Александрович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Шпаковскпй Георгий Вячеславович Доктор биологических наук, профессор Сулимова Галина Ефимовна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН.

Защита состоится £ ■¿'ноября 2004 г. в на заседании Диссертационного Совета Д. 501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан ЖОпяе^зя2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета доктор биологических наук

Н.О. Калинина

¿ООН

<696?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость проблемы:

Изучение паразитических простейших, относящихся к семейству ТгурапозотаМае, помимо фундаментального интереса также имеет практическую значимость. К этому таксону относятся паразиты растений, насекомых и позвоночных животных, которые являются возбудителями серьезных заболеваний человека (трипаносомозы и лейшманиозы) домашних животных и растений. При этом до сих пор не существует эффективных методов борьбы с этими возбудителями. Это стало одной из главных причин активного изучения представителей этого семейства.

У трипаносоматид обнаружены уникальные процессы, нехарактерные для представителей других групп организмов, одним из которых является уридиловое редактирование, на данный момент изученное достаточно подробно. Уридиловое редактирование - это процесс, заключающийся в посттрансткрипционных вставках и/или делециях уридиловых остатков из/в митохондриальные пре-мРНК. Показано, что этот процесс полярный (3'-5') и матричный (матрицей для редактирования являются гидовые РНК). Д ля описания этого типа редактирования был предложен механизм ферментативного каскада, который подтвержден экспериментально, выделен белковый комплекс, обеспечивающий этот процесс и охарактеризованы белки, участвующие в этом процессе. Несмотря на то, что процесс редактирования и организация мтДНК трипаносоматид изучены достаточно подробно, сведения о транскрипции митохондриального генома и процессинге пре-мРНК очень скудны. Как и в изучении редактирования, основной областью интересов являются белки, участвующие в митохондриальных транскрипции и процессинге (выделено и охарактеризовано несколько митохондриальных эндорибонуклеаз и митохондриальная РНК-полимераза), тогда как ничего не известно о количестве и структуре промоторов, форме, в которой

рос. ккг '.* н*>'1

(

транскрибируются прс-РНК, взаимосвязи транскрипции, редактирования и других видов процессинга. Цель работы.

Целью данной работы являлось определить:

- в какой форме (поли или моноцистрониой) транскрибируются митохондриальные прс-РНК (Мт прс-РНК).

- количество, положение и первичную структуру сайтов, способных инициировать транскрипцию максикольцевых генов.

- происходит ли редактирование в составе полицистронных матриц.

- происходит ли модификация З'-концов рибосомных и матричных РНК. Экспериментальные задачи.

- детектировать кДНК полицистронных РНК (пц-РНК), содержащих продукты двух генов разделенных спейсером.

- детектировать кДНК, содержащие 5'и З'-концевые последовательности РНК.

- методом транскрипции т ог^атИо выявить фрагменты ДНК, способные инициировать транскрипцию митохондриальных генов.

- проанализировав нуклеотидную последовательность полученных кДНК, выявить продукты редактирования исследуемых генов, наличие полинуклеотидных трактов на З'-концах исследуемых молекул.

Научная новизна и практическая ценность работы:

- Показано, что митохондриальные гены 1.ер1отопа.ч хеутоип транскрибируются в составе как моно, так и полицистронных РНК. Причем, часть этих полицистронных РНК подвергается разрезанию, тогда как для одной полицистронной молекулы не было показано дальнейшее разрезание.

- Определено положение сайта инициации транскрипции генов рибосомных РНК (в дивергентной области (ДО) положение -175 - -164 от начала гена 12Э рРНК). Впервые

были локализованы сайты, способные инициировать транскрипцию, в консервативной области максикольцевой ДНК. Была локализована последовательность AAAAAC(T/C)(T/C), которая способна инициировать транскрипцию митохондриальных генов.

- Выявлено, что редактирование пре-РНК осуществляется в составе полицистронных молекул. При анализе продуктов редактирования гена Аб впервые было показано существование альтернативных зрелых мРНК.

- Показано, что зрелые 12S и 9S рРНК не подвергаются модификации З'-концов, тогда как мРНК полиаденилируются.

Структура диссертации: диссертация состоит из трех частей - 1) обзор литературы; 2) материалы и методы; 3) результаты и обсуждение.

Работа содержит список цитируемой литературы ссылка), 2S рисунков, 6" таблиц (ы). Общий объем диссертации ¿?0страниц (ы). Апробации работы и публикации.

Результаты диссертации докладывались на международном семинаре BSP "Trypanosomiasis and leishmaniasis seminar": Cesk6 Budejovice (2004) и регулярно проводящихся семинарах кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ, а также были представлены на международных конференциях "Ломоносов 2001" и "Ломоносов 2002". По теме диссертации опубликовано 2 статьи. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовалась культура Leptomonas seymouri (АТСС30220), любезно предоставленная д.б.н. С.А. Подлипаевым (ЗИН, Санкт-Петербург). Культивирование проводили в течение 7 дней при 25° С на среде Стар. Кинетопластную ДНК выделяли согласно стандартной методике.

Выделение суммарной и митохондриальной РНК проводили с использованием гуанидинизотиоцианатного метода (Sambrook D., 1989). ОТ-ПЦР и 3'RACE проводили

по методике фирм-производигелей обратных транскриптаз. 5'RACE проводили методом РЕЕТА (Flouriot G., 1999). Выделение митохондрий проводилось центрифугированием в градиенте Перкола (Harris М. Е„ 1990). Трансформация митохондрий и транскрипция in organelle/ проводились по методике, описанной ранее (EstevezA. М„ 1999). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Транскрипция и процсссинг митохондриальных рибосомиых РНК

Гены, кодирующие митохондриальные рРНК, располагаются последовательно друг за другом, ген 12S рРНК прилегает к дивергентной области (рисунок 3). В литературе имеются данные о том, что у некоторых представителей этого таксона транскрипция генов митохондриальных рРНК осуществляется в виде крупной полицистронной молекулы (Kozlovvsky D. J., 1997; Tarasov I.А., 1987). Но имеющиеся данные не позволяют предполагать, что транскрипция в составе полицистронной РНК (пц-РНК) характерна для всех видов трипаносоматид. Для предварительной оценки, в моно- или полицистронной форме присутствуют 12S и 9S рРНК в митохондриях Leptomonas scymouri, была проведена Northern-гибридизация митохондриальной РНК с фрагментами генов 12S и 9S (рисунок 1).

М 1 2 3 Рисунок 1. Радиоавтограф Northern-f,—, гибридизации митохондриальной РНК

ЮООнт__> .V- " . \ ^ Leptomonas seymouri.

¡ > I >' 1 нопожка - с, мече

600 нт

1 дорожка - с меченым зондом, включающим »■\ : ' - ! участок гена 9S рРНК;

' 2 дорожка - с меченым зондом, включающим

участок гена 12S рРНК;

3 дорожка - с мечеными зондами, включающими участки обоих генов; М - маркер ("Fermentas"),

Гибридизация с участком 9S рРНК выявила два фрагмента РНК длиной 600 нт и более ЮООнт (рисунок 1). Первый фрагмент по длине соответствует размеру гена 9S рРНК, тогда как второй несколько длиннее, чем 1000 нт. Гибридизация с фрагментом гена 12S рРНК также выявила два фрагмента РНК: один длиной 1000 нт. (соответствующей размеру гена 12S рРНК); второй несколько длиннее и совпадающий по размеру с аналогичным фрагментом, определенным для гена 9S рРНК (рисунок 1). Можно предположить, что фрагменты, длина которых соответствует размерам генов, представляют собой зрелые рРНК. Поскольку выявленные более крупные молекулы гибридизовались с фрагментами обеих рРНК, следовательно, можно предположить, что эта фракция содержит полицистронную РНК, в состав которой входят как 12S, так и 9S рРНК. Для проверки этого предположения была проведена реакция ОТ-ПЦР с использованием праймеров, один из которых отжигается в 3'-концевой части гена 12S рРНК, второй - в 5'-концевом участке 9S рРНК. В результате был получен ПЦР-продукт длиной около 500 п.н., определение первичной структуры которого показало, что данный фрагмент является ДНК-копией фрагмента дицистронной молекулы РНК, содержащей обе рибосомные РНК и межгенный промежуток.

Таким образом, можно считать, что гены рРНК считываются в виде пц-РНК, которая затем процессируется.

