Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие пренатального гамма-нейтронного облучения на экспрессию тканеспецифических генов и протоонкогенов в головном мозге крысы

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Действие пренатального гамма-нейтронного облучения на экспрессию тканеспецифических генов и протоонкогенов в головном мозге крысы"

я»'5 0 8

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИП РЕНТГЕНО-РАДИОЛОГИЧЕСКИИ ИНСТИТУТ

На правах рукописи УДК 591.2:016.36.001.28

БОРОВИЦКАЯ Анна Эдуардовна

ДЕЙСТВИЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО ГАММА-НЕЙТРОННОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ И ПРОТООНКОГЕНОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫСЫ

Специальность: 03.00.01 — Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском рентгг-ио-радпологическом институте Минздрава СССР (г. Ленинград).

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор Жербин Е. Л.

Научный консультант — член-корреспондент АМН СССР, доктор медицинских паук, профессор Хансон К. П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Дамбинова С. Л.; доктор биологических наук Живоговскнй Б. Д.

Ведущее научное учреждение — Научно-исследоватсльскнн институт медицинской радиологии АМН СССР.

Защита диссертации-состоится « » 1991 г. в часов

на засед-ании Специализированного совета Д 074.23.01 при' Центральном научно-исследовательском рентгено-радиологическом институте Минздрава СССР (г. 'Ленинград,' .Песочный-2,--ул. "Ленинградская,.:д. 70/4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1991 г.

Ученый секретарь .. . ^ • '. . • ....

Специализированного совета,

доктор медицинские наук .-.-' ' Л- И- Корытова

• ' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуа^ьндсть_т9ны^_пр9натальннп период развития характеризуется' гатея активным протеканием процессов клеточной пролиферации и диф-;ренцировки, нарушение равновесия между которыми макет приводить к гаелым последствиям для развивающегося организма / Ярмоненко,1988/. ) вавывеет сомнений, чта именно поэтому в процессе эволюции у зех видов животных сформировались системы защити эмбриона от влитая вредных факторов окружающей среда. Эти системы, однако, оказы-аются неэффективными в отношении ионизирующего излучения, обладаю-зго выражениям генетическим, тератогенным и канцерогенным действи-« в пренатальном периоде / Mole, 1990 /.

Характер аффекта пренагального облучения существенно зависит от тадаи развития организма и каадой конкретной ткани в момент облуча-ия /Job, 1935/. Особенно высокой, радиочувствительностью отличается азвивапцаяся нервная ткань. Гак, облучение не 15 -21 день развития лода у грызунов и в течение 8-15 недель беременности у человека риводит к выражвнннм структурно-функциональным нарушениям головного озга в постнатэльном периоде /Копегаагш, 1980/. Вероятно поэтому аиболее часто встрвчаодишся последствиями внутриутробного облуче-ия-детей в результате атомной бомбардировки Хиросимы и Нагасаки яв-яются микроцефалия и умственная отсталость /ShulL, 1986/.

В эксперименте на животных, подвергнутых облучении In utero, бнаружеш глубокие нарушения ряде биохимических процессов в головам мозге: снижение синтеза гястонов и негистововнх белков /Antal, 984/, изменение активности ферментов холинэргической системы' TCaacíc, 1980/, нарушение, транспорта ионов /Weber, 1982/ и т.д.

Несмотря на то, что нарушение развития мозга при внутриутробном >блучении плода известна давно и феноменология его достаточно полно >писана, молекулярные механизмы данного явления до сих пор не иссле-юванн.

Целъю_настоящей работы явилось изучение влияния пренатальноп гамма-нейтронного облучения в суммарной дозе 0.5 и 0.75 Гр (вкла, нейтронов 70%) на динамику экспрессии генов, принимающих участие i развитии, дкф1вреицироЕКЭ и функционировании мозга..

Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

1.G помощь» комплекса цитологических и физиологических метода оценить структурно-функциональное состояние мозга крыс, подвергнута:

. пренатальному облучению в. поздний плодный период (17-Я день 1 utero).

2. Изучить динамику изменения экспрессии тканесцецифиескк глиалышх генов - основного белка миелина (ОБМ) и протеолипидноп белка <ШШ) - у контрольных и пренатально солучвншх крас (ПКО) ] период I - 5Ь'а дней после ррвдения (п.р.). .•"'■•

3. Исследовать пострадиационную динамику экспрессии нейрональ них генов ( ИСАК, GAI-43, CD 4, синаотофизина, NSE, N?-L, кальмоду-лина, пратешшинвзы С ) в головной мозге и его отделах ( продолговатый мозг, мозжечок, средний мозг, кора больших полушарий ).

