Молекулярные механизмы и функциональное значение процессов клеточной гибели в головном мозге пренатально облученных крыс

Евтушенко, Владимир Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы и функциональное значение процессов клеточной гибели в головном мозге пренатально облученных крыс
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы и функциональное значение процессов клеточной гибели в головном мозге пренатально облученных крыс"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. ЛОМОНОСОВА

■РПГод"

На правах рукописи

ЕВТУШЕНКО Владимир Иванович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ ПРЕНАТАЛЬНО ОБЛУЧЕННЫХ КРЫС

03.00.01 - Радиобиология

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1997

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

член-корр. РАМН РФ профессор К.П.ХАНСОН

Доктор медицинских наук профессор В.Н.АНИСИМОВ

Доктор биологических наук профессор И.И.ПЕЛЕВИНА

Доктор биологических наук профессор А.С.САЕНКО

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский институт ядерной физики

им.Б.П.Константинова РАН.

5 _

Защита состоится "__А--Я, 1997 года в " " часов на

заседании Диссертационного Совета Д 053.05.74 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Московском государственном Университете им. Ломоносова по адресу 119899 Москва, Воробьевы горы, биологический факультет МГУ.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана "¿3 " 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук —г-/

профессор ^ О.Р.КОЛЬС

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Эволюция млекопитающих и, в наибольшей степени, самых интеллектуальных представителей этого касса - гоминид была сопряжена с быстрым структурно-функциональным усложнением головного мозга, особенно его высших отделов, в частности неокортек-са. Следствием этого усложнения явилось то, что функциональное развитие мозга не ограничивается периодом онтогенеза, а продолжается и после рождения, причем длительность этого периода находится в прямой зависимости от сложности и разнообразия функций ЦНС конкретного вида. Головной мозг взрослых особей млекопитающих в высшей степени радиорезистентен, тогда как мозг эмбриона является одной из наиболее радиочувстительных тканей организма и даже небольшие дозы ионизирующего излучения приводят к тяжелым поражениям ЦНС. У млекопитающих сформировалась пожалуй наиболее совершенная система защиты развивающегося эмбриона от факторов окружающей среды в виде внутриутробного развития. Однако, эта система оказывается совершенно неэффективной в отношении ионизирующего излучения, с которым млекопитающим не приходилось сталкиваться в ходе их эволюции до середины нынешнего века, когда радиация стала одним из новых антропогенных факторов, обладающим выраженным генетическим, цитотоксиче-ским, тератогеным и канцерогенным действием (Mole, 1990).

Пренатальный период развития млекопитающих характеризуется активным протеканием процессов клеточной пролиферации и диффе-ренцировки, нарушение равновесия между которыми может приводить к тяжелым последствиям для организма (Ярмоненко, 1988). Характер эффекта пренаталыюго облучения существенно зависит от стадии развития организма и каждой конкретной ткани в момент облучения. В результате радиационного воздействия на плод после рождения развивается дефицит массы головного мозга, сопровождающийся широким спектром нарушений высшей нервной деятельности и поведения (Right, 1959; Пи-онтковсий, 1964). Несмотря на высокую пластичность и способность к восстановлению ЦНС, функциональные нарушения в облученном мозге приматов сохраняются в течение длительного времни (Brizze, 1986). Степень поражения мозга зависит от вида излучения, его дозы и от периода внутриутробного развития. Нейробласты в нервной системе эмбриона крысы появляются на 9-й день внутриутробного развития (у че-

ловека - с 25-го дня) и сохраняются еще некоторое время после рождения. Именно в этот период нервная система чувствительна к воздействию радиации (Пионтковский, 1964). У грызунов наиболее серьезные последствия наблюдаются после обучения 15-18-дневных эмбрионов, а у человека в течение 8-15 недель беременности (Kopermann, 1980). При этом, почти все врожденные аномалии, возникающие в результате прена-тального облучения грызунов, можно выявить и в случае облучения человека, если учитывать эмбриологически сравнимые периоды беременности (Rugh, 1965). Так, у крыс, облученных в плодный период, после рождения выявляются тяжелые дефекты переднего мозга: микроцефалия, гетеротопия, отсутствие мозолистого тела (Hicks, 1966), подавление двигательной активности (Werboff, 1961) и отставание в способности к обучению (Куопо, 1981). У человека, микроцефалия и задержка умственного развития возникали у большинства детей, получивших относительно высокие дозы рентгеновского излучения на ранних стадиях внутриутробного развития (Dobbing, 1973). Наиболее часто встречающимися последствиями внутриутробного облучения детей в результате атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки также являются микроцефалия и умственная отсталость (Otake, 1984; Schull, 1986). Показано, что частота умственной отсталости у людей, облученных в период 8-15 недель беременности линейно увеличивается с ростом дозы излучения (Otake, 1984; Schull, 1986). При этом, максимальная радиочувствительность мозга соответствует периоду внутриутробного развития, когда у человека происходит формирование и дифференцировка переднего мозга, а содержение ДНК этого отдела увеличивается логарифмически параллельно пролиферации нейробластов (Dobbing, 1973; Mole, 1987).

В основе структурно-функциональных нарушений эмбрионального мозга лежит пострадиационная гибель клеток и, в первую очередь, нейробластов. В мозге пренатально облученных (ПНР) животных наблюдается опустошение слоев коры, нарушение колоночной организации нейронов, а также хаотическое и избыточное ветвление их отростков. Так, через 6 часов после рентгеновского облучения эмбрионов грызунов на 18-й день беременности наблюдалось значительное количество пикноти-ческих ядер нейробластов в коре переднего мозга и наружном гранул-лярном слое мозжечка (Bruckner, 1980). Аналогичные данные получены и в случае нейтронного облучения крыс, причем пикнотические клетки обыли отмечены уже через 2 ч после облучения (Antal, 1986). У низших

приматов, облученных во втором триместе беременности, также отмечено значительное уменьшение числа нейронов, а также отростков дендри-тов в гиппокампе (Brizze, 1980). После рождения, во всех отделах ПНО животных отмечены нарушения показателей, характеризующих процессы созревания мозга - потеря плотности тифоидного вещества, снижение плотности миелина, дезориентация клеток и отростков (Konermann, 1987). Глубина этих нарушений зависит от дозы облучения.

Биохимические исследования мозга ПНО животных свидетельствуют о наличии тонких функциональных нарушений. Прежде всего показано, что у облученных грызунов и приматов после рождения в коре и мозжечке отмечено повышение содержания ацетилхолина (Valcana, 1974), а также активности холинэргических и ряда других ферментов (Weber 1979; Kaack, 1980). Возможно, что этот феномен, также как и кратковременный всплеск метаболизма дезоксиглюкозы (Heinzmann, 1986), носит компенсаторный характер. Вместе с тем, в мозге 3-х недельных ПНО мышей синтез кислоторастворимой фракции ядернных белков оказался подален на 40%, а с помощью двумерного электрофореза у них было выявлено существенное снижение содержания гистоновых и ряда негистоновых белков (Fonagy, 1985). При этом оказалось, что способность синтезировать белки в бесклеточной системе и аминокислотный пул в мозге 3-х недельных ПНО мышей существенно не отличаются от контроля, тогда как аминоацилирование тРНК у них снижено на 40% по сравнению с контролем и является, по-видимому, лимитирующей стадией белкового синтеза в этой ткани. Эти данные находятся в соответствии с наблюдениями о параллельном угнетении белкового синтеза и аминоацилирования тРНК в облученных тимоцитах крыс (Smith, 1964).

Имеются лишь единичные наблюдения о характере генной экспрессии у ПНО животных. Так, синтез суммарной ядерной РНК в мозге 3-х недельных крыс, подвергнутых гамма-нейтронному ПНО, не отличался от контроля (Fonagy, 1985). Усиление экспрессии гена теплового шока hps70, а также прото-онкогенов c-fos и с-тус наблюдали в течение нескольких часов после гамма облучения 8-дневных эмбрионов мыши (Higo, 1989).

Таким образом, феноменология нарушений головного мозга на структурно-функциональном и клеточно-биохимическом уровнях у пре-натально облученных животных описана достаточно полно. Однако,

вплоть до настоящего времени практически отсутсвуют работы, в которых бы направленно и комплексно исследовались молекулярпо-биологи-ческие аспекты пострадиационных поражений мозга. В частности, остается невыясненным вопрос являются ли выжившие после облучения нервные клетки функционально полноценными, то есть способны ли они обеспечить нормальный уровень экспрессии генов, продукты которых участвуют в процессах дифференцировки и функционирования нервных клеток.

Цель и задачи иследования.

Целью настоящего исследования явилось изучение молекулярных механизмов радиационной гибели эмбриональных нейробластов и ее роли в нарушениях функциональной активности головного мозга прена-тально облученных крыс.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить изменения динамики клеточных популяций отделов головного мозга в пострадиационный период и оценить структурно-функциональное состояние головного мозга крыс, подвергнутых пренатально-му гамма и гамма-нейтронному облучению на 17-й день внутриутробного развития.

2. Охарактеризовать пострадиационный тип клеточной гибели облученных нейробластов (апоптоз, некротический, смешанный).

3. В период массовой гибели облученных нейробластов головного мозга изучить динамику экспрессии известных генов, участвующих в реализации программы клеточной гибели по типу апоптоза в тканях млекопитающих.

4. Конструировать клонотеки кДНК головного мозга 17-дневных эмбрионов контрольных и in utero облученных крыс и с помощью истощающей гибридизации получить в клонированной форме последовательности генов, экспрессия которых активируется в период массовой гибели облученных нейробластов.

5. На основании анализа изменений экспрессии генов в облученных нейробластах в период их массовой гибели, оценить гомологию с известными генетическими программами реализации гибели полученными на других клеточных системах.

'6. Изучить нарушения динамики экспрессии основных групп клеточных генов (тканеспецифических, кодирующих ферменты основных метаболических путей клетки, прото-онкогенов) в головном мозге и его

отделах у пренатально облученных крыс в период 1 день - 1.5 года после рождения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пренаталыюе облучение вызывает массовую гибель эмбриональных нейробластов по типу агюнтоза.

2. Радиационная индукция апоптоза в эмбриональных нейробластах сопровождается снижением уровня мРНК генов, кодирующих структурные белки и ферменты основных метаболических путей, и активацией экспрессии широкого спектра регуляторных генов.

3. Апоптоз в пренатально облученных нейробластах реализуется по р53-зависимому пути, характерному для радиационной гибели тимоцнтов.

4. В ранний иостнатальный период, соответствующий завершению функционального созревания головного мозга (2-4 недели после рождения), в мозге облученных крыс происходит компенсаторное усиление экспрессии всех исследованных групп клеточных генов.

5. В отдаленные сроки после облучения (1.5 года) в коре головного мозга in utero облученных крыс экспрессия ряда ключевых генов существенно снижена по сравнению с контрольными животными.

Научная новизна работы.

Впервые использован комплексный подход для изучения структурно-функциональных и молекулярно-биологических нарушений в головном мозге пренатально облученных крыс. Временной интервал наблюдений охватывает продолжительный период жизни животных с 17-го дня эмбрионального развития до 1.5 лет после рождения. Доказано, что гибель in utero облученных клеток головного мозга реализуется по типу апоптоза. Изучены пострадиационные нарушения экспрессии более 30 видов мРНК, являющихся транскриптами основных классов клеточных генов. У в мозге in utero облученных крыс в ранний постнатальный период описан феномен компенсаторного усиления экспрессии большой группы клеточных генов. Клонированы последовательности новых, ранее неизвестных генов, экспрессия которых активируется в период массовой гибели облученных нейробластов.

Научно-практическая значимость работы.

Исследование относится к разряду теоретических работ. В настоящее время значимость исследований в области последствий облучения in utero особенно велика в связи с широким клиническим исполь-

зованием различных видов излучений, увеличением радиационного фона в результате антропогенной деятельности, а также испытаний ядерного оружия и аварий на реакторах.

Форма выполнения диссертационной работы.

Работа выполнялась в рамках финансирования по программе ГКНТ 0.74.05 - "Молекулярная биология и молекулярная генетика в медицине", по гранту Международного Научного Фонда J4W100 и проектам РФФИ 93-04-20253 и 95-04-136276. Апробация работы.

Материалы, представленные в диссертации, докладывались на 1-м Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), XII Всесоюзном съезде рентгенологов и радиологов (Ленишрад, 1990), XV международном раковом конгрессе (Гамбург, ФРГ, 1990), 1-й Международной конференции "Биологические и радиоэкологические аспекты последствий аварии на Чернобыльской атомной станции" (Зеленый мыс, 1990), 23-й ежегодной конференции нейрохимического общества (Вашингтон, США, 1993), симпозиуме ASBMB "Генетические и биохимические подходы к изучению клеточной гибели" (Lake Tahoe, США, 1994), Международном симпозиуме "Физиолого-биохимические основы жизнедеятельности мозга" (С-Петебург, 1994) и на ежегодных заседаниях нейрохимического и иммунологического обществ Санкт-Петербурга (1995, 1996).