Ранее было показано, что инициация транскрипции митохондриальных рРНК у T. brucei осуществляется в дивергентной области на расстоянии около 1 kb от начала гена 12S рРНК (Michelotti Е. F., 1992). Таким образом, можно предположить, что сайт инициации транскрипции рРНК L. seymouri также располагается в дивергентной области. Для предварительной оценки положения этого сайта было необходимо установить точные границы 5'-конца первичного транскрипта 12S рРНК. Определение границ РНК проводилось методом РЕЕТА, положение праймера 12SR6, использованного для primer extension, показано на рисунке ЗА. В результате

эксперимента было получено три типа ГТЦР-продуктов длиной около 300 п.н., 250 п.н., и 143 п.н., соответственно. Анализ нуклеотидной последовательности этих продуктов показал, что они представляют собой фрагменты, соответствующие началу зрелой 12S рРНК (длина фрагмента 143 п.н.) с различной длиной 5'-коицевого спейсера, которая, для указанных выше трех групп ПЦР-продуктов, составила 164, 110 и 0 п.н., соответственно.

Можно предположить, что продукты длиной 143 п.н. представляют собой кДНК зрелых 12S рРНК, а фрагменты размером 250 п.н. и 300 п.н. могут быть либо промежуточными продуктами созревания рРНК, либо первичными транскриптами, то есть в дивергентной области могут располагаться, как минимум, три сайта инициации транскрипции. Поэтому следующей задачей данной работы было определить, существует ли в участке дивергентной области, прилегающем к гену 12S рРНК, фрагмент, способный инициировать транскрипцию. Для этого был разработан следующий метод.

Участок максикольцевой ДНК, содержащий исследуемый район и примыкающий к нему 5'-концевой фрагмент гена, амгитифицировали, затем клонировали в вектор. Полученная конструкция использовалась в качестве матрицы для амплификации фрагмента, содержащего исследуемый район, 5'-концевой участок гена и фрагмент плазмиды (в качестве маркерного участка). Полученный фрагмент был трансформирован в митохондрии L. seymouri, затем проводилась транскрипция in organelle. Детекцию продуктов транскрипции с экзогенной ДНК проводили методом ОТ-ПЦР, для которой использовалась пара праймеров, один из которых отжигается в фрагменте плазмидной ДНК, второй в участке гена, транскрипция которого исследуется. На первом этапе такому функциональному тесту был подвергнут участок дивергентной области (ДО), примыкающий к гену 12S рРНК длинной 360 п.н. В результате были детектированы продукты реакции (рисунок 2).

Наличие ПЦР-продуктов позволяет предположить, что в участке дивергентной области длиной 360 п.н., прилегающем к гену 128 рРНК, находится один или несколько сайтов, способных инициировать транскрипцию митохондриальных рибосомных РНК. Для выяснения количества промоторных элементов в функциональном тесте использовали фрагменты ДО длиной 164 и 158 п.н., первый из них совпадал с кДНК самого длинного из детектированных транскриптов, тогда как второй был несколько короче самого длинного транскрипта, но длиннее двух других. Транскрипты, считываемые с этих фрагментов ДНК не были детектированы, на основании чего можно предположить, что в этом участке отсутствуют промоторные элементы. Таким образом, сайт способный инициировать транскрипцию 128 рРНК единственный и располагается в участке ДО от -360 до -164.

M 1 2 3 4 S 6 7 а 9 10 11 12 13 14 15 И

Рисунок 2. Гель-электрофорез в 6% нативном ПААГ продуктов ОТ-ПЦР, полученных с использованием праймеров 12SF1- Ма125.

1,3,5,7,9,11,13 дорожки - в качестве матрицы использовалась РНК, выделенная из митохондрий, трансформированных продуктами реакции ПЦР с помощью пар праймеров: 1. 12S-158 и Ма1-25; 3. 12S-I64 и Ма1-25; 5. 12S-174 и Ма1-25; 7. 12S-188 и Ма1-25; 9. 12S-202 и Mal-25; 11. 12S-254 и Mai-25; 13.I2S-360 и Mal-255, соответственно.

2, 4, 6, 8, 10, 12,14 дорожки - контроль на примесь ДНК - ПЦР без реакции обратной транскрипции.

15 дорожка - продукт реакции ПЦР с праймерами 12SF1-Mal25, в качестве матрицы использовалась исходная плазмида. Положение праймеров показано на рисунке ЗА.

Для минимизации участка, способного инициировать транскрипцию, использовались фрагменты ДО, длина которых составляла 252, 202, 188, 174 п.н., соответственно (все праймеры, использованные для идентификации и минимизации участка, способного инициировать транскрипцию рибосомных РНК, показаны на

рисунке ЗА). Все эти фрагменты были способны инициировать транскрипцию 12S рРНК. Это позволило определить минимальную длину участка, способного инициировать транскрипцию - 10 п.н. Сравнение данной последовательности с первичной структурой участка ДО, прилежащего к гену 12S рРНК у других представителей трипаносоматид, не выявило идентичных или высокогомологичных последовательностей, за исключением блока АААААС. Обнаруженная нами последовательность значительно короче известных митохондриальных промоторов. Возможно, этот блок входит в состав более длинной инициаторной области, которая может быть индивидуальной у каждого вида жгутиковых простейших. В то же время не исключено, что стартовая точка начала транскрипции обозначается каким-либо регуляторным белком.

Таким образом можно заключить, что гены 12S и 9S рРНК транскрибируются с одного промотора в виде полицистронной молекулы, которая затем разрезается с образованием зрелых рРНК. Как было показано, первичный транскрипт содержит транскрибируемый спейсер, имеющий две точки разрезания. Для идентификации остальных точек разрезания пц-РНК необходимо было получить кДНК, содержащие 3'-и 5'-концевые последовательности зрелых 12S и 9S рРНК. Для этого использовались методы 3'RACE и 5'RACE. Идентифицированные последовательности сравнили с границами генов, определенных по гомологии аналогичных участков максикольцевой ДНК у различных представителей трипаносоматид. Было выявлено, что реальные границы рРНК L. seymouri отличаются от определенных по гомологии участков. Аналогичная ситуации наблюдается при сравнении реальных и предсказанных границ рРНК у С. fasciculata, Т. brncei, L. tarentolae (таблица 1).

Опираясь на эти данные, можно предположить, что метод поиска гомологий нельзя использовать для точного определения реальных границ генов рибосомных РНК, он может быть применен только на начальных этапах определения границ генов,

Таблица 1. Различия реальных и определенных по гомологии аналогичных участков максикольцевой ДНК границ генов 12S и 9SpPHK для С. fasciculata, Т. brucei, L larentolae и L. seymouri.

1 - столбец, в котором показаны реальные границы генов (для С. fasciculata и Т. brucei (SloofP., 19985));

2 - границы генов, определенные по гомологии (для всех видов (Lake J.A., 1988));

3 - количество нуклеотидов, на которое различаются реальные и определенные по гомологии границы рРНК (н— реальная граница располагается downstream; - — upstream относительно определенной по гомологии).

Вид Границы гена 12S рРНК Границы гена 9S рРНК

5'- концевые 3'- концевые 5'- концевые 3'- концевые

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

L. tarentolae tat tat 0 tat tat 0 tag tag 0 ttt ttt 0

Т. brucei att aat -1 tat tat 0 taa tgg -8 ttt ttt 0

С. fasciculata ttt tat +2 tat tat 0 ttt tatg -4 att ttt -2

L.seymouri tat tat 0 ttt tat +15 tat tag -12 ttt tttt +2

Определение 3'-концевых нуклеотидов показало, что 12S рРНК содержит 3 уридила, 9S рРНК - 6. В обеих РНК эти нуклеотиды закодированы в максикольцевой ДНК, тогда как для Т. brucei показано, что полиуридиловый хвост длиннее (около 40 нуклеотидов) и не кодируется в геноме, то есть является результатом посттранскрипционной модификации (Adler В. К., 1991). Такое несоответствие может быть связано с многообразием представителей семейства, нельзя исключать возможность того, что у Т. briicei рРНК модифицируются, тогда как у L. seymouri- нет. Кроме того, у обоих организмов рРНК содержат полиуридиловый тракт, различие заключается только в его длине. Однако, для более определенных выводов имеющихся данных недостаточно.

Также был более точно определен размер межгенного спейсера 139 п.н. (при определении границ рРНК L. seymouri по гомологии длина межгенного промежутка -159 пн.). Такой размер не является характерным для других трипаносоматид (обычно спейсер составляет 29-40 п.н.). Northern-гибридизация с фрагментом спейсера выявила фракцию молекул, определенных как полицистронные. Отсутствие коротких фракций

позволяет предположить, что либо полноразмерный спейсер не вырезается из пц-РНК, либо быстро деградирует.

А

12256 12Б5Р 93Р2ге»

123-350 123-202 123-174 12Э-168 , *", Г*--,

—"_—^ —^ | ррнк| |^ррнк|

12"§362 12§Тв8 128-164

Ди*«рг*итнзл область

|АДЦЦСГ I 12в рРНК |139п.н.|вЗрРНК|

-164 -164 -110 +1

| транскрипция

12$ ррнк [аэ ррнк|

М ♦ + ♦

| лроцксинг | 125 рРНК | |93рРНК|

Рисунок 3. А. Схема расположения праймеров, использованных для детекции пц-РНК, границ первичного транскрипта, идентификации и минимизации участка ДНК, способного инициировать транскрипцию пре-рРНК. В. Схема транскрипции и процессинга митохондриапьных рРНК. Флажком отмечена точка инициации транскрипции, стрелками - точки процессинга.