'4. Изучить особенности экспрессии протронкогеков (с-Гоя, c-Jun , c-mafl, c-fyn) в различиях отделах мозга посла ПНО.. < f Научная новизна. В работе шервце проведен комплексный,авали: структурных, функциональных к молекулярных нарушений головного мозг; пренатально облученных крыс. Показан зависимый от дозы нейтронное облучения характер развития дэфвдпа веса мозга. • Обнаружено, чт< нейтронное облучение на 17-й день in utero вызывает задержку мигозо] в мозге вибрионов через сутки после облучения; у новорожденных животных отмечается компенсаторная пролиферация облученных клеток моз-. га; через две недели п.р. как у контрольных, тек и у облученных животных пролиферативной активности клеток мозга не наблюдается. Поведение ТОО крыс характеризуется,повышенной тревожностью, хаотичность] в агрессивностью, что, вероятно, обусловлено недостаточностью тор-

— г—

эзного влияния коры головного мозга не подкорковые структуры вслед-твид пострадиационной гибели корковых нейронов. Установлено, что в оловном мозге ПНО крыс наблюдается усиление экспрессии трех груш леточных генов - гмашш, яеЯрональннх и иротооякогенов - в пзри-д, совпадающий по времени с процессом созревания мозга в норме, а акже с проявлением максимального дефицита веса мозга у облученных, ивотных. Период активации , экспрессии генов, по-видимому, пред-тавляет собой компенсаторную реакцию на радиационную гибель клеток' взвивающегося мозга. Позднее наступает фаза подавления активности icex изученных генов, а также II) - годоОкых последовательностей:, что горрелирует с развитием функциональной неполноценности мозга в отда-кнные сроки посла лренатального облучения.

Полученные данные о сходстве пострадиационной активации экс-грессш изученных тканеспецифических генов и протоонкогенов в голов-юм мозге пренатально облученных крыс свидетельствуют о возможности ;у^И8ствовага;и единого молекулярного механизма компенсации радиаци-знной гибели эмбриональных нейроблзстов мозга после рождения.

Научно -.практическая значимость. Исследование относится к разряду теоретических работ. В настоящее время значимость работ по ис~ зле'дованию последствий облучения In utero особенно велика в .связи с кассовым клиническим использованием Х-лучей и радиоактивных материа-ков, а также с увеличением радиационного фона в результате развития атомней энергетики, испытаний ядерного оружия, аварий на реакторах.

Полученные данные об экспрессии генов в головном мозге, пренатально облученных крыс расширяют и углубляют представления о молекулярных собмпях, лекапта в основе процессов компенсации радиационной потери клеток в мозге, а также развития функциональной неполноценности мозга в отдаленный пострэдиашоншй период. Пострадиационная активация экспрессии протоонкогенов может способствовать формированию благоприятного фона для развития радиогенных: опухолей.

ФоЕМ§_§нед£едая_. Работа проведена в рамках плановых заданий ЦНИРРИ МЗ ССОР по программе 0.74.05 " Молекулярная биология и молекулярная генетика медицина " (постановление ГКНГ СССР, Госцлана СССР и президиума АН СССР N 492 / 245 / 146 от 8.12.81). Номер государственной регистрации темы 01860049367.

Апрдбауия_работыА Материалы диссертации доложены на Всесоюзной школе-семинара "Современные проблемы радиационной медицины"(Киев-Ка-нев, октябрь 1988), на научном заседании Ленинградского общества рентгенологов и радиологов (Ленинград, май 1989), на I Всесоюзном радиобиологическом сьезде (Москва, май 1989), на XII Всесоюзном сьездв рентгенологов и радиологов (Ленинград, ноябрь 1990), на Сим-т поаиуме европейских биохимически! обществ <РШ) (Будапешт, август 1990).

г-

По материалам диссертации опубликовано 4 работы..

Структура и объем диссертация. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных экспериментальных данных,, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками в фотографиями. Указатель литературы содержа* ' ссылок на публикации отечественных и зарубежных ¿торов.

ЦАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В экспериментах использовались белые беспородные крысы. Самцы и самки весом 200-300 г. ссвхивалиоь на одни.сутки (бсамок+1 самец). На 17-й день беременности крыс облучали в биологическом канале реактора ВВР-Ц (ЛШФ т. Константинова АН СССР) гамма-нейтронным излучением в суммарной дозе О.Б и О.ТбГр (вклад нейтронов 70%), Энергия нейтронов в разных сериях облучения составляла 0.7-1.0 Ыэв.

Через оцределевше сроки после рождения (п.р.) облученных и контрольных крыс забивали и их мозг взвешивали. Результата обрабаты-

— ? —

вали статистически с вычислением критерия Стьвдента (Зайцев, 1984). Различия считали значишмл при р«3.05.

Анализ цнтогашетики головного мозга по содержании Д!И проводили методой проточной цитомэтряи (Ягунов, 1986). Ядра клеток мозговой ткани контрольных и цренаталыю облученных: кивотних выделяли цитрат-сяхароашм методом (МоПуапа, 1969). Выделенные ядра фиксировали в 25* этанола ' па физиологическом раствора, содержащем ДНК-сшнсгфяческий краситель Иоей1з1;-33252. Измерение фляоресцеции проводили па проточном цитофлюаршетре. гистограмма распределения ядер клеток по содержанию ДНК обрабатывал! на ЭВМ ЕС-1840 и в результата получав процентное содержание клеток в а0+1, 3, 02+М фазах клеточного цикла (Еаг1с^1е, 1976).

Изучение поведения животных проводили с помощью тестов открытого поля и зоосоциялькой депривация (Попшвалов, 1986). при исследовании двигательной активности контрольных и облученных животных в открытом пола (площадка 100x100 см о отверстиями) регистрировали девять поведенческих элементов. Регистрация поведения и обработка экспериментальных • данных проводилась по программам, разработанным для ЭВМ "Электроника ДЗ-28" на языке Бейсик, позволяющим учитывать последовательность и ,длительность поведенческих элементов, а также провести анализ структуры поведения ' группы в целом (Псшивзлов, 1989)^ Результата експериментоа представлены в виде направленных графоц, отражающих взаимосвязи поведенческих единиц, и кластеров, 'обьедкявдпх поведенческие элементы по уровня взаимных.переводов.

При изучении эффекта зоосоциальной изоляции животные содержались индивидуально в течение одной недели. Реакция на вторжение ин-трудера регистрировалась в течение 8 мин..Выделяли 2 основных группы поведенческих элементов-внутривидовыэ и индивидуальные. Д.ля анализа неведения были использованы принципы классификации поведения самцов мнаей и крыс <Пошгвалов, 1978)..

РНК из мозга ■ крыс выделяли центрифугированием гомогвнатов градиенте гуаниданизотиоцианат/CsGl (Ctiirgwta, 19Т9). Глиоксшира равную РНК фракционировали в I-I.33S агарозном геле, .переносили а капроновые фильтры (Маниатис, 1984). Транскрипты иммобилизовали ш фильтрах с помощью УФ (Khandjian, 1986).

В качестве зондов для гибридизации использовали ллазмида, содержание фрагмента соответствующих генов, меченные -33Р-дШ5> в реакции ник-трансляции до удельной активности 0.7-I.5xIQ8 имп/шш/ша да.

Гибридизацию связанной с фильтрами РНК проводили в растворе, содержащем 0.5М NaCl - 20 мМ трис.ШЯ.рН 7.6 - 0.52 ДСК - 5мМ ЭДГА-10% íicoll 400, в течение 24-48 ч при 60-64°С. Отштые от несвязав-шейся метки - фильтры экспонировали с рентгеновской шюнкой (HS-11 "ORTO", ГДР) в кассетах с усиливающим званом ЭУИ-КССОР) при -70°С в течение 1-7 суток. Интенсивность гибридизации определяли до степени почернения рентгеновской пленки (лазерный денситометр SIR-1D/2D, "Zelnech", США). ,

РЕЗУЛЬТАТЫ КССЛВДОВАНШ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие дефицита веса мозта и анализ цитоишетшш головного

' У прэнатвльно облучениях (ПНО) живота после рождения развивается дефицит веса мозга (рисЛа). Сравнение двух доз облучения нейтронами (0.35 и 0.5 Гр) выявило зависимый от дозы характер снижения веса мозга: при действии большей дозы повреждение, очевидно, захватывает более обширные популяции клеток. Важно отметить, что дефицит веса мозга облученных крыс сохраняется на протяжении всего периода наблюдения (до 1,5 лет ноотнагальной кизни). При визуальном сравнении мозга взрослых контрольных и облученных хивотвых (рис .10) у последних выявляется уменьшение гшоцеда коры больших полушарий и сглаженность ее извилин. " 1