Основное содержание работы отражено в 30 научных публикациях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Облучение животных. В опытах использовали белых беспородных крыс массой 250 - 300 г. Самок и самцов ссаживали на одни сутки. Эмбрионы облучали in utero на 17-й день внутриутробного развития гамма-нейтронным излучением в биологическом канале реактора ВВР-М (ПИЯФ им. Б.П. Константинова) или гамма облучением на установках ЛУЧ-1 (ЦНИРРИ МЗМП) и Mark 1 Shefferd (Национальный институт здоровья США). При гамма-нейтронном облучении в дозе 0.75 Гр вклад нейтронов был равен 70%, а энергия в различных сериях составляла 0.71.0 Мэв. При гамма облучении в дозе 4 Гр мощность дозы в различных сериях составляла 1.4-1.9 Гр/мин. Группа контрольных животных в каждом случае подвергалась ложному облучению. Через различные сроки после пренатального облучения (ПНО), животные забивались под эфир-

ным наркозом, мозг контрольных и облученных животных взвешивали, результаты обрабатывались статистически с вычислением критерия t Сгыодента, различия считались значимыми нри р<0.05.

Гистология. Корональные срезы мозга эмбрионов толщиной 8-10 мкм окрашивали 0.05% раствором толуидинового синего или красителем Hoechst-33258 по стандартной методике и анализировали с помощью микроскопа Zeiss Axioplan.

Проточная цитомегрия. Ядра клеток целого мозга и его отделов анализировали методом проточной цитометрии на приборе, разработанном в ЦНИРРИ МЗМП (Ягунов, 1986). В результате анализа получали гистограммы распределения ядер по содержанию ДНК, которые после математической обрабатывали были представлены в виде процентного содержания клеток: находящихся в разных фазах клеточного цикла.

Исследование поведения. Обследовались две группы 1.5-годовалых крыс обоего пола. Контрольная группа была представлена интактнымии, а опытная - ПНО животными. Самки, находящиеся в фазе проэструса и эструса, в эксперимент не включались. В тесте открытого поля испыты-вались 26 самцов и 34 самки, из них 12 самцов и 10 самок составляли группу ПНО животных. Открытое поле представляло собой площадку размером 100x100 см, разбитую на 25 одинаковых квадратов и имеющую 36 норок (отверстий диаметром 3 см), равномерно распределенных по всей площади. Освещенность площадки не менялась за время эксперимента и составляла 100 лк. Стартован площадкой служил квадрат, расположенный в левом нижнем углу. Животные тестировались один раз на протяжении трех минут. Регистрировались девять поведенческих элементов: локомоция - стремительные перемещения животного в горизонтальной плоскости; локомоция с принюхиванием - передвижение животного в горизонтальной плоскости с одновременным обнюхиванием территории; сидение - неподвижная поза животного в тонусе с открытыми глазами; сидение с принюхиванием - поза без существенных смещений тела с поворотом головы и шевелением вибрисс; радиальное принюхивание - изменение положения корпуса и передних конечностей при неподвижности задних; заглядывание в отверстие, подъем на задние лапы; чистка; замирание. Для изучения эффекта зоосоциапыюй изоляции использовали 10 самцов и 10 самок, из них 5 самок и 5 самцов составляли группу ПНО животных. При изоляции животные содержались индивидуально в клетках размером 50x30x15см; обеспечивался свободный дос-

туп к воде и пище и 12-часовой световой режим. Парное взаимодействие животных изучали после недельной изоляции; к каждому опытному животному подсаживали интактного партнера того же или противоположного пола. Реакция на вторжение интрудера (партнера) регистрировалась в течение 8 минут. Для анализа поведения были применены принципы классификации поведения самцов мышей и крыс (Пошивалов, 1986). Выделяли две основные группы поведенческих элементов: внутривидовые (скучивание, напряженное внимание, пассивный контакт, обнюхивание тела, обиюхивание половое, груминг партнера, попытка садки, угроза вертикальная, борьба) и индивидуальные (сидение с принюхиванием, ло-комоция, подъем на задние лапы, чистка, отряхивание, еда, рытье подстилки, замирание). Индивидуальное поведение животных наблюдали в течение 3 мин в открытом поле, представляющем собой открытое пространство размером 150x150 см с 36 равномерно распределенными отверстиями с диаметром 3 см. Опыты выполнены на 42 полуторагодовалых крысах обоего пола, из них 8 самцов и 13 самок были облучены пренатально. Регистрация поведения и обработка экспериментальных данных проводилось но специальным программам, разработанным на языке Бейсик, позволяющих учитывать последовательность и длительность поведенческих элементов, а также провести графологический кластерный анализ структуры поведения группы в целом (Пошивалов, 1989). Результаты экспериментов представлены в виде направленных графов, отражающих взаимосвязи поведенческих единиц, и кластеров, объединяющих поведенческие элементы по уровню взаимных переходов. Достоверность отличий показателей поведения в контроле и опыте в открытом поле оценивали по не- парному непараметрическому критерию Манна -Уитни, в парном взаимодействии - по парному непараметрическому критерию Т Вилкоксона (Гублер, 1973).

Экстракция и анализ ДНК. Свежеизвлеченный мозг гомогенизировали в 2 мл лизирующего раствора (1% ДСН, 0.2 мг/мл протеиназы К, 0.1 М ИаС1, 20 мМ трис-НС1 рН 8.0, 20 мМ ЭДТА) и инкубировали не менее 1 ч при +50°С. ДНК дважды депротеинизировали смесью фенол-хлороформ (1:1) и осаждали 2 объемами этанола в присутствии 0.3 М ацетата аммония. Осадок ДНК растворяли в БТЕ буфере и обрабатывали РНКазой А 1 ч при после чего вновь депротеинизировали и оса-

ждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в ТЕ буфере и концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм. 30

мкг прогретой при +50°С ДНК наносили в лунку 1.6% агарозного геля, приготовленном на lxTBE буфере и содержащем 0.5 мкг/мл бромистого этидия, и проводили электрофорез в течение 4-6 ч при постоянном напряжении.

Выделение РНК, электрофорез и перенос на фильтр. Суммарную клеточную РНК выделяли 27методом ультрацентрифугирования в хлористом цезии (Chirwin, 1979). Мозг 6-12 животных одного помета быстро гомогенизировали в 5 М растворе гианидинтиоцианата из расчета 8 мл раствора на 1 г ткани. Гомогенат наслаивали на на 20 мл 5.7 М раствора CsCl и центрифугировали в роторе SW-27 на ультрацентрифуге Beckman L7-87 в течение 24 часов при 24000 об/мин. Осадок РНК растворяли в 1 мл воды и осаждали 2.5 объемами этанола в присутствии 3 М ацетата аммония. РНК растворяли в воде и ее концентрацию измеряют спектро-фотометрически при длине волны 254 нм. РНК (10 мкг) денатурировали в присутствии 1 М глиоксапя при +60°С в течение 30 мин, после чего проводили электрофорез в 1.2% агарозном геле, приготовленном на 20 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7.0 в течение 6 часов. По окончании электрофореза, РНК переносили из геля на нейлоновый фильтр (Хийу Калур, Эстония; Duralon-UV, Stratagene) методом электро- или капиллярного блоттинга. РНК фиксировали на фильтре УФ-светом с течение 1 мин, после чего удаляли глиоксаль, инкубируя фильтр в горячем (+90°С ) растворе 10 мМ Трис-HCl рН 9.0 в течение 20 мин. Качество переноса РНКи ее количественную оценку проводили путем окрашивания фильтрараствором 0.02% метиленового синего.

Радиоактивное мечение ДНК-пробы и Northern-гибридизация. Все упомянутые в работе клонированные последовательности генов были получены непосредственно от авторов с разрешение на их использование для научных целей. В качестве радиоактивного предшественника использовали [фосфор-32]-дЦТФ (ТМО В/О "Изотоп"; "New England Nuclear"; УА> 111 Пбк/моль). Мечение ДНК производили с помощью коммерческих наборов для ник-трансляции ("Amersham") и праймер-ме-чения ("Stratagene" и "Pharmacia") по стандартным протоколам. Фильтры с иммобилизованной РНК предварительно инкубировали в течение ночи в смеси следующего состава: 7% ДСН, 0.15 М натрий-фосфатный буфер рН 7.0, 5 мМ ЭДТА при +60°С. Гибридизацию фильтров с [фос-

фор-32]-мечеными ДНК пробами (УР 0.5-1.5x10 имп/мин мкг ДНК) проводили в смеси того же состава в течение 24 часов при +60°С. По

окончании гибридизации, фильтры подвергали жесткой отмывке в O.lxSSC буфере при с последующей авторадиографией и денси-

тометрированием рентгеновской пленки на лазерном денситометре SLR-1D/2D ("Biomed Instruments")- Воспроизводимость результатов для каждого гена контролировали путем проведения 2-4 независимых гибридизаций.

Белковый (Western) анализ. Экстракты клеток мозга получали ли-зируя ткань в буфере: 15 мМ трис-HCl рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 0.1% ДСН, 0.5% тритон Х-100, 1 мМ пирофосфат натрия, 10 мкл/мл PMSF и 5 мкг/мл пепстатина А). Электрофорез белков (15 мкг на дорожку) проводили в градиентном 4-20% акриламидном геле (ДСН-трис-глициновый буфер) с последующим электропереносом на PVDF мембрану. Контроль качества электрофореза осуществляли окрашиванием отделенной перед электропереносом верхней части геля раствором красителя Coomassie brilliant blue. После стадии блокирования участков несиецифической сорбции на мембране 5% раствором обезжиренного молока, проводили инкубацию фильтра с 100 иг/мл антител мыши против человеческих белков р53, bcl-2 и bax ("Oncogene Science") в течение 1 часа в буфере: PBS, 1% молоко, 0.05% твин-20. Для иммунодетекции использовали высокочувствительную хемилюминесцентную систему ECL ("Amersham").

Конструироване клонотек кДНК. Процедура направленного клонирования в системе lambda ZAP II ("Stratagene") детально описана нами ранее (Евтушенко, 1994) и состоит из следующих этапов: синтез первой цепи кДНК на матрице поли(А) содержащей РНК мозга контрольных и подвергнутых гамма-нейтронному облучению в дозе 0.75 Гр (0.5 Гр нейтронов) 17-дневных эмбрионов крысы, синтез второй цепи кДНК; встраивание кДНК в фагмидный вектор и упаковка первичных клонотек; амплификация первичных фаговых клонотек; перевод клонотек кДНК из фагового вектора lambda ZAP II в форму одноцепочечной гшазмидны pBluescript (SK-).

Получение вычитательной клонотеки. Для получения вычитатель-ной клонотеки головного мозга ПНО эмбрионов производились следующие процедуры. Выделяли одноцепочечную ДНК из плазмидных клонотек ' контрольных и ПНО крыс. Производили амплификацию и одновременное биотинилирование вставок кДНК контрольной клонотеки с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР): реакционная смесь

содержала 1-кратный ПЦР буфер, 1 мкг ДНК контрольной клонотеки, 0.2 мМ каждого из дНТФ и 0.1 мМ биотин-21-дАТФ, 1.5 мМ MgCl2, 1 мкМ стандартных ТЗ и Т7 праймеров и 5 единиц Taq ДНК полимеразы. После проведения 30 циклов амплификации (денатурация +94°С в течение 1 мин, отжиг праймеров +55°С в течение 1 мин, синтез +72°С в течение 2 мин) биотинигшрованую кДНК депротеинизировали смесью фенол-хлороформ и осаждали этанолом. Осадок кДНК (10 мкг) контрольной клонотеки растворяли в 10 мкл гибридпзационного буфера (50% формамид, 0.5 M NaCl, 10 мМ трис-HCl рН 7.5 и 1 мМ ЭДТА), содержащего 0.1 мкг одноцепочечной ДНК клонотеки облученного мозга и проводили гибридизацию при +42°С в течение 48 часов. Гибридизацион-ную смесь разбавляли до 0.2 мл буфером STE и биотинигшрованую кДНК удаляли инкубацией с стрептавидин-сефарозы, после чего сефаро-зу удаляли центрифугированием. Одноцепочечнуго кДНК, обогащенную последовательностями специфическими для облученного мозга, осаждали этанолом, растворяли в ПЦР-смеси, добавляли SK праймер и инкубировали при +55°С в течение 1 мин, а затем при +72°С в течение 10 мин, превращая ее таким образом в двуцепочечную ДНК. На заключительном этапе производили лигирование кДНК с вектором pBluescript, предварительно обрабатанными рестриктазами EcoRI и Xhol, после чего клетки E.coli штамма XL 1-Blue MRF' трансформировали полученным конструктом и высевали на питательную среду, содержащую в качестве селективного агента ампицшпш в концентрации 50 мкг/мл.