Таким образом, было выявлено, что 12в и 98 рРНК транскрибируются в составе пц-РНК, содержащей продукты генов рРНК и два транскрибируемых спсйсера - первый представляет собой межгенный промежуток, второй - участок ДО, прилегающий к гену 12Э рРНК длиной 164 п.н., затем разрезается с образованием зрелых 12Б и 9Б рРНК. Схема транскрипции и точки процессинга показаны на рисунке ЗВ.

Глава 2 Транскрипция и процессинг белок-коднрующих генов максикольцевой ДНК ЬерНтюпах эеутоип.

Митохондриапьные гены трипаносоматид располагаются в консервативной области максикольцевой ДНК. Кодирующими являются обе цепи, что характерно для митохондриальных геномов большинства организмов. Несмотря на то, что максикольцевая ДНК достаточно компактна, размер спейсерных участков может варьировать от 30 п.н. (между генами СуЬ и А6) до 2-х тыс. п.н. (между генами А6 и

ND1). Кроме того, различается структура этих межгенных промежутков: они могут бьггь как некодирующими, так и содержать гены гРНК или неидентифицированные рамки считывания. Кроме того, в митохондриях трипаносоматид обнаружен процесс уридилового редактирования (постранскрипционные вставки и/или делеции уридиловых остатков, в результате чего мРНК становится транслируемой). В литературе присутствуют данные о том, что у Т. brucei инициация транскрипции происходит в дивергентной области (Michelotti Е. F., 1992), гены максикольцевой ДНК транскрибируются в виде полицистронной РНК и редактирование происходит независимо от транскрипции и разрезания пре-РНК (Koslowsky D. J., 1997).

Для определения наличия в митохондриальном матриксе крупных полицистронных молекул была проведена Northern-гибридизация митохондриальной РНК с фрагментами генов ND8, Аб, Cyb. Было показано, что во всех случаях меченые фрагменты гибридизовапись с фракцией крупных молекул РНК, длина которых превышала 1 kbp, то есть размер 'генов, чьи фрагменты использовались для гибридизации. Более короткие фрагменты выявить не удалость. Из этого можно заключить, что в митохондриях L. seymouri присутствует фракция полицистронных молекул РНК. Далее для определения наличия продуктов митохондриальных генов в составе пц-PHIC использовался метод ОТ-ПЦР. Этим методом получали кДНК пц-РНК, содержащие З'-концевой участок одного гена, межгенный промежуток и 5'-концевой участок гена, располагающегося downstream. Результаты получения продуктов ОТ-ПЦР для макеикольцевых генов представлены в таблице 2.

Анализ расположения генов консервативной области максикольцевой ДНК показывает, что часть генов образует кластеры, разделенные короткими некодирующими или кодирующими гРНК спейсерами.

Таблица 2. Наличие кДНК к фрагменту полицистронной РНК, содержащей 5'-конец гена, спейсер и З'-конец гена, расположенного downstream. Также в таблице указаны структуры, располагающиеся в межгенных промежутках.

Пары генов Наличие кДНК полнцистронной РНК Структуры, располагающиеся в спейсере

9S рРНК -ND8 + гРНКк СуЬ (располагается по другой цепи)

ND8-ND7 - N09 М1Л1Р5 (располагается подругой цепи)

ND7-C0III + некодирующий

СОШ - СуЬ + (■(¡кодирующий

Cyb - Аб + некодирующий

MURF1-NDI - О-богатый учаеток 3 (располагается по другой цепи)

СОИ - MURF2 - гРНКк СОН (располагается по той же цепи)

ND4-RPS12 - N03 (располагается по другой цепи)

RPS12-ND5 + некодирующий

В первый кластер входят три гена - 12Э и 9Б рРНК, N08, во второй 4 рамки

считывания - N07, С01Н, СуЬ и А6, в третий всего два гена - ЯР812 и N05. Все эти кластеры отделены друг от друга и от других генов максикольца длинными спейсерными участками, содержащими гены, закодированные по другой цепи. Остальные белок-кодирующие гены также разделены длинными спейсерами. Как видно из таблицы, продукты генов, образующих кластеры, присутствуют в митохондриальном матриксе в составе пц-РНК. В то же время пц-РНК, содержащие продукты других генов, не были детектированы. Таким образом, можно утверждать, что часть генов действительно транскрибируется в составе пц-РНК; но нельзя исключать возможность того, что другие гены также транскрибируются в составе полицистронных матриц, однако процессинг этих пре-мРНК происходит настолько быстро, что метод ОТ-ПЦР не позволяет детектировать полицистронные транскрипты генов. Следующим этапом было определение 3'- и 5'-концов зрелых моноцистронных мРНК, содержащих продукты максикольцевых генов. Прежде всего, исследовались те гены, для которых определялось наличие полицистронных матриц. Для идентификации З'-концевых последовательностей использовался метод 3'11АСЕ. Известно, что большинство митохондриальных мРНК различных организмов подвергаются

полиаденилированию своих З'-концов, поэтому обратная транскрипция проводилась с поли-Т-праймером. Определение 5'-концевых последовательностей проводилось методом РЕЕТА. В результате были получены З'-концсвые фрагменты мРНК, содержащие продукты генов: Аб, ND1, СОИ, ND4, ND5; 5'-концевые фрагменты мРНК продуктов генов: ND7, СОИ, MURF2, COI, ND4, RPS12. Детектировать З'-концевые фрагменты мРНК ND7, COIII, Cyb, а также 5'-концы COIII, Cyb, Аб, не удалось.

Основываясь на этих данных, можно предположить, что группы генов, разделенные короткими, некодирующими спейсерами, транскрибируются в составе полицистронной молекулы, количество рамок считывания в которой совпадает с числом генов в данной группе. Разрезание этих молекул, скорее всего не происходит, так как удалось определить концы только для первого и последнего генов в кластере. В то же время гены, не объединенные в такие группы, транскрибируются в виде моноцистронной матрицы. Все З'-концевые последовательности были идентифицированы с помощью поли-Т-праймера, следовательно, они содержали поли-А-тракты на своих З'-концах. Это позволяет предположить, что все исследованные мт-РНК полиаденилированы.

Так как некоторые пары генов разделены достаточно длинными спейсерами, и в случае этих генов пц-РПК не были идентифицированы, было сделано предположение, что в данных спейсерных участках могут располагаться сайты, способные инициировать транскрипцию генов, расположенных downstream. Для выяснения наличия промоторных элементов были выбраны участки между генами NDB и ND7, ND4 и RPSI2, а также фрагменты спейсеров, прилегающие к следующим генам: COII, ND4, COI.

Определение наличия сайтов, способных инициировать транскрипцию митохондриальных генов проводили аналогично идентификации участка инициации

транскрипции для гена 128 рРНК. Во всех случаях были детектированы продукты ОТ-ПЦР (смотри рис. 4).

1 г 3 4 5 6 7 в 9 И 11 « 13 14 15 16 17 13 19 » 21 И

Рисунок 4. Гель-электрофорез в 6% нативном ПААГ продуктов ОТ-ПЦР, полученных с использованием праймеров: 1-3 дорожки - ^8Р2с1па и ТЗ; 4-6 дорожки - 960б и ТЗ; 7-9 дорожки - N04? 1 и ТЗ; 10-12 дорожки - ЯР812Р2 и ТЗ; 13-15 дорожки - 961 э и 8Рбто<1; 16-18 дорожки - Абгеусопя и вРбтос!; 19-21 дорожки - СОЛР4тос1 и ТЗ. 1,4,7,10,13,16,19 дорожки - в качестве матрицы использовалась РНК, выделенная из митохондрий, трансформированных продуктами реакции. 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 дорожки - контроль на примесь ДНК ПЦР без реакции обратной транскрипции. 3, 6, 9, 12,15, 18 21 дорожки - продукт реакции ПЦР, в качестве матрицы использовалась исходная плазмида. М- маркер "фЬсо".

Полученные результаты позволяют предположить, что в спсйсерных участках, прилегающих к 5'-концам генов N07, N04, СОИ, С01, 11Р812 располагаются сайты, способные инициировать транскрипцию. Следующим этапом данной работы следовала проверка наличия промоторных элементов в спсйсерных участках между генами, транскрибирующимися в составе полицистронной пре-РНК. Для этого по схеме, аналогичной описанной для рибосомных РНК, были исследованы спейсеры между парами генов: 98 рРНК - N08, С0111 - СуЬ, СуЬ - Аб. Продукты транскрипции с этих фрагментов детектированы не были (рисунок 4). Из всех выше перечисленных данных можно предположить, что участки, способные инициировать транскрипцию максикольцевых генов у Ь. хеутоип, располагаются не только в дивергентной, но и в консервативной областях. Нами было идентифицировано пять участков, где

располагаются сайты, способные инициировать транскрипцию митохондриальных генов. Четыре из них были определены для прямой цепи, один - для обратной. Наличие множественных сайтов инициации в максикольце также подтверждает предположение, о том, что реализация митохондриального генома ¿. яеу тоип ближе к механизму, обнаруженному у грибов и растений (Тааптап 1999).