II нш (t>¡

Рис.1. Структурные нарушения головного мозга преяятально облученных крыс: динамика развития ¡дефицита веса мозга в постнатальный период (А) недоразвитие коры мозга ;облученных крнс (Б). ¡А: (•-•) - контроль; (о-в) - пренатальнов обучение в дозе 0.35Гр | нейтронов; (*•-*) - пре-!нательное облучение в ¡дозе 0.5Гр нейтронов. ! Ордината - вес мозга (г)

évlsj ■

I рождения;

i Б: слева-мозг контроль-\ ного животного; справа' t^f** s ! мозг облученного- животного через 6 мес. после рождения.

Это соответствует описанным в литературе фактам о недоразвитии коры мозга у взрослых животных после ПНО в период, критический Для формирования этого отдела мозга (Шонтковсгай, I9S4; Mole,. 1990). У человека внутриутробное облучение в критический период (8-IB над. беременности) тартэ приводит к тяжелым последствиям таким квк микроцефалия. и умственная отсталость (Dobbing, 19ТЗ). Уменьшение окружности головы наблюдалось и у детей, переживших атомную бомбардировку Хиросимы и Нагасаки (OtaKe, 1983).

i.

csr? м

$ V >V' i , J

fe- ./

Изучение цигоишетики головного мозга контрольных и ПНО животных выявило увеличение процента клеток в S+G2+M фазах митотического цикла через сутеи после облучения (18-й день In utero) и у новорожденных облученных: животных. В первом случав это может быть следствием как радиационного блока митозов (Окада, IÖ74), так и радиационной ..гибели части клеточной попу ляда. Хорошо установленным фактом является существование программированной гибели некоторых популяций нейронов в процессе нормального развития мозга (Rlhn, 1990). Возможно, что радиация индуцирует программу гибели шйробластов по интерфазному, типу, как это показано для лимфоидаых клеток (Хвнсон, 197У). В пользу этого предположения свидетельствует появление пйхнотических ядер в мозге ужз через 4-6 часов посла облучения (Mole,.1990). Увеличение доли клеток в S и G2+-M фазах кла точного цикла у новорождан-riiix животных, вероятно, отражает компенсаторную пролиферацию клеток мозга после радиационной гибели части популяции. Ранее было показано» что при облучении крыс на 18-й день in utero одновременно" с уменьшением числа нейронов вследствие их гибели происходит возрастание количества глиальных клеток почти на 509 в.наружных слоях коры мозга (Hlcka, 1953). Радиационная гибель нейроблвстов вызывает также ' усиление пролиферации йейрональных клеток: в, коре мозга образуются характерные "розетки", состоящие из выживших нервных клеток; которые сохранили способность делиться, но не могут мигрировать в патологическом .окружении (Mole, 1990).

Чарез две недели п.р. различий в распределении клеток по циклу не наблюдалось; к втоыу времени подавдяюцэе большинство нервных клеток находится в состоянии покоя (Marea, 1985) и радиация не вносит изменений в распределение клеток по клеточному. циклу. .

. Таким образом, компенсаторная пролиферация клеток в мозге ПНО юдаэпшх заканчивается, по-видимому, в первые дни после рождения .и не предотвращает развитиа пострадиационного дефицита веса мозга.

' Лучение доведения__контрольных^___1гре1]атальна__облу'ге1гш1х__жи;

Наблюдаемые нами нарушения поведения ПНО кивотянх по-видимому связаны с повреждением корн мозга. Анализ структуры поводения по тесту двигательной активности в открытом поле выявляет у облученных хивотных усиление хаотичности перемещений (увеличивается частота переходов между отдельными поведенческими актами) и тревожности (появляется реакцияизамираш1в"). Результата исследования поведения по тесту парного взаимодействия с партнером противоположного пола свидетельствует о повышенной агрессивности ПНО животных. Очевидно, описанные нарушения поведения ШО крыс отражают недостаточность тормозных влияний со стороны поврежденной коры мозга. Важно отметить, что наблюдаемые наш нарушения поведения крыс регистрируются у 1.6-годовалых животных, что свидетельствует о сохранении функциональной неполноценности мозга в отдаленный пострадиационный- период.