Дифференциальный анализ клонотеки. Индивидуальные колонии, полученные в процессе конструирования вычитателыюй клонотеки и содержащие рекомбинантные плазмиды, переносили на 3 фильтра и идентично располагали рядами 16x16 колоний. Полученные таким образом репликн фильтров обрабатывали согласно стандартному протоколу (Ма-ниатис, 1979) с целью фиксации ДНК плазмиды. В качестве зондов использовали одноцепоченную [фосфор-32]-меченую кДНК, синтезированную с помощью набора cDNA Synthesis Kit ("Stratagene") на матрице РНК из 17-дневного мозга контрольных и ПНО эмбрионов. Реплики фильтров параллельно гибридизовалась парами - один фильтр с контрольной [фосфор-32]-кДНК, а второй с [фосфор-32]-кДНК из мозга ПНО крыс. Процедура гибридизации и отмывки описана выше. Радиоавтографы сравнивали визуально и для последующего анализа отбирали те клоны, экспрессия которых после облучения усиливалась. Секвенирова-

ние вставок кДНК осуществляли с помощью коммерческого набора (Sequenase DNA Sequencing Kit, "USB"), последующий электрофорез - в аппарате S2 Sequencing Gel System ("Life Technologies"). Компьютерный анализ первичных последовательностей проводили на копьютере HELIX с использованием программы GCG (Национальный институт здоровья США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структурно-функциональные нарушения мозга.

Дефицит веса головного мозга. Пренатальное гамма-нейгронное облучение после рождения приводит к развитию дефицита веса головного мозга. В отдаленные сроки после облучения (1.5 года) в дозе 0.75 Гр (вклад нейтронов - 0.5 Гр) в мозге ПНО животных заметно уменьшена площадь коры больших полушарий и сглаженность ее извилин (рис. 1). Динамика пострадиационой задержки накопления массы головного мозга при двух дозах гамма-нейтронного облучения (рис. 2) выявила зависимый от дозы характер. У новорожденных дефицит веса мозга составил 18% (0.5 Гр нейтронов), у недельных крысят эта величина достигает

■1 v я Г.' г -+U J 1 \ * . „-<¡4 5 г -, ™ ,, „ ' .?• ^ ' sV ■

о К

Рисунок 1. Внешний вид головного мозга пренатально облученных (О) и контрольных (К) крыс через 1.5 года после рождения.

Е 2 С

(г)

Рисунок 2. Возрастная динамика увеличения веса головного мозга

контрольных и in utero облученных крыс. К - контрольные животные; О - пренаталыго облученные в дозе 0.5 Гр (вклад нейтронов - 0.35 Гр); О' - пренатально облученные в дозе 0.75 Гр (вклад нейтронов - 0.5 Гр).

38% и наиболее выражена у 3-х недельных животных (42%). Дефицит веса мозга сохраняется на уровне 31-37% в течение всего срока наблюдения (1.5 года). Наши данные находятся в хорошем соответствии литературными (Пионтковский, 1964; Vogel, 1984) и свидетельствуют о том, что экспериментальная условия выбраны адекватно.

Анализ поведения животных. Прежде всего исследовали те аспекты поведения взрослых (1.5 года) пренатально облученных крыс (гамма-нейтронное облучение в дозе 0.75 Гр, вклад нейтрнов - 0.5 Гр), которые отражают функциональное состояние центральной нервной системы (ЦНС) этих животных. Так как нарушение поведенческих функций наиболее отчетливо выявляется в экстремальных условиях, были рассмотрены две стрессовые ситуации: помещение интактных и пренатально облученных крыс в условиях открытого поля и парное взаимодействие после кратковременной изоляции (1 неделя) с неагрессивным партнером из группы. Используемая этологическая методика позволяет оценить особенности структуры как индивидуального, так и зоосоциаль-ного поведения в целом. Отличительной особенностью методики является непрерывное наблюдение за свободно движущимся животным в течение заданного промежутка времени с регистрацией последовательности и длительности всех идентифицируемых актов и поз на основе классификации элементов поведения крыс (Пошивалов, 1989).

Рисунок 3. Структура поведения группы животных в открытом поле: а - контрольная группа, б - облученная. Толщина стрелок отражает вероятность переходов из одной позы в другую, величина окружности - уровень относительной длительности поведенческого элемента. Обозначения элементов см. в тексте.

Для индивидуального поведения крысы в ситуации открытого ноля такими элементми являются: локомоция (Л), локомоция с принюхиванием (ЛПр), сидение с принюхиванием (СПр), радиальное принюхивание (РПр), подъем на задние лапы (ПЗЛ), заглядывание в отверстие (30), чистка (Ч), сидение (С), замирание (3). В тесте парного взаимодействия такими элементами поведения являются: в категории общительности -скучивание (Ск), пассивный контакт (ПК), груминг партнера (ГП), попытка садки (ПС), обнюхивание тела (ОТ), обнюхивание аногениталь-ной области (ОП); в категории исследования среды - сидение с принюхиванием (СПр), подъем на задние лапы (ПЗЛ), локомоция (Л); в категории агонистического поведения - борьба (Б), угроза вертикальная (УВ), угроза головой (УГ), угроза корпусом (УК), замирание (3); в категории комфортного поведения - чистка (Ч); в категории пищевого поведения - еда (Е); в категории прочих поведений - сидение (С), рытье подстилки (РП), напряженное внимание (НВ). Структура поведения облученных особей в открытом поле по уровням подобия элементов была близка к структуре поведения контрольной группы, однако возросла частота взаимных переходов между элементами, увеличилась (р<0,05) длительность позы "сидение", появилась поза "замирание" (рис. 3).

Рисунок 4. Структура поведения группы животных в ситуации парного взаимодействия с однополым партнером (левая половина рисунка) и с партнером противоположного пола (правая половина рисунка). а - контрольная группа, б - облученная. Заштрихованные окружности -поведение, которое входит в комплекс агрессивности. Обозначения элементов см. в тексте.

Ведущим элементом поведения животных обеих групп являлось "сидение с принюхиванием". В группе облученных животных были выявлены достоверные (р<0,05) межполовые различия латентного периода первой побежки со стартовой площадки.

В структуре поведения при парном взаимодействии после изоляции у облученных животных появился комплекс агрессивности (рис. 4). Одновременно, на фоне увеличения (р <0,05) локомоторной активности появилась поза "замирание". Более выраженную агрессивность у облученных особей наблюдали по отношению к сородичам противоположного пола, при этом межполовых различий выявлено не было. В связи с тем, что изоляция от сородичей усугубляет индивидуальные особенности

животного, можно предположить, что пренатально облученные особи изначально более агрессивны вследствие сниженной скорости адаптации.

Сопоставляя результаты, полученные в обеих ситуациях, можно отметить, что общая активация поведения, появление агрессии, возрастание хаотичности наряду с присутствием поведенческих поз, характерных для угнетенного состояния животного ("сидение", "замирание", "скучива-ние", "пассивный контакт"), указывает на большую степень тревожности пренатально облученных особей, слабую скорость привыкания к незнакомой обстановке vi недружелюбное отношение к сородичам. Наблюдаемые особенности поведения пренатально облученных животных, очевидно, можно объяснить недостаточностью тормозного влияния коры головного мозга на подкорковые структуры вследствие пострадиационного недоразвития этого отдела мозга. Нарушение поведения взрослых крыс свидетельствуют о функциональной неполноценности пренатально облученных мозга в отдаленный период.

Цитокинетика. Типичная гистограмма распределения ядер клеток мозга по содержанию ДНК у 18-дневных эмбрионов в норме и после гамма-нейтронного облучения в дозе 0.75 Гр на 17-й день in utero представлена на рис. 5а-б. Распределение клеток имеет бимодальный характер, первый пик на гистограмме соответствует клеткам, находящимся в Gq+i фазах, второй - в G^+M фазах. Промежуточное положение занимают клетки в S-фазе. Через сутки после облучения (рис. 56) наблюдается перераспределение клеток по фазам жизненного цикла, которое заключается в достоверном увеличении процентного содержания

Таблица 1. Распределение клеток суммарного головного мозга и его

" хкмраст крыс, дни, к отделы цозга U ж |! Ii Контроль

доля клеток к фатах цикла. % доля клеток в фазах цикла, %

Go»i S Gj+M С0,| S о2+м

Возраст 18, in utero l.post partum 7, post partum 14, post partum Отделы мозга, 7 дней post partum Мозжечок СрсдниД мозг Продолговатый Кора 1 5 12 19 73.3 t 1.9 77.1 ±2.9 90.8 it.8 94,6 ±3.2 723 ± 2.0 98.0 ± 1.7 97.8 ± 1.9 96.1 ± 1.8 12.7 ±1.3 16.5 ±0.7 5.5 ±1.7 Z3±1.3 16.2 ±2.2 0.6 ±13 1.1 ± 1.3 2.9 ± 1.6 14.1 ±1.4 6.4 ±2.6 3.7 ±1.8 3.1 ±2.8 11.6 ± 1.9 1.5 ± 1.4 1,1 ± 1.2 1.0 ±1.9 84.8 ±0.8 85.8 ± 1.6 96.1 ±0.5 94.4 ±2.3 88.7 ±1.1 97J ± 1.1 94.5 ±2.3 97.4 ±1.5 7.8 ±0.1 9.8 ±2.4 1.5 ±0.6 4.5 ±3.2 5.9 ±1.8 1.1 ±1.8 3.6 ±2.1 0.6 ±1.3 7.4 ±0.8 4.6 ±2.8 2.4 ±1.6 1.1 ±1.0 5.5 ± 1.6 1.6*1.6 1.9 ±1.8 2.0 ±1.9

Рис. 5. Распределение клеток головного мозга по фазам жизненного цикла в разные сроки после in Mero гамма-нейтронного облучения крыс на 17-й день. Слева - контрольные, справа - облученные животные через 1 сутки (а, 6), 5 суток (в, г), 12 суток (д, е) и 20 суток (ж, з) после радиационного воздействия в дозе 0.5 Гр нейтронов. Абсцисса - содержание ДНК в отн. ед.; ордината - число клеток.

Рис. 6. Распределение клеток головного мозга по фазам жизненного цикла в отделах головного мозга контрольных и ПНО крыс через 7 суток после рождения (12 суток после in utero облучения).

Верхний ряд - облученные животные, нижний ряд - контрольные.

клеток в S и G2+M фазах и, соответственно, уменьшении доли клеток в Go+i фазе (табл. 1). Наблюдаемое явление может быть объяснено как интерфазной гибелью части клеток, так и радиационным блоком митоза, возникающими после облучения. Анятш? распределен;:;; клеток по Си-держанию ДНК у контрольных и ПНО новорожденных крысят (5 дней после внутриутробного облучения) показывает, что если в контрольной группе распределение клеток у 18-дневных эмбрионов и новорожденных крысят было почти одинаковым (рис. 5 а,в), то после облучения наблюдается возрастание доли клеток, находящихся в S-фазе цикла. Это, по-видимому, обусловлено компенсаторным усилением пролиферации клеток мозга в ответ на радиационную гибель части популяции. Уже через 5 дней после рождения в большинстве отделов мозга крысы (продолговатый и средний мозг, кора мозга) не обнаруживается различий в распределении клеток по циклу (рис. 6). Отличия сохраняются лишь в мозжеч-

ке, где у облученных животных отмечается увеличение доли клеток S+G2+M (табл. 1). Вероятно, это объясняется тем, что пролиферация клеток в мозжечке сохраняется на достаточно высоком уровне в течение первых недель после рождения. Несмотря па то, что пролиферация ней-рональных клеток еще происходит в первые дни после рождения, основной пролиферирующей системой в мозге после рождения являются гли-альные клетки. Через 12 дней после рождения в суммарной клеточной популяции мозга контрольных и ПНО животных не выявляются различия в распределении клеток по циклу (рис. 5 ж-з). К этому времени большинство нервных клеток находится вне пролиферации, за исключением ограниченной популяции (нейроглия, незрелые клетки вторичного герминативного слоя перед него мозга, эндотелиальные клетки). Из литературы известно, что облучение грызунов на 15-18-й день внутриутробного развития различными видами излучения (рентгеновским, гамма, нейтонным и смешанным) приводит к гибели нейробластов (Hick, 1957; Antal, 1984; Mole, 1990). В пострадиационный период это сопровождается уменьшением числа нейронов и увеличением количества глиальных клеток в результате их усиленной пролиферации. Наблюдается также компенсаторная пролиферация нейроналышх клеток, при этом в облученном мозге образуются характерные "розетки", состоящие из нейронов, которые сохранили способность делиться, но не могут мигрировать в патологическом окружении (Mole, 1990).

Таким образом, наблюдаемое в наших экспериментах пострадиационное увеличение доли клеток в S+G2+M фазах клеточного цикла у новорожденных крыс отражает усиление пролиферации выживших после облучения нервных клеток, которое однако не предотвращает развития дефицита веса головного мозга после рождения.

2. Ранние молекулярно-биологические изменения в in utero облученном мозге.