Следующей задачей была идентификация сайтов инициации транскрипции. Для этого сравнили последовательности всех участков, в которых были обнаружены промоторные участки, между собой и 10-и нуклеотидным фрагментом, способным инициировать транскрипцию кинетопластных рРНК. В результате была выявлена последовательность АААААС(Т/С)('Г/С). Эта последовательность короче известных митохондриальных промоторов, но сопоставима по длине с промоторной областью миниколец. Чтобы выяснить, будет ли осуществляться транскрипция только с последовательности АААААС, был получен фрагмент

(ааааас'п,ттт1'тгтптттттттттслтолтсасстссосассоо), который затем был клонирован в плазмиду, далее был проведен функциональный тест, в качестве отрицательного контроля для функционального теста использовался ПЦР-продукт, полученный с помощью праймеров 128-158 и Ма1-25 (положение праймеров показано на рисунке ЗА). Продукты транскрипции с маркерного фрагмента, содержащего последовательность ААААААС были детектированы.

Таким образом, было показано, что в консервативной области максикольцевой ДНК существует несколько сайтов инициации транскрипции, с которых считываются белок-кодирующие митохондриальные гены в составе как полицистронных, так и моноцистронных РНК.

Для большинства исследованных организмов было показано, что транскрибированные митохондриальные пре-РНК подвергаются различными видам нроцессинга. Для представителей семейства трипаносоматид был выявлен уникальный

механизм созревания пре-РНК - уридиловое редактирование. Механизм этого процесса, а также белки его осуществляющие изучены достаточно хорошо. Но данные о том, как согласуются во времени транскрипция, редактирование и другие виды процессинга противоречивы — с одной стороны показано, что эти процессы происходят независимо, с другой - что степень отредактированное™ РНК зависит от длины поли-А-тракта.

Для выяснения взаимосвязи между транскрипцией и редактированием у L. seymouri, полученные кДНК пц-РНК, содержащих продукты генов ND7, COIII, Cyb, Аб, были клонированы, и была определена их первичная структура.

Ген Аб (б-я субъединица АТФ-азы) содержит на своем 5'-конце редактируемый фрагмент 143 п.н. При анализе продуктов ОТ-ПЦР с пц-РНК, содержащей продукт данного гена, было выявлено 5 типов кДНК, различающихся по последовательности редактируемого домена. Первый представляет собой кДНК неотредактированной матрицы, остальные - РНК различной степени отредактированное™. Продукты редактирования сравнили с отредактированными РНК L. tarentolae и С. fasciculata. В результате сравнения были обнаружены три типа молекул. Следует отметить, что степень отредактированности ограничена тремя позициями. Таким образом, можно предположить, что полученные конечные точки промежуточных продуктов, соответствуют по длине участку редактируемому одной гРНК. То есть для полного редактирования гена Аб необходимо 3 гРНК. Аналогичное количество гРНК выявили для С. fasciculata (Yasuhira S., 1995). Помимо двух типов промежуточных продуктов редактирования было выявлено два типа полностью отредактированных матриц. Первый тип имеет высокий процент совпадений с полностью отредактированной мРНК гена Аб L. tarentolae. Для него выявлен инициаторный кодон (AUG), формирующийся в результате редактирования.

Второй тип также соответствует полностью отредактированной мРНК. Однако в данном случае был выявлен 31 сайт редактирования, при этом 62 уридиловых остатка вставляется и 11 делстирустся. При сравнении последовательностей этого типа с полностью отредактированной мРНК L. tarentolae, отличие затрагивало первые 36 нт., также в ходе редактирования образуется неканонический старт-кодон AUA. Вопрос о возможной роли AUA как инициаторного никак не изучен у трипаносоматид, однако для некоторых генов (например, ND7 у L. tarentolae) в базах данных он был обозначен как стартовый. Следует отметить, что в митохондриях кодон AUA довольно часто выступает стартовым и кодирует инициаторный метионин. Это было показано для митохондриального кодонового словаря круглых червей, иглокожих и млекопитающих (Okimoto R., 1990; Himeno Н., 1987; Jukes Т.Н., 1990). Наличие двух типов отредактированных матриц может быть связано либо с ошибками процесса редактирования, либо существованием альтернативных продуктов. Так как в результате вставок/делеций уридилов мРНК становится транслируемой, было проведено предсказание аминокислотной последовательности, кодируемой этими матрицами, в обоих случаях были получены сходные последовательности, в которых отличались только 12 N-концевых аминокислот. Следовательно, изменения в редактировании по последней гРНК не приводит к сбоям рамки считывания. Однако, как было сказано ранее, возможность трансляции с использованием кодона AUA в качестве стартового у трипаносоматид не доказана, поэтому возможно, что второй тип отредактированных матриц является результатом «ошибки редактирования».

Ген COIII (3-я субъединица цитохромоксидазы) содержит 5'-концевой редактируемый домен (РД) длиной 45 п.н. При анализе кДНК пц-РНК, содержащих редактируемый домен гена C01II были выявлены два типа кДНК. Сравнение последовательности отредактированной РНК COIII L. tarentolae выявило, что первый фрагмент является кДНК с частично отредактированной РНК, причем участок с 1-го по

S-й сайты редактирования совпадает с последовательностью кДНК, тогда как фрагмент с 9-го по 15-й сайты полностью или частично совпадают с последовательностью РНК L tarenlolae. Последовательность кДНК второго типа практически полностью совпадает с отредактированной мРНК. Для мРНК СОШ L. tarenlolae была выделена одна гРНК, обуславливающая редактирование с 1-го по 8-й сайты (Sturm N.R. 1990), следовательно, редактирование всего РД обеспечивается, как минимум, двумя гРНК. На основании этих результатов можно предположить, что редактирование гена СОШ осуществляется двумя гРНК.

Редактируемый фрагмент гена цитохрома b (Cyb) располагается на 5'-конце и длина его составляет 24 нуклеотида. При анализе продуктов ОТ-ПЦР были обнаружены два вида матриц, одна из которых представляет собой полностью неотредактированную РНК Cyb, вторая является промежуточным продуктом редактирования, где модификации подвергся первый сайт редактирования. Для L. tarenlolae показано, что редактирование осуществляется двумя гРНК (Blum В., 1990; Maslov D.A., 1992). То есть, если редактирование этого гена у L. seymouri осуществляется по сходной схеме, то выявлен промежуточный продукт редактирования. В то же время нельзя исключать, что это продукт ошибки редактирования. Таким образом, наличие полностью отредактированных рамок считывания в полицистроне было показано для генов СОШ, Аб. Промежуточные продукты этого процесса были выявлены для СОШ, Аб и Cyb. На основании полученных данных можно заключить, что редактирование генов в митохондриях L.seymouri происходит в составе полицистронной молекулы.

^героп 10кь

^.тагшич

СОШ 1ъс]МГ1

та /ьс}4Г4 'лбл^пях

транскрипция

Ь 12ЭрРНК ]|95рРНК||{1.М Р"|И ЫР7 | | СОШ II СуЬ ||~А6

разрезание

редактирвани» полиаденилированио

| 12ЭрРНК ^рРНК)

1 III N07 | II сот | суь А6 ,

III N07 | || СОШ | II Суь | II А6

Ев

Ег

ЫРБ

N114

папиаденилирование

N05

1ААААМ

N04

1АААААА

Рисунок 5. Предположительная схема транскрипции и процессинга максикольцевой ДНК ЬерЮтопаз леутоип. Белым отмечены нередактируемые гены и их участки; черным - редактируемые гены и домены; серым - частично или альтернативно отредактированные мРНК СОШ, СуЬ, А6; флажками - положение сайтов, способных инициировать транскрипцию масикольцевых генов; стрелками - положение праймеров, использованных для амплификации фрагментов кпДНК, в которых детектировали сайты, способные инициировать транскрипцию.

На основании всего выше перечисленного может быть представлена следующая схема транскрипции и процессинга кпДНК ЬерЮтопси хеутотч (рисунок 5). В максикольцевой ДНК идентифицировано 6 сайтов, способных инициировать транскрипцию, один из них находится в дивергентной области, остальные - в консервативной. С этих сайтов осуществляется транскрипция трицистронной РНК (включающая 125; 9Б рРНК и N08), тетрацистронной (N07; СОШ; СуЬ и Аб),

дицистронной (RPS12 и ND5), а таюче мокоцистронной РНК (ND4). РНК COIII, Cyb и Аб редактируются в составе пц-РНК. Для А6 показано существование альтернативных продуктов редактирования. Трицистронная РНК разрезается с образованием зрелых I2S и 9S рРНК, а так же моноцистронной мРНК ND8.