Следующим этапом работы явилось изучение- последствий ПН0 на ко-лекулярно-генэтическом уровне.

Известно, что в мозге экспрессируется большое число генов - в 3-5 раз больше, чем в других тканях и органах животных и человека. В настоящей работе исследовали экспрессию генов, участвующих в"развитии и функционировании мозга, принадлежащих к трем группам (глиаль-ные и нейронэльные гены и тгротоонкогены).

Динамика изменения экспрессии глиальных генов. Гены основного белка миелина (ОБМ) и протеолипидаого белка (ГОШ) кодируют функционально связанные белки, являющиеся основными структурными компонентами миелиновой оболочки- вксонов в ЦНС." Экспрессия этих генов имеет сходный характер как на уровне целого мозга, так ц в его отделах. Постнатальная активация экспрессии генов ОБМ и ПЛП <2-4 нед. п.р.) по времени коррелирует с процессами мшлинизации, которые являются одним из.завершающих этапов созревания мозга. Пренатальное облучение

вызывает длительную активацию вкслрессии атих генов, начиная с 3-х недель п.р. до 2-х мвс.(в случав гена OBI) и в течение более продолжительного времени (5 мес.) - для гена ПЛП (рис.2).

ar « цаi г *

Рис.2. Динамика изменения экспрессии гена OBI (А) и ПЛП (Б) в коре головного мозга крыс. (•—•) - контроль; (о--о) - пренатальноо облучение. Ордината - уровень транскршх-тов генов в относительных единицах; абсцисса -'время после рождения.

Следует отметить, что наиболее выраженные пострадиационные изменения вкслрессии найладастся-в коре головного мозга.

Через 1.5'года постнатальной жизни уровень экспрессии гена ОШ в'коре мозге оказывается сниженным по сравнению с контролем..

Интересно, что развитое максимального пострадиационного дефицита веоа мовгв по времени совпадает о периодом активного созревания мозга в норме (2-4 над, п.р.). в втот же период у ПНО животных наб-лвдается активация экспрессии генов белков миелина. В литературе, однако, описан факт снижения в мозге-ПНО животных количества миелина и содержания миелановнх балков в миелине. (Копегаапп, 1989), Вероятно, причина несоответствия результатов на уровне м РНК и белка заключается в нарушении трансляционных и восттрансляционта процессов, т.к. показано, что пострадиационное снижение синтеза белка в мозге

обусловлено подавлением аминоацилировашя т РНК (Antal, 1985).

Известно, что компенсация пострадиационной утраты нейрональных клеток может осуществляться как путем образования новых отростков и новых синаптических контактов выжившими после облучения нервными клетками, так и за счет усиления, пролиферации глиалышх клеток (Hicks, 1953). Реализация этих процессов, по-видимому, находит отражение в наблюдаемом в наших экспериментах усилении активности миели-новых гонов.

Била изучена также экспрессия восьми генов, кодирующих следую- , щие нейрональные белки: синаптофизин, CD 4, КСАМ (гликопротеины поверхности клеточной мембраны),. ШЕ (нейрон-специфическая едалаза), KF-L (белок нейрофиламентов), протеинкиназу С, кальмодулия, GAP-43 (фосфопротеин пресинаптической мембраны). По характеру экспрессии в постнатвльном онтогенезе их мохно условно разделить на две группы:

. гены, характеризующиеся высоким уровнем экспрессии в первые 2-3 над. п.р. с последующим снижением в период завершения функционального созревания мозга (3-4 над. п.р.)' (геш синаптофизина, NF-1, NSE, протеинкиназы С, кальмодулина);

гены, уровень вкспрессии которых максимален у новорожденных животных (CD 4, NCM) или в первую надел» п.р. (О/Р-43) и резко снижается, начиная со второй недели п.р.