Для исследования ранних пострадиационных нарушений мозга эмбриона, происходящих в первые часы после радиационного воздействия мы использовали гамма облучение в дозе 4 Гр. Это было связано с технической невозможностью исследовать динамические параметры у животных, подвергнутым in utero гамма-нейтронному облучению в биологическом канале реактора ВВР-М в первые 5 ч после воздействия. Мы вы-

брали дозу гамма-облучения 4 Гр, поскольку по литературным данным она вызывает в мозге такие же физиологические, цитологические и биохимические последствия, как и доза 0.5 Гр нейтров (Пионтковский, 1964; Vogel, 1978; Antal, 1984; OECD, 1988). Мы поставили также ряд собственных контролен, которые показали, что в эмбриональном мозге 17-дневных крыс появление пикнотических клеток, межнуклеосомная деградация ДНК и характер экспрессии ряда генов через 5 ч после in utero облучения был одинаков для обоих видов радиационного воздействия (4 Гр гамма- и 0.75 Гр гамма-нейтронного облучения).

Морфологический анализ. Для характеристики гибели нервных клеток использовали как обычное окрашивание срезов мозга толуидино-вым синим, так и флуоресцентным ДНК-специфическим красителем Hoechst 33258 (рис. 7). Срезы переднего мозга 17-дневных эмбрионов в контроле содержали исчезающе малое количество пикнотических клеток

Рисунок 7. Световые и флуоресцентные микрофотографии (увеличение 1000-кратное) срезов мозга 17-дневных эмбрионов крысы.

Верхний ряд - окрашивание толуидиновым синим, нижний - ДНК-специфическим красителем Hoechst 33258.

А - контрольные животные; Б - через 5 часов после облучения в дозе 4 Гр; В - через 15 часов после гамма-облучения в дозе 4 Гр.

(менее 0.3%), что свидетельствует о низком уровне естественной гибели клеток коры на этой стадии развития (Ferrer, 1992). На срезах переднего мозга через 5 часов после in utero гамма-облучения в дозе 4 Гр в 80% клеток кортикального нейроэпителия и 40-50% клеток основания коры наблюдается пикноз, что характерно для клеточной гибели по типу апоп-тоза. При большем разрешении в никнотических ядрах переднего мозга отчетливо видны кареорексис и фрагментация конденсированного хроматина. В области основания коры пикнотические клетки находятся в окружении нормальных, что также характерно для апоптотиче-ского, но не некротического типа гибели. Через 15 часов после облучения большинство клеток (60-65%) переднего мозга погибает и исчезает, а ядра оставшихся клеток выглядят как лизированые мешочки, в которых видны небольшие комочки хроматина. Такая картина более характерна для некротического кариолизиса или "онкозиса" (Manjo, 1995), чем для апоптотического кариорексиса. По-видимому, в более отдаленные сроки после облучения у части клеток головного мозга, в которых программа реализации апоптоза не была завершена фагоцитозом соседними клетками вследствие массовой гибели последних, возникают вторичные некрозы, как это было описано для индуцируемого стрессом апоптоза кортикальных нейробластов (Ratan, 1994).

Таким образом, по морфологический критерию большинство клеток облученного эмбрионального мозга в первые часы после радиационного воздействия гибнет по апоптотическому типу, что соответствует литературным данным, полученным для различных типов излучения - рентгеновского, гамма и нейтронного (Altman, 1971; Antal, 1984; Mole, 1990).

Анализ фрагментации геномной ДНК. Характерная для апоптоза картина межнуклеосомного расщепления ДНК клеток мозга эмбриона выявляется уже через 1 час после облучения (рис. 8, дорожка 4). В последующий пострадиационный период 2-24 ч межнухлеосомная деградация ДНК усиливается. Межнуклеосомная фрагментация ДНК клеток коры и другие морфологические характеристики апоптоза описаны и в случае in utero облучения 13-дневных эмбрионов мыши (Inouye, 1995).

Таким образом, на биохимическом уровне пострадиационная гибель клеток эмбринального мозга также присходит по типу апоптоза.

М1 23456789

Рисунок 8. Пострадиационная фрагментация геномной ДНК в головном

мозге 17-дневных эмбрионов крысы. М - маркер, смесь ДНК фрагментов кратных 123 парам оснований (п.о.); 1- ДНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - ДНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - ДНК из мозга облученных 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения.

Электрофорез в 1.6% агарозном геле, окрашивание бромистым этидием.

Для того, чтобы установить, зависит ли реализация индуцированного радиацией апоптоза от синтеза белка и РНК мь: ггрятснили ингиби-торныи анализ. В качестве ингибитора белкового синтеза использовали циклогексимид (ЦГИ), а ингибитора синтеза РНК - актиномицин Д (АМД). Известно, что ЦГИ проникает как сквозь плацентарный барьер, так и гемато-энцефалический, поэтому его инъецировали подкожно двумя дозами, первую инъекцию производили за 0.5 ч до облучения, а вторую - через 1.5 ч после облучения. Такая схема гарантирует подавление белкового синтеза на протяжении всего пострадиационного периода наблюдения (4 ч). Оказалось, что ЦГИ полностью блокирует индуцируемую радиацией межнуклеосомную фрагментацию ДНК (рис. 9). Микроскопический анализ подтвердил, что ЦГИ подавляет кареорексис ядер и пик-

М 1 2 3 4 5 б

861 и.о. -615 п.о. -

369 п.о. -*

123 п.о. - _

Рисунок 9. Подавление межнуклеосомного расщепления геномной ДНК циклогексимидом через 4 ч после in utero облучения.

М - маркер, смесь ДНК фрагментов кратных 123 парам оснований; 1- ДНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - ДНК из мозга облученных 17-дневных эмбрионов; 3 - ДНК из мозга контрольных эмбрионов после инъекции ЦГИ в суммарной дозе 2 мг; 4 - ДНК из мозга облученных эмбрионов после инъекции ЦГИ в суммарной дозе 2 мг; 4 - ДНК из мозга контрольных эмбрионов после инъекции ЦГИ в суммарной дозе 5 мг; 6 - ДНК из мозга облученных эмбрионов после инъекции ЦГИ в суммарной дозе 5 мг.

ноз клеток. Таким образом, для реализация индуцированного радиацией апоптоза клеток эмбрионального мозга необходим белковый синтез.

Поскольку использование АМД in vivo невозможно, ввиду его неспособности проникать сквозь плацентарный барьер (Баранов, 1969), мы изучалии эффекты АМД на временной культуре диссоциированных клеток эмбрионального мозга. Оказалось, что в клетках, инкубированных в течение 1 часа до облучения в присутствии 5 мкМ АМД также блокируется индуцируемая радиацией межнуклеосомная фрагментация ДНК.

Полученные данные показывают, что для реализации программы апоптоза в клетках эмбрионального мозга необходим как белковый синтез, так и транскрипция РНК. Это данные косвенно свидетельствуют в

123456789 10

А .

18 S —

••««А » ■ ; т

123456789 10

Рисунок 10. Анализ представленности мРНК группы генов,

кодирующих структурные белки и ферменты основных метаболических путей. А - глицерофосфат дегадрогеназа; Б - Р-актин; В - циклофшшн А. 1- РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после гамма облучения в дозе 4 Гр; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; б - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; Q - через 24 ч после облучения; 10 -РНК из мозга контрольных взрослых крыс.

пользу того, что в реализации радиационного апоптоза участвуют синтезированные de novo продукты специфических клеточных гены.

Экспрессия клеточных генов. Содержание суммарной РНК на грамм ткани через 5 ч после радиационного воздействия не отличалось от контрольного значения, однако снижалось на 20% через 24 часа. Эти изменения касаются главным образом рибосомной РНК, составляющей большую часть (до 85%) клеточной РНК. Доля мРНК в клеточной популяции транскриптов обычно не превышает 5%, поэтому для изучения эф-

фектов радиации на содержание мРНК индивидуальных генов использовали метод Northern-гибридизации. В первую очередь исследовали экс прессию транскриптов генов, кодирующих структурные белки и ферменты основных метаболических путей, которые составляют подавляющую часть популяции мРНК. На рис. 10 представлены данные для трех генов этой группы - глицерофосфат дегидрогеназы, ß-актина и циклофилина А. Были взяты гены, характер экспрессии которых в процессе развития мозга крысы существенно отличается: в то время, как представленность мРНК глицерофосфат дегидрогеназы в мозге взрослых крыс (дорожка 10) увеличивается по сравнению с эмбрионом (дорожка 1), содержание мРНК ß-актина и циклофилина А в мозге взрослых животных значительно ниже. Оказалось, что представленность мРНК (то есть число молекул в 1 мкг суммарной РНК) трех генов через 3-5 часов после in utero облучения снижена в 2-3 раза (дорожки 6-8) по сравнению с контролем (дорожка 1). Через сутки после облучения (дорожка 9) наблюдается частичное восстановление представленности этих мРНК. Аналогичные данные были получены нами для мРНК некоторых рибосомных белков и ряда других структурных генов. Таким образом, в эмбриональном мозге облучение угнетает экспрессию большой группы клеточных генов, кодирующих структурные белки и ферменты основных метаболических путей, независимо от индивидуальной программы их экспрессии в онтогенезе мозга. По литературным данным известно, что индукция апоптоза в культуре нейронов крысы в период, предшествующий их гибели, также сопровождается общим снижением уровня транскриптов нейрональных генов (более 70 видов мРНК) и рибосомных РНК (Estus, 1994).

Следующая ipynna изученых генов включала представителей прото-онкогенов, кодирующих факторы транскрипции (c-fos, c-jun, c-junB и с-шус) и играющих исключительно важную роль в развитии и функционировании нервной системы. В клетках мозга контрольных 17-дневных эмбрионов уровень транскриптов генов c-fos и c-junB был очень низким по сравнению со взрослыми животными (рис. 11, дорожки 1 и 10). В период 2-24 ч после облучения (дорожки 5-9) содержание c-fos мРНК резко увеличивается, превышая контрольный уровень в 15-20 раз через 3-5 ч. Содержание мРНК c-junB также резко возрастает в период 1-5 ч после облучения (дорожки 4-8), превышая в 40 раз контрольный уровень через 3 ч после воздействия (дорожка 6). Напротив, экспрессия прото-онкогенов c-jun и с-шус в мозге in utero облученных эмбрионов заметно

с-]ип

с-^ип В

28Я-18Б-

с-тус

28 8-

18в-

123456 789

Рисунок 11. Анализ представленности транскриптов прото-онкогенов с-Го», с-]ип, с-]ипВ и с-тус, кодирующих транскрипционные факторы. 1 - РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения; 10 -РНК из мозга контрольных взрослых крыс.

снижена. По сравнению с контролем, уровень транскриптов гена с-шус через 3 ч после облучения был в 10 раз ниже (дорожки 1 и 6), а наиболее существенное падение уровня c-jun происходит через сутки после радиационного воздействия (дорожка 10), хотя тенденция к снижению отмечается уже в первые часы. На модели апоптоза нейронов крысы, индуцированного дефицитом фактора роста нервов также наблюдали активацию гена c-fos, которая была ограничена клетками, в которых происходит конденсация хроматина. При этом, микроииъекция в нейроны антител к белку Fos защищала клетки от апоптоза, в то время как антитела к белкам семейства Jun не оказывали защитного действия (Estus, 1994). Как известно, белки семейства Fos и Jun являются компонентами АР-1 транскрипционного фактора, тонкая регуляция которого осуществляется путем включения в состав комплекса белковых гетеродимеров Fos/Jun и гомодимеров семейства Jun (Curran, 1991). Низкий уровень экспрессии мРНК c-jun и c-junB позволяют предположить, что белки Fos и JunB не входят в состав АР-1 комплекса на этой стадии развития мозга. Быстрая пострадиационная активация транскрипции генов c-jun и c-junB приводит, по-видимому, к появлению гетеродимера Fos/JunB в составе АР-1 комплекса, что в свою очередь меняет транскрипционную специфичность комплекса (Deng, 1993) и характер генной экспрессии клетки в целом.

Особый интерес представляет изучение пострадиационной экспрессии генов, участие белковых продуктов которых в регуляции физиологического апоптоза установлено на других клеточных системах. В эту группу мы включили четыре гена, три из которых - Bcl-2, Bcl-xL и ICE - являются ингибиторами апоптоза, а одни - Вах - активатором. В В экспериментах на трансгенных животных показано, что наличие хотя бы одного функционального аллеля гена Вс1-х необходимо для нормального эмбриогенеза головного мозга мыши. Инактивация обоих аллелей Вс1-х приводит к массовому апоптозу постмитотических нейробластов и гибели эмбриона к 13-му дню развития (Motoyama, 1995). В экспериментах in vitro установлено, что продукт гена Вс1-2 предотвращает апоптоз нейронов, индуцированный различными агентами, включая дефицит трофических факторов (Garcia, 1992; Zhong, 1993). Bcl-2 экспрессируется на высоком уровне в нейронах всех исследованных отделах развивающейся центральной и периферической нервной системы в период массовой физиологической гибели нервных клеток, что связывают с его функцией

ICE

123456789 10

28 S- '

18S-

Bcl-2

Bcl-xl 28 S-

18S-

Bax

18 S-

i г 3 д .ч fi 7 a q in

Рисунок 12. Анализ представленности мРНК генов ICE, Bcl-2, Bc1-xl и Вах.