Для тетрацистронной мРНК (ND7; COIII; Cyb и Аб), дицистронной (RPSI2 и ND5) и моноцистронной (ND4) показано наличие З'-концевых поли-А-трактов. Это позволяет предположить, что мРНК в митохондриях L. seymouri полиаденилируются. З'-концевых модификаций 12S и 9S рРНК не обнаружено.

Выводы:

1. а) В максикольцевой ДНК ЬерЮтопах хеутоип обнаружено 6 сайтов, способных инициировать транскрипцию, один из которых располагается в дивергентной области остальные 5 - в консервативной.

в) анализ участков, способных инициировать транскрипцию, показал, что все они содержат нуклсотидную последовательность АААААС(С/Т)(С/Т).

2. Показано, что с максикольцевой ДНК Ьершпопахеутотч транскрибируется три полицистронные молекулы РНК (теграцистронная, включающая продукты генов N07, СОШ, СуЬ, А6; трицистронная - 12Б рРНК, 95 рРНК, N08; дицистронная - ПРБ12, N05) и моноцистронная - N04.

3. Редактирование мРНК СОШ, СуЬ и А6 осуществляется в составе полицистронной РНК. Для мРНК А6 показано наличие продуктов альтернативного редактирования.

4. Зрелые 128 рРНК и 9Э рРНК не содержат модификаций на своих З'-концах, тогда как все обнаруженные нами пре-мРНК - полиаденилированы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колесников А. А.. Мерзляк Е. М., Беесолицына Е. А., Федяков А. В. Г., Шониан Г. Редукция редактируемого домена митохондриапьного гена Аб (6-ой субъединицы АТФазы) у трипаносоматид. // Мол. биология. 2003, т. 37, № 4, с. 1-6.

2. Васильева М. А., Бессолицына Е.А., Мерзляк Е.М., Колесников А. А. Идентификация промотора гена 12S рРНК в митохондриальной ДНК Leptomonas seymouri. И Мол. биология. 2004, т. 38, № 6. с. 1-5.

3. Бессолицына Е.А. Транскрипция и созревание рибосомных РНК в митохондриях Leptomonas seymouri . II Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002". Москва 10-13 апреля 2002 г. издательство МГУ. выпуск 7, с. 13.

4. Федяков А.В., Бессолицына Е.А. Анализ редактирования пре-мРНК криптогена MURF4 Leptomonas seymouri. II Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002". Москва 10- 13 апреля 2002 г. издательство МГУ. выпуск 7, с. 62-63.

5. Бессолицына Е.А. Исследование митохондриальных РНП-комплексов Leptomonas seymouri, ассоциированных с продуктами гена 9S рРНК. // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001". Москва 10-13 апреля 2001 г. издательство МГУ. выпуск б, с. 10.

6. Bessolitsyna Е.А., Merzlyak Е.М., Kolesnikov А.А. Maturation of Leptomonas seymouri mitochondrial pre-mRNA. // British society for parasitology. Tryponosomasis and leishmaniasis seminar 2004. Ceske Budejovice 27-30-th August 2004 p.56.

7. Merzlyak E.M., Bessolitsyna E.A., Kolesnikov A.A. Initation of transcription and maturation of Leptomonas seymouri mitochondrial ribosomal genes. // British society for parasitology. Tryponosomasis and leishmaniasis seminar 2004. Ceske Budejovice 27-30-th August 2004 p.84.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stpnnt.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338

'ЗЯК'ЯЧ NTo Tunow \ Г1{\ Г7„_---------

ДЛЯ ЗАМЕТОК

РНБ Русский фонд

2007-4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бессолицына, Екатерина Андреевна

Введение.

Обзор литературы.

Структура митохондриального генома различных организмов.

Инициация митохондриальной транскрипции.

Инициация транскрипции животных.

Инициация транскрипции в митохондриях беспозвоночных животных.

Инициация транскрипции в митохондриях грибов.

Инициация транскрипции в митохондриях растений.

Транскрипция митохондриальной ДНК у различных групп организмов.

Процессинг митохондриальных пре-мРНК у различных групп организмов.

Нарезание полицистронных пре- мРНК, сигналы процессинга.

Модификация З'-конца митохондриальных мРНК.

Сплайсинг митохондриальных интронов.

Редактирование митохондриальных мРНК.

Структура и экспрессия митохондриального генома у представителей отряда

Kinetoplastida.

Организация митохондриального генома.

Транскрипция митохондриального генома представителей семейства

Trypanosomatidae.

Процессинг митохондриальных пре-мРНК у представителей отряда Kinetoplastida.

Уридиловое редактирование пре-мРНК.

Нарезание и сигналы процессинга пре-мРНК в митохондриях трипаносоматид.

Материалы и методы.

Выделение суммарной и митохондриальной РНК.

Выделение кинетопластной ДНК.

Электрофоретические методы.

Northern-гибридизация.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

3' RACE 12S и 9S рРНК.

5' RACE 12S и 9S рРНК.

Клонирование PCR-продуктов.

Выделение митохондрий Leptomonas seymouri.

Компьютерный анализ.

Результаты и обсуждение.

Транскрипция и созревание митохондриальных рРНК Leptomonas seymouri.

Транскрипция и процессинг белок-кодирующих генов максикольцевой ДНК

Leptomonas seymouri.

Выводы.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Бессолицына, Екатерина Андреевна

Выводы.

1. а) В максикольцевой ДНК Leptomonas seymouri обнаружено 6 сайтов, способных инициировать транскрипцию, один из которых располагается в дивергентной области остальные 5 - в консервативной. в) анализ участков, способных инициировать транскрипцию показал, что все они содержат нуклеотидную последовательность АААААС(С/Т)(С/Т).

2. Показано, что с максикольцевой ДНК Leptomonas seymouri транскрибируется три полицистронные молекулы РНК (тетрацистронная, включающая продукты генов ND7, COIII, Cyb, А6; трицистронная - 12S рРНК, 9S рРНК, ND8; дицистронная -RPS12, ND5) и моноцистронная - ND4.

3. Редактирование мРНК COIII, Cyb и А6 осуществляется в составе полицистронной РНК. Для мРНК А6 показано наличие продуктов альтернативного редактирования.

4. Зрелые 12S рРНК и 9S рРНК не содержат модификаций на своих З'-концах, тогда как все обнаруженные нами пре-мРНК - полиаденилированы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бессолицына, Екатерина Андреевна, Москва

1. Кузьмин Е.В., Зайцева Г.Н. (1987) Организация и экспрессия митохондриального генома. Итоги науки и техники. Серия Общие проблемы физико-химической биологии, том 6, стр. 145-245.

2. Adler В. К., Haris М. Е., Bertrand К. I., Hajduk S.L. (1991) Modification of Trypanosoma brucei mitochondrial rRNA by urydile tail formation. Mol. Cell Biol. 11:78-84.

3. Alfonzo J. D., Thiemann О. H., Simpson L. (1998) Purification and characterization of MAR1 (a mitochondrial associated ribonuclease from Leishmania tarentolae). J. Biol. Chem. 273:30003-30011.

4. Alfonzo J. D., Thiemann O., Simson L. (1997) The mechanism of U insertion/deletion RNA editing in kinetoplastid mitochondria. Nucleic Acids Res. 25:3751-3759

5. Antes Т., Costandy H., Mahendran R., Spottswood M„ Miller D. (1998) Insertional editing of mitochndrial tRNAs of Physarum polycephalum and Didymium nigripes. Mol. Cell. Biol. 18(12):7521-7527.

6. Aphasizhev R., Aphasizheva I., Simpson L. (2003) A. tale of two TUTases. Proc Natl Acad Sci USA. 100(19): 10617-22.

7. Attardi G., (1985) Animal mitochondrial DNA: an extreme example of genetic economy. Int. Rev. Cytol. 93: 93-145.

8. Backer J.S., Getz G.S. (1987) Identification of a new promoter within the tRNA gene cluster of the mitochondrial DNA of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 15(22): 9309-9318.

9. Bakalara N., Simpson A.M., Simpson L. (1989) The Leishmania kinetoplast-mitochondrion contains terminal uridyltranspherase and RNA ligase activities. J. Biol. Chem. 264:18679-18686.

10. Baldacci G., Cherif-Zahar В., Bernardi G. (1984) The initiation of DNA replication in the mitochondrial genome of yeast. EMBO J. 3:2115-2120.

11. Barth C., Greferath U., Kotsifas M., Fisher P. R. (1999) Polycistronic transcription and editing of mitochondrial small subunit (SSU) ribosomal RNA in Dictyostelium discoideum. Curr Genet. 36: 55-61.