Продукты нейроналышх генов, принимают участие в процессах развития и созревания мозга. Белок GAP-43 - фосфопротеин.пресинаптической мембраны конусов роста аксонов; поверхностные гликопротеины ПСАМ и CD 4 -рецептордаэ балки, обеспечивающие межклеточные контакты в'мозге на начальных этапах его развития. В процессе созревания мозга и установления все более спенифичейких контактов уровень вкспрессии генов этой группы снижается; в этот период начинают активно экс- , прессироваться гены второй групш. Продукт гена NSE функционирует в зрелых синапсах после определения окончательной локализации нейро-

нов. Сшапгофлзшг-мембрашшй гликолротеш синаптических пузырьков, регулирующей процесса депонирования в везикулах и высвобождения нвй-ромедиаторов. Белок ЯР-1 ~ один из компонентов цитоскэлета аксонов, участвующий в росте и регенерации аксонов, а также в аксоналыюм транспорто органелл и молекул по аксону. Протоинкиназа С и кальмоду-лин -"зависание от присутствия кальция белки, прямо и опосредованно вктивирунияе фермента, которие участвуют в важнейших физиологических процессах клетки: в сигнальных путях передачи информации от поверхности клетки в ядро, фосфорилировании ядерных селков (в том числе, с-Гоз м с-Лип, активаторов транскрипции), белков цитоскелета, мемб-раннмх белков и т.д. Таким образом, с помощью протеинииназы.С и квльмодулша осуществляются процессы образования, развития и регенерации нервных связей, проведение- нервного импульса, обеспечиваются пластические перестройки синапсов.

Интересно, что для большинства изученных в работе нейрональных генов наблюдается повышенный уровень транскриптов в мозге взрослых животных (к 6-1в мэс.) (рис.3), что, вероятно, отражает участие этих генов в реализации свойства пластичности, т.е. способности к образованию новых и перестройке уже существующих'нервных связей. Это свой-• ство является уникальной особенность мозга, отличающей его от всех других органов и лежащей в основе таких долговременных процессов как . научение и память.

. Оце одной особенностью нейрональных генов является то, что ; только в коре больших полушарий и ни в одном другом отделе мозга наблюдается доявление у I.5-годовалых контрольных и подавление у ПНО животных шзкомолекулярних ПМюдобШх транскриптов, которые, как считают, регулируют экспрессию основных структурных генов (ЗигсШГе, 1983). ' ■ • .

Лренатальное облучение приводит к активации всех исследованных генов, которая наиболее выражена в период (3-4 нед. п.р.)' совпадаю-

- ОТ-

Ций па времени как с завершением функционального соареьшыя мозга в норме, тек и с развитием максимального пострадиационного дефицита веса мозга (рио.З).

Рис.3. Дииашша изменения экспрессии' найрональних генов протэмшша-зы С (А), кальмодулина (Б), ПСАМ (В), САР-43 (Г) в коре головного мозга крыс.. (•-»)-контроль; (о--о)-пренагальное облучение.'Ордшата. -уровень транскриптов генов в относительных единицах; абсцисса - время после рождения.

По-видимому, повышенный уровень транскриптов неПроналышх генов ■у ГШО ¡кивотдах отражает; компенсаторные процессы в мозге в условиях дефицита' клеток, который является следствием радиационной гибели значительной части популяции. Эти компенсаторные процессы выражаются в'формировании дополнительных аксонных выростов, ветвлении девдритоя И' образовании новых синапсов. Процебс компенсаторного разрастания нервных отростков (спраутинг) был продемонстрирован в вкспери.мон-тальных условиях в раде отделов головного мозга после хирургических воздействий, приводящих к'потере посгсинаптических мишеней. во мно-

— 1С

гн отношения/, такой процесс предполагает реактивацию механизмов, которые действовали в период развития (Шеперд, .1987).

Наиболее значительную пострадиационную активацию экспрессии всех изученных генов да отмечали в коре мозга по.сравнению с другими его отделами (продолговатый мозг, мозлечок, средний.мозг). Интересно, что нейроны коры облученного мозга способны поддерживать высокий уровень транскршгтов некоторых, генов, характерный для взрослых животных, на протяжении •длительного времени - в течение 6 мес. постна-■ тельной жизни (еинвптофизин, кальмодулин,, CD 4), тогда как для других генов (NCAM, GAP-4-3, протеишшназа С) наблюдается только кратковременная активация - через I мес.-; в последующие сроки уровень-генов NOAM и протеинкинази,С даже ниже, чем в контроле, a GAT-43 - не отличается от контроля. Важно отметить, что для нейрональных генов почти во всех случаях через 18 мес. наблюдается снижение уровня экспрессии как специфических структурных генов, так и низкомолекулярных ID-гомологичных последовательностей, что, возможно, отражает функциональную неполноценность клеток мозга в отдаленный пострадиационный период.

Динамика экспрессии прогоонкогенов в мозге контрольных и прена-тально облученных крыс в постнатальном онтогенезе.'