I - РНк. из мозга контрольных 17-днсвных эмбрионов; 2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения; 10 -РНК из мозга контрольных взрослых крыс.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рисунок 13. Анализ уровня белкового продукта гена Вс1-2. 1 - белки мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - белки мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - белки мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения.

дифференциального предотвращения гибели нейронов в процессе развития (Merry, 1994). Ген ICE является членом семейства сериновых проте-аз, участвующих в регуляции апоптоза в различных типах клеток, в том числе и в нервных (Kumar, 1994). Ген Вах принадлежит к тому же сесемейству, что и гены Вс1-2 и Bcl-хь однако повышенная экспрессия белка Вах приводит к активации программы апоптоза. Известно также, что радиационная индукция апоптотической гибели клеток в культуре сопровождается 5-кратным повышением уровня мРНК гена Вах (Zhan, 1994).

Анализ уровня мРНК генов ICE, Вс1-2 и Bcl-xL показал, что он снижается в период 3-5 ч после облучения (рис. 12). В результате аль" тернативного сплайсинга транскрипты гена Вс1-2 существуют в виде двух форм мРНК размером 2.4 и 7.5 тысяч нуклеотидов. В пострадиационный период представленность обеих мРНК Вс1-2 в клетках мозга была в 2-3 раза ниже, чем в контроле. С помощью Western-blot анализа показано паралельное снижение уровня белкового продукта гена Вс1-2 к 5 ч после облучения и его восстановление через 24 ч (рис. 13). Напротив, уровень мРНК гена Вах был в 2-2.5 раза выше контрольного в период 1-5 ч после радиационного возд-ействия и возвращался к исходному значению через 24 ч. Следует отметить, что представленность мРНК гена Вах относительно пострадиационного уровня мРНК Вс1-2 и Bcl-xj, усиливалась в 4 раза, С помощью Western-blot анализа было также показано параллельное усилению экспрессии мРНК гена Вах повышение уровня его белкового продукта через 1-5 ч после облучения.

12345 67 89 10

28 S -

Рисунок 14. Анализ представленности мРНК гена р53. 1 - РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения; 10 -РНК из мозга контрольных взрослых крыс.

Таким образом, после in utero облучения в клетках эмбрионального мозга усиливается экспрессия активатора апоптоза гена Вах и одновременно снижается экспрессия группы генов, предотвращающих или задерживающих развитие апоптоза (ICE, Bcl-2 и Bc1-Xl). По существу-ющей гипотезе (Oltvai, 1994), белки Вах, Вс1-2 и Bcl-xL, являющиеся членами одного семейства, образуют гетеродимеры, а активатор апоптоза белок Вах способен вытеснять белки Вс1-2 и Вс1-х^ из гетеродимера, сдвигая таким образом равновесие в сторону реализации программы клеточной гибели по принципу реостата. Временной характер экспрессии згой группы генов свидетельствеут в пользу того, что изменение соотношения их белковых продуктов в клетках облученного мозга скорее поддерживает программу реализации апоптоза, чем является ее активатором.

Одним из ключевых генов, необходимым для контроля процессов пролиферации и клеточной гибели, является опухолевый супрессор р53. Установлено, что реализация индуцированною радиацией апоптоза в ти-моцитах мыши возможна только при наличии нормальною аллеля гена р53 (Lowe, 1993). В то же время, у резистентных к радиационному апо-

А Б 123456789 10 р53 ' .

Рисунок 15. Анализ уровня белкового продукта гена р53. 1 - белки мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - белки мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - белки мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч носче облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения; 10 -белки мозга контрольных взрослых крыс.

А - положительный контроль, Calu 6 - линия-суперпродуцент белка р53; Б - отрицательный контроль, линия клеток, в которой инактнвированы оба аллеля гена р53.

птозу мышей с нефункциональными аллелями гена р53 этот тип гибели легко вызывается другими агентами (глюкокортикоиды, кальциевые ио-нофоры и пр.). Эти данные позволили предположить существование двух путей индукции апоптоза - р53-зависимого и р53-независимого (Clarke, 1993). Прямое участие белка р53 в индуцированной гибели нервных клеток по типу апоптоза было показано in vitro и in vivo (Sakhi S., 1994; Eizenberg, 1995) В наших экспериментах уровень мРНК гена р53 был высоким в клетках 17- и 18-дневного эмбрионального мозга и очень низким во взрослом мозге (рис. 14, дорожки 1, 2 и 10), что коррелирует с радиочуствительностью клеток мозга на этих стадиях развития. В период 3-5 ч после in utero облучения уровень мРНК р53 снижался, падая до минимума к 4 ч (дорожка 7), и существенно не меняясь в период между 5 ч и 24 ч после радиационного воздействия.

Из литературы известно, что во многих тканях радиация повышает содержание белка р53 путем его пост-трансляционной стабилизации, без усиления транскрипции мРНК гена р53 (Donehower, 1993). Действительно, оказалось, что уровень белка р53, очень низкий как в клетках 17- и 18-дневного эмбрионального мозга (рис. 15, дорожки 1, 2), так и взрос-

лого мозга (дорожка 10), резко увеличивался в период 1-3 ч после облучения, после чего также быстро возвращался к исходному уровню к 5 ч после радиационного воздействия.

Зависимость индуцированного радиацией апоптоза от наличия функциональных аллелей р53 и синтеза de novo РНК и белка позволяет предположить существование программы, реализуемой путем транскрипционной активации р53-зависимых генов. Белок р53 способен специфически связываться с ДНК и функционировать как транскрипционный фактор. Известны несколько генов, экспрессия которых в ответ на гено-токсический стресс активируется непосредственно р53. Среди этих генов - Вах (Zhan, 1994) и p21/WAFl (Dulic, 1994). Мы уже отметили повышение уровня мРНК Вах (рис. 12) и его белкового продукта в мозге облученных эмбринов. Индуцированный радиацией апоптоз клеток Ml также сопровождается 5-кратной активацией экспрессии гена Вах, причем эта активация имела место только в линиях клеток, в которых присутствуют нормальные аллели гена р53 (Zhan, 1994). Ген p21AVAFl кодирует белок, который блокирует клеточный цикл путем подавления циклин-за-висимых протеинкиназ, и параллельно ингибирует репликацию ДНК, являясь таким образом ключевой молекулой при генотоксическом шоке (Waga, 1984; Pines, 1984). Как и в случае ген Вах, для радиационной активации гена p21AVAFl необходимо наличие нормального аллеля гена р53 (Dulic, 1994).

Уровень экспрессии гена р21AVAF1 в эмбриональном и взрослом мозге крысы был исключительно низким, на пределе чуствительности метода (рис. 16, дорожки 1, 2 и 10). Однако, уже через 1 час после облучения содержание мРНК p21/WAFl увеличивалось в десятки раз, достигая максимума (100-кратная активация) через 2-5 ч после радиацинно-го воздействия и снижалось через 24 ч, оставаясь тем не менее на достаточно высоком уровне. Пострадиационный всплеск уровня мРНК гена p21/WAFl (1-5 ч) по времени следует за пиком экспрессии белка р53 (0.5-3 ч), что свидетельствует о причинно-следственном характере активации их экспрессии в эмбриональном мозге. Известно также, что р53 является негативным регулятором экспрессии ряда генов, блокирующих развитие радиационного апоптоза, в частности Bcl-2 (Zhan, 1984), что совпадает с нашими данными и свидетельствует о ключевой роли гена р53 в индукции клеточной гибели нейробластов облученного мозга.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

28 S-

18 S-

Рисунок 16. Анализ представленности мРНК гена p21/WAFl. 1 - РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 1 ч после облучения; 5 - через 2 ч после облучения; 6 - через 3 ч после облучения; 7 - через 4 ч после облучения; 8 - через 5 ч после облучения; 9 - через 24 ч после облучения; 10 -РНК из мозга контрольных взрослых крыс.

Таким образом, радиационная гибель эмбриональных нейробла-стов головного мозга крыс реализуется по р53-зависимому пути, характерному для гибели облученных тимоцитов. Это находится в соответствии с известными фактами о том, что эмбриональные нейробласты и лимфоциты тимуса являются одними из наиболее радиочувительных клеток организма и в обоих тканях - мозге и тимусе - в процессе диффе-ренцировки происходит жесткий отбор и интенсивная физиологиче физиологическая гибель клеток. Известно также, что в клетках головного мозга экспресируются гены, сиедифичекие для лимфоцитов, в частности, поверхностные рецепоры CD4, 0X2, Thy-1, и Т-4. Эти данные позволяют предположить наличие в клетках нервной и лимфоидной тканей общих генетических механизмов регуляции программы клеточной гибели.

Необходимо отметить, что идея существования генетической программы радиационной гибели лимфоидных клеток по типу апоптоза была впервые сформулирована К.П.Хансоном в 1979 году (Хансон, 1979; Hanson, 1981). Гипотеза была обоснована в цикле работ его лаборатории

Таблица 2

Анализ гомологии активируемых радиацией последовательностей кДНК эмбрионального мозга мыши с известным» генами млекопитающих

Клон Размер Степень Гомология с последовательностями

мРНК акти- известных генаов

(ht) вации

pcdlO 1600 3-4 рекомбинант гена белка MQV-34 мыши и фактора инициации трансляции 3 человека

pedis 1600 3-4 член семейства [i-субъеднниц G белка (123)

pcdlß 2200 2 субъсд. 5 митохондриалыюй НАДФ дегндрогеназы

рс<Ш 1500 4 фактор транскрипции человека

pcd25 1400 45 нет гомологии с известными генами

pcd27 1200 3 ■»охарактеризованная кДНК мыши

pcd28 3000 3-4 бепа белок TIF1 и белок KRAB-A мыши

B2 1200 1.5 митохондриалыюй апоцитохром b

1522 1500 45 ^охарактеризованная кДНК человека

CIO 1500 7 ^охарактеризованная кДНК человека

Fl 1500 2 убихитин

F7 1500 2-3 легкая цепь ферритчиа

Jll 2500 2 а!2 субьсдшшца G белка человека

Lll 2000 2 TIS7 белок раннего ответа мыши NGF-индуцируемый белок крысы и

Oil 1800 2 FK50(>-cua3b]BawwHH белок мыши

E8 800 2 содержит Alu повтор

на модели облученных тимоцитов крыс (Хансон, 1986; Hanson, 1990) и явилась исходной посылкой для поиска активируемых радиацией генов на модели in utero облученного мозга.

С целью поиска генов, экспрессия которых активируется облучением в клетках эмбрионального мозга в период массовой гибели нейробластов, были конструированы две клонотеки кДНК на основе вектора lambda ZAP II. Для индукции апоптоза использовали гамма-нейтронное облучение 17-дневного мозга в дозе 0.75 Гр (вклад нейтронов -0.5 Гр). Одна клонотека была приготовлена на основе РНК из контрольного, а вторая - на основе РНК из in utero облученного мозга через 5 часов после радиационного воздействия. Методом истощающей гибридизации была получена "вычитательная" клонотека, предположительно обогащенная последовательностями, активируемыми радиацией. С помо-

•-Ц

/ *

т ■ ■

Ш-' V ' - *' 'О • "

* * * «

л , \

*Г » « '» . »."IM4"

V *' >#

äSN

i m '

Рисунок 17. Дифференциальный скрининг "вычитательной" клонотеки

кДНК облученного мозга 17-дневного эмбриона. Две пары реплик фильтров с иммобилизованными колониями гибридизова-ли с радиоактивно мечеными пробами кДНК из контрольного (К-1 и К-2) и облученного (0-1 и 0-2) мозга. По степени почернения рентгеновской пленки визуально отбирались колонии, содержащие вставки генов экспрессия которых усиливалась после облучения.

щью гибридизации двух панелей фильтров с радиоактивно меченой пробой кДНК из контрольного и облученного мозга был проведен скрининг "вычитательной" клонотеки (рис. 17), Всего было проанализировано 680 клонов, из которых 80 клонов содержали вставки клеточных генов, экспрессия которых усиливалась после облучения. Пострадиационный анализ экспрессии индивидуальных клонов проводили с помощью Northern гибридизации. Последовательности кДНК интересующих клонов секвенировали и анализировали с целью поиска гомологии с последовательностями известных генов. Частично результаты анализа суммированы в таблице 2. С помощью Northern гибридизации мы сравнили пострадиационную экспрессию мРНК ряда клонов (F7, pcd27, Oll и Е8) в клетках эмбрионального мозга крыс, облученных двумя тинами излучения, использованными в наших экспериментах: гамма излучением в дозе 4 Гр и гамма-нейтронным излучением в дозе 0.75 Гр (вклад нейтронов - 0.5 Гр). На рис. 18 представлены данные для клона F7 (ген легкой цепи ферри-тина), в обоих случаях наблюдается повышение уровня мРНК этого ге-

Рисунок 18. Анализ пострадиационной экспрессии клона ¥7 (гена легкой цепи ферритина) при двух типах облучения. А - гамма облучение в дозе 4 Гр:

1 - РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; 2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов; 3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 0.5 ч после облучения; 4 - через 2 ч после облучения; 5 - через 3 ч после облучения; 6 - через 4 ч после облучения; 7 - через 5 ч после облучения; 8 - через 24 ч после облучения; 9 - РНК из мозга контрольных взрослых крыс. Б - гамма-нейтронное излучение в дозе 0.75 Гр:

К - РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов; О - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 5 ч после облучения.