12. Begel О., Boulay J., Albert В., Dufour E., Sainsard-Chanet A. (1999) Mitochondrial group II introns, Cytochrome с Oxidase, and senescence in Rodospora anserina. Mol. and Cell. Biol. 19: 4093-4100.

13. Benne R. (1993) RNA editing in mitochondria of Leishmania tarentolae and Crithidia fasciculata. Semin Cell. Biol. 4(4):241-249.

14. Benne R., Van den Burg J., Brakenhoff J., Sloof p., Van Boom J., Tromp M. (1986) Major transcript of frameshifted coxll gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46:819-826.

15. Binder S., Hatzack F., Brennicke A. (1995) A novel pea mitochondrial in vitro transcription system recognizes homologous and heterologous mRNA and tRNA promoters. J. Biol. Chem. 270(38): 22182-22189.

16. Biswas Т.К. (1999) Nucleotide seguences surrounding the nonanucleotide promoter motif influence the activity of yeast mitochondrial promoter. J. Biochem. 38: 9693-9703.

17. Biswas Т.К., Edwards J.C., Rabinowitz M„ Getz G.S. (1984) Characterization of yeast mitochondrial promoter by deletion mutagenesis. J. Biochem. 82: 1954-1958.

18. Blom D., de Haan A., Van der Berg M., Sloof P., Jirku M., Lukes J., Benne R. (1998) RNA editing in the free-living bodonid Bodo saltans. Nucleic Acids Res. 26:1205-1213.

19. Blum В., Sturm N. R., Simpson A. M. (1991) Chimeric gRNA-mRNA molecules with oligo(U) tails covalently linked at sites of RNA editing suggest that U addition occurs by transesterification. Cell. 65:543-550.

20. Blum В., Bakalara N., Simpson L. (1990) A model for RNA editing inkinetoplastid mitochondria: «guide» RNA molecules transcribed from maxicircle DNA provide the edited information. Cell. 60(2): 189-198

21. Bogenhagen D.F., Romanelli M.F. (1988) Template sequences required for transcription of Xenopus laevis mitochondrial DNA from two bi-directional promoters. Mol. Cell. Biol. 8: 2917-2924.

22. Boore J. L. (1999) Survey and summary animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Res. 27: 1767-1780.

23. Borner G., Mori M., Wissinger В., Brennicke A., Schmelzer C. (1995) RNA editing of group II intron in Oenothera as prerequisite for splacing. Mol. Gen. Genet. 246: 739-744.

24. Borst P., Fase-Fowler F., Hoeijmakers J.H., Frasch A.C. (1980) Variations in maxi-circle and mini-circle sequences in kinetoplast DNAs from different Trypanosoma brucei strains Biochim. Biophys. Acta. 610(2):197-210.

25. Brennicke A., Marchfelder A., Binder S. (1998) RNA editing. FEMS Microbiol. Rev. 23:297-316.

26. Burger G., Citterich M. H., Nelson M. A., Werner S., Masino G. (1985) RNA processing in Neurospora crassa mitochondria: transfer RNAs punctuate a large precursor transcripts. EMBO J. 41:197-204.

27. Byrne E.M., Gott J.M. (2002) Cotranscriptional editing of Physarum mitochondrial RNA requires local features of the native template. RNA. Cambridge University Press. 8:1174-1185.

28. Camasamudram V., Fang J.-K., Avadhani N. (2003) Transcription termination at the mouse mitochondria H-strand promoter distal site requires an A/T rich sequence motif and sequence specific DNA binding proteins. Eur. J. Biochem. 270:1128-1140.

29. Chang D., Clayton D. (1987) A novel endoribonuclease cleaves at a priming site of mouse mitochondrial DNA replication. EMBO J. 6(2):409-417.

30. Cantatore P., Roberti M„ Rainaldi G., Gadaleta M.N., Saccone C. (1989) Thecomplete nucleotide sequence, gene organization, and genetic code of the mitochondrial genome of Paracentrotus lividus. J. Biol. Chem. 264(19): 1096510975.

31. Carrara G., Calandra P., Fruscoloni P., Tocchini-Valentini G. P. (1995) Twu helices plus a linker: A small model substrate for eukaryotic Rnase P. Proc. Natl. Acad. USA. 92:2627-2631.

32. Carrodeguas J.A., Vallejo C.G. (1997) Mitochondrial transcription initiation in the crustacean Artemia franciscana. Eur. J. Biol. Chem. 250: 514-523.

33. Castanio J.G., Tobian J.A., Zasloff M. (1985) Purification and characterization of an endonuclease from Xenopus laevis ovaries which accurately processes the 3' terminus of human pre-tRNA-Met(i) (3' pre-tRNase). J. Biol. Chem. 260: 90029008.

34. Cech T. R. (1986) A model for the RNA-catalyzed replication of RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 44:207-210.

35. Chang C., Stern D. B. (1999) DNA-binding factors assemble in sequence-specific manner on the maize mitochondrial atpA promoter. Curr. Genet. 35(5): 506-511.

36. Christianson Т., Rabinowitz M. J. (1983) Identification of multiple transcriptional initiation sites on the yeast mitochondrial genome by in vitro capping with guanylyltransferase. Biol. Chem. 258:14025-14033.

37. Clark-Walker G. D. (1992) Evolution of Mitochondrial Genomes in Fungi. International Review of Cytology Mitochondrial genomes. 141:89-127.

38. Clary D.O., Wolstenholme D.R. (1984) The Drosophila mitochondrial genome. Oxf. Surv. Eukaryot. Genes. 1: 1-35.

39. Clayton D.A., Chang D.D. (1986 a) Identification of primary transcriptional start sites of mouse mitochondrial DNA: accurate in vitro initiation of both heavy and light- strand transcripts. Mol. Cell. Biol. 6:1446-1453.

40. Clayton D.A., Chang D.D. (1986 b) Precise assignment of the heavy strand promoter of mouse mitochondrial DNA: cognate start sites are not required for transcription initiation. Mol. Cell. Biol. 6:3262-3267.

41. Cosson J., Tzagoloff A. (1979) Sequence homologies of guanosine + cytidine-rich regions of mitochondrial DNA of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 25(41): 42-43.

42. Darr S. C., Race В., Race N. R. (1990) Characterization of ribonuclease P from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus. J.Biol.Chem. 265:12927-12932.

43. Dombrowski S., Brennicke A., Binder S. (1997) З'-Inverted repeats in plant mitochondrial mRNAs are processing signals rather than transcription terminators. EMBO J. 16:5069-5076.

44. Dombrowski S., Hoffmann M., Guha C., Binder S. (1999) Continuous primary sequence requirements in the 18-nucleotide promoter of dicot plant mitochondria. J. Biol. Chem. 274(15): 10094-1099.

45. Dubin D. Т., Timko K. D., Baer R. J. (1981) The 3' terminus of the large ribosomal subunit ("17S") RNA from hamster mitochondria is ragged and oligoadenylated. Cell. 23:271-278.

46. Dyson N.J., Brown Т.A., Ray J.A., Waring R.B., Scazzocchio C., Davis R.W. (1989) Processing of mitochondrial RNA in Aspergillus nidulans. J. Mol. Biol. 208: 587-599.

47. Estevez A. M., Simpson L. (1999) Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria. Gene. 240:247-260.

48. Estevez A.M., Thiemann O.H., Alfonzo J.D., Simpson L. (1999) T7 RNA polymerase-driven transcription in mitochondria of Leishmania tarentolae and Trypanosoma brucei. Mol. Biochem. Parasitol. 103: 251-259.

49. Fey J., Marechal-Drouard L. (1999) Compilation and analysis of plant mitochondrial promoter sequences: an illustration of a divergent evolution between monocot and dicot mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 256: 409-414.

50. Fisher R.P., Topper J.N., Clayton D.A. (1987) Promoter Selection in human mitochondria involves binding of a transcription factor to orientation independent upstream regulatory elements. Cell. 50:.247-248.

51. Flouriot G., Brand H., Gannon F. (1999) Identification of differentially expressed5'-end mRNA variantsby an improved RACE teqnique (PEETA). Nucleic Acids Res. 27:8.

52. Fu G.K., Markovitz D.M. (1998) The human LON protease binds to mitochondrial promoters in a single-stranded, site-specific, strand-specific manner. Biochem. 37:1905-1909.

53. Gagliardi D., Leaver C.J. (1999) Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial mRNA associated with cytoplasmic male sterilithy in sunflower. EMBO J. 18(13): 3757-3766.

54. Giege P., Brennike A. (2001) From gene to protein in higher plant mitochondria.1. Genetics. 324: 209-217.

55. Giliespie D. E., Salazar N. A., Rehkopf D. H., Feagin J. E. (1999) The fragmented mitochondrial ribosomal RNAs of Plasmodiun falciparum have short A tails. Nucleic Acids Res. 27: 2416-2422.