Клеточные гомологи вирусных онкогенов, протоонкогены, - это нормальные клеточные гены, продукты которых участвуют в процессах передачи сигналов от поверхности клетки в ядро (ростовые факторы, рецепторы, П'0-связывакщие белки, цитоплазматическиё протеишиназы) и регулируют экспрессию генов (ядерные протоонкогены, обладающие дак-свяэывэвдей активностью). В мозге экспрессируется большое количество протоонкогенов; активность некоторых из них связана с пролиферацией клеток,. другие участвуют в дифференцировке клеток.'и сигнальных путях передачи информации (Sudol, 1988).

В работе исследовали экспрессию 4-х протоонкогенов - c-ios, с-

— f7 —

Juri, c-maa, c-fyn.

Протоонкогены c-íoa и с-Зип кодируют ядерные балки, которые могут активировать транскрипцию определенных клеточных генов, связываясь с энхансерными и.промоторными последовательностями ДНК. Показано, что белки Роз и Jun образуют стабильные комплексы - гомо- и ге-теродимеры, причем, гетеродимеры Fos-Jun являются наиболее эффектов-' ными активаторами транскрипции, че соответствующие гомодимеры (Franza, 1983).

Лротоонкоген с-шаз кодирует "нейроналышй" тип рецептора ангио-тадзйна, имеющего структурную гомологию с гормон- и нейромедиатор-рецекторннми белками клетки и участвующей в трансдукции сигналов через ююзитол-липидннй сигнальный путь (Jackson, 1988).. c-fyn является членом згс-семейства тирозиновых протеинкиназ, которые также участвуют в передаче сигналов через инозитол-липидшй путь-с помощью активации'протеинкшазы С й -повышения содержания внутриклеточного кальция (Manes3, 1988)'.

В раннем постнатальвом онтогенезе наблюдается двухфазный характер экспрессии протоонкогенов: высокий уровень транскриптов у новорожденных животных, возможно, связан с участием генов этой группы в пролиферации клеток коры мозга, которая еще происходит в первые дни после рождения, а также в процессах миграции яостмиготичесхих нейронов (рис. 4). Второй пик экспрессии протоонкогенов - у 3-х недельных ■животных -коррелирует с периодом терминальной диф!еренцировки клеток коры мозга и функциональным созреванием нервных связей в мозге. Сходство динамики экспрессии протоонкогенов, независимо от того, к какому классу, они принадлежат (ядерные, цигоплвзматические, мембран-но связанные) предполагает их функциэйальную взаимосвязь. . Действительно, продукты многих'протоонкогенов взаимодействуют в процессе развития и функционирования нервных связей в мозге.

Следует отметить, что наряду с изменением общего уровня транс-

— ft

IDM M О I r ,

■V

, __ \ ' ~ V i \ 1 V i А'Л ^ vf \ 'X 4 (-POS ■ - ----с^ ч— \ N N.

«MAS

\ 1

\ t

ч '

ХУ^:

i-г

Г—-г

"1С n.f.

Рис.4. Диневджв изменения экспрессии протоонкогенов с-£оз (А) чеша (Б) в коре . головного мозга крно. (•—•)-контроль; (о--о)-прена-•тальное облучение. Ордината - уровень транскриптов генов в относительных единицах; абсцисса - время после рождения.

криптов наблюдаются различия в экспрессии индивидуальных .форм- м РНК (по крайней мере для гена с-Гоз) (рис.5). - ~~ ~~ рис.5. Гибридиза-

ция препаратов

с- ros

• о

4 м « о ■ л

_ г- — м м ч> - »>

КОРА МОЗГА

'Ч ' «к :

, ' ¥ .

ш •

_ ^ 2 5; S • 2 5 ЛПР И®-' выделенных

-............. из коры головного

рй • }-. g 0 мозга контрольна*

' ' ; ' * — '«* , (К) и пренатально

, облученных (ШО)

t if

m il?

I?

крыс с32Р-мечен-

'И' >r41

>■ к| . " ной плазмидой

Щ} & ' pfOS-I, содержа-

К ЧН0о".и ' щей вставку y-îos

,онкогена. Вверху' дни после рожде- •

кия; справа - маркеры молекулярной Mgccu (Z8S и I8S рРНК).