на через 5 ч после облучения (ср. А - дорожки 1, 7 и Б - дорожки К и О). Аналогичные данные были получены нами и для других клонов.

Это свидетельствует о том, что в эмбриональном мозге крыс оба типа облучения не только приводят к очень близким структурно-функциональным и клеточные нарушениям, но и вызывают сходные сдвиги генной экспрессии, что позволяет нам сопоставлять данные, полученные в разных сериях экспериментов. Среди клонированных кДНК транскрип-тов с незначительной степенью активации (1.5-2 раза) были идентифицированы два митохондриальных гена - апоцитохром Ь и субъединица 5 НАДФ-дегидрогеназы (для конструирования клоиотек мы использовали суммарную клеточную РНК). Это свидетельствует о том, что митохондрии активно функционируют в период конденсации хроматина и фрагментации ядерной ДНК облученных нейробластов. Результаты также находятся в соответствии с фактами о том, что при апоптозе не наблюдается фрагментации ДНК митохондриальнош генома (Ми^а, 1992), а белковые продукты митохондриального генома (цитохром с) необходимы

для поддержания апоптоза по крайней мере в модельных экспериментах (Lui, 1996).

Среди клонированных последовательностей (pcdl5, Fl, F7, Н8) несколько принадлежат известным генам - альфам2 и бетта-субъединице G белка, легкой цепи ферритина и убихитину. Как известно, убихитин является одним из белков ответа на стресс, он возможно также принимает участие в дегенеративных процессах в мозге (Finley, 1991). Убихитину приписывается важная роль в реализации программированной клеточной гибели, в частности в радиационном апоптозе лимфоцитов (Délie, 1993), где он выступает в качестве маркера белков, которые должны подвергнуться деградации. Среди клонов, пострадиационная экспрессия которых нами детально пока не исследовалась (Н7), присутствует реком-бинантиая последовательность, также содержащая фрагмент гена убихи-тина, что свидетельствует об активном участии этого гена в апоптозе нейробластов. Экспрессия семейства ферритиных генов регулируется на транскрипционном уровне и одним из его индукторов является фактор некроза опухолей (Totri, 1988), вызывающей как известно апоптоз клеток. В свою очередь, легкая цепь ферритина способна активировать транскрипцию генов, в частности семейства глобинов (Wu, 1991), и таким образом при определенных обстоятельствах выступать в качестве регулятора транскрипции. К группе транскрипционных факторов относятся также продукты генов pcd22 и pcd28, причем последний клон имеет гомологию с репрессором транскрипции KRAB-A (Pengue, 1994). Семейство G белков (гуанидин-связывающих) выполняет в клетке важные функции, связанные прежде всего с регуляцией клеточного цикла (Dolphin, 1988), поэтому вполне вероятно, что клонированные нами последовательности (pcdl5 и J11), имеющие гомологию с членами этого семейства, также вовлечены в процесс пострадиационного митотического блока. Клон pcdlO имеет гомологию с геном MOV-34, который жизненно необходим для раннего эмбриогенеза мыши (Gridley, 1991). Кроме того, этот клон частичено гомологичен фактору трансляции - IF-3, что указывает на его важную регуляторную функцию. Последователь-ность L11 содержит фрагменты генов, кодирующих белок индуцируемый фактором роста нервов и предполагаемый аутокринный фактор TIS7 (Varnum, 1989), а клон 011 - белок со свойствами цитоплазматического рецептора, участвующего в экстренных изменениях метаболизма клетки (Harding, 1989). Клон Е8 содержит фрагмент гомологичный Alu повтору,

Рисунок 19. Анализ пострадиационной экспрессии клонов pcd25 (А),

pcd27 (Б) и СЮ (В), не имеющих гомологии с известными генами.

1 - РНК из мозга контрольных 17-дневных эмбрионов;

2 - РНК из мозга контрольных 18-дневных эмбрионов;

3 - РНК из мозга 17-дневных эмбрионов через 5 ч после облучения;

4 - РНК из мозга эмбрионов через 24 ч после облучения.

Гамма-нейтронное излучение в дозе 0.75 Гр.

принадлежащему к семейству SINE, члены которого играют в головном мозге роль активаторов генной экспрессии (McKinnon, 1987).

Таким образом, большинство клонированных нами последовательностей были гомологичны генам кодирующих регуляторные белки.

Среди анализированных последовательностей была также группа (pcd25, pcd27n СЮ), которая не имела значительной гомологии с известными генами. В ходе нормального эмбриогенеза мозга их транскрипция усиливалась в период между 17- и 18-м днями эмбрионального развития (рис. 19, дорожки 1 и 2). После гамма-нейтронного облучения уровень транскриптов этих генов увеличивался в 3-7 раз через 5 ч (дорожки 1 и 3) после воздействия. Через 24 часа после облучения (дрожка 4) уровень транскриптов генов pcd25 и pcd27 падал и был существенно подавлен по сравнению с кон-трольным 18-дневным эмбрионом, тогда как содержание транскрипта гена С10 не менялось и соответствовало контрольному уровню (дорожка 2). По-видимому, продукты этих генов играют важную роль как в нормальном эмбриогенезе мозга, так и в реализации программы апоптоза облученных нейробластов.

Анализ существующих литературных данных свидетельствует в пользу того, что в различных тканях существуют множественные кон-

кретные пути реализации программы апоптоза. Более того, даже в одной ткани клеточная гибель может реализовываться различными путями, в зависимости от тина иидуктора и функционального состояния ткани в момент воздействия (Schwartz, 1993). Это позволяет предположить, что в программу индукции и реализации апоптоза вовлечены представители многих семейств клеточных генов, в том числе и неизвестных, взаимодействие между которыми предстоит еще выяснить. Хорошо известно, что по сравнению с другими тканями организма, в головном мозге наблюдается самый высокий уровень генной экспрессии (Chikaraishi, 1978). Количественная оценка генетической сложности ядерных транскриптов показала, что в мозге крысы одновременно функционирует не менее 180 тысяч видов генов (Евтушенко, 1989). Наш анализ 680 последовательностей из обогащенной кпонотеки кДНК облученного мозга показал, что примерно каждый десятый клон (80 из 680) содержал фрагмент гена, активируемого радиацией. Следует отметить, что была проанализирована лишь часть клонотеки и ожидаемое число активируемых генов, по-видимому, будет в несколько раз больше, хотя очевидно, что продукты далеко не всех этих генов играют ключевую роль в реализации апоптоза. Однако, принадлежность многих из клонированных нами последовательностей к семействам генов факторов рефляции транскрипции и трансляции, а также белкам регуляции клеточного цикла позволяет надеяться что будут открыты новые гены, продукты которых выполняют в клетке важные функции. Столь значительное число активированных генов можно объяснить тем, что для быстрого сдвига метаболизма активно проли-ферирующего и дифферинцирующегося нейробласта в сторону его гибели необходимы существенные изменения экспрессии большой группы генов, и в первую очередь - регуляториых.

4. Отдаленные последствия пренатального облучения на характер экспрессии клеточных генов в головном мозге

Генная экспрессия в клетках головного мозга имеет ряд специфических особенностей. Прежде всего, по сравнению с другими тканями организма, в мозге на уровне ядерных транскриптов экспрессируется в 3-5 раз больше РНК (Chikaraishi, 1978). Известно также, что в отличие от других тканей, генетическое разнообразие транскриптов в головном мозге увеличивется в процессе развития (Chaundhari, 1983), что свидетельст-

вует о том, что дифференцировка нервной системы связана с активацией большого числа специфических генов. Установлено, что отделы головного мозга различаются между собой по уровню экспрессии генов, а генетическое разнообразие транскриптов увеличивается в каудо-краниальном направлении (Kaplan, 1982). Наиболее высокая сложность клеточной РНК наблюдается в самом эволюционно молодом отделе мозга - неокор-тексе, что вероятно на молекулярном уровне отражает физиологическую сложность этого отдела, осуществляющего интегративную функции ЦНС. Исходя из этого, мы надеялись, что анализ пострадиационных изменений генной экспрессии в головном мозге и его отделах позволит глубже понять причины функциональной неполноценности ЦНС пренатально облученных животных.

Была изучена экспрессия индивидуальных генов в головном мозге крыс, облученных гамма-нейтронным излучением в дозе 0.75 Гр (вклад нейтронов - 0.5 Гр) в период 1 день - 1.5 года после рождения. Крысы этой же группы были использованы для изучения динамики дефицита веса мозга и анализа поведения, описанных выше. Были изучены следующие группы генов: глиальные, нейрональные и прото-онкогены.

Экспрессгия глиальных генов. Гены основного белка миелина (ОБМ) и протеолипидного белка (ПЛП) кодируют функционально связанные белки, являющиеся основными структурными компонентами мие-линовой оболочки аксонов, образуемой олигодендроцитами в ЦНС (Sutcliffe, 1988). Транскрипция обоих генов начинается после рождения и совпадает с началом миелинизации. Динамика экспрессии миелиновых генов совпадает с ходом миелинизации различных отделов мозга, те есть растет в каудо-ростральном направлении (Stahl, 1990). Максимальный уровень экспрессии мРНК и белка ПЛП у грызунов наблюдается через 3 недели после рождения и впоследствии остается на достаточно высоком уровне (Sorg, 1987). Следует отметить, что процесс миелинизации - один из заключительных этапов функционального созгевания мозга, который начинается только после того, как все проекционные нейроны займут свои места. В этот же период происходит синаптогенез и завершение образования сииаптических сетей в мозге. В контроле, динамика экспрессии генов ОМД и ПЛП в мозге имеет сходный характер (рис. 20). В течение первой недели после рождения транскрипты ОМБ и ПЛП практически не детектируются. В дальнейшем экспрессия генов активируется и максимальный уровень мРНК обоих генов наблюдается через 3-4 недели,

Вреыг после рождении, мес.

Рисунок 20. Динамика экспрессии глиальных генов - основного белка миелина (а) и протеолипидного белка (б) в головном мозге крыс в постнатальный период.

1 - контрольные животные; 2 - пренатально облученные.

что совпадает с периодом миелинизации. В дальнейшем, экспрессия генов несколько снижается, оставаясь тем не менее на достаточно высоком уровне в течение 6 месяцев наблюдения. Пренатальное облучение вызывает длительное повышение уровней мРНК ОМД и ПЛП, начиная с 3-х недель после рождения, которое достигает максимума через 4 недели. В дальнейшем, через 6 месяцев п.р., уровни мРНК ОМБ в мозге контрольных и ПНО животных не различаются, тогда как уровень мРНК ПЛП у облученных животных в два раза выше контрольного значения. В коре мозга через 1.5 года после рождения мы наблюдали снижение уровния мРНК гена ОМБ, тогда как уровень мРНК ПЛП практически не отличался от контрольного. Таким образом, после рождения в мозге ПНО крыс происходит повышение содержания транскриптов глиальных генов, которое по времени совпадает с периодом развития максимального дефицита веса мозга (37-42%). Причиной повышения уровня мРНК может быть как усиление экспрессии глиальных генов, так и усиленная проли-

ферация глиальных клеток в облученном мозге в этот период. Однако, в более поздние сроки (6 месяцев п.р.) повышенный уровень мРНК является следствием усиленной экспрессии или посттранскрипционных процессов. Как известно, нарастание веса мозга после рождения осуществляется главным образом за счет увеличения содержания миелина в ЦНС. Одной из причин пострадиационного дефицита веса, наряду с гибелью нейробластов, является снижение количества миелина и содержания в нем белков (Корегшапп, 1987). Мы полагаем, что повышение уровня мРНК миелиновых генов на фоне развития дефицита веса мозга и снижения плотности миелина у ПНО животных является компенсаторной реакцией. Однако, механизм компенсаторного повышения уровня мРНК глиальных генов оказывается мало эффектовным на уровне биосинтеза белков облученного мозга и основной причиной этого является, по-видимому, нарушение трансляционных механизмов, в частности, снижения аминоацелирования тРНК в мозге ПНО крыс (Во1ош, 1978; Аш1, 1984).

Экспрессия непрональных генов. Мы исследовали пострадиационные изменения экспрессии нейрональных генов, принадлежащих к различным семействам. По характеру постнатапьной экспрессии их можно разбить на две группы:

а - гены, участвующие в дифференцировке нейробластов, характеризующиеся высоким уровнем транскрипции у новорожденных и снижением экспрессии в период предшествующий функциональному созреванию мозга (2-4 недели п.р.). К этой группе относятся САР-43, Ы-САМ и СБ4;

б - гены, участвующие в функционировании зрелых нейронов, характеризующиеся низким уровнем транскрипции у новорожденных и повышением экспрессии в период функционального созревания мозга (24 недели п.р.). К этой группе относятся №-Ь, ЫБЕ, протеишсиназа С и кальмодулин.