56. Grams J., Morris J.C., Drew M.E., Wang Z., Englund P.T., Hajduk S.L. (2002 ) A trypanosome mitochondrial RNA polymerase is required for transcription and replication J. Biol. Chem. 277(19): 16952-16959.

57. Grams J., McManus M. Т., Hajduk S. L. (2000) Processing of polycistronic guide RNAs is associated with RNA editing complexes in Trypanosoma brucei. EMBO J. 19:5525-5532.

58. Gray M. W. (2003) Diversity and evolution of mitochondrial RNA editing systems. IUBMB Life. 554: 227-233.

59. Gray M. W., Lang B.F., Cedergren R., Golding G. В., Lemleux C., Sankoff D„ Burger G. (1998) Genome structure and gene content in protist mitochondrial DNAs. Nucleic Acids Res. 26: 865-878.

60. Hancock K., Hajduk S. L. (1990) The mitochondrial tRNAs of Trypanosoma brucei are nuclear encoded. J. Biol. Chem. 265:19208-19215.

61. Harris M.E., Moore D.R., Hajduk S.L. (1990) Addition of Uridines to Edited RNAs in Trypanosome Mitochondria Occurs Independently of Transcription. J. Biol. Chem. 265(19): 11368-11376.

62. Himeno H., Masaki H., Kawai Т., Ohta Т., Kumagai I., Miura K., Watanabe K.1987) Unusual genetic codes and a novel gene structure for tRNA(AGYSer) in starfish mitochondrial DNA.Gene. 56(2-3):219-230.

63. Hofmann T. J., Min J., Zassenhaus H. P. (1993) Formation of the 3' end of yeast mitochondrial mRNAs occurs by site-specific cleavage two bases downstream of a conserved dodecamer sequence. Yeast. 9: 1319-1330.

64. Horton T.L., Landweber L.F. (2000) Evolution of four types of RNA editing in myxomycetes. RNA. 6:1339-1346.

65. Horton T.L., Landweber L.F. (2000) Mitochndrial RNAs of myxomycetesterminate with non-encoded 3' polyU tails. Nucleic Acids Res. 28(23): 4750-4754.

66. Horvath A., Berry E.A., Maslov D.A. (2000) Translation of the edited mRNA forcytochrome b in trypanosome mitochondria. Science. 287(5458): 1639-1640.

67. Janke A., Arnason U. (1997) The complete mitochondrial genome of Alligator mississippiensis and the separation betwen recent Archosauria (birds and crocodiles). Mol. Biol. Evol. 14:1266-1272.

68. Ji Y. E„ Mericle B. L., Rehkopf D. H., Anderson J. D., Feagin J. E. (1996) The Plasmodium falciparum 6 kb element is polycistronically transcribed. Mol. Biochem. Parasitol. 81; 211-223.

69. Jukes Т.Н., Osawa S. (1990) The genetic code in mitochondria and chloroplasts.

70. Experientia. 46 :1117-1126.

71. King T.C., Low R.L. (1987) Mapping of control elements in the displacement-loop region of bovine mitochondrial DNA. J. Biol. Chem. 262:6204-6213.

72. Kiss Т., Marshallsay C., Filipowicz W. (1992) 7-2/MRP RNAs in plant and mammalian cells: association with higher order structures in the nucleolus. EMBO J.l l(10):3737-3746.

73. Koslowsky D. J., Yahampath G. (1997) Mitochondrial mRNA 3' cleavage/polyadenylation and RNA editing in Trypanosoma brucei are indepedent events. Mol. Biochem. Parasitol. 90:81-94.

74. Koslowsky D. J., Riley G.R., Feagin J.E., Stuart K. (1992) Guide RNAs for transcripts with developmentally regulated RNA editing are present in both life cycle stages of Trypanosoma brucei. Mol. Cell. Biol. 12(5):2043-2049.

75. Kubelik A.R., Kennell J.C., Akins R.A., Lambowitz A.M. (1990) Identification of Neurospora mitochondrial promoters and analysis of synthesis of the mitochondrial small rRNA in wild-type and the promoter mutant \poky\. J. Biol. Chem. 265( 8): 4515-4526.

76. Kudla J., Bock R. (1999) RNA editing in an untranslated region of the Ginkgo chloroplast genome. Gene. 234:81-86.

77. Kuzmann A., Brennicke A., Marchefelder A. (1998) 5' end maturation and RNA editing have to precede tRNA 3' processing in plant mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:108-113.

78. L'Abble D., Duhaime J-F., lang B.F., Morais R. (1991) The transcription of DNA on chicken mitochondria initiates from one major bidirectional promoter J. Biol. Chem. 266(17): 10844-10850.

79. Lake J.A., de la Cruz V., Ferreira P.C.G., Morel C., Simpson L. (1988) Evolutionof parasitism: Kinetoplastid protozoan history reconstructed from mitochondrial rRNA gene sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (Evolution). 85: 4779-4783.

80. Lambert L., Muller U.F., Souza A. E., Goringer H. U. (1999) The involvement of gRNA-binding protein gBP21 in RNA editing an in vitro and in vivo analysis. Nucleic Acids Res. 27: 1429-1436.

81. Lang B. F., Paquin В., Laforest M., Forget L., Roewer I., Wang Z., Longcore J. (1997) The fungal mitochondrial genome project: evolution of fungal mitochondrial genomes and their gene exspression. Curr. Genet. 31:380-395.

82. LeBlanc A.J., Yermovsky-Kammerer A. E., Hajduk S. L. (1999) A nuclear encoded and mitochondrial imported dicistronic tRNA precursor in Trypanosoma brucei. J. Biol. Chem. 274(30): 21071-21077.

83. Liu H.T., Hu Y.H., Wang C.T., Lin L.Y. (1996) Sequences and comparisons of duck mitochondrial DNA control regions. Сотр. Biochem. Physiol. Biochem. Mol. Biol. 115(2): 209-214.

84. Longran К. M., Gray M. W. (1996) Expression of continuous open reading frame encoding subunits 1 and 2 of cytochrome с oxidase in the mitochondrial DNA of Acanthamoeba castellani. J. Mol. Biol. 257:1019-1030.

85. Lukes J., Jirku M., Avliyakulov N„ Benada O. (1998) Pankinetoplast DNA structure in a primitive bodonid flagellate, Cryptobia helicis. EMBO J. 17:838-846.

86. Lupoid D. S., Caoile A. G. F. S., Stern D. B. (1999) The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. J. Biol. Chem. 274(6): 3897-3903.

87. Makenzie S., Mcintosh L. (1999) Hiegher plant mitochondria. The plant cell. 11: 571-585.

88. Manam S., Van Tuyle G.C. (1987) Separation and characterization of 5'- and 3'-tRNA processing nucleases from rat liver mitochondria. J. Biol. Chem. 262(21): 10272-10279.

89. Marchefelder A., Schuster W., Brennicke A. (1990) In vitro processing of mitochondrial and plastid derived tRNA precursors in a plant mitochondrial extract. Nucleic Acids Res. 18(6): 1401-1406

90. Marienfeld J., Unseld M., Brandt P., Brennicke A. (1996) Genomic recombinationof the mitochondrial atp6 gene in Arabidopsis thaliana at the protein processing site creates two different presequences. DNA Res. 31(5):287-290.

91. Martin N. C., Meller D. (1983) Characterization of the yeast mitochondrial locus necessary for tRNA biosynthesis: DNA sequence analysis and identification of a new transcript. Cell. 34:911-917.

92. Martin N.C. (1995) In tRNA: Structure , Biosynthesis, and Function. (D. Sell and U. L. Raj. Bhadary Eds.,) ASM Press, Washington DC. 127-140.

93. Maslov D.A., Kolesnikov A.A., Zaitseva G.N. (1984) Conservative and divergent base sequence regions in the maxicircle kinetoplast DNA of several trypanosomatid flagellates. Mol. Biochem. Parasitol. 12:351-364.

94. Maslov,D.A., Simpson,L. (1992) The polarity of editing within a multiple gRNA-mediated domain is due to formation of anchors for upstream gRNAs by downstream editing. Cell 70 (3), 459-467.

95. Maslov D.A., Horvath A., Berry E.A. (2000) Translation of the edited mRNA for cytochrome b in trypanosome mitochondria. Science. 287(5458):1639-1640.

96. Merzlyak E. M, Zakharova M. Yu, Kolesnikov A. A. (2001) ND8 editing in monogenetic trypanosomatids. Europ. Journ. Protist. 37:233-239.

97. Michel F., Ferrat J.L. (1995) Structure and activites of group II introns. Annu. Rev. Biochem. 64:435-461.

98. Michelotti E. F., Harris M.E., Adler В., Torri A.F., Hajduk S.L. (1992) Trypanosoma brucei mitochondrial ribosomal RNA synthesis, processing and developmentally regulated expression. Mol. Biochem. Parasitol. 54(1):31-41.