— /г—

Прй этом максимальное содержание специфического мозгового транскрипта гена с-Гоз (2.2 т.п.н.) отмечается в период активного созревания мозга (3-4 нед. п.р.), а также у взрослых животных (6-18 мес.). Интересно, что в коре мозга I.5-годовалых крыс, так же, как и в случае нейрональных генов, но в значительно большем количестве, наблюдается появление'низкомолекулярных транскрипгов, которые, возмож--но, гомологичны специфическим мозговым регуляторам ID-последовательностям (рис.5), считают, что появление низкомолекулярных РНК, ■ гомологичных IB-элементам, в мозге предшествует экспрессии основной группы структурных генов. Однако, никто не исследовал экспрессию этих транскриптов в течение длительного времени. Возможно, в данном случае в силу функциональной взаимосвязи нейрональных генов и прото-онкогенов в развивающемся и зрелом' мозге эти регуляторные последовательности участвуют в поддержании высокого уровня транскриптов исследованных груш структурных генов, необходимого для нормальной функции зрелого мозга.

После ШЮ наблюдается снижение уровня экспрессии протоонкогенов1 в раннем постнагальком онтогенезе (у 1-7-Дневных животных), связанный, вероятно, с гибелью клеток, а также с нарушением миграции нейронов коры мозга и образования первичных синаптических связей (рис. 4). Начиная с 3-х недель посгнагального развитая, отмечается повышение содержания протоонкогенов. Этот период связан, с завершением .фувкциональнбго созревания мозга.- В этот же период отмечается развитие максимального дефицита веса мозга (рис. 1а). Интересно отметить, что 'активация экспрессии протоонкогенов происходит за. счет увеличе- ' ния количества высокомолекулярных транскриптов (рис.5). Это напоминает распределение' транскриптов в мезге контрольных новорожденных животных и,' вероятно, связано с изменением скорости транскрипции и процессинга м РНК в облученном мозге. Активация экспрессии протоонкогенов наблюдается на протяжении 6 мес. .лостнатальной жизни и к 18

мвс. сменяется существенным подавлением уровня транскриптов генов с-£оа, с-Зип и; с-таз (но не с-1уп). По-видимому, так же, как и в случае нейрональных генов, это отражает функциональную неполноценность мозга в отдаленный период после облучения. Об этом же свидетельствуют полученные наш, а также описанные- в литературе данные о нарушении поведения и усжэвяо-рефшекторной деятельности пренагально облученных животных. ,

ВЫВОДУ

1. Пренатальное 'гамма-нейтронное облучение крыс на 17-й день внутриутробного развития ■ приводит к массовой гибели эмбриональных нейробластов коры мозга и последующей компенсаторной пролиферации клеток, которая^ однако, на предотвращает развитие дефицита веса облученного мозга после рождения.

2. Пренатальное облучение, приводит к усилению экспрессии трех изученных групп генов (глиальные, нейрональные и протоонкогекы) в период, совпадающий с развитием максимального дефицита веса мозга ( 2-4 нед. я.р.).

3. Пострадиационная активация экспрессии генов наиболее выражена в коре головногй мозга и, по-видимому, представляет собой молекулярную основу компенсаторной реакции выживших после облучения клеток мозга.

4. В отдаленные сроки после облучения (1.5 года) наблюдается подавление экспрессии изученных 'генов и низкомолекулярных последовательностей, а тага» нарушение поведения облученных 'животных, что, по-видимому, свидетельствует о функциональной неполноценности мозга в отдаленный пострадиационный период.'

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ: I. Экспрессия генов в клетках головного мозга преиаталью облученных крыс.//Тез. докл. I, Всесоюзн. радиобиологии, съезда. Пущино.-

1989 - т.IV - С. 865-866^/ Соавторы: Евтушенко В.П., Хансон К.П., Жербин Е.1.,,

2. рлияниа радиации на генную экспрессию в клетках тимуса и головного мозга крно.// Радиобиология - 1990 - N4, - С.531 / Соавторы: Евтушенко В.И., Жербин Е.А., Хансон К.П.

3. Действие пренатального нейтронного облучения на экспрессию генов белков миелина и нейрональных поверхностных гликопротеинов в разви-ваицемся мозге крысы.// Доклады АН СССР - 1990 - T.3I6, N6. -C.I482-I484 / Соавторы: Евтушенко В.И., Хансон К.П.

4. Perinatal neutron Irradiation (PNI) activates gene expression In developing rat tissues.// 20th IEBS Budapest, Hungary. Abstracts. -

1990 - P.164"./ Соавторы: Evtushenko V.l., Hanaon K.P. '