На рис. 21 представлены пострадиационные изменения динамики экспрессии генов ГчБЕ (нейрон-специфической енолазы, белок Мура) и 1Ч-САМ (нейрональный белок адгезии клеток), принадлежащим к разным группам. Уровень мРНК ИБЕ в мозге ПНО крыс оказался в 2 раза выше контрольного в период 2-4 недели п.р.. Появление белка М5Е в ЦНС связано с формированием зрелых синапсов в период, когда в процессе

д 7 14 21 28 1 7 14 21 28

28Б -

185 - ' "Г*- Щ

КОНТРОЛЬ ОБЛУЧЕНИЕ

КОНТРОЛЬ

ОБЛУЧЕНИЕ

Рисунок 21. Динамика экспрессии нейроиальных генов - N85 (нейрон-специфической енолазы) и М-САМ (белок адгезии клеток) в головном мозге крыс в постнатальный период. Сверху указаны дни после рождения.

функционального созревания мозга определяется окончательная локализация нейронов и синаптических контактов (8акипига, 1985). Предполагается также, что ИБВ - единственная обнаруженная в нейронах енола-за, обеспечивающая клетку энергетическими метаболитами (\Vanatabe, 1990). Аналогичная активация экспрессии в мозге ПНО крыс через 2-4 недели п.р. выявлена нами и для другого гена, кодирующего ключевой фермент - Ыа, К-зависимую АТФазы. Анализ постнатальной экспрессии экспрессии гена М-САМ показал, что в мозге новорожденых крысят на-

блюдается высокий уровень транскриптов этого гена (рис. 21Б). Оказалось, что детектируютвуют четыре вида мРНК размером 6.7-, 5.2-, 4.3- и 2.9-тысяч нуклеотидов. В мозге мыши также идентифицированы множественные транскрипты гена такого же размера (Santoni, 1987). Множественные мРНК одного гена N-CAM образуются на пост-транскрипционном уровне в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК (Barbas, 1988). В мозге новорожденных ПНО крыс уровень всех четырех мРНК гена N-CAM существенно подавлен подавлен, особенно мРНК 4.3- и 2.9-тысяч нуклеотидов, характерных для взрослого мозга. Однако, уже у 3-х недельных ПНО животных содержание мРНК превышает контрольный уровень, а через 4 недели п.р. наблюдается 5-кратный всплеск эскпрес-сии мРНК гена N-CAM. В клетке продукты генов семейства САМ участвуют в регуляции процессов роста, миграции и дифференцировки, а также играют исключительную роль в процессах нейрональной регенерации (Walsh, 1996). Таким образом, в мозге in utero облученных крыс наблюдается повышение уровня мРНК нейрональных генов, причем это повышение происходит независимо от характера поснатальной экспрессии гена в ходе нормального онтогенеза.

Следующим исследованым нейрональным геном был NF-L, принадлежащий к семейству генов, кодирующих нейрофиламенты. Нейрофи-ламенты, наряду с микротрубочками и микрофиламентами, формируют цитоскелет нейронов и их отростков, также участвуют в транспорте молекул и органелл по аксону. Известно, что мРНК NF-L детектируется уже в мозге 11-дневных эмбрионов, экспрессируется на высоком уровне в течение раннего постнатального периода и снижается у взрослых крыс (Julien, 1986). Показано также, что раннее появление нейрофиламентов сопутствует началу роста аксонов в постмитотических нейронах. В наших экспериментах исследовалась экспрессия мРНК гена NF-L в целом мозге и его отделах (рис. 22). Уровень мРНК в суммарном мозге (А) увеличивается практически линейно в течение первых трех недель п.р., после чего резко снижается к 4-й неделе и остается на этом уровне в течение 6 месяцев наблюдения. В коре больших полушарий (Б) высокий уровень транскриптов наблюдается уже у новорожденных крысят, достигает максимального уровня через 4 недели п.р., после чего также снижается. В продолговатом мозге (В) содержание мРНК NF-L было значительно ниже, чем в коре и в целом мозге. Пренаталыюе облучение приводит к активации экспрессии мРНК NF-L в целом мозге и его отделах в период

20. 16.. 12. 8-

16. 12. 8 . 4.

В..

4. о.е.

Й 1 2 3 6

мес. после рождения

Рисунок 22. Динамика экспрессии мРНК гена в головном

мозге крыс и его отделах в постнаталышй период. А - суммарная РНК мозга, Б - кора больших полушарий, В - продолговатый мозг. 1 - контрольные животные, 2 - Г1НО облученные.

3 недели -2 месяца п.р.. Активация на уровне суммарного мозга выявляется уже через 2 недели п.р., однако в коре она гораздо более выражена. В продолговатом мозге увеличеие уровня мРНК очень незначительно. Следует также отметить, что с помощью ¡ЧоЛЬегп-гибридизании у ПНО крыс выявляется большое количество предшесвенников мРНК Ь, что свидетельствует в пользу активации экспрессии этого гена на уровне транскрипции.

Кальмодулин - широко распространенный кальций-связывающий белок, играющий центральную роль в регуляции таких важных клеточных процессов как секреция, митоз и дифференцировка. Связывание с

О ©

28S

18S

КОНТРОЛЬ ОБЛУЧЕНИЕ

Рисунок 23. Динамика экспрессии мРНК гена кальмодулина (СаМ 1) в коре головного мозга крыс в постнатальный период.

Сверху указаны дни после рождения.

кальмодулином опосредует влияние кальция на на активность кальций-кальмодулин-зависимых ферментов и структурных белков - протеиназ, фосфатаз, фодрина (Nojima, 1989). Некоторые из этих ферментов участвуют в регуляции транскрипции генов (Le Vine, 1985). Нами использовался для гибридизации фрагмент гена СаМ 1 продуктами транскрипции которого являются две мРНК размером 4.0- и 1,7-тысяч нуклеотидов (Nojima, 1987). В коре мозга ПНО крыс содержание обеих мРНК оказалось существенно повышенным в период 3 недели - 2 месяца п.р., тогда как у 1.5-годовалых ПНО животных экспрессия этих мРНК была в 2 раза ниже, чем в контроле. Анализ мРНК СаМ 1 в отделах мозга выявил аналогичное усиление в коре полушарий и в среднем мозге, тогда как в продолговатом мозге увеличение уровня мРНК было незначительным.

Гликопротеин синаптофизин - основной компонент мембран малых нейросекреторных пузырьков пресинаптических нервных окончаний. Синаптофизин участвует в регуляции депонирования в везикулах и высвобождения нейромедиаторов в синантических терминалях (Leube, 1987). На рис. 24 представлена динамика экспрессии мРНК гена синап-тофизина в коре головного мозга в период 1 день - 1.5 года после рождения. Уровень мРНК этого гена в коре ПНО крыс также оказался существенно выше по сравнению с контролем в период 3 недели - 6 месяцев

1 5 1 5

1 7 14212860 3 5 1 714212860 8 5

0 0 0 0

28S -18S- > * > fSf - ■ . IP Л.

КОНТРОЛЬ ОБЛУЧЕНИЕ

Рисунок 24. Динамика экспрессии мРНК гена синаптофизина в головном мозге крыс в постнатальный период. Сверху указаны дни после рождения.

п.р., однако, у 1,5-годовалых животных экспрессия мРНК была ниже по сравнению с контрольными животными того же возраста.

GAP-43 - фосфопротеин пресинаптической мембраны, который связан с началом формирования, регенерации и функциональной перестройки синаптических связей (Neve, 1987). В развивающихся нейронах GAP-43 экспрессируется на высоком уровне и транспортируется в конусы роста и незрелые синапсы. Его концентрация в конусах роста в мозге молодых крыс в 12 раз выше, чем в синаптических мембранах взрослых животных. Показано, что уровень GAP-43 повышается при регенерации аксонов (Basi, 1987). Высокий уровень экспрессии гена GAP-43 отмечается в ряде интегративных зон коры головного мозга по сравнению с нижележащими отделами, что предполагает его роль в процессах памяти и научения (Neve, 1987). В ЦНС взрослых животных фосфорили-рование этого белка связано с модуляцией синаптических функций. Белок GAP-43 является главным субстратом нротеинкиназы С и возможно опосредует некоторые физиологические эффекты на синаптическом уровне (Neve, 1987). В постнатальный период уровень мРНК GAP-43 быстро снижается после первой недели и практически не детектируется в период 1-2 месяцев п.р. (рис. 25). Транскрипт вновь выявляется у 6-месячных животных и его содержание даже несколько увеличивается у 1,5-годовалых крыс. Особенностью экспрессии мРНК этого гена в коре

V—

28$

КОНТРОЛЬ

ОБЛУЧЕНИЕ

Рисунок 25. Динамика экспрессии мРНК гена ОАР-43 в головном мозге крыс в постнатальный период. Сверху указаны дни после рождения.

ПНО крыс является то, что транскрипт вАР-43 не выявляется у 7-дневных животных, что по-видимому отражает на мо лекулярном уровне степень поражения облученых нейробластов. В дальнейшем, через 2-3 недели п.р. происходит восстановление содержания мРНК ОАР-43, а через 4 недели п.р. наблюдается 100-кратное ее повышение. Через 2 месяца п.р. в коре мозга сохраняется повышенный уровень мРНК ОАР-43. Следует ометить, что усиление экспрессии мРНК этого гена через 4 недели п.р. отмечено нами также в мозжечке и среднем мозге, хотя это усиление не столь ярко выражено, по сравнению с корой мозга.

Особо следует отметить тот факт, что в коре мозга 1.5-годовалых крыс одновременно с специфической гибридизацией фрагментов ряда клонированных генов (ОАР-43, синантофизина, кальмодулина, протеин-киназы С и с-йэ.ч) с их мРНК наблюдается также гибридизация с низкомолекулярными транскриптами в зоне 8-128 нмРНК. Условия ЫопЬегп-гибридизации были максимально жесткими, что возволяет исключить неспецифику. Этот эффект ограничивается исключительно корой мозга и наблюдается только у мозга 1.5-годовалых животных. Как известно, в мозге экспрессируется большая группа повторящихся ГО-последовательностей, расположенные в интронах структурных генов и играющих важную роль в регуляции генной экспрессии мозга (8ЩсШе, 1988). Показано также, что в ходе дифференцировки мозга происходит накопление транскриптов Ш-элементов. Возможно, что наблюдаемые нами низкомо-

лекулярные транскрипты также относятся к этой группе и их появление в этот период отражает важные сдвиги генной транскрипции в коре мозга. Однако, этот вопрос требует специального изучения. Тем не менее, тот факт, что в коре 1.5-годовалых пренатально облученных крыс посно-стыо подавлена экспрессия этих низкомолекулярных транскриптов (рис. 25, 27), свидетельствует в пользу глобальных нарушений экспрессии генов у этих животных в отдаленные сроки.

Протеинкиназа С (ПКС) является кальций- и фосфолипид-зави-симой протеинкиназой, широко распространеной в тканях и органах (Spoci, 1989). Наиблее высокий уровень активности ПКС обнаружен в нервных клетках головного мозга. ПКС выполняет центральную роль в контроле широкою спектра физиологических процессов, таких как дифференцировка клеток, опосредование действия гормонов, ростовых факторов и нейромедиаторов (Spoci, 1989). Показано, что члены семейства генов ПКС дифференциально экспрессируются в мозге, так уровень мРНК ПКС-гамма во взрослом мозге в 50 раз выше чем в эмбриональном, что свидетельствует в пользу того, что этот ген опосредует развитие с становление функций ЦНС. В течение первых трех недель после рождения в коре мозга ПНО крыс уровень мРНК протеинкиназы С был снижен по сравнению с контролем (рис. 26, А). Через месяц после рождения в коре ПНО крыс наблюдается 3-4-кратная активация экспрессии, ко 2-му месяцу уровень транскрипта снижался до контрольного значения, после чего к 1.5 годам происходит 2-кратное стижение мРНК ПКС по сравнению с контролем. Таким образом, особенностью пострадиационной экспрессии гена ПКС является подавление экспрессии в раннем постнатальном онтогенеза и у взрослых животных. Учитывая ключевую роль этого фермента в важнейших физиологических процессах в мозге (дифференцировка, проведение нервного импульса, долговременные перестройки синапсов), можно предположить, что что длительное подавление активности гена ПКС у in utero облученных животных может играть роль в формировании таких интегративных процессов как нарушение поведения, условно-рефлекторной деятельности и памяти. В пользу этого свидетельствуют также данные о снижении в коре мозга 1.5-годовалых крыс уровня мРНК генов кальмолулина, N-CAM и GAP-43 (рис. 25, Б-Г)-

В головном мозге экспрессируется большое количество прото-онкогенов, причем часть из них преимущественно экспрессируются в

Рисунок 26. Динамика экспрессии мРНК генов протеинкиназы С (А), кальмодулина (Б), N-CAM (В) и GAP-43 (Г) в коре головного мозга крыс в постнатальный период. 1 - контрольные животные, 2 - ПНО облученные.