99. Militello К. Т., Read L. K. (1999) Coordination of kRNA editing and polyadenylation in Trypanosoma brucei mitochondria: complete editing is not required for long poly (A) tract addition. Nucleic Acids Res. 27:1377-1385.

100. Miller D., Mahendran R., Spottswood M., Costandy H., Wang S., Ling MI., Yang N. (1993) Insertional editing in mitochndria of Physarum. Sem. Cell BioJ. 4:261-266.

101. Mohr S., Wanner L. A., Bertrand H., Lambowitz A. M. (2000) Characterization of an unusual tRNA-like sequence found insert in a Neurospora crassa. Nucleic Acids Res. 28:1514-1524.

102. Morales M. J., Wise C. A., Hollingsworth M. J., Martin N. C. (1989) Characterization of yeast mitochondrial RNase P: an intact RNA subunit is not essential for activity in vitro. Nucleic Acids Res. 17:6865-6881.

103. Mori M., Marchefelder A. (2001) The final cut. The importance of tRNA 3'-processing. EMBO reports. 21: 17-20.

104. Muhich M. L., Neckelmann N., Simpson L. (1985) The divergent region of the Leishmania tarentolae kinetoplast maxicircle DNA contains a diverse set of repetitive sequences. Nucleic Acids Res. 5:3241-3258.

105. Ojala D., Attardi G. (1974) Identification and partial characterization of multiple discrete polyadenylic acid containing RNA components coded for by HeLa cell mitochondrial DNA. J. Mol. Biol. 82:151-174.

106. Ojala D., Montoya J., Attardi G. (1981) tRNA punctuation model of RNA processing in the human mitochondria. Nature. 260:470-474.

107. Okimoto R., Macfarlance J.L., Wolsteholme D.R. (1990) Evidence for the frequentuse of TTG as the translation initiation codon of mitochondrial protein genes in the nematodes, Ascaris suum and Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 18: 6113-6118.

108. Piller K„ Rusche L., Cruz-Reyes J., Soliner-Webb B. (1997) Resolution of the RNA editing gRNA- directed endonucleases in Trypanosoma brucei mitochondria. RNA. 1:279-290.

109. Ramirez V., Savoie P., Morais R. (1993) Molecular characterization and evolution of a duck mitochondrial genome. J. Mol. Evol. 37(3): 296-310.

110. Read L. K., Goringer H. U., Stuart K. (1994) Assembly of mitochondrial ribonucleoprotein complexes involve specific guide RNA (gRNA)-binding proteins and gRNA domains but does not require preedited mRNA. Mol. Cell Biol. 14:2629-2639.

111. Rehkopf D. H., Giliespie D. E., Harrell M. I., Feagin J. E. (2000) Transcription mapping and RNA processing of the Plasmodium falciparum mitochondrial mRNAs. Mol. Biochem. Parasitol. 105: 91-103.

112. Reichert A., Rothbauer U., Merl M. (1998) Processing and editing of overlapping tRNA in human mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 273: 31977-31984.

113. Rossmanith W., Karwan R. M. (1998) Characterization of human mitochondrial Rnase P novel aspects in tRNA processing. Biochem. Biophys. Res. Com. 247:234241.

114. Ryan C.M., Militello K.T., Read L.K. (2003) Polyadenylation regulates the stability of Trypanosoma brucei mitochondrial RNAs. J. Biol. Chem. 278(35):32753-62.

115. Sabatini R.S., Adler B.K., Madisson- Antenucci S., McManus M. Т., Hajduk S. L. (1998) Biochemical methods for analysis of kinetoplastid RNA editing. Methods: A companion to methods in enzymology. 15:15-26.

116. Sachs A., Wahle E. (1993) Poly(A) tail metabolism and function in eucaryotes. J. Biol. Chem. 268:22955-22958.

117. Salavati R., Panigrahi A.K., Stuart K. (2001) Mitochondrial ribonuclease P activity of Trypanosoma brucei. Mol. Biochem. Parasitol. 115(1): 109-117.

118. Salavati R., Panigrahi A.K., Morach B.A., Palazzo S.S., Igo R.P., Stuart K. (2002) Endoribonuclease activities of Trypanosoma brucei mitochondria. Mol. Biochem. Parasitol. 120(1):23-31.

119. Sambrook J., Fritsch e. F., Sambrook T.,(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press.

120. Shadel G. S., Clayton D. A. (1993) Mitochondrial transcription initiation. J. Biol. Chem. 268(22): 16083-16086.

121. Shu H.-H., Stuart K. (1994) Mitochondrial transcripts are processed but are not edited normally in Trypanosoma equiperdum (ATCC 30019) which has kDNA sequence deletion and duplication. Nucleic Acids Res. 22:1696-1700.

122. Simon M., Faye G. (1984) Organization and processing of the mitochondrial oxi3/oli2 multigenic transcript in yeast. Mol. Gen. Genet. 19(62): 266-274.

123. Simpson L., Wang S. H., Thiemann О. H., Alfonzo J. D., Maslov D. A., Avila H. A. (1998) U-insertion/deletion edited sequence database. Nucleic Acids Res. 26:170-176.

124. Soto M., Requena J.M., Jimenes-Ruiz A., Alfonso C. (1991) The mRNA coding for the nucleosomal protein H2A of Leismania is polyadenylated and has stem-loop at the 3' end. Nucleic Acid Res. 19(16) :4554.

125. Steiwert S.D., Heidmann S., Stuart K. (1996) Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggestts a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84:831-841.

126. Stuart K., Allen Т., Heidmann S., Seiwert S. (1997) RNA editing in kinetoplastid protozoa. Microb. Molec. Biol. Reviews. 61:105-120.

127. Stuart K., Feagin J. E. (1992) Mitochondrial DNA of kinetoplastids. Int. Rev. Cytol. 141:64-87.

128. Sturm N. R., Simpson L. (1990) Kinetoplast DNA minicircles encode guide RNAsfor editing of cytochrome oxidasesubunit III mRNA. Cell. 61:879-884.

129. Suyama Y. (1986) Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis analysisof Tetrahymena mitochondrial tRNA. Curr. Genet. 10: 411-420.

130. Taanman J.-W. (1999) The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 14(10): 103-123.

131. Tarassoff I. A., Levchenco I. V., Zaitseva G. N. (1987)Transcripts of the maxicircle kinetoplast DNA of Crithidia ocopelti. Mol Biochem Parasitol. 26:235-245.

132. Tracy R.L., Stern D.B. 1995 Mitochondrial transcription initiation: promoter structure and RNA polymarases. Curr. Genet 28. 205-216.

133. Unseld M., Marienfeld J.R., Brandt P., Brennicke A. (1997) The mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana contains 57 genes in 366924 nucleotides. Nat. Genet. 15: 57-61.

134. Vallejo C. G., Carrodeguas J. A. (1997) Mitochondrial transcription initiation in the crustacean Artemiafranciscana. Eur. J. Biochem. 250:514-523.

135. Valvedre J.R., Marco R., Garesse R. (1994) A conserved heptamer motif for ribosomal RNA transcription termination in animal mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:5368-5371

136. Vickerman К. (1994) The evolutionary expansion of the Trypanosomatid Flagellates. International Journal of Parasitology. 24:1317-1331.

137. Visomirski-Robic L. M., Gott J. M. (1997) Insertional editing of nascent mitochondrial RNAs in Physarum. Biochem. 94:4324-4329.

138. Ward B.L., Anderson R.S., Bendich A.J. (1981) The size of the mitochondrial genome is large and variable in a family of plants (Cucumbitaceae). Cell. 25: 793803.

139. Wiesenberger G., Costanzo M., Fox T. D. (1995) Analysis of the Saccharomyces cerevisiae mitochondrial COX3 mRNA 5' untranslated leader: translation activation and mRNA processing. Mol. Cell. Biol. 15(6):291-3300.

140. Wiliams M. A., Johzuka Y., Mulligan R. M. (2000) Addition of non-genomically encoded nucleotides to the 3'-terminus of maize mitochondrial mRNAs: truncated rps 12 mRNAs frequently terminate with CCA. Nucleic Acids Res. 28:4444-4451.

141. Wissinger В., Schuster W., Brennicke A. (1991) Trans-splicing in Oenothera mitochondria : nadl mRNAs are edited in exon and trans-splicing group II intron sequence. Cell. 65:473-482.

142. Worney E. A., Schnaufer A., Mian I.S., Stuart K., Salavati R. (2003) Comparative analysis of editosome proteins in trypanosomatids. Nucleic Acids Res. 31(22):6392-408.

143. Yasuhira S., Simpson L. (1995)Minicircle-encoded guide RNAs from Crithidia fasciculata. RNA. 1:634-643.1. Благодарности.

144. А Е- 0.J и*1/ш>1 В Е--Ч Hal/malс Е--10.4 kkal/»ol1. D tf- -13.9 kk»J/MoI1. Е Г kk*lSnol