этой ткани (c-fyn, c-mas, c-yes, , src+ и c-syn). Белки прото-онкогенов участвуют в регуляции практически всех жизненно важных процессов нервной клетки (Sudol, 1988). Одним их таких генов является c-fos. В большинстве постэмбриональных тканей уровень экспрессии гена c-fos выше, чем в эмбриональных. У грызунов наиболее высокое содержание белка Fos обнаруживается в головном мозге, особенно в его коре (Sudol, 1988). Полагают, что Fos принимает учачтие в долговременных адаптивных процессах в мозге, то есть в пластических перестройках синаптиче-ских связей (Morgan, 1987). Анализ пострадиационной экспрессии с-fos показал, что как и в случае протеинкиназы С, в ранний постнатальный период в коре ПНО крыс наблюдается снижение мРНК и пре-мРНК гена c-fos (рис. 27). Начиная с 3-й недели п.р., в коре происходит резкое повышение мРНК и пре-мРНК этого гена по сравнению с контро-

Рисунок 27. Динамика экспрессии мРНК гена с^ов в коре головного мозга крыс в постнатапьный период. Сверху указаны дни после рождения.

лем. У 1.5-годовалых животных также наблюдается снижение экспрессии этого гена. Следует отметить практически полное отсутствие гибридизации с низкомолекулярными ГО-подобными транскриптами в зоне 8-128 нмРНК в этот период. Мы исследовали экспрессию гена с-_рт, кодирующего также как и с-{'оя компонент сложного транскрипционного комплекса АР-1, способного связываться с регуляторными последовательностями ДНК и активировать транскрипцию (Ргап7а, 1988). Показано, что генеродимеры Рое и Лип являются более эффективными активаторами транскрипции, чем гомодимеры Роб-Роя или Тип-Лип. В постнатальный период мы наблюдали достаточно синхронные изменеия уровня содержания мРНК этих двух генов как у контроленых, так и ПНО животных (рис. 28). Пострадиационная активация в период 3 недели - 2 месяца и подавление экспрессии через 1.5 года наиболее выражено в коре мозга. По-видимому, синхронные изменения мРНК с-1Ъз и с^ип в коре отражают динамику состояния транскрипционной активности в целом и свидетельствуют о неспособности в отдаленный период клеток коры ПНО животных поддерживать нормальный уровень транскрипции.

Нами исследовалась также экспрессия мРНК прото-онкогенов с-таэ, кодирующего нейтральный тип рецептора ангиотензина, действую

c-fos c-jun

Рисунок 22. Динамика экспрессии мРНК генов c-fos и c-jun в отделах головного мозга крыс в постнатальнын период. А - кора больших полушарий, Б - средний мозг, В - продолговатый мозг (c-fos), мозжечок (c-jun). 1 - контрольные животные, 2 - ПНО облученные.

щего как нейромедиатор и нейрогормон (Jackson, 1988) и члена тирози-новых протеинкиназ c-fyn, характеризующегося высоким уровнем экспрессии в коре мозга (Sudol, 1988). Пострадиационная экспрессия мРНК этих двух прото-онкогенов подчинялась тем же закономерностям, что и два предыдущих: активация в коре ПНО крыс через 3 недели - 2 месяца п.р. и снижение экспрессии у 1,5-годовалых животных, хотя но сравнению с генами c-fos и c-jun это снижение было незначительным.

Таким образом, развитие после рождения дефицита веса головного мозга у пренатально облученных крыс сопровождается компенсаторным повышением активности всех изученных групп генов, которое, однако, оказы-вается неэффективный и не предотвращает развития тяжелых структурно-функциональных нарушений. В отдаленный период после рождения, в клетках коры облученного мозга происходит снижение экспрессии большой группы функционально важных генов, но-види-

мому, в результате глобальных поврежнений транскрпипционного аппарата выживших после облученния нервных клеток, что по времени совпадает с серьезными нарушениями поведения ПНО крыс.

ВЫВОДЫ

1. Пренатальное облучение крыс вызывает массовую гибель эмбриональных нейробластов по типу апоптоза, которая сопровождается межнуклеосомным расщеплением геномной ДНК и блокируется специфическими ингибиторами транскрипции и трансляции.

2. Радиационно-индуцируемый апоптоз нейробластов ассоциирован с накоплением белкового продукта гена р53, активацией экспрессии р21ЛУАР 1 и комплекса транскрипционных факторов АР-1 (Рое и 1ипВ), также увеличением содержания транскриптов гена Вах относительно [Вс1-2+Вс1-хь].

3. Характер пострадиационной экспрессии генов в облученных нейробластах свидетельствует о том, что апоптоз этих клеток реализуется по р53-зависимому пути, характерному также для гибели облученных тимоцитов.

4. Радиационная гибель эмбриональных нейробластов сопровождается подавлением экспрессии генов кодирующих структурные белки и ферменты основных метаболических путей клетки и одновременной активацией экспрессии широкого спектра генов с невыясненными функциями, имеющими гомологию с факторами регуляции транскрипции и трансляции.

5. В период, соответствующий завершению функционального созревания мозга и развития максимального дефицита его веса у облученных животных (2-4 недели после рождения), происходит компенсаторное усиление экспрессии всех исследованных групп клеточных генов.

6. В отдаленные сроки после облучения (1.5 года) наблюдается нарушения поведения животных и снижение экспрессии ряда ключевых генов, что свидетельствует о неэффетивности компенсаторных механизмов и функциональной неполноценности клеток мозга в этот период.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козлов А.П., Плюснин А.З., Евтушенко В.И., Сейц И.Ф. Изучение влияния низкомолекулярных ядерных РНК на синтез РНК в изолированных ядрах// Молек. биология. 1978. Т. 12. № 1. С. 91-99.

2. Козлов А.П., Плюснин А.З., Евтушенко В.И., Сейц И.Ф. Изучение влияния низкомолекулярных ядерных РНК на активность РНК-по-лимеразы II в ядрах печени крысы// Биохимия. 1979. Т. 44. № 1. С. 2732.

3. Евтушенко В.И., Хансон К.П. Исследование процесса транскрипции в клетках тимуса крыс, подвергнутых рентгеновскому облучению. Сообщение 4. Биосинтез и созревание рибосомных РНК// Радиобиология. 1979. Т. 19. № 6. С. 821-826.

4. Евтушенко В.И., Хансон К.П. Исследование процесса транскрипции в клетках тимуса крыс, подвергнутых рентгеновскому облучению. Сообщение 5. Биосинтез и созревание гетерогенной ядерной РНК// Радиобиология. 1980. Т. 20. № 4. С. 495-501.

5. Евтушенко В.И., Хансон К.П. Особенности биосинтеза и созревания рибосомных РНК в клетках тимуса крыс// Биохимия. 1980. Т. 45. № 1. С. 173-179.

6. Евтушенко В.И., Хансон К.П. Исследование процесса транскрипции в клетках тимуса крыс, подвергнутых рентгеновскому облучению. Сообщение 6. Биосинтез и обмен поли(А)-содержащей и поли(А)-несодержащей РНК полисом// Радиобиология. 1981. Т. 21. № 3. С. 341347.

7. Евтушенко В.И., Хансон К.П. Разделение популяций тимоцитов крысы в градиенте фиколл-пака. Сообщение IV. Генетическая сложность клеточной РНК субфракций тимоцитов// Цитология. 1984. Т. 26. № 6. С. 719-723.

8. Евтушенко В.И., Козлов А.П. Сравнительное изучение низкомолекулярных ядерных РНК у представителей различных системаиче-ских групп// Молек. биология. 1984. Т. 18. № 5. С. 1396-1406.

9. Евтушенко В.И., Курбатова Т.В., Козлов А.П. Гибридизация низкомолекулярных ядерных РНК с ядерной РНК и с рестриктазными фрагментами ДНК// Молек. биология. 1984. Т. 18. № 5. С. 1424-1430.

10. Евтушенко В.И. Возникновение и функции клеточной гибели в эволюции эукариот// Материалы рабочего совещания "Интерфазная и репродуктивная гибель клеток". Научный совет АН СССР по проблемам радиобиологии. Информационный бюллетень. 1985. Выпуск № 31. С. 79-80.

11. Хансон К.П., Животовский Б.Д., Евтушенко В.И., Звонарева Н.Б., Сейлиев A.A., Борисове Е.А. Итоги и перспективы исследования механизмов интерфазной гибели облученных клеток// Научный совет АН СССР по проблемам радиобиологии. Информационный бюллетень. 1986. Выпуск № 32. С. 37-39.

12. Хансон К.П., Евтушенко В.И. Клеточные и молекулярные механизмы радиационного канцерогенеза// Вопр. онкологии. 1986. Т. 32. № 8. С. 3-11.

13. Евтушенко В.И., Хансон К.П. Изучение биосинтеза и созревания гетерогенной ядерной РНК в тимоцитах крыс// Биохимия. 1988. Т. 53. № 5. С. 862-871.

14. Evtushenko V.l., Borovitskaya А.Е., Barabitskaya О. V., Zherbin Е.А., Hanson K.P. Effects of irradiation on expression of tissue-specific genes and proto-oncogenes in developing brain// Abstracts of the 28th EEMS Annual Meeting. Varna, Bulgaria, 1988. P. 63.

15. Евтушенко В.И., Хансон К.П., Барабицкая O.B., Емельянов A.B., Решетников В.Л., Козлов А.П. Определение верхнего предела величины экспрессии генома крысы// Молек. биология. 1989. Т. 23. № 3. С. 663-675.

16. Боровицкая А.Э., Евтушенко В.И., Хансон К.П., Жербин Е.А. Влияние радиации на генную экспрессию в клетках тимуса и головного мозга крыс// Радиобиолгия. 1990. № 4. С. 531.

17. Барабицкая О.В., Евтушенко В.И., Хансон К.П. Влияние рентгеновского облучения на "клеточный цикл-зависимую" экспрессию протоонкогенов c-fos и c-Ha-ras в гепатоцитах регенерирующей печени крыс// Доклады АН СССР, 1990. Т. 315. № 4. С. 991-993.

18. Боровицкая А.Э., Евтушенко В.И., Хансон К.П. Действие пре-наталыюго нейтронного облучения на экспрессию генов белков миелина и нейрональных поверхностных гликопротеинов в развивающемся мозге крысы// Доклады АН СССР, 1990. Т. 315. № 6. С. 1482-1484.

19. Borovitskaya A.E., Evtushenko V.I., Hanson K.P. Perinatal neutron irradiation (PNI) activates gene expression in developing rat tisues// Abstracts of the 20th FEBS Meeting, Budapest, Hungary, 1990. P. 164.

20. Evtushenko V. Radiation and proto-oncogene expression in rat development// Lecture Abstracts of 15th International Cancer Congress. J. Cancer Res. Clin. Oncology. 1990. V. 116. P. 808.

21. Боровицкая А.Э., Евтушенко В.И. Экспрессия клеточных онкогенов в тканях пренатально облученных крыс// Тезисы докладов 1-й международной конференции "Биологические и радиобиологические аспекты последствий аварии на Чернобыльской атомной станции". Зеленый Мыс, 1990. С. 198.

22. Боровицкая А.Э., Евтушенко В.И., Хамсон К.П. Действие пре-натального нейтронного облучения на экспрессию генов в развивающемся мозге крысы// Вопросы мед.химии, 1991. Т. 37. № 6. С. 25-30.

23. Вековищева О.Ю., Благова О.Е., Боровицкая А.Э., Евтушенко В.И., Хансон К.П. Некоторые поведенческие особенности взрослых пренатально облученных крыс// Доклады АН СССР, 1992. Т. 324. № 6. С. 1323-1326.

24. Hanson К.Р., Chavchich М.М., Evtushenko V.I. Identification of genes involved in radiation-induced programmed cell death// Abstracts of 19th Meeting European Study Group for Cell Proliferation. Cell Proliferation. 1993. V. 26. № 5. P.

25. Borovitskaya A.E., Evtushenko V.I., Sabol S.L. Cloning and characterization of programmed cell death-associated radiation-induced genes from embryonal neuroblasts// Abstracts of 23rd Annual Meeting Society for Neuroscience. Washington, D.C., USA, 1993. V.19. P. 885.

26. Yakubovitch E., Evtushenko V. cDNA cloning of early retinoic-induced genes from embryo-derived mouse steam cell line// Abstracts of 2nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St. Petersburg, 1993. P. 30.

27. Borovitskaya A.E., Evtushenko V.I., Sabol S.L. Molecular analysis of radiation-induced apoptosis in rat fetal forebrain stem cells// Abstracts of the ASBMB Fall Symposium "Genetic and Biochemical Approaches for Studing Cell Death". Granlibakken, Lake Tahoe, CA, USA, 1994.

"28. Боровицкая А.Э., Евтушенко В.И., Токалов С.В., Ягунов А.С., Хансон К.П. Цитофлуорометрический анализ кинетики клеток

Информация о работе

Евтушенко, Владимир Иванович
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.01

Автореферат

Молекулярные механизмы и функциональное значение процессов клеточной гибели в головном мозге пренатально облученных крыс - